HUT63440A

HUT63440A - Proccess for producing thrombin inhibitors based on amino acid sequence of hirudine and pharmaceutical compositions comprising same

Info

Publication number: HUT63440A
Application number: HU923968A
Authority: HU
Inventors: John Dimaio; Feng Ni; Yasuo Konishi
Original assignee: Ca Nat Research Council
Priority date: 1990-06-15
Filing date: 1991-06-14
Publication date: 1993-08-30
Also published as: DE69128247T2; EP0536177B1; FI925696A0; JPH06500073A; ATE160356T1; NO309040B1; AU654820B2; DK0536177T3; NO924834D0; CA2085465C; WO1991019734A2; WO1991019734A3; DE69128247D1; FI925696A; NO924834L; EP0536177A1; KR100212162B1; JP2669510B2; AU8085591A; ES2111567T3

Description

hirudin aminosavszekvenciáján alapuló trombin-inhibitoezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására

JTIíEF'NATIONAL

RESEARCH COUNCIL OF CANADA,

Montreal

Kanada

A bejelentés napja: 1991. 06. 14.

u </

Elsőbbsége: 1990. 06. 15. (/538 322)

Amerikai Egyesült Államok

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/CA91/00213

KIVONAT

A találmány tárgya eljárás trombin inhibitor és ezt tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására. A találmány szerint előállított trombin inhibitor egy első, a trombinnak a proteolízisért felelős katalitikus helyével kölcsönhatásba lépő hidrofób részből, és egy második részből áll, amely az N-acetilhirudin^45-65 C-terminális nem-katalitikus régiójánál lévő natív hirudin 55-60 aminosavak hidrofób és savas jellegét legalább megőrzi; és az első és második rész között egy bivalens összekötő egység van, amelynek lánca legalább 10 szénatomos. Előnyösen a terjedelmes hidrofób rész legalább egy D-konfigurációjú aminosavat tartalmaz.

A találmány szerint előállított vegyületek és az ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények trombotikus rendellenességek kezelésére alkalmasak.

KÉPVISELŐ:

DANUBIA SZABADALMI ÉS

VÉDJEGY IRODA KFT

9 6 8 ' 9 2 KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY t 04 V ki 4 °

Á 6A K

E1járás hirudin aminosavszekvenciáján alapuló trombin-inhibitorok, és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására TITtí NATIONAL RESEARCH COUNCIL OF CANADA, Montreal, Kanada

Feltalálók:

DIMAIO, John,

NI, Feng,

KONISHI, Yasuo

Montreal, Quebec

Pierrefonds, Quebec

St-Laurent, Quebec

Kanada

A bejelentés napja: 1991. 06. 14.

C í

Elsőbbsége: 1990. 06. 15. (Í538 322)

Amerikai Egyesült Államok

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/CA91/00213

A nemzetközi közzététel száma: WO 91/19734

A találmány tárgyát trombin inhibitorokként hasznos peptidszármazékok képezik. Ezek a peptidek a hirudin 45-65. aminosav jait tartalmazó szegmensének szekvenciáján alapulnak, és az alkalmas módosítások folytán a megfelelő natív peptid fragmentuménál három nagyságrendig terjedő mértékben nagyobb kötődéssel bírnak. A találmány szerinti peptideket bifunkciós trombin inhibitorokként jelöljük, mivel a trombin molekula két különböző kötőhelyéhez kapcsolódnak.

A trombin a vér koagulációs kaszkád fontos szerin proteináz komponense. Amellett, hogy a fibrinogén hasításával megindítja a vér alvadását, a trombin más hemokoaguláló faktorokat, köztük az (V), (VIII) és (XIII) faktorokat, valamint a protein C antikoaguláns enzimet aktiválja. A trombin ezen kívül hatásos vérlemezke aktivátor is, ami in vivő gyengíti a szövet-plazminogén-aktivátor által közvetített trombolízist. így a trombin pozitív visszaható szabályozása a vérzéscsillapítás fokozására szolgál, de életveszélyes vérrögöket okoz az ér és agyi ér artériák rendellenességeire adott válaszként.

Ennek az enzimnek a különböző funkciói folytán az enzim gátlása hatásos és fajlagos vegyületekkel felbecsülhetetlen hozzájárulás lenne a trombózissal kapcsolatos rendellenességek kezeléséhez. Ezen rendellenességek közé tartoznak a koronáriás artéria megbetegedések, az agyi ér megbetegedések, a perifériás artériák elzáródásával kapcsolatos megbetegedések, a mélyvénás trombózis és a tüdőembólia.

A trombin leghatásosabb inhibitoraként a hirudin ismert, amely pióca (Hirudo Medicinalis) mirigyváladékából izolált izoproteinek egy családja. A hirudin antikoaguláns tulajdonságai régóta ismertek. Ez ideig azonban igen kevés terápiás értékkel bírt, mivel ennek a proteinnek jó hatékonyságú, adagolható formában való formálása nehezen megoldhatónak tűnik, mivel mind a bélen, mind a bőrön át történő abszorpciója igen alacsony, ezért ez ideig nem volt lehetséges a véráramban a protein megfelelő szintjének elérése.

Továbbá, a pióca extraktumból izolált hirudin klinikai felhasználása nem valószínű korlátozott mennyisége, költségessége, valamint a hirudin méretével bíró idegen proteinek adagolásakor szokásosan jelentkező allergiás reakciók miatt.

