JP2002308899A

JP2002308899A - アシル化インスリン

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Publication number: JP2002308899A
Application number: JP2001385921A
Authority: JP
Inventors: Svend Havelund; ハベルン，スベン; J Broberg Halstrom; ブロベルイハルストレーム，ヨー; Ib Jonassen; ヨナセン，イブ; Asser Sloth Andersen; スロートアンデルセン，アセル; Jan Markussen; マルクセン，ヤン
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1993-09-17
Filing date: 2001-12-19
Publication date: 2002-10-23
Anticipated expiration: 2023-03-12
Also published as: JP2000060556A; NO2004006I1; PL178466B1; EP1132404A2; SI0792290T1; RU2164520C2; AU4846197A; UA45321C2; LU91101I2; CN1056618C; IL110977A; JP3917333B2; DK0792290T3; JP3014764B2; AU7652094A; KR960704925A; HUT75991A; FI961220A0; ATE204882T1; HU9600676D0

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は可溶性且つ遅延型プロフィールを有
するインスリン誘導体を提供する。【解決手段】本発明は、遅延型ヒトインスリン誘導体
であって、Ａ21及びＢ３アミノ酸残基が、独立して、 L
ys, Arg 及び Cysを除く遺伝子コードによりコードされ
うる任意のアミノ酸残基であり、 Phe^B1が欠失していて
よく；Ｂ30アミノ酸残基が欠失しているか、又はLys, A
rg及び Cysを除く遺伝子コードによりコードされうる任
意のアミノ酸残基であり、 Lys^B29 のε−アミノ基は親
油性置換基を有し、Zn²⁺複合体でないインスリン誘導体
に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、可溶性であり、且
つ遅延型の活性プロフィールを有する新規のヒトインス
リン誘導体、かかる誘導体の提供方法、それらを含む薬
理組成物、及び糖尿病の処置におけるかかるインスリン
の利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】多くの糖尿病患者は、食事に関係する必
要条件をカバーするため、即効性インスリンのボーラス
注射により補給される基底Ｘ要条件をカバーする遅延型
インスリンの１又は２回の日常注射を含んで成る療法で
の複数回の日常のインスリン注射で処置される。遅延型
インスリン組成物は当業界において公知である。即ち、
遅延型インスリン組成物の一の主要タイプは結晶インス
リン又はアモルファスインスリンの注射用水性懸濁物を
含んで成る。これらの組成物において、利用されるイン
スリン化合物は一般にプロタミンインスリン、亜鉛イン
スリン又はプロタミン亜鉛インスリンである。

【０００３】インスリン懸濁物の利用には所定の欠点が
ある。即ち、正確な投与量を保障するため、所定容量の
この懸濁物をバイアルから抜き取る又はカートリッジか
ら押し出す前にインスリン粒子をゆっくりと振盪させる
ことによって均質に懸濁しておかねばならない。また、
インスリン懸濁物の保存のためには、凝塊の形成又は凝
集を避けるため、インスリン溶液よりも幅の狭い域値内
に温度を保たねばならない。

【０００４】プロタミンは当初は非免疫原であると信じ
られていたが、しかし現在ではプロタミンはヒトにおい
て免疫原でありうる、また医療目的のためのその用途は
抗体の形成を招きうるものと明らかとなった（Samuel
ら、Studies on the immunogenecity of protamines in
humans and experimental animals by means of a mic
ro-complement fixation tesr, Clin. Exp. lmmunol. 3
3 , pp252-260 (1988))。

【０００５】また、プロタミン−インスリン複合体はそ
れ自体免疫原であることがわかった(Kurtzら、Circulat
ing IgG antibody to protamine in patients treated
withprotamine-insulins, Diabetologica25, pp322-324
(1983)) 。従って、一部の患者については、プロタミ
ン含有インスリン組成物の使用は避けねばならない。別
のタイプの遅延型インスリン組成物は生理学的pHより低
いpH値を有する溶液であり、その溶液を注射したときの
pH値の上昇を理由に、インスリンはその溶液から沈殿し
出す。このような溶液の欠点は、注射により組織の中で
形成される沈殿物の粒度分布、そしてそれ故薬物治療の
タイミングが、注射部位の血流及びその他のやや予測で
きない状況のパラメーターに依存する点にある。更なる
欠点は、インスリンの固体粒子が注射部位において組織
炎症を引き起こす局所刺激物として作用しうることにあ
る。

【０００６】WO 91／12817 (Novo Nordisk A／S)はコ
バルト（III ）のインスリン複合体を含んで成る遅延型
可溶性インスリン組成物を開示する。これらの複合体の
遅延性はほんの中間的であり、そしてその生物学的利用
能は低い。

【０００７】ヒトインスリンは３個の第一アミノ基を有
する：Ａ−鎖及びＢ−鎖のＮ−末端基並びに Lys^B29 の
ε−アミノ基。これらの一又は複数の基において置換さ
れているいくつかのインスリン誘導体が従来技術におい
て知られている。即ち、米国特許第 3,528,960号(Eli L
illy）はＮ−カルボキシアロイルインスリンであって、
そのインスリン分子の１，２又は３個の第一アミノ基が
カルボキシアロイル基を有するインスリンに関する。具
体的なＮε^B29 置換化インスリンは開示されていない。

【０００８】GB特許第 1,492,997号(Nat．Res. Dev. Co
rp.)によれば、Ｎε^B29 においてカルバミル置換を有す
るインスリンは向上した低血糖作用プロフィールを有す
る。

【０００９】日本特許公開公報第１−254699の（Kodama
Co., Ltd.）は、脂肪酸が Phe^B1のアミノ基に、もしく
は Lys^B29 のε−アミノ基に、又はその両者に結合して
いるインスリンを開示する。その誘導化の記述の目的
は、薬理学的に許容される安定なインスリン製剤の獲得
にある。

【００１０】Ｂ30において、ヌクレオチドトリプレット
により必ずしもコードされない少なくとも５個の炭素原
子を有するアミノ酸を有するインスリンが日本国特許公
開公報第57− 067,548号（Shionogi）に記載されてい
る。そのインスリン類似体は真性糖尿病、特にウシ又は
ブタインスリン抗体の発生によりインスリン耐性となっ
ている患者の真性糖尿病の処置において有用であると主
張されている。

【００１１】本明細書で用いている「インスリン誘導
体」とは、ヒトインスリンの分子構造と類似のそれを有
し、 Cys^A7と Cys^B7との間及び Cys^A20 と Cys^B19 との
間にジスルフィド架橋を、そして Cys^A6と Cys^A11 との
間に内部ジスルフィド架橋を有し、更にインスリン活性
を有する化合物を意味する。

【００１２】ところで、可溶性であり、且つ注射を経た
後に溶液のままであり、そして最少限の炎症及び免疫原
特性をもつインスリンを含む遅延型注射用インスリン組
成物についての要望がまだある。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の一の目的は、
遅延型の活性プロフィールをもち、生理学的pH値におい
て可溶性であるヒトインスリン誘導体を提供することに
ある。

【００１４】本発明の別の目的は、本発明に係るヒトイ
ンスリン誘導体を含んで成る薬理組成物の提供にある。
本発明の更なる目的は、本発明のヒトインスリン誘導体
を作るための方法の提供にある。

【００１５】

【課題を解決するための手段】驚くべきことに、 Lys
^B29 のε−アミノ基が親油性置換基を有している一定の
ヒトインスリン誘導体は遅延型の活性プロフィールを有
し、且つ生理学的pH値において可溶性であることが明ら
かにされた。

【００１６】従って、最も広い観点において、本発明は
以下の配列を有するインスリン誘導体：

【化１】（式中、Ａ21及びＢ３位にある Xaaは独立して、Lys, A
rg及び Cysを除く、遺伝子コードによりコードされうる
任意のアミノ酸残基であり；Ｂ３位にある Xaaは Pheに
あるか又は欠失しており；Ｂ１位にある Xaaは（ａ）10
〜24個の炭素原子を有するコードされ得ない親油性アミ
ノ酸、この場合５個までの炭素原子を有するカルボン酸
のアシル基が Lys^B29 のε−アミノ基に結合している、
（ｂ）Lys, Arg及び Cysを除く、遺伝子コードによりコ
ードされうる任意のアミノ酸残基、この場合、 Lys^B29
のε−アミノ基は親油性置換基を有する、又は（ｃ）欠
失している、この場合、 Lys^B29 のε−アミノ基は親油
性置換基を有する）及びその任意のZn²⁺複合体に関し、
ただしＢ30位にある Xaaが Thr又はAla,Ａ21及びＢ３位
にある Xaaが共に Asn、そしてＢ１位にある Xaaが Phe
であるとき、このインスリン誘導体はZn²⁺複合体となっ
ている。

【００１７】一の好適な態様において、本発明は、Ｂ30
アミノ酸残基が欠失しているか、又はLys, Arg及び Cys
を除く遺伝子コードによってコードされうる任意のアミ
ノ酸残基であり；Ａ21及びＢ３アミノ酸残基が独立し
て、Lys, Arg及び Cysを除く遺伝子コードによりコード
されうる任意のアミノ酸残基であり； Phe^B1が欠失して
いてよく； Lys^B29 のε−アミノ基が少なくとも６個の
炭素原子を含んで成る親油性置換基を有し；そして２〜
４個のZn²⁺イオンが各インスリンヘキサマーに結合して
いることのあるヒトインスリン誘導体に関連し、ただし
B30が Thr又は Alaであり、そしてＡ21及びＢ３が共に
Asnであり、そして Phe^B1が欠失していないとき、２〜
４個のZn²⁺イオンがこのインスリン誘導体の各ヘキサマ
ーに結合している。

【００１８】別の好適な態様において、本発明は、Ｂ30
アミノ酸残基が欠失しているか又はLys, Arg及び Cysを
除く遺伝子コードによりコードされうる任意のアミノ酸
残基であり；Ａ21及びＢ３アミノ酸残基が独立してLys,
Arg及び Cysを除く遺伝子コードによりコードされうる
任意のアミノ酸残基であり、ただしＢ30アミノ酸残基が
Ala又は Thrなら、残基Ａ21及びＢ３の少なくとも一方
が Asn以外のものであり； Phe^B1が欠失していてよく；
そして Lys^B29 のε−アミノ基が少なくとも６個の炭素
原子を含んで成る親油性置換基であるヒトインスリン誘
導体に関する。

【００１９】別の好適な態様において、本発明は、Ｂ30
アミノ酸残基が欠失しているか又はLys, Arg及び Cysを
除く遺伝子コードによりコードされうる任意のアミノ酸
残基であり；Ａ21及びＢ３アミノ酸残基が独立してLys,
Arg及び Cysを除く遺伝子コードによりコードされうる
任意のアミノ酸残基であり； Phe^B1が欠失してよく；Ly
s^B29 のε−アミノ基が少なくとも６個の炭素原子を含
んで成る親油性置換基であり；そして２〜４個のZn²⁺イ
オンが各インスリン亢量体に結合している、ヒトインス
リン誘導体に関する。

【００２０】別の好適な態様において、本発明はＢ30ア
ミノ酸残基が欠失しているヒトインスリン誘導体に関す
る。別の好適な態様において、本発明はＢ30アミノ酸残
基が Aspであるヒトインスリン誘導体に関する。別の好
適な態様において、本発明はＢ30アミノ酸残基が Gluで
あるヒトインスリン誘導体に関する。別の好適な態様に
おいて、本発明はＢ30アミノ酸残基が Thrであるヒトイ
ンスリン誘導体に関する。別の好適な態様において、本
発明はＢ30アミノ酸残基が少なくとも10個の炭素原子を
有する親油性アミノ酸であるヒトインスリン誘導体に関
する。

【００２１】別の好適な態様において、本発明はＢ30ア
ミノ酸が10〜24個の炭素原子を有する親油性α−アミノ
酸であるヒトインスリン誘導体に関する。

【００２２】別の好適な態様において、本発明はＢ30ア
ミノ酸が10〜24個の炭素原子を有する直鎖・飽和・脂肪
族α−アミノ酸であるヒトインスリン誘導体に関する。
別の好適な態様において、本発明はＢ30アミノ酸がＤ−
又はＬ−Ｎε−ドデカノイルリジンであるヒトインスリ
ン誘導体に関する。別の好適な態様において、本発明は
Ｂ30アミノ酸がα−アミノデカノン酸であるヒトインス
リン誘導体に関する。別の好適な態様において、本発明
はＢ30アミノ酸がα−アミノウンデカノン酸であるヒト
インスリン誘導体に関する。別の好適な態様において、
本発明はＢ30アミノ酸がα−アミノドデカノン酸である
ヒトインスリン誘導体に関する。別の好適な態様におい
て、本発明はＢ30アミノ酸がα−アミノトリデカノン酸
であるヒトインスリン誘導体に関する。別の好適な態様
において、本発明はＢ30アミノ酸がα−アミノテトラデ
カノン酸であるヒトインスリン誘導体に関する。別の好
適な態様において、本発明はＢ30アミノ酸がα−アミノ
ペンタデカノン酸であるヒトインスリン誘導体に関す
る。別の好適な態様において、本発明はＢ30アミノ酸が
α−アミノヘキサデカノン酸であるヒトインスリン誘導
体に関する。別の好適な態様において、本発明はＢ30ア
ミノ酸がα−アミノ酸であるヒトインスリン誘導体に関
する。

