JP2001517451A - 遺伝子鎮静化物質および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 植物の第一部分に存在する標的ヌクレオチド配列（好ましくは全身的な、一つ以上の内因性遺伝子を示す）を鎮静する方法であって、当該植物の第二部分の細胞の細胞質に核酸構成物を一時的に導入することを含み、前記細胞は標的配列をコードする核酸を含み、かつ、当該植物の前記第一部分から離れて位置する、植物の標的ヌクレオチド配列を鎮静する方法が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、植物において遺伝子鎮静化を調節する方法および物質、およびこれ
らの方法および物質を利用する様々なプロセスおよび産物に関する。

【０００２】

【従来の技術】

内在性遺伝子の共抑制およびアンチセンス抑制 安定に組み込まれた（stably−integrated）導入遺伝子（下記で「ＳＴ遺伝子
」または「ｉｎｔ遺伝子」と呼ぶ）（これは、恒常的に発現され得る）を使用し
て、相同的内在性（homologous endogeneous）（「ＨＥ遺伝子」）植物遺伝子を
抑制し得る。これは、ペチュニアのカルコンシンターゼ導入遺伝子が内在性カル
コンシンターゼ遺伝子の抑制を引き起こしたときに初めて発見された。その後、
全てとは言わないまでも多くの植物遺伝子が、導入遺伝子により「鎮静（鎮静）
」され得ることが記載された。遺伝子鎮静化（サイレンシング）には、導入遺伝
子と鎮静される遺伝子間の配列相同性が必要である（Matzke，M．A．およびMatz
ke，A．J．M．）（1995）、Trends in Genetics、11：1−3）。この配列相同性 は、鎮静した遺伝子のプロモーター領域またはコード領域と関与し得る（Matzke
，M．A．およびMatzke，A．J．M．）（1993）Annu．Rev．Plant Physiol．Plant
Mol．Biol．、44：53−76、Vaucheret，H．（1993）C．R．Acad．Sci．Paris、
316：1471−1483、Vaucheret，H．（1994）、C．R．Acad．Sci．Paris、317：31
0−323、Baulcombe，D．C．）およびEnglish，J．J．（1995）、Current Opinio
n In Biotechnology、7：173−180、Park，Y−D．ら（1996）、Plant J．、9：1
83−194）。 コード領域が関与する場合、遺伝子鎮静化を引き起こすことのできる導入遺伝
子を、コード配列ＲＮＡのセンスまたはアンチセンス配向を転写するプロモータ
ーを用いて構築し得る。少なくとも１つの例において、コード配列導入遺伝子は
、プロモーターを用いて構築された（Van Blokland，R．ら（1994）、Plant J．
、6：861−877）。

【０００３】 導入遺伝子の共抑制 また、遺伝子鎮静化は、従来の遺伝学の知識とは容易に一致しなかった、トラ
ンスジェニック植物のいくつかの特徴を説明できることが明らかになった。例え
ば、ＳＴ遺伝子構成物によるＳＴ遺伝子発現の同胞系間の多様性は、一部、遺伝
子鎮静化に起因する：低い発現体は、遺伝子鎮静化レベルの高いものであり、一
方、高い発現体は、遺伝子鎮静化が存在しないか、または植物発達の後期に誘導
されたものである。この場合、ＳＴ遺伝子に対応するＨＥ遺伝子が存在する必要
性はない(例えば、Elmayan&Vaucheret(1996)Plant J.9:787-797参照)。 ウイルス耐性 ＳＴ遺伝子の観察に加えて、遺伝子鎮静化はまた、ウイルス耐性にも関与して
いる。これらの場合、異所性ＤＮＡ相互作用⁶、ＤＮＡメチル化⁷、導入遺伝子発
現レベル⁸および二本鎖ＲＮＡ⁹を含む様々な要因が、遺伝子鎮静化の発動（開始
）因子として提唱されている。 加えて、非トランスジェニック植物において、植物におけるウイルスの全身性
蔓延後に発生した葉は、症候性の葉よりもウイルス含有レベルが低いことが実証
された。この耐性は、導入遺伝子により誘導された遺伝子鎮静化と性質が類似し
ている（例えば、Ratcliffら(1997)Science、276:1558-1560参照)。

【０００４】 細胞質で複製するウイルス構成物 Biosource Technologies、ＷＯ９５／３４６６８は、アンチセンスまたはセン ス（「コサプレッサー」）ＲＮＡのいずれかである抑制性ＲＮＡを生成する、細
胞の細胞質で複製するＲＮＡウイルスに基づく遺伝子構成物の使用を示唆した。
この構成物を使用して、特定のＨＥ遺伝子（フィトエン・デサチュラーゼ）を阻
害した。細胞を、細胞質で複製する遺伝子構成物（ＲＮＡコード領域は目的の遺
伝子に特異的である）を用いてトランスフェクトした。ハイブリッドウイルスが
、接種していない上部の葉を含む植物全体に蔓延した（透過型電子顕微鏡により
確認）。トランスフェクション後、系に広く遺伝子鎮静化が報告された。 英国特許出願第９７０３１４６．２号、およびＰＣＴ／ＧＢ９８／００４４２
(両方共、John Innes Centre Innovations Limitedの名称で出願)を引用によりこ
こに援用する。これらの出願（本出願の優先権主張日より前には公開されていな
かった）は、植物ゲノムに安定に取込まれ、遺伝子鎮静化を顕現できる細胞質で
複製する構成物を産生する、様々な構成物（「アンプリコン」）を議論している
。 動物における鎮静化 Fireら(1988)Nature 391:806-811（本出願の優先権主張日より前には公開され
ていなかった）は、線虫における、内在性遺伝子の鎮静化を達成する、ＲＮＡ、
特に二本鎖ＲＮＡおよびＧＦＰ導入遺伝子の使用を議論している。実証された干
渉効果は、細胞境界を横断することができるようであった。

【０００５】 遺伝子鎮静化の適用 基本的に、遺伝子鎮静化には穀物改良に非常に大きな実用的可能性がある。植
物において望ましくない特質を与える遺伝子を、これらの遺伝子の要素を含む導
入遺伝子構成物を用いた形質転換により、鎮静することが可能である。この型の
適用例は、収穫した果物の加工および取扱い特徴を改良する、トマトにおける熟
成特異的遺伝子の遺伝子鎮静化；Ｆ１ハイブリッド産生のために、生産者が再生
的に雄繁殖不能植物を作れるような、花粉形成に関与する遺伝子の遺伝子鎮静化
；植物の栄養組織から製造した紙パルプの品質を改良するための、リグニン生合
成に関与する遺伝子の遺伝子鎮静化；新規な花の色を作るための、花色素産生に
関与する遺伝子の遺伝子鎮静化；新規な成長体質または（例えば）疾病耐性を有
する植物を産生するために、発達または環境応答を制御する調節経路に関与する
遺伝子の遺伝子鎮静化；毒素産生に必要な遺伝子の遺伝子鎮静化による毒性二次
代謝物の除去を含む。 遺伝子鎮静化はまた、遺伝子機能の調査に有用であり、これを使用して、特定
の遺伝子の中間またはヌル表現型に施すことができ、これによりインビボにおけ
るその遺伝子の機能に関する情報を得ることができる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】 現在までのこの現象の実用的な活用における主な難点は、遺伝子鎮静化が予測
不可能かつ低頻度であることである。それ故、形質転換が困難であり、そのため
多くの形質転換体を産生することが困難である植物において、遺伝子鎮静化を試
みることは現実的ではなかった。同様に、同植物において、数個の異なる特質ま
たは数個のウイルスに対して遺伝子鎮静化を活性化（および不活性化）すること
は困難であった。形質転換が容易な植物でさえ、複数の系を産生する必要から、
遺伝子鎮静化の活用し易さは制限される。

【０００７】

【課題を解決するための手段】

本発明者は、今回、系、特に成熟植物（これはトランスジェニック植物であっ
てもよいが、好ましくはそうではない）内において、一貫した、制御された、全
身的な遺伝子鎮静化を提供する新規な手段を実証した。この新規なアプローチは
、以前に記載された遺伝子鎮静化へのアプローチ、例えばトランスウイッチおよ
びアンチセンス技術とは、空間的および所望により時間的に遺伝子鎮静化を調節
できる多成分システムを記載している点で、明らかに異なる。 本発明はまた、バイオソース・テクノロジーにより以前に記載されたウイルス
誘導遺伝子鎮静化とも異なる。本発明において、遺伝子鎮静化を与える導入遺伝
子またはその転写物が、ウイルス成分を使用して、またはウイルス複製に類似し
た機構を通して、複製できることは絶対必要条件ではないが、ある有利な実施形
態においては、そうであり得る。重要には、本発明の全身的な鎮静化においては
、導入遺伝子またはその転写物は、細胞間を移動するためにウイルス由来の機構
（例えば、「移動タンパク質」と当分野で呼ばれる）を使用する必要はない。 これらの移動タンパク質は、ほとんど（おそらくほぼ全て）の植物ウイルスに
よりコードされている。移動タンパク質は、通常、ウイルスゲノムの変異解析に
より認識される。移動タンパク質遺伝子の変異は、ウイルスの感染植物内に蔓延
する能力に影響を及ぼすが、ウイルスの複製能には影響を及ぼさない。このよう
に同定されたウイルス性移動タンパク質の例は、タバコモザイクウイルスの３０
ｋＤａタンパク質(Deomら、1987)、ポテトウイルスＸの２５ｋＤａ、１２ｋＤａ および８ｋＤａの三遺伝子ブロックタンパク質（図２）(AngellおよびBaulcombe
、1995;Angellら、1996;Verchotら、1998)およびカウピーモザイクウイルスの細管 形成タンパク質(Van Lentら、1991)を含む。あるウイルスはまた、植物の篩管を 通るウイルスの転位に特異的な移動タンパク質をコードしている。これらの長距
離移動タンパク質の例は、キュウリモザイクウイルスにコードされた２ｂタンパ
ク質(Dingら、1995）およびトマトブッシー・スタントウイルスの１９ｋＤａタン
パク質(Scholthofら、1995)を含む。

【０００８】 最近まで、移動タンパク質は植物細胞の間にチャネルを開口し、よってウイル
ス移動を仲介すると考えられていた(Wolfら、1989)。しかし、今では、少なくと もこれらのタンパク質のいくつかは、ウイルス移動を遮断する植物の防御機構の
抑制により移動を促進し得ることが明らかとなり、これはそれ自体、前記した遺
伝子鎮静化に関連し得る。これらの新しい発見から、(これは、Anandalakshmiら(
1998)およびBrignetiら(1998)による観察と一致する［両方共刊行されている］ ）、移動タンパク質は遺伝子鎮静化のサプレッサーであり得ることが明らかであ
る。同様に、本発明者の研究により、病原性タンパク質とのみ前記したあるタン
パク質もまた、遺伝子鎮静化シグナルの抑制に役割を果たし得ることが示唆され
る。 従って、遺伝子鎮静化用の導入遺伝子構成物が、ウイルス移動タンパク質また
は病原性タンパク質（これはＲＮＡ−ウイルスに基づくベクターの活性に依拠し
た従来システムの基本的な部分である）によって、遺伝子鎮静化の発現へと導か
なければ、より強力で、全身的な遺伝子鎮静化が得られると認識できる。かかる
システムはＴＩＧＳ効果を仲介し得ない(例えば、Dougherty,W.G.ら、植物-微生物
分子性相互作用、1994:7、544-552参照)。 本発明の新規な遺伝子鎮静化システムは、緑蛍光タンパク質の遺伝子を用いて
安定に形質転換されたもの（ｓｔＧＦＰと呼ぶ）を用いて安定に形質転換された
トランスジェニックN.benthamianaを使用して初めて実証された。

【０００９】 研究者は、ｓｔＧＦＰの発現は、バイナリーＴｉプラスミドベクターを有する
Agrobacterium tumefaciens株を使用して、または直接的な浸潤を使用して、Ｇ ＦＰレポーター遺伝子（ｓｔＧＦＰから区別するためにｔｒＧＦＰと呼ぶ）の一
時的存在により鎮静できることを実証した。鎮静化は、全身性であり、感染また
は浸潤部位から遠くで生じた。 このアプローチにより、植物において全身性遺伝子鎮静化を仲介する、既知で
はないシグナリング機構の存在が示唆される。鎮静化のシグナルは、遺伝子特異
的であり、細胞間を移動する核酸のようである。 植物細胞の細胞質における自己複製または細胞から細胞への移動が可能である
必要はないが、全身に伝播し得るシグナルを発生する、外来発動（開始）因子で
ある核酸または核酸複合体（以後、「ｆｉＮＡ」と呼ぶ）の植物の一部における
（安定な組み込みではなく）一過性（一時的な）存在により開始される、遺伝子
鎮静化の全身性配列特異的シグナルは、完全に新規であり、植物生物学において
意外な概念である。観察により、多くの重要（産業的に応用可能）な特性が判明
した。これらの特性、およびそれらを達成するに必要とされるｆｉＮＡの特徴は
、より詳細に以後議論する。

【００１０】 本発明者の研究は、あと知恵と共に、他の刊行された実験システムのデータと
一致し、植物における遺伝子鎮静化の一般的な特色となり得る。 従って、花色素生合成に必要とされる遺伝子の導入遺伝子誘導鎮静化を示すト
ランスジェニックペチュニアは、普通でない不規則な色素形成パターンを示すこ
とが示された。これらは、おそらく遺伝子鎮静化の細胞系依存性合図よりもむし
ろ細胞外シグナルにより説明できる(Jorgensen(1995) Science 268、686-691参照
)。この研究において、ＨＥ遺伝子（ＣＨＳ）の遺伝子鎮静化は、試験植物にキ メラＳＴ遺伝子を使用して誘導されたことを強調すべきである。論文に、遺伝子
鎮静化の２段階システムを推測しているが、どのように遺伝子鎮静化のスイッチ
がオンとなるかの情報は全くない。 異なるグループによる研究により、トランスジェニックタバコの非クローン性
領域におけるキチナーゼ遺伝子鎮静化が実証された(Kunzら(1996)Plant J.10、43
37-450参照)。この研究により、唯一ＳＴ遺伝子の発現の「自己」不活性化、お よびＳＴ遺伝子によるＨＥ遺伝子の不活性化が実証された。この研究はまた、遺
伝子鎮静化は転写後事象であることを示唆した。遺伝子鎮静化は、トランスジェ
ニック植物の後代で確率的に生じるが、非鎮静状態への「リセット」は、発達中
種子において非確率的に生じることが実証された。これらの観察、およびある植
物が示す多様な鎮静化形式により、遺伝子鎮静化表現型は、単に系の事象ではな
いことを実証し、また遺伝子鎮静化の予測不可能性を強調した。論文には、非鎮
静または「リセット」遺伝子における遺伝子鎮静化を調節するためのｆｉＮＡの
使用は全く示唆されていない。

【００１１】 Palaquiら、EMBO Journal(1997)V16 No15:pg 4738は、非鎮静接木を遺伝子鎮静
化台木（共抑制されたＳＴおよびＨＥ硝酸レダクターゼ遺伝子）上につぎ木する
と、接木上に鎮静化が施されることを実証した。接木はＳＴ遺伝子を含まなけれ
ばならず、鎮静化は一方向性であり、ＨＥ硝酸レダクターゼ遺伝子が存在し、シ
グナル変換常在性遺伝子として機能している野生型幹「バリヤー」を通して生じ
得る。拡散性メッセンジャーが仮定されるが、既に鎮静化した同型接合植物株の
移植片の使用の他には、このメッセンジャーの発生または使用に関する記載は全
くない。 本発明者により実証された全身性シグナルはまた、遺伝子鎮静化は、ウイルス
に対して誘導された天然防御と関連するという最近の知見と一致する。シグナル
は、ウイルス誘導よりも前に植物内を移動でき、よって、抗ウイルス性遺伝子鎮
静化は前に感染の蔓延を遅延できる(Ratcliffら(1997)Science、276:1558-1560) 。下記のデータはまた、ある状況において、ウイルスタンパク質は、このシグナ
ル伝播を阻害するように作用し得ることを示唆する。 シグナリング機構の規定およびそれを活性化できる新規な手段（ｆｉＮＡの一
過性存在）により、多くの可能性を開き、これはより詳細に以後議論する；本質
的に、遺伝子鎮静化を全身性に便宜に調節できることは、遺伝子機能の調査、お
よび遺伝子鎮静化植物の産生の両方、並びに遺伝子鎮静化の機構の調査に有用で
ある。

【００１２】 特に有用なのは、表現型を調査するために、迅速かつ一貫して、自由意志によ
り、遺伝子鎮静化を機能が既知または未知のＨＥまたはＳＴ遺伝子に施せること
である。 全身性シグナルは依然として構造的に特徴づけられていないが、本研究に照ら
してそれに関する多くの指摘をなし得る。それは、ｆｉＮＡを植物細胞に、特に
、同植物細胞において、鎮静すべき標的遺伝子またはおそらく常在性遺伝子（下
記で定義）が転写されている、細胞質に直接的または間接的に導入したときに産
生され、ｆｉＮＡと標的遺伝子のコード領域間には配列類似性がある。 これらの知見から、タンパク質産物、または対応するＤＮＡまたはＲＮＡが、
シグナルの成分であることが示唆される。これらの中で、タンパク質が最も可能
性の低い候補である。なぜなら、それがどのように全身的かつ特異的に標的のＲ
ＮＡに標的化し得るかを説明する機構が全く知られていないからである。しかし
、核酸を基本としたシグナルは、標的遺伝子ＲＮＡ（または相同的常在性遺伝子
の転写産物）との塩基対形成または三重ヘリックス構造を介して、その遺伝子を
発現する細胞および組織間を移動しながら、配列特異的遺伝子鎮静化を仲介でき
る。さらに、核酸は、おそらくウイルスまたはウイロイド移動に関与するチャネ
ルを使用して、植物内を移動できる。実証されたＳＴ−ＧＦＰ鎮静化の全身性伝
播（図３ｃ）は、この示唆と一致する。なぜなら、それは、感染植物におけるウ
イルス蔓延のパターンと類似した経過（図３ｃ、３ｇ）をとるからである。