Közleményében [Pharmacology of selective thrombin inhibitors, Nouv. Rév. Fr. Hematol., 30, 161-165 (1988)] Markwardt további klinikai információkat ad a hirudinról, amelyeket természetes és szintetikus trombin inhibitorokkal végzett farmakológiai vizsgálatainak eredményeire alapoz.

Általános észrevételeit közli a hirudinra vonatkozóan, megemlíti, hogy a peptid, amely erősen savas c-terminális részt tartalmaz, igen specifikus α-trombinra. Arra a következtetésre jut, hogy a hirudin C-terminális egysége feltehetően az enzim anionos kötő—hely tartományában kötődik, míg a tömör Nterminális rész feltehetően az enzim aktív hely tartományához kötődik.

Arra a felismerésre jutottunk, hogy a natív deszulfohirudin45_₆5 mind marha, mind ember α-trombinjának fibrinogén által történő kicsapását dózisfüggő módon gátolja. A marha a-trombinra kapott 940±200 nmól/liter IC5Q érték jó egyezésben van az azonos fragmentumra közölt plazma fibrin alvadék képzés értékkel, és háromszor alacsonyabb, mint a hirudin^55-65 esetén, amelyet úgy jelöltek meg, mint az antikoaguláns aktivitáshoz szükséges minimális mag. Azt is megfigyeltük, hogy ugyanazok a peptidek következetesen hatásosabbak voltak humán a-trombinnal szemben, mint marha α-trombinnal szemben.

A szakirodalomban korábban számos esetben kimutatták, hogy a hirudin aminosav-szekvenciájának aktív fragmentuma feltehetően a 45-65. aminosavakat magában foglaló aminosav-szekvencia. Ennek folytán kísérleteket tettek a peptid gátló aktivitásának fokozására azáltal, hogy az ebben a szekvenciában jelenlévő aminosavak némelyikét helyettesítették.

Krstenansky és munkatársai az Antithrombin properties of C-terminus of hirudin using synthetic unsulfated Na-acetyl-hirudin szakirodalmi helyen [Febs. Letters, 211, (1) 10-16 (1987)] a szulfatálatlan Na-acetil-hirudin45_g5 C-terminális fragmentumának szintézisét ismertetik. A szerzők egy korábbi munkára hivatkoznak [Chang, J.-V., FEBS Letters, 164. 307 (1983)], és megemlítik, hogy ez a fragmentum feltehetően két fajlagos kötő domént tartalmaz, az egyik a trombin katalitikus helyéhez kötődik, a másik a trombin egy másik felismerő helyéhez. A szerzők arra a következtetésre jutottak, hogy ez a feltételezés nem helytálló.

A szerzők mégis kimutatták, hogy a hirudin 45-65 szekvenciája a véralvadás aktivitását gátló hatással bír, valamint gátolja a fibrinopeptid A trombin által való szabaddá tételét. Azt is feltételezik, hogy a hirudin45_g5 azonos szekvenciája nem vehet közvetlenül részt a trombin katalitikus helyével való kötődésben, mivel a trombinnak szintetikus szubsztrátok irányában kifejtett amidolitikus jellemzői zavartalanok.

:

- 5 Krstenansky és munkatársai az Anticoagulant peptides: natúré of the interaction of the C-terminal region of hirudin with a noncatalytic site on thrombin című közleményükben [J. Med. Chem., 30, 1688-1691 (1987)] közlik, hogy a trombin minimális aktív szekvenciája a nem-katalitikus kötési helyen a hirudin56_64. Erre a feltételezésre alapozva a szerzők néhány Cterminális hirudin54_55 analóg szintézisét, valamint ezek trombin által kiváltott fibrin alvadék képzés gátlásában való hatásosságát ismertetik annak érdekében, hogy megállapítsák a hirudin₅₆_₆4 és a trombin nem-katalitikus kötési helye közötti kölcsönhatás természetét.

Következtetésükben a szerzők megemlítik, hogy a hirudin Cterminális régiója kötődhet a fibrinogénnek egy olyan, a trombinon kötődő régiójához, amely nem azonos azzal a régióval, amelyet a szakirodalomban a korábbiakban ilyenként ismertettek.

Dodt és munkatársai az Interaction of site specific hirudin variants with α-thrombin című közleményükben [Febs Letters, 229 (1), 87-90 (1988), Degryse és munkatársai, Point mutations modifying the thrombin inhibition kinetics and antithrombotic activity in vivő of recombinant hirudin című közleményükben [Protein Engineering, 2, (6), 459-465 (1989)] és

Braun és munkatársai: Use of site-directed mutagenesis to investigate the hasis fór the specificity of hirudin című közleményükben [Biochemistry, 27, 6517-6522 (1988)] hirudin génen végrehajtott helyspecifikus mutáció eredményeit ismertetik. Tanulmányozzák thrombin gátlását a mutáns hirudin peptidek által.

A fenti közleményekben a szerzők olyan mutációkra vonatkozó vizsgálatokat ismertetnek, amelyeket a teljes proteinre vonatkozóan hajtottak végre, nem pedig a hirudin 45-65. szegmensére korlátozottan. Továbbá, a 45-65. szegmensen végrehajtott módosítások egyetlen módosításra korlátozódnak, szokásosan a 47-helyzetben, annak bemutatására, hogy ez az egység nincs kölcsönhatásban az aktív hellyel, bár a fenti közleményekben bemutatnak az 51, 57, 58, 61 és 62 helyzetekre vonatkozó mutációkat is.

