JPH07505467A - フルオロメーター検出システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 フルオロメーター検出システム 発明の分野 本発明は、溶液または表面からの蛍光の検出に関する。さらに詳しくは、本発明 は、過渡状態イムノアッセイの測定に適する。

発明の背景 蛍光は分析、特徴付けまたはイメージング（ｉｍａｇｉｎｇ）のために、対象か らの蛍光放射をモニタする過程である。典型的には、放射の励起パルスは、試料 の表面または内部に向けられ、続いて、試料の蛍光が発せられ、次いで蛍光放射 が検出される。検出した蛍光は試料の分析、特徴付けまたはイメージングに使用 される。

イムノアッセイの場合、試料の分析は、典型的には、蛍光性タッグで所望の種を マークし、試料を励起し、該タッグからの蛍光をモニタすることによってなされ る。

理論的には、フルオロメトリーは、すべての分析器具のうちで最も感度のあるも のとされ得る。単一の光量子事象を検出することができ、また発蛍光団を再励起 し、分析を確認することが可能である。しかしながら、蛍光に不利益を与えてき た問題は、注目する蛍光信号を系におけるバックグラウンド放射から識別するこ とにあった。しばしば、「バックグラウンド」放射からの信号は、注目する蛍光 信号の強度の１０．０００倍も大きくなり得る。望まないバックグラウンド放射 の検出は、画像の質および検出の精度を低下させる。

バックグラウンド放射によって引き起こされる問題は生物学的系において特に鋭 敏である。例えば、血漿の分析において、ビリベルジンのごとき天然に存在する 蛍光性物質の存在は、実質的なバックグラウンド放射を引き起こす。望ましくな いバックグラウンド放射の他の源は、周囲の放射、速量光放出性物質からの放射 （一般に、工ないし１５ナノ秒のオーダーの減衰半減期であると考えられている ）、およびラマン散乱バンドのごとき種々の散乱機構を包含する。

バックグラウンド放射の問題を克服するための初期の試みは、少ししか成功しな かった。第１の技術は、波長に基づいてバックグラウンド放射から区別すること を含む。一般に、フィルタを用いて、すべてであるが、狭く規定される波長バン ドにおいて検出される放射を除（。この技術は、一義的に成功したというもので は到底なかった。何故ならば、バックグラウンド放射は所望の蛍光信号と同一の 波長におけるものでもあり得るものであり、従って、フィルタを通過し、検出さ れるからである。

バックグラウンドから所望の蛍光信号を区別しようとする第２の技術は、いわゆ る時間ゲートアプローチである。ここに、蛍光信号は励起後の短いタイムウィン ドウで観察される。該タイムウィンドウは、その長さおよび開始時間共に変更し 得る。種々のタイムウィンドウを使用することにより、検出される放射は、検出 感度に最適の時間において観察され得る。歴史的には、この技術は、注目する蛍 光信号の検出前にバックグラウンド蛍光を実質的に減衰させることを可能とする （１．０００ナノ秒のごとき）非常に長い減衰時間の発蛍光団を使用してきた。

しかしながら、一般に、長減衰時間の発蛍光団は、短減衰時間の発蛍光団よりも 望ましくない。何故ならば、それは比較的感度が低く、総じて解析に長時間を要 するからである。

歴史的には、過渡状態蛍光分析について、２つの励起パルスフォーマットがあっ た。１のフォーマットは、発蛍光団を励起する単一の比較的高出力パルスを利用 する。過渡状態は、典型的には、時間の関数としての電流を表すアナログ信号を モニタすることによって高速光電子増倍管によりモニタされる。単一のパルス系 は、非常に多数の蛍光性分子を励起して検出を信頼性のおけるものとするのに十 分な高出力を要する。過渡状態蛍光分析についての他の主要なフォーマットは、 繰返し励起パルスを利用する。通常、比較的短く、典型的にはナノ秒間持続する マイクロワット範囲の出力を持つ光のパルスを、１ないし１０，０００Ｈｚで変 化させて試料に繰返し適用する。通常、励起源はキセノンランプのごときランプ である。しばしば、減衰曲線は、フォトンの受容に対する時間を測定することに よってデジタル的に決定される。１の商業的に入手可能な系は、（５，０００Ｈ ｚのごとき）繰返しパルスを使用し、時間依存性強度信号を得るために、フラッ シュ後に時間を徐々に増大させて、光電子増倍管をストローブする。かかる系に おける検出は、非常に時間がかかり、かつ感度が低いことが判明している。単一 の分析は、比較的高い蛍光性染料濃度においてさえ（例えば、１０−’Ｍ）　、 １時間のオーダーかかり得る。

最近、蛍光性染料の領域において、重要な進展がなされた。１の態様において、 赤色および赤外波長におけるごとく、長波長放射によって励起され得る染料が今 や入手できる。出願人は、１９９１年５月１５日に出願され、発明の名称カリ蛍 光マーカー構成要素および蛍光プローブ（Ｆｌｕｏｒｅｓａｃｅｎｔ　Ｍａｒｋ ｅｒ　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ａｎｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｂｅｓ） Ｊであるアレニウス（Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ）の（１９９０年５月１５日に出願さ れ米国特許出願第５２３．６０１号の一部継続出願である）米国特許出願第７０ １．４４９号、および１９９１年５月１５日に出願され、発明の名称が「凝集お よび血清結合の無い蛍光染料（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｄｙｅｓ　Ｆｒｅｅ　 ｏｆ　Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎａｎｄ　Ｓｅｒｕｍ　Ｂｉｎｄｉｎｇ）Ｊである ダンドライカー（Ｄａｎｄｌｉｎｋｅｒ）およびシ、　−（ｆｌｓｕ）の（１９ ９０年５月１５日に出願された米国特許出願第５２４，２１２号の一部継続出願 である）米国特許出願第７０１．４６５号を引用して本明細書の一部とみなす。

感度における重要な改良が、以前の染料よりも優れたこれらのモダンな染料の使 用を通じて達成されている。

さらに重要な進歩が、データ収集および解析技術を通じて感度の増大においてな された。ダンドライカー（Ｄａｎｄｌｉｎｋｅｒ）の、発明の名称が「フルオロ メーター（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）Ｊである米国特許第４，８７７．９６５号 に記載されているごと（、時間ゲート技術が、データ収集および解析技術と組み 合わせて用いられて、バックグラウンドに対讐る信号が改良されている。一般に 、ダンドライカー（Ｄａｎｄｌｉｋｅｒ）らは、所望の信号源、および種々の望 まないバックグラウンド源を含めた、種々の源からの信号から構成されるべき時 間の関数としての検出強度を考慮している。所望の信号の最適化は、データ収集 および解析技術を介して達成されている。