【００２３】別の好適な態様において、本発明はＡ21ア
ミノ酸が Alaであるヒトインスリン誘導体に関する。別
の好適な態様において、本発明はＡ21アミノ酸が Glnで
あるヒトインスリン誘導体に関する。別の好適な態様に
おいて、本発明はＡ21アミノ酸が Glyであるヒトインス
リン誘導体に関する。別の好適な態様において、本発明
はＡ21アミノ酸が Serであるヒトインスリン誘導体に関
する。

【００２４】別の好適な態様において、本発明はＢ３ア
ミノ酸が Aspであるヒトインスリン誘導体に関する。別
の好適な態様において、本発明はＢ３アミノ酸が Glnで
あるヒトインスリン誘導体に関する。別の好適な態様に
おいて、本発明はＢ３アミノ酸が Thrであるヒトインス
リン誘導体に関する。

【００２５】別の好適な態様において、本発明は Lys
^B29 のε−アミノ基が少なくとも６個の炭素原子を有す
るカルボン酸に対応するアシル基である親油性置換基を
有するヒトインスリン誘導体に関する。

【００２６】別の好適な態様において、本発明は Lys
^B29 のε−アミノ基が８〜12原子長の炭素鎖を有するカ
ルボン酸に対応する枝分れした又は枝分れしていないア
シル基である親油性置換基を有するヒトインスリン誘導
体に関する。

【００２７】別の好適な態様において、本発明は Lys
^B29 のε−アミノ基が少なくとも６個の炭素原子を有す
る脂肪酸に対応するアシル基である親油性置換基を有す
るヒトインスリン誘導体に関する。別の好適な態様にお
いて、本発明は Lys^B29 のε−アミノ基が６〜24個の炭
素原子を有する直鎖・飽和カルボン酸に対応するアシル
基である親油性置換基を有するヒトインスリン誘導体に
関する。別の好適な態様において、本発明は Lys^B29 の
ε−アミノ基が８〜24個の炭素原子を有する直鎖・飽和
カルボン酸に対応するアシル基である親油性置換基を有
するヒトインスリン誘導体に関する。別の好適な態様に
おいて、本発明は Lys^B29 のε−アミノ基が10〜16個の
炭素原子を有する直鎖・飽和カルボン酸に対応するアシ
ル基である親油性置換基を有するヒトインスリン誘導体
に関する。

【００２８】別の好適な態様において、本発明は Lys
^B29 のε−アミノ基が10個まで、好ましくは５個までの
オキシエチレン単位を含んで成るオリゴオキシエチレン
基である親油性置換基を有するヒトインスリン誘導体に
関する。別の好適な態様において、本発明は Lys^B29 の
ε−アミノ基が10個まで、好ましくは５個までのオキシ
プロピレン単位を含んで成るオリゴオキシプロピレン基
である親油性置換基を有するヒトインスリン誘導体に関
する。

【００２９】別の好適な態様において、本発明は各イン
スリンヘキサマーが２個のZn²⁺イオンと結合しているヒ
トインスリン誘導体に関する。別の好適な態様におい
て、本発明は各インスリンヘキサマーが３個のZn²⁺イオ
ンと結合しているヒトインスリン誘導体に関する。別の
好適な態様において、本発明は各インスリンヘキサマー
が４個のZn²⁺イオンと結合しているヒトインスリン誘導
体に関する。別の好適な態様において、本発明は糖尿病
を処置するための医薬品の調製のための本発明に係るヒ
トインスリン誘導体の利用に関する。

【００３０】別の好適な態様において、本発明は、治療
的に有効な量の本発明に係るヒトインスリン誘導体を薬
理学的に許容される担体と共に含んで成る糖尿病の処置
を必要とする患者のかかる処置のための薬理組成物に関
する。

【００３１】別の好適な態様において、本発明は、治療
的に有効な量の本発明に係るヒトインスリン誘導体を、
即効性を有するインスリン又はインスリン類似体と混合
されて、薬理学的に許容される担体と共に含んで成る糖
尿病の処置を必要とする患者のかかる処置のための薬理
組成物に関する。

【００３２】別の好適な態様において、本発明は、生理
学的pH値において可溶性である本発明に係るヒトインス
リン誘導体を含んで成る薬理組成物に関する。

【００３３】別の好適な態様において、本発明は約 6.5
〜約 8.5の間隔の中のpH値において可溶性である本発明
に係るヒトインスリン誘導体を含んで成る組成物に関す
る。別の好適な態様において、本発明は、本発明に係る
ヒトインスリン誘導体を含んで成る遅延型薬理組成物に
関する。

【００３４】別の好適な態様において、本発明は、約 1
20nmol／ml〜約1200nmol／ml、好ましくは約 600nmol／
mlの本発明に係るヒトインスリン誘導体を含む溶液であ
る薬理組成物に関する。

【００３５】別の好適な態様において、本発明は、治療
的に有効な量の本発明に係るインスリン誘導体を薬理学
的に許容される担体と共に糖尿病の処置を必要とする患
者に投与することを含んで成る、かかる処置を必要とす
る患者の糖尿病の処置のための方法に関する。

【００３６】別の好適な態様において、本発明は、治療
的に有効な量の本発明に係るインスリン誘導体を、即効
性を有するインスリン又はインスリン類似体と混合し
て、薬理学的に許容される担体と共に、糖尿病の処置を
必要とする患者に投与することを含んで成る、かかる処
置を必要とする患者の糖尿病の処置のための方法に関す
る。

【００３７】Zn²⁺イオンが結合していない本発明に係る
好適なヒトインスリン誘導体の例は以下の通りである：Ｎε^B29 −トリデカノイルデス（Ｂ30）ヒトインスリ
ン、Ｎε^B29 −テトラデカノイルデス（Ｂ30）ヒトイ
ンスリン、Ｎε^B29 −デカノイルデス（Ｂ30）ヒトイ
ンスリン、Ｎε^B29 −ドデカノイルデス（Ｂ30）ヒト
インスリン、Ｎε^B29 −トリデカノイル Gly^A21 デス
（Ｂ30）ヒトインスリン、Ｎε^B29 −テトラデカノイル
Gly^A21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン、Ｎε^B29 −デカ
ノイル Gly^A21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン、Ｎε^B29
−ドデカノイル Gly^A21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
Ｎε^B29 −トリデカノイル Gly^A21 Gln^B3デス（Ｂ30）
ヒトインスリン、Ｎε^B29 −テトラデカノイル Gly^A21
Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン、Ｎε^B29 −デカ
ノイル Gly^A21 Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン、Ｎ
ε^B29 −ドデカノイル Gly^A21 Gln^B3デス（Ｂ30）ヒト
インスリン、Ｎε^B29 −トリデカノイル Ala^A21 デス
（Ｂ30）ヒトインスリン、Ｎε^B29 −テトラデカノイル
Ala^A21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン、Ｎε^B29 −デカ
ノイル Ala^A21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン、Ｎε^B29
−ドデカノイル Ala^A21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン、
Ｎε^B29 −トリデカノイル Ala^A21 Gln^B3デス（Ｂ30）
ヒトインスリン、Ｎε^B29 −テトラデカノイル Ala^A21
Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン、Ｎε^B29 −デカ
ノイル Ala^A21 Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン、Ｎ
ε^B29 −ドデカノイル Ala^A21 Gln^B3デス（Ｂ30）ヒト
インスリン、Ｎε^B29 −トリデカノイル Gln^B3デス（Ｂ
30）ヒトインスリン、Ｎε^B29 −テトラデカノイル Gln
^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン、Ｎε^B29 −デカノイル
Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン、Ｎε^B29 −ドデカ
ノイル Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン、Ｎε^B29 −
トリデカノイル Gly^A21 ヒトインスリン、Ｎε^B29 −テ
トラデカノイル Gly^A21 ヒトインスリン、Ｎε^B29 −デ
カノイル Gly^A21 ヒトインスリン、Ｎε^B29 −ドデカノ
イル Gly^A21 ヒトインスリン、Ｎε^B29 −トリデカノイ
ル Gly^A21 Gln^B3ヒトインスリン、Ｎε^B29 −テトラデ
カノイル Gly^A21 Gln^B3ヒトインスリン、Ｎε^B29 −デ
カノイル Gly^A21 Gln^B3ヒトインスリン、Ｎε^B29 −ド
デカノイル Gly^A21 Gln^B3ヒトインスリン、Ｎε^B29 −
トリデカノイル Ala^A21 ヒトインスリン、Ｎε^B29 −テ
トラデカノイル Ala^A21 ヒトインスリン、Ｎε^B29 −デ
カノイル Ala^A21 ヒトインスリン、Ｎε^B29 −ドデカノ
イル Ala^A21 ヒトインスリン、Ｎε^B29 −トリデカノイ
ル Ala^A21 Gln^B3ヒトインスリン、Ｎε^B29 −テトラデ
カノイル Ala^A21 Gln^B3ヒトインスリン、Ｎε^B29 −デ
カノイル Ala^A21 Gln^B3ヒトインスリン、Ｎε^B29 −ド
デカノイル Ala^A21 Gln^B3ヒトインスリン、Ｎε^B29 −
トリデカノイル Gln^B3ヒトインスリン、Ｎε^B29 −テト
ラデカノイル Gln^B3ヒトインスリン、Ｎε^B29 −デカノ
イル Gln^B3ヒトインスリン、Ｎε^B29 −ドデカノイル G
ln^B3ヒトインスリン、Ｎε^B29 −トリデカノイル Glu
^B30 ヒトインスリン、Ｎε^B29 −テトラデカノイル Glu
^B30 ヒトインスリン、Ｎε^B29 −デカノイル Glu^B30 ヒ
トインスリン、Ｎε^B29 −ドデカノイル Glu^B30 ヒトイ
ンスリン、Ｎε^B29 −トリデカノイル Gly^A21 Glu^B30
ヒトインスリン、Ｎε^B29 −テトラデカノイル Gly^A21
Glu^B30 ヒトインスリン、Ｎε^B29 −デカノイル Gly
^A21 Glu^B30 ヒトインスリン、Ｎε^B29 −ドデカノイル
Gly^A21 Glu^B30 ヒトインスリン、Ｎε^B29 −トリデカ
ノイル Gly^A21 Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン、

【００３８】Ｎε^B29 −テトラデカノイル Gly^A21 Gln
^B3 Glu^B30 ヒトインスリン、Ｎε^B29 −デカノイル Gly
^A21 Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン、Ｎε^B29 −ドデカ
ノイル Gly^A21 Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン、Ｎε
^B29 −トリデカノイル Ala^A21 Glu^B30 ヒトインスリ
ン、Ｎε^B29 −テトラデカノイル Ala^A21 Glu^B30 ヒト
インスリン、Ｎε^B29 −デカノイル Ala^A21 Glu^B30 ヒ
トインスリン、Ｎε^B29 −ドデカノイル Ala^A21 Glu
^B30 ヒトインスリン、Ｎε^B29 −トリデカノイル Ala
^A21 Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン、Ｎε^B29 −テトラ
デカノイル Ala^A21 Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン、Ｎ
ε^B29 −デカノイル Ala^A21 Gln^B3 Glu^B30 ヒトインス
リン、Ｎε^B29 −ドデカノイル Ala^A21 Gln^B3 Glu^B30
ヒトインスリン、Ｎε^B29 −トリデカノイル Gln^B3 Glu
^B30 ヒトインスリン、Ｎε^B29 −テトラデカノイル Gln
^B3 Glu^B30 ヒトインスリン、Ｎε^B29 −デカノイル Gln
^B3 Glu^B30 ヒトインスリン、及びＮε^B29 −ドデカノイ
ル Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン。

【００３９】２個のZn²⁺イオンが一のインスリンヘキサ
マー当りに結合している本発明に係る好適なヒトインス
リン誘導体の例は以下の通りである：（Ｎε^B29 −トリ
デカノイルデス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、
（Ｎε^B29 −テトラデカノイルデス（Ｂ30）ヒトイン
スリン）₆,2Zn²⁺ 、（Ｎε^B29 −デカノイルデス（Ｂ
30）ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノ
イルデス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε
^B29 −トリデカノイル Gly^A21 デス（Ｂ30）ヒトインス
リン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Gly
^A21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 2Zn ²⁺、（Ｎε
^B29 −デカノイル Gly^A21 デス（Ｂ30）ヒトインスリ
ン）₆,2Zn²⁺ 、（Ｎε^B29 −ドデカノイル Gly^A21 デス
（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリ
デカノイル Gly^A21 Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリ
ン）₆,2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Gly^A21
Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン） ₆, 2Zn²⁺、（Ｎε
^B29 −デカノイル Gly^A21 Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトイン
スリン）₆, 2Zn ²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル Gly^A21
Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎ
ε^B29 −トリデカノイル Ala^A21 デス（Ｂ30）ヒトイン
スリン）₆, 2Zn²⁺、

【００４０】（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Ala^A21 デ
ス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 2Zn ²⁺、（Ｎε^B29 −デ
カノイル Ala^A21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 2Zn
²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル Ala^A21 デス（Ｂ30）ヒ
トインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイル
Ala^A21 Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆,2Z
n²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Ala^A21 Gln^B3デ
ス（Ｂ30）ヒトインスリン） ₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デ
カノイル Ala^A21 Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）
₆, 2Zn ²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル Ala^A21 Gln^B3デ
ス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ト
リデカノイル Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 2
Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Gln^B3デス（Ｂ3
0）ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイ
ル Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、