【００１３】

【発明の実施の形態】

従って、本発明の第一の実施形態において、 （ｉ）細胞から細胞へと移動不可能であり、および （ｉｉ）任意により、自己複製不可能であり、および （ｉｉｉ）鎮静すべき配列と配列相同性を有する、外来発動因子核酸（ｆｉＮＡ
）を、標的配列が存在する（好ましくは転写されている）植物の細胞の細胞質に
、一過性に導入（すなわち安定に組込まれた導入遺伝子を介してではない）する
ことを含む、植物において、標的ヌクレオチド配列（例えば遺伝子）を鎮静する
方法が開示される。 本法は、 （ａ）遺伝子鎮静化シグナルを産生するために、第一部分から遠隔の、植物の第
二部分を、上記の外来発動因子核酸（ｆｉＮＡ）に一過性に曝露し、 （ｂ）標的遺伝子を鎮静するために、シグナルの植物の第二部分への伝播を引き
起こすまたは可能とする段階を含む、植物の第一部分における標的遺伝子を鎮静
するために使用する。 この意味での「引き起こすまたは可能とする」は、特に、ｆｉＮＡ（従ってシ
グナル）を産生する構成物が、例えば細胞から細胞へのウイルスの移動を可能と
する移動タンパク質といった、シグナルを遮断するようなタンパク質をコードし
ていないことを含意する。

【００１４】 従って、本発明者は、初めて、一過性（一時的）に誘導した遺伝子鎮静化（Tr
ansiently Induced Gene Silencing）（または「ＴＩＧＳ」）を実証した。彼ら
はまた、遺伝子鎮静化を伝播可能なシグナルは、植物の第二部分で開始して、第
一部分に遺伝子の鎮静化を誘導できることを実証した。 一般的に言えば、ＴＩＧＳは３つの相を有すると考えることができる： （ｉ）植物細胞の細胞質におけるｆｉＮＡの一過性存在による遺伝子鎮静化シグ
ナルの開始（これはより詳細に下記する）、 （ｉｉ）植物の組織を通る遺伝子鎮静化シグナル（ｆｉＮＡ自体ではない）の転
位（これはその組織における標的遺伝子に相同性を有するＨＥ遺伝子またはＳＴ
遺伝子の発現により促進される）、 （ｉｉｉ）最初に一過性にｆｉＮＡに曝露した部位から遠隔であり得る、植物の
細胞内における遺伝子鎮静化シグナルの維持。 ＴＩＧＳの様々な異なる特色をここでより詳細に議論する： この文脈における「鎮静化（サイレンシング）」は、（標的）遺伝子の発現
の抑制を意味するために使用される。必ずしも転写の減少を含意するものではな
い。なぜなら、少なくともある場合、遺伝子鎮静化は転写後に起こると信じられ
ているからである。減少度は、コードされた遺伝子産物の産生が全体的に消失す
るようなものであり得るが（ヌル表現型を生じる）、より一般的には、発現の消
失は一部であり、ある程度の発現が残存し得る（中間表現型を生じる）。それ故
、この用語は発現の完全なる「鎮静化」を要求するものと捉えるべきではない。
当業者はこれを理解しているため、便宜な場合、それを本明細書において使用す
る。

【００１５】 「全身性」鎮静化は、標的遺伝子が、実質的に植物組織を通り転位するシグナ
ルを介して、鎮静することを意味する（しかし、詳細に下記で議論するように、
分裂組織などのある組織は鎮静し得ない）。 本発明における「標的」遺伝子（すなわち、鎮静すべき遺伝子または鎮静した
遺伝子）は、目的の任意の遺伝子であり得る。下記で議論するように、それはｆ
ｉＮＡと相同性を共有する。特に、それは、相同的内在性遺伝子（ＨＥ遺伝子）
または安定に形質転換した相同的導入遺伝子（ＳＴ遺伝子、上記で使用したｓｔ
ＧＦＰと共に）であり得る。 １つ以上の標的遺伝子（例えば遺伝子ファミリー）を、それらが全てｆｉＮＡ
と相同性を共有する場合、同時に標的化し得る。 より詳細に以後議論するように、本発明のある実施形態において、遺伝子の実
体または表現型は未知であり得、実際ＴＩＧＳはそれを同定するために使用され
得る。 「ｆｉＮＡ」（これはＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであり得る）は、合成し
得るか（すなわち人工）、または天然の核酸配列であり得、これは標的遺伝子の
相同体であるか、またはセンスまたはアンチセンス配向における標的遺伝子の全
てまたは一部の複製であり得る。それは、二本鎖または一本鎖であり得、例えば
それはアンチセンス（二本鎖）ＲＮＡから構成され得る。

【００１６】 当分野で遺伝子鎮静化を行うために使用されたＲＮＡウイルスをベースとする
ベクターと異なり（例えば、バイオソース・テクノロジー、ＷＯ９５／３４６６
８）、ｆｉＮＡ自体は、植物細胞から植物細胞への移動を可能とし、任意により
植物細胞の細胞質における複製を可能とする配列を欠失している（すなわち、ｆ
ｉＮＡは細胞において自己複製可能である必要はない）ことは強調すべきである
。 ＰＣＴ／ＧＢ９８／００４４２の単位複製配列と異なり（これは任意によりか
かる移動配列を欠失する）、ｆｉＮＡは植物において安定に組込まれた導入遺伝
子により産生されない。 従って、シグナル開始の効力を付与するｆｉＮＡの非常に重要な要素は以下で
ある： （ｉ）それは、植物に対して外来性であるか、または少なくとも、おそらく植物
中に存在する核酸と相互作用した後、外来性として認識される、 （ｉｉ）それは、標的遺伝子（コードまたは非コード鎖）の全てまたは一部と相
同性を共有する、 （ｉｉｉ）それは、植物細胞から植物細胞へと移動できず（より具体的には、シ
グナルと干渉する移動タンパク質または病原性タンパク質をコードする配列を含
まない）、任意により植物細胞細胞質で自己複製できない。

【００１７】 「外来（外因性）」なる語は、ｆｉＮＡが、植物の細胞またはその先代に、お
そらく組換えＤＮＡ技術を使用して、しかしいずれの場合にもヒトの介入により
、導入されたことを示すために広く使用される。別の言葉でいえば、ｆｉＮＡは
、それが導入された細胞において非天然である。例えば、ｆｉＮＡは、異なる型
または種または種類の植物の植物細胞の内容物内に配置された、特定の型の植物
細胞または種または植物の種類、またはウイルスのコード配列を含み得るか、ま
たはそれから誘導し得る。別に、ｆｉＮＡは、植物ゲノムから引き出し得るが、
「非天然」細胞性または染色体位置に存在するか、または標準内在性配列（遺伝
子または転写物）のある特色を欠失している。さらなる可能性は、ｆｉＮＡが、
細胞内に配置することであり、この場合それまたは相同体は天然で見られるが、
ｆｉＮＡが核酸に結合および／または隣接する場合、細胞、またはその型または
種または種類の植物の細胞内では天然ではなく、例えば発現の調節のためのプロ
モーター配列などのように、１つ以上の調節配列と機能的に連結している。

【００１８】 ｆｉＮＡの「相同性」に関して、従来技術の研究から明らかであるように、転
写された配列に対応する完全な配列を、遺伝子鎮静化の奏効のために使用する必
要はない（しかし本明細書に記載のｆｉＮＡを使用しなかった、またはＴＩＧＳ
を提供しなかった）。例えば、十分な長さのフラグメントを使用し得る。様々な
サイズのフラグメントを選別し、標的遺伝子のコードまたは非コード配列の様々
な部分から、例えば、後述するＧＦＰシステムに基づくシステムを使用して、遺
伝子鎮静化レベルを最適化することは当業者には慣用的なことである。標的遺伝
子の開始メチオニンＡＴＧコドン、およびおそらく開始コドンの上流の１つ以上
のヌクレオチドを含むことが有利であり得る。さらなる可能性は、例えば１つ以
上の標的遺伝子の特徴である配列などの、標的遺伝子内の保存配列を標的化し、
同一または類似の保存配列を含む数個の遺伝子を鎮静することである。 ｆｉＮＡは、３００ヌクレオチドまたはそれ以下、おそらく約２００ヌクレオ
チド、または約１００ヌクレオチドであり得る。はるかに短い長さ、１４−２３
ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを使用することが可能であり得る。ｆｉＮＡ
が転写により産生されるか、または短いフラグメントは細胞質ヌクレアーゼ活性
から保護されない場合、可能であれば、より長いフラグメント、および一般的に
は３００より長いヌクレオチドが、好ましい。

【００１９】 ｆｉＮＡと標的配列の相当部分の間に完全な配列同一性が存在することが好ま
しくあり得るが、配列の全相補性または類似性は必須ではない。標的指向化配列
において、１つ以上のヌクレオチドが、標的遺伝子とは異なり得る。従って、本
発明のｆｉＮＡは、標的遺伝子の野生型配列に対応し得るか、または該配列の１
つ以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失または置換による、突然変異体、誘導
体、変異体または対立遺伝子であり得る。 ｆｉＮＡは、オープンリーディングフレームを含む必要はなく、または翻訳可
能なＲＮＡを指定する必要はない。ｆｉＮＡと対応する相同的標的配列の間に、
約５％、１０％、１５％、２０％または３０％またはそれ以上のミスマッチが存
在しても、ＴＩＧＳシグナルは生じ得る。配列相同性（または「同一性」または
「類似性」−この用語は本明細書において同義語として使用する）は、任意の慣
用的な方法により評価し得、例えばそれは当分野で標準的に使用される、アルト
シュール(Altschul)ら(1990)J.Mol.Biol.215:403-10のＴＢＬＡＳＴＮプログラ ムにより決定し得る。

【００２０】 ＴＩＧＳシグナルの転位に関して、上述のように、これは植物細胞がｆｉＮＡ
に一過性に曝露された場合に産生され、転位組織は、標的遺伝子または標的遺伝
子と相同性を有する別の「常在性遺伝子」およびかかる組織を通して伝達される
遺伝子鎮静化シグナルのｆｉＮＡを含む、および好ましくは転写する（必ずしも
発現する必要はない）。しかし、下記の実施例に示したように、必ずしも全ての
転位組織が遺伝子を転写する必要はなく、シグナルは発現細胞の間で「中継（リ
レー）」され得る。 常在性遺伝子（より詳細に下記で議論する）は、植物に対して内在性または外
在性であり得る。常在性遺伝子に関連した「相同性」なる用語は、上記のｆｉＮ
Ａ／標的遺伝子に関連した使用と同じように使用される。この場合、非常に重要
な要素は、相同性が、シグナル産生および／または伝播を可能とするに十分なこ
とである。上述のように、相同性は、好ましくは、少なくとも７０％、より好ま
しくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少
なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または最も好ましくは９５％
以上である。 常在性遺伝子としてＳＴ遺伝子を使用する利点は、その転写を、ＨＥ遺伝子で
ある標的遺伝子よりも容易に（所望であれば）制御し得ることであり、これはよ
り詳細に、下記のシグナル伝播促進と関連して議論する。

【００２１】 植物の第二部分のｆｉＮＡへの「一過性曝露」は、任意の慣用的な方法により
達成し得る。本質的には、ｆｉＮＡは、直接的または間接的に（例えば、局所的
に存在する外来核酸からの核で産生されたｆｉＮＡの曝露）、植物の第二部分の
細胞の細胞質に導入する。 核酸を植物細胞に導入する既知方法は、天然の遺伝子導入能を活用した、アグ
ロバクテリウムが保持する無毒化したＴｉプラスミドベクターの使用を含む（Ｅ
Ｐ−Ａ−２７０３５５、ＥＰ−Ａ−０１１６７１８、ＮＡＲ１２（２２）８７１
１−８７２１（１９８４）、粒子または微粒子銃（ボンバードメント）（ＵＳ５
１００７９２、ＥＰ−Ａ−４４４８８２、ＥＰ−Ａ−４３４６１６）マイクロイ
ンジェクション（ＷＯ９２／０９６９６、ＷＯ９４／００５８３、ＥＰ３３１０
８３、ＥＰ１７５９６６、Ｇｒｅｅｎら（１９８７）植物組織および細胞培養、
Academic Press)、電気穿孔法（ＥＰ２９０３９５、ＷＯ８７０６６１４）、他 の形の直接的ＤＮＡ取込み（ＤＥ４００５１５２、ＷＯ９０１２０９６、ＵＳ４
６８４６１１）、リポソーム仲介ＤＮＡ取込み（例えば、Freemanら、Plant Cell
Physiol.29:1353(1984))、またはボルテックス法（例えば、Kindleら、PNAS U.S.
A.87:1228(1990d))。植物細胞の物理的形質転換法は、オアド(Oard)、1991、Biote
ch.Adv.9:1-11に論評されている。 好ましくは、ｆｉＮＡは、金粒子を用いた微粒子銃（ボンバードメント）によ
り導入される。減圧浸潤またはアグロバクテリウム注入またはカーボランダム粉
ホイスカーにより仲介される直接的取込み(Frameら、Plant J.1994、6:941-948)、
または電気穿孔法。

【００２２】 様々な実施形態をここに例示する： ｆｉＮＡの導入−シグナルの開始 上述のように、ｆｉＮＡは裸ＤＮＡとして直接的に導入し得るか、または植物
に導入した（しかし安定に取込まれなかった）核酸から転写し得る。ｆｉＮＡは
細胞の細胞質に位置しなければならないが、ｆｉＮＡは細胞において転写される
必要は全くなく、従って、ｆｉＮＡは、遺伝子鎮静化シグナルを開始するために
、プロモーター領域を取込む必要も、また核を介して細胞質に導入する必要も全
くないことを強調する。 さらなる実施形態において、ウイルスまたは他の染色体外発現ベクター（これ
は翻訳シグナルを含んでも、含まなくてもよい）、例えばｆｉＮＡ、およびレプ
リカーゼをコードするが、植物の感染部分を越えて移動できるか、または最初の
導入後植物内に保持されているシグナルの産生を阻害し得る伝達要素（例えば移
動タンパク質または他の病原性タンパク質）は欠失するウイルス基本ベクターを
使用することが可能であり得る。しかし、ウイルス、特に伝達可能であるものは
、例えば安全性、耐性等の他の理由から望ましくない。 さらなる実施形態において、植物の第二部分の、細胞、おそらく核またはゲノ
ムに存在するｆｉＮＡコード配列の転写を一過性に（例えば局所的に）開始する
ことにより達成され得る。

【００２３】 これはＴｉ−基本バイナリーベクター（下記したｔｒＧＦＰの使用と比較参照
）の使用により達成され得る。一般的にいえば、当業者はベクターを構築し、一
過性組換え遺伝子転写のプロトコールを設計できる。さらなる詳細は、例えば、
Molecular Cloning:実験マニュアル:第二版、サムブルック(Sambrook)ら、1989、Co
ld Spring Harbor Laboratory Press参照。 任意により、ｆｉＮＡの転写は、例えば、誘導性プロモーターを使用して、活
性剤の制御下に配置し得る。 プロモーターに適用した「誘導性」なる語は、当業者によりよく理解される。
本質的には、誘導性プロモーターの制御下の転写は、刺激の適用により「スイッ
チがオン」または増加する。刺激の性質は、プロモーターにより異なる。ある誘
導性プロモーターは、適当な刺激の非存在下で、僅かなまたは検出不可能なレベ
ルの転写を引き起こし（または全く転写を引き起こさない）、また別の誘導性プ
ロモーターは、刺激の非存在下で、検出可能な恒常的発現を引き起こす。刺激の
非存在下では、どのような発現レベルであっても、任意の誘導性プロモーターか
らの発現は、正しい刺激の存在下で増加する。

【００２４】 誘導性プロモーターの１つの例は、ＧＳＴ−ＩＩ−２７遺伝子プロモーターで
あり、これは成長植物に適用できるある化学化合物により誘導されることが示さ
れた。プロモーターは、単子葉植物および双子葉植物の両方で機能する。それ故
、それは、カノーラ、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、ワタなどの農作物；小麦、
大麦、コメ、メイズ、モロコシなどの穀物；トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、
西洋ナシ、イチゴ、バナナ、およびメロンなどの果物；ニンジン、レタス、キャ
ベツおよびタマネギなどの野菜を含む、様々な遺伝工学的修飾植物において遺伝
子発現を調節するために使用できる。ＧＳＴ−ＩＩ−２７プロモーターはまた、
根、葉、幹および再生組織を含む、様々な組織における使用に適している。他の
例の誘導性プロモーターも当業者には公知であり、その選択は、実施する特定の
適用における誘導剤の使用の便宜により決定される。

【００２５】 他の適当なプロモーターは、ＤＥＸプロモーターであり得る(Plant Journal(1
997) 11:605-612)。 この実施形態において、活性剤を、植物の１つ以上の領域（ここにｆｉＮＡコ
ード構成物が導入される（「第二部分」））に局所的に適用すると、他の部分（
「第一部分」）の遠隔鎮静化が達成できる。 最も好ましい実施形態において、ｆｉＮＡは、ＧＢ９８／００４４２の端を切
り取った「アンプリコン」に対応する構成物として導入され得る。これは一般的
に以下を含む： （ｉ）植物プロモーター （ｉｉ）そのプロモーターに機能的に結合させた核酸配列（該配列は、ＲＮＡ依
存性レプリカーゼをコードし、さらにｆｉＮＡをコードし、これはそれ自体該レ
プリカーゼにより認識され得るサブ−ゲノムプロモーターに機能的に結合され、
よってｆｉＮＡは自己細胞質複製でき、ただし核酸配列は活性ウイルス移動タン
パク質（および任意により病原性タンパク質）をコードせず、そうでなければ構
成物を導入した植物において全身的にＴＩＧＳシグナルが伝播することが阻止さ
れる）。