Hasonló módon, Dodt és munkatársai, a Distinct binding sites of Ala⁴⁸-Hirudin^1-47 and Ala⁴⁸-Hirudin^48-65 on a-thrombin című közleményükben [The Journal of Biological Chemistry, 265, (2) 713-718 (1990)] olyan vizsgálatokat írnak le, amelyek célja a hirudin szekvenciájának 48-as helyzetében létrehozott helyspecifikus mutáció. Úgy tűnik, hogy az a munka, amelyet Dodt és munkatársai végeztek, arra korlátozódik, hogy ebben a helyzetben prolin helyére alanint vigyenek be annak érdekében, hogy megkönnyítsék a vizsgálataikhoz szükséges proteolízist.

Végül Maraganore és munkatársai az Anticoagulant activity of synthetic hirudin peptides című közleményükben [The Journal of Biological Chemistry, 264, 15, 8692-8698 (1989)], Dennis és munkatársai a Use of fragments of hirudin to investigate thrombin-hirudin interaction című közleményükben [Eur. J. Biochem. 188, 61-66 (1990)] és Chang és munkatársai a The structural elements of hirudin which bind to the fibrinogen recognition site of thrombin are exclusively located within its acidic C-terminal tail című közleményükben [Febs., 261 (2), 287-290 (1990)] számos olyan peptid szintézisét és antikoaguláns tulajdonságait írják le, amelyek szekvenciája a natív hirudin különböző fragmentumainak szekvenciáján alapul.

Az antikoaguláns tulajdonsággal bíró vegyületek értékes terápiás szerek, amelyek különféle patológiás állapotok kezelésére használhatók. Azok közül a legfontosabb állapotok közül, amelyekben az antikoaguláns kezelés használható, külön megemlítjük a miokardiális infarktust, a tüdőembóliát és az agyi erek megbetegedéseit, a mélyvénás trombózist, és más trombóliás rendellenességeket.

A jelenleg beszerezhető antikoagulánsok számos tekintetben nem kielégítőek. például a heparint trombin aktivitásának gátlására alkalmazták, ezért olyan állapotok kezelésére használták, mint a vénás trombózis és a tromboembólia. Azonban a heparin számos olyan nemkívánt mellékhatással bír, amely egy kedvezőbb toxicitási szinttel bíró antikoaguláns szükségességét igazolja.

A trombin olyan alacsony molekulatömegű és fajlagos inhibitorainak létrehozása, amelyek a katalitikus központtól távoli vagy azzal kapcsolatos járulékos kötőhelyeket hasznosítanak, hasonlóan ahhoz, ahogy a fibrinogén vagy a hirudin kötődik a trombinhoz, a protein-kémiában még megoldásra váró feladat. Feltehetően egy ilyen többfunkciós inhibitor két vagy több felismerő elemet foglal magában, amelyeket egy megfelelő elválasztó egység (spacer) választ el egymástól, és amely többszörös egyidejű kölcsönhatásoknak kedvez, valamint amely fokozott aktivitású és fajlagosságú. Ha egy alacsony molekulatömegű szerkezetbe idegen kémiai elemeket építenénk be, ez a szerkezetnek proteolízissel szembeni ellenállást és kedvező biológiai hozzáférhetőséget adhatna.

A találmány szerinti trombin inhibitorok két részből

tevődnek össze, egy terjedelmesebb hidrofób részből és egy erősen savas részből, amelyeket egymáshoz egy megfelelő összekötő egység (linker) kapcsol. Ebben a legtágabb értelmében a találmány az (I) általános képletű peptidekre vonatkozik - a képletben

X jelentése egy hidrofób csoport;

B jelentése egy hidrofób aminosav maradéka;

D jelentése lineáris, 2-4 szénatomos szénlánc, amely adott esetben rövidszénláncú alkilcsoporttal helyettesített, vagy D jelentése p-fenil-metil- vagy p-fenil-etil-csoport;

Y jelentése karbonilesöpört, D- vagy L-konfigurációjú hidroxi-metil-csoport, vagy -CH2-;

Z jelentése kétértékű egyenesláncú összekötő egység, amelynek lánchossza legalább 10 atomos, és abban az esetben, ha Y jelentése karbonilesöpört vagy hidroxi-metil-csoport, az Y helyettesítő szénatomjával szomszédos atom lehet helyettesítő nélküli vagy fluoratommal mono- vagy diszubsztituált, továbbá Z lehet egy olyan szénlánc, amelyet egy vagy több -0-, -S-, -NH-, karbonil-, észter- vagy amidcsoport szakít meg, és ez a helyettesítő adott esetben egy vagy több helyettesítőt hordozhat, amelyek jelentése alkil-, alkoxi-, alkoxi-alkil-, aril- vagy aralkilcsoport, amelyek további helyettesítőként amid-, hidroxi-, imidazol- vagy karboxilcsoport vagy halogénatom helyettesítőket hordozhatnak, a lánc terminális atomja egy szénatom, amely egy olyan karbonilcsoport része, amely a G L-a-aminosawal peptidkötést alkot;

- 9 G és G' azonos vagy különböző, jelentésük L-a-aminosav, amelynek pK értéke 5 vagy az alatti;

X' jelentése hidrofób L-a-aminosav;

Q jelentése egy L-a-aminosav vagy egy gyűrűs L-iminosav maradéka;

W jelentése hidrogénatom, vagy egyenes vagy elágazó láncú alkil-, aril- vagy aralkilcsoport;

R jelentése 1-5 aminosavból álló hidrofób csoport vagy alkil-, aril- vagy aralkilcsoport, amelyek egy karboxilvagy amid-funkcióval helyettesítettek lehetnek, vagy

