JP2001509255A

JP2001509255A - 試料媒体にある標的粒子の所定の特性を決定するための方法および装置

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Publication number: JP2001509255A
Application number: JP52428198A
Authority: JP
Inventors: ザイデルクラウズ; ブランドレイフ; ガンゼールロルフ
Original assignee: マックス−プランク−ゲゼルシャフトツルフェルデルングデァヴィッセンシャフテンエー．フォオ．，ベルリン; エボテックバイオシステムズアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1996-11-27
Filing date: 1997-11-26
Publication date: 2001-07-10
Anticipated expiration: 2017-11-26
Also published as: EP0941466A2; EP0941466B1; DK0941466T3; ATE252729T1; WO1998023941A2; DE59710903D1; JP3830167B2; WO1998023941A3; US6137584A

Abstract

(57)【要約】蛍光相関分光分析法の応用分野を広げる方法または装置を提供する。前記装置は共焦光学構造体，パルス状のレーザー（２０）および時間相関した一光子計数の信号を測定する検出（８）および判定（２７）の要素を有する。検出した光子のそれぞれに対して、検出時間をマイクロ秒で記録し、また蛍光遅延時間をナノ秒で記録するようにしてデータを記録する。各検出した光子に関するこのような最大限の情報を用いて、時間相関した一光子計数により決定したパラメータを各検出した光子に割り当て、そこから発生した検出したパラメータに対しての相関関数を作る。次いでパラメータの相関関数または選択的な相関関数，例えば蛍光燃焼寿命の相関関数を得る。また、方法または装置を使用して、個々の分子を検出し個々の存在する粒子に割り当てられたそれらの信号区分のみの相関関数を計算することで、極めて希薄な溶液におけるＳ／Ｎ比を改善できる。

Description

【発明の詳細な説明】試料媒体にある標的粒子の所定の特性を決定するための方法および装置本発明は、請求項１の前文に記載の方法，請求項１５の前文に記載の方法および請求項１８の前文に記載の装置に関する。時間相関された一光子の計数は、多目的に使用可能な分光技術であって、これを用いると調査中の多数の粒子のパラメータを決定できる。これらの特性は、中でも、蛍光寿命または指数倍で崩壊する種々の蛍光寿命，回転拡散定数および運動変換率を含むものである。パルスを励起させ、時間相関された一光子計数に対して高度の時間分解を行うと、遅延した蛍光から遅延していない散乱した励起光を分離する有効な手段となる。この手段を用いて、望ましい信号（蛍光）を望ましくない雑音（遅延していない散乱光）から分離することができ、多くの応用において信号雑音比（Ｓ／Ｎ比）を大きくすることができる。他の特性、特に、標的粒子の拡散定数は、蛍光相関分光分析（ＦＣＳ）法を用いることで得ることができる。拡散定数が分かると、標的粒子の大きさやその粒子の他の大きい分子への結合に係る様々な情報が得られる。しかしながら、従来のＦＣＳ測定方法（国際公開第９４／１６３１３号を比較されたい）では、遅延していない散乱励起光と遅延した蛍光とを区別することができないため、Ｓ／Ｎ比は非常に小さいものとなる。両方の技術、すなわち、時間相関された一光子計数と蛍光相関分光分析は、蛍光粒子の極めて希薄な溶液、好ましくはサブナノモル範囲のものでの高感度の測定に適している。これらの技術を用いると、試料媒体にある個々の分子をも検出可能である（ツェー．ツァンデル等(C．Zander et al.)の「応用物理学Ｂ(Appli ed Physics B)」，第６３巻，第５１６〜５２３頁，１９９６年を比較されたい）。しかしながら、依然として個々の粒子から信号の自動相関関数を決定することは不可能である。前文に述べている種類の方法および装置に関しては、リチャードエー．ケラー等(Richard A Keller et al.)による「応用分光分析学(Applied Spectroscopy )」，第５０巻，第７号，１９９６年の第１２Ａ〜３２Ａ頁に記載されている。そこに記載されている装置を用いてデータを分析すると、時間相関された一光子計数もしくはＦＣＳのいずれかを判定の可能性として個別に使用することに限られてしまう。つまり、これらの技術の両方の利点は組み合わせて使用されないことになる。さらに、引用から公知の装置で用いる判定装置は、複雑かつ高価なＣＡＭＡＣフレームを用い、多経路スケーラ（ＭＣＳ）を必要とする。本発明の目的は、蛍光相関分光分析の使用可能性を広げることである。本発明によると、この問題は、請求項１の特徴を有する方法，請求項１５の特徴を有する方法および請求項１８の特徴を有する装置により解決される。試料媒体にある標的粒子の所定の特性を決定する本発明による方法の第１の実施例において、最初に試料媒体をある一定の周期をもつ周期的に変調された光で照射する。試料媒体は、規則的に連続した一定間隔の光パルスで照射することが好ましい。２つの光パルス間の距離（周期）は、例えば、１２ｎｓである。試料媒体で散乱した個々の光子形の光を検出装置で検出する。また、各光子の検出時間とそれと関連する照射光の周期内の基準時間との時間間隔を、遅延時間として決定し規定する。さらに、各光子の検出時間を決定する。これは通常、特定の測定要求に応じて２つの異なる測定装置手段を用いて行う。時間遅延は、ナノ秒範囲のものであり、極端に短時間の過程を測定するためのアナログ測定装置を必要とする。また、検出時間は通常、マイクロ秒範囲の対応する時間を測定するのに適したディジタル測定装置で決定する。本発明による方法は、最初に、多数の連続して検出される光子にそれぞれ遅延時間を用いて、少なくとも１つの散乱光のパラメータを決定することを特徴とする。連続して検出される光子の数は、例えば、固定数に設定し予め決定したり試料面にある標的粒子の存在に応じて適応させることもできる。第１のパラメータ値を多数の連続して検出される光子に対して決定する。次に、第２のパラメータ値を多数のさらに連続して検出される光子の遅延時間から決定する。第２の多数の連続して検出される光子はその前の多数の検出される光子の後に続くものもあれば、その代わりに第２の多数の光子は第１の多数の光子の一部を含む（重複する）場合もある。前者の場合、連続して検出される光子を連続したグループに分け、それぞれのグループで１つのパラメータ値を決定する。後者の場合、実質的に、選択した時間の窓を連続して検出される光子上にスライドし、時間窓内にある光子の遅延時間を用いてパラメータ値を出す。遅延時間からパラメータ値を決定するために、粒子の所定の特性を予め判定して得られる追加情報を一般的に用いる。これらの特性は、例えば、予め分かる蛍光寿命のような分光分析データの形式である。次いで記録した分光分析データを用いて、連続して検出される光子の所定の数に対する遅延時間を判定する。例えば、遅延していない散乱光と遅延した蛍光の比例した振幅を量的に分析する。次いでパラメータやそれと関連する連続して検出される光子の検出時間を用いて、１組のパラメータと時間の値を得、そして多数組のパラメータおよび時間値を使用して少なくとも１つのパラメータ−時間関数を決定する。次いでこの少なくとも１つのパラメータ−時間関数の相関関数を算出する。算出されたパラメータ−時間関数を相関することにより、粒子の特性に関する広範囲かつ新規の情報が得られる。本発明により時間相関された一光子計数により得られるパラメータ値へ相関技術を応用すると、標的粒子の新規の特性を決定する手段となり、公知の技術の可能性をさらに広げることになる。例えば、蛍光からの散乱光の要素のうち独立した振幅要素の自動相関関数を算出できる。これにより効果的に背景信号を抑えることができる。算出した相関関数を用いて、例えば、標的粒子の拡散定数を決定することが可能である。従来のＦＣＳと比較すると、本発明による方法によりＳ／Ｎ比が改善されることは明らかである。また、本発明による方法により、この種の測定を超希薄溶液においても最初に行えることになる。本発明による方法の利点のさらなる特徴において、試料媒体で散乱された光を２以上の検出器により検出する。次いで少なくとも１つのパラメータ−時間関数を各検出器により検出された光子に対して別々に算出する。次いで、相関関数を種々の検出器からのパラメータ−時間関数を用いる交差相関関数の形式で算出することが好ましい。