イムノアッセイにおいて関連材料を測定する能力において、さらに重要な進歩が なされている。例えば、ここに出典明示して本明細書の一部とみなす、１９９０ 年３月６日に出願され、発明の名称が「過渡状態ルミネッセンスアッセイ（Ｔｒ ａｎｓｉｅｎｔ　５ｔａｔｅ　Ｌｕ１ｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ａｓ５ａｙｓ）Ｊで あるダンドライカー（Ｄａｎｄｌｉｋｅｒ）らの（１９８９年６月１３日に出願 された米国特許出願第３６５，４２０号の一部継続出願である）米国特許出願第 ４９０，７７０号においては、ホモジニアスアッセイにおける物質の結合形およ び遊離形が決定できる。一般に、該技術は、平行および垂直偏光成分の強度の時 間依存性減衰を測定することを必要とする。

種々の偏光状態の時間依存性減衰を測定することによって、ホモジニアス解析フ ォーマットにおいてハブテン、ペプチド、または小蛋白のごとき物質の結合形お よび遊離形を測定することができる。重要なことには、結合物質と遊離物質との 分離は必要とされない。

蛍光性染料の分野においてなされた重要かつ有望な改良にもかかわらず、データ 解析の局面において、蛍光を達成しそれを検出する現実の方法および装置は、従 来、比較的変化しないままであった。最も感度が良好で優れた装置を使用しても 、物質の高濃度においてさえ、解析には１時間あるいはそれ以上の時間を要する 。フルオロメトリーを臨床におけるイムノアッセイに用いる場合、解析および適 当な診断のための時間は、絶対的に重要であり得る。患者の生存は、正確で適宜 な解析に依存し得る。加えて、迅速なテストは、患者を長時間待たせることなく 再テストすることを可能とし、その結果、より迅速で正確な診断ができる。感度 に関しては、微量の蛍光性物質を検出できるのが極めて望ましい。しかしながら 、試料中の蛍光性物質の量が増加するにつれて、所望の信号に対する望まない的 により長い時間を要する。

従来、解析に要する時間はかなり長かった。公知の方法および装置は、試料の迅 速で正確な診断ならびに解析を供することができなかった。これは、フルオロメ トリーの明確で知られた要望の使用にも拘わらずそうであった。

発明の概要 改良された蛍光検出システムは、系の感度および精度を高めるために、高速検出 エレクトロニクスを装備した、比較的高出力で、比較的高い繰返し速度の光源を 利用する。好ましくは、該光源はレーザダイオードである。高速検出エレクトロ ニクスは、単−事象光量子の計数を可能とする。

１の具体例において、光源、好ましくは、レーザダイオードを用いて、タイムウ ィンドウの位厘を変更することによって、発蛍光団の減衰プロフィールが得られ る。過渡状態検出は、発蛍光団を反復して励起し、はっきりとしたタイムウィン ドウ内で検出器によって受容された事象数をモニターすることによって達成され る。レーザダイオードは、有利には、（５ないし１００ミリワツトのごとく）比 較的高出力、長寿命を有し、（１０ＭＨｚのごとく）比較的高繰返し速度でバ　 。

ルスを発生できるするものを用いる。比較的高出力の励起パルスと比較的高繰返 し速度とを組み合わせると、実質的に迅速でより正確な蛍光測定ができることと なる。

好ましい具体例において、高出力の光源、好ましくは、レーザダイオードを用い て、光量子の受容に対する時間を測定し、そのデータからのヒストグラムを編集 することによって、発蛍光団の減衰プロフィールが得られる。ハードウェアのカ ウンタは、モニタ時間内の合計検出事象数を測定する。蛍光減衰曲線の形状は、 光量子の受容の時間のヒストグラムを発生させることによって決定される。好ま しい具体例において、事象検出の時点においてランプ電圧をサンプリングし、該 電圧を保存してヒストグラムを編集する。一旦、それまでの事象が検出され、か つデータが貯蔵されたならば、次の事象の検出のために、モニタリングを再開す る。減衰曲線の形を決定した後、検出された合計事象数の比を乗じ、ヒストグラ ムからなる合計事象数で除することによって、正しい強度を決定できる。好まし くは、暗電流を測定し、該比を決定する前に、合計カウントおよびヒストグラム カウントから減じる。この技術は、ダンドライカー（Ｄａｎｄｌｉｋｅｒ）らの 米国特許第４．８７７．９６５号のデータ解析技術を直接適用できるヒストグラ ムの直接的発生を可能とする。

本発明のもう１つの態様において、改良された感度は、励起パルス後直ちに受容 されたデータを無視することによって達成される。１の具体例において、データ 獲得ウィンドウを、最初の過渡事象が終わった後の時点で始まるように設定する 。もう１つの具体例において、データは獲得されるが、データ解析の間には使用 されない。

従って、大いに促進された感度を有する改良されたフルオロメーターを提供する のが本発明の主目的である。本発明のさらにもう１つの目的は、しばしば数秒以 内の、迅速で正確な測定を実現できるフルオロメーターを提供することにある。

本発明のさらにもう１つの目的は、極端に低濃度の蛍光性物質を測定できるシス テムを提供することにある。

本発明の目的は、比較的コンパクトで、比較的低コストであって比較的厳格であ る点で、臨床にて有用なフルオロメーターを提供することにある。

本発明のさらなる目的は、新しい世代のより長波長の蛍光性染料を開発するのに 特に適したフルオロメーターを提供することにある。

図面の簡単な説明 第１図は、時間ゲート過渡状態蛍光減衰測定システムの概略を示す。

第２図は、時間ゲートシステムのブロックダイアグラムを示す。

第３図は、時間ゲートシステムの態様についての代表的なタイミングダイアグラ ムを示す。

第４図は、時間ゲートシステムのための検出器印刷回路ボードについてのブロッ クダイアグラムの詳細を示す。

第５図は、時間ゲートシステムにおけるレーザ印刷回路ボードについてのブロッ クダイアグラムの詳細を示す。

す。

第７図は、事象の受容の時間の検出についてのフルオロメーターシステムの概略 図を示す。

第８図は、検出システムの時間についてのデータ獲得プロセッサーボードのブロ ックダイアグラムの詳細を示す。

第９図は、検出システムの時間についてのタイミングダイアグラムを示す。

第１０図は、検出システムの時間のレーザーＰＣＢについての詳細なブロックダ イアグラムを示す。

第１１図は、検出システムの時間についての検出器印刷回路ボードの詳細なブロ ックダイアグラムを示す。

第１２図は、検出システムの時間についての検出システムの操作のフローチャー トである。

第１３図は、検出システムの時間を利用する感度および直線性を示すグラフであ り、ノボキシンプローブ濃度の対数値の関数としての、計数強度の対数値を示す 。　゛ 第１４図は、検出システムの時間を利用するジゴキシン血清アッセイを示すグラ フであり、散乱および蛍光曲線についての生データを示し、時間ビン数に対し、 １０００単位で表した強度（カウント７秒）を示す。