R jelentése Glu-Glu-Phe-Leu-R', Glu-Glu-Phe-Leu-Gln-R',

c	C
Glu-Glu-Phe-Leu-Glu-R',

C

ahol
0	0	0
II	II	II
C jelentése H, OH, -O-S-OH,	-CHo-S-OH vagy	-O-P-OH vagy
II	II	II
0	0	0

O

II

-ch₂-p-oh,

II o

amely helyettesítők a fenilgyűrűhöz para-helyzetben kapcsolódnak, vagy

R és R· azonos vagy különböző, jelentésük egy aminosav, vagy egy

-Ν' általános képletű amincsoport, ahol R₂ és R3 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, rövidszénláncú alkil-, aril- vagy alkoxi-alkil-csoport, vagy R₂ és R₃ a nitrogénatommal, amelyhez kapcsolódnak, egy 5-6-tagú gyűrűt alkothatnak, amely gyűrű adott esetben egy további heteroatomot tartalmazhat, a lehetséges heteroatom -0-, —S— vagy -NH-, vagy

R’ jelentése hidroxilcsoport, amely Leu-hoz kapcsolódva egy karboxilcsoportot alkot, valamint ezek terápiás szempontból elfogadható sói.

Arra a felismerésre jutottunk, hogy a 45-65 helyzetű egységeket magában foglaló natív hirudin fragmentum egyidejűleg képes kölcsönhatásba lépni a trombinon lévő két független és távoli hellyel, az egyik hely egy vélt anion exozit, míg a másik egy a proteolízisért felelős katalitikus hely. Ez a kötési mód szimulálja ugyan a natív hirudin molekula kötődési mechanizmusát, amely a trombin aktív helyével három N-terminális egységével lép kölcsönhatásba, de különbözik attól. így, úgy tűnik, hogy a 45, 46 és 47 számú egységek nem szolgálnak kötési helyként a natív proteinben, de az N-terminális mag hiányában térbelileg helyes kölcsönhatásra hajlamosak, bár a kölcsönhatás gyenge.

A fenti megfigyelés alapján olyan új peptideket szintetizáltunk, amelyek a molekula mindkét inhibitor komponensében módosításokkal bírnak, és amelyek antitrombin aktivitása bármely

rész önmagában kifejtett aktivitását meghaladja. Továbbá, az újonnan létrehozott könnyen hasítható kötés kémiai módosításával aktívabb vegyületek nyerhetők, amelyek előnyös tulajdonságai, hogy proteolitikusan stabilak trombinnal szemben. A peptidek hasznos antikoagulánsok, és gátolják a vérlemezke aggregálódást, ezáltal csökkentik az artériás trombózis és más rokon kardiovaszkuláris megbetegedések rizikófaktorát.

Ennek folytán azt találtuk, hogy a hirudin₄5_g5 antikoaguláns jellemzői lényegesen fokozódnak, ha az N-acetilhirudin₄₅_65 N-terminális katalitikus részét úgy módosítjuk, hogy beviszünk egy nagy terjedelmű hidrofób részt, előnyösen olyan részt, amely legalább egy D-konfigurációjú aminosavat tartalmaz, oly módon, hogy egy nem-proteogén pszeudodipeptidet, előnyösen arginil-glicin egy izoszterjét építjük be a 47-48helyzetbe, és legalább fenntartjuk a natív hirudin 55-60 aminosavjainak hidrofil jellegét az N-acetil-hirudin^45-65 C-terminális nem-katalitikus részében.

A találmány szerinti vegyületek ezért olyan peptideket tartalmaznak, amelyek megfelelnek a hirudin 45-65 egységeit magában foglaló karboxil dóménjének, de nem korlátozódnak erre.

A találmány tárgyát képezi egy a trombotikus rendellenességek tüneteinek kezelésére szolgáló készítmény is. Ez a készítmény az (I) általános képletű peptidszármazék hatékony mennyiségét tartalmazza gyógyászati szempontból elfogadható hordozóanyaggal elegyítve.

A találmány tárgyát képezi továbbá trombózissal kapcsolatos érmegbetegedések kezelésére vagy megelőzésére szolgáló módszer is. A módszer abban áll, hogy a betegnek az (I) általános ♦ ·-· *

- 12 képletű peptidszárinazék és gyógyászati célra alkalmas hordozóanyag elegyét tartalmazó készítmény hatásos mennyiségét adagoljuk.

A találmány tárgyát képezi egy eljárás a trombolitikus szerrel kezelt beteg vér-újraáramlási idejének csökkentésére vagy újraelzáródási idejének növelésére. Az eljárás abban áll, hogy a betegnek az (I) általános képletű peptidszármazék, egy trombolitikus szer és egy gyógyászati célra alkalmas hordozóanyag elegyét tartalmazó készítmény hatékony mennyiségét adagoljuk.

Az alábbiakban az ábrákat ismertetjük.

Az 1. ábrán normál humán plazma aktivált parciális tromboplasztin idejének és protrombin idejének gátlási görbéit mutatjuk be P53, P79, P102 és P103 peptidek és r-hirudin (HV-2) esetén.

A 2. ábrán trombinnal aktivált vérlemezke aggregálódás gátlását mutatjuk be P79 peptid hatására.

A 3. ábrán különböző polipeptidek plazmában mért stabilitását mutatjuk be.

A 4. ábrán normál humán plazma protrombin idejének gátlási görbéjét mutatjuk be P79, P184 és P185 peptidek esetén.

A találmányt az alábbi részletes leírásban ismertetjük közelebbről.