これにより、例えば個々の検出分岐点に異なるスペクトルフィルタを用いることで、粒子間の結合反応を正確に観察することができる。試料媒体にある標的粒子の所定の特性を決定する方法の代替実施例において、試料媒体を最初に光で照射し、その後に試料媒体に散乱した個々の光子形の光を検出装置で検出し、そして各散乱光子の検出時間を検出する。標的粒子の密度分布を選択して、平均して１つの標的粒子よりも少ないものが試料媒体（試料空間）の観察した容積要素に存在するようにする。検出の測定時間を判定して、標的粒子が試料空間に個々に存在する間の時間間隔を得る。これは、例えば、連続した検出時間の間の時間間隔を測定することで行い、標的粒子が試料空間に入ると、例えば、所定数の時間間隔が最大間隔よりも下がるときに認識される。その代わりとして、例えば、所定の時間間隔の測定した検出時間の回数を判定することもでき、その場合には試料空間に標的粒子が存在すると、ユニット時間当たりに測定される検出時間数が最小値よりも下がるものとされる。本発明による方法は、相関関数をこのように決定される時間間隔（標的粒子が試料空間に存在する間）内に生じる検出時間によりのみ算出することと、標的粒子の所定の特性を前記相関関数により決定することを特徴とする。本発明による方法において、従来技術と対比すると、検出時間により算出した検出関数を相関させる前に検出関数を測定した検出時間を選択する。検出関数は、例えば、走査時間間隔中に光子を全く検出しなければ値が０で、走査間隔中に検出されれば値が１とされる走査関数である。選択した時間間隔がより大きいものであれば、検出関数も各一定の時間間隔で測定された検出時間の回数を表示する。本発明による装置において、全ての光子が検出された場合、各光子の検出時間および照射光の各周期に対する基準時間との間の時間間隔，すなわち、遅延時間を決定し、また光子の連続した検出時間の時間間隔をカウンタ装置を用いて決定する。これら２つの時間は１組のものとして記憶する。本発明によると、光子の連続した検出時間の時間間隔を、少なくとも第１および第２のカウンタを含む交互カウンタ装置で決定する。検出装置から電気パルスによりそれを制御し、カウンタが交互に計数するように接続する。すなわち、光子を検出すれば、パルスが生じて第１のカウンタを始動する。第２の光子を検出すれば、検出装置からの関連する電気信号で第１のカウンタを停止して、第２のカウンタを始動する。第２のカウンタが計数を続けている間、第１のカウンタのカウント数を下流のコンピュータユニットに送信する。第３の光子が到達すると、第２のカウンタが停止して第１のカウンタが再始動する。その後すぐに、第１のカウンタが再度計数を始める間に第２のカウンタのカウント数を読み出して下流のコンピュータユニットに送信する。本発明による装置の一つの利点は、非常に単純な手段，例えば、カウンタや公知の回路要素から構成することが可能なことである。別の利点を挙げると、この装置は無駄な時間や損失なしに動作する点である。１つのカウンタを再設定する場合、他のカウンタは計数を行う準備ができている状態である。最後に、本発明による装置のさらなる利点は、光子の検出時間を決定する本発明による時間分解が非常に高度なもので、それを予め決定できる柔軟性をもつことである。本発明により、１分子もしくは数個の分子に対して、手頃な価格の装置で高性能かつ種々の分析能力を備えた分光分析調査を行うことが可能となる。本発明を用いると、標的粒子により散乱された光を妨害する背景信号から効果的に分離し、結果的に標的粒子の望ましい特性をこれまでにない精度で測定することができる。本発明の利点のさらなる特徴は、サブクレームに記載している。以下、本発明を図面に概要を図示した例示的実施例を参照しながらさらに詳細に説明する。各図面にある同じ参照番号は、同じ要素を示すものである。さらに詳しく言えば、図１は、本発明の第１の例示的実施例のブロック図である。図２は、本発明の第２の例示的実施例のブロック図である。図３は、光子シーケンスでの光子の連続した検出時間の時間間隔Δｔを示す曲線である。図４は、ユニット時間当たりに検出された光子の数を図３の光子シーケンスにおいてプロットしたヒストグラムである。図５は、図３および図４に印を付けた第１の間隔における励起パルスと光子の検出時間との時間間隔から得たヒストグラムである。図６は、図３および図４に印を付けた第２の間隔における励起パルスと光子の検出時間との時間間隔から得たヒストグラムである。図７は、記録データの判定の例を示す曲線群である。本発明による方法および本発明による装置には多数の使用法がある。決定すべき標的粒子の特性は、例えば、別の分子への結合能力もしくは所定の試料媒体にある拡散定数の値等がある。「特性」はまた、標的粒子の状態もしくは標的粒子の状態の変化を含むものである。よって、標的粒子の状態を挙げるとすれば、例えば、結合状態もしくは自由状態の場合がありうる。状態変化に関しては、「結合」や「自由」間の遷移や標的粒子の種々の電子状態間での遷移が挙げられる。最も単純な場合では、状態変化が第１の励起した一重光と基本的な電子状態，すなわち蛍光との間の遷移である場合がある。それに関連する速度定数の逆数が蛍光寿命である。標的粒子は、分光分析して測定もしくは検出される対象の粒子である。それらは試料媒体中もしくはその上に存在する。標的粒子は、分子もしくは分子集合体または複合体の場合がある。また、原子，ウィルス等の微生物体，オルガネラまたは細胞および膜，もしくはラテックス小球等の他の小物体に本技術を用いることができる。試料媒体は通常液体媒体であり、特に標的粒子の溶剤である。試料媒体は通常、有機溶媒，水または生物調査に適する緩衝液，もしくは血液または菌培養媒体またはバクテリア培養媒体である。試料媒体は、液体，固体または気体，均質または不均質，すなわち、異なる段階からなるものである。例えば、２つの段階からなり、例を挙げると、固体表面上の液体または気体等である。試料空間は、前文による装置により観察される試料の容積要素である。試料空間にある試料媒体の標的粒子を照射する光は、可視光もしくは紫外線または赤外線光の場合がある。最も一般的な場合では、光は、標的粒子により散乱される電磁放射である。光の周期が固定されたものであれば、要求通りに光を変調できる。さらに詳しく言えば、光をパルスにしたり、適切なオフセットで正弦曲線に変調することができる。光は様々な方法で散乱させることができる。さらに詳しく言えば、光を弾性的または非弾性的に散乱することができ、言い換えれば、光の波長を保持または変化させることである。また、それを遅延させなかったり遅延させたりすることもある。遅延させた弾性的な散乱は、ルミネッセンス，特に蛍光を含み、その通常の遅延時間は数ナノ秒である。前文による装置の検出装置は通常、適切な光学構造体，１つ以上の検出器および検出した信号を処理し、通常はアナログ・ディジタル変換器を含む下流の電子ユニットからなる。前文による装置の判定装置は、検出装置やコンピュータである場合が多い計算ユニットからのデータを受信するインターフェースからなる。光子の検出時間は、測定当初からの絶対測定により得るかもしくは連続して検出した光子の検出時間の時間間隔を決定することで得る。これら２つは、減算もしくは時間間隔を加算することにより互いに変換できるものである。決定するパラメータは、時間相関された信号−光子計数により決定されるものであればどのパラメータでもよい。そのようなパラメータの例としては、蛍光寿命，必要であれば指数倍で崩壊する種々の蛍光寿命，回転拡散定数，運動変換率，光子数や全振幅や散乱光の個々の要素の振幅要素，もしくは測定した信号および望ましい信号間の距離のあらゆる統計的な測定形式，例えば、エム．コルネ（ M．Kollner）の「応用光学(Applied Optics)」，第３２（６）巻（１９９３年），第８０６〜８２０頁に記載の最小二乗法を用いた距離または情報測定等の測定形式がある。相関関数は、所定の振幅要素の自動相関関数等の所定のパラメータの自動または交差相関関数でもあり、または所定の蛍光寿命の交差相関関数でもある。以下、本発明による装置のいくつかの例示的な実施例を詳細に記載し、標的粒子の特性を本発明による装置で獲得したデータからどのように得るかを詳細に示す。まず初めに光学構造体について考慮する。通常、光学構造体は、共焦または近視野構造体の形態である。最大の局部分解能をもつ近視野光学構造体の場合、標的粒子を照射または誘導する光源からの光を開口を介して試料媒体に送る。開口は、試料空間から約１００ｎｍだけ離れた距離にある。また、開口の直径は励起光の波長よりも小さいものである。その結果、開口の周りにある励起光の強度分布は極めて局部的に制限されたものとなる。この種の近視野光学構造体は、表面に存在する個々の標的粒子への接近を制御する場合には特に適している。最大感度を有する共焦構造体を適応すると、試料媒体にある容量が小さい要素，例えば、試料空間を照射し、それを観察する。