第１５図は、検出システムの時間についての１００万単位で表した高速カウンタ （カウント／１０秒）に対して、１０００単位で表したタイミングシステムカウ ンタ（カウント７１０秒）のグラフを示す。

第１６図は、検出システムの時間についての生カウントおよび正規化したカウン トのグラフを示し、プローブ濃度（ＩＸＩＯ−”リットル当たりのモル）に対し て、１００万単位で表した強度を示す。

第１７図は、ジゴキシン濃度に対する過渡状態偏光のグラフを示す。

詳細な記載 本発明によると、時間の関数としての蛍光強度は迅速かつ正確に測定され得る。

該システムは、時間の関数としての合計強度を測定するか、あるいは時間の関数 としての信号の種々の偏光成分の強度を測定するよう設計できる。さらに、定常 状態および過渡状態分析共に可能である。しかしながら、好ましい具体例におい て、過渡状態蛍光は定常状態蛍光よりも優先的にモニタされる。過渡状態蛍光測 定は、散乱バンドおよび速量光放出体からの寄与を減じる傾向にある。

一般的に言えば、本発明のシステムは、試料の表面または内部に向けられるべき 励起放射源、および試料からの蛍光を測定するための検出系からなる。当業者に よく知られたように、フィルタおよび偏光子のごとき通常のオプティックスを本 発明のシステムと組み合わせて使用することができる。

励起放射源は、比較的高出力であって、比較的高繰返し速度で操作できることに よって特徴付けられる。レーザダイオードはこの両要件に適合する。一般に、通 常の閃光ランプフルオロメーターよりおおざっばに言って１０００倍高出力の１ ００ミリワツトの範囲までの出力を持つ通常のレーザダイオードを利用できる。

かかるデバイスの出力レベルは増大し続けると期待される。さらに、通常のレー ザダイオードは１０ＭＨｚ範囲またはそれ以上にて容易に操作でき、閃光ランプ システムおよびレーザシステムと比較して、１’ＯＯＯ倍を超える繰返し速度の 増加を提供する。現在、レーザダイオードは、いずれの数の離散的出力波長にて も利用でき、これは商業的に入手可能な蛍光染料に匹敵する。例えば、６７０ｎ ｍ。

６８５ｎｍ、７２０ｎｍ、７５０ｎｍおよび７８０ｎｍの波長を有するレーザダ イオードが利用できる。これらの範囲の蛍光性染料は、前記にて出典明示して本 明細書の一部とみなしたアレニウス（Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ）およびダンドライカ ー（［１Ｂｎｄｌｉｋｅｒ）およびシュー（Ｂｓｕ）の出願、および出典明示し て本明細書の一部とみなす、本出願と同日に出願された「凝集および血清結合の 無い蛍光染料を用いる蛍光イムノアッセイ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｉｍｍ ｕｎｏａｓｓａｙｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ＤｙｅｓＦｒｅｅ 　ｏｆ　Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｓｅｒｕｍ　Ｂｉｎｄｉｎｇ）Ｊに 提供されている技術に従つて製造される。一般に、これらの染料はケージド・ジ カルボキシシリコンフトシアニン（ｃａｇｅｄ　ｄｉｃａｒｂｏｘｙ　５ｏｌｉ ｃｏｎ　ｐｈｔｈｏｃｙａｎｉｎｅ）をいい、ジゴキシンプローブを用いる場合 、ケージド・ジカルボキシシリコンフトシアニンージゴキシゲニンをいう。

さらに、それらの出力を増大させるために、レーザダイオードをオーバーライド させることも可能であるが、それらをオーバーヒートさせて該ダイオードを損傷 させないものとする。さらに、本発明と組み合わせて、チューナプルレーザダイ オードを用いることもできる。例えば、量子井戸ダイオードは出力波長のチュー ニング性を与える。

一般に、当該検出システムは、単一の光量子事象の検出を可能とする。高バンド 幅デバイスが商業的に入手可能であり、検出された事象をモニタするのに使用さ れる。後記する特別の具体例は、本明細書中に記載する検出方法と組み合わせて 有利であることが判明した。重要なことには、超高速事象は、かなり低い操作ス ピードの検出エレクトロニクスでもって測定できる。

本発明の重要な態様は、バックグラウンド事象によって比較的影響されない試料 についての蛍光測定を行うことである。極端に一時的な事象を考慮から排除する ことによって、所望の蛍光信号の検出において重要な改良がなされ得る。後記す る実験結果セクションに詳細に記載するごとく、通常の方法のほぼ１００倍の改 良が達成される。この排除はいずれの方法で行うものであってもよい。例えば、 極端に一時的な事象が実質的に終わった後に開始するように時間ゲートを設定す ることにより、時間ゲート技術によって当該データを排除することができる。別 法として、該データを収集するが、データの解析の間には考慮しないとすること ができる。さらに、放射の偏光もモニタすることができ、それにより、データ解 析を可能とすることができる。該システムの感度における重要な改良が本発明の システムによって達成され得る。

総じて、解析の速度および感度における重要な改良が本発明のシステムによって 達成される。各々がほぼ１０００のオーダーだけ繰返し速度および励起パルスの 出力を増大させることによって、実質的改良が検出感度においてなされ、解析の ための時間を劇的に減少させる。検出は、従前は数時間かかっていたのを数秒間 でなすことができる。さらに、速検出エレクトロニクスの使用は、単一光量子事 象の計数を可能とし、なおさらにシステムの感度および精度を増大させる。

第１図は本発明の１の具体例の概略を示す。その開始時間またはその持続のいず れか、あるいは双方に関して、タイムウィンドウを変更することによって、発蛍 光団の減衰プロフィールが得られる。構造的には、主要構成要素は励起源、試料 ホールダ、関連オプティックス、および検出器からなる。例えば、コンピュータ によって、随意のプロセッシングおよびディスプレイの可能性が供される。

好ましい具体例においては、３つの主要な印刷回路ボード、レーザ駆動機ＰＣＢ ＩＯ１検出器ＰＣＢ１２、および主要ＰＣＢ１４がある。レーザ駆動機ＰＣＢ１ ０は、好ましくは、レーザダイオードおよびある種のオプティックスを含有する 。レーザ駆動機ＰＣＢＩＯは、好ましくは、ダイオードレーザの偏光の向きを変 更できるように回転可能とする。レーザ駆動機ＰＣＢＩＯ上のレーザダイオード （示さず）は、反応セル１６内に含有される物質の励起を引き起こすために該反 応セル１６に向けられる。蛍光放射は検出器ＰＣＢ１２によって検出される。

