JPH02195235A - 蛍光測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明は、蛍光測定装置、特に試料に励起光を入射し、
試料中の蛍光物質により発生する蛍光を１１−１定し、
これによって、蛍光物質により標識された試料中の物質
を特定する蛍光測定装置に関するものである。

［従来の技術］ 医療分野において、生体内微量物質の定量分析法として
は、従来から放射性物質を標識としたＲＩＡ（放射能免
疫分析法）及び酵素を標識としたＥＩＡ（酵素免疫分析
法）などの測定が行なわれており、このＲＩＡ、ＣＩＡ
と共に蛍光物質を標識とし、抗原−抗体反応を利用した
ＦＩＡ（蛍光免疫学的定量法）が広範囲に利用されてい
る。

特に、このＦＩＡは、一般的にある特定量の検体に対し
て、例えば、一種類の蛍光物質を標識とした試薬などを
反応させて、蛍光量の測定を行ない、その検出体中の一
種類の抗原量を定量することにある。

そして、このＦＩＡによる蛍光測定装置では、主に、蛍
光量自身、蛍光寿命時間あるいは蛍光開光解消時間の測
定を行なっている。

すなわち、蛍光量自身は、定常的励起光による蛍光量で
あり、蛍光寿命時間は、試料中の蛍光物質に励起光を入
射してから蛍光量が所定値まで減少するまでの時間を示
し、また蛍光偏光解消時間は、所定方向の偏光の励起光
を入射したときに、試料中の蛍光物質に発生する蛍光の
偏光が無偏光状態になるまでの時間を示す。そして、こ
れらの時間測定結果から、蛍光物質や蛍光物質により標
識された物質の特定を行なっている。

第６図（Ａ）、（Ｂ）には、このようなＦＩＡによる蛍
光測定装置の従来例が示されており、以下その構成・作
用を説明する。

第６図（Ａ）には、前述した蛍光寿命時間を測定する場
合の装置が示されている。

すなわち、従来のＦＩＡによる蛍光測定装置において、
励起光源１０から、所定の励起波長の励起光１０ａが試
料１４へ入射されると、容器内の被検体に含まれている
蛍光物質は、照射された励起光１０ａに応じて所定の蛍
光波長の蛍光１４ａを発生する。そして、この蛍光１４
ａを光検出器１８が１ｌｌｌ光し、測光値として時系列
信号１８ａを出力している。

ここで、試料１４に入射される所定励起波長の励起光１
０ａと、蛍光波長の蛍光１４ａにより、出力する時系列
信号１８ａが第２図に示されている。

一般に、蛍光１４ａは、時間と共に変化し、その応答の
波形は、蛍光物質によって決定される。

すなわち、第２図に示されているように、励起光１０ａ
がパルス波形として試料１４に入射されると、励起光の
パルス波形立上がりから蛍光１４ａが発生し、蛍光量が
増加し始める。

次に、励起光１０ａのパルス波形立下がりで励起光はし
ゃ断されるので、この立下がり時点からは、第２図に示
したように蛍光量が減少し、励起光のパルス波形立下が
りから時間Ｔ１後には蛍光量がＯとなる。従って、蛍光
１４ａは、時間と共に変化することが理解される。

特に、試料中に含まれている蛍光物質の性質は、第２図
に示されているように前述した励起光のパルス波形立下
がり時点からの蛍光量の減少カーブａ、ｂに現われ、例
えば、急激に減少するカーブａと、比較的ゆるやかに減
少するカーブｂとの比較により、蛍光物質の違いが理解
される。

更に、この蛍光量の減少カーブに応じて蛍光寿命時間Ｔ
１が決まり、蛍光物質の特定を可能としている。

次に、第６図（Ｂ）には、前述した蛍光偏光解消時間を
測定する場合の装置が示されている。なお、第６図（Ａ
）との同一部材には同一符号を付し、以下説明を省略す
る。

この第６図（Ｂ）では、前述した第６図（Ａ）とを比較
すれば、蛍光偏光解消時間のｉｌｌ定において、所定の
偏光方向の励起光を得るために、偏光板１２を励起光源
１０と試料１４の間に設け、また、偏光板１６を試料１
４と光検出器１８の間に設けたことに違いがある。