【００２６】 「レプリカーゼ」により、適当な場合、レプリカーゼ機能を付与するに必要な
全ての成分を意味する。構成物は、移動タンパク質をコードし得るが、それらは
例えば１つ以上が欠失または修飾されているために機能しないという意味で「活
性移動タンパク質」をコードしない。

【００２７】 植物を通るシグナルの伝播および維持 局所領域におけるｆｉＮＡの一過性活性化または導入を使用して（例えば特異
的薬剤の適用による）、全身性遺伝子鎮静化を達成する利点は、ｆｉＮＡの誘導
剤を植物組織内に転位させる必要、または植物の全部分に適用する必要が全くな
いことである。一旦開始されると、シグナルは植物の遠隔部分にも遺伝子鎮静化
を誘導できる。この遺伝子鎮静化は安定であり、ｆｉＮＡを除去した後にも持続
する。

【００２８】 「遠隔」により、植物の第一および第二部分は、あきらかに植物組織を介して
接続されているが、空間的には分離していることを意味する。植物の第一部分が
第二のレベルよりも上部である場合、または経路が、光合成産物の濃縮領域から
使用領域への「源泉−シンク」移動に対応する場合、有利であり得る。実施例に
記載した観察により、シグナル移動は、ある点で、ウイルスまたはウイルス−ベ
クター移動に擬似していることが示唆される。しかし、本発明のシグナルも、そ
れを開始するために使用したｆｉＮＡもウイルスではない、例えば移動性の細胞
質で複製可能なベクターではないことを強調する。 また、標的遺伝子が鎮静される植物の部分は、植物の全部、またはほとんど全
部を包含し得る（これはｆｉＮＡに直接曝露されておらず、すなわち全身性鎮静
化）ことを強調する。 従って、この実施形態の１つの実施形態において、標的遺伝子は、植物組織、
すなわち植物の第一および第二部分およびそれらの間の組織において全身的に鎮
静される（下記のｓｔＧＦＰと比較参照）。 実施例に詳述したように、これらの組織の全ての細胞が標的遺伝子を転写する
必要はない。

【００２９】 また、接続植物組織のいくつかまたは全ての細胞が、常在性遺伝子を含み、そ
の転写（必ずしも発現はない）によりシグナルの伝播は容易になる。 「常在性遺伝子」により、ＴＩＧＳシグナルの変換を容易にする、標的遺伝子
と相同的であり、ｆｉＮＡに相同的である遺伝子（内在性または外在性）を意味
する。 従って、この実施形態の第二の実施形態において、標的遺伝子は、植物の第二
の、遠隔部分においてのみ転写されるが（例えば、それは組織特異的に発現され
る）、標的遺伝子に相同的な常在性遺伝子が、植物の第二部分の植物組織および
／または植物の第一および第二部分の間の組織に存在し、好ましくは転写される
。従って、この常在性遺伝子の存在または好ましくは転写は、シグナル伝播を引
き起こすまたは可能とするように作用し得る。 この実施形態により、組織特異的標的遺伝子の制御が可能である。常在性遺伝
子は、シグナルの全身性伝播を助けるように作用する。従って、シグナルの全身
性伝播は、ｆｉＮＡ曝露の直接的制御より高いレベルで調節でき、遺伝子鎮静化
をさらに時間的および空間的に制御することができる。

【００３０】 ＴＩＧＳシグナルを保持する細胞における常在性遺伝子の転写を調節すること
により、植物の第一部分における遺伝子鎮静化が効果的に達成されているかの決
定、または遺伝子鎮静化の組織特異性に影響を及ぼすことが可能である。 常在性（ＳＴ遺伝子）の転写は、誘導性プロモーターの使用により変化し得、
これはｆｉＮＡに関して上記している。 前記から明らかなように、本発明は、ｆｉＮＡの存在または転写またはシグナ
ル伝播を操作することにより、例えば、常在性遺伝子の転写を誘導する活性剤の
存在または非存在を調節することにより、植物における遺伝子鎮静化を制御する
方法を包含する。常在性遺伝子発現を操作する物理的方法もまた考えられる。例
えば、許容（すなわち常在性遺伝子を有する細胞を含む）または非許容（細胞は
常在性遺伝子を有さない）である植物の異なる部分の間での組織片を使用して、
シグナルの転位を制御することができる。

【００３１】 ＴＩＧＳの選択適用 説明および非制限のみの目的の下記に実験的に例示した本発明の実施形態にお
いて、遺伝子鎮静化の標的を決定したｆｉＮＡをコードする一過性に導入した遺
伝子は、クラゲ緑蛍光タンパク質ＧＦＰをコードする遺伝子であった(Chalfieら
(1994)Science 263:802-805)。これを使用して、安定に組込まれたＧＦＰ導入遺 伝子を鎮静した。 植物の任意の他のＳＴ−またはＨＥ遺伝子、または動物、真菌、細菌またはウ
イルス起源のＳＴ遺伝子が標的遺伝子であり得、ただしｆｉＮＡは対応する相同
的配列を含む。 本発明の１つの実施形態において、標的遺伝子は、未知の表現型であり得、そ
の場合、ＴＩＧＳシステムを使用して、全身性（または広範な）ヌル（またはほ
ぼヌル）表現型を産生することにより、表現型を解析し得る。

【００３２】 従って、本発明のさらなる実施形態は、 （ａ）上記のＴＩＧＳシステムを使用して、植物のある部分またはある発達段階
における標的遺伝子を鎮静し、 （ｂ）標的遺伝子が鎮静した、またはしたときに、植物の部分の表現型を観察す
る段階を含む、標的遺伝子を特徴づける方法を含む。 好ましくは、遺伝子は全身性に鎮静する。一般的に、観察したものを、遺伝子
を特徴づける（すなわち、遺伝子に特徴的な１つ以上の表現型を確立する）ため
に、標的遺伝子が発現された植物と対比させる。 本法には、別の方法（標的遺伝子は、挿入または他の変異誘発法により不活性
化される、または遺伝子鎮静化は制御されていない）にはない、いくつかの利点
がある。変異誘発法より優れた利点は、標的遺伝子の役割を果たしている相同性
遺伝子が１つ以上存在する場合に適用される。変異誘発法は通常、その状況では
表現型を示さない。本発明が変異誘発法および非調節遺伝子鎮静化法の両方より
も優れた利点を有する第二の状況は、標的遺伝子が致死表現型を有する場合に適
用される。遺伝子鎮静化の調節可能な属性により、かかる遺伝子の表現型を、調
査し、本発明の開示前に利用できた別の方法を使用するよりも効率的に活用する
ことができる。

【００３３】 この実施形態は、かなりの量のシークエンスデータが現在ゲノム計画（これは
機能または表現型に関して割り当てられていない）で得られているので特に有用
である。従って、遺伝子がその効果を特定の組織でのみ奏効する場合でも、これ
はウイルスが全植物に浸透したことを確認する必要がなく、検出可能であり得る
（バイオソース・テクノロジー、ＷＯ９５／３４６６８）。 ＨＥ遺伝子の同定のために、遺伝子鎮静化がすでに活性化され効果が観察でき
る、トランスジェニック植物を試みる、および産生することが必要である。 さらなる実施形態において、ＴＩＧＳ法の使用を含む、植物の表現型を変化さ
せる方法が開示される。 表現型を変化させることが望ましくあり得る特質は、以下を含む：色；疾病ま
たは害虫耐性；熟成効力；雄稔性。 例えば、雌稔性植物が、ハイブリッド種子の産生のために必要とされる。雌稔
性系を繁殖するために、雄稔性を回復することが必要である。雄稔性が導入遺伝
子により誘導される例において、上記のアプローチを使用して、調節された導入
遺伝子の鎮静化により雄稔性を回復できるであろう。

【００３４】 多くの遺伝子が発達において複数の役割を果たしている。それらは、例えば、
胚発達および成熟植物の器官または組織の発達に必要であり得る。鎮静化システ
ムが、これらの遺伝子を、胚発達中に活性とならないように調節できなければ、
明らかにこれらを鎮静できない。本明細書で記載したシステムは、その調節を行
うために使用できる。 他の特質が当業者には理解される。各場合において、唯一必要なことは、適切
なｆｉＮＡを案出するための、標的遺伝子の十分量を知ることであり、これはも
ちろんわざわざ所望の効果を達成しなくても最適化し得る。標的遺伝子が全身性
に発現されていない場合、シグナル伝播を可能とするために、常在性ＳＴ遺伝子
が全身性に転写されているトランスジェニック植物を産生することが必要であり
得る。次いで、ｆｉＮＡを使用してシグナルを開始できる。 トランスジェニック植物の産生は、現在では当業者に非常によく知られており
、これは様々な報告された方法により明示され、そのいくつかは、John Innes C
entre Innovations Limitedの名称の非先行公開ＧＢ特許出願第９７０３１４６ ．２号に記録されており、その内容を引用によりここに援用する。

【００３５】 本発明のさらなる実施形態において、標的遺伝子またはその相同体を発現する
植物の一部の、ｆｉＮＡへの一過性曝露を引き起こすまたは可能とすることを含
む、標的遺伝子を鎮静できる植物において全身性遺伝子鎮静化シグナリング剤を
産生する方法が開示される。 全身性遺伝子鎮静化シグナリング剤は、 （ａ）核酸を含み、 （ｂ）標的遺伝子の配列特異的遺伝子鎮静化を仲介可能であり、 （ｃ）それは、標的遺伝子またはその相同体を転写する植物細胞をｆｉＮＡに一
過性曝露することにより得られ、 （ｄ）植物の第一部分と第二部分の間を移動でき、該部分は、該標的遺伝子また
はその相同体を含む、および好ましくは転写する細胞により接続され、移動は上
記で議論した移動または病原性タンパク質により阻害されることを特徴とする。 本発明の様々な核酸は、単離および／または精製された（すなわちその天然の
環境から）、実質的に純粋または相同的な形の、または他の核酸を含まないまた
は実質的に含まないで提供され得る。本発明に記載の核酸は、全体的または部分
的に合成されたものであり得る。「単離する」なる語は、これら全ての可能性を
包含する。

【００３６】 本発明により包含されるものは、ＴＩＧＳを使用して全身性に鎮静した標的遺
伝子を含むトランスジェニック植物である。 本発明は、穀物および豆類、メイズ、小麦、ポテト、タピオカ、コメ、モロコ
シ、キビ、カッサバ、大麦、エンドウ、および他の根、塊茎または種子作物を含
む、作物植物などの植物に使用し得る。重要な種子植物は菜種油、テンサイ、メ
イズ、ヒマワリ、大豆およびモロコシである。本発明を適用し得る園芸植物は、
レタス、エンダイブおよびキャベツ、ブロッコリーおよびカリフラワーを含む植
物性アブラナ、およびカーネーションおよびフクロソウを含み得る。本発明は、
タバコ、カボチャ、ニンジン、イチゴ、ヒマワリ、トマト、ペッパー、キク、ポ
プラ、ユーカリノ木およびマツに適用し得る。 本発明は、実験結果および添付図面を参照して説明および例示する。本発明の
さらなる実施形態および実施形態、および本明細書に開示したものの修飾は、当
業者には明らかである。全本明細書に記載の全ての文献は引用によりここに援用
する。

【００３７】 図１．導入遺伝子とウイルス構成物 ａ．Nicotiana benthamianaの安定な形質転換のために用いられたｐＢｉｎ−３ ５Ｓ−ｍＧＦＰ５のＴ−ＤＮＡ（ｐｎｏｓ：nosプロモーター、ｔｎｏｓ：nosタ
ーミネーター、３５Ｓ：ＣａＭＶ−３５Ｓプロモーター、ＲＢ：右端、ＬＢ：左
端）。これはＳＴ遺伝子構成物である。 ｂ．葉の浸潤のために用いられたAgrobacterium tumefaciens株ＬＢＡ４４０４ に保有される種々のバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ（ＯＣＳ：オクトピンシン
ターゼターミネーター、ＢａＲ：ＢＡＳＴＡ耐性遺伝子）。これらは、ＴＲ遺伝
子構成物である。ｌａｃＺ：クローニングを容易化するために挿入された多重ク
ローニング部位。

【００３８】 図２．ＰＶＸ−ＧＵＳ¹⁷とＰＶＸ−ＧＦＰ¹⁶の構造。挿入されたマーカー遺伝子
の発現は、二重のコートタンパク（ＣＰ）プロモーターによって制御されている
（影の付された四角）。その他の省略は、ＲｄＲｐ：ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラ
ーゼ、および２５Ｋ、１２Ｋ、８Ｋ：細胞−細胞移動タンパクである。これらの
構成物は、とりわけ、遺伝子鎮静が転写前または転写後のいずれであるのかを調
べる際に用いられた。

【００３９】 図３．N.benthamianaにおけるＧＵＳおよびＧＦＰレポーター遺伝子の発現 これらの像は、ＧＵＳ活性²⁴に関して染色された葉を示すパネルＩ−Ｌおよび
ＥとＦの下のパネルを除いて、全てＵＶ照射の下に作製されたものである。方法
および省略は実施例１に詳細に記載されている。露光時間とＵＶ源により、ＧＦ
Ｐは緑色または黄色に見える。ＧＦＰが存在しなければ、クロロフィル植物組織
(chlorophyllous plant tissue)は赤く見える。 （ａ）安定に組み込まれたＧＦＰホモジーン(homogene)（ｓｔＧＦＰ）植物の葉
（ｂ）非トランスジェニック（not）nt植物の葉 （ｃ−ｄ）アセトシリンゴンの存在下（ｃ）または不在下（ｄ）で調製された、
A.tumefaciens（アグロバクテリウムツメファシエンス）のＮＰＴ：ＧＵＳ：Ｇ ＦＰ株の培養を用いて１８ｄ前に浸潤されたｓｔＧＦＰ植物；矢印は浸潤された
葉を示す。 （ｅ−ｆ）A.tumefaciensのＮＰＴ：ＧＵＳ：ＧＦＰ株を用いて２ｄ前に浸潤さ れたｎｔ植物（ｅ）またはｓｔＧＦＰ植物（ｆ）の葉におけるｔｒＧＦＰ（上の
パネル）とＧＵＳ（下のパネル）の発現。（ｅ）の矢印は、赤い蛍光組織のライ
ンが観察される浸潤されたゾーンの端におけるｓｔＧＦＰ抑制のゾーンを示す。
（ｇ）（ｃ）に示された植物の３つの完全に開いた葉の一つから現れる腋生の苗
条の拡大像。これらの腋生の苗条の葉は、常に非常に強いｓｔＧＦＰ抑制を示す
。これらの葉が開いたときに、ｓｔＧＦＰの残りの発現の分散パッチが見えなく
なる。このパネルに示された腋生の苗条の一部の小さい小葉（矢印）は、均一に
赤い。 （ｈ）水（左）またはA.tumefaciensのＮＰＴ：ＧＵＳ：ＧＦＰ株（中央および 右）を用いて１８日前に浸潤されたｓｔＧＦＰ植物の茎から現れた上方の葉のＵ
Ｖ照射。 （ｉ）（ｈ）で示された葉がＧＵＳ活性について染色された。 （ｊ）（ｉ）で示された組織化学的ＧＵＳ染色の内部コントロールとしてA.tume
faciensのＮＰＴ：ＧＵＳ：ＧＦＰ株を用いて浸潤された葉。 （ｋ−ｌ）A.tumefaciensのＮＰＴ：ＧＵＳ：ＧＦＰ株（ｋ）または水（ｌ）を 用いて浸潤されたｓｔＧＦＰ植物の全身的な葉に観察されたＰＶＸ−ＧＵＳ病巣
。葉はＰＶＸ−ＧＵＳを用いて接種され、ＧＵＳ染色用に５日後に回収された。
葉が接種後５日より後に回収された場合には、ＧＵＳ病巣は葉脈に広がり、ｓｔ
ＧＦＰ鎮静化とは独立なＰＶＸ−ＧＵＳの全身的広がりの可能性を示している。

【００４０】 図４．ｓｔＧＦＰおよびＰＶＸ−ＧＦＰ ＲＮＡのノーザン解析 ｓｔＧＦＰ植物（ＧＦＰ）またはｎｔ植物（ＮＴ）を、水（偽）、またはアセ
トシリンゴンで以前に誘導されたA.tumefaciensのＮＰＴ：ＧＵＳ：ＧＦＰ株で 以前に浸潤し（Ｎ：Ｇ：Ｇ）−Ｘ（Ｎ：Ｇ：Ｇ−）は、培養が以前に誘導されな
かったことを示す。２０ｄ後、二つの上方の葉を水（偽）またはＰＶＸ−ＧＦＰ
を用いて接種した。ウイルス接種から５ｄ後、二つの接種された葉の一方から全
体のＲＮＡを抽出し、１０μｇのＲＮＡに対してノーザン解析を実施して、ｓｔ
ＧＦＰ ＲＮＡおよびＰＶＸ−ＧＦＰ ＲＮＡの蓄積を調べた（上のパネルの左側
に示した）。トラック９−１４におけるヘテロ分散(heterodisperse)ＲＮＡ種は
、サブゲノムの(sub-genomic)、分解されたＲＮＡ種を示し、接種された葉のＰ ＶＸ ＲＮＡサンプルの典型である。下のパネルは、ＲＮＡの同等の充填を確認 するためにｒＲＮＡプローブを用いたノーザンブロットのプロービングを示す。 図５から８では、ｉｎｔＧＦＰは安定に組み込まれたＧＦＰを指すが、ｅｐｉ
ＧＦＰは浸潤された配列を指す。