A célszerűség kedvéért a találmány szerinti peptidszármazékokat a következőkben egyszerűen peptidekként jelöljük.

A maradék megjelölésen, amennyiben azt egy a-aminosav esetén alkalmazzuk, egy a megfelelő α-aminosavból oly módon származó csoportot értünk, hogy a karrboxilcsoportról egy

- 13 hidroxilcsoportot, és az α-aminocsoportról egy hidrogénatomot eltávolítunk.

Az egyes maradékok jelölésére alkalmazott rövidítések a IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature [Biochemistry, 11. 1726-1732, (1972)] ajánlásai szerintiek. Az aminosav” megjelölésen a természetben előforduló aminosavakat, valamint nem-természetes analógjaikat is értjük, továbbá azokat az aminosavakat, amelyek a kémiai szintézisekben és peptidkémiában jártas szakember által szokásosan használtak. A nem-természetes aminosavak felsorolása megtalálható a következő szakirodalmi helyen: The Peptides, 5. kötet, 1983, Academic Press, 6. fejezet, D. C. Roberts és F. Vellaccio.

A proteogén vagy nem-proteogén α-aminosav megjelölésen azokat az aminosavakat értjük, amelyeket szakember szokásosan alkalmaz a peptidkémiában, ezek közé tartoznak a természetes előfordulású α-aminosavak, de a fenti kifejezések nem korlátozódnak ezekre. A természetben előforduló aminosavak a glicin (Gly), alanin (Alá), valin (Val), leucin (Leu), izoleucin (Ile), szerin (Ser), metionin (Met), treonin (Thr), fenilalanin (Phe), tirozin (Tyr), triptofán (Trp), cisztein (Cys), prolin (Pro), hisztidin (His), aszparaginsav (Asp), glutaminsav (Glu), aszpargin (Asn), glutamin (Gin), arginin (Arg), ornitin (Orn) és a lizin (Lys).

A hidrofób aminosav megjelölésen általában egy olyan savat értünk, amely az α-szénatomhoz kapcsolódva egy alkil- vagy arilcsoportot hordoz. így például a glicin, amelyben nem található ilyen csoport az α-szénatomhoz kötötten, nem hidrofób aminosav. Az alkil- vagy arilcsoportok kölcsönzik az aminosavnak a * t ««4·

0..J ..

• ·· · • · • ··

- 14 hidrofób jelleget. Az alkil- vagy arilcsoportok helyettesítettek lehetnek, feltéve, ha a helyettesítő vagy helyettesítők nem károsak a sav általános hidrofób jellegére. Előnyösen a vízben való oldhatóvá tételt szolgáló helyettesítők, például a -OH, -COOH és -NH₂ csoportok kerülendők. A hidrofób aminosavak közé tartoznak természetes aminosav-maradékok, például alanin, hisztidin, izoleucin, leucin, fenilalanin, triptofán, tirozin, továbbá nem-természetes aminosavak, így például azok, amelyeket a következő szakirodalmi helyen ismertetnek: The Peptides, 5. kötet, 1983, Academic Press, 6. fejezet, D.C. Roberts és F. Vellaccio. példaként említhetjük a β-(2- és 3-tienil)-alanint, a β-(2- és 3-furanil)-alanint, a β-(2- és 3- és 4-piridil)-alanint, a ciklohexil-alanint és a SubPhe-t. A SubPhe jelölés jelentése az aromás gyűrűn helyettesítőket hordozó fenilalanin maradék. Az aminosavkémiában jártas szakember számára szokásos helyettesítők a halogének (fluorid, bromid és klorid), elektronszívó csoportok (például nitrocsoport), vagy rövidszénláncú alkil vagy aril helyettesítők a 2-, 3- vagy 4-helyzetben. Megjegyezzük, hogy ha más megjelölés nem szerepel, a találmánnyal összefüggésben említett aminosavak L-konfigurációjúak.

Az alkil megjelölésen előnyösen 1-6 szénatomos alkilcsoportokat értünk, például metil-, etil-, propil- vagy butilcsoportot. Ha más megjelölés nem szerepel, a 3 vagy több szénatomot tartalmazó alkilcsoportok egyenes vagy elágazó láncúak is lehetnek.

A találmány tárgyát trombin inhibitorokként alkalmazható peptidek képezik. A találmány tárgyát képező peptidek az (I) általános képlettel jellemezhetők. A képletben

- 15 X jelentése egy hidrofób csoport;

B jelentése egy hidrofób aminosav maradéka;

Z jelentése bivalens egyenesláncú összekötő egység, amelynek lánchossza legalább 10 atomos, és abban az esetben, ha Y jelentése karbonilcsoport vagy hidroxi-metilcsoport, az Y helyettesítővel szomszédos szénatomnak helyettesítő nélkülinek vagy fluoratommal egyszeresen vagy kétszeresen helyettesített lehet, továbbá Z helyettesítő lehet egy olyan szénlánc, amelyet egy vagy több -0-, -S-, -NH-, karbonil-, észter- vagy amidcsoport szakít meg, és egy vagy több helyettesítőt hordozhat, amely helyettesítők jelentése alkil-, alkoxi-, alkoxi-alkil-, aril- vagy aralkil-csoport, amelyek további helyettesítőket hordozhatnak, ezek amid-, hidroxil-, imidazolil- vagy karboxilcsoport vagy halogénatomok, és a lánc terminális atomja egy olyan szénatom, amely egy a G L-a-aminosawal peptidkötést alkotó karbonilcsoport része.