好ましくは、検出器は出力放射から直角の角度に配置する。主要ＰＣＢ１４はレ ーザ駆動機ＰＣＢＩＯおよび検出器ＰＣＢ１２に連結され、それとコンピュータ １８と連絡する。所望により、フィルタ２０、レンズ２２、および／または開口 ２４のごときオプティックスを光の経路内に置くことができる。当業者によく知 られたごと（、偏光子の種々の組合せを利用することができ、共に主要ＰＣＢＩ ４から制御される回転可能偏光子２６を含む。所望により、反応セル１６にはス タークー、最も好ましくは電磁タイプのスタークーを設けることもできる。

コンピュータ１８は、使用者が制御、プロセッシング、およびディスプレイ機能 についてのシステムと干渉できる１の方法を提供する。コンピュータ１８は、当 業者に知られているごとく、スタンド−アローン型であるか、あるいはその必要 な機能を別々の構成要素の集合として設置することもできる。第１図におけるコ ンピュータ１８は、時間の関数としての発蛍光団の過渡状態減衰の特徴的ディス プレイを備える。コンピュータ１８は、多数の機能を制御することができるが、 それは、レーザのオン−タイム、レーザ出力、レーザのオン−オフ制御、ＰＭＴ 高電圧設定点、ＰＭＴ電流検出閾値設定点、ＰＭＴのオン−オフ、検出ウィンド ウの開始の遅延、検出ウィンドウの終了の遅延、実験当たりのサイクル数、偏光 子の平行−垂直、スタークーのオン−オフ、およびレーザダイオードの操作温度 第２図は、主要ＰＣＢ１４の詳細なブロックダイアグラムを示す。マイクロプロ セッサ−３０はボードの操作を制御する。好ましい具体例において、マイクロプ ロセッサ−３０は８０Ｃ３２プロセツサーであり、メモリ３２は３２に）くイト のＲＯＭおよび３２にバイトのＲＡＭである。所望により、Ｒ３２３２ボートの ごときインターフェース３４により、ディスプレイ３６用のコンピュータへの接 続を可能とすることもできる。直接的には示さないが、マイクロプロセッサー３ Ｏは、高電圧出力供給制御、閾値コンパレーター電圧制御、および偏光子モータ ーを供する。該偏光子モーター（示さず）は、偏光子を回転させて、種々の偏光 の向きの検出を可能とするために供される。

励起源はレーザおよびオプティックスブロック４０によって供される。励起光は 試料４２を照射し、蛍光放射はオプティックスおよび偏光子４４を通過して検出 器４６に至る。

操作では、マイクロプロセッサ−３０はタイマ／マスタカウンタ５０をセットし て、レーザ４０についてオンタイムを設定し、レーザオフカウンター５２をセッ トしてレーザ４０をオフとする時間を決定する。さらに、マイクロプロセッサ− ３０は、ウィンドウオーブンカウンタ５４をセットしてデータ獲得ウィンドウの 開口に対応させ、ウィンドウクローズドカウンタ５６をセットしてデータ獲得ウ ィンドウの閉鎖に対応させる。ゲート５８は検出器４６の出力を受容し、データ 獲得ウィンドウの間にそれを該カウンタ６０へと通過させる。ゲート５８につい ての制御は、ウィンドウオーブンカウンタ５４から到来し、それは検出器４６か らのパルスの、該カウンタ６０、およびゲート５８を閉じるウィンドウクローズ ドカウンタ５６への通過を可能とし、検出器４６からカウンタ６０へ通過するデ ータを排除する。後のプロセッシング、解析、およびディスプレイのため、マイ クロプロセッサ−３０の制御下に、カウンタ６０におけるカウント値をメモリ３ ２に移す。

第３図は、第２図の回路の一般的タイミング態様を示す。システムクロック６２ は、全体としてのシステムの同調および制御を供する。システムクロック振動１ ００ｎｓであり、最大５０ｎｓの周期を与える。レーザパルスの持続は、タイマ ／マスタカウンタ５０およびレーザオフカウンター５２によって制御される。

好ましくは、システムクロソク６２の立ち上がりはレーザパルス６４の発生をト リガする。レーザパルスの立ち下がりは、レーザオフカウンター５２に設定され た時間によって決定される。第３図の波形６６は、レーザオフカウンター状態を 示し、レーザパルス６４を終了させるべき場合は低く変化させる。ウィンドウオ ーブンカウンタパルス６８は、データ獲得ウィンドウ７２の開始まで一定時間作 動させる。ウィンドウクローズドカウンタパルス７０はウィンドウオーブンカウ ンタパルス６８よりも長く作動させ、ウィンドウクローズドカウンタパルス７０ の立ち下がりはデータ獲得ウィンドウパルス７２の立ち下がりを決定する。デー タ獲得ウィンドウパルス７２は、データが検出器４６（第２図）からカウンタ６ ０に供給される時間周期を決定する。複合蛍光信号７４は、最初の定常状態部分 ７６、続いての強度減衰部分７８を有する。現実には、いずれの所与の単一レー ザパルスについても、光量子はいずれのデータ獲得ウィンドウについても検出さ れないというのでないよりもあり得る。従って、蛍光信号７４は、多数のレーザ パルスが種々のデータ獲得ウィンドウ時間内に発っせられた後は、事象の編集と なろう。

第４図は、検出器ＰＣＢ１２の詳細を示す。好ましくは、単一の光量子事象を検 出できる検出エレクトロニクスを用いる。好ましい具体例において、光電子増倍 管（ｒＰＭＴＪ）８０は、試料（示さず）からの蛍光を検出する向きとする。

最適には、ＰＭＴ８０は、低い暗電流および１００ＭＨｚのごとき高いバンド幅 を有する。高電圧出力供給８２は、ＰＭＴ８０へ出力を供給する。主要ＰＣＢＩ ４（第２図に示す）からの高電圧出力供給制御信号８４は、出力供給８２からＰ ＭＴ８０への高電圧供給値を決定する。ＰＭＴ８０の出力は、要すれば、増幅す る。好ましくは、コンパレータ８８は、所望のパルス振幅の選択を可能とし、増 幅器８６におけるオフセットを補償する。コンパレータ８８は、好ましくは、８ ８の出力はゲート５８を介してカウンタ６０（第２図）に至る。好ましくは、主 要ＰＣＢ１４から検出器ＰＣＢ１２へのケーブル接合は、その長さが１２インチ 未満に保たれた６５オームの保護されたリボンケーブルである。

第５図は、レーザＰＣＢＩＯの詳細を示す。レーザダイオード９０は、好ましく は、ビームコリメータ９５に収容され、レーザＰＣＢＩＯに直接取り付けられる 。便宜には、ソケットアセンブリを用いてレーザダイオードの交換を容易とする ことができる。好ましくは、コリメータアセンブリ９２およびレーザダイオード ９０は、さらに、乾燥剤（示さず）を入れた密封した区画９４に収容される。