【００４１】 図５．実施例１３で用いられた構成物 アグロバクテリウム浸潤に用いられたＴ−ＤＮＡ構成物は、Ｎ：Ｇ：Ｇ構成物
から誘導される。ＧＦＰ遺伝子を制御する３５Ｓプロモーターは、Ｎ：Ｇｎｏｓ
構成物におけるｎｏｓプロモーターで置換され、Ｎ：Ｇ△構成物では削除された
。 図６．ＴＩＧＳシグナルの転座の動力学 上の図は、下記の事象の順を示す。ｉｎｔＧＦＰ植物の一枚の葉がA.tumefaci
ensのＮ：Ｇ：Ｇ株で浸潤され（アセトシリンゴンで以前に誘導）、浸潤から１ 、２、３、４または５日後に除去した。浸潤された葉の除去後ＴＩＧＳを受けた
植物のパーセントをＵＶ照射の下で評価した。図の各点は、同時に浸潤された３
０の個々の植物から得られた平均パーセントを示す（実施例１４参照）。

【００４２】 図７．ＴＩＧＳのバイオリスティック活性化 （Ａ）ＴＩＧＳのバイオリスティック活性化について試験されたＤＮＡ構成物。
ｐＵＣ３５Ｓ−ＧＦＰプラスミドは、ｐＢｉｎ３５Ｓ−ＧＦＰの３５Ｓ−ＧＦＰ
発現カセットを含む（図１および２）。ＧＦＰプラスミドは、ｐＵＣ１９のBamH
I-SalI制限フラグメントとしてクローン化されたｐＢｉｎ３５Ｓ−ＧＦＰの全長
ＧＦＰオープンリーディングフレームのみを含む。..ＰおよびＧ..ＤＮＡ構成物
は、直鎖状の、ＧＦＰオープンリーディングフレームのＰＣＲ増幅フラグメント
であり、それぞれ３４８および４５３ｂｐの長さである。等量の各構成物がボン
バードされた（実験方法および実施例１６参照）。 （Ｂ）ＴＩＧＳのバイオリスティック活性化に対するｅｐｉＧＦＰおよびｉｎｔ
ＧＦＰ間の相同性の長さの効果。ｉｎｔＧＦＰ種苗を、類似した物理的長さを有
するが、種々の長さのＧＦＰ ｃＤＮＡの３’末端フラグメントを有する、一連 のＰＣＲ増幅フラグメントを用いてボンバードした。これらのフラグメントは、
一つのベクター特異的プライマーと一つのＧＦＰ特異的プライマーを用いること
によって、全長ＧＦＰオープンリーディングフレームを含むpBluescriptベクタ ーから増幅された。図の白点は、ＧＦＰオープンリーディングフレームの５’末
端を示す。等量の各構成物がボンバードされた（実験行程および実施例１６参照
）。

【００４３】 図８．ＴＩＧＳはｅｐｉＧＦＰとｉｎｔＧＦＰの相互作用を必要とする 実施例１７参照。 （Ａ）ボンバードされたｅｐｉＧＦＰと接種されたウイルス構成物。..ＰとＧＦ
．ＤＮＡ構成物は図６Ａに記載されたＧＦＰ構成物の誘導体である。ＰＶＸ−Ｇ
ＦとＰＶＸ−Ｐは、それぞれ、ＧＦＰオープンリーディングフレームのＧＦ．と
..Ｐ制限フラグメントを有するＰＶＸベクターである。 （Ｂ）ｉｎｔＧＦＰとＰＶＸ−ＧＦ／ＧＦＰ ＲＮＡのノーザン解析。上の図は 、下記の事象の順を示す。最初のｉｎｔＧＦＰ種苗または非トランスフォーム植
物（ＮＴ）は、それぞれ、未被覆の金粒子（−）またはＧＦＰまたは..Ｐ構成物
で被覆された金粒子を用いてボンバードされた。２１日後、二つの上方の葉が、
水（偽）、ＰＶＸ−ＧＦＰまたはＰＶＸ−ＧＦを用いて接種された。ＴＩＧＳを
示すＧＦＰまたは誘導体を用いてボンバードされた植物は、ウイルス接種のため
に選択された。ウイルス接種から５日後、二つの接種された上方の葉の一方から
全ＲＮＡを抽出し、１０（ｇのＲＮＡに対してノーザン解析を実施して、ｉｎｔ
ＧＦＰおよびＰＶＸ−ＧＦ／ＧＦＰ ＲＮＡの蓄積を調べた（上のパネルの左側 に示した）。

【００４４】 図９：ｐＰＶＸ２０９とｐＰＶＸ２１０Ａ 実施例１９に記載したように、ｐＰＶＸ２１０Ａ［図９（ｂ）］を作成するた
めに、ｐＰＶＸ２０９［図９（ａ）］からＣＰを削除した。この配列は３５Ｓプ
ロモーターから番号付けされ、このプロモーターのすぐ上流のSacI部位がヌクレ
オチド４と番号付けされた。 図１０および１１：ｐＣＬ−ベクターと原種構成物 ＴＧＢ（三重遺伝子ブロック）を除去した後で、ｐＰＶＸ２１０Ａから増幅さ
れたタグ付けされたＰＣＲフラグメントが、レプリカーゼ機能を回復させるため
に再度挿入された。（ａ）ｐＣＬ１００；（ｂ）ｐＣＬ１０１；（ｃ）ｐＣＬ１
０２；（ｄ）ｐＣＬ１０５（レプリカーゼに１７２９ｂｐの欠失を含む）；（ｅ
）ｐＣＬ１０６（ＧＦＰ機能を回復させ、サブゲノムＲＮＡの産生を増強するた
めにｐＰＶＸ２１０ＡのＰＣＲフラグメントを含む）；（ｆ）原種構成物ｐＡ５
００［表２参照；実施例１９］；（ｇ）ｐＣＬ１０３；（ｈ）ｐＣＬ１０４が示
されている。用語の説明については図９参照。

【００４５】 図１２：プラスミドｐＳＬＪ７５５／５へのｐＵＣ１９構成物の挿入 ｐＳＬＪ７５５／５中の番号は、SacIクローニング部位に関連する。 図１３ないし１７：構成物のポジティブ鎖配列 クローニングに用いられた制限部位は下線が付され、灰色にラベルされている
。“Ｘｘｘｘ”は、リゲートされたSalI／XhoI hlaf部位を示す。この配列の短 縮された部分は、ティルデ（“〜”）でラベルされている。１４４の下線が付さ
れた塩基は、下流ＧＦＰ５’末端と共にｐＣＬ１００に挿入されてｐＣＬ１０６
を作製する、二重のＣＰプロモーター領域を示す。下方の場合の塩基は、クロー
ニングに用いられたＰＣＲプライマーによって導入された非ウイルス性配列を示
す。各クローニング段階の後に確かめられた配列は二重下線が付され、シークエ
ンシングの生データを調べることにより明白ではないが偽造された単一ｐｂの交
換または逸脱は小文字イタリック体である。ＣＰ欠失のスペーシングは、ＴＧＢ
欠失構成物において圧縮されている。 （ａ）ｐＰＶＸ２０９（１０７６２ｎｔ） （ｂ）ｐＰＶＸ２１０Ａ（１００２４ｎｔ） （ｃ）ｐＣＬ１００（８７５３ｎｔ） （ｄ）ｐＣＬ１０２（８９１８ｎｔ） （ｅ）ｐＣＬ１０１（８７８０ｎｔ） （ｆ）ｐＣＬ１０６（８９０１ｎｔ）

【００４６】

【実施例】

一般的な方法−実施例１ないし１２ 植物のトランスフォーメーション ＧＦＰトランスジーンを有するNicotiana benthamiana植物（ｓｔＧＦＰ植物 ）の４つの独立した系統をA. tumefaciens−媒介葉ディスクトランスフォーメー
ション法²²に従って作製した。トランスフォーメーションには、バイナリーベク
ターｐＢｉｎ-３５Ｓ-ｍＧＦＰ５²³を含む無力化されたアグロバクテリウム（Ag
robacterium）株ＧＶ-３１０１を用いた。制限分解およびサザン解析は、各系統
が一つのＴ-ＤＮＡ組み込み部位を保有し、Ｒ１世代にＧＦＰの発現の観察され た３：１の分離と一致することを示した。いずれの場合においても、この一つの
座は、ＧＦＰ導入遺伝子の一つの完全なコピーと関連している。ノーザン解析は
、これら４つの独立系統で同等の高レベルのＧＦＰ ｍＲＮＡを示した。この研 究で用いられた全てのｓｔＧＦＰ植物は、ホモ接合の、最初の形質転換体の自家
受粉されたＦ１子孫であった。

【００４７】 Agrobacteriumの浸潤と選択的濃縮アッセイ 一時的発現のためのAgrobacterium培養物の浸潤は、以前に記載された方法¹³ に基づく。最初に、図１ｂ記載の構成物を、３親交配によりA.tumefaciens GV31
01に移し、その株をｍｉｎＡ培地にプレートした。単一のコロニーを、適切な抗
生物質を含む５ｍｌのＬＢ培地に接種し、２８℃で４８時間生育させた。１ｍｌ
の培養物を、１０ｍＭのＭＥＳ ｐＨ５．６と２０μＭのアセトシリンゴン(acet
osyringone)を含む１００ｍｌのＬＢに移し、２８℃で１６時間生育させた。こ の細菌（ＯＤ６００＝１）を遠心沈降させ、５０ｍｌの１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂に懸
濁し、室温で３時間維持した。浸潤は、３週齢の苗の一または二枚の広がった葉
に対して、２ｍｌの注射器を用いて行われた。浸潤された葉は、二日間、小さい
プラスチックのバッグに密封した。種苗は２０から２５℃の間で温室に維持され
た。１６時間以上の昼の長さとするために、必要であれば、人工照明が用いられ
た。 Agrobacteriumの選択的濃縮アッセイは、記載の通りに行われた¹⁹。この方法 を用いて、０．１ｇのタバコ組織と混合された単一の単離されたAgrobacterium 細胞は、インキュベーションの３日後に指数増殖後期に濃縮される。

【００４８】 一般的な方法 ＰＶＸ-ＧＦＰおよびＰＶＸ-ＧＵＳ接種物は、対応するｃＤＮＡクローン^{16,1 7} のin vitro転写物に感染した植物（Nicotiana clevelandii）の樹液抽出物であ
る。ＲＮＡ単離とノーザン解析を以前に記載された¹⁷通りに行った。ハイブリダ
イゼーションに用いられたプローブは、完全なＧＦＰオープンリーディングフレ
ームに対応する³²Ｐ−ラベルされたｃＤＮＡである。ＧＵＳ活性に関する植物材
料の組織化学的染色は、Jeffersonの方法²⁴に従って行われた。

【００４９】 一般的な方法−実施例１３ないし１９ これらは以下を除いては上記の通りである： Agrobacteriumの浸潤 A.tumefaciensの浸潤は、以前に記載された方法(Englishら, 1997)に基づく。
図５に記載された構成物を、３親交配またはエレクトロポレーションによってA.
tumefaciens（特記しなければＧＶ３１０１株）に移し、この株をｍｉｎＡ培地 にプレートした。方法は、上記の通りである。 接ぎ木方法 非トランスフォームおよびトランスジェニックN.benthamiana植物を、接ぎ木 の前約一ヶ月間生育させた。この茎を土から１０−１５ｃｍに頭部を切り、同じ
世代の接ぎ穂を用いてウェッジ接ぎ木(wedge-grafting)を行った。次いで接ぎ目
を固定し、パラフィルムで乾燥から保護した。接ぎ木後の第一週では、高い湿気
条件を維持するためにプラスティックバッグを用いて植物を被覆した。

【００５０】 種苗ボンバードメント(bombardment) N.benthamiana種子を、１５分間、０．２５％の次亜塩素酸ナトリウムを用い て滅菌し、滅菌水で３回すすいだ。種子をＭＳＲ６培地で７−１０日間発芽させ
た。ボンバードメントの一日前に、１０−１２のグループで種苗を、３．２ｃｍ
２の標的エリアに配置された新鮮なＭＳＲ６培地に移した。ＤＮＡコーティング
および粒子ボンバードメントを以前に記載された通り（Christouら, 1991）に実
施した。１０の種苗の各グループを、３２６ｎｇのＤＮＡで被覆された金粒子１
６３ｍｌで２回ボンバードし、１２Ｋｖで増進させた。ボンバードメントから２
週間後に、種苗を２０から２５℃の間で温室に移した。１６時間以上の昼の長さ
とするために、必要であれば、人工照明が用いられた。

【００５１】 in vitroでの増殖 N.benthamianaの葉を、温室生育植物から収穫した。葉を、５分間、０．２５ ％（ｗ／ｖ）の次亜塩素酸ナトリウムを用いて滅菌し、滅菌蒸留水で３回すすい
だ。葉のディスクを、１ｍｇ／ｌの６-ベンジルアミノプリンと０．１ｍｇ／ｌ の（-ナフタレン酢酸を含むＭＳＲ６培地（Vainら, 1998）に無菌的にプレート した。培養を、２３（Ｃおよび１６時間の光周期の下に、ミクロ細孔テープ（Mi
cropore( tape）を用いて密封された２ｃｍの深さのペトリ皿中で行った。葉を 、１５日の間をおいて新鮮な培地に移した。４ないし６週後、再生された苗条を
解剖し、ＭＳＲ６培地に根付かせた。 ＧＦＰ像 植物全体におけるＧＦＰ蛍光の視覚的検出を、１００Ｗのハンドヘルド長波長
紫外線ランプ（UV products, Upland CA 91786, Black Ray model B 100AP）を 用いて行った。植物を、Wratten 8フィルターを介して、Kodak Ektachrome Pant
her (400 ASA)フィルムを用いて撮影した。露光時間は、蛍光の強度および植物 からカメラとランプ距離に依存して、７０秒まで変化させた。in vitroで培養さ
れた外植体の観察は、付帯蛍光モジュール(epifluorescent module)と組み合わ せられたMZ12 Leica解剖顕微鏡を用いて行われた。写真は、Kodak Ektachrome P
anther (400 ASA)フィルムを用いて撮影した。共焦点顕微鏡法を、Leica TCS-NT
システムと組み合わせられたLeica DMRモジュールの下で行った。１００ｍＷの アルゴンイオンレーザーを、４８８ｎｍの青色励起光を生じるために使用した（
放射フィルター５２２ｎｍ）。これらのフィルターの組み合わせを用いて、バッ
クグラウンドのサンプルからの自己蛍光を除いた。各像は光学ディスクに貯蔵し
た。

【００５２】 ＰＶＸ誘導体の作製およびin vitroでの転写 ＰＶＸ−ＧＦＰについては、以前に記載されている（Baulcombeら, 1995）。 ＰＶＸ−ＧＦは、ＰＶＸベクターｐＴＸＳ−ＧＦＰの元のＧＦＰ挿入物（Baulco
mbeら, 1995）をｐＢｉｎ−３５Ｓ−ｍＧＦＰ５由来のｍＧＦＰ５挿入物（Hasel
offら, 1997）で置き換え、さらに、ClaI部位（ＧＦＰ５コード配列内の４６５ 位）とＧＦＰ５の３’末端のSalI部位（８１８位）との間の３５４ｂｐフラグメ
ントを除去することによって作製された。ＰＶＸ−Ｐは、ＦＰ５由来のClaI−Sa
lI制限フラグメントをＰＶＸベクターpP2C2S（Baulcombeら, 1995）に挿入する ことによって調製された。ウイルス接種物は、対応するｃＤＮＡクローンのin v
itro転写物（Chapmanら, 1992）に感染した植物(N.clevelandii)の樹液抽出物で
ある。

【００５３】 農業的浸潤(Agroinfiltrated)およびボンバード(bombarded)されたepiＧＦＰ構 成物 Ｎ：Ｇ：Ｇバイナリーベクター（図１）は、ｐＢＩＮ３５Ｓ：ＧＦＰ４（Hase
loffら, 1997）に基づいており、これは、ｐＵＣ１９由来のｌａｃＺポリリンカ
ーが、ＧＦＰ４の３５Ｓプロモーターの上流に位置するHindIII平滑制限部位に 挿入されている。次いで、pSLJ4D4由来の３５Ｓ−ＧＵＳ発現カセット（Jonesら
, 1992）を、HindIII−EcoRI制限フラグメントとしてＬａｃＺポリリンカーに挿
入した。Ｎ：ＧｎｏｓとＮ：Ｇ△構成物（図５）をｐＢｉｎ ３５Ｓ：ＧＦＰ４ から誘導される。Ｎ：Ｇ△は、BamHI−HindIII制限によるＧＦＰ４の３５Ｓプロ
モーターの除去、その後の平滑末端化（Klenow）およびリゲーションによって得
られた。Ｎ：Ｇｎｏｓは、BamHI−HindIII制限による３５Ｓプロモーターの除去
、その後のクレノウＤＮＡ充填およびｎｏｓプロモーターの挿入によって得られ
た。ｐＵＣ３５Ｓ−ＧＦＰ４構成物（図７）は、ｐＵＣ１９におけるｐＢＩＮ ３５Ｓ：ＧＦＰ４（HindIII−EcoRI制限フラグメント）由来の３５Ｓ：ＧＦＰ４
発現カセットを挿入することによって得られた。ＧＦＰ構成物は、ｐＵＣ１９（
Yanisch-Perronら, 1985）におけるｐＢＩＮ ３５Ｓ：ＧＦＰ４（BamHI−SacI制
限フラグメント）由来の全長ＧＦＰオープンリーディングフレームを挿入するこ
とによって得られた。“Ｇ．．”フラグメント（図７）は、ｐＢＩＮ ３５Ｓ： ＧＦＰ５（Haselffら, 1997）から、プライマーGGATCCAAGGAGATATAACAAおよびAA
ATCGATTCCCTTAAGCTCG（それぞれ、ＧＦＰ５ ｃＤＮＡにおけるｐｏｓ１とｐｏｓ
４５３）を用いてＰＣＲ増幅された。“．．Ｐ”フラグメント（図７）は、ｐＢ
ＩＮ ３５Ｓ：ＧＦＰ５から、プライマーAGCTTAAGGGAATCGATおよびCTTAGAGTTCGT
CATGTTTGT（それぞれ、ＧＦＰ５ ｃＤＮＡにおけるｐｏｓ４５４とｐｏｓ８１３
）を用いてＰＣＲ増幅された。epiＧＦＰとintＧＦＰとの間の相同性の長さの効
果の研究のために用いられた一連のＰＣＲ増幅フラグメント（図７ｂ）は、pBlu
escriptから得られ、これは完全なＧＦＰ５ ｃＤＮＡがBamHI−SacI制限フラグ メントとして挿入されている。各増幅に用いられるプライマーの組み合わせは以
下の通りである： 「配列表１」 」 ．．．ＰおよびＧＦ．構成物は、それぞれ、上記ＧＦＰ構成物由来のClaI−Sa
lIおよびBamHI−ClaI制限フラグメントである。