すなわち、偏光板１２は励起光源１０より照射される励
起光１０ａから所定の一方向（偏光）のみの励起光を得
るためのものであり、この励起光が試料中の蛍光物質に
照射される。これにより、蛍光物質から蛍光が発せられ
ると、偏光板１６は、特定の偏光方向のみの蛍光１４ａ
を通過させる。

そして、光検出器１８は、その蛍光１４ａを検出し、測
光を行ない、時系列信号１８ａを出力する。

ここで、第３図には、前述した第２図と同様に、励起光
１０ａと蛍光量（時系列信号１８ａ）とが示されている
。第３図において、第２図と相違することは、この時系
列信号１８ａの蛍光偏光解消時間Ｔ２を測定することに
よって蛍光物質を特定することにある。

すなわち、試料１４の容器に注入された溶液中の分子の
細かい運動（ブラウン運動）は、分子量が大きいほど遅
くなる。この分子の動きは、分子に標識した蛍光の偏光
の時間変化から測定することができる。すなわち、第３
図に示す偏波面のそろった励起光１０ａで、蛍光物質が
標識された分子を励起すると、その励起した時点から蛍
光を発生し始める。そして、この蛍光１４ａは、励起光
１０ａのパルス立上がりから立下がり時までは、励起光
の偏光方向に応じて偏波面が一定方向にそろっているの
で蛍光量が増加する。

ところが、そのパルス立下がり後、励起光がしゃ断され
ると、分子が細かく運動している速度とともに、偏波面
が不規則となり、最終的には無偏光になる。

従って、分子の運動速度は、分子量に依存するので、偏
光から無偏光になるまでの蛍光偏光解消時間を測定すれ
ば、分子量に相当する蛍光物質を特定することができる
。

以上のことから、第３図に示された時系列信号１８ａは
、蛍光偏光解消時間Ｔ２と共に変化する蛍光量を示した
ものであり、勿論、第２図と同様に蛍光量の減少する過
程において、その減少カーブｃ、ｄにより、蛍光物質の
特定が可能となる。

［発明が解決しようとする課題］ 以上のように、試料中の蛍光物質を測定する従来の蛍光
測定装置は、前述した第６図（Ａ）、（Ｂ）のように構
成されていたので、測光値としての時系列信号１８ｇに
基づいて、蛍光量の減少波形、蛍光寿命時間Ｔ１、ある
いは蛍光偏光解消時間Ｔ２をａ―１定することにより、
蛍光物質、又は蛍光物質が標識されている物質の特定を
行なうことができる。

しかしながら、従来の蛍光測定装置では、時間と共に変
化する蛍光量の蛍光寿命時間又は蛍光偏光解消時間だけ
の１１１定を行なうため、蛍光量の微妙な変化まで分析
することが困難であり、高精度に蛍光物質を分析するこ
とはできなかった。

すなわち、従来の蛍光ａ１定装置では、蛍光量の時間的
変化が比較的著しい蛍光物質のみしか特定できず、蛍光
物質の微妙な蛍光変化を捕えることができないため、場
合によっては、蛍光物質の特定を誤ってしまったり、あ
るいは特定することが困難な場合が生じていた。

発明の目的 本発明は上記従来の課題に鑑みなされたものであり、そ
の目的は、周波数分析手段により、蛍光物質から発生さ
れる時間と共に変化する蛍光量を測光し、その測光値で
ある時系列信号の周波数成分を分析することにより、蛍
光物質を高精度に解析でき、蛍光物質又は蛍光物質が標
識されている物質を特定することができる蛍光測定装置
を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 上記目的を達成するために、本発明に係る蛍光ｎ１定装
置は、試料に光源からの所定励起波長の励起光を入射し
、該試料中に含まれている蛍光物質により発生する所定
蛍光波長の時間と共に変化する蛍光量を測光し、その測
光値としての時系列信号を周波数分析手段に入力して、
その周波数成分を分析し、前記時系列信号の周波数分析
結果によって、試料中の蛍光物質及び蛍光物質が標識さ
れている物質を特定することを特徴としている。

〔作用〕

上記構成における本発明の蛍光測定装置によれば、励起
光により、試料中に含まれた蛍光物質から発生される時
間と共に変化する蛍光量を測光し、その測光値である時
系列信号を周波数分析手段に入力し、その周波数成分を
分析することができる。

この結果、蛍光物質の微妙な蛍光量の変化を捕えること
が可能となり、蛍光物質を高精度に分析でき、かつ、試
料中の蛍光物質あるいは蛍光物質が標識された物質を確
実に特定することができる。