A találmány egyes megvalósítási módjainál a Z helyettesítőt - legalább részben - normál peptidkötésekkel kapcsolódó a-aminosavak alkotják, és ezek lehetnek a natív hirudin 49-54 aminosav jai;

G és G* azonos vagy különböző, jelentésük egy L-a-aminosav, amelynek ppK értéke mintegy 5 vagy annál alacsonyabb;

X' jelentése hidrofób L-a-aminosav;

Q jelentése egy L-a-aminosav vagy egy gyűrűs L-iminosav maradéka;

R jelentése 1-5 aminosavból álló hidrofób csoport vagy alkil-, aril- vagy aralkilcsoport, amelyek egy karboxilcsoporttal vagy amid-funkcióval helyettesítettek lehetnek, vagy jelentése Glu-Glu-Phe-Leu-R',

I c

Glu-Glu-Phe-Leu-Gln-R' ,

I c

Glu-Glu-Phe-Leu-Glu-R',
1 c
ahol
0	0	0
II	II	II
C jelentése H, OH, -O-S-OH,	-CHn-S-OH vagy	-O-P-OH vagy
II	II	II
0	0	0

II

-ch₂-p-oh,

II o és a C helyettesítőként álló csoportok a fenilgyűrűn para-helyzetben helyezkednek el; és

R’

R' jelentése Leu-hoz kapcsolódó hidroxilcsoport, amellyel karboxilcsoportot alkot, vagy terápiás szempontból megfelelő sója, vagy jelentése egy aminosav, vagy egy amincsoport, amely az ·*·· ·♦ • «

<*·· ^r2 általános képlettel jellemezhető, a képletben R2 és R3 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, rövidszénláncú alkil-, aril- vagy alkoxi-alkil-csoport, és ezek a helyettesítők egymással összekapcsolódva 5- vagy 6-tagú gyűrűt alkothatnak, amely gyűrű adott esetben egy további heteroatomot tartalmazhat, a lehetséges heteroatom -0-, -S- vagy -NH- lehet.

Az (I) általános képletű peptidek előnyös körét képezik azok, amelyekben X jelentése D-konfigurációjú hidrofób a-aminosav. Az X helyettesítőként álló sav peptidkötéssel kapcsolódik a B a-aminosavhoz. Más megoldás szerint X jelentése egy másik nagy, hidrofób csoport, amely a B sav α-aminocsoportjának nitrogénatomjához kapcsolódik, ilyen csoport lehet például egy aril-szulfonil-csoport;

B jelentése egy L-konfigurációjú hidrofób a-aminosav maradéka, vagy egy olyan gyűrűs iminosav maradéka, amely a gyűrűhöz kapcsolódva adott esetben egy vagy több alkilcsoport helyettesítőt hordoz, amelyek egymással összekapcsolódva gyűrűs szerkezetet alkothatnak;

D jelentése p-fenil-metil-, ρ-fenil-etil-, etilén-, butilén- vagy propiléncsopport.

NH₂

A -D-NH-C egység fontos jellemzői hossza és

NH bázikussága. Ha az (I) általános képletű vegyületek szintézise során L-arginint alkalmazunk, olyan megfelelő szterokémiájú (I) általános képletű vegyületet nyerünk, amelyben D jelentése 1,3-propilén. Ha L-homoarginint alkalmazunk, olyan vegyületet nyerünk, amelyben D jelentése 1,4-butilén. Ha L-norarginint alkalmazunk, olyan vegyületet nyerünk, amelyben D jelentése 1,2-etilén. Ha 4-guanidinil-L-fenilalanint alkalmazunk, olyan vegyületet nyerünk, amelyben D jelentése p-fenil-metil-csoport. Ha

4-guanidil-L-homofenilalanint alkalmazunk, olyan vegyületet nyerünk, amelyben D jelentése p-fenil-etil-csoport;

Y jelentése karbonilesöpört;

Z egy 12 - 40, előnyösen 20 atomos lánc;

G és G* jelentése Asp, Glu, vagy (1) vagy (2) általános képletű csoport, ahol n értéke 1 vagy 2;

X’ jelentése L-Phe, L-4FPhe vagy L-4ClPhe;

Q jelentése prolin, pipekolinsav, szarkozin vagy Glu;

W jelentése hidrogénatom vagy a piperidin- vagy pirrolidingyűrű 3-, 4- vagy 5-helyzetében kapcsolódó rövidszénláncú alkil-, aril- vagy aralkilcsoport helyettesítő;

R jelentése Glu-Glu-Phe-Leu-R' vagy Leu-R', ahol

I c

oo

IIII

C jelentése hidrogénatom, -CH₂-S-OH, -OH, -O-S-OH, vagy

IIII

O0 oo

IIII

-O-P-OH, vagy CH₂-P-OH,

IIII οo a C helyettesítő a fenilgyűrű para-helyzetében kapcsolódik; és R’ jelentése hidroxilcsoport vagy « ·

ahol R₂ és R3 egyenes vagy elágazó láncú, 1-6 szénatomos csoport, a két csoport egy 5- vagy 6-tagú gyűrűvé kapcsolódhat össze.