【００５４】 一般的な方法 ＲＮＡの単離およびノーザン解析は、以前に記載されているように行った（Mu
ellerら, 1995）。ハイブリダイゼーションに用いられたプローブは、完全なＧ ＦＰオープンリーディングフレームに対応する３２Ｐ−ラベルｃＤＮＡであった
。ＧＵＳ活性に関する植物材料の組織化学染色は、標準的な方法（Jefferson, 1
987）を用いて行った。

【００５５】 実施例１：遺伝子鎮静シグナルは、遠隔的な鎮静を強要する 遺伝子鎮静の活性化の再生システムを開発するために、Nicotiana benthamian
aにおける鎮静導入遺伝子の一時的発現を用いた。これらの実験における遺伝子 鎮静の標的は（図１ａ）、健康な組織を侵さずに観察することができるクラゲの
緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）¹¹をコードする：トランスジェニックＧＦＰ植物の
葉は、ＵＶ光の下で緑色に見えるが、非トランスジェニック（ｎｔ）の葉は、ク
ロロフィル蛍光により赤く見える（図３ｂ）。鎮静導入遺伝子を運ぶために、N.
benthamianaの葉^12,13を、ＧＦＰレポーター遺伝子を備えたものを含む、種々 のバイナリーＴｉプラスミドベクター（図１ｂ）を有するAgrobacterium tumefa
ciensの株を用いて浸潤した。安定に組み込まれ、かつ一時的に発現されたＧＦ Ｐ導入遺伝子を、それぞれｓｔＧＦＰおよびｔｒＧＦＰと称する。

【００５６】 A.tumefaciensのＮＰＴ：ＧＵＳ：ＧＦＰ種（図１Ｂ）を用いた浸潤の二日後 までには、浸潤された組織においてＧＵＳとｔｒＧＦＰレポーター遺伝子の両方
の発現があった（図３ｅ、３ｆ）。ｓｔＧＦＰトランスジェニック系統では（図
３ｆ）、ｔｒＧＦＰによる強い緑色の蛍光が、ｓｔＧＦＰからのより弱いバック
グラウンドの蛍光の上に重ねられた。しかしながら、浸潤された領域の端では、
ｓｔＧＦＰ発現が抑制されたことを示す赤い蛍光組織（図３ｆ）の薄いラインが
あった。 ｓｔＧＦＰ抑制の領域は浸潤された葉の中でさらに広がることはなかったが、
浸潤の１８日後までには、ＮＰＴ：ＧＵＳ：ＧＦＰ浸潤植物の上方の葉ではｓｔ
ＧＦＰの抑制があった（図３ｃ）。この効果は、浸潤された葉の直接に上方に位
置する茎および葉、および葉脈の周りの組織において明らかであった（図３ｃ、
３ｈ）。腋生の苗条の葉（図３ｇ）および一部の最上位の葉（図３ｈ）では、ｓ
ｔＧＦＰによる緑色蛍光の完全な抑制があった。ｓｔＧＦＰ抑制の時間経過およ
び浸潤された植物の栄養部を介した広がりのパターンは、それぞれ４つの独立し
たｓｔＧＦＰ系統の２０の植物を含む５つの独立した実験において一貫して観察
された。

【００５７】 実施例２：遺伝子鎮静シグナルは配列特異的である 植物を、ＮＰＴ：ＧＵＳ、ＧＵＳ：ＢＡＲまたはA.tumefaciensの空のベクタ ー種を用いて浸潤した場合には（図１ｂ）、ｓｔＧＦＰの抑制はなかった。抑制
が浸潤方法によって引き起こされたなら、これらのコントロール種は、ｓｔＧＦ
Ｐの抑制を引き起こした。同様に、ｔｒＧＦＰのｎｏｓターミネーター構成物ま
たは３５Ｓプロモーターが関係する場合には、ＮＰＴ：ＧＵＳおよびＧＵＳ：Ｂ
ＡＲ種を用いた浸潤後にｓｔＧＦＰの抑制があった（図１ｂ）：これらの構成物
は、３５Ｓプロモーターとｎｏｓターミネーターの両方を有する。それゆえ、ｓ
ｔＧＦＰの全身性の抑制は、ｓｔＧＦＰおよびｔｒＧＦＰにおけるＧＦＰコード
配列の一般的な存在に基づいた配列特異的効果である。

【００５８】 実施例３：遺伝子鎮静シグナルｆｉＮＡをコードする導入遺伝子の取り込みを必
要とする この実験で用いられたA.tumefaciens培養物は、毒性（Vir）機能¹⁴の誘発物質
としてアセトシリンゴン(acetosyringone)を含んでいた。Vir遺伝子発現が欠失 する場合には、Ｔｉプラスミド由来のＴ−ＤＮＡ（左右の端の間；図１ｂ）の、
植物細胞への移入はない。結果的に、nt N.benthamianaの葉が、アセトシリンゴ
ンを用いずにインキュベートされたA.tumefaciensのＮＰＴ：ＧＵＳ：ＧＦＰ株 を用いて浸潤された場合、浸潤後二日までにＧＵＳまたはｔｒＧＦＰの発現はな
かった。さらに、浸潤後１８日までにｓｔＧＦＰの全身的な抑制はなかった（図
３ｂ、２日）。この結果から、ｓｔＧＦＰの全身的な抑制は、植物細胞へのｔｒ
ＧＦＰ核酸のＴ-ＤＮＡ-媒介トランスファーを必要とする。

【００５９】 実施例４：遺伝子鎮静シグナルは後の転写鎮静に影響する ｓｔＧＦＰの全身的な抑制を示す組織において、ｓｔＧＦＰ ＲＮＡの定常状 態のレベルは、ノーザンブロット検出のレベル以下に低減し（図４レーン１−４
）、遺伝子鎮静があることを示す。ｓｔＧＦＰ鎮静のメカニズムが転写によるも
のか、転写後によるものなのかを調べるために、転写後に静められた導入遺伝子
が、鎮静導入遺伝子¹⁵と同様の配列がある、修正されたポテトウイルスＸ（ＰＶ
Ｘ）構成物に対して耐性を付与するという、以前になされた証明を利用した。転
写による遺伝子鎮静を示す導入遺伝子は、対応するウイルス構成物に影響を与え
なかった¹⁵。この分析における修飾されたＰＶＸ（図２）は、ＧＦＰまたはＧＵ
Ｓレポーター遺伝子（それぞれ、ＰＶＸ−ＧＦＰ¹⁶およびＰＶＸ−ＧＵＳ¹⁷）を
有する。ウイルス接種物は、水またはA.tumefaciensの培養物を用いて、浸潤後 １８日にN.benthamianaの上方の葉に適用された。 ノーザン解析（図４）は、接種後５日目に、以前に水を用いて浸潤されたｎｔ
およびｓｔＧＦＰ N.benthamianaの葉に豊富なＰＶＸ−ＧＦＰ ＲＮＡがあるこ とを示した（図４，レーン１１−１３）。植物がアセトシリンゴンの存在（ｎｔ
ライン）または欠失（ｓｔＧＦＰライン）に調製されたＮＰＴ：ＧＵＳ：ＧＦＰ
株を用いて以前に浸潤された場合には、ＰＶＸ−ＧＦＰ ＲＮＡも豊富であった （図４，レーン９、１０、１４）。しかしながら、以前にA.tumefaciensのアセ トシリンゴン処理ＮＰＴ：ＧＵＳ：ＧＦＰ株を用いて浸潤された植物のｓｔＧＦ
Ｐが鎮静化された葉では、ＰＶＸ−ＧＦＰ ＲＮＡの蓄積が、検出の限界または それ以下のレベルまで低減された（図４、レーン５−８）。ＰＶＸ−ＧＵＳがこ
れらの葉に接種された場合、ｓｔＧＦＰの抑制がない、対応するコントロールの
葉と同じくらい多くのＧＵＳ細胞増殖巣(foci)があった（図３ｋ．ｌ）。ＰＶＸ
−ＧＦＰとＰＶＸ−ＧＵＳにおけるこれらの異なる効果から、ｔｒＧＦＰが、後
転写レベルにおいて配列特異的遺伝子鎮静を引き出したと結論した。

【００６０】 実施例５：遺伝子鎮静シグナルは、ｆｉＮＡをコードする導入遺伝子を含む宿主
または構成ベクターではない ｓｔＧＦＰの全身的抑制を示した組織においてＧＵＳ¹⁸が検出されなかったこ
とから、ｓｔＧＦＰの全身的な抑制が、A.tumefaciensのＮＰＴ：ＧＵＳ：ＧＦ Ｐ株の全身的広がりと関連するということを除外することができる（図３ｈ−ｊ
）。さらに、選択的濃縮方法¹⁹を用いて、ｓｔＧＦＰの抑制を示す組織の樹液抽
出物中にA.tumefaciensを検出することはできなかった。１０のサンプルにおい て、選択的濃縮方法は、浸潤された葉の抽出物の１０^-12倍希釈物中にA.tumefac
iensを検出した。しかしながら、ｓｔＧＦＰの完全または部分的な鎮静を示す全
身的組織（茎および頂点を含む）の４５サンプルにおいて、浸潤されたA.tumefa
ciensは、希釈されていないサンプル中にさえも検出されなかった。それゆえ、 これらの感度の高いアッセイ方法は、A.tumefaciens細胞が、ｓｔＧＦＰが抑制 された全身性の組織から欠失していることを確認した。また、ＧＵＳ ＤＮＡの ＰＣＲテストの陰性の結果に基づいて、そのA.tumefaciens宿主とは独立にＮＰ Ｔ：ＧＵＳ：ＧＦＰバイナリーベクターの全身性の移動があるということも、除
外することができる。

【００６１】 実施例６：低減されたレベルのｆｉＮＡの効果 ｆｉＮＡが核内の核酸の転写により細胞質中に導入される実施態様において、
細胞質内におけるｆｉＮＡの効率的な導入鎮静の効率を決定するかもしれない。
このことを確かめるために、ＧＦＰ構成物が、３５Ｓプロモーターが欠失、また
は、弱いノパリン(nopaline)シンターゼプロモーターで置換されるように修飾さ
れていれば、ＧＦＰの全身性鎮静は部分的のみであった。得られた部分的鎮静は
、ｓｔＧＦＰによりＧＦＰがない、浸潤された植物の全身的な葉の小さい点とし
て明白であった。低減された遺伝子鎮静は、より弱いプロモーターの下で低減さ
れた転写のために、細胞質中にＧＦＰ ｍＲＮＡ ｆｉＮＡの低減されたレベルを
反映するかもしれない。

【００６２】 実施例７：遺伝子鎮静シグナルは、ｆｉＮＡ転写を必要としない 第二段階の実験では、同一のｓｔＧＦＰ植物が、ＤＮＡフラグメントを有する
金粒子を用いて若い種苗と同様にボンバードされた。金粒子がｓｔＧＦＰに相同
な配列を有する場合、１０ｄ以上後に、浸潤された植物について上述したように
ＧＦＰの鎮静があった。これらの実験は、外因性の核酸が全身性の遺伝子鎮静を
引き出すために転写される必要はないことを示した。 構成物／ボンバードメントに用いられた核酸： ここに記載された全ての実験は、植物の標的遺伝子としてＧＦＰに関連する。
各ボンバードメントは、同時に１０の植物に行われる。植物は、ＡＧＡＲ上で生
育された小さい種苗（通常１ｃｍの長さ）である。示された核酸は金粒子上に被
覆され、ＤＮＡ被覆金のボンバードメントは、当業者に周知のせいでん的加速を
用いる。 以下の構成物／核酸は、少なくとも３回処理された（３０の植物）。鎮静を促
進する構成物の能力は、収量として表される。この収量は１０のボンバードされ
た植物について算出され、明確な全身性の鎮静を示す植物数に対応する。これら
を目的とする鎮静は、遺伝子鎮静シグナルの植物内における開始を意味すると解
され、本質的に全身性の成体植物の永続的な鎮静を導く（分裂組織および花粉お
よび卵を除く）。全身性鎮静は、通常、ボンバードメント後１０日以内に明らか
になり、２８日後に完了する。

【００６３】 １．ＰＵＣ１９における｛ＣａｍＶ ３５Ｓプロモーター−ＧＦＰ ｃＤＮＡ−Ｎ
ｏｓターミネーター｝ この構成物は、試験されたものの中で最も高い収量を示した。７つの独立した
ボンバードメント実験から（７０の植物）、鎮静の平均収量は７５％である。 ２．ＰＵＣ１９／pBluescriptにおける｛ＧＦＰ ｃＤＮＡ｝（ＧＦＰ ｃＤＮＡ は８００ｂｐ） この構成物は、鎮静を与えるが、弱められた収量であった。インプット相同配
列の転写（ｆｉＮＡ）は、植物を介した鎮静およびシグナルをセッティングする
のに必要ではないことが示されている。 ４つの独立した実験（４０の植物）で算出された平均収量：４０％。

【００６４】 ３．ＧＦＰ ｃＤＮＡの５’部に対応するＰＣＲ増幅フラグメント、４００ｂｐ の長さ、ベクターではない。 これは、３つの実験に基づいて算出された平均収量が３０％で、鎮静を示した
。これは、標的遺伝子の一部でさえ（ここでは約半分）鎮静を生じることができ
ることを示す。また、プラスミドベクターがインプット配列を有する必要がない
ことを示す。 ４．ＰＵＣ１９における｛ＧＦＰ ｃＤＮＡの３’部、３００ｂｐの長さ｝ これは、２つの実験のみに基づいて算出された平均収量が２０％で、鎮静を示
した。これは、（ｉ）潜在的に標的配列のあらゆる部分が鎮静を引き出すことが
でき、かつ、（ii）標的とインプット配列の間の長さおよび／または相同性が、
鎮静の収量に影響しうるが、遺伝子鎮静は部分的な配列のみを用いて達成するこ
とができることを示す。 ５．対照実験 以下の構成物はいずれもＧＦＰ鎮静を引き起こさなかった： ａ．６０の植物に対して試験されたＰＵＣ１９における｛ＣａｍＶ ３５Ｓプロ モーター−ＧＵＳ ｃＤＮＡ−Ｎｏｓターミネーター｝ ｂ．６０の植物に対して試験されたＰＵＣ１９における｛ユビキチンプロモータ
ー−ＧＵＳ ｃＤＮＡ−Ｎｏｓターミネーター｝ ｃ．４０の植物に対して試験されたＰＵＣ１９における｛４００ｂｐのＰＤＳ ｃＤＮＡ｝ ｄ．３０の植物に対して試験されたＰＵＣ１９

【００６５】 実施例８：遺伝子鎮静シグナルの転座は、ｆｉＮＡに相同な固有遺伝子の発現に
よって容易とされる 下方の茎部が、実施例１に記載されたアグロバクテリウムのＮＰＴ：ＧＵＳ：
ＧＦＰ株を用いて以前に浸潤され、ＧＦＰの全身的な鎮静がある、ｓｔＧＦＰ 植物である、３方向の接ぎ木(three-way graft)を作製した。また、上方の接ぎ 穂は、浸潤されていない、ｓｔＧＦＰが鎮静されていない、ｓｔＧＦＰトランス
ジェニックN.benthamiana由来である。中間の接ぎ穂は、非トランスジェニックN
.benthamiana、すなわちＧＦＰ遺伝子またはその配列相同体を含まない植物由来
であった。この接ぎ木された植物の上部は数週間にわたり緑色蛍光のままであり
、このシグナルが、ｆｉＮＡに相同な遺伝子を欠いた非トランスジェニックセグ
メントを介して移動しないことを示した。しかしながら、以下の実施例１４では
、６週間後に、多数のケースにおいてシグナルが接ぎ木接合部を通過して広がる
ことが示され、相同遺伝子の転写がトランスミッションにとって絶対に必要とい
うわけではないことを示している。 別の実験では、遺伝子鎮静のシグナルが、二つのｓｔＧＦＰ植物の茎と接ぎ穂
の間の接ぎ木接着部を通過して効率的に移動したことが確認された。

【００６６】 実施例９：ＴＩＧＳは安定に維持されるが、ＶＩＧＳは異なる ｓｔＧＦＰ N.benthamiana植物を、ＧＦＰの“ウイルス誘導遺伝子鎮静（“Ｖ
ＩＧＳ”）”を誘導するためにＰＶＸ−ＧＦＰを用いて感染させるか、あるいは
、ＴＩＧＳを誘導するためにアグロバクテリウムのＮＰＴ：ＧＵＳ：ＧＦＰ株を
用いて浸潤させた。ＶＩＧＳは、接種後２１日までに植物の上部の殆どを通じて
広まり、これに関連して、ＰＶＸ−ＧＦＰのノーザンブロッティングで検出可能
なレベル以下までの抑制があった。３５日までに、この植物の最上部が緑色蛍光
を回復し、ＰＶＸ−ＧＦＰの出現はなかったが、ＶＩＧＳが減少したことを示し
ている。これは、ＶＩＧＳがイニシエーターウイルスの継続的存在が必要である
ことを示唆している。 ＧＦＰのＴＩＧＳを示す植物においては、遺伝子鎮静の開始の広まりが、ＶＩ
ＧＳを示す植物と同じ速度であった。しかしながら、これらの植物においては、
鎮静状態は、最初の浸潤から４２日間以上にわたって永続的であった。分裂組織
、花粉および卵を除く植物の全ての上部が、ＧＦＰの鎮静を示した。鎮静状態は
、浸潤された葉が取り除かれても続いた。かくして、ＴＩＧＳはｆｉＮＡの連続
した存在を必要としない。