［実施例］ 本発明に係る蛍光測定装置の好適な実施例を第１図に基
づいて説明するが、前述した第６図（Ａ）、（Ｂ）の同
一部材には同一符号を付して以下説明を省略する。

第１図に示された本発明の蛍光測定装置において特徴的
なことは、周波数分析手段として周波数分析装置２０を
設け、これにより、蛍光物質から発生する蛍光量の１ｌ
ＦＩ光値である時系列信号１８ａを周波数分析すること
にある。この分析結果により、本発明は確実に蛍光物質
の特定が可能となる。

従って、第６図（Ａ）、（Ｂ）に示されている従来の蛍
光測定装置では、蛍光寿命時間Ｔ１あるいは蛍光偏光解
消時間Ｔ２の測定のみで、蛍光物質を分析していたので
、蛍光量の微妙な変化を観察することができず、確実な
物質の特定が困難であった。

そして、本発明のような時系列信号の周波数成分を分析
するために周波数分析手段を有する蛍光測定装置は今ま
でには存在していなかった。

第１図に示されている本実施例の蛍光測定装置は、周波
数分析手段としての周波数分析装置２゜を設けており、
前述した光検出器１８からの測光値である時系列信号１
８ａを入力している。

そして、該周波数分析装置内のアンプ２２は、該時系列
信号１８ａを所定レベルまで増幅するために設けられ、
Ａ／Ｄコンバータ２４は、アナログ信号である時系列信
号１８ａをデジタル信号に変換するために設けられてい
る。

また、ＦＦＴ　（ファースト・フーリエ・トランスフォ
ーメーション）２６は、周波数分析を行なう信号解析部
として設けられ、表示装置２８は、該ＦＦＴ２６がａ？
１定した周波数スペクトルを画像表示するために設けら
れている。

以下、次に作用について説明する。

前記アンプ２２は、時系列信号１８ａを入力し、所定レ
ベルまで増幅する。そして、増幅された時系列信号１８
ａは、Ａ／Ｄコンバータ２４に人力され、該時系列信号
をデジタル信号に変換して、ＦＦＴ２６に入力される。

ここで、ＦＦＴ２６は、時系列信号１８ａを周波数成分
に分解し、その周波数分析結果として、表示出力信号を
表示装置２８へ出力する。従って、表示装置２８は、そ
の周波数分析結果として、表示出力信号に基づいて、例
えば、周波数型カスベクトルをテレビ画面上に表示する
ことができる。

次に、以下第２図、第３図、第４図、及び第５図を用い
て、詳細にその作用を説明する。

第４図、第５図には、第２図、第３図に示された時系列
信号１８ａをＦＦＴ２６に入力し、周波数分析を行った
結果として、表示装置２８により画像表示された状態が
示されている。

すなわち、これが時系列信号１８ａの周波数成分を分析
したスペクトル分布であり、第４図には、パワースペク
トルの形状、及びパワースペクトルＰが最大時の１／２
になるところの周波数の変化幅を示すスペクトル半値幅
ＨａＳＨｂが示されており、これらの特性から蛍光物質
を分析することができる。

従って、このパワースペクトル表示により、周波数成分
の分布を知るとともに、微妙な分布変化を観察すること
ができ、高精度に時系列信号を分析することが可能とな
る。これによって、蛍光物質あるいは蛍光物質が標識さ
れた物質の特定を確実に行うことができる。

更に、第４図、第５図に示されたスペクトル表示につい
て、詳細に説明する。

例えば、−例として、蛍光寿命時間を７１１１定した場
合の、第２図に示されている時系列信号１８ａを、周波
数分析すると、第４図に示すスペクトル分布になる。

ここで、例えば、蛍光物質をＡとして、第２図の時系列
信号１８ａを蛍光量の急峻な減少カーブａとすると、ス
ペクトル分布は、第４図のａのようなカーブになり、低
い周波数から高い周波数までを含んだ多くの周波数成分
が含まれていることが理解される。従って、そのスペク
トル半値幅Ｈａは、周波数帯域の広い値になる。

次に、他の蛍光物質をＢとし、時系列信号１８ａを蛍光
量の急峻な減少カーブａに比べ、比較的ゆるやかなカー
ブｂとすれば、スペクトル分布は、第４図のｂのように
急激に減少したカーブとなり、高い周波数成分が少なく
、直流分を含む低い周波数成分が多く含まれれているこ
とが理解される。