【００４１】（Ｎε^B29 −ドデカノイル Gln^B3デス（Ｂ
30）ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカ
ノイルヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テト
ラデカノイルヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29
−デカノイルヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29
−ドデカノイルヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε
^B29 −トリデカノイル Gly^A21 ヒトインスリン）₆, 2Zn
²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Gly^A21 ヒトインス
リン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイル Gly^A21 ヒト
インスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル Gly
^A21 ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカ
ノイル Gly^A21 Gln^B3ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎ
ε^B29 −テトラデカノイル Gly^A21 Gln^B3ヒトインスリ
ン）₆,2Zn²⁺ 、（Ｎε^B29 −デカノイル Gly^A21 Gln^B3
ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル
Gly^A21 Gln^B3ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29
−トリデカノイル Ala^A21 ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、
（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Ala^A21 ヒトインスリ
ン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイル Ala^A21 ヒトイ
ンスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル Ala
^A21 ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカ
ノイル Ala^A21 Gln^B3ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、

【００４２】（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Ala^A21 G
ln^B3ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイ
ル Ala^A21 Gln^B3ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε
^B29 −ドデカノイル Ala^A21 Gln^B3ヒトインスリン）₆,
2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイル Gln^B3ヒトインス
リン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Gln^B3
ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイル G
ln^B3ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノ
イル Gln^B3ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ト
リデカノイル Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎ
ε^B29 −テトラデカノイル Glu^B30 ヒトインスリン）₆,
2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイル Glu^B30 ヒトインスリ
ン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル Glu^B30 ヒト
インスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイル G
ly^A21 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29
−テトラデカノイル Gly^A21 Glu^B30 ヒトインスリン）
₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイル Gly^A21 Glu^B30 ヒ
トインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル G
ly^A21 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29
−トリデカノイル Gly^A21 Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリ
ン）₆, 2Zn ²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Gly^A21
Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29
−デカノイル Gly^A21 Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリ
ン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル Gly^A21 Gln
^B3 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ト
リデカノイル Ala^A21 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 2Zn
²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Ala^A21 Glu^B30 ヒ
トインスリン）₆, 2Zn²⁺、

【００４３】（Ｎε^B29 −デカノイル Ala^A21 Glu^B30
ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル
Ala^A21 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε
^B29 −トリデカノイル Ala^A21 Gln^B3 Glu^B30 ヒトイン
スリン）₆, 2Zn ²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Ala
^A21 Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε
^B29 −デカノイル Ala^A21 Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリ
ン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル Ala^A21 Gln
^B3 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ト
リデカノイル Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 2Z
n²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Gln^B3 Glu^B30 ヒ
トインスリン）₆, 2Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイル Gln
^B3 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 2Zn²⁺及び（Ｎε^B29 −
ドデカノイル Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 2Z
n²⁺。

【００４４】３個のZn²⁺イオンが一のインスリンヘキサ
マー当りに結合している本発明に係る好適なヒトインス
リン誘導体の例は以下の通りである：（Ｎε^B29 −トリデカノイルデス（Ｂ30）ヒトインス
リン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイルデス
（Ｂ30）ヒトインスリン）₆,3Zn²⁺ 、（Ｎε^B29 −デカ
ノイルデス（Ｂ30) ヒトインスリン)₆,3Zn²⁺、（Ｎε
^B29 −ドデカノイルデス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆,
3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイル Gly^A21 デス（Ｂ
30）ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデ
カノイル Gly^A21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 3Zn
²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイル Gly^A21 デス（Ｂ30）ヒト
インスリン）₆,3Zn²⁺ 、（Ｎε^B29 −ドデカノイル Gly
^A21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε
^B29 −トリデカノイル Gly^A21 Gln^B3デス（Ｂ30）ヒト
インスリン）₆,3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイル
Gly^A21 Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン） ₆, 3Z
n²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイル Gly^A21 Gln^B3デス（Ｂ3
0）ヒトインスリン）₆, 3Zn ²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノ
イル Gly^A21 Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 3
Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイル Ala^A21 デス（Ｂ3
0）ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデ
カノイル Ala^A21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 3Zn
²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイル Ala^A21 デス（Ｂ30）ヒト
インスリン）₆, 3Zn²⁺、

【００４５】（Ｎε^B29 −ドデカノイル Ala^A21 デス
（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリ
デカノイル Ala^A21 Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリ
ン）₆,3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Ala^A21
Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン） ₆, 3Zn²⁺、（Ｎε
^B29 −デカノイル Ala^A21 Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトイン
スリン）₆, 3Zn ²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル Ala^A21
Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎ
ε^B29 −トリデカノイル Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインス
リン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Gln^B3
デス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、

【００４６】（Ｎε^B29 −デカノイル Gln^B3デス（Ｂ3
0）ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノ
イル Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、
（Ｎε^B29 −トリデカノイルヒトインスリン）₆, 3Zn
²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイルヒトインスリン）
₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイルヒトインスリン）
₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイルヒトインスリ
ン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイル Gly^A21 ヒ
トインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイ
ル Gly^A21 ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デ
カノイル Gly^A21 ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε
^B29 −ドデカノイル Gly^A21 ヒトインスリン）₆, 3Z
n²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイル Gly^A21 Gln^B3ヒト
インスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイル
Gly^A21 Gln^B3ヒトインスリン）₆,3Zn²⁺ 、（Ｎε^B29
−デカノイル Gly^A21 Gln^B3ヒトインスリン）₆, 3Z
n²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル Gly^A21 Gln^B3ヒトイ
ンスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイル Ala
^A21 ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデ
カノイル Ala^A21 ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、

【００４７】（Ｎε^B29 −デカノイル Ala^A21 ヒトイン
スリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル Ala^A21
ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイ
ル Ala^A21 Gln^B3ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε
^B29 −テトラデカノイル Ala^A21 Gln^B3ヒトインスリ
ン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイル Ala^A21 Gln^B3
ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル
Ala^A21 Gln^B3ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29
−トリデカノイル Gln^B3ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、
（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Gln^B3ヒトインスリン）
₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイル Gln^B3ヒトインスリ
ン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル Gln^B3ヒトイ
ンスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイル Glu
^B30 ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデ
カノイル Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε
^B29 −デカノイル Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、
（Ｎε^B29 −ドデカノイル Glu^B30 ヒトインスリン）₆,
3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイル Gly^A21 Glu^B30
ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、

【００４８】（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Gly^A21 G
lu^B30 ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デカノ
イル Gly^A21 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎ
ε^B29 −ドデカノイル Gly^A21 Glu^B30 ヒトインスリ
ン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイル Gly^A21 G
ln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 3Zn ²⁺、（Ｎε^B29 −
テトラデカノイル Gly^A21 Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリ
ン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイル Gly^A21 Gln^B3
Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ドデ
カノイル Gly^A21 Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 3
Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイル Ala^A21 Glu^B30 ヒ
トインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイ
ル Ala^A21 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε
^B29 −デカノイル Ala^A21 Glu^B30 ヒトインスリン）₆,
3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル Ala^A21 Glu^B30 ヒ
トインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイル
Ala^A21 Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 3Zn ²⁺、

【００４９】（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Ala^A21 G
ln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −
デカノイル Ala^A21 Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン）₆,
3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル Ala^A21 Gln^B3 Glu
^B30 ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカ
ノイル Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎ
ε^B29 −テトラデカノイル Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリ
ン）₆, 3Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイル Gln^B3 Glu^B30
ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺及び（Ｎε^B29 −ドデカノイ
ル Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺。

【００５０】４個のZn²⁺イオンがこのインスリンヘキサ
マー当りに結合している本発明に係る好適なヒトインス
リン誘導体の例は以下の通りである：（Ｎε^B29 −トリデカノイルデス（Ｂ30）ヒトインス
リン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイルデス
（Ｂ30）ヒトインスリン）₆,4Zn²⁺ 、（Ｎε^B29 −デカ
ノイルデス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎ
ε^B29 −ドデカノイルデス（Ｂ30）ヒトインスリン）
₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイル Gly^A21 デス
（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テト
ラデカノイル Gly^A21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆,
4Zn ²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイル Gly^A21 デス（Ｂ30）
ヒトインスリン）₆,4Zn²⁺ 、（Ｎε^B29 −ドデカノイル
Gly^A21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎ
ε^B29 −トリデカノイル Gly^A21 Gln^B3デス（Ｂ30）ヒ
トインスリン）₆,4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイ
ル Gly^A21 Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン） ₆, 4Zn
²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイル Gly^A21 Gln^B3デス（Ｂ3
0）ヒトインスリン）₆, 4Zn ²⁺、

【００５１】（Ｎε^B29 −ドデカノイル Gly^A21 Gln^B3
デス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −
トリデカノイル Ala^A21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）
₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Ala^A21 デス
（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 4Zn ²⁺、（Ｎε^B29 −デカ
ノイル Ala^A21 デス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 4Z
n²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル Ala^A21 デス（Ｂ30）
ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイ
ル Ala^A21 Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆,4Zn
²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Ala^A21 Gln^B3デス
（Ｂ30）ヒトインスリン） ₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デカ
ノイル Ala^A21 Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆,
4Zn ²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル Ala^A21 Gln^B3デス
（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリ
デカノイル Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 4Zn
²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Gln^B3デス（Ｂ30）
ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイル G
ln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε
^B29 −ドデカノイル Gln^B3デス（Ｂ30）ヒトインスリ
ン）₆, 4Zn²⁺、

【００５２】（Ｎε^B29 −トリデカノイルヒトインス
リン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイルヒト
インスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイルヒト
インスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイルヒ
トインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイル
Gly^A21 ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テト
ラデカノイル Gly^A21 ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎ
ε^B29 −デカノイル Gly^A21 ヒトインスリン）₆, 4Z
n²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル Gly^A21 ヒトインスリ
ン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイル Gly^A21 G
ln^B3ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデ
カノイル Gly^A21 Gln^B3ヒトインスリン）₆,4Zn²⁺ 、
（Ｎε^B29 −デカノイル Gly^A21 Gln^B3ヒトインスリ
ン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル Gly^A21 Gln
^B3ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノ
イル Ala^A21 ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −
テトラデカノイル Ala^A21 ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、
（Ｎε^B29 −デカノイル Ala^A21 ヒトインスリン）₆, 4
Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル Ala^A21 ヒトインスリ
ン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイル Ala^A21 G
ln^B3ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデ
カノイル Ala^A21 Gln^B3ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、
（Ｎε^B29 −デカノイル Ala^A21 Gln^B3ヒトインスリ
ン）₆, 4Zn²⁺、

【００５３】（Ｎε^B29 −ドデカノイル Ala^A21 Gln^B3
ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイ
ル Gln^B3ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テト
ラデカノイル Gln^B3ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε
^B29 −デカノイル Gln^B3ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、
（Ｎε^B29 −ドデカノイル Gln^B3ヒトインスリン）₆, 4
Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイル Glu^B30 ヒトインス
リン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Glu
^B30 ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイ
ル Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ド
デカノイル Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε
^B29 −トリデカノイル Gly^A21 Glu^B30 ヒトインスリ
ン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Gly^A21
Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デ
カノイル Gly^A21 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、
（Ｎε^B29 −ドデカノイル Gly^A21 Glu^B30 ヒトインス
リン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイル Gly^A21
Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 4Zn ²⁺、（Ｎε^B29
−テトラデカノイル Gly^A21 Gln^B3 Glu^B30 ヒトイン
スリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイル Gly^A21 G
ln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −
ドデカノイル Gly^A21 Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン）
₆, 4Zn²⁺、

【００５４】（Ｎε^B29 −トリデカノイル Ala^A21 Glu
^B30 ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデ
カノイル Ala^A21 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、
（Ｎε^B29 −デカノイル Ala^A21 Glu^B30 ヒトインスリ
ン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −ドデカノイル Ala^A21 Glu
^B30 ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカ
ノイル Ala^A21 Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 4Zn
²⁺、（Ｎε^B29 −テトラデカノイル Ala^A21 Gln^B3 Glu
^B30 ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイ
ル Ala^A21 Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺、
（Ｎε^B29 −ドデカノイル Ala^A21 Gln^B3 Glu^B30 ヒト
インスリン）₆, 4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −トリデカノイル G
ln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 4 Zn²⁺、（Ｎε^B29
−テトラデカノイル Gln^B3 Glu^B30 ヒトインスリン）₆,
4Zn²⁺、（Ｎε^B29 −デカノイル Gln^B3 Glu^B30 ヒトイ
ンスリン）₆, 4Zn²⁺及び（Ｎε^B29 −ドデカノイル Gln
^B3 Glu^B30 ヒトインスリン）₆, 4Zn²⁺。

【００５５】用語本明細書において用いているアミノ酸残基についての３
文字コード及び１文字コードはJ. Biol. Chem. 243, p.
3558 (1968) に記載されているものである。この DNA配
列において、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニ
ン、そしてＴはチミンである。

【００５６】以下の頭文字語を使用した：ジメチルスル
ホキシドについてはDMSO、ジメチルホルムアミドについ
ては DMF, tert・ブトキシカルボニルについては Boc、
逆相高性能液体クロマトグラフィーについてはRP-HPLC,
X-OSuはＮ−ヒドロキシスクシニミドエステル、Ｘはア
シル基、そしてトリフルオ酢酸については TFA。