【００６７】 実施例１０：ＴＩＧＳは再生された植物において維持されうる ＴＩＧＳ植物の上部由来の葉のディスク外植片の組織培養によって、ｓｔＧＦ
Ｐ鎮静植物を再生することができる。これらの再生植物は、もとの浸潤された植
物と同様にｓｔＧＦＰの鎮静を示した。 遺伝子鎮静植物の再生は、植物の再生のための当業者に用いられる方法と同様
の方法によって行うことができる。要約すると、再生は以下のように行われる： １）鎮静された植物（ＴＩＧＳにより鎮静）から葉を採取する ２）７．５％のドメスト(domesto)中で３０分間滅菌する ３）小さい四角形に葉を切断する ４）この四角片を、１．０ｍｇ／ｍｌの６−ＢＡＰ、０．１ｍｇ／ｍｌのＮＡＡ
、３％のスクロースを添加した“MS media plus viatamins”(Sigma)に移す ５）２−３週後、この四角片は、完全に鎮静された苗条を生じ始める（分裂組織
を除く） ６）これらの苗条を無添加の“MS media plus viatamins”に移す ７）植物を生育させる。 転写後の鎮静は、鎮静された遺伝子と相同性を有するウイルス構成物に対する
連続的な耐性によって証明されるが、ＧＦＰ配列またはその相同体を含まない別
のウイルス構成物に対する耐性はなかった。

【００６８】 実施例１１：ＴＩＧＳシグナルは、核酸の特徴を有する ＧＦＰトランスジェニックN.benthamianaを、アグロバクテリウムのＮＰＴ： ＧＵＳ：ＧＦＰ株を用いて浸潤した後１０−２０ｄに採取し、ＧＦＰ発現が鎮静
された葉をリン酸バッファー（５０ｍＭ ｐＨ７．０）中でホモジネートした。 このホモジネートを、以前に浸潤されていない、ＧＦＰ発現が鎮静されていない
、ＧＦＰ N.benthamianaの葉に適用した。樹液の適用方法は、ウイルス感染樹液
を用いて植物に接種するに用いられた標準的な方法と同じであり、最初に葉にカ
ーボランダムを振りかける。樹液の液滴（２０ｕＬ）を葉に適用し、樹液成分が
細胞に入ることを介する摩損個所ができるように葉を手で優しく擦った。５分後
に、残りの樹液が毒性作用を持たないように、水に葉を浸した。 処理から２０日後までに、ＧＦＰ発現は十分には影響されなかった。しかしな
がら、ＧＦＰ発現（ＵＶ光の下で緑色蛍光の欠失により診断）がない、いくつか
（５−２０）の小さい領域が各植物に見られた。これらの領域は、１ないし１０
ｍｍの直径で異なる。以前にアグロバクテリウムのＮＰＴ：ＧＵＳ：ＧＦＰ株で
浸潤されたＧＦＰ N.benthamiana、または非トランスジェニック植物から抽出物
を得た場合には、ＧＦＰ抑制の領域はなかった。 ＧＦＰ発現が抑制された領域の存在は、沈静化のシグナルが樹液抽出物中に単
離されたことを示す。熱に不安定（１００℃ ５分）であり、樹液をフェノール ／クロロホルムで抽出した場合でも破壊されないことから、このシグナルが核酸
であると結論した。また、このシグナルが、樹液のＤＮＡアーゼ処理によって破
壊されないことから、ＲＮＡであることが示唆される。

【００６９】 実施例１２：ＴＩＧＳはＶＩＧＳと同じではない ｓｔＧＦＰ N.benthamianaを、ＣＰ遺伝子を削除したＰＶＸ−ＧＦＰの変異誘
導体を用いて接種した。この変異により、ウイルスは細胞から細胞への移動が阻
まれている。完全なＰＶＸ−ＧＦＰは、植物を通したウイルスの全身的広がりと
同じ方法でＧＦＰ導入遺伝子の全身的沈静化を誘導したが、これらの変異構成物
はそのようにならなかった。これは、接種物が不活性であったからではない：同
一の接種物が、ウイルスのＣＰ変異を補うために、ＰＶＸ ＣＰ産生クローニン グ(croning)感染座を発現するトランスジェニック植物に適用された。 この結果は、ＶＩＧＳが、感染した細胞を越えて長い距離を移動するシグナル
を生じなかったことを示す：ＶＩＧＳの全身的な効果は、ウイルスが細胞間を移
動できるからに違いない。対称的に、ＴＩＧＳは、細胞から細胞への移動特性が
授けられていないｆｉＮＡと関連するにも関わらず、上記実施例に記載されたと
おり長距離のシグナルを生じる。 以下の実施例１３−１９では、安定に組み込まれたＧＦＰ導入遺伝子（ｔｒＧ
ＦＰ）が“intＧＦＰ”と称され、一時的ＦＩＮＡ ＧＦＰ（ｔｒＧＦＰ）が“ep
iＧＦＰ”と称される。

【００７０】 実施例１３：遺伝子鎮静シグナルは、ｆｉＮＡをコードする導入遺伝子の取り込
みを必要とする：Ｔ-ＤＮＡトランスファーおよび転写の役割 上記実施例３に記載したとおり、A.tumefaciens由来のＴ-ＤＮＡの植物細胞核
への導入は、細菌の毒素（Vir）遺伝子の発現を必要とする方法である。ＴＩＧ Ｓが植物細胞へのepiＧＦＰの導入を必要とするか否かを調べるために、A.tumef
aciens Vir遺伝子活性がアップ-またはダウンレギュレートされる条件下で、以 前に記載された実験を繰り返した。Vir遺伝子をダウンレギュレートするために 、A.tumefaciens培養を、Vir遺伝子の誘導物質であるアセトシリンゴンの不在下
で湿潤させる前にインキュベートした（Ream, 1989）。Vir遺伝子のアップレギ ュレーションは、VirＧ、VirＥ１およびVirＥ２の二重のコピーを有するA.tumef
aciens（cor308）の強毒性株の使用によって行われた（Hamiltonら, 1996）。Vi
rＧは全てのVir機能の転写アクチベーターである：VirＥ１とVirＥ２は、Ｔ−Ｄ
ＮＡ導入と細胞質における安定化に関連する。また、VirＥ２は、Ｔ−ＤＮＡの 核ターゲッティングに必要である（ZupanとZambryski, 1997）。 両方のアプローチが、ＴＩＧＳがVir遺伝子機能を必要とすることを示した。 かくして、以下の表１に示すように、Ｎ：Ｇ：Ｇを用いた場合、A.tumefaciens 培養はアセトシリンゴンの不在下で産生し、ＴＩＧＳの開始は植物によって一貫
せず、アセトシリンゴンの存在下で調製された培養（浸潤後２０ｄくらい）より
もはるかに遅かった（浸潤後４０ｄ）。

【００７１】 表Ｉ．ＴＩＧＳに対するA.tumefaciens Vir遺伝子とepiＧＦＰプロモーターの
効果

【表１】 “ｄｐｉ”は、浸潤後のｄ(d post infiltration)の省略である。全身の葉の葉 脈の周りのＧＦＰ蛍光の損失がある場合には、植物が鎮静されたと見なされた。 さらに、培養がアセトシリンゴンなしで産生された場合には、ＴＩＧＳは浸潤
された植物の上部の小さい独立したゾーンに制限され、アセトシリンゴン処理培
養を用いて浸潤された植物よりはるかに少ない規模であった。逆に言えば、Ｎ：
Ｇ：Ｇ構成物の高毒性A.tumefaciens（cor308）宿主の使用は、数日でのＴＩＧ Ｓの発達を加速した：この株を用いて引き起こされたＴＩＧＳは、浸潤後７ｄに
始まり、１０ｄまでに完了した（表Ｉ）。

【００７２】 Vir遺伝子発現の影響は、ＴＩＧＳがＴ−ＤＮＡの植物細胞への導入を必要と することを示す。しかしながら、これらの実験は、epiＧＦＰの転写が必要か否 かを示していない。この論点と取り組むために、浸潤実験を、epiＧＦＰの３５ Ｓプロモーターがnosプロモーターで置換されている、ｐＢｉｎ３５Ｓ：ＧＦＰ 構成物（図１および２）の誘導体を用いて繰り返した（Ｎ：Ｇnos、図５）。こ のnosプロモーターは、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターよりもはるかに弱い（Har
psterら, 1988）。さらに、ＧＦＰプロモーターを含まない構成物でアグロ浸潤(
agroinfiltrate)させた（Ｎ：Ｇ△、図５）。数回の実験で（表Ｉ）、構成物が トランスジェニックN.benthamiana植物に浸潤された場合に、intＧＦＰのＴＩＧ
Ｓがあった。これらの構成物の両方を用いた場合に、ＴＩＧＳは、もとのＮ：Ｇ
：Ｇ構成物を用いた場合と同じくらい早く発達し（表Ｉ）、プロモーター上流ep
iＧＦＰの存在がＴＩＧＳの開始に必要でないことを示している。

【００７３】 実施例１４：ＴＩＧＳシグナルの伝搬 植物における分子の合胞体移動(symplastic movement)は、プラスモデスマタ(
plasmodesmata)および／または篩部を介して細胞から細胞へ行われる（Lucasら,
1989）。ＴＩＧＳを普及させるのにこれらのいずれの経路が用いられるのかを 調べるために、A.tumefaciensのＮ：Ｇ：Ｇ株を用いた植物の浸潤の後のｉｎｔ ＧＦＰ鎮静化を監視した。低方の葉の浸潤後２０ｄに、鎮静化は、全身的に若い
発達中の葉に明白に現れ、苗条の先で明確であった。浸潤時に既に開いていた上
方の葉においても鎮静化があったが、若くて発達中の葉よりも僅かであり広くな
かった。対照的に、浸潤された葉のすぐ上または下の葉は、完全に緑色蛍光のま
まであった。浸潤から３０ｄ後、浸潤された葉の茎および根もｉｎｔＧＦＰ鎮静
化を示し、ＴＩＧＳシグナルの移動が、植物において二方向性であることを示し
ている。早さおよび空間的分布に関して、この広がりのパターンは、葉を沈める
源から、篩部におけるウイルスの移動に似ている（LeisnerとTurgeon, 1993）。 シグナルの篩部輸送のさらなる支持は、一枚の葉においてA.tumefaciensのＮ ：Ｇ：Ｇ株を用いてｉｎｔＧＦＰ植物が浸潤される実験からもたらされる。これ
らの実験は、植物の反対側の２，３枚の葉において植物が浸潤された以前に記載
された実験とは異なる。浸潤後１月では、茎におけるｉｎｔＧＦＰ鎮静化が、も
との浸潤された葉の側に制限された。茎の鎮静化された部分から現れた若枝は鎮
静化されたが、鎮静化されていない半分から現れた方は鎮静化されなかった。こ
のシグナル移動パターンは、篩部転移染料の拡散およびN.benthamianaにおける 全身性ウイルスの拡散と極めて類似している（Robertsら, 1997）。

【００７４】 葉における鎮静化の発達は、N.benthamianaのクラスI、II、およびIII葉脈を 介した篩部輸送染料の転座にも類似していた（Robertsら, 1997）。浸潤の際に 既に開いていた全身的な葉では、ｉｎｔＧＦＰ鎮静化は、最初に（浸潤後２０ｄ
）主要な葉脈の周りの領域で、そして、後で（浸潤後２７ｄ）副次的葉脈の周り
の領域で起こった。浸潤後３４ｄでは、ｉｎｔＧＦＰ鎮静化は、葉の葉身全体に
広まり、鎮静化シグナルの細胞−細胞間移動および篩部を介した転移があったこ
とを示している。この細胞−細胞間移動は、シグナルが葉に移動する前に合胞体
的に単離された気孔防御細胞(stomatal guard cells)にｉｎｔＧＦＰ鎮静化がな
かったことから、プラスモデスマタを介して起こると思われる（Dingら,1997; M
cLeanら,1997）。しかしながら、先端成長点にシグナルが広がった後に発達した
葉においては、ｉｎｔＧＦＰが、気孔防御細胞においてさえも一様に鎮静化され
た。この観察結果から、防御細胞の合胞体的単離の前に、シグナルが発達におい
て早期に葉に浸透すれば、防御細胞は、遺伝子鎮静化に十分適していると結論す
る。 ＴＩＧＳシグナルの移動をさらに調べるために、導入遺伝子誘導遺伝子鎮静化
の全身的広がりを特徴付けする以前に記載された実験（Palauquiら,1997;上記実
施例８も参照）に似た接ぎ木実験を行った。特に、ＴＩＧＳの標的に配列類似性
を有する遺伝子がない細胞を介してシグナルが移動できるか否かを調べたい。最
初に、シグナルが接ぎ木伝染性であることを確認するために、ＴＩＧＳを示すｉ
ｎｔＧＦＰ根茎に非鎮静化ｉｎｔＧＦＰ接ぎ穂をウェッジグラフトさせた。試験
された１６の接ぎ木の内の１０に、接ぎ木後約４週間でＴＩＧＳが接ぎ穂に広ま
った。完全なＮ：Ｇ：Ｇ浸潤植物と同様に、接ぎ穂におけるｉｎｔＧＦＰ抑制は
、新たに現れる葉の葉脈の周りに最初に現れ、後で接ぎ穂の全ての栄養部に広ま
った。

【００７５】 このシステムにおけるシグナルは接ぎ木伝染性であることが立証され、鎮静さ
れたｉｎｔＧＦＰ根茎、ｎｔ茎の中間部、および非鎮静化ｉｎｔＧＦＰ植物の上
方接ぎ穂を含む、３方向接ぎ木(three-way grafts)を作成した。この方法を用い
て、試験された１１の接ぎ木の内の５つにおいて接ぎ木接合後約６週間でｉｎｔ
ＧＦＰ上方接ぎ穂に鎮静化が起こることを確認した。この結果は、ＴＩＧＳシグ
ナルが長距離を、中間部がＧＦＰ配列を全く持たないような、対応する核遺伝子
がない細胞を介して、移動できることを証明する。 別の一連の実験では、シグナル移動の広がりが、A.tumefaciensのＮ：Ｇ：Ｇ 株を用いた浸潤から１、２、３、４または５日後に浸潤された葉を除去すること
によって評価された。これらの実験では、浸潤された葉が浸潤から２ｄ後に除去
された場合に、植物の１０％にｉｎｔＧＦＰ蛍光の全身的損失（すなわち、ＴＩ
ＧＳ）があった。浸潤された葉が３ｄ以後に除去された場合には、漸進的により
高い割合の植物がＴＩＧＳを示した（図６）。これらのデータから、シグナルの
産生および転移は浸潤後２または３ｄいないに起こると結論する。 浸潤された葉の除去後にＴＩＧＳを示した植物では、ｉｎｔＧＦＰの損失は完
全な植物と同じくらい早く発達し、同じくらい長く持続した。さらに、Ｎ：Ｇ：
Ｇ浸潤植物の全てにおいて、ｉｎｔＧＦＰのＴＩＧＳは浸潤から１００ｄ以上に
わたって持続した。これらの古い植物でさえ、老化により浸潤された葉を失って
いるにもかかわらず、ＴＩＧＳは新たに現れた葉に誘導され続けた。これらの観
察結果から、ＴＩＧＳシグナルの伝搬はリレー方法を介して生じると提案する。
浸潤された葉からシグナルを受け取った細胞は、シグナルの第二の源となり、植
物におけるＰＴＧＳの維持が浸潤された葉とは独立になる。

【００７６】 実施例１５：分裂組織細胞におけるＴＩＧＳ Ｎ：Ｇ：Ｇ浸潤N.benthamiana植物における広くて永続的なｉｎｔＧＦＰの鎮 静化があるが、花、栄養および根の先端は、常に鎮静されないまま、すなわち緑
色蛍光のままであった（以下参照）。遺伝子鎮静化のシグナルは分裂細胞に入り
込めないか、あるいは、分裂細胞がｉｎｔＧＦＰを鎮静する能力を欠いている。
これらを調べるために、ＧＦＰのＴＩＧＳを示す植物の葉の外植片を培養した。
この外植片は、苗条の再生を促進する培地で培養された。分裂細胞がｉｎｔＧＦ
Ｐを鎮静する能力を欠くのであれば、ｉｎｔＧＦＰ鎮静化が失われることが予想
された。 これらの外植片から再生された苗条と葉では、器官の殆どの部分にｉｎｔＧＦ
Ｐ蛍光はなかったが、非鎮静化植物から再生された苗条は完全に緑色蛍光のまま
だった。これらの観察結果から、鎮静化は培養方法によって誘導されなかったが
、in vitroでの器官形成を介して維持されると結論する。しかしながら、鎮静化
された苗条の極端に先端部分は、原種植物のように緑色蛍光であった。この苗条
が根を備えた植物に成長した場合、根の先および栄養先端ゾーンおよび花の苗条
も緑色蛍光であった。この先端の蛍光は、非トランスフォーム植物には存在せず
、蛍光化合物の存在により、人工産物よりむしろ真にＧＦＰである。これらの結
果は、ＴＩＧＳが分裂細胞に維持されるか、分裂細胞を通過しうるが、おそらく
ＴＩＧＳのシグナルがこれらの領域に到達できないことから、遺伝子鎮静メカニ
ズムは植物の分裂組織において有効ではないことを示す。これらの知見は、分裂
組織から一般的に除外された、植物ウイルスの移動とＴＩＧＳシグナルの移動の
間の類似性を補強する（Matthews,1991）。