従って、スペクトル半値幅Ｈｂは周波数帯域の狭い値と
なる。

このようにして、本発明の周波数分析装置によれば、従
来の時間変化のみの測定に比べ、蛍光物質ＡとＢにおけ
る蛍光量減少カーブａとｂ、及びスペクトル半値幅Ｈａ
とＨｂとの違いを詳細に観察することができ、周波数成
分をスペクトル表示することによって高精度に分析する
ことができる。

このため、異なる蛍光物質Ａ及びＢ特有の微妙な蛍光量
変化の違いを判別することが容易となる。

次に、他の例として、蛍光偏光解消時間を測定した場合
の第３図に示されている時系列信号１８ａを周波数分析
すると、第５図のようなスペクトル分布になる。

すなわち、例えば、試料中に含まれる蛍光物質Ｃについ
て、前述したように、第３図の蛍光量の減少が急峻なカ
ーブＣのときには、第５図のスペクトル分布は、Ｃのよ
うなパワースペクトルの変化が激しいカーブになり、こ
の結果、蛍光物質Ｃは、低周波領域でパワースペクトル
の変動が大きい性質を有することが理解される。

また、次に、例えば、蛍光物質りとして、１３図の蛍光
量の減少がゆるやかなカーブｄのときにゆは、第５図の
スペクトル分布は、ｄのようなカーブになり、この蛍光
物質りは、パワースペクトルの変動が少な（、安定した
性質を示すことがわかる。この結果から、蛍光の偏光に
おける蛍光物質ＣとＤとの蛍光量の特性上の違いが、ス
ペクトル表示によって明らかになり、本発明によれば、
従来の蛍光偏光時間のみの測定に比べ微妙なパワースペ
クトルレベルの変化まで捕えることができる。

以上のようにして、本発明の特徴である周波数分析装置
２０は、時間と共に変化する蛍光量をパワースペクトル
、周波数分布及びスペクトル半値幅を求めることができ
、これらの結果から、蛍光物質の発する蛍光量の変化を
詳細に調べることができると共に、高精度に分析するこ
とが可能となる。

なお、本実施例においては、周波数分析手段としての周
波数分析装置２０をＦＦＴ２６により解析することを示
したが、チャーブＺ方式を用いて周波数分析を行うこと
も可能である。

［発明の効果］ 以上のようにして、本発明に係る蛍光測定装置では、試
料中に含まれた蛍光物質により発生される時間と共に変
化する蛍光量をルー１定し、δ−１光値としての時系列
信号を周波数分析手段により、その周波数成分を分析す
ることができる。

このため、本発明では、従来における蛍光量の時間的変
化のみの分析では不可能であった蛍光物質を高精度に測
定することができ、スペクトル表示により、蛍光量の微
妙な変化を捕えることで、蛍光物質特有の性質を知るこ
とができる。

従って、本発明によれば、蛍光物質及び蛍光物質が漂識
された物質の特定を確実に行うことが可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の蛍光測定装置のブロック図、第２図
は励起光及び蛍光の波形を示した説明図、第３図は励起
光及び蛍光偏光の波形を示した説明図、 第４図、第５図は、本発明の蛍光ハ１定装置により、周
波数分析結果が示された説明図、第６図（Ａ）、（Ｂ）
は、従来の蛍光ａｌｌｌ装定のブロック図である。 ２０　・・・　周波数分析装置 ２２　・・・　アンプ ２４　・・・　Ａ／Ｄコンバータ ２６　・・・　ＦＦＴ ２８　・・・　表示装置 １０ａ　　・・・　励起光 １８ａ　　・・・　時系列信号 ＨａＳＨｂ　　・・・　スペクトル半値幅Ｔ１　・・・
　蛍光寿命時間 Ｔ２　・・・　蛍光両光解消時間。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 試料に光源からの所定励起波長の励起光を入射し、該試
   料中に含まれた蛍光物質により発生される所定蛍光波長
   の時間と共に変化する蛍光量を測光し、その測光値であ
   る時系列信号を測定する蛍光測定装置において、 前記時系列信号を入力し、その周波数成分を分析する周
   波数分析手段を有し、 前記周波数分析手段により、前記時系列信号の周波数分
   析結果によって、試料中の蛍光物質及び蛍光物質により
   標識された物質を特定することを特徴とする蛍光測定装
   置。