このため、通常、標的粒子は観察中に容積内に拡散したり容積から拡散したりする。その代わりとして、標的粒子をフローシステムもしくは他のものにある試料空間内に搬送または移動させたりすることもできる。ここで図１を参照する。図１に示している光源は、パルス状のレーザー２０である。通常、モード結合されたレーザーまたはパルス状のダイオードレーザーを使用し、このレーザーは、レーザーの性質によって長さが約１００ｆｓ（フェムト秒）と約５００ｐｓ（ピコ秒）の間であり、約１０から３０ｎｓ（ナノ秒）の間隔をもつパルスを放出する。光源のパルスまたはパルス間隔がより長いものであると不都合であることが分かっている。本発明によると、パルス状の光源を周期的に変調された光源で置き換えることができる。次いで振幅の変化と励起光に対する散乱光の移送の変化を判定して測定した信号を分析する。この測定方法は、ジェイ．アール．ラコヴィック(J．R ．Lakowicz)の「蛍光分光分析学の原理(Principles of fluorescences pectrosc opy)」，プレナム出版，ニューヨーク，１９８３年に詳細に記載されている。図１に示されている共焦構造体の場合、レンズ１でレーザー光の焦点を１点に合わせる。ビームの次の経路として、レーザー光をダイクロイックミラー２で顕微鏡の対物レンズに偏向させる。ダイクロイック偏光ミラーが、レーザー光は反射するが標的粒子からの波長がより長い散乱光または蛍光を伝送するようにミラーを組み立てる。偏向ミラー２や顕微鏡の対物レンズを用いることで、レーザーの焦点の像を試料媒体の内側にある１点に映し出す。試料媒体は、例えば、顕微鏡スライドの形態の試料ホルダ５上に置くこともある。試料媒体内にあるレーザー２０で照射する点は、顕微鏡の対物レンズを用いて、ピンホール６または絞り上に像を映す。色により望ましい散乱光要素と望ましくない散乱光要素を分離するための分光フィルタ７をピンホールの前に配置する。ピンホールのすぐ後ろには検出器８を配置し、この検出器は個々の光子を検出できる感度をもつものである。この目的を達成するために、光電子倍増管，マイクロチャネルプレート光電子倍増管，アバランシュフォトダイオードもしくは上流の像増幅器を有するＣＣＤまたは有さないＣＣＤを用いる。ゲー．カルチェ等(G．Kalusche et al.)の「物理学の実験的技術(Experimental Technique of Physics)」，第４１（２）巻（１９９５年），第２６５〜２７３頁もしくはエム．アイゲ(M．Eigen)，エル．リグレ(R．Rigler)の「米国国立科学アカデミー会報(Proceedings of the Natio nal Academy of Sciences of the U.S.A.)」，第９１巻（１９９４年，第５７４０〜５７４７頁に、共焦構造体を詳細に記載している。光検出器８からの信号とは別に、レーザー２０からの同期信号が必要である。これは、レーザーを制御する電子ユニットによる直接的な電気信号出力であったり、またはレーザー光自体からのものである場合がある。このため、レーザー２０からのビーム経路に配置したビームスプリッタ９を用いて、レーザー光の一部を検出器１０の方に偏向する。検出器１０は、例えば、フォトダイオード等である。試料媒体に散乱した光子の検出時間を決定するためには、励起の時間またはレーザーパルスの時間と光子の放出時間との間の時間間隔を決定する必要がある。散乱光が蛍光であれば、時間間隔を「蛍光遅延時間」とも呼べる。それは、検出器１０が放出するトリガパルスと検出器８にある光子の検出時間との間の時間間隔を決定することで決定する。電気構造体や光学構造体により、通常、検出器１０からのトリガパルスと遅延していない散乱光子が検出器８により検出される時間との遅延は一定である。この遅延は、他の全ての検出した光子に対して常に一定であり、適切な較正や適切な遅延要素により補償することができる。あらゆるぶれの可能性を避けるために、検出器８と１０からの電気パルスを通常、「定数−分数」弁別器（ＣＦＤ）２１を介して搬送する。適切な検出器を選択すれば、このＣＦＤ２１は必要ない。次いでパルスを「時間・振幅」変換器（ＴＡＣ）２２に送る。ＴＡＣは、始動パルスとそれにかける遅延停止パルスとの時間差を電圧振幅に変換する。始動パルスは、実質的に線形の電圧勾配で始動するが、その次にくる上昇は停止パルスが到達することで中断される。これまでの電圧を出力部で出力する。レーザー励起パルスと光子の検出時間との間の時間間隔を決定するために、レーザーパルスのトリガ信号を最初にＴＡＣの始動入力部に供給し、光子を検出した検出器８からの電気パルスを停止パルスに供給する（いわゆる、通常モード）。これにより、一定の遅延とは別に標的粒子の励起と光子の放出との時間間隔が決定する。試料空間から放出されるすべての光子が顕微鏡の対物レンズ３と検出器８で検出されるわけではない。僅か１％程の光子が検出されない可能性がある。その結果、レーザー２０の励起パルスの数は検出される光子よりもかなり多いものとなる。そのような状況下においても特性の決定を信頼性のあるものにするために、検出する光子の最大数が必要となる。検出する光子の数は、例えば、５０および約５千万個の間である。励起パルスの数はそれに応じてより多いものでなければならない。決定した遅延時間から対応するヒストグラムを用意すれば、蛍光の時間の遅延がヒストグラムの曲線のように再現されるのが分かる。ＴＡＣ２２への不必要な負荷や結果として生じる無駄な時間を避けるために、検出された光子を示す検出器８からのパルスをＴＡＣ２２の始動入力部にかけ、レーザー２０からのトリガパルスをＴＡＣ２２の停止入力部にかける（いわゆる、逆モード）。これは事実上時間方向の逆に相当するものである。元の信号は時間方向を再度逆にし、下流のコンピュータユニットの時間軸を選択的に一定に置き換えすることで難なく再現できる。ＴＡＣ２２からの出力電圧をアナログ・ディジタル変換器（ＡＤＣ）２３に供給する。次いでディジタル化した振幅値をライン１２を介してディジタル入／出力カード２８に供給し、さらにコンピュータ２７に搬送する。ここでは通常ヒストグラムを作るために多経路分析を行う。このようにして、ヒストグラムを検出した光子の遅延時間をそれぞれが表す個々のディジタル化した振幅値から作る。これまで記載した装置は検出した光子の遅延時間を決定するのみのものである。この装置では、光子を検出したときの絶対時間，すなわち測定開始時からのもので、固定基準点に対してまたは最後の光子を検出した時に対しての絶対時間を決定することはできない。これを達成するには、種々の部品を前述した装置に追加し、以下詳細に説明する。第１の例示的実施例において、変換後にそれぞれＡＤＣ２３により出力された問合せパルスを、ライン１１を介して最初に切換装置２４に供給し、次いでディジタル入／出力カード２８に供給してデータ記録を開始する。問合せパルスは切換装置２４の出力を切り換えるもので、この装置の構造は、問合せパルスの上昇フランクで切り換わり、次いでその周波数を効果的に半分にするものである。したがって、これは周波数分割器となる。周波数分割器回路２４はフリップフロップを基にしたもので、従来の方法では互いに否定する２つの出力をもつものである。この回路はＤまたはＪＫフリップフロップから公知の方法で構成する。周波数分割器２４の第１の出力部１５を、例えば、第１のカウンタ１７の停止入力部と第２のカウンタ１８の始動入力部に接続する。同じように、周波数分割器２４の第２の出力部１６を第１のカウンタ１７の始動入力部と第２のカウンタ１８の停止入力部に接続する。またこれとは逆に接続しても同様に適切な接続となる。ＡＤＣ２３から問合せパルスを受信した後、周波数分割器回路２４は、例えば、第１のカウンタ１７を始動し第２のカウンタ１８を停止する。それに応じて、第１のカウンタは図１に示したクロック発生器２５のサイクルを計数する。クロック発生器２５は、例えば、周波数がいくつかのジャンパを挿入することで可変のものである従来の水晶時計である。クロック発生器２５の通常の周波数は、１００ＭＨｚおよび２０ｋＨｚの間である。検出器１０からレーザー20自体により誘導されたトリガ信号はまた、クロックとしても使用できる。別の光子を検出器８で検出した後に、別の問合せパルスをＡＤＣ２３によりトリガする。それに応じて、周波数分割器２４はその出力を切り換え、そして第１のカウンタを停止して第２のカウンタを始動する。その後、停止した第１のカウンタはそのカウントを中間メモリ２６に転送する。問合せパルスを第２のライン１１を介して周波数分割器２４からディジタル入／出力カード２８に供給する。同様に、中間メモリのコンテンツをライン１３を介して入／出力カード２８に供給する。問合せパルスの受信後、ディジタル入／出力カード２８はデータの記録待受け状態になる。