【００７７】 実施例１６：ＴＩＧＳのバイオリスティック活性化 上記の実験において、ｅｐｉＧＦＰは、ｉｎｔＧＦＰトランスジェニック植物
の葉にA.tumefaciensを浸潤させることによって誘導された。ｅｐｉＧＦＰ誘導 の別の意味を評価するために、ｐＵＣ３５Ｓ−ＧＦＰプラスミドで被覆された金
粒子を用いて小さい種苗（５−７ｍｍの長さ）をボンバードした（図７Ａ）。こ
のプラスミドは、ｐＵＣ１９に基づき、ｐＢｉｎ３５Ｓ−ＧＦＰ由来の完全な３
５Ｓ−ＧＦＰカセットを有する（図７Ａ）。ボンバードメントから３週間後、７
５％の植物がｉｎｔＧＦＰのＴＩＧＳを示した。アグロ浸潤された植物と同じよ
うに、苗条と根の成長点を除く植物全体にｉｎｔＧＦＰのＴＩＧＳがあった。こ
の結果は、全部で７０の植物を含む７つの独立した実験で一貫しており再現性が
あった（図７Ａ）。ｉｎｔＧＦＰ植物が、ＧＦＰ ＯＲＦを備えていないプラス ミドまたは未被覆の金粒子を用いてボンバードされた場合には、ｉｎｔＧＦＰの
ＴＩＧＳは観察されなかった（データ示さず）。引き渡されたＤＮＡを受けた細
胞の数を評価するために、ｐＵＣ３５Ｓ−ＧＵＳプラスミドを用いて種苗をボン
バードし、３日後にＧＵＳ活性のために全ての植物を染色した。平均で、８未満
の不規則に分配された個々の細胞が全体の種苗において青く染まることを見いだ
した。これらの結果は、ＴＩＧＳがｅｐｉＧＦＰの輸送方法に依存しないこと、
並びに、非常に局所的な事象が、遺伝子鎮静化の配列特異的シグナルの産生およ
び広がりを開始しうることを示す。 プロモーターのないＧＦＰ ｃＤＮＡの線形フラグメント、完全あるいは５’ または３’フラグメントのボンバードメントも、ＴＩＧＳを引き起こした。ＧＦ
Ｐのこれら二つのフラグメント（..ＰおよびＧ..；図７Ａ）は、完全なｃＤＮＡ
よりもＴＩＧＳのイニシエーターとして効率が悪く（ＧＦＰ、図７Ａ）、ＴＩＧ
Ｓの開始がｅｐｉＧＦＰの長さにより影響されることを示している。ｅｐｉＧＦ
Ｐの長さの重要性をさらに調べるために、一連のＰＣＲ増幅フラグメントが作成
された。これらのフラグメントは、全て同一の物理的長さ（５００ｂｐ）である
が、異なる長さのＧＦＰ ｃＤＮＡの３’コターミナルフラグメントを有する。 これらのフラグメントの非ＧＦＰ ＤＮＡは、pBluescript由来である。同じ量の
各フラグメントを、５つの独立した実験で５０の植物にボンバードした。この結
果は、図７Ｂにまとめられ、ＴＩＧＳの開始の効率がｅｐｉＧＦＰとｉｎｔＧＦ
Ｐとの間の相同性の長さによって決定されることを明確に示す。

【００７８】 実施例１７：ＴＩＧＳはｅｐｉＧＦＰとｉｎｔＧＦＰとの相互作用を必要とする 原則として、ＴＩＧＳはｅｐｉＧＦＰのみによって開始されうる。あるいは、
ｅｐｉＧＦＰとｉｎｔＧＦＰ ＤＮＡまたはｉｎｔＧＦＰ ＲＮＡとの相互作用の
後に開始されうる。これらの可能性を区別するために、ＧＦＰｃＤＮＡの５’ま
たは３’直鎖フラグメントを用いたボンバードメント後のＴＩＧＳの標的をさら
に特徴付けした（ＧＦ.および..Ｐ、図８Ａ）。ＴＩＧＳがボンバードされたＤ ＮＡのみによって開始されたら、標的はボンバードされたＤＮＡの領域（すなわ
ち配列）に限定される。しかしながら、ｉｎｔＧＦＰとの相互作用後に決定され
た標的は、ボンバードされたＤＮＡの領域を越えて広がることができる。ＴＩＧ
Ｓ標的部位のアッセイは、ＧＦＰ、..ＰまたはＧＦを用いて２１ｄ前にボンバー
ドされたｉｎｔＧＦＰ植物に、ＰＶＸ−ＧＦおよびＰＶＸ−Ｐ（図８Ａ）の接種
を含む（図８Ａ、線図）。ウイルス接種はｉｎｔＧＦＰのＴＩＧＳを示す葉にな
され、ウイルスＲＮＡの蓄積は、接種から８ｄ後に接種された葉から得られたＲ
ＮＡサンプルのノーザン解析によって評価された（図８Ａ、線図）。

【００７９】 接種された葉のノーザン解析は、ＰＶＸ−ＧＦＰおよびＰＶＸ−ＧＦの蓄積（
図８Ｂ、レーン８−１０と１２−１４）が、トランスフォームされていない植物
の葉（図８Ｂレーン６）または未被覆の金粒子を用いて以前にボンバードされた
ｉｎｔＧＦＰ植物の葉（図８Ｂ、レーン６、７および１１）よりも、ｉｎｔＧＦ
ＰのＴＩＧＳを示す葉において低い（少なくとも１０倍）ことを示した。ｅｐｉ
..Ｐによって誘導された鎮静化がＰＶＸ−ＧＦを標的とし（図８Ｂ、レーン１３
と１４）、逆に、ｅｐｉＧＦ．によって誘導された鎮静化がＰＶＸ−Ｐを標的と
し得ること（図８Ａ、データ示さず）が、特に注目される。この実験に関するＧ
Ｆ.および..Ｐフラグメントの間には配列の重複は無いので、ＴＩＧＳの標的部 位は、ｅｐｉＧＦＰとｉｎｔＧＦＰ ＤＮＡまたはｉｎｔＧＦＰ ＲＮＡとの相互
作用後に決定されると結論する。 さらに、ボンバードされたＤＮＡの影響は、３’（ＧＦからＰ）または５’（
ＰからＧＦ）方向の両方に伸びることができる。

【００８０】 実施例１８：自発的ＴＩＧＳ トランスジェニックN.benthamiana系統のなかで、ｉｎｔＧＦＰ全身的鎮静化 が自発的に起こる一つの系統（１５ａ）を同定した。植物におけるＰＴＧＳの多
くの例と同様に、系統１５ａの鎮静表現型は導入遺伝子投与量によって影響され
る（Hobbsら, 1993）（Muellerら, 1995）。ヘミ接合のＧＦＰ導入遺伝子を備え
た１５ａの子孫は緑色蛍光のままだったが（データ示さず）、ホモ接合体導入遺
伝子を用いたものはｉｎｔＧＦＰ鎮静化を示した。これらの植物における鎮静化
の発達は、浸潤およびボンバードされた植物と同じパターンに従う。最初に、こ
の植物は一様に緑色蛍光であるが、四つ葉ステージでは、上方の葉の葉脈の周り
に赤い蛍光のスポットが形成された。最後に、これらの領域は、A.tumefaciens のボンバードメントまたは浸潤によって誘導されたＴＩＧＳに関して、葉脈の長
さ方向に沿って、植物全体に広がった。系統１５ａにおける鎮静化の全身的シグ
ナルの関与を接ぎ木実験で確かめた。さらに、ＴＩＧＳを示す植物のように、１
５ａ分裂組織にはｉｎｔＧＦＰ鎮静化が観察されなかった。これらの観察結果か
ら、ボンバードメントまたはA.tumefaciens浸潤は、トランスジェニック植物に おいて自発的に生じる方法をまねることを結論する。

【００８１】 実施例１９：ウイルス構成物由来のＴＩＧＳ−ウイルスタンパクの効果 多数の構成物が、PCT/GB98/00442のＰＶＸ−ＧＦＰのアンプリコン(amplicon)
構成物に基づいて調製されたが、ＰＶＸまたは導入遺伝子領域に種々の欠失を含
む。ＧＦＰはＵＶ光の下で観察された。 プラスミドの作成 図９ないし１２を参照。 構成物はｐＰＶＸ２０９（３５Ｓプロモーターの下にｐＵＣ１９プラスミド中
にＰＶＸ−ＧＦＰが挿入されている）に基づいており、また、ｐＰＶＸ２０４（
Baulcombeら,1995参照）に基づいているが、プロモーターの５’側に付加的なSa
cI部位を含む。 コートタンパク（ＣＰ）の欠失を含むプラスミドｐＰＶＸ２１０Ａが、ｐＰＶ
Ｘ２０９から生成された。 細胞−細胞間移動タンパクの“トリプルブロック”（２５Ｋ、１２Ｋおよび８
Ｋ）にさらなる欠失を含むプラスミドｐＣＬ１００、ｐＣＬ１０１およびｐＣＬ
１０２は、ｐＰＶＸ２１０Ａから生成された。 レプリカーゼ（Ｒｅｐ）領域にさらに欠失を含むプラスミドｐＣＬ１０５は、
ｐＣＬ１００から生成された。 プラスミドｐＣＬ１０６は、ＧＦＰ機能を回復させるために、ｐＰＶＸ２１０
Ａ由来のＰＣＲフラグメントを含む。

【００８２】 図１２は、ｐＵＣ１９構成物が、アグロバクテリウムバイナリーベクタープラ
スミドｐＳＬＪ７５５／５にどのように挿入されるかを示す。これらの構成物は
表２のように番号付けされている。

【表２】 表２。作成された最小構成物（太字）、および原種構成物のリストおよび記載
。 △Ｂ：２５ｋＤａタンパク遺伝子の５’末端およびＴＧＢの５’ＵＴＲを維持す
るＴＧＢ欠失 △ＧＢ：ＴＧＢの５’ＵＴＲを維持するＴＧＢ欠失 △ＴＧＢ：ＴＧＢのＵＴＲの最初の３ｎｔのみを維持するＴＧＢ欠失 一部の構成物の陽性鎖配列は図１３ないし１７に記載されている。

【００８３】 感染細胞におけるウイルスＲＮＡの産生および複製 これは、野生型の植物において確かめられた。移動タンパクが殆どの構成物に
おいて無能力にされたことにより、標準的な感染アッセイが用いられなかった。
しかしながら、アグロバクテリウム株は浸潤された葉の領域の高密度の細胞を感
染するためにN.benthamianaの葉に浸潤されうる。葉の浸潤されたゾーンから単 離されたＲＮＡのノーザン解析は、その構造から予想されるように構成物２１２
Ａ、１１０、１１２および１１６からの転写物の複製があったことを示す。強力
なＣＰサブゲノムプロモーターを含む１１６構成物は、他の構成物よりサブゲノ
ムなＲＮＡを産生した。同様に、ＵＶ光の下では、２１２Ａおよび１１６は、明
るい緑色蛍光を示した。３５Ｓ−ＧＦＰ構成物（ｐＡ１０３６−示さず）よりも
明るく、これはこの構成物の複製と再び一致する。

【００８４】 ＴＩＧＳを生じる構成物の使用 ＧＦＰトランスジェニック植物の鎮静化は、非複製３５Ｓ−ＧＦＰ構成物に関
連した先の実施例に記載されているように評価された。上記構成物は、アグロバ
クテリウムtumefaciens（株ＧＶ３１０１）に導入され、培養がアセトシリンゴ ンの存在下で生育された。ＧＦＰトランスジェニック植物の葉が、実施例１に記
載したようにアグロバクテリウムで浸潤され、遺伝子鎮静化が植物のＵＶ照明に
より４週間にわたって観察された。ｐＰＶＸ２１２ＡにおけるＰＶＸ−ＧＦＰ構
成物（表２参照）は、ＰＶＸ−Ｄｒｅｐ−ＤＴＧＢ−ＦＰ構成物よりも効率の低
い鎮静配列であるが、ＰＶＸ−ＤＴＧＢ−ＦＰ（ｐＣＬ１１０）およびＰＶＸ−
ＤＴＧＢ−ＧＦＰ（ＰＣＬ１１６）はＰＢＸ−Ｄｒｅｐ−ＤＴＧＢ−ＦＰよりも
効率的であった。これらのデータから、複製ＲＮＡを産生する能力は、本発明の
実施には不要であるが、鎮静化の効率を顕著に増強するが、ウイルス移動タンパ
ク（ＰＶＸ−ＤＴＧＢ−ＦＰ（ｐＣＬ１１０）およびＰＶＸ−ＤＴＧＢ−ＧＦＰ
（ＰＣＬ１１６）ではなくｐＰＶＸ２１２Ａにおいてコードされている）は遺伝
子鎮静化のアンタゴニストであると結論する。遺伝子鎮静化のための構成物は、
遺伝子鎮静化メカニズムをアンタゴナイズする移動タンパクの発現を避けるよう
に構成されるべきと結論する。

【００８５】 実施例１３−１９の考察 これらの実施例は、独立の開始、拡散および維持のステージへのＰＴＧＳのさ
らなる解析をするために、ＴＩＧＳを用いる。この考察では、これらの異なるス
テージの可能な分子メカニズムおよび植物および他の生命体における遺伝子鎮静
化の本来の役割を評価する。遺伝子鎮静化のシグナルの可能性のある性質につい
ての推理が、遺伝子鎮静化の開始および維持ステージに関する考察に影響するこ
とから、最初に拡散ステージを考察する。

【００８６】 ＴＩＧＳの全身的な拡散 ＴＩＧＳの全身的拡散は、配列特異的シグナルに関係することに注目すべきで
ある：ＧＦＰに対して開始されたＴＩＧＳは、ｉｎｔＧＦＰまたはウイルスＧＦ
Ｐ ＲＮＡに特異的であるが、ＧＵＳに対するＴＩＧＳはＧＵＳ ＲＮＡに特異的
である。配列特異性のこのパターンは、ＴＩＧＳが非特異的に傷つけるシグナル
であるか、あるいは特異性が３５Ｓプロモーターに関連するといった可能性を排
除する。それゆえ、ＴＩＧＳのシグナルは標的遺伝子の転写領域に特異的であり
、特異性の決定因子は核酸成分を含むと思われる。かくして、ＧＦＰのＴＩＧＳ
のシグナルは、ＧＦＰ ＲＮＡまたはＤＮＡを含むと思われるが、ＧＵＳまたは 他の遺伝子のＴＩＧＳのシグナルは、対応する択一的な核酸種を含む。全身的な
拡散のパターンとスピードから、この推定上の拡散が、プラスモデスマタを介し
た細胞から細胞へ動くことができるのみならず、最近の論評（Jougensenら, 199
8）に提案されているように、篩部を介して全身的にも移動できることを確かめ た。

【００８７】 細胞間を移動する内在性の核酸に関する植物における先例がある。例えば、転
写ファクターのｍＲＮＡ（Lucasら, 1995）およびスクロース輸送ｍＲＮＡ（Kuh
nら, 1997）を含む核遺伝子によってコードされた移動核酸がある。しかしなが ら、これら両方の例では、移動は細胞間のみである：ＴＩＧＳのシグナルのよう
な長距離移動の証拠はない。遺伝子鎮静化の推定上のシグナルに最も明らかに匹
敵する移動核酸はウイロイドである。鎮静化のシグナルのように（図６）、これ
らの小さい非コードＲＮＡ種は接種から数日間以内に全身的に移動する（Paluka
itis, 1987）。ウイロイドとＴＩＧＳの両方で、移動の経路は、プラスモデスマ
タを介した細胞細胞間および篩部を介した長距離拡散を含む（Palukaitis, 1987
; Dingら, 1997）。 葉を除去する実験から（図６）、シグナルの移動はリレーに関係すると推論す
る。ｅｐｉＧＦＰを受けた一部の細胞は最初のシグナル産生の最初の源である。
しかしながら、シグナルがボンバードまたは浸潤された葉の外に移動すると、こ
の最初の源はもはや必要ではなく、シグナル分子の二次的源である植物中の他の
細胞が存在するに違いない。シグナル産生における一時および二次リレーポイン
ト間の最大距離はわからないが、３方向接ぎ木実験から、数センチメートル以上
距離が関与すると推論する。 シグナルの拡散（または開始）に対するウイルス移動タンパクの推定上の効果
も興味がある（実施例１９）。これは、ｆｉＮＡの源として複製構成物を有する
ことが望ましいが、これらを、全て適切な植物プロモーターの制御の下にある、
関連するシス作用成分および標的配列を加えたレプリカーゼのみに限定すること
も望ましい。

【００８８】 シグナル産生の開始と維持 ＴＩＧＳはｅｐｉＧＦＰを受けたボンバードまたは浸潤された細胞に開始され
る。正式に排除されるわけではないが、プロモーターの存在はＴＩＧＳの開始に
殆どまたは全く影響を与えないことから、ＴＩＧＳは導入されたＤＮＡの転写を
必要とすると思われる（上記表Ｉ、図７および８）。..Ｐによって誘導されたＴ
ＩＧＳは、ＧＦＰ ＲＮＡのＧＦ．成分の標的化を生じることから、シグナルは 、導入されたＤＮＡから直接誘導されるとは思われない。同様に、ＧＦ．のボン
バードメントは、..Ｐに対して標的化された鎮静を生じた（図８）。これらのデ
ータからの解釈は、ＴＩＧＳはｉｎｔＧＦＰとｅｐｉＧＦＰとの間の相互作用に
よって開始され、ＴＩＧＳの標的はｉｎｔＧＦＰによって決定されるということ
である。ＴＩＧＳに対するｅｐｉＧＦＰの長さの影響も、ｅｐｉＧＦＰとｉｎｔ
ＧＦＰとの間の相同性依存相互作用と一致する（図７Ｂ）。 この提案されたｅｐｉＧＦＰの相互作用がｉｎｔＧＦＰ ＤＮＡまたはＲＮＡ に関係し、我々のデータがいずれに対しても決定的な証拠を提供しないことにつ
いては認識している。しかしながら、Ｎ：Ｇ：ＧとＮ：Ｇ_△において、ＧＦＰ導
入遺伝子は、Ｔ−ＤＮＡの左端に向かって５’から３’に方向付けられているか
ら、ＤＮＡとの相互作用は、ＲＮＡよりも確からしいと考える（図５Ｂ）。A.tu
mefaciensのＴ−ＤＮＡは、５’末端にＴ−ＤＮＡの右端を有する一本鎖ＤＮＡ として植物細胞に移されるから、この遺伝子の方向は適切である（ZupanとZambr
yski, 1997）。この鎖特異的トランスファーメカニズムは、両方の分子が同じ極
性を有することから、一本鎖ｅｐｉＧＦＰ ＤＮＡをｉｎｔＧＦＰ ＲＮＡと相互
作用させない。しかしながら、一本鎖ｅｐｉＧＦＰ Ｔ−ＤＮＡは、挿入の配向 に関わりなく、ゲノムの相同なＤＮＡと相互作用する可能性を有する。ＤＮＡレ
ベル相互作用と一致して、ｉｎｔＧＦＰ ＲＮＡの極性を有する一本鎖ＧＦＰ Ｄ
ＮＡが、ボンバードメント後にＴＩＧＳを開始しうることも示した（データ示さ
ず）。