Az (I) általános képletű peptidek egy még előnyösebb csoportja az, amelyben

X jelentése -D-Phe, D-4FPhe vagy D-4ClPhe, ahol az a-aminosav acetilezéssel vagy benzoilezéssel semlegesített, vagy

X jelentése naftalinszulfonil-, benzolszulfonil- vagy toluolszulfonil-csoport;

B jelentése Val, pipekolinsav vagy Pro;

W jelentése hidrogénatom vagy rövidszénláncú alkilcsoport, arilcsoport vagy aralkilcsoport helyettesítő, a gyűrű 3-,

4— vagy 5-helyzetében ha B jelentése Pro vagy pipekolinsav,

D jelentése propilén-csoport, vagy fenil-metil-csoport;

Y jelentése karbonilcsoport,

II

Z jelentése -(CH₂)_nC-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-, ahol n értéke 1 és 4 közötti egész szám, a natív hirudin^48-54 szekvenciája vagy egy szintetikus elválasztó egység, amelynek képlete

ahol η

értéke 1 és 4 közötti egész szám; és jelentése egy hexapeptid vagy egy telített vagy telítetlen alkillánc, amely egy hexapeptid 18 vagy kevesebb atomjának megfelelő.

Előnyösen a Z összkötő egység a (3) általános képletnek megfelelő, ahol n és m 1 és 4 közötti egész számok; és

Aj és A2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, vagy dehidrogén a cisz- vagy transz-konfigurációban; azzal a megkötéssel , hogy ha m értéke 1, n értéke 3 vagy 4;

ha Αχ, és A₂ jelentése dehidrogén, akkor Z a (4) általános képletnek megfelelő, ahol n és ρ 1 és 4 közötti egész számok. így a találmánnyal kapcsolatosan alkalmazott összekötő egységnek legalább olyan hosszúnak kell lennie, hogy lehetővé tegye, hogy az (I) általános képletű peptid két különböző, egymástól független kötőhellyel lépjen kölcsönhatásba, amely kötőhelyeket a trombin felületén egymástól egy kritikus távolság (mintegy 15 Á) választ el. Ezért a Z helyettesítő olyan összekötő egység, amelyben az atomok összes száma azonos a hirudin⁴⁹”⁵⁴ aminosav-szekvencia megfelelő atomszámának vagy annál alacsonyabb; és

R jelentése Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH, Leu-OH vagy Glu-Glu-Tyr-Leu-R', ahol R' jelentése hidroxilcsoport vagy egy

N általános képletű csoport, ahol R₂ jelentése -CH3 vagy fenetilcsoport,

R3 jelentése hidrogénatom, vagy -CH3, vagy R₂ és R₃ egymással összekapcsolódva -CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂- vagy -CH₂-CH₂-O-CH₂-élcsoportot alkot.

Az (I) általános képletű vegyületeknek még előnyösebb körét

képezik azok a vegyületek, amelyekben
X	jelentése	D-Phe;
B	jelentése	prolin,
D	jelentése	propiléncsoport,
Y	jelentése	karbonilesöpört,
G	jelentése	Asp,
G'	jelentése	Glu,
X'	jelentése	Phe;
Q	jelentése	Glu vagy Pro;
z	0 II jelentése -(CH₂)₂-C-Gln-Ser-His-Asp-Asp-Gly, -Ser-His-Asp-Asp-Gly-,	0 II -(CH₂)₃-C-Gln-

II

-(CH₂)4-C-Gln-Ser-His-Asp-Asp-Gly-,

0o

IIII

-(CH₂)4C-(NHCH₂CH=CHCH₂C)-, oo

IIII “(CH₂)₄C-(NHCH₂CH=CHCH₂C)₂-, vagy

0O

IIII “(CH₂)4C-(NHCH₂CH=CHCH₂C)3-;

W jelentése hidrogénatom, n-butil- vagy metilcsoport és

R jelentése Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH vagy -Leu-OH.

Arra a felismerésre jutottunk, hogy a rövidebb peptidek, például a Glu⁶¹, Glu⁶², Tyr⁶³ és Gin⁶⁵ aminosavakat nem tar22 talmazó csonkolt” natív hirudin peptidek, érdekes biológiai jellemzőkkel bírnak. Mivel a csonkolt peptidek rövidebb molekulaként jobb biológiai hozzáférhetőséggel bírnak, kevésbé valószínű, hogy immunreakciókat váltanak ki, és kevésbé valószínű, hogy proteolízisen mennek át. Ezen kívül a rövidebb, kisebb molekulatömegű peptidek adagolása is könnyebb, továbbá általában abszorpciójuk is jobb, mint a hosszabb peptideké. Megjegyezzük még, hogy a szintetikus összkötő egységek alkalmazása megelőzi a peptidnek proteolízis révén való bomlását is.

A következőkben a találmány szerinti peptidszármazékok előállítását ismertetjük.

A találmány szerinti peptidszármazékok számos, szakember számára jól ismert eljárással előállíthatok. Szintetizálhatok például ezek a peptidek szilárdfázisú eljárással Stewart és munkatársai (Solid phase peptide synthesis, Freeman & Co., San Francisco, 1969] eljárása sszerint megfelelő peptidszintetizátorban.

Egyes esetekben azonban a találmány szerinti peptidek (i), (ii) vagy (iii) régiói szintetikus egységek lehetnek, amelyek előállítására kémiai szintézis szükséges azt megelőzően, hogy ezt az egységet más aminosawal kapcsolva a kívánt peptidet szokásos szilárdfázisú szintézissel előállítanánk. A leírás későbbi részében következő 1-6. példákban a kémiai szintézisnek egy olyan típusát mutatjuk be, amely az (i) régió egy előnyös megvalósítási módjának szintéziséhez szükséges, míg a 7. példában a (iii) régióban alkalmazott szintetikus összekötő egység szintézisét mutatjuk be. Nyilvánvaló, hogy a szerves kémiában jártas szakember könnyen előállíthatja azokat a kémiai egységeket, amelyek a találmány szerinti peptidek (i), (ii) és (iii) régióihoz szükségesek.