そこでライン１２を介してＡＤＣ２３により出力された変換したＴＡＣ値と、さらにライン１３を介した中間メモリ２６のコンテンツも記録し、それらをコンピュータ２７で一緒に記憶する。変換したＴＡＣ値は通常８ビット幅で、中間メモリ２６は２４ビット幅であることから、ディジタル入／出力カード２８は３２ビット幅の入力をもつことになる。しかしながら、当然、クロック発生器２５の周波数と中間メモリ２６の幅が実験上の条件に適合する限りは、他のビット幅でも適切である。６４ビットを受け入れる入／出力カードもまた使用可能である。異なるビット領域を異なる検出器からの信号用に保存しておく。同様に、個々のビットを使用して特定の光子を検出した検出器をコード化する。データ記録処理の最後に、入／出力カード２８はライン１４を介して確認信号をアナログ・ディジタル変換器に送り、次いで新しい変換態勢に入る。第３の光子を検出器８で検出すると、ＡＤＣ２３はライン１１を介して別の問合せパルスを送り、周波数分割器２４はその周波数を再度切り換える。次いで第１のカウンタを再度始動させて第２のカウンタを停止させる。その後第２のカウンタは中間メモリ２６のコンテンツを転送し、このコンテンツをライン１３を介して入／出力カード２８が受ける。引き続き全ての光子検出の処理において同じことが繰り返される。このように、次の励起パルスへの時間間隔と前の検出時間からの時間間隔を各光子に対して記憶する。両方の情報は、共に判定したり（以下本発明による方法を参照）または別々に判定に適している。例えば、光子の検出時間のみが対象であれば、ディジタル化したＴＡＣ値を無視して、検出時間を適切な判定に供給する。また、蛍光崩壊のタイムシーケンスのみが対象であれば、変換したＴＡＣ値をヒストグラムに組み合わせて、個々の光子が検出された時間間隔をさらに考慮せずに判定する。別の例示的実施例において、別の代替カウンタ装置の代わりに、単一カウンタまたはクロックを図２に示すように用いており、以下これを参照する。ライン１１を介して出力されたＡＤＣ２３の問合せパルスにより、図２に示す中間メモリ２６は、カウンタ２９またはクロックにより示された時間を検出し一時的に記憶する。その結果生じた中間メモリ２６のコンテンツを、ライン１３を介して問合せパルスを受けた後に第１の実施例で記載した方法と同じ方法でディジタル入／出力カード２８で受け取る。第３の実施例において、カウンタ２９を第２の実施例にあるように接続すると、ＡＤＣ２３からの問合せパルスがそれを停止するようになる。実際のカウントを中間メモリ２６で書き込み、カウンタ２９をリセットして新たに計数を始める。第１の実施例にすでに記載したように、ディジタル入／出力カード２８がライン１１を介してＡＤＣ２３から問合せパルスを受信した後、中間メモリ２６のコンテンツをライン１２を介してディジタル化したＴＡＣと共にディジタル入／出力カード２８で記録する。中間メモリ２６とＡＤＣ値のビット幅は、第１の実施例に記載したものと同じ方法で構成させることができる。またこの実施例において、カウンタ２９は、例えば図２に示すクロック発生器２５のサイクルを計数し、この発生器は第１の実施例にあるような可変のクロックレートで構成されている。実施例に記載の装置の構造は、カウンタ，中間メモリ，クロック発生器およびクロックがコンピュータ２７の外部にあり、データはディジタル入／出力カード２８を介してコンピュータ２７で受信する。それとは別に、装置の部品をすべてコンピュータ２７のプリント回路基盤や集積回路に配置することもできる。第４の実施例において、検出器８および１０またはＣＦＤ２１からのパルスをＴＡＣ２２，ＡＤＣ２３および前述した他の部品によりコンピュータ２７用に効果的に処理せず、その代わりに、信号のアナログ時間変化を時間精度を最高にした状態で検出する。これは、例えば、二重ビームのオシロスコープを最大記憶深で用いることで行う。次いでその結果生じるデータを遅延時間および検出時間の間隔に変換する。本発明による装置を前述してきたが、以下、標的粒子の特性を獲得したデータからいかに決定するかに関して記載する。ここで図３を参照する。図３は、光子シーケンスで光子を連続的に検出した時間の時間間隔Δｔを示す曲線である。光子の検出順に番号を付してＸ軸上にイベント番号でプロットする。ここで連続した光子を検出する間の時間間隔を、クロック発生器２５のクロックレート２０ＭＨｚに対応する５０ナノ秒の精度で検出する。これは共焦構造体で測定を行う。使用する標的粒子は、エチレングリコールで溶解したローダミン−１１０染料分子である。標的粒子またはローダミン１１０分子が試料空間に全く存在しなければ、検出した光子を計数するレートは、ローダミン１１０のような高吸収蛍光染料分子が観察中の容積要素にあるときよりもかなり低くくなる。その例を図３に示す。イベント第１５００番のあたりで、個々の光子検出イベントとの時間間隔は約６０，０００×５０ｎｓ，すなわち、約３ｍｓであり、約３００Ｈｚの背景計数レートに対応する。また。イベント第１９００番のあたりで、個々の光子の検出時間の時間間隔はかなり狭くなっている。第２のケースでの個々の光子イベント間の平均間隔は、約１０００×５０ｎｓ，すなわち約５０μｓである。これは約２０ｋＨｚの検出レートに対応する。したがって、背景計数レートよりも約６０倍大きなものとなる。このことは図４に示した図からも直接分かることで、以下これを参照する。図４は、図３のデータを示しているが、連続光子の検出の時間間隔を示しているのではなく、１ミリ秒当たりに検出される光子の数を示しているもので、それをＹ軸に沿ってプロットしたものである。また、Ｘ軸のイベント番号も時間と置き換えてある。図４は図３を基にしたデータから得たもので、個々の検出時間の時間間隔を加算し光子が検出された時の絶対時間で各光子を関連させることで得ることができる。次いで各ミリ秒間隔で生じる検出時間の数を決定しプロットする。図３には、２２０個の光子が検出されたところにそれぞれ対応する２つの領域に印を付けている。同じ領域を図４にプロットする。図３にあるイベント第１５００番あたりの領域は図４では７３７ｍｓかかる。図３にあるイベント第１９００番あたりの同じ数である２２０光子は、比較するとかなり高い平均検出レートに対応するものであるが、図４では４６ｍｓしかかからない。これから分かるように、光子検出レートが増加するのは、ローダミン−１１０分子が焦点内または試料空間にあることからである。図４の結果は、背景よりも明らかに上昇する山である。図４に示した方法は通常、多経路スケーリング（ＭＣＳ）または多経路計数と言われるものである。図４の形態でデータを発生させる測定過程（ＭＣＳ測定過程）は個々の分子を決定するものであるが、図３の形態でデータを記録する測定方法はさらに正確にデータを判定する方法である。これは、図３において各個々の光子が検出された正確な時間で割り当てられているためである。それに対して、ＭＣＳ測定過程では、光子を検出した時間を１ｍｓの精度でしか決定しないことが多い。共焦構造体にある試料室または焦点の典型的な直径は、０．５および１μｍの間である。ローダミン−１００分子が０．５μｍの距離を通って拡散する，すなわち、焦点を通るのに必要な時間は、約５００μｓの二乗平均値である。このように、１ミリ秒の積分時間の経路幅は焦点を通る分子の搬送時間に近いものとなる。したがって、ＭＣＳデータは、入出時間のより正確な調査に使用することはできない。しかしながら、記録したデータ用に相関関数を計算するためにはそのようなデータが必要となる。これに関して以下にさらに詳細に説明する。標的粒子が測定間隔中に焦点内にあるか否かを決定するには、図３および図４に示した光子検出レートまたは個々の測定間隔のｎｓスケールでの検出した信号のそれぞれの崩壊作用のいずれかを考慮する。この場合、時間相関された信号光子計数の通常の方法では、レーザーパルスまたは励起時間および光子を検出した時間との時間間隔，すなわち蛍光遅延時間を測定間隔中個々の光子に対してヒストグラムの形式で示す。これを図３および図４からのデータの例に対して図５および図６で示す。図５および図６のヒストグラムは、１経路につき約５０ピコ秒の時間分解で作ったものである。各光子に対して、光子の前の検出時間から時間の差を関連する遅延時間と共に記憶する。これらの値は常に、励起光または連続するレーザーパルスとの時間間隔よりも下の値である。図５および図６において、遅延時間は０および約１２ｍｓの間である。図５は、イベント第１５００番あたりの図３に印を付した２２０個の光子の領域と図４に印を付した７３７ｍｓに対応する２２０個の光子の領域の時間当たりの崩壊作用を示したヒストグラムである。図３および図４に示しているように、この測定間隔中に試料空間には全く標的粒子がない。したがって、図５は、初期の段階に山があるヒストグラムの時間曲線であり、その山の後にほぼ一定に分布した時間曲線が続く。