【００８９】 ｅｐｉＧＦＰとｉｎｔＧＦＰのＤＮＡレベル相互作用がどのようにＴＩＧＳを
生じるのか？トランスジェニック植物におけるＰＴＧＳの早期異所性ペアリング
モデルに類似したメカニズムを提案する。このモデルによると、ｅｐｉＧＦＰと
ｉｎｔＧＦＰとの異所性相互作用は、ｉｎｔＧＦＰの転写を混乱させ、最終的に
アンチセンスＲＮＡの形成を導く（BaulcombeとEnglish, 1996）。このアンチセ
ンスＲＮＡは、分解のためにＧＦＰ ＲＮＡを標的とし、シグナル分子の成分と なる。ＤＮＡレベル相互作用が、ゲノムＤＮＡの非コード鎖の異常な転写を導く
のであれば、このアンチセンスＲＮＡは、ゲノムから直接転写された産物であろ
う。あるいは、アンチセンスＲＮＡは、はじめに導入遺伝子媒介ＰＴＧＳを説明
するために示唆されたように、宿主にコードされたＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
ゼによって間接的に産生される（Lindboら,1993）。このシナリオにおいて、Ｒ ＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型として異常なセンスＲＮＡを用いてアンチ
センスＲＮＡを作成する。 異常な転写を導く相同ＤＮＡの異所性相互作用が存在しうるという提案は、植
物、動物および真菌からの先例に基づく。ある例では、哺乳動物細胞のβグロビ
ン遺伝子を用いて、異所性ＤＮＡ相互作用が、ゲノムの相同配列を有するトラン
スフェクトされたプラスミドの共局在(co-localisation)によって直接証明され た（Asheら, 1997）。植物および真菌細胞では、異所性相互作用は、相同ＤＮＡ
の修正されたメチル化パターンから間接的に推論される（Hobbsら,1990; Barry ら,1993）。これらの異所性相互作用は、Ascobolus immersusにおいて示されて いるように（Barryら,1993）、未熟に切りつめられたＲＮＡ種を導く転写の阻止
により異常なＲＮＡを導くかもしれない。あるいは、異所性相互作用は、β−グ
ロビン遺伝子の例のように（Asheら,1997）、転写の異常な拡張を引き起こすか もしれない。

【００９０】 異常な転写を引き起こすＤＮＡレベルの相互作用は、植物におけるＴＩＧＳの
持続と均一性を都合良く説明する。例えば、なぜ鎮静された植物が生涯を通じて
鎮静状態を安定に保つのかを説明する。導入されたＤＮＡまたはＤＮＡレベルで
のシグナリング分子の相互作用は、鎮静化された細胞がシグナルを受けなくなっ
ても持続できるクロマチン修飾またはＤＮＡメチル化に関係する後成的な変化を
導きうる。 この仮説と一致して、ウイロイドＲＮＡがトランスジェニック植物における配
列特異的ＤＮＡメチル化を指令しうることが示された（Wasseneggerら, 1994） 。さらに、後変異(epimutated)ＤＮＡまたはクロマチンの転写は、ＴＩＧＳにお
ける増幅段階を提供する。この増幅は、ＴＩＧＳのリレーを説明し、また、なぜ
シグナルが、最初に浸潤またはボンバードされた細胞から離れて移動するにつれ
希釈されないのかを説明する。

【００９１】 植物および動物における遺伝子鎮静化の他の例と比較したＴＩＧＳ。 植物における遺伝子鎮静化の多くの例は、ＴＩＧＳに類似している。例えば、
導入遺伝子誘導ＰＴＧＳを示すトランスジェニック植物では、接ぎ木実験（Pala
uquiら, 1997）および鎮静化の細胞外シグナルが存在する鎮静化の空間的パター
ンから明らかである。さらに、例えばＧＵＳ導入遺伝子を用いた、開始の遅延を
伴う遺伝子鎮静化はシグナルの全身的拡散と関係するかもしれない（ElmayanとV
aucheret, 1996）。これらの場合では、ＴＩＧＳについてここで示したように、
このプロセスが植物のまさに一つまたはいくつかの細胞に開始され、シグナルの
拡散が、植物全体の遺伝子鎮静化の原因であると思われる。 シグナル分子の関与は、単細胞における遺伝的または後成的発現の変異が、植
物全体の遺伝子鎮静化のレベルに影響することを意味している。結果的に、全て
の植物ＤＮＡにおける導入遺伝子の解析は、ＰＴＧＳに影響するファクターの厳
密な指標ではないかもしれない。例えば、全体の植物ＤＮＡの解析に基づいた以
前の研究では、単一コピー、ヘミ接合導入遺伝子がＰＴＧＳを活性化できること
が結論される（ElmayanとVaucheret, 1996）。この結論は、異所性のＤＮＡ相互
作用がＰＴＧＳを開始するという示唆とは調和し難い（BaulcombeとEnglish, 19
96）。 しかしながら、ここに示された結果は、植物全体におけるＰＴＧＳがＤＮＡ内 再複製(endoreduplication)または染色体再配列により導入遺伝子の多重コピー を有する各細胞に開始されたことを示す。それゆえ、ゲノムに１コピーのみの鎮
静導入遺伝子を有する植物でさえ、ＰＴＧＳが相同ＤＮＡの異所性の相互作用に
よって開始されたことは除外できない。

【００９２】 ＰＴＧＳの殆どの解析は、植物と真菌に関与する。しかしながら、植物と真菌
のシステムに類似していると思われる、動物における遺伝子鎮静現象の報告があ
る。例えば、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）では、ペチ ュニア、タバコおよびその他の植物システムのような、導入遺伝子と内因性遺伝
子の共抑制がある（PalBhadraら, 1997）。しかしながら、より注目すべきは、 セノラブディティスエレガンス（Caenorhabditis elegans）（Fireら, 1998）と
ゾウリムシ（Paramecium）（Ruizら, 1998a）における遺伝子鎮静化に関する二 つの最近の例である。C.elegansについて記載された“遺伝的干渉”は、ここで 記載したようにＤＮＡよりむしろ二本鎖ＲＮＡによって開始されるが（Fireら,
1998）、影響を受けた生命体を通じたリレーメカニズムによる拡散能力を含めて
ＴＩＧＳと共通の多くの特徴を有する。ゾウリムシでは、遺伝子の配列を含むプ
ラスミドの微量注入が、体細胞大核の対応する遺伝子の相同性依存鎮静化を導く
（Ruizら,1998a）。ＴＩＧＳについて記載したように、鎮静化効果は、遺伝子の
コード領域のみを含むプラスミドで開始され、生命体の栄養成長を通じて安定に
維持される。おそらく、ＴＩＧＳ、ゾウリムシにおける誘導された鎮静化および
C.elegansにおける二本鎖ＲＮＡの効果の類似性は、異常なＲＮＡを特別に標的 とすることができる植物および動物に遍在するメカニズムの存在を反映する。こ
の可能性は、ＲＮＡ二本鎖が、トランスジェニック植物におけるＰＴＧＳの開始
に必要とされる潜在的な異常であることの示唆とよく適合する（Metzlaffら, 19
97）。

【００９３】 植物におけるＴＩＧＳの役割とは？ ＴＩＧＳがウイルスおよびトランスポゾンに対する植物における保護メカニズ
ムを反映するという以前になされた示唆に加えて（VoinnetとBaulcombe, 1997- 上記も参照）、ＴＩＧＳが植物の発達において自然なシグナリングメカニズムを
示す可能性があると考える。これらの提案は、ウイロイドがＲＮＡシグナリング
の自然のメカニズムを利用することを示唆するという、１９８２年に記載された
洞察に満ちた論評に予期されていた（Zimmern, 1982）。例えば、ＴＩＧＳ様シ グナリングが植物における開花の制御に関連する可能性があると考えられる。古
典的な実験から、ＴＩＧＳの自然的現れの多くの予想された特性を有する開花の
接ぎ木伝達性シグナル（フロリゲン）が存在することがわかっている（Poethig,
1990）。ＴＩＧＳシグナルのように、フロリゲンは、植物において通常特徴付け
されているホルモンまたは他のシグナリング分子のいずれとも対応していないが
、後成的発現スイッチを生じるために全身的に移動する（Bernier, 1988; Colas
antiら, 1998）。フロリゲンにあっては、後成的発現スイッチは植物の栄養から
開花状態への移行と関係し、ＴＩＧＳでは、遺伝子鎮静化は後成的発現事象とし
て考えることができる。ある場合には、ＤＮＡメチル化の変化が、花のコミット
メント(commitment)に関係していた（Poethig, 1990）。おそらく、フロリゲン と推定されるＴＩＧＳのシグナルは、似たようなタイプの移動性ＲＮＡである。
このＲＮＡは、植物において全身的に移動可能にし、配列特異的ＤＮＡメチル化
を引き起こす、ウイロイドＲＮＡの特徴を有するかもしれない（Wasseneggerら,
1994）。フロリゲンの場合には、標的ＤＮＡは、栄養から開花状態への移行を 制御する配列かもしれない。

【００９４】 「参考文献」

【図面の簡単な説明】

【図１】 導入遺伝子とウイルス構成物

【図２】 導入遺伝子とウイルス構成物

【図３】 N.benthamianaにおけるＧＵＳおよびＧＦＰレポーター遺伝子の 発現

【図４】 ｓｔＧＦＰおよびＰＶＸ−ＧＦＰ ＲＮＡのノーザン解析

【図５】 実施例１３で用いられた構成物

【図６】 ＴＩＧＳシグナルの転移の動力学

【図７】 ＴＩＧＳのバイオリスティック活性化

【図８】 ＴＩＧＳはｅｐｉＧＦＰとｉｎｔＧＦＰの相互作用を必要とする

【図９】 ｐＰＶＸ２０９とｐＰＶＸ２１０Ａ

【図１０】 ｐＣＬ−ベクターと原種構成物

【図１１】 ｐＣＬ−ベクターと原種構成物

【図１２】 プラスミドｐＳＬＪ７５５／５へのｐＵＣ１９構成物の挿入

【図１３】 構成物のポジティブ鎖配列

【図１４】 構成物のポジティブ鎖配列

【図１５】 構成物のポジティブ鎖配列

【図１６】 構成物のポジティブ鎖配列

【図１７】 構成物のポジティブ鎖配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 カーシュテン・ヴェルナー・レーデラー ドイツ・Ｄ−56566・ノイヴィート・イ ン・デア・ミュンヒヴィーゼ・８ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 4B024 AA08 BA80 CA01 DA01 EA04 GA11

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 植物の第一部分に存在する標的ヌクレオチド配列を鎮静す る方法であって、当該植物の第二部分の細胞の細胞質に核酸構成物を一時的に導
   入することを含み、前記細胞は標的配列をコードする核酸を含み、かつ、当該植
   物の前記第一部分から離れて位置し、前記構成物が、 （i）標的ヌクレオチド配列または当該配列の相補配列と同一の配列を有する配 列をコードし、かつ、 （ii）当該構成物を含まない鎮静シグナルが、前記標的ヌクレオチド配列の鎮静
   を引き起こすように、当該植物の第一部分において誘導され、かつ、当該植物の
   第二部分に伝達されるように、遺伝子鎮静シグナルの全身的移動をブロックし得
   るタンパクをコードしない、植物の標的ヌクレオチド配列を鎮静する方法。
2. 【請求項２】 遺伝子鎮静シグナルの全身的移動をブロックし得るタンパ クが、細胞内のウイルスの移動を媒介しうるものである、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 核酸が導入される植物の部位が、光合成産物が濃縮される 領域に対応し、かつ、標的ヌクレオチド配列が、当該産物が使用される離れた領
   域に存在する、請求項１または２記載の方法。
4. 【請求項４】 標的ヌクレオチド配列または当該標的ヌクレオチド配列と 相同性を有するヌクレオチド配列が、植物の第一および第二部分を連結し、遺伝
   子鎮静シグナルの伝達を媒介する組織の細胞において転写される、請求項１ない
   し３のいずれか一項に記載の方法。
5. 【請求項５】 標的ヌクレオチド配列が植物において全身的に鎮静される 、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方法。
6. 【請求項６】 構成物が、自律複製し得ない、請求項１ないし５のいずれ か一項に記載の方法。
7. 【請求項７】 植物細胞に導入された構成物がウイルスのコートタンパク をコードしない、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の方法。
8. 【請求項８】 標的遺伝子と配列同一性を備えた配列が、タンパク産物に 翻訳されないように翻訳認識シグナルを含まない、請求項１ないし７のいずれか
   一項に記載の方法。
9. 【請求項９】 核酸構成物がＤＮＡである、請求項１ないし８のいずれか 一項に記載の方法。
10. 【請求項１０】 構成物がヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモ ーターを含み、当該ヌクレオチド配列が、 （i）ウイルスレプリカーゼをコードし、 （ii）導入細胞の細胞質で複製されるように、標的ヌクレオチド配列またはその
    相補配列と配列同一性を有し、かつ、前記レプリカーゼに認識される一つ以上の
    シス作用成分に連結された複製可能な配列をコードし、 （iii）細胞内のウイルスの移動を媒介することができるタンパクをコードしな い、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の方法。
11. 【請求項１１】 ウイルスレプリカーゼがＰＶＸレプリカーゼである、請 求項１１記載の方法。
12. 【請求項１２】 プロモーターが誘導プロモーターである、請求項１０ま たは１１記載の方法。
13. 【請求項１３】 構成物が、植物ゲノムへの構成物の組み込みを可能にす るＴｉ誘導配列を含む、請求項１０ないし１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 【請求項１４】 構成物が、 （i）プロモーターまたはターミネーター配列、 （ii）植物ゲノムへの構成物の組み込みを可能にするＴｉ誘導配列 のいずれも含まない、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の方法。
15. 【請求項１５】 構成物が、アグロバクテリウムツメファシエンス（Agrob
    acteriun tumafaciens）を用いて植物に導入される、請求項１３記載の方法。
16. 【請求項１６】 構成物が、微量発射ボンバードメントによって植物細胞 に導入される、請求項１ないし１４のいずれか一項に記載の方法。
17. 【請求項１７】 標的ヌクレオチド配列が異種遺伝子をコードする、請求 項１ないし１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 【請求項１８】 標的ヌクレオチド配列が、植物に内在性の遺伝子をコー ドする、請求項１ないし１６のいずれか一項に記載の方法。
19. 【請求項１９】 植物がトランスジェニック植物ではない、請求項１８記 載の方法。
20. 【請求項２０】 標的ヌクレオチド配列が、植物中のウイルスのウイルス ゲノムの全てまたは一部をコードする、請求項１ないし１９のいずれか一項に記
    載の方法。
21. 【請求項２１】 配列同一性を有する二つ以上の標的遺伝子が鎮静される 、請求項１ないし２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 【請求項２２】 （ａ）請求項１ないし２１のいずれか一項に記載の方法 に従って植物においてヌクレオチド配列を鎮静すること、 （ｂ）植物の表現型を観察すること、そして任意に、 （ｃ）対照の植物の表現型と観察結果を比較すること を含む、植物における標的ヌクレオチド配列と関連する表現型の特徴を評価する
    方法。
23. 【請求項２３】 請求項１ないし２１のいずれか一項に記載された方法の 使用を含む、植物における標的ヌクレオチド配列の発現を制御する方法。
24. 【請求項２４】 請求項１ないし２１のいずれか一項に記載された方法の 使用を含む、植物の表現型を全身的に変更する方法。
25. 【請求項２５】 （i）ウイルスレプリカーゼをコードし、 （ii）導入細胞の細胞質で複製されるように、標的ヌクレオチド配列またはその
    相補配列と配列同一性を有し、かつ、前記レプリカーゼに認識される一つ以上の
    シス作用成分に連結された複製可能な配列をコードし、 （iii）細胞内のウイルスの移動を媒介することができるタンパクをコードしな い ヌクレオチド配列に、機能的に連結されたプロモーターを含む核酸構成物。
26. 【請求項２６】 ＤＮＡプラスミドである、請求項２５記載の構成物。
27. 【請求項２７】 Ｔｉプラスミドベクターである、請求項２６記載の構成 物。
28. 【請求項２８】 植物細胞に請求項２５ないし２７のいずれか一項に記載 の構成物を導入する工程を含む、植物において全身性遺伝子鎮静シグナルを産生
    する方法。
29. 【請求項２９】 構成物によって産生されたシグナルが、当該構成物を欠 く条件で安定に維持される、請求項２８記載の方法。
30. 【請求項３０】 請求項２５ないし２７のいずれか一項に記載された構成 物を含む植物細胞。
31. 【請求項３１】 請求項３０に記載された植物細胞を含む植物。
32. 【請求項３２】 請求項１ないし２１のいずれか一項に記載の方法に従っ て鎮静された標的ヌクレオチド配列を含む植物。