温度制御回路９６は、サーミスタ９８を介してレーザダイオード９０の温度をモ ニタする。ヒータ１００は、レーザダイオード９０を加熱するために温度コント ロール９６によって制御される。（第２図からの）温度設定点コントロールは、 温度コントロール９６が調節する温度を決定する。レーザダイオード９０の温度 を変化させることによって、ダイオードの放出波長のチューニングを行うことが できる。一般には、波長は１度摂氏当たり０．３ナノメーターシフトする。温度 を変化させることによって、レーザ波長は、個々の蛍光性染料について最も有利 な波長へ変化させることができる。通常、個々のレーザダイオードおよび所望の 波長に応じて、レーザは２５℃から５０℃で作動させる。しかしながら、所望に より、通常の冷蔵技術を用いてレーザを冷却することもできる。レーザダイオー ド駆動機１０２は、レーザダイオード９０への駆動出力を供する。レーザダイオ ード駆動機１０２への制御入力は、レーザオンオフ制御およびレーザ出力レベル 設定を含み、その両者共に主要ＰＣＢ１４から到来する。典型的には、レーザダ イオード９０はｌＱＭＨｚのパルス繰返し速度および平均定格出力のほぼ６ない し７倍のピーク出力にて作動させる。ピークベースに基づく定格出力を超えるこ とも可能である。何故ならば、レーザーパルスは短くて、通常の失敗のメカニズ ム、熱ミラーの失敗は、平均出力が典型的な連続作動出力未満であるので起こら ないからである。

第６図は、全操作についてのフローチャートを示す。マイクロプロセッサ−３０ はレーザのオンタイム１０４およびレーザのオフタイム１０６を設定する。デー タ獲得ウィンドウの開始への遅延時間は、マイクロプロセッサ−３０によって設 定され、出発減衰１０８として標識される。一旦データ獲得ウィンドーが開かれ たならば、マイクロプロセッサ−３０によって設定された閾値レベルを超えるパ ルスがステップ１１０にてカウントされる。これらの事象はカウント１１２とし て合計される。データ獲得についての時間が終了していないと、決定ブロック１ １４がサイクルの再度の開始を指示し、もう１つのレーザパルスおよびカウンテ ィングの開始を引き起こす。該決定ブロック１１４がデータ獲得時間が完了した ことを示すと、結果は、コンピュータまたは他のデータ処理デバイスに提供され る。

データ獲得ウィンドウの位置を変更することによって、時間の関数としての強度 のヒストグラムを編集することができる。所望により、好ましくは、ダンドライ カー（Ｄａｎｄｌｉｋｅｒ）の米国特許第４．８７７．９６５号のデータ収集お よび解析技術を用いてデータの質をさらに改良することもできる。

システムのタイミング分解能を正確に望むように設定することができる。好まし い具体例において、４００ピコ秒のタイミング分解能を選択し“Ｃ２ナノ秒もの 短い蛍光減衰時間の正確な形成を可能とすることができた。従って、データ獲得 ウィンドウはタイミング分解能値の倍数として採られる。

第７図は、光量子の検出の時間を決定するように設計した本発明のフルオロメー ターのシステム幅の図である。検出サイクルの多数の反復の後、時間の関数とし ての事象の数のヒストグラムを得る。好ましい具体例において、７５ナノ秒を超 える１、０２４の時間ビンまたは間隔の結果、７５ピコ秒のビン幅となる。レー ザＰＣＢおよび入力オプティックスボード１２０は、レーザビームを反応セル１ ２４へ向ける。反応セル１２４からの蛍光は検出器ＰＣＢ１．２６によつて検出 され、その入力は増幅器ＰＣＢ１３０によって増幅され、その信号はコンパレー タＰＣＢ１３２に供給され、最終結果はデータ獲得ＰＣＢ１２８に供給される。

データ獲得ＰＣＢ１２８からの結果は、コンピュータ１３４または他の機能が同 様のデータ処理デバイスに供給することができる。所望により、インターフェー スＰＣＢ１３６はデータ獲得ＰＣＢ１２８とレーザＰＣＢ１２０との間の接合に 供する。さらに、熱コントロールＰＣＢ１３８はレーザダイオードの温度をモニ タし、制御する（示さず）。加えて、当業者に公知のごと（、かつ前記した具体 例に関連して述べたごとく、光学フィルタ１４０、偏光子１４２、レンズ１４４ 、および開口１４６を用いることができる。

操作において、レーザＰＣＢ１２０は反応セル１２４へのレーザパルス列を供す る。検出器ＰＣＢ１２６は、もしあれば、フォトンの受容を検出し、増幅器ＰＣ Ｂ１３０によって増幅された後、コンパレータＰＣＢ１３２につき設定されたレ ベルを超える信号については、事象はデータ獲得ＰＣＢ１２８によって検出され ると考えられる。一般的に言えば、次いで、事象の検出は２つの方法で用いられ る。第１に、事象の合計数の実行カウントは注目する時間周期の間になされる。

好ましい具体例において、注目する時間周期は、検出周期の間連続して実行され る。第２に、事象の検出は事象が起こった時間を決定するのに用いられる。

本明細書にて利用する装置および方法をより詳細に理解するために、第８図およ び第９図を参照されたい。マイクロプロセッサ−１４０およびメモリ４２はデー タ獲得ＰＣＢ１２８に基づいて作動してシステムを制御する。好ましくは、Ｒ８ ２３２ボートのごときインターフェース１４４は、コンピュータ１４６または他 のデータ処理デバイスまたはディスプレイデバイスとの連結を可能とする。マイ クロプロセッサ−１４０は、典型的にはデジタルからアナログへのコンバータ１ ５０を介して、偏光子コントロール１２８に対する制御、ＰＭＴ高電圧制御、お よびＴＣＯＮＴ信号のごとき多数の制御信号を供する。

総括クロック信号１５２は、好ましくは、ｌＱＭＨｚのオーダのものとする。

これは、１００ナノ秒のサイクル時間を提供する。タイミング回路１５４はレー ザ駆動パルス１５６を発生し、これは、形状１６０を有するレーザパルスの発生 を引き起こす。さらに、タイミング回路１５４は遅延回路１５６の活性化を引き 起こし、これは、所定の遅延の後、ランプ発生器１５８を活性化する。ランプ電 圧１６２は一定時間の遅延で始まり（第９図参照）、次いで、ランプ部分を開始 させる。好ましい具体例において、遅延時間は２５ナノ秒である。検出事象信号 １６４の受容に際し、ランプ電圧１６２の値はフリップ−フロップ１６６による ごとくにラッチされる。ランプ発生器１５８からの電圧のラッチされた値はアナ ログからデジタルへのコンバータ１６８で変換され、メモリ１４２での貯蔵のた めにマイクロプロセッサ−１４０に提供される。加えて、検出事象信号１６４は カウンタ１７０に提供され、これはすべての検出された事象のカウント実行を維 持する。