この曲線は遅延していない散乱光に対応しており、ほぼ一定に分布した次の曲線は他の背景雑音に対応する。これと対比して、図６は、ローダミン−１１０または標的粒子の蛍光の時間曲線を示している。図６は、イベント第１９００番あたりの図３に印を付した２２０個の光子の領域と図４に印を付した４６ｍｓに対応する２２０個の光子の領域の図５と同種のヒストグラムを示している。図３および図４からすでに明らかなように、標的粒子またはローダミン−１１０分子はこの測定間隔中に焦点内にある。従って、図６に示した蛍光の時間曲線は短時間のレーザーパルスによる励起に応じて最初に急勾配に上昇し、次いで実質的に一定に減少していく。ユニット時間当たりの減少速度は図５よりもかなり低速である。図６が示す蛍光寿命はおよそ３．６ｍｓである。さらに、図６には最初に明白な山があり、これは散乱光のうち追加の遅延していない散乱要素から生じたものである。最初の山−および比較可能なヒストグラムの比較可能な山−が散乱光の追加の遅延していない散乱要素からくるものであるか否かを決定するためには、遅延していない散乱光のみを別の測定，例えば純エチレングリコールで記録する。その結果生じる時間曲線は図５と比較可能であるが、ヒストグラムの１経路につき実質的に多い数の検出光子と比較可能である。標的粒子，ここではローダミン−１１０の蛍光の崩壊作用を別の測定で同様に検出することができる。次いですでに分かっているこれらのデータを用いて、遅延していない散乱光と例えば図６にあるデータの振幅との割合を決定する。これは効果的な統計上のアルゴリズムで行うことができ、例えば、最小二乗法の適用または最大見込み値の適用等であり、この適用に関しては、文献（ジェイ．エヌ．デマス(J．N．Demas ）の「励起状態の寿命測定(Excited state lifetimeme asurements)」，アカデミック出版，ニューヨーク，１９８３年、またはエム．コルネ(M．Kollner)，ジェイ．ヴォルフル(J．Wolfrum)，化学物理学通信(Chemical Physics Letters)，第２００巻（１９９２年），第１９９〜２０４頁を参照されたい）に記載されている。遅延していない散乱光の割合で適用テストを行うことにより高精度の蛍光寿命を決定することができ、例えば、標的粒子の蛍光での崩壊を示す指数関数的に下降する曲線や信号での遅延していない散乱光の決定されていない割合等が想定される。したがって、測定した振幅要素，すなわち、ここでは蛍光や遅延していない散乱光を用いて、標的粒子の所定の特性として標的粒子の蛍光寿命を決定するための方法である。他の要素，例えば、他の粒子または他の散乱源からの要素は、同様の別の測定やそこから得たデータを介して考慮に入れる。検出効率を上げるために、図１および図２に示す光学構造体は、試料ホルダ５の下部にある第１の顕微鏡の対物レンズ３の光線経路のラインに第２の顕微鏡の対物レンズを配置することで追加することができる。その結果、集光効率を２倍にすることができる。顕微鏡対物レンズ３と同様に顕微鏡対物レンズの後には、フィルタ，ピンホール，検出器を配置しなければならない。他の下流のデータ獲得電子ユニットや判定装置は第２の検出経路とは別に設置するか、または第２の検出器からの信号をルートユニットを介して既存のＴＡＣ２２に供給する。前者（別々にデータを獲得する装置）の場合、個々の検出器で検出した光子を記載した方法で個々に判定する。さらに詳しく言えば、個々の散乱光の要素，すなわち遅延した散乱光または蛍光および遅延していない散乱光の要素の振幅を個々の検出器で検出した光子に対して決定し、標的粒子の特性をそれから計算することができる。また、データを適切なヒストグラムに組み合わせて全て一緒に判定することができる。試料の下部に直接適切なミラーを用いることで検出効率をさらに上げることができる。図５および図６のヒストグラムは、２２０個の光子が存在した測定間隔に関したものである。他の適切な光子数も同等にヒストグラムに組み合わせることができる。また、図４から明らかなように、図５および図６にあるヒストグラムは与えられた光子数に関するものではなく与えられた所定の時間間隔に関してのものである。時間間隔が所定の検出光子数で規定される場合、図３にある種々の光子部分のスライド判定は、適切なヒストグラムを作り分析することで得られる。例えば、次に検出した光子をヒストグラムに組み合わせて前に検出した光子を取り除く。その代わりとして、１個の光子ではなく、１０個または他のあらゆる光子数をヒストグラムに含めたりヒストグラムから除去したりする。また、所定の検出した光子数は変えられる。例えば、単一の標的粒子が存在する場合、光子数を他の散乱光の場合よりも多くしたり小さくすることができる。次いで個々の散乱光要素の決定した振幅要素または必要であれば決定した寿命を、検出時間または連続した検出時間の時間間隔を介して、時間またはイベント番号に対してプロットする。これを図７の例を用いて図示する。図７は、図３を基にしたデータのスライド判定をしめしており、ヒストグラムはそれぞれ４０個の光子を基に作成し、次のヒストグラムをそれぞれ次に検出した光子を加算し前に検出した光子を取り除くことで作成する。図７に「◆」の印を付した個々の光子の検出時間の間隔Δｔは同様に平均４０個の光子を超えるものである。イベント第１８８５０番のあたりの領域は、焦点内に標的粒子が存在することを意味する狭い検出光子の時間間隔が、遅延していない散乱光の同様に小さい振幅要素および長い蛍光寿命と相関することを明白に示している。この場合、蛍光寿命は約４〜５ｎｓである。これと対比して、イベント第１９０００番のあたりの領域は、連続した光子イベント間の長い時間間隔を示すもので、すなわちこれは標的粒子が焦点内に全くないということで、その結果遅延していない散乱光の振幅要素が１００％近くに上昇し、蛍光寿命は著しく減少する。図７の例で示した形式のデータは、本発明によりさらなる処理に適しているものである。文献（例えば、エム．エイゲ(M．Eigen)，エル．リグレ(R．Rigler) ，「アメリカ合衆国国立アカデミー会報（Proceedings of the National Academ y of Sciences of the U.S.A.）」，第９１巻（１９９４年），第５７４０〜５７４７頁）には、検出した光子の自動相関関数によって、測定中に１個のみの標的粒子または２以上の標的粒子が焦点に存在するか否かを如何にして信頼性のある決定をするかということを一般的に記載している。また、標的粒子の拡散点数を散乱光の自動相関関数から計算する。また、相関関数を用いて散乱光の個々の要素の有意の共通する存在を決定する。このため、個々の決定した振幅要素の交差相関関数は公知の方法で計算する。この関数が時間零付近で明白な山をもてば、考慮中の散乱光の要素は信号に有意に同時に生じるか、または通常同時に生じる。これにより、有意に示されるべき２つの標的粒子が共に生じることができる。この種の測定は、２つの分子または分子錯体間の結合を薬理学を目的にして立証する必要があるときに重要なものとなる。これは「薬剤選別(drug screening) 」に関連するもので、ここでは標的粒子，例えば抗原および別の標的粒子，例えば抗体間の特に強力な結合を立証するのに重要な場合が多い。結合が見られる標的粒子が共に標識付けされた蛍光であれば、各振幅要素は同時に高い値を取る。振幅要素は、例えば、これらの標的粒子の別々の記録したデータを介して決定することができる。結合力が弱ければ、同時に生じたものは弱くマークを付されるのみである。結合力が強ければ、粒子は通常互いに結びつき、したがって焦点内で同時に観察される。結合を挟み込みテストにより立証することもできる。挟み込みテストでは、２つの他の分子間の望ましい分子の結合を観察する。これらの分子のうち少なくとも１つは、蛍光または標識付けされた蛍光である。両方の分子が標識付けされた蛍光であれば、それらが同時に生じたことを相関関数で決定し、結合の量的分析用に用いる。それらのうち１つのみが蛍光であれば、結合を変化させた拡散定数により自動相関関数から導き出す。本発明による方法を用いて単一粒子を調査できるので、これは物理的測定の平均値を検出する手段だけにはならない。それとは逆に、測定される値の分布を個々の標的粒子で多数の個々の測定を決定して直接測定する。これにより、標的粒子の不均一な量の不均一性も分析できる。本発明によると、例えば、蛍光寿命の自動相関関数を特定のパラメータとして示すことができる。また、標的粒子の蛍光により散乱光の割合の自動相関関数も計算できる。すでに説明したように、この振幅要素は、標的粒子の既知の蛍光寿命を考慮に入れて決定する。その結果は、選択的蛍光寿命の自動相関関数であり、それから例えば関連する拡散定数を計算できる。従来のＦＣＳ技術と対比すると、本発明による相関関数を散乱光要素を取り除いて選択的に計算できる。