【００５７】

【発明の実施の形態】親油性インスリン誘導体の調製本発明に係るインスリン誘導体はとりわけ以下に記載の
通りにして調製できる：１．Ｂ30位における遺伝子コードによりコードされう
るアミノ酸残基、例えばスレオニン（ヒトインスリン）
又はアラニン（ブタインスリン）を特徴とするインスリ
ン誘導体１．１ヒトインスリンからの出発ヒトインスリンを Boc−試薬（例えばジ−tert−ブチル
ジカルボネート）で処理して（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocヒ
トインスリン、即ち、両鎖のＮ−末端が Boc基によって
保護されているヒトインスリンを生成する。HPLC等によ
る任意的な精製後、その生成物をＸが導入すべきアシル
基である式 X-OSuのＮ−ヒドロキシスクシニミドエステ
ルと反応させることによりアシル基を Lys^B29 のε−ア
ミノ基の中に導入する。最終段階において、 TFAを Boc
基を除去するために使用し、次いで生成物Ｎε^B29 −Ｘ
ヒトインスリンを単離する。

【００５８】１．２一本鎖インスリン前駆体からの出
発Ｂ１位においてアルギニン残基を介してそのＢ１に接続
されている伸長部(Exp）で伸長され、且つＢ30とＡ１と
の架橋がアルギニン残基である一本鎖インスリン前駆
体、即ち、一般式Ext-Arg-B(1-30)-Arg-A(1-21) の化合
物を出発材料として用いてよい。Ｘがアシル基である一
般式 X-OSuのＮ−ヒドロキシススクシニミドエステルに
よるこの出発材料のアシル化は、 Lys^B29 のε−アミノ
基の中及び前駆体のＮ−末端アミノ基の中にアシル基Ｘ
を導入する。一般式（Ｎε^B29 −Ｘ）のこのアシル化前
駆体、即ちX-Ext-Arg-B(1-30)-Arg-A(1-21) を、水と適
当な水混和性有機溶媒、例えば DMF, DMSO又は低級アル
コールとの混合物の中でトリプシンにより処理すること
で、式（Ｎε^B29 −Ｘ）の中間体 Arg^B31 インスリンが
得られる。この中間体をカルボキシペプチダーゼＢで処
理すると所望の生成物（Ｎε^B29 −Ｘ）インスリンが得
られる。

【００５９】２．Ｂ30位においてアミノ酸残基を有さ
ないインスリン誘導体、即ちデス（Ｂ30）インスリン２．１ヒトインスリン又はブタインスリンからの出発アンモニアバッファー中でのカルボキシペプチダーゼＡ
による処理により、ヒトインスリン及びブタインスリン
は共にデス（Ｂ30）インスリンとなる。任意的な精製の
後、デス（Ｂ30）インスリンを Boc試薬（例えばジ−te
rt−ブチルジカルボネート）で処理して（Ａ１，Ｂ１）
−ジ Boc デス（Ｂ30）インスリン、即ち、両鎖のＮ−
末端が Boc−基により保護されているインスリンを生成
する。HPLCの如くによる任意的な精製の後、その生成物
をＸが導入すべきアシル基である式 X-OSuのＮ−ヒドロ
キシスクシニミドエステルと反応させることにより Lys
^B2 ⁹ のε−アミノ基の中にアシル基を導入する。最終工
程において、 Boc基を除去するのに TFAを使用し、そし
て生成物（Ｎε^B29 −Ｘ）デス（Ｂ30）インスリンを単
離する。

【００６０】２．２一本鎖ヒトインスリン前駆体から
の出発Ｂ１位においてアルギニン残基を介してそのＢ１位に接
続されている伸長部(Exp）で伸長され、且つＢ30とＡ１
とに架橋を有する一本鎖インスリン前駆体が有用な出発
材料となりうる。好ましくは、この架橋は式Yn-Argのペ
プチドであり、ここでＹはリジン及びアルギニンを除く
コード可能なアミノ酸であり、そしてｎは０又は１〜35
の整数である。ｎ＞１のとき、Ｙは辺々のアミノ酸を表
示しうる。Ｂ30とＡ１との架橋の好適な例はAlaAlaArg,
SerArg, SerAspAspAlaArg及び Arg（ヨーロッパ特許第
163529号）である。一般式Ext-Arg-B(1-30)-Yn-Arg-A(1
-21)のかかる前駆体のリシルエンドペプチダーゼ、例え
ばアクロモバクター・リティカス（Achromobacter lyti
cus ）プロテアーゼによる処理はExt-Arg-B(1-29)-Thr-
Yn-Arg-A(1-21)デス（Ｂ30）インスリンをもたらした。
この中間体の、一般式 X-OSuのＮ−ヒドロキシスクシニ
ミドエステル（ここでＸはアシル基である）によるアシ
ル化は、アシル基Ｘを Lys^B29 のε−アミノ基の中に並
び並びにＡ−鎖及びＢ−鎖の中にＮ−末端アミノ基を導
入し、（Ｎε^B29 −Ｘ）X-Ext-Arg-B(1-29)X-Thr-Yn-Ar
g-A(1-21) デス（Ｂ30）インスリンをもたらす。この中
間体は、水と適当な有機溶媒、例えば DMF, DMSO又は低
級アルコールとの混合物の中での処理により、所望の誘
導体（Ｎε^B29 −Ｘ）デス（Ｂ30）ヒトインスリンをも
たらす。

【００６１】Ｎε^B29 修飾インスリンのデーターＮε^B29 修飾インスリンの一定の実験データーを表１に
示す。

【００６２】インスリン誘導体の、ヒトインスリンに対
する親油性 k'relを、LiChrosorb RP18 （５μｍ， 250
×４mm）HPLCカラムで、（Ａ）10％のアセトニトリルを
含む0.1Ｍのリン酸ナトリウムバッファー pH7.3及び
（Ｂ）50％アセトニトリル水溶液の混合物を溶出液とし
て用いて40℃でのイソクラチック溶出により測定した。
この溶出は溶出液のUV吸収を 214nmで追跡することによ
りモニターした。ボイド時間toは、 0.1mMの硝酸ナトリ
ウムの注入により確認した。ヒトインスリンについての
保持時間ｔhuman は、ＡとＢ溶液との比を変えることに
よって少なくとも２toとなるように調整した。 k'rel＝（ｔderivative−to）／（ｔhuman −to）

【００６３】血流グルコース低下作用の延長の度合いを
ウサギで試験した。各インスリン誘導体は一日遅延試験
で６羽づつのウサギに12nmolのそれを皮下注射すること
によって試験した。グルコース分析用の血液採取は注射
の前、並びに注射して１，２，４及び６時間後に行っ
た。実験グルコース値は初期値の％として表わす。血液
グルコース値より計算した遅延指数は等級付け遅延（延
長）指数である。Markussen ら、Protein Engineering
Ｉ(1987) 205-213におけるp211を参照のこと。その方式
は、ウシ・ウルトラレンテ・インスリンについて 100の
値、そしてActrapid（商標）（Novo Nordisk A／S, 288
0 Bagsraerd, Denmark）について０の値とするように等
級付している。

【００６４】表１に挙げているインスリン誘導体は、Zn
を含まないと特定されているものを除き、インスリンヘ
キサマー当り３個のZn²⁺を含む溶液として投与した。

【００６５】非常に遅延型の類似体にとってはウサギの
モデルは不適当であり、なぜなら初期値からの血液グル
コースの低下は遅延指数を評価するには小さすぎるから
である。かかる類似体の延長はブタでの消失率による方
がより良く特性決定される。Ｔ50％は、外部γ−カウン
ターで測定したときに、注射部位からＡ14 Tyr (¹²⁵I)
類似体の50％が消失した時間とする（Ribel, Uら、The
Pig as a Model for Subcutaneous Absorption in Man.
In: M. serrano-Rios and P. J. Lefebre（編）： Dia
betes 1985; Proceeding of the 12th Congress of the
InternationalDiabetes Federation, Madrid, Spain,
1985 (Excerpta Medica, Amsterdam, (1986) 891-96)
。

【００６６】表２には一連の非常に延長型のインスリン
類似体のＴ50％値を示す。これらの類似体はヘキサマー
当り３個のZn²⁺を含む溶液として投与した。

【００６７】

【表１】

【００６８】

【表２】

【００６９】溶解度インスリンヘキサマー当り３個のZn²⁺イオンを含む表１
に挙げるＮε^B29 修飾インスリン全ての溶解度が、防腐
剤としての 0.3％のフェノール及び等張性を達しめるた
めの 1.6％のグリセロールを更に含んで成る中性(pH7.
5）で水性の薬理製剤の中で 600nmol／mlを超えてい
た。 600nmol／mlは、臨床において通常採用される100
IU／mlの組成物で認められるヒトインスリンの濃度であ
る。

【００７０】ε−Ｂ29アミノ基は、アミド結合、スルホ
ンアミド結合、カルバミド、チオカルバミド又はカルバ
メートの成分でありうる。ε−Ｂ29アミノ基により担持
される親油基はアルキル基でもありうる。

【００７１】本発明に係るヒトインスリン誘導体を含
む、薬理組成物はかかる処置を必要とする患者に非経口
投与してよい。非経口投与はシリンジ、任意的にはペン
型シリンジにより、皮下、筋肉内又は静脈内注射によっ
て実施されうる。他方、非経口投与は点滴ポンプによっ
て行ってよい。更なる任意は、鼻スプレー式でヒトイン
スリン誘導体を投与するための粉末又は液体でありう
る。

【００７２】本発明の注射用ヒトインスリン組成物は薬
品産業の慣用の技術を利用して調製してよく、それは成
分を適宜溶解及び混合して所望の最終製品にすることを
含む。

【００７３】即ち、一手順に従うと、このヒトインスリ
ン誘導体を、調製すべき組成物の最終容量より若干少な
い量の水に溶かす。等張剤、防腐剤及びバッファーを適
宜加え、次いで溶液のpHを必要ならば例えば塩酸、又は
塩基、例えば水性水酸化ナトリウムを用いて必要に応じ
て調整する。最後に、溶液の容量を水で調整して所望の
成分濃度にする。

【００７４】等張剤の例は、塩化ナトリウム、マンニト
ール及びグリセロールである。

【００７５】防腐剤の例は、フェノール、ｍ−クレゾー
ル、メチルｐ−ヒドロキシベンゾエート及びベンジルア
ルコールである。

【００７６】適当なバッファーの例は酢酸ナトリウム及
びリン酸ナトリウムである。

【００７７】本発明に係るインスリン誘導体の鼻投与用
組成物は、例えば、ヨーロッパ特許第 272,097号（Novo
Nordisk A／S)に記載の通りにして調製できうる。

【００７８】本発明のインスリン組成物は糖尿病の処置
に利用できうる。任意の患者のための最適投与レベルは
様々な要因、例えば採用する特定のヒトインスリン誘導
体の薬効、患者の年齢、肉体的活動力及び食事、他の薬
剤との可能な組合せ、並びに糖尿病の症度に応じるであ
ろう。本発明のヒトインスリン誘導体の日常の投与量は
公知のインスリン組成物についてと似たようにして当業
者により各個別の患者について決定されることが推奨さ
れる。

【００７９】好都合なら、本発明のヒトインスリン誘導
体はその他のタイプのインスリン、例えばヒトインスリ
ンもしくはブタインスリン、又はより即効性を有するイ
ンスリン類似体と混合して利用してよい。かかるインス
リン類似体の例は例えばヨーロッパ特許出願、公開番号
EP 214,826 (Novo Nordisk A／S), EP375,437 (NovoNor
disk A ／S)及びEP383,472 (Eli Lilly & Co.) に記載
されている。

【００８０】本発明を以下の実施例で更に説明するが、
しかしながらそれらを保護範囲を狭めるものではない。
以上の説明及び以下の実施例に開示の特徴は、それぞれ
独立して、又は組合されて、本発明を様々な形態で実施
するための資料となりうる。

【００８１】

【実施例】プラスミド及び DNA材料発現プラスミドは全てcPOTタイプである。かかるプラス
ミドはEP特許出願第 171,142号に記載され、そしてプラ
スミドの選別及び安定化の目的でシゾサッカロマイセス
・ポンベ (Schizosaccharomyces pombe ）トリオースミ
リン酸イソメラーゼ遺伝子(POT）を含むことを特徴とす
る。 POT−遺伝子を含むプラスミドは寄託されている
Ｅ．コリ（E.coli）株（ATCC 39685）より入手できる。
このプラスミドは更にＳ．セレビジエ（S.cerevisiae）
トリオースミリン酸イソメラーゼプロモーター及びター
ミネーター(P_TP1 及び T_TP1)を含む。これらはpMT742
(Egel-Mitani,Ｍら、Gene 73 (1988) 113-120)（図１
参照のこと）と、シグナル／リーダー／生成物について
のコード領域を含むEcoRＩ-XbaＩ制限部位によって規定
される領域を除き、同一である。

【００８２】合成 DNAフラグメントを自動 DNA合成装置
（Applied Biosystemsモデル380A）で、ホスホラミジッ
ト薬品及び市販の試薬を用いて合成した（Beaucage, S.
L. and Caruthers, M.H., Tetrahedron Letters 22
(1981) 1859-1869)。

【００８３】利用したその他の方法及び材料は全て当業
界公知一般事項である（例えばSambrook, J., Fritsch,
E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Labor
atory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York, 1989 を参照のこと）。