好ましい具体例において、いずれのサイクルにて検出されたかに拘わらず、カウ ンタ１７０は検出されたすべての事象をカウントする。特に、カウンタ１７０は 、暗電流周期の間、レーザパルス時間の間、または過渡状態蛍光周期の問いずれ かに拘わらず、検出された事象をカウントする。別法として、カウンタ１７０は 所望の時間の間でのみ活性化でき、例えば、暗電流時間の間は活性化されない。

操作において、検出された事象１６４がデータ獲得ＰＣＢ１２８によって受容さ れると（第８図）、検出事象の時間を測定し、それを処理し、それを蓄えるのに ある量の時間を要する。このプロセスを続けつつ、時間検出システムは、従前に 受容された光量子時間が完了するまで新しい光量子または事象を無視する。選択 した個々のハードウェアに応じて、新しい光量子が無視される間の時間は３０マ イクロ秒のオーダーとできる。もしクロック振動数がｌＱＭＨｚである゛と、は ぼ３００のレーザパルスが無視される。一般に、これは最高濃度の発蛍光団を除 いたすべてにおいて重要でない。通常の濃度において、ＰＭＴからの光量子事象 の典型的な入力速度は１秒当たりほぼ１０，０００である。従って、光量子はお おざっばに言って毎１，０００パルスごとに検出される。より高濃度の発蛍光団 については、パルス速度は大きさのオーダーによって増大させ得る。直線性を維 持するためには、レーザダイオードピーク出力を低下させるか、あるいは開口を 検出経路中にに置くことができる。別法として、より大きいパルス速度について は、カウンター１７０は、検出される事象のタイミングとは独立して、すべての 検出された事象をモニタする。

この方法を通じて、ヒストグラムの形状を、非常に多数の試料についての検出事 象の時間を測定することによって決定できる。しかしながら、ある事象はプロセ ッシング時間の間は無視できるので、カウンタ１７０は、時間の関数としての与 える。好ましい方法において、暗電流信号レベル（レーザパルスまたは蛍光減衰 が無い場合にさえ存在する電流または検出事象のレベル）を検出する。次に、暗 電流の値を、各ビンにおけるカウントの合計数から差し引く。このようにして、 その時間ビンの間に起こる検出事象の数の真実の測定を設定する。次に、時間ビ ンにおけるカウントの合計数を合わせて、検出事象の合計数の測定が得られる。

次に、カウンタ１７０によりカウントされた事象およびビンカウント（暗電流未 満）のすべてを統合することによって見い出された事象の数の比を各ビンの値に 乗する。このようにして、カウンタ１７０によって貯蔵された検出事象によって 示されるごとく、解析の開に起ったが、（恐らくは、事象が処理されつつあった のに）ランプ電圧１６２からの値のサンプリングによりて検出されたヒストグラ ムの一部を形成しなかった事象について補償がなされる。

すべての時間ビンについての事象の検出に等しい重みを与えることが必要である 。もしシステムが１ノ−ザバルスの後に最初に検出された事象を常に記録するな らば、不釣合な数の事象がヒストグラムに初期に検出され、それにより、ヒスト グラムの結果をゆがめてしまう。ヒストグラムにおけるかかる歪みを回避する１ の方法は、検出につきランダム開始時間を採用することである。好ましい具体例 において、この時間は、それまでの事象の貯蔵に直接的に続いてのいずれかの時 間に対するランプ電圧１６０を測定する能力を再度可能ならしめることによって 測定できる。このようにして、休止時間は発生せず、データの獲得および貯蔵の ための比較的長い周期が与えられたならば、引き続いて検出された事象について のモニターリングの再開の正確な時間は実質的にランダムである。

レーザｐｃＢ１２０についての詳細なブロックダイアダラムは第１０図に示す。

レーザＰＣＢ１２０はデータ獲得プロセッサーボード（第８図）からレーザ駆動 パルス１５８を採り、レーザ光パルスを発生する。好ましい具体例において、パ ルスの持続は数ナノ秒のオーダーであり、比較的高出力である。レーザ駆動パル ス１５８における次の上昇端はレーザフラッノユの発生を引き起こす。入力ロジ ック１７０．１７４、“および１７６は、非常にシャープな上昇端を発生させ、 これは高出力デジタル駆動機１７８に供給される。デジタル駆動機１７８はレー ザダイオード１７８にパワーを供給する。レーザダイオード１８０によって使用 される電流は、データ獲得ＰＣＢからの信号Ｉ　Ｃ０ＮＴによって設定される（ 第８図）。

レーザパルスの持続は遅延１７２を変更することによって変えることができる。

さらに、レーザパルスの振幅は電流値ＩＣ０ＮＴを設定することによって変更さ れる。参照ダイオード１８２はレーザ出力の長期安定性をモニタする。好ましく は、参照ダイオード１８２はレーザビームが通過するオプティックスおよびフィ ルタの下流に位置させる。このようにして、試料に向けられる合計入力をモニタ することができる。合計入力に影響する種々の因子は、レーザの性能または質低 下、光学構成要素のクリーンさまたはレーザフィルタの質低下を包含する。光電 流モニタ１８４はレーザダイオード１８０の光電流をモニタする。パルスの長さ および繰返し速度は分かりているので、レーザダイオード１８０によって発生さ れるべき平均出力は計算できる。この出力の読み、標識されたＶＭＯＮはデータ 獲得ＰＣＢにフィードバックされる（第８図）。

加えて、随意のヒータ１８６ならびにサーミスタおよび温度制御１８８は、レー ザダイオード１８０に対する温度制御を供する。温度設定点はデータ獲得ＰＣＢ からヒータ１８６および制御１８８に供給される。第１の具体例に関連して記載 したごとく、温度を変化させると、レーザダイオード１８０の波長を変化さゼる 。

検出器ＰＣＢ１２６は第１１図に詳細に記載する。光電子増倍管１９０は試料か らの蛍光放射を受容する。増幅器１９６としてのＰＭＴ高電圧制御信号１９４の 制御下、高電圧発生器１９２はＰＭＴ１９０に対して高電圧を供する。ＰＭＴ１ ９０の出力は増幅器１９２を通過し、コンパレータ１９４を通って送られる。

もし検出され増幅された値が参照値を超えると、コンパレータは該信号をデータ 獲得ＰＣＢへの出力として通過させる。好ましくは、微分シグナルを与えるデュ アル共軸ケーブルによって、増幅器１９２はコンパレータ１９４に接続する。コ ンパレータ１９４は同様に共軸ケーブルを介してデータ獲得ＰＣＢに接続される 。

第１２図は、操作の好ましい方法についてのフローチャートを示す。初期化相子 （ｒＬｃＰＪ）サイクル、およびＬＣＰを平行して設定する。次に、データ獲得 は２０２をスタートさせる。レーザパルス２０４および遅延２０６の後、ランプ ２０８が開始する。光量子が検出されたならば（２１０）、ランプ電圧は凍結さ れ（２１２）、高さを測定し、デジタルに変換する（２１４）。該データは適当 なビンを更新する（２１６）。データ獲得時間決定が許容される時間を超えると （２１８）、ハードウェアカウンタは停止する。データ獲得時間がそのままであ ると、レーザパルス列が再度開始される。データ獲得時間が完了すると、カウン タからのデータが貯蔵される（２２０）。所望により、偏光子を代わりに他の向 きに変更することもできる（２２２）。