その結果、試料空間内にほとんど存在しないか少しだけ存在する標的粒子からの極端に弱い信号のＳＮ比が改良される。選択的蛍光自動相関関数を、例えば、蛍光寿命が結合状態と自由状態とでは異なる蛍光標的粒子の結合を量的に分析するために使用することができる。例えば、ＤＥ−ＯＳ３８０７９７５に記載された「インテリジェント」ダイは、この目的に合ったダイである。本発明によれば、この場合には自動相関関数を結合状態および自由状態に対して選択的に計算できる。また、異なるパラメータの交差相関関数を計算することで、山または谷での有意の共通する発生または有意の別々の発生を交差相関関数の時間零のあたりで読みだすことができる。また、２つの検出器の場合、交差相関関数を個々の検出器からのデータ用の同様または異なるパラメータに対して計算する。前述したように、情報は標的粒子が共通または別々に発生した付近で読みだすことができる。１個を超える標的粒子が焦点内にある場合もある。異なる標的粒子が異なる蛍光寿命をもてば、ヒストグラムに変換した測定された信号は蛍光崩壊の指数倍の時間曲線をもつ。個々の標的粒子がすでに指数倍の蛍光崩壊をもてば、蛍光曲線はこのようになる。この場合、前述した統計上の方法を各個々の指数崩壊に対して別々の振幅要素を決定することで使用する。これを適切に行うために、種々の標的粒子または各個々の標的粒子の蛍光崩壊に関するデータを前述したように別々の測定で記録する。指数倍の蛍光崩壊の場合または１個を超える標的粒子が焦点内にある場合、異なる標的粒子が異なる蛍光寿命をもつかぎり、個々の標的粒子の蛍光寿命をその振幅要素以外に全散乱光に対して決定できる。また、これらの振幅要素または蛍光寿命を互いに相関させたり、それらの交差相関関数を計算することができる。標的粒子が共に発生する，例えば互いに結合した状態での発生を、振幅要素または蛍光寿命を高くしたものを同時に発生させることで立証できる。ＤＥ４２１０９７０Ｃ２に記載された「マルチプレックス」ダイはこの目的に特に適したものである。分光光学分野では一般に知られているように、分光光学データは、標的粒子の回転特性も反映するものである。標的粒子が回転すると、崩壊時間中に蛍光を解消することになる。この解消作用は、極性をもたせた励起光や検出器８の前に設置した分析器を用いて、図６にあるようにヒストグラムで決定する。解消作用を別々の測定で正確に決定すれば、その情報を用いて全散乱光の一部として標的粒子の蛍光振幅要素を決定することができる。分光分析学的に個々の蛍光体，例えばこれまで記載した２つの標的粒子の蛍光体以外にも、２つの蛍光体の間で共鳴エネルギー伝送が生じる蛍光体を使用することもできる。例えば、第１の標的粒子をレーザー光でシミュレートし、すなわちレーザー光を吸収し，エネルギーを第２の標的粒子に共鳴伝送し、そして後者の粒子を放出する。この種の共鳴エネルギー伝送の距離は密接に依存しており、すなわち標的粒子が互いに結合すれば効果的に発生し、標的粒子が共に結合しなければ実質的に存在しない。次いで散乱光にある個々の標的粒子の振幅要素を決定して、その交差相関関数を計算し、伝送エネルギーを受け取る第２の標的粒子の蛍光のみを両方が焦点内に同時に発生するときに観察できることから標的粒子間の強力な結合を示す。次いで交差相関関数の負の相関を観察する。前述の共焦光学構造体で記録した散乱光の自動相関関数曲線を蛍光粒子を拡散させて決定する。その特有の数量は粒子の拡散定数や焦点の空間の広がりである。これらの拡散定数は、前述の交差相関関数に重大な影響を及ぼす。個々の標的粒子の拡散定数やそれらの自動相関関数の特有の曲線を別々の測定で決定する。この情報を用いて、交差相関関数を判定して相関関数で個々の標的粒子の特性を示す。すでに記載したように、本発明による装置は個々の標的粒子の分光分析調査に特に適している。個々の標的粒子が観察中に試料空間，媒体，容積中に存在するかを決定するには、試料媒体の観察部分または試料空間内に１個未満の標的粒子が平均して存在するような希釈溶液に標的粒子が最初に存在しなければならない。この目的に必要な通常の濃度は、１０^-9〜１０^-12Ｍ溶液（Ｍ＝モル／リットル）である。例えばエチレングリコールにローダミン−１１０の１０^-12Ｍ溶液を用い、焦点は０．２５μｍの短い半軸と２．５μｍの長い半軸をもつ楕円であり、観察した試料空間の容積は約０．６５μｍ³である。濃度が１０^-12モル／リットルのローダミン−１１０分子で増倍すると、ローダミン−１１０分子が観察中に所定の時間で試料空間に存在する確率が約４×１０^-4になる。さらに高濃度の溶液を調査するには、前記溶液にかなりの希釈形態で存在する標的粒子の蛍光作用がさらに高濃度の粒子により影響を受ける必要がある。この影響は局部分子の相互作用によるもので、蛍光寿命や蛍光強度，解消作用等のような蛍光作用の特性に影響を及ぼすものである。解消作用は、例えば、標的粒子とさらに高濃度の粒子が結合することで変化する。これらの条件の下に決定した標的粒子の蛍光作用により、さらに高濃度の粒子に関する情報が得られる。標的粒子はかなり希釈したものであるため、単一粒子が試料空間に通常存在する。ここで図３を再度考慮する。イベント第１９００番付近の検出した光子間の比較的狭い時間間隔やそれに応じて比較的高密度の検出時間，すなわち高い光子の検出レートが意味することは、すでに説明したように試料媒体内に単一の標的粒子が存在するということである。さらに量的に処理するために、アール．エイ．ケラー(R．A．Keller)の「応用分光分析学(Applied Spectroscopty)」，第５０巻，第７号（１９９６年），第１２Ａ〜３２Ａ頁に記載の平均し、しきい値を設定する処理を用いる。その代わりに、ヒストグラムから決定できるパラメータ、例えば与えらえた蛍光寿命の振幅要素等のパラメータであれば、例えば個々の標的粒子が試料空間内に存在するか否かを決定するための単純なしきい値設定処理を用いて使用できる。また、観察した信号が純粋な背景雑音からのものであるか否かという仮定をテストする統計上の処理を用いることもできる。このためには、これらの短い時間間隔で多数の光子を観察する確率を計算して、それらが背景雑音からのものかまたは遅延していない散乱光からのものかを想定する。この確率が所定の値よりも下がれば、少なくとも１つの蛍光分子または標的粒子が焦点に存在する。図３乃至図６にあるように、存在する個々の標的粒子に関連する光子を選択してヒストグラムを図６に作り、個々の標的粒子の蛍光寿命を決定する。その代わりに、観察した蛍光の寿命を特定の種類の標的粒子の既知のデータと比較して、個の場合にどの既知の種類の標的粒子が存在するかを決定できる。エム．コルネ (M．Kollner)の「応用光学(Applied Optics)」，第３２（６）巻（１９９３年），第８０６〜８２０頁に記載のアルゴリズムはこの目的に特に適している。個々の分子または標的粒子をこの方法で認識できる。したがって、データ獲得の装置やそれに関連する判定方法は、レーザー分光分析法による生体分子等の光学的な質的量的決定のためのＤＥ４２１０９７０Ｃ２に記載の方法に適している。これは特に、ここで記載した装置や方法が存在する個々の標的粒子に適用される場合である。また、前述した判定方法の１つを使用して、単一の標的粒子が観察した試料空間内に存在するか否かを見い出す。次いで対応するアルゴリズムの結果が単一標的粒子が試料空間に高確率で存在すると決定した場合にのみデータを判定する。この手順はスライド前判定の形式である。その代わりに、全散乱光に対して遅延していない散乱光の比例した振幅を用いて、次の判定のデータを予めフィルタがけする。さらに詳しく言えば、予めフィルタがけした信号を用いて、存在する個々の標的粒子に対して検出した光子の自動相関関数を効果的に計算する。このため、単一の標的粒子が所定の確率で試料空間に存在したときに検出した光子からのみ自動相関関数を作る。一般的な遅延していない散乱光と関連するそのような光子や背景の残りの光子は計算には含まれていない。これにより、自動相関関数の振幅が自動相関を基にした関数のＳ／Ｎ比に左右されるため、散乱光を抑制でき、それに応じて計算した自動相関関数の精度や振幅を改善できる。Ｓ／Ｎ比が悪ければ、自動相関関数の振幅も小さくなる（ディー．イー．コッペル(D.E.Koppel)の「物理学論評Ａ(Physical Review A)」，（１９７４年）、第１０部，第１９３８頁を比較されたい）。遅延時間からの情報を用いずに、光子の検出時間で利用可能な情報のみを使用すれば、個々の標的粒子に関連する光子の検出時間用にそれ自体の相関関数を計算し、そこから決定したパラメータ用には計算しない。すでに説明したように、従来のＦＣＳと対比すると、これはＳ／Ｎ比が著しく改善されたことになる。相関関数は個々の標的粒子に対して選択的に計算する。どのような種類の光もこれを応用するさいに使用でき、特に変調されていない連続光も使用できる。