【００８４】分析調製したインスリンの分子量はMS（マススペクトル）に
よって、Bio-Ion 20装置 (Bio-Ion Nordic AB, Uppsal
a, Sweden）を利用するPDMS（プラズマ脱離マススペク
トル）、又はAPI III Biomolecular Mass Analyzer (P
erkin-Elmer Sciex Instruments, Thornhill, (Canada)
を用いるESMS）エレクトロスプレー・マススペクトル）
のいづれかにより得た。

【００８５】実施例１LaC212 spx３シグナル／リーダーを用いる酵母株yEA002
からの Ala^A21 Asp^B3ヒトインスリン前駆体の合成以下のオリゴヌクレオチドを合成した：

【化２】

【００８６】以下のポリメラーゼ連鎖反応(PCR）をGene
Amp PCR試薬キット（Perkin Elmer, 761 Main Avewal
k, CT 06859, USA)を用い、製造者の仕様書に従って行
った。全ケースにおいて、 PCR混合物に 100μｌのミネ
ラル油（Sigma Chemical Co.,St. Louis, MO, USA）を
かぶせた。 2.5 μｌのオリゴヌクレオチド#98 (2.5pmol) 2.5 μｌのオリゴヌクレオチド#128 (2.5pmol) 10μｌの10Ｘ PCR バッファ 16μｌのdNTP混合物 0.5 μｌの Taq酵素 58.5μｌの水１サイクルを行った：94℃で 45sec, 49℃で１min , 72
℃で２min 。

【００８７】次に、５μｌのオリゴヌクレオチド #16及
び#126を加え、そして15サイクルを行った：94℃で 45s
ec, 45℃で１min , 72℃で1.5min。 PCR混合物を 2.5％
のアガロースゲルに載せ、そして電気泳動に標準の技術
を利用してかけた（Sambrookら、Molecular Cloning, C
old Spring Harbour Laboratory Pres, 1989) 。得られ
る DNAフラグメントをアガロースゲルから切り取り、そ
してGene Clean Kit (Bio 101 Inc., PO BOX 2284, La
Jolla, CA 92038, USA）を用いてその製造者の仕様書に
従って単離した。精製した PCR DNAフラグメントを10μ
ｌの水及び制限エンドヌクレアーゼの中に溶かし、そし
て制限エンドヌクレアーゼ NcoＩ及び XbaＩにより標準
の技術に従って切り、 2.5％のアガロースゲルで泳動さ
せ、そしてGene Clean Kitを用いて記載の通りに精製し
た。

【００８８】プラスミドpAK188は、ベクター（ファージ
ミド）pBLUESCRIPT IIsk( ＋／−）(Stratagene, USA）
のEcoRＩ／ XbaＩフラグメントの中に挿入されている合
成酵母シグナル／リーダー遺伝子LaC212 spx３(WO 89／
02463 のExample ３記載）をコードするEcoRＩ／Nco Ｉ
フラグメントより成る 412bpの DNA配列、それに続くＢ
29とＡ１のアミノ酸残基をつなぐSer Asp Asp Ala Lys
架橋を有するインスリン前駆体Ｍ15をコードする合成 N
coＩ／ XbaＩより成る。このプラスミドpAK188を図１に
示す。

【００８９】プラスミドpAK188を制限エンドヌクレアー
ゼ NcoＩ及び XbaＩで切り、そして3139bpのベクターフ
ラグメントを単離した。２本の DNAフラグメントをＴ４
DNAリガーゼ及び標準の条件を利用して互いとライゲー
ションさせた（Sambrookら、Molecular Cloning, Cold
Spring Habour Laboratory Press, 1989）。そのライゲ
ーション混合物をコンビテントＥ．コリ株（Ｒ^- ，Ｍ
⁺ ）の中に形質転換し、次いでアンピシリン耐性につい
て選別した。プラスミドを、得られるＥ．コリコロニー
から、標準の DNAミニプレップ技術（Sambrookら、Mole
cular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Pres
s, 1989)で単離し、適当な制限エンドヌクレアーゼ、即
ちEcoRＩ， XbaＩ, Nco Ｉ及び HpaＩでチェックした。
選別したプラスミドは DNA配列決定分析（Sequenase,
U.S. Biochemical(orp.）により、Ala^A21, Asp^B3ヒトイ
ンスリン前駆体についての適正な配列を含むことが示さ
れ、pEA5.3と命名した。

【００９０】プラスミドpKFN1627はＥ．コリーＳ．セレ
ビジエシャトルベクターであり、EP特許第 375,718号に
記載のプラスミドpKFN1003とは、固有 XbaＩ部位の上流
の短い DNA配列を除き同じである。pKFN1003において、
この配列は酵母接合因子アルファー１シグナル−リーダ
ー配列とインフレームで融合した合成アプロチニン遺伝
子をコードする 178bpのフラグメントである。pKFN1627
において、対応の 184bpの配列は接合因子アルファー１
配列とインフレームで融合したインスリン前駆体MI５(G
lu^B1，Glu ^B28)（即ち、B(1-29), Glu^B1, Clu^B28)-Ser
Asp Asp Ala Lys-A(1-21)をコードする（ SEQ 1D No.1
7,18及び19を参照のこと）。ベクターpKFN1627を図１に
示す。

【００９１】pEA5.3を制限エンドヌクレアーゼEcoRＩ及
び XbaＩで切り、そして得られる 412bpの DNAフラグメ
ントを単離した。酵母発現ベクターpKFN1627を制限エン
ドヌクレアーゼ NcoＩ及び XbaＩ、並びに NcoＩ及びEc
oRＩで切り、9273bpの DNAフラグメントが１回目の消化
より単離され、そして1644pbの DNAフラグメントが２回
より単離された。次に 412bpのEcoRＩ／ XbaＩフラグメ
ントを他の２つのフラグメント、即ち、9273bpの NcoＩ
／ XbaＩフラグメント及び1644bpの NcoＩ／EcoRＩフラ
グメントに標準の技術を利用してライゲーションさせ
た。

【００９２】そのライゲーション混合物を上記の廻りに
してＥ．コリの中に形質転換せしめた。得られるＥ．コ
リ由来のプラスミドを標準の技術を利用してチェック
し、単離し、そして適当な制限エンドヌクレアーゼ、即
ち、EcoRＩ， XbaＩ， NcoＩ，HpaＩでチェックした。
選別したプラスミドは DNA配列分析により(Sequenase k
itを用い、その製造者U.S. Biochemicalにより述べられ
ている通りにして）、 Ala^A21 Asp^B3ヒトインスリン前
駆体 DNAの適正な配列を含み、且つ LaC212 spx３シグ
ナル／リーダー DNAをコードする DNAの後に挿入されて
いることを示した。このプラスミドをpEA5.3.2と命名
し、そして図１に示す。LaC212spx ３シグナル／リーダ
ー／ Ala^A21 Asp^B3ヒトインスリン前駆体複合体をコー
ドする DNA配列及びそのアミノ酸配列をSEQ ID No.20，
21及び22に示す。プラスミドpEA5.3.2をヨーロッパ特許
出願公開番号 214,826に記載の通りにしてＳ．セレビジ
エ株 MT663に形質転換し、そして得られる株をyEA002と
命名した。

【００９３】実施例２LaC212 spx３シグナル／リーダーを用いる酵母株yEA005
からの Ala^A21 Thr^B3ヒトインスリン前駆体の合成以下のオリゴヌクレオチドを合成した：

【化３】

【００９４】Ala^A21 Thr^B3ヒトインスリン前駆体をコ
ードする DNAは、実施例１の Ala^A2 ¹ Asp^B3ヒトインス
リン前駆体をコードする DNAについて述べたのと同じよ
うにして構築した。LaC212 spx３シグナル／リーダー／
Ala^A21 Thr^B3ヒトインスリン前駆体複合体をコードす
る DNA配列及びそのアミノ酸配列をSEQ ID No.23, 24及
び25に示す。プラスミドpEA8.1.1は所望の配列を含むこ
とが示され、実施例１に記載の通りにしてＳ．セレビジ
エ株 MT663に形質転換させ、そして得られる株をyEA005
と命名した。

【００９５】実施例３LaC212 spx３シグナル／リーダーを用いる酵母株yEA007
からの Gly^A21 Asp^B3ヒトインスリン前駆体の合成以下のオリゴヌクレオチドを合成した：

【化４】

【００９６】Gly^A21 Asp^B3ヒトインスリン前駆体をコ
ードする DNAは、実施例１の Ala^A2 ¹ Asp^B3ヒトインス
リン前駆体をコードする DNAについて述べたのと同じよ
うにして構築した。LaC212 spx３シグナル／リーダー／
Gly^A21 Asp^B3ヒトインスリン前駆体複合体をコードす
る DNA配列及びそのアミノ酸配列をSEQ ID No.26, 27及
び28に示す。プラスミドpEA1.5.6は所望の配列を含むこ
とが示され、実施例１に記載の通りにしてＳ．セレビジ
エ株 MT663に形質転換させ、そして得られる株をyEA007
と命名した。

【００９７】実施例４LaC212 spx３シグナル／リーダーを用いる酵母株yEA006
からの Gly^A21 Thr^B3ヒトインスリン前駆体の合成以下のオリゴヌクレオチドを合成した：

【化５】

【００９８】Gly^A21 Thr^B3ヒトインスリン前駆体をコ
ードする DNAは、実施例１の Ala^A21Asp^B3ヒトインスリ
ン前駆体をコードする DNAについて述べたのと同じよう
にして構築した。LaC212 spx３シグナル／リーダー／ G
ly^A21 Thr^B3ヒトインスリン前駆体複合体をコードする
DNA配列及びそのアミノ酸配列をSEQ ID No.29, 30及び
31に示す。プラスミド pEA4.4.11は所望の配列を含むこ
とが示され、実施例１に記載の通りにしてＳ．セレビジ
エ株 MT663に形質転換させ、そして得られる株をyEA006
と命名した。

【００９９】実施例５アルファー因子リーダーを用いる酵母株yEA113からのＮ
−末端伸長部（Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Arg)を有
する Arg^B-1 Arg^B31 一本鎖ヒトインスリン前駆体の合
成Ａ）以下のオリゴヌクレオチドを合成した：

【化６】

【０１００】以下のポリメラーゼ連鎖反応(PCR）を、Ge
ne Amp PCR試薬キット(Perkin Elmer, 761 Main Avewal
k, CT 06859, USA）を用い、その製造者の仕様書に従っ
て行った。全ケースにおいて、 PCR混合物に 100μｌの
ミネラル油(Sigma ChemicalCo. St. Louis, MO, USA）
をかぶせた。プラスミドpAK220（これはpAK188と同一で
ある）は、ベクター( ファージミド) pBLUESCRIPT IIsk
( ＋／−）(Stratagene, USA）の中に挿入された、合成
酵母シグナル／リーダーLaC212 spx３(WO 89／02463 の
Example ３に記載）をコードする 412bpの DNA配列、そ
れに続くインスリン前駆体MI５(SEQ ID No.14,15及び16
参照のこと) より成る。

【０１０１】５μｌのオリゴヌクレオチド#220 (100pmo
l) ５μｌのオリゴヌクレオチド#263 (100pmol) 10μｌの10ＸのPCR バッファー 16μｌのdNTP混合物 0.5 μｌの Taq酵素 0.5 μｌのpAK220プラスミド（pAK188と同じ）を鋳型と
して（0.2 μｇの DNA） 63μｌの水

【０１０２】全部16サイクルを行い、各サイクルは95℃
で１分、40℃で１分及び72℃で２分より成る。 PCR混合
物を２％のアガロースゲルに載せ、そして標準の技術を
利用して電気泳動にかけた。得られる DNAフラグメント
をアガロースゲルから切り出し、そしてGene Clean Kit
(Bio 101 Inc., PO BOX 2284, La Jolla, CA 92038,US
A）を用い、その製造者の仕様書に従って単離した。精
製した PCR DNAフラグメントを10μｌの水及び制限エン
ドヌクレアーゼバッファーに溶かし、そして制限エンド
ヌクレアーゼHindIII 及び XbaＩで標準の技術を用いて
切った。このHindIII ／ XbaＩ DNAフラグメントをGene
Clean Kitを用い、上記の通りに精製した。

【０１０３】プラスミドpAK406は、酵母アルファー因子
リーダーをコードするpMT636(WO 90／10075 に記載）由
来のEcoRＩ／HindIII フラグメントを含んで成る 520bp
の DNA配列とベクターcPOTの中に挿入されたインスリン
前駆体MI５の残りをコードするpAK188由来のHindIII ／
XbaＩフラグメント(SEQ ID No.32,33及び34参照のこ
と) にライゲーションされたインスリン前駆体の一部よ
り成る。ベクターpAK406を図２に示す。

【０１０４】プラスミドpAK233は、合成酵母シグナル／
リーダーLaC212 spx３(WO 89／02463 のExample ３記
載）をコードする 412bpの DNA配列、それに続くベクタ
ーcPOTの中に挿入されたインスリン前駆体B(1-29)-GluL
ysArg-A(1-21) (A21-Gly) (SEQID No.35, 36 及び37参
照のこと）についての遺伝子より成る。プラスミドpAK2
33を図２に示す。