実験結果 本明細書に記載したデバイスおよび方法を、多数の系、特に生物学的系からの蛍 光測定で用いた。本明細書で報告するデータは、検出システムの時間にて得られ たものである。

アレニウス（Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ）およびダンドライカー（Ｄａｎｄｌｉｋｅｒ ）およびンユー（Ｈｓｕ）に対する同時係属出願に記載されている蛍光性染料と 組み合わせて用いた場合、本明細書に記載したフルオロメトリーシステムは、通 常の技術の１００倍を超える信号検出の改良となる。以下の表は、所望の信号の 強度がバックグラウンドの強度と等しくなる時点における染料の検出可能な濃度 レベルをリストする。

使用した緩衝液は１％のウソ血清アルブミンを含有する。データは以下の通りで ある。

第１表 鼠邑　ヨ　！！ ４９０ｎｍ　定常状態　１．５Ｘ１０−’６８５ｎｍ　定常状態　２．２ｘ１０ −＋。

６８５ｎｍ　過渡状態　１．１　ｘ　】、　０−＋＋長波長を持つ染料を選択す ることによって、および本明細書に記載した時間ゲートおよび検出の時間の技術 を利用することによって、検出シグナル強度における重要な改良が達成される。

直線性に関し、第１３図はジゴキンンプローブ濃度の関数としての強度のｌｏｇ −１ｏｇプロットを示す。結果は、システムが４桁の大きさにわたって直線性で あることを示す。さらに、１リツトル当たりほぼ１ｏ−１３モルもの低い濃度が 検出され得る。正確なシステムはかかる直線性応答を有するはずである。という のは、蛍光性物質の濃度が減少するにつれ、検出されるカウント数の対応する直 線的減少があるはずだからである。

試料からの現実のデータを第１４図に示す。強度（１００秒当りのカウント数） を１０００単位にてｙ軸に示す。Ｘ軸は時間ビン数を示し、各ビンは７５ピコ秒 間隔に対応する。散乱曲線は蛍光曲線のピークの左側にわずかにピークを持つ。

暗電流カウントは、一般に、ビン数２００からビン数的３００の時間の内に示さ れる。時間の関数としての蛍光曲線の減衰は、ダンドライカー（Ｄａｎｄｌｉｋ ｅｒ）らの米国特許第４．８７７．９６５号に開示されているごときデータ解析 技術を組み合わせて用いることができるヒストグラムを与える。

前記にて詳細に記載したごと（、検出システムの時間は、強度曲線の形状を正確 に描き、従ってその形状が時間の関数としての強度の絶対的測定を与えるヒスト グラムを形成する。好ましい具体例において、用いる方法は、高速））−ドウエ アカウンタでカウントの合計数をモニタすること、およびそれらのカウントを統 合することによって形状ヒストグラムからなるカウントの合計数を決定すること である。次いで、ヒストグラム形状曲線に、合計統合カウントに対する／Ｘ−ド ウエアカウントの比を乗じる。第１５図は高速カウンタのカウントの関数として の統合したタイミングシステムのカウントを示す。１秒当たり最大３３．０００ のカウントをタイミングシステムカウンタによって検出することができる。しか しながら、これは、選択された特別の７％−ドウエアの関数である。当業者がデ ザインを選択できるごと（、専用のプロセッサーまたはより速いブロモ・ンサー を選択するならば、事象の受容の時間を貯蔵するのに必要な時間が減少し、従っ て、１秒当たりのカウント数を増大させることができる。

第１６図は、２つの曲線につき、（リットルｘ　ｌ　Ｑ　Ｉ　Ｏ当たりのモルで 表した）プローブ濃度の関数としての（１００万単位での）強度を示す。上側の 曲線は正規化したカウントを示し、下側の曲線は生のカウントを示す。前記した 技術の使用を通じて、生のカウントを正規化したカウントに変換し、それにより 、プローブ濃度の関数としての強度の直線性を得ることができる。

受容システムの時間において、ハードウェアカウンタ補償と組み合わせたレーザ ーダイオードの高繰返し速度は、最良に有用なデータを与えた。好ましくは、光 量子のフラックスは比較的低い。光量子フラックスが比較的低いと、２つの光量 子が同時にＰＭＴにヒツトする確率は実質的に減少し、それにより、システムの 非直線性は回避される。発蛍光団の濃度が減少するに従い、レーザ出力および／ または繰返し速度は速度データ獲得まで増大させることができる。

第１７図は、過渡状態偏光一対一ジゴキシン濃度のグラフを示す。

既知レベルのジゴキシンを含有する２０マイクロリツトルの試料を、１００マイ クロリツトルの緩衝液中、２５マイクロリツトルのウサギ抗ジゴキシン抗体と共 に５分間インキュベートした。次いで、蛍光標識したジゴキシンプローブ２０マ イクロリツトル（濃度５Ｘ１０”Ｍ）を添加し、゛さらに５分間インキュベート した。最終的に、溶液を緩衝液１ミリリツトルで希釈した。次いで、蛍光信号を 検出ハードウェア装置の時間を用いて読み取った。

特別の好ましい具体例に関連して本発明を記載してきたが、多くの変形および修 飾は当業者に直ちに明らかであろう。従って、添付の請求の範囲は、多くのかか る変形および修飾を含むように、先行技術を考慮して、できる限り広く解釈され るべきである。

コンピュータ ＦＩＧ、２゜ ＦＩＧ、３゜ システム＃１ ＦＩＧ、９゜ 検出器ＰＣＢ （ＯＧ　＋　ジゴキンンブロー・ブ濃度　（モル几））ＦＩＧ、１３゜ 光学系＃２からの生データ タイミング比較 ２００　４００　ＥＥ　７ｍ ビンｌｆ　（７５１ｄピノ） 十散乱　◇ジゴキシンプローブ ＦＩＧ、１４゜ （１００万単位） 高速カウンタ（カワ２８フ１０秒間ジ ＦＩＧ、１５゜ ＋　３　５　７　９　Ｉ＋　１３　１５プローブＪ匿　（モル／Ｌ　＝　ＩＥＩ ＯＩ＋　正規化カウント　島　生カウント ＦＩＧ、１６゜ ジゴキシンアッセイ検量線 ジゴキシン１度　（ｎｇ／ｍＬ］ ＦＩＧ、１７゜