単一標的光子が試料空間内に存在するか否かを決定するのに、本発明によれば、ユニット時間当たりの比較的高密度のものかまたは連続光子を検出する時間の比較的短い時間間隔を使用できる。すでに記載したように、これは、図４と組み合わせることで図３のイベント第１９００番付近を見れば明らかに分かるものである。図３にある「谷」は図４では山として現れており、一般的にこれを「突発 (burst)」とも言う。図３のイベント第１１００番付近での連続した光子の検出時間が比較的短い時間間隔とイベント第１９００番付近の曲線にある谷との間を比較すると、谷の継続時間がかなり変化があるものかまたはかなり異なる検出光子数からなることが分かる。この種の谷が背景信号の不規則的な変動によるものか存在する個々の標的粒子によるものかを判断するのに、前述の統計的基準を用いることができ、他の散乱光から発生したものとしてイベント第１１００番付近の谷を見分ける。結果的に、突発期間の評価は、光子検出時間が比較的高密度のものであれば標的粒子が存在することを意味するか否かを評価する効果的な方法となる。本発明の範囲内において種々の変形を行うことは可能である。特に、パラメータが特定の値（図７を比較）を超えるかそれよりも低い値のものか、またはユニット時間当たりの検出時間数（強度）を使用できる（図４を比較）ものであれば、単一の標的粒子の存在を検出できる。したがって、しきい値の設定には２つの基本的な方法があるということである。さらに、パラメータの相関関数または強度の相関関数を計算する。このようにしきい値を設定する可能性が２つと相関関数を計算する可能性が２つあることにより、計４つの組合せが可能になる。すなわち、１．強度のしきい値を予め決定し、次いで強度の相関関数を計算する。２．強度のしきい値を設定し、次いでパラメータの相関関数を計算する。３．パラメータ値のしきい値を予め決定し、次いで強度の相関関数を計算する。４．パラメータ値のしきい値を予め決定し、次いでその相関関数または別のパラメータの相関関数を決定する。電源，検出装置および判定装置に関しては、上述したように個々の可能性に合わせて選択すべきものである。このように、本発明による方法および装置を用いることにより、非常に低い濃度においてでさえ、標的粒子を様々に選択できさらに良好のＳ／Ｎ比の状態でＦＣＳを実行することが初めて可能となる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年１月７日（１９９９．１．７）【補正内容】特許請求の範囲１．試料媒体の標的粒子の特性を決定する方法において、ａ）試料媒体を周期的に変調した光で照射し、ｂ）試料媒体に散乱した個々の光子形の光を検出装置で検出し、ｃ）各検出した光子の検出時間とそれと関連した照射光の周期内の基準時間との時間間隔を遅延時間として記録し、ｄ）各検出した光子の遅延時間を決定しさらに各検出した光子の検出時間を記録し、ｅ）少なくとも１つのパラメータを近接して連続する検出した光子のそれぞれの番号の遅延時間から決定し、ｆ）前記近接して連続する検出した光子のそれぞれの番号を検出した時から時間値を決定し、ｇ）前記近接して連続する検出した光子のそれぞれの番号の前記少なくとも１つのパラメータと前記時間値から少なくとも１組のパラメータと時間値を決定し、ｈ）複数の連続した番号の前記パラメータと時間値の組から少なくとも１つのパラメーター時間関数を決定し、ｉ）前記少なくとも１つのパラメータ−時間関数の相関関数を計算し、そしてｊ）前記相関関数により前記標的粒子の特性を決定する試料媒体の標的粒子の特性を決定する方法。２．前記方法において、前記周期的に変調した光をパルス状に変調することを特徴とする請求項１記載の試料媒体の標的粒子の特性を決定する方法。３．前記方法において、試料媒体に散乱した光を１を超える検出器で検出し、そしてそれぞれの場合において、各検出器で検出される光子の少なくとも１つのパラメータ−時間関数を別々に計算することを特徴とする請求項１または２記載の試料媒体の標的粒子の特性を決定する方法。４．前記方法において、前記相関関数は、種々の検出器のパラメータ−時間関数を用いて計算する交差相関関数であることを特徴とする請求項３記載の試料媒体の標的粒子の特性を決定する方法。５．前記方法において、前記遅延時間のヒストグラムを散乱光の連続して検出した光子の各所定の番号または所定の時間間隔に対して作り、そして散乱光のパラメータを有効な統計上の方法により前記ヒストグラムから決定することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項記載の試料媒体の標的粒子の特性を決定する方法。６．前記方法において、標的粒子は群（蛍光体）からなる蛍光または粒子として可能な分子であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項記載の試料媒体の標的粒子の特性を決定する方法。１２．前記方法において、使用する標的粒子はそれぞれ蛍光体からなる少なくとも２つの粒子であり、前記各蛍光体との間に共鳴エネルギー伝送が発生し、決定した前記パラメータは各蛍光体で散乱した光の前記比例振幅であり、そして決定した前記相関関数は前記各蛍光体で散乱した光の前記比例振幅の自動相関関数であることを特徴とする請求項７乃至１１のいずれか１項記載の試料媒体の標的粒子の特性を決定する方法。１３．前記方法において、平均して１未満の標的粒子が試料媒体（試料空間）の観察した容積要素に存在するように標的粒子の密度を選択し、そして個々の標的粒子と関連するパラメータ−時間関数の部分から前記相関関数を独立して計算することを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか１項記載の試料媒体の標的粒子の特性を決定する方法。１４．前記方法において、前記試料空間に個々の標的粒子が存在すれば、所定のしきい値を散乱光の所定のパラメータが超えている時であることを特徴とする請求項１３記載の試料媒体の標的粒子の特性を決定する方法。１５．試料媒体の標的粒子の特性を決定する方法において、ａ）試料媒体を光で散乱し、ｂ）試料媒体で散乱した個々の光子形の光を検出装置で検出し、ｃ）各検出した光子の検出時間を決定し、ｄ）平均して１未満の標的粒子が試料媒体（試料空間）の観察した容積要素に存在するように標的粒子の密度を選択し、ｅ）測定した検出時間を判定して標的粒子が試料空間に個々に存在した間の時間間隔を決定し、ｆ）前記時間間隔の中から選択した１つの時間間隔で測定した検出時間から、前記選択した時間間隔に制限された少なくとも１つの時間依存関数を作り、前記関数は所定のユニット時間当たりに測定した多数の検出時間を示すもので、前記所定のユニット時間は前記選択した時間問隔よりもかなり短いものであり、ｇ）前記時間依存関数の相関関数を計算し、そしてｈ）前記標的粒子の特性を前記相関関数を用いて決定する試料媒体の標的粒子の特性を決定する方法。１６．前記方法において、所定数を超える連続して検出した光子の検出時間の時間間隔の平均値が所定の値よりも下がるとき、これを試料空間にある個々の標的粒子の存在の決定基準として用いることを特徴とする請求項１５記載の試料媒体の標的粒子の特性を決定する方法。１７．前記方法において、所定の時間間隔を超える連続して検出した光子の検出時間の時間間隔の平均値が所定の値よりも下がるとき、これを試料空間にある個々の標的粒子の存在の決定基準として用いることを特徴とする請求項１５記載の試料媒体の標的粒子の特性を決定する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者レイフブランドドイツ連邦共和国、ディー―25436、トルネシュ、ウエテルゼネルストラーセ 37 (72)発明者ロルフガンゼールドイツ連邦共和国、ディー―22525、ハンブルグ、シャケンブルガーリ 114

Claims