【０１０５】プラスミドpAK233を制限エンドヌクレアー
ゼ NcoＩ及び XbaＩで切り、そして9237bpのベクターフ
ラグメントが単離された。このプラスミドpAK406を制限
エンドヌクレアーゼ NcoＩ及びHindIII で切り、そして
2012bpのベクターフラグメントが単離された。これら２
本の DNAフラグメントを一緒にHindIII ／Xba Ｉ PCRフ
ラグメントにＴ４ DNAリガーゼ及び標準の条件を用いて
ライゲーションさせた。このライゲーション混合物を次
にコンビテントＥ．コリ株（Ｒ^- ，Ｍ⁺ ）に形質転換
し、続いてアンピシリン耐性について選別した。プラス
ミドを、得られるＥ．コリコロニーから標準のミニプ
レップ技術を用いて単離し、そして適当な制限エンドヌ
クレアーゼ、即ち、EcoRＩ,XbaＩ, Nco Ｉ, HindIII で
チェックした。選別したプラスミドは DNA配列決定によ
り、 Arg^B31 一本鎖ヒトインスリン前駆体 DNAについて
の適正な配列を含み、且つＳ．セレビジエアルファー因
子 DNAをコードする DNAの後に挿入されていることを示
した。このプラスミドをpEA108と命名し、そして図２に
示す。アルファー因子リーダー／ Arg^B31 一本鎖ヒトイ
ンスリン前駆体複合体をコードする DNA及びそのアミノ
酸配列はSEQ ID No.38, 39及び40である。プラスミドpE
A108を実施例１に記載の通りにしてＳ．セレビジエ株 M
T663の中に形質転換させ、そして得られる株をyEA108と
命名した。

【０１０６】Ｂ）以下のポリメラーゼ連鎖反応(PCR）
を、Gene Amp PCR試薬キット(Perkin Elmer, 761 Main
Avewalk, CT 06859, USA）を用い、その製造者の仕様書
に従って行った。全ケースにおいて、 PCR混合物に 100
μｌのミネラル油(Sigma ChemicalCo. St. Louis, MO,
USA）をかぶせた。５μｌのオリゴヌクレオチド#220 (100pmol) ５μｌのオリゴヌクレオチド#307 (100pmol) 10μｌの10Ｘの PCRバッファー 16μｌのdNTP混合物 0.5 μｌの Taq酵素 0.5 μｌのpEA108プラスミドを鋳型として（0.1 μｇの
DNA） 63μｌの水

【０１０７】全部16サイクルを行い、各サイクルは95℃
で１分、40℃で１分及び72℃で２分より成る。 PCR混合
物を２％のアガロースゲルに載せ、そして標準の技術を
利用して電気泳動にかけた。得られる DNAフラグメント
をアガロースゲルから切り出し、そしてGene Clean Kit
(Bio 101 Inc., PO BOX 2284, La Jolla, CA 92038,US
A）を用い、その製造者の仕様書に従って単離した。精
製した PCR DNAフラグメントを10μｌの水及び制限エン
ドヌクレアーゼバッファーに溶かし、そして制限エンド
ヌクレアーゼ NcoＩ及び XbaＩで標準の技術を用いて切
った。この NcoＩ／ XbaＩ DNAフラグメントをGene Cle
an Kitを用い、上記の通りに精製した。

【０１０８】プラスミドpAK401は、アルファー因子リー
ダーをコードするpMT636(WO 90／10075 に記載）（部位
特異的突然変異誘発によりアルファーリーダーの３′末
端の中に Nco部位を導入して構築）由来のEcoRＩ／ Nco
Ｉフラグメントを含んで成る523bpの DNA配列ベクター
（ファージミド）pBLVESCRIPT(＋／−）(Stratagene,US
A）の中に挿入されたインスリン前駆体MI５をコードす
るpAK188由来の NcoＩ／ XbaＩフラグメント(SEQ ID N
o.41,42及び43参照のこと) より成る。ベクターpAK401
を図３に示す。

【０１０９】プラスミドpAK401を制限エンドヌクレアー
ゼ NcoＩ及び XbaＩで切り、そして3254bpのベクターフ
ラグメントが単離され、そして NcoＩ／ XbaＩ PCRフラ
グメントで一緒にライゲーションさせた。このライゲー
ション混合物をコンビテントＥ．コリ株の中に形質転換
し、そして得られるＥ．コリコロニーから標準の DNA
ミニプレップ技術を利用してプラスミドを単離し、そし
て適当な制限エンドヌクレアーゼ、即ち、EcoRＩ,Xba
Ｉ, Nco Ｉでチェックした。選別したプラスミドを p11
3Aと命名し（図３に示す）、EcoRＩ及び XbaＩで切り、
そして 535bpのフラグメントが単離された。

【０１１０】プラスミドpAK233を制限エンドヌクレアー
ゼ NcoＩ及び XbaＩで切り、そして9237bp及び1644bpの
フラグメントが単離された。これら２本の DNAフラグメ
ントを一緒にEcoRＩ／Xba Ｉ PCRフラグメントにＴ４ D
NAリガーゼ及び標準の条件を用いてライゲーションさせ
た。このライゲーション混合物を次にコンビテントＥ．
コリ株（Ｒ^- ，Ｍ⁺ ）に形質転換し、続いてアンピシリ
ン耐性について選別した。プラスミドを、得られるＥ．
コリコロニーから標準のミニプレップ技術を用いて単
離し、そして適当な制限エンドヌクレアーゼ、即ち、Ec
oRＩ,XbaＩ, Nco Ｉ, HindIII でチェックした。選別し
たプラスミドは DNA配列決定により、Ｎ末端伸長部 Glu
Glu Ala Glu Ala Glu Ala Argを有する Arg^B31 一本鎖
ヒトインスリン前駆体 DNAについての適正な配列を含
み、且つＳ．セレビジエアルファー因子 DNAをコードす
る DNAの後に挿入されていることを示した。このプラス
ミドをpEA113と命名し、そして図３に示す。Ｎ末端伸長
部(Glu Glu Ala Glu Ala GluAla Arg）アルファー因子
リーダー／ Arg^B-1 Arg^B31 一本鎖ヒトインスリン前駆
体複合体をコードする DNA及びそのアミノ酸配列はSEQ
ID No.44, 45及び46である。プラスミドpEA113を実施例
１に記載の通りにしてＳ．セレビジエ株 MT663の中に形
質転換させ、そして得られる株をyEA113と命名した。

【０１１１】実施例６アルファー因子リーダーを用いる酵母株yEA136からのＮ
−末端伸長部(Glu GluAla Glu Ala Glu Ala Glu Arg）
を有する Arg^B-1 Arg^B1一本鎖ヒトインスリン前駆体の
合成以下のオリゴヌクレオチドを合成した：

【化７】

【０１１２】以下の PCRをGene Amp PCR試薬キットを用
いて実施した。５μｌのオリゴヌクレオチド#220 (100pmol) ５μｌのオリゴヌクレオチド#389 (100pmol) 10μｌの10Ｘの PCRバッファー 16μｌのdNTP混合物 0.5 μｌの Taq酵素２μｌのpEA113プラスミドを鋳型として（0.5 μｇの D
NA） 63μｌの水

【０１１３】全部で12サイクルを行い、各サイクルは95
℃で１分、37℃で１分、及び72℃で２分より成る。

【０１１４】Ｎ−末端伸長部(Glu Glu Ala Glu Ala Glu
Ala Glu Arg）を有するアルファー因子リーダー／ Arg
^B-1 Arg^B1一本鎖ヒトインスリン前駆体をコードする D
NAを、実施例５のＮ−末端伸長部(Glu Glu Ala Glu Ala
Glu Ala Arg）を有するアルファー因子リーダー／ Arg
^B-1 Arg^B31 一本鎖ヒトインスリン前駆体をコードする
DNAに記載と同じようにして構築した。Ｎ−末端伸長部
(Glu Glu Ala Glu AlaGlu Ala Glu Arg）を有するアル
ファー因子リーダー／ Arg^B-1 Arg^B31 一本鎖ヒトイン
スリン前駆体をコードする DNA配列及びそのアミノ酸配
列はSEQ ID No.47, 48及び49である。このプラスミドを
実施例１記載の通りにしてＳ．セレビジエ株 MT663に形
質転換し、そして得られる株をyEA136と命名した。

【０１１５】実施例７（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocヒトインスリンの合成５ｇの亜鉛非含有インスリンを41.3mlのDMSOに溶かし
た。この溶液に 3,090mlの酢酸を加えた。反応を室温で
行い、そして 5,650mlのDMSOに溶かした 565mgのジーte
rt−ブチルピロ炭酸塩の添加により開始させた。反応を
５ 1／2 時間進行させ、そして 250μｌのエタノールア
ミノの添加により停止させた。生成物を1500mlのアセト
ンの添加により沈殿させた。その沈渣を遠心により単離
し、そして真空乾燥して、6.85ｇの収量の物質が得られ
た。

【０１１６】（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocインスリンを以下
のようにして逆相HPLCにより精製した。粗生成物を 100
mlの25％のエタノール水溶液に溶かし、pHを HClで 3.0
に合わせ、そしてオクタデシルジメチルシリル−置換化
シリカ粒子（平均粒子サイズ15μｍ、孔サイズ 100Å）
の充填したカラム（直径５cm、高さ30cm）に載せ、そし
て溶出バッファーで平衡にした。溶出はエタノールと１
mMの水性HCl, 0.3Ｍのkclの混合物を用いて２ｌ／ｈの
流速で行った。インスリンはエタノール含有量を30％か
ら45％に上昇させることにより溶出した。適切な画区を
20％のエタノールで希釈し、そして pH4.8で沈殿させ
た。沈殿した物質を遠心により単離し、そして真空乾燥
した。これにより、 1.701ｇの（Ａ１，Ｂ１）−ジ Boc
ヒトインスリンが94.5％の純度で得られた。実施例８（Ｎε^B29 −ベンゾイルヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺の合
成 400mgの（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocヒトインスリンを２ml
のDMSOに溶かした。この溶液にＮ−メチルモルホリンと
DMSOとの（１：９，Ｖ／Ｖ）混合物 748μｌを加えた。
反応は15℃で行い、そして 132μｌの DMF に溶かした
14.6mgの安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル
の添加により開始させた。反応は２時間後に 100mlのア
セトンを添加することにより停止させた。沈殿した物質
を遠心により単離し、そして真空乾燥した。 343mgの物
質が回収できた。

【０１１７】Boc保護基を４mlの TFAの添加により除去
した。溶解物質を30分インキュベートし、そして50mlの
アセトンの添加により沈殿させた。この沈渣を遠心によ
り単離し、そして真空乾燥した。Ｎε^B29 −ベンゾイル
ヒトインスリンを実施例７に記載の通りにして逆相HPLC
により精製した。 230mgの収量が得られた。６mMのZn²⁺
及び50mMのクエン酸を含む pH5.5の15％の水性エタノー
ルからの再結晶化は、表題の化合物の結晶をもたらし、
これを遠心により単離し、そして真空乾燥した。収量は
190mgであった。MSによる分子量は5911；理論値は5911
である。

【０１１８】実施例９（Ｎε^B29 −リトコロイルヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺の
合成 400mgの（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocヒトインスリンを２ml
のDMSOに溶かした。この溶液にＮ−メチルモルホリンと
DMSOとの（１：９，ｖ／ｖ）混合物 748μｌを加えた。
反応は15℃で行い、そして 300μｌの DMF に溶かした
31.94mgのリトコリン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエ
ステルの添加により開始させた。反応は２時間後に 100
mlのアセトンを添加することにより停止させた。沈殿し
た物質を遠心により単離し、そして真空乾燥した。 331
mgの物質が回収できた。

【０１１９】Boc保護基を４mlの TFAの添加により除去
した。溶解物質を30分インキュベートし、そして50mlの
アセトンの添加により沈殿させた。この沈渣を遠心によ
り単離し、そして真空乾燥した。収量は 376mgであっ
た。

【０１２０】Ｂ29−リトコロイルインスリンを実施例７
に記載の通りにして逆相HPLCにより精製した。67mgの最
終収量が94％の純度で得られた。６mMのZn²⁺及び50mMの
クエン酸を含む pH5.5の15％の水性エタノールからの再
結晶化は、表題の化合物の結晶をもたらし、これを遠心
により単離し、そして真空乾燥した。収量は49mgであっ
た。 MSによる分子量は6160；理論値は6166である。

【０１２１】実施例10（Ｎε^B29 −ベンゾイルヒトインスリン）₆, 3Zn²⁺の合
成 400mgの（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocヒトインスリンを２ml
のDMSOに溶かした。この溶液にＮ−メチルモルホリンと
DMSOとの（１：９，ｖ／ｖ）混合物 748μｌを加えた。
反応は15℃で行い、そして 132μｌの DMF に溶かした
18.0mgのデカノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステ
ルの添加により開始させた。反応は60分後に 100mlのア
セトンを添加することにより停止させた。沈殿した物質
を遠心により単離し、そして真空乾燥した。 420mgの中
間生成物が回収できた。

【０１２２】Boc保護基を４mlの TFAの添加により除去
した。溶解物質を30分インキュベートし、そして生成物
を50mlのアセトンの添加により沈殿させた。この沈渣を
遠心により単離し、そして真空乾燥した。粗生成物の収
量は 420mgであった。