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．試料を励起するためのレーザダイオード、蛍光放出を受容するように位置さ せた検出器、および蛍光放出の受容の時間を測定するための手段よりなり、ここ に、該手段はランプ発生器を包含することを特徴とする発蛍光団を包含する試料 を励起し、該試料からの蛍光放出を検出するためのフルオロメーター。
2. ２．蛍光放出の受容の時間を測定するための該手段がさらに該ランプをサンプリ ングするための手段を包含する請求の範囲第１項記載のフルオロメーター。
3. ３．さらに、検出器の出力を受容するために作動可能に連結したカウンタを包含 する請求の範囲第１項記載のフルオロメーター。
4. ４．放射のパルスで発蛍光団を励起し、次いで、減衰蛍光およびバックグラウン ドを時間の関数としておよび偏光の関数として検出する工程を使用する過渡状態 フルオロメトリーシステムにおいてバックグラウンドからの改良された蛍光信号 を得る方法であって、放射のパルスの間およびその直後において起こる減衰蛍光 およびバックグラウンドを無視する工程を付加することを含む改良。
5. ５．減衰蛍光およびバックグラウンドを無視する該工程が、放射のパルス直後の 減衰蛍光およびバックグラウンドを排除するための時間ゲートの工程を含む請求 の範囲第４項記載の方法。
6. ６．減衰蛍光およびバックグラウンドを無視する該工程が、放射のパルスの直後 に起こる減衰蛍光およびバックグラウンドを得るが、それを用いない請求の範囲 第４項記載の方法。
7. ７．蛍光の事象を検出し、 検出した事象の合計数をカウントし、 ヒストグラムの形状の予備ヒストグラムを決定し、該予備ヒストグラムからなる 事象の数をカウントし、次いで、該予備ヒストグラムに、事象の合計数のカウン トおよび該予備ヒストグラムからなる事象の数のカウントの比を乗じる工程から なることを特徴とする過渡状態蛍光測定についての時間の関数として強度のヒス トグラムを発生させる方法。
8. ８．さらに、暗電流を測定し、カウンティングおよび乗じる工程に先立って、予 備ヒストグラムから暗電流の寄与を減じる工程を含む請求の範囲第７項記載の方 法。
9. ９．ａ）検出された事象をモニタし、 ｂ）事象に際し、検出された事象の発生の時間を測定し、ｃ）工程ｂで測定した 時間を貯蔵し、工程ｂの目的のために、この工程を行うことなく、他の検出され た事象を無視し、ｄ）工程ｃの完了に際し、工程ｃの完了後の時点で工程ａにお いてモニタリングを再度行い、 ｅ）工程ｃで貯蔵した時間を用いてヒストグラムを発生させる工程よりなること を特徴とする過渡態フルオロメトリーシステムにおいて検出された事象のヒスト グラムを発生させる方法。
10. １０．工程ｄにおいて、工程ａにおけるモニタリングを工程ｃの完了後直ちに測 定する請求の範囲第９項記載の方法。
11. １１．工程ｂにおいて、事象の時間の発生の測定をランプ電圧をサンプリングす ることによって行う請求の範囲第９項記載の方法。
12. １２．ランプ電圧をサンプリングした後に、該重圧をデジタル表示に変換する請 求の範囲第１１項記載の方法。
13. １３．工程ｃの完了後の該時間がランダム時間である請求の範囲第９項記載の方 法。
14. １４．１秒当たり１０，１１１サイクルを超えてパルス発生できるレーザ、ケー ジド・ジカルボキシシリコンフトシアニン染料を包含する試料を受容するのに適 したホールダー、および 該試料からの蛍光放出を受容するように位置させた検出器よりなるフルオロメト リーシステム。
15. １５．該レーザがレーザダイオードである請求の範囲第１４項記載のフルオロメ トリーシステム。
16. １６．さらに、蛍光放出の受容の時間を測定するための手段を包含する請求の範 囲第１４項記載のフルオロメトリーシステム。
17. １７．さらに、時間ゲート発生器を包含する請求の範囲第１４項記載のフルオロ メトリーシステム。
18. １８．該染料がケージド・ジカルボキシシリコンフトシアニン−ジゴキシゲニン である請求の範囲第１４項記載のフルオロメトリーシステム。
19. １９．試料を励起するためのレーザダイオード、蛍光放出を受容するように位置 させた検出器、蛍光放出の受容の時間を測定するための手段、および該検出器の 出力を受容するように作動可能に連結したカウンタよりなることを特徴とする発 蛍光団を包含する試料を励起し、該試料からの蛍光放出を検出するためのフルオ ロメーター。
20. ２０．さらに、時間ゲート発生器を包含する請求の範囲第１９項記載のフルオロ メトリーシステム。
21. ２１．該時間ゲート発生器が検出器の出力をゲートする請求の範囲第２０項記載 のフルオロメトリーシステム。
22. ２２．さらに、検出器の出力を入力として受容し、時間ゲート発生器の出力によ って制御されるゲートを包含する請求の範囲第２０項記載のフルオロメトリーシ ステム。
23. ２３．該時間ゲート発生器がカウンタを包含する請求の範囲第２０項記載のフル オロメトリーシステム。
24. ２４．該時間ゲート発生器がウィンドウオープンカウンターおよびウィンドウク ローズドカウンタを包含する請求の範囲第２３項記載のフルオロメトリーシステ ム。
25. ２５．該検出器が光電子増倍管である請求の範囲第１９項記載のフルオロメトリ ーシステム。
26. ２６．該検出器が赤色感受性である請求の範囲第１９項記載のフルオロメーター 。
27. ２７．該検出器が赤外線感受性である請求の範囲第１９項記載のフルオロメータ ー。
28. ２８．該レーザダイオードが試料に対して回転可能である請求の範囲第１９項記 載のフルオロメーター。
29. ２９．該レーザダイオードが赤色ないし赤外線範囲で放射する請求の範囲第１９ 項記載のフルオロメーター。
30. ３０．該レーザダイオードが可変波長を有する請求の範囲第１９項記載のフルオ ロメーター。
31. ３１．さらに、温度変更デバイスを包含する請求の範囲第３０項記載のフルオロ メーター。
32. ３２．該レーザダイオードがチューナプルレーザダイオードである請求の範囲第 ３０項記載のフルオロメーター。
33. ３３．該レーザダイオードが量子井戸レーザダイオードである請求の範囲第３２ 項記載のフルオロメーター。
34. ３４．さらに、オプティックスを包含する請求の範囲第１９項記載のフルオロメ ーター。
35. ３５．さらに、ディスプレイを包含する請求の範囲第１９項記載のフルオロメー ター。
36. ３６．試料を励起させるためのレーザダイオード、蛍光放出を受容させるように 位置させた検出器、および蛍光放出の受容の時間を測定するための手段よりなり 、ここに、該手段がディスプレイ発生器を包含することを特徴とする発蛍光団を 包含する試料を励起し、該試料からの蛍光放出を検出するためのフルオロメータ ー。