A találmány szerinti peptidek némelyikét egy Applied Biosystems 430A peptidszintetizátoron szintetizáljuk. Szilárdfázisú hordozóként BOC-GlnPAM gyantát (Applied Biosystems; 0,64 mmól/g) alkalmazunk. Az aminosav kapcsolást diciklohexil-karbodiimid/N-hidroxi-benzoltriazol alkalmazásával végezzük, a védőcsoportok eltávolítására 50 %-os metilén-kloridos trifluor-ecetsavat (TFA) alkalmazunk 3 percig, majd ezt további 20 perces ciklus követi. Az oldalláncokat védő csoportok a következők: Asp(Chx), Glu(Bzl), His(Bom), Arg(Tos), Tyr(2-BrZ), Ser(Bzl). A teljesen védett peptid-gyantát ezután -5 °C hőmérsékleten 60 percen át anizolt és dimetil-szulfidőt (10 térfogat%) tartalmazó folyékony hidrogén-fluoriddal kezeljük. A hidrogén-fluorid felesleegét nitrogéngáz áramban eltávolítjuk, a visszamaradó szilárd anyagot éterrel extraháljuk, és szűrjük. A gyantát jégecettel és vízzel háromszor extraháljuk, majd liofilezzük.

A következőkben a szintetikus peptidek tisztítását és elemzését ismertetjük.

A kapott liofilezett nyers peptideket homogenitásig tisztíthatjuk általánosan elfogadott peptid-tisztítási eljárásokkal. Egy alkalmas eljárás például a fordított fázisú kromatográfiás eljárás Vydac oktadecil-szilicium-dioxid üvegoszlopon (15 R, 1,5 x 30 cm, 27,6·10³ Pa), 500 ml A oldószerrendszer és 1 liter B oldószerrendszer lineáris gradiensének alkalmazásával (A oldószerrendszer: 500 ml, 0,1 %-os vizes trifluor-ecetsav, B oldószerrendszer, 0,1 % trifluor-ecetsavat tartalmazó 60 %-os vizes acetonitril). A frakciókat fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással elemezzük Varian LC berendezésen Vydac Cjg analitikai oszlop alkalmazásával, 215 nm-nél végzett detektálással. A 99 %-os-nál nagyobb tisztaságú frakciókat összegyűjtjük, és liofilizáljuk. A peptidtartalmat aminosavanalízissei határozzuk meg Beckman 6300 típusú aminosavanalizátoron. A mintákat ezután Waters Pico-Tag Work Station berendezésben szárítjuk. A fiolába 200 μΐ 1 % fenolt tartalmazó, állandó forrásban lévő hidrogén-kloridot adunk, és felváltva száraz nitrogénnel öblítjük, majd három átöblítés után vákuum alá helyezzük. Végül a mintát tartalmazó fiolát 1 órán át vákuumban 150 °C hőmérsékleten melegítjük. Ezután tömegspektrum-elemzést végzünk ionpermetező bevezető forrással felszerelt SCIEX API III spektrométeren.

így a találmány szerint szintetizált peptidek szerkezetét és szekvenciáját a pontos aminosav összetétel és a tömegspektrum alapján megerősíthetjük annak érdekében, hogy megállapítsuk, egyezést mutat-e a számított molekulatömeggel.

Az alábbi példák a találmány további megvilágítását szolgálják a korlátozás szándéka nélkül.

A példákban alkalmazott rövidítések jelentése a következő: BOC: terc-butoxi-karbonil; Tos: p-toluolszulfonil; CH₂C1₂.' metilén-klorid; TEA: trietil-amin; BOP: benzotriazolil N-oxi-trisz(dimeti1-amino)-foszfónium-hexafluorofoszfát; DMF: dimetil-formamid; EtOAc: etil-acetát; DCC: N,N'-diciklohexil-karbodiimid; DPPA: difenil-foszforil-azid; THF: tetrahidrofurán; HF: hidrogén-fluorid; CBZ: benzil-oxi-karbonil.

1. példa (2S)—2 —(BOC)-N-metoxi-N-metil-5-tozil-guanidino-pentánamid előállítása

428 mg, 1 mmól N^-BOC-NÓ-tozil-arginin 30 ml DMF-ban készült oldatához, amely oldat 0,4 ml, 3 mmól TEA-t és 146 mg,

1,5 mmól Ν,Ο-dimetil-hidroxil-amin-hidrogén-kloridot is tartalmaz, 0 °C hőmérsékleten, jégfürdőben hozzáadunk 500 mg, 1,1 mmól BOP reagenst [B. Castro, J.R. Dormoay, G. Elvin,

C.Selve; Tetrahedron Letters, 1975 (14), 1219-1222]. A reakcióelegyet 15 órán át 4 °C hőmérsékleten keverjük, majd az oldószert nagy vákuumban lepároljuk róla. A visszamaradó anyagot 50 ml EtOAc-ban oldjuk, és vízzel mossuk. A szerves fázist további három alkalommal 5 %-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, és három alkalommal 1 n hidrogén-kloriddal extraháljuk, majd nátrium-szulfáton szárítjuk. Az oldatot Celiten szűrjük, majd vákuumban bepároljuk. A koncentrátumhoz kevés hexánt adunk, így 500 mg cím szerinti vegyület válik ki fehér, szilárd anyag formájában. MS: M/Z = 472 (M+H)⁺.

2. példa

6-B0C-9-tozil-guanidino-l-nonén-5-on szintézise

600 mg, 1,3 mmól, az 1. példa szerint előállított termék 25 ml