【０１２３】その粗生成物を実施例７に記載の通りにし
て逆相HPLCにより精製した。表題の生成物の 254mgの最
終収量が得られた。６mMのZn²⁺及び50mMのクエン酸を含
む pH5.5の15％の水性エタノールからの再結晶化は、表
題の化合物の結晶をもたらし、これを遠心により単離
し、そして真空乾燥した。収量は 217mgであった。MSに
よる分子量は5962；理論値は5962である。

【０１２４】実施例11デス（Ｂ30）ヒトインスリンの合成デス（Ｂ30）ヒトインスリンの合成はMarkussen (Metho
ds in diabetes research. Vol. I, Laboratory method
s, part B, 404-410. Ed: J. Larner and S. Phol., Jo
hn Wiley & Sons, 1984)に記載の通りにして実施した。
５ｇのヒトインスリンを 500mlの水に溶かし、その間溶
液のpH値は 0.5Ｍの硫酸の添加により 2.6に保っておい
た。次に、インスリンを 100ｇの硫酸アンモニウムの添
加により塩析し、そして沈渣を遠心により単離した。そ
のペレットを 800mlの 0.1Ｍの炭酸水素アンモニウムの
中に溶かし、そしてその溶液のpH値を１Ｍのアンモニア
で8.4に調整した。

【０１２５】50mgのウシカルボキシペプチダーゼＡを25
mlの水に懸濁し、そして遠心により単離した。その結晶
を25mlの水に懸濁し、そして透明な溶液が得られる最終
pH10となるまで 0.1Ｍのアンモニアを加えた。このカル
ボキシペプチダーゼ溶液をインスリン溶液に加え、そし
てその反応を24時間進行させた。数滴のトルエンを反応
中の防腐剤として働くように加えた。

【０１２６】24時間後、デス（Ｂ30）ヒトインスリン
を、その溶液を撹拌しながら80ｇの塩化ナトリウムを逐
次添加することによって結晶化させた。次いでpH値を
8.3に調整し、そして結晶化をゆっくり撹拌しながら20
時間進行させた。結晶を 1.2μｍのフィルター上で単離
し、 250mlの氷冷２−プロパノールで洗い、そして最後
に真空乾燥した。

【０１２７】実施例12（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocデス（Ｂ30）ヒトインスリンの
合成表題の化合物を実施例７に記載と類似の方法で、出発物
質としてデス（Ｂ30）ブタインスリンを用いて合成し
た。その粗生成物をアセトンにより沈殿させ、そして真
空乾燥した。（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocデス（Ｂ30）ヒト
インスリンを実施例７記載の通りにして逆相HPLCにより
精製した。

【０１２８】実施例13Ｎε^B29 −デカノイルデス（Ｂ30）ヒトインスリンの合
成 400mgの（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocデス（Ｂ30）ヒトイン
スリンを、実施例10記載の手順に従うＮε^B29 −デカノ
イルデス（Ｂ30）ヒトインスリンの合成のための出発物
質として用いた。その粗生成物をアセトンにより沈殿さ
せ、真空乾燥し、 TFAを用いて脱保護した。得られる生
成物をアセトンにより沈殿させ、そして真空乾燥した。
次いでＮε^B29 −デカノイルデス（Ｂ30）ヒトインスリ
ンを実施例10に記載の通りにして逆相HPLCにより精製し
た。 MSにより認められる分子量5856；理論値5861。

【０１２９】実施例14Ｎε^B29 −ドデカノイルデス（Ｂ30）ヒトインスリンの
合成ａ．Ａ．リティカスプロテアーゼの固定化５mlの水性の 0.2ＭのNaHCO₃バッファー pH9.4に溶解し
た13mgのＡ．リティカスプロテアーゼを、同じバッファ
ーで洗っておいた４mlの沈降させたMiniLeak（商標）メ
ディウムゲルと混合した（MiniLeakは、Kem En Tec, Co
penhagenより入手したジビニルスルホン活性化 Sepharo
se CL 6Bである）。このゲルを室温で24時間ゆっくり撹
拌することにより懸濁を保った。次に、このゲルを濾過
により単離し、水で洗い、そして20mlの１Ｍのエタノー
ルアミン pH9.4に懸濁し、そして室温で24時間懸濁に保
った。最後に、このゲルを水、次いで 0.1Ｍの酢酸で洗
い、そして４℃で保存した。濾液の酵素活性は当初の溶
液の13％であり、約87％の固定化反応が得られたことを
示唆する。

【０１３０】ｂ．ブタトリプシンの固定化ブタトリプシンをMiniLeak（商標）Low に、Ａ．リティ
カスの固定化について上記した条件を利用し、１mlのゲ
ル当り１mgの置換度となるように固定化した。

【０１３１】ｃ．固定化Ａ．リティカスプロテアーゼを
用いるGlu(GluAla)₃Arg-B(1-29), ThrArg-A(1-21) イン
スリンの合成 20mlの 0.1ＭのNaHCO₃バッファー pH9.0に溶かした 200
mgのGlu(GluAla)₃Arg-B(1-29)-ThrArg-A(1-21)一本鎖ヒ
トインスリン前駆体に固定化Ａ．リティカスプロテアー
ゼを担持するゲル４mlを加えた。そのゲルを室温で６時
間反応混合物の中で懸濁に保った後、加水分解は完了
し、Glu(GluAla)₃-Arg-B(1-29), ThrArg-A(1-21)ヒトイ
ンスリンが得られる（反応は逆相HPLCにより追跡）。加
水分解後、ゲルを濾過により除去した。その濾液に５ml
のエタノール及び15μｌの１Ｍの ZnCl₂を加え、そして
pHを HClを用いて 5.0に合わせた。生成物の沈殿は４℃
で一夜ゆっくり撹拌しながら放置することで完了した。
その生成物を遠心により単離した。１mlの氷冷20％エタ
ノールで１回洗い、そして真空乾燥した後、収量は 190
mgであった。

【０１３２】ｄ．ドデカノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニ
ミドエステルを用いるＮ ^A1,Ｎ ^B1,Ｎε^B29 −トリドデ
カノイルGlu(GluAla)₃Arg-B(1-29), Thr-Arg-A(1-21)ヒ
トインスリンの合成 190mg（30μmol)のGlu(GluAla)₃Arg-B(1-29), ThrArg-A
(1-21) インスリンを１mlのDMSO及び1.05mlの 0.572Ｍ
のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの DMF溶液に溶
かした。この溶液を15℃に冷やし、そして 0.6mlのDMSO
に溶解した36mg(120μmol)のドデカノン酸Ｎ−ヒドロキ
シスクシニミドエステルを加えた。反応は24時間以内に
完了した。親油性の表題の化合物は単離しなかった。

【０１３３】ｅ．Ｎε^B29 −ドデカノイルデス（Ｂ30）
インスリンの合成約2.65mlのDMSO／ DMF／Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチル
アミンの中に含まれている先の工程ｄ由来の生成物を20
％のエタノールを含んで成る10.6mlの50mMのグリシンバ
ッファーで希釈し、そしてpHをNaOHで10に調整した。室
温で１時間放置後、１mgの固定化トリプシンを１mlのゲ
ル当り担持している１mlのMiniLeakゲルを加えた。その
反応混合物を室温で48時間ゆっくり撹拌した。所望の生
成物を単離するため、反応混合物を、オクタデシルジメ
チルシリル−置換化シリカ粒子（平均粒子サイズ15μ
ｍ、孔サイズ 100Å）で充填した逆相HPLCカラム（直径
５cm、高さ30cm）に載せた。溶出のためには、 pH7.7に
調整され、エタノール濃度が40％から44％（ｖ／ｖ）に
上昇する20mMのトリス／HCl バッファーを2000ml／ｈの
流速で用いた。約43〜44％のエタノールで溶出する主要
ピークが表題の化合物を含んでいた。主要ピークを含む
画分をプール、エタノール濃度を20％（ｖ／ｖ）に下げ
るように水を加え、そしてpHを 5.5に調整した。その溶
液を−20℃で一夜放置し、これにより生成物を沈殿させ
た。その沈渣を−８℃での遠心により単離し、そして真
空乾燥した。表題の化合物の収量は90mgであった。MSに
より認められる分子量は5892；理論値は5890。

【０１３４】実施例15Ｎε^B29 −（Ｎ−ミリストイル−α−グルタミル）ヒト
インスリンの合成 500mg の（Ａ１，Ｂ１）−ジBoc ヒトインスリンを 2.5
mlのDMSOに溶かし、そして 2.5mlの１／１のDMSO／DMF
(ｖ／ｖ）に希釈しておいた 428μｌのエチルジイソプ
ロピルアミドを加えた。その温度を15℃にし、そして
2.5mlの１／１のDMSO／DMF(ｖ／ｖ）に溶解した85mgの
Ｎ−ミリストイル−Glu (OBut)Ｎ−ヒドロキシスクシニ
ミドエステルを加えた。30分後、その反応混合物を60ml
の水に注ぎ、pHを５にし、そしてその沈渣を遠心により
単離した、その沈渣を真空乾燥した。乾燥反応混合物を
25mlの TFAに溶かし、そしてその溶液を室温で30分放置
した。TFAを真空でエバポレーションした。ゼラチン状
の残渣を60mlに水に溶かし、そしてpHを濃アンモニアを
用いて11.2にした。表題の化合物は６Ｎの HClを用いて
pHを 8.5にすることによってこの溶液から結晶化した。
その生成物を遠心により単離し、10mlの水で洗い、そし
て真空乾燥した。収量 356mg・HPLCにより純度94％。

【０１３５】本例の生成物は、 Lys^B29 のε−アミノ基
が以下の構造を有する置換基を有するヒトインスリンで
ある： CH₃(CH₂)₁₂CONHCH(CH₂CH₂COOH)CO- MSにより認められた分子量6146：理論値6148。

【０１３６】実施例16Ｎε^B29 −ウンデカノイルデス（Ｂ30）ヒトインスリン
の合成表題の化合物は実施例14に記載のＮε^B29 −ドデカノイ
ルデス（Ｂ30）ヒトインスリンと類似にして、ドデカノ
ン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの代わりにウ
ンデカノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを利
用することにより合成した。 MSにより認められたこの生成物の分子量5876：理論値58
76。

【０１３７】実施例17Ｎε^B29 −トリデカノイルデス（Ｂ30）ヒトインスリン
の合成表題の化合物は実施例14に記載のＮε^B29 −ドデカノイ
ルデス（Ｂ30）ヒトインスリンと類似にして、ドデカノ
ン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの代わりにト
リデカノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを利
用することにより合成した。 MSにより認められたこの生成物の分子量5899：理論値59
04。

【０１３８】実施例18Ｎε^B29 −ミリストイルデス（Ｂ30）ヒトインスリンの
合成表題の化合物は実施例14に記載のＮε^B29 −ドデカノイ
ルデス（Ｂ30）ヒトインスリンと類似にして、ドデカノ
ン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの代わりにミ
リスチン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを利用
することにより合成した。 MSにより認められたこの生成物の分子量5923：理論値59
18。

【０１３９】実施例19Ｎε^B29 −パルミトイルデス（Ｂ30）ヒトインスリンの
合成表題の化合物は実施例14に記載のＮε^B29 −ドデカノイ
ルデス（Ｂ30）ヒトインスリンと類似にして、ドデカノ
ン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの代わりにパ
ルミチン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを利用
することにより合成した。 MSにより認められたこの生成物の分子量5944：理論値59
46。

【０１４０】実施例20Ｎε^B29 −スベロイル−Ｄ−チロキシンヒトインスリンａ．Ｎ−（スクシニミジルスベロイル）−Ｄ−チロキシ
ンの調製ジスクシニミジルスベレート(1.0ｇ，Pierce) を DMF
(50ml) に溶かし、そしてＤ−チロキシン(2.0ｇ，Aldri
ch)を20℃で撹拌しながら加えた。チロキシンをゆっく
り溶かし、そして20時間後、溶媒を真空エバポレーショ
ンにより除去した。油状の残渣を２−プロパノールから
結晶化させ、 0.6ｇのＮ−（スクシニミジルスベロイ
ル）−Ｄ−チロキシンを得た。m.p. 128−133 ℃。

【０１４１】ｂ．（Ａ１，Ａ２）−ジ Bocヒトインスリ
ンとＮ−（スクシニミジルスベロイル）−Ｄ−チロキシ
ンとの反応（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocヒトインスリン(200mg）をドラ
イ DMF（10ml）の中に、室温でトリエチルアミン（20μ
ｌ）の添加により溶かした。次にＮ−（スクシニミジル
スベロイル）−Ｄ−チロキシン（80mg）を加えた。この
反応を逆相HPLCによりモニターし、そして反応が約90％
完了したら、溶媒を真空除去した。このエバポレーショ
ン残渣に無水トリフルオロ酢酸（５ml）を加え、そして
この溶液を室温に１時間保った。真空でトリフルオロ酢
酸を除去した後、その残渣を１Ｍの酢酸（５ml）とアセ
トニトリル(1.5ml）との混合物に溶かし、調製逆相HPLC
により精製し、そしてPD−10カラムで脱塩した。Ｎε
^B29 −スベロイル−Ｄ−チロキシンヒトインスリンの収
量は50mgであった。