【特許請求の範囲】１．試料媒体の標的粒子の所定の特性を決定する方法であって、ａ）試料媒体を所定の周期をもつ周期的に変調した光で照射し、ｂ）試料媒体に散乱した個々の光子形の光を検出装置で検出し、ｃ）ここにおいて、各光子の検出時間とそれと関連した照射光の周期内の基準時間との時間間隔を決定して遅延時間として規定し、ｄ）各光子の遅延時間を決定しさらに各光子の検出時間も決定し、そしてｅ）検出した光子の遅延時間を使用して散乱した光の少なくとも１つのパラメータを決定する試料媒体の標的粒子の所定の特性を決定する方法において、ｅ’）近接して連続する光子のそれぞれの番号に前記遅延時間を用いて前記少なくとも１つのパラメータを決定し、ｆ）前記近接して連続する光子のそれぞれの番号に前記検出時間を用いて時間値を決定し、ｇ）前記近接して連続する検出した光子のそれぞれの番号の前記少なくとも１つのパラメータと前記時間値を用いて少なくとも１組のパラメータと時間値を決定し、ｈ）複数の連続した番号の前記パラメータと時間値の組から少なくとも１つのパラメータ−時間関数を決定し、ｉ）前記少なくとも１つのパラメータ−時間関数の相関関数を計算し、そしてｊ）前記相関関数を用いることで前記標的粒子の所定の特性を決定することを特徴とする試料媒体の標的粒子の所定の特性を決定する方法。２．前記方法において、前記周期的に変調した光をパルス状に変調することを特徴とする請求項１記載の試料媒体の標的粒子の所定の特性を決定する方法。３．前記方法において、試料媒体に散乱した光を１を超える検出器で検出し、そしてそれぞれの場合において、各検出器で検出される光子の少なくとも１つのパラメータ−時間関数を別々に計算することを特徴とする請求項１または２記載の試料媒体の標的粒子の所定の特性を決定する方法。４．前記方法において、前記相関関数は、種々の検出器のパラメータ−時間関数を用いて計算する交差相関関数であることを特徴とする請求項３記載の試料媒体の標的粒子の所定の特性を決定する方法。５．前記方法において、前記遅延時間のヒストグラムを散乱光の連続して検出した光子の各所定の番号または所定の時間間隔に対して作り、そして散乱光のパラメータを有効な統計上の方法により前記ヒストグラムから決定することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項記載の試料媒体の標的粒子の所定の特性を決定する方法。６．前記方法において、標的粒子は群（蛍光体）からなる蛍光または粒子として可能な分子であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項記載の試料媒体の標的粒子の所定の特性を決定する方法。７．前記方法において、散乱光の前記少なくとも１つのパラメータを、検出した散乱光が少なくとも標的粒子からの蛍光と他の散乱光の割合からなるということにより決定し、そして決定した前記パラメータは全振幅に対する前記散乱光の割合であることを特徴とする請求項６記載の試料媒体の標的粒子の所定の特性を決定する方法。８．前記方法において、決定した前記パラメータは蛍光寿命であることを特徴とする請求項７記載の試料媒体の標的粒子の所定の特性を決定する方法。９．前記方法において、散乱光の個々の要素の比例振幅を決定するのに、標的粒子から蛍光の構成に関する所定の情報を特定の蛍光寿命で記される複数の個々の指数関数的な崩壊を重複させることで処理し、そして決定した前記パラメータは前記比例振幅および／または前記個々の指数関数的な崩壊の蛍光寿命であることを特徴とする請求項７または８記載の試料媒体の標的粒子の所定の特性を決定する方法。１０．前記方法において、標的粒子の通常の蛍光寿命に関する情報を前記個々の指数関数的な崩壊の前記比例関数を決定するさいに用いることを特徴とする請求項９記載の試料媒体の標的粒子の所定の特性を決定する方法。１１．前記方法において、各標的粒子で散乱した光の前記比例振幅を標的粒子の回転または蛍光復極具合に関する情報を用いて決定することを特徴とする請求項７乃至１０のいずれか１項記載の試料媒体の標的粒子の所定の特性を決定する方法。１２．前記方法において、使用する標的粒子はそれぞれ蛍光体からなる少なくとも２つの粒子であり、前記各蛍光体との間に共鳴エネルギー伝送が発生し、決定した前記パラメータは各蛍光体で散乱した光の前記比例振幅であり、そして決定した前記相関関数は前記各蛍光体で散乱した光の前記比例振幅の自動相関関数であることを特徴とする請求項７乃至１１のいずれか１項記載の試料媒体の標的粒子の所定の特性を決定する方法。１３．前記方法において、平均して１未満の標的粒子が試料媒体（試料空間）の観察した容積要素に存在するように標的粒子の密度を選択し、そして個々の標的粒子と関連するパラメータ−時間関数の部分から前記相関関数を独立して計算することを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか１項記載の試料媒体の標的粒子の所定の特性を決定する方法。１４．前記方法において、前記試料空間に個々の標的粒子が存在すれば、所定のしきい値を散乱光の所定のパラメータが超えている時であることを特徴とする請求項１３記載の試料媒体の標的粒子の所定の特性を決定する方法。１５．試料媒体の標的粒子の所定の特性を決定する方法であって、ａ）試料媒体を光で散乱し、ｂ）試料媒体で散乱した個々の光子形の光を検出装置で検出し、ｃ）各散乱光子の検出時間を決定し、ｄ）平均して１未満の標的粒子が試料媒体（試料空間）の観察した容積要素に存在するように標的粒子の密度を選択し、そしてｅ）測定した検出時間を判定して標的粒子が試料空間に個々に存在した間の時間間隔を決定する試料媒体の標的粒子の所定の特性を決定する方法において、ｆ）前記時間間隔の中から選択した１つの時間間隔で測定した検出時間から、前記選択した時間間隔に制限された少なくとも１つの時間依存関数を作り、前記関数は所定のユニット時間当たりに測定した多数の検出時間を示すもので、前記所定のユニット時間は前記選択した時間間隔よりもかなり短いものであり、ｇ）前記少なくとも１つの関数の相関関数を計算し、そしてｈ）前記標的粒子の前記所定の特性を前記相関関数を用いて決定することを特徴とする試料媒体の標的粒子の所定の特性を決定する方法。１６．前記方法において、所定数の連続した検出光子の検出時間の時間間隔の平均値が所定の値よりも下がるとき、これを試料空間にある個々の標的粒子の存在の決定基準として用いることを特徴とする請求項１５記載の試料媒体の標的粒子の所定の特性を決定する方法。１７．前記方法において、所定の時間間隔で連続して検出した光子の検出時間の時間間隔の平均値が所定の値よりも下がるとき、これを試料空間にある個々の標的粒子の存在の決定基準として用いることを特徴とする請求項１５記載の試料媒体の標的粒子の所定の特性を決定する方法。１８．請求項１記載の前記方法を使用する装置であって、ａ）所定の周期をもつ変調した光を伝送する少なくとも１つの光源（２）と、ｂ）試料媒体の粒子を光源からの光で照射する試料空間と、ｃ）試料空間から個々の光子を検出する装置（１８）であって、試料空間からの光子を検出すると、第１の出力端（１１）でパルスを伝送し、各光子の検出時間とそれと関連する照射光の周期内の基準時間との間の時間間隔として規定時間を決定して規定し、第２の出力端（１２）でディジタルデータ形式の遅延時間を伝送する構造の装置（１８）と、そしてｄ）前記ディジタルデータを受信し判定するための検出装置の前記第１および第２の出力端に接続する判定装置とからなる前記方法を使用する装置において、ｅ）前記判定装置は、前記第２の出力端に接続されるコンピュータユニット（２７）と、始動および停止入力端をそれぞれ有する２つのカウンタ（１７，１８）と、および前記カウンタの前記始動および停止入力端を検出装置の第１の出力端（１１）に接続する切換装置（２４）とからなり、ｆ）ここにおいて、前記切換装置は前記検出装置により各パルス出力端で前記２つのカウンタを反対方向にオンとオフに切り換えることで、１つのカウンタが計数している間、別のカウンタは停止しおよび／またはカウントを伝送しており、前記カウンタのサイクル時間はクロック発生器装置（２５）で予め決定され、そしてｇ）前記標的粒子の特性を決定するために前記カウントは前記コンピュータユニット（２７）に伝送可能であることを特徴とする請求項１記載の前記方法を使用する装置。１９．前記装置において、前記カウンタ（１７，１８）を停止後および再始動前にリセットするように接続することを特徴とする請求項１８記載の装置。２０．前記装置において、前記第１の出力端（１１）から電気パルスを受信すると、前記検出装置（８）によりディジタルデータ出力を記憶し、それらをカウンタ（１７，１８）のカウントと関連付けるように前記判定装置を構成することを特徴とする請求項１８または１９のいずれか１項記載の装置。２１．前記装置において、前記カウンタ（１７，１８）の後に前記コンピュータユニット（２７）に伝送する前に１つのカウンタまたは複数のカウンタを記憶するための少なくとも１つの中間メモリ（２６）が続くことを特徴とする請求項１８乃至２０のいずれか１項記載の装置。２２．前記装置において、前記コンピュータユニット（２７）は前記ディジタルデータを受信するためのディジタル入出力カード（２８）を有するコンピュータからなり、そして前記データ受信カードは前記検出装置（８）からのパルス（１１）により起動することを特徴とする請求項１８乃至２１のいずれか１項記載の装置。２３．前記装置において、前記検出装置（８）は１を超える検出装置からなる請求項１８乃至２２のいずれか１項記載の装置。２４．前記装置において、前記検出装置（８）は共焦顕微鏡または近視野顕微鏡の形式の光学装置からなることを特徴とする請求項１８乃至２３のいずれか１項記載の装置。