【０１４２】本例の生成物は Lys^B29 のε−アミノ基が
以下の構造の置換基を有するヒトインスリンである：Th
yrox-CO(CH₂)₆CO （ここでThyroxは、α−アミノ基に対
するアミド結合を介してオクタンジオン酸成分に結合し
ているチロキシンである）。MSにより認められたこの生
成物の分子量は6724：理論値6723。

【０１４３】実施例21Ｎε^B29 −（２−スクシニルアミド）ミリスチン酸ヒト
インスリンの合成ａ．α−アミノミリスチン酸メチルエステル・HCl の調
製 −10℃においてメタノール（５ml，Merck)に塩化チオニ
ル(0.2ml, Aldrich)を強力に撹拌しながら滴下した。次
にα−アミノミリスチン酸(0.7ｇ；α−ブロモ酸からア
ンモニアとの反応により調製）を加えた。その反応混合
物を室温で一夜撹拌し、次いで乾くまでエバポレートし
た。粗生成物(0.7ｇ）を工程ｂに直接用いた。

【０１４４】ｂ．Ｎ−スクシノイル−α−アミノミリス
チン酸メチルエステルの調製 α−アミノミリスチン酸メチルエステル・HCl (0.7ｇ）
をクロロホルム（25ml，Merck)に溶かした。トリエチル
アミン（0.35ml，Fluka)を、次いで無水コハク酸(0.3
ｇ，Fluka)を加えた。その反応混合物を室温で２時間撹
拌し、乾くまで濃縮し、そしてその残渣を酢酸エチル／
石油エーテル（１／１）から再結晶化させた。収量：
0.8ｇ。

【０１４５】ｃ．Ｎ−（スクシニミジルスクシノイル）
−α−アミノミリスチン酸メチルエステルの調製Ｎ−スクシノイル−α−アミノミリスチン酸メチルエス
テル(0.8ｇ）をドライDMF (10ml, Merck, ４Åモレキュ
ラーシーブで乾燥）に溶かした。ドライピリジン（80μ
ｌ，Merck)及びジ（Ｎ−スクシニミジル）炭酸塩(1.8
ｇ，Fluka)を加え、そしてその反応混合物を室温で一夜
撹拌した。そのエバポレーション残渣をシリカゲル60
（Meck）でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製
し、そして２−プロパノール／石油エーテル（１／１）
から再結晶化させた。Ｎ−（スクシニミジルスクシノイ
ル）−α−アミノミリスチン酸メチルエステルの収量：
0.13ｇ，m.p.64−66℃。

【０１４６】ｄ．（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocヒトインスリ
ンとＮ−（スクシニミジルスクシノイル）−α−アミノ
ミリスチン酸メチルエステルとの反応反応は実施例20ｂに記載の通りに実施したが、ただしＮ
−（スクシニミジルスベロイル）−Ｄ−チロキシンの代
わりにＮ−（スクシニミジルスクシノイル）−α−アミ
ノミリスチン酸メチルエステル（16mg）を使用した。真
空でトリフルオロ酢酸を除去後、そのエバポレーション
残渣を 0.1Ｍの水酸化ナトリウムにより０℃で処理して
メチルエステルをけん化した。けん化が逆相HPLCによっ
て完了していると判定できたら、溶液中のpH値を３に
し、そして溶液を凍結乾燥した。調製逆相HPLCによる精
製及びPD−10カラムでの脱塩の後、Ｎε^B29 −（２−ス
クシニルアミド）ミリスチン酸ヒトインスリンの収量は
39mgであった。

【０１４７】本例の生成物は、 Lys^B29 のε−アミノ基
が次の構造式の置換基を有するヒトインスリンである：
CH₃(CH₂)₁₁CH(COOH)NHCOCH₂CH₂CO- 。 MSにより認められた分子量は6130：理論値6133。

【０１４８】実施例22Ｎε^B29 −オクチルオキシカルボニルヒトインスリンの
合成この合成は実施例20ｂに記載の通りに実施したが、ただ
しＮ−（スクシニミジルスベロイル）−Ｄ−チロキシン
の代わりに、ｎ−オクチルオキシカルボニルＮ−ヒドロ
キシスクシニミド（９mg；ｎ−オクチルクロロホルメー
ト（Aldrich)及びＮ−ヒドロキシスクシニミドより調
製）を用いた。Ｎε^B29 −オクチルオキシカルボニルヒ
トインスリンの収量は86mgであった。

【０１４９】本例の生成物は、 Lys^B29 のε−アミノ基
が次の構造式の置換基を有するヒトインスリンである：
CH₃(CH₂)₇OCO- 。 MSにより認められた分子量は5960：理論値5964。

【０１５０】実施例23Ｎε^B29 −（２−スクシニルアミド）パルミチン酸ヒト
インスリンａ．Ｎ−（スクシニミジルスクシノイル）−α−アミノ
パルミチン酸メチルエステルの調製本化合物は実施例21ａ．〜ｃ．に記載の通りにして、α
−アミノミリスチン酸の代わりにα−アミノパルミチン
酸を用いて調製した。

【０１５１】ｂ．（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocヒトインスリ
ンとＮ−（スクシニミジルスクシノイル）−α−アミノ
パルミチン酸メチルエステルとの反応この反応は実施例21ｄに記載の通りに実施したが、ただ
しＮ−（スクシニミジルスクシノイル）−α−アミノパ
ルミチン酸メチルエステルの代わりにＮ−（スクシニミ
ジルスクシノイル）−α−アミノパルミチン酸を用い、
Ｎε^B29 −（２−スクシニルアミド）パルミチン酸ヒト
インスリンを得た。本例の生成物は Lys^B29 のε−アミ
ノ基が以下の構造式の置換基を有するヒトインスリンで
ある：CH₃(CH₂)₁₃CH(COOH)NHCOCH₂CH₂CO- 。

【０１５２】実施例24Ｎε^B29 −（２−スクシニルアミドエチルオキシ）パル
ミチン酸ヒトインスリンａ．Ｎ−（スクシニミジルスクシノイル）−２−アミノ
エチルオキシパルミチン酸メチルエステルの調製本化合物は実施例21ａ．〜ｃ．に記載の通りにして、α
−アミノミリスチン酸の代わりにα−アミノエチルオキ
シパルミチン酸(R. TenBrink, J. Org. Chem.52 (1987)
418-422 記載の一般手順により合成）を用いて調製し
た。

【０１５３】ｂ．（Ａ１，Ｂ１）−ジ Bocヒトインスリ
ンとＮ−（スクシニミジルスクシノイル）−α−アミノ
エチルオキシパルミチン酸メチルエステルとの反応この反応は実施例21ｄに記載の通りに実施したが、ただ
しＮ−（スクシニミジルスクシノイル）−α−アミノミ
リスチン酸メチルエステルの代わりにＮ−（スクシニミ
ジルスクシノイル）−α−アミノエチルオキシパルミチ
ン酸を用い、Ｎε^B29 −（２−スクシニルアミドエチル
オキシ）パルミチン酸ヒトインスリンを得た。

【０１５４】本例の生成物は Lys^B29 のε−アミノ基が
以下の構造式の置換基を有するヒトインスリンである：
CH₃(CH₂)₁₃CH(COOH)NHCH₂CH₂OCOCH₂CH₂CO-。

【０１５５】実施例25 Ｎε^B29 −リトコロイル−α−グルタミルデス（Ｂ30）
ヒトインスリンの合成この合成は、実施例13に記載の通りにして、デカノン酸
Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの代わりに、Ｎ−
リトコロイル−Ｌ−グルタミン酸α−Ｎ−ヒドロキシス
クシニミドエステル、γ−tert−ブチルエステルを用い
て実施した。

【０１５６】本例の生成物は Lys^B24 のε−アミノ基が
以下の構造式の置換基を有するデス（Ｂ30) ヒトインス
リンである：リトコロイル−NHCH(CH₂CH₂COOH)CO- 。 MSにより認められたこの生成物の分子量は6194：理論値
6193。

【０１５７】実施例26Ｎε^B29 −３，３′，５，５′−テトラヨードチロアセ
チルヒトインスリンの合成この合成は実施例10に記載の通りにして、デカノン酸Ｎ
−ヒドロキシスクシニミドエステルの代わりに３，
３′，５，５′−テトラヨードチロ酢酸Ｎ−ヒドロキシ
スクシニミドエステルを用いて実施した。 MSにより認められたこの生成物の分子量は6536：理論値
6538。

【０１５８】実施例27Ｎε^B29 −Ｌ−チロキシルヒトインスリンの合成この合成は実施例10に記載の通りにして、デカノン酸Ｎ
−ヒドロキシスクシニミドエステルの代わりに Boc−Ｌ
−チロキシンＮ−ヒドロキシスクシニミドエステルを用
いて実施した。 MSにより認められたこの生成物の分子量は6572：理論値
6567。

【０１５９】実施例28溶液において 600nmol／mlのＮε^B29 −デカノイルデス
Ｂ（30）ヒトインスリン・１／３ Zn²⁺ を含んで成る薬
理組成物Ｎε^B29 −デカノイルデス（Ｂ30）ヒトインスリン(1.2
μmol)を水 (0.8ml)に溶かし、そしてpH値を 0.2Ｍの水
酸化ナトリウムの添加により 7.5にした。0.01Ｍの酢酸
亜鉛（60μｌ）と、0.75％のフェノール及び４％のグリ
セロールを含む溶液 (0.8ml)とを加えた。この溶液のpH
値を 0.2Ｍの水酸化ナトリウムを用いて7.5にし、そし
てこの溶液の容量を水で２mlにした。

【０１６０】得られる溶液を濾過により滅菌し、そして
無菌状態でカートリッジ又はバイアルに移し入れた。

【０１６１】実施例29溶液において 600nmol／mlのＮε^B29 −デカノイルデス
Ｂ（30）ヒトインスリン・１／２ Zn²⁺ を含んで成る薬
理組成物表題の化合物 1.2μmol を水 (0.8ml)に溶かし、そして
pH値を 0.2Ｍの水酸化ナトリウムの添加により 7.5にし
た。0.75％のフェノール及び1.75％の塩化ナトリウムを
含む溶液 (0.8ml)とを加えた。この溶液のpH値を 0.2Ｍ
の水酸化ナトリウムを用いて 7.5にし、そしてこの溶液
の容量を水で２mlにした。得られる溶液を濾過により滅
菌し、そして無菌状態でカートリッジ又はバイアルに移
し入れた。

【０１６２】実施例30溶液において 600nmol／mlのＮε^B29 −リトコロイルヒ
トインスリンを含んで成る薬理組成物表題の化合物 1.2μmol を水 (0.8ml)に溶かし、そして
0.2Ｍの水酸化ナトリウムを用いて溶液のpH値を 8.5に
することによって溶解させた。その溶液に0.75％のクレ
ゾール及び４％のグリセロールを含むストック水溶液
0.8mlを加えた。最後に、そのpHを再び 8.5にし、そし
て溶液の容量を水で２mlにした。得られる溶液を濾過に
より滅菌し、そして無菌状態でカートリッジ又はバイア
ルに移し入れた。

【配列表】

〈110 〉ノボノルディスクアクティーゼルスカブ〈120 〉アシル化インスリン〈130 〉〈150 〉 DK 1044/93 〈151 〉 1993-9-9 〈150 〉 US 08/190,829 〈151 〉 1994-2-2 〈160 〉 49 〈170 〉 Patent In Release #1.0, Version #1.25

【化８】

【化９】

【化１０】

【化１１】

【化１２】

【化１３】

【化１４】

【化１５】

【化１６】

【化１７】

【化１８】

【化１９】

【化２０】

【化２１】

【化２２】

【化２３】

【化２４】

【化２５】

【化２６】

【化２７】

【化２８】

【化２９】

【化３０】

【化３１】

【化３２】

【化３３】

【化３４】

【化３５】

【化３６】

【化３７】

【化３８】

【化３９】

【化４０】

【化４１】

【化４２】

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドpEA5.3.2の構築を示す。

【図２】プラスミドpEA108の構築を示す。

【図３】プラスミドpEA113の構築を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ハルストレーム，ヨーブロベルイデンマーク国，デーコー−3990 フネステズ，セーネルガゼ 44 (72)発明者ヨナセン，イブデンマーク国，デーコー−2500 バルビー，バルビーランガゼ 10 (72)発明者アンデルセン，アセルスロートデンマーク国，デーコー−1864 フレデリクスベルウセー，グルントビクスバイ 35，２．テーベー. (72)発明者マルクセン，ヤンデンマーク国，デーコー−2730 ヘルレウ，キクトバッケン７Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA01 CA04 DA12 EA04 GA11 HA01 4C084 AA02 AA07 DB34 NA14 ZC351 4H045 AA10 AA30 CA40 DA37 EA27 EA30 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｎε^B29 −テトラデカノイルデス（Ｂ３
０）ヒトインスリンである、インスリン誘導体。
【請求項２】糖尿病の処置を必要とする患者のかかる
処置のための薬理組成物であって、治療的に有効な量の
請求項１記載のインスリン誘導体を薬理学的に許容され
る担体と一緒に含んで成る薬理組成物。
【請求項３】糖尿病の処置を必要とする患者のかかる
処置のための薬理組成物であって、治療的に有効な量の
請求項１記載のインスリン誘導体を、即効性を有するイ
ンスリン又はインスリン類似体との混合において、薬理
学的に許容される担体と一緒に含んで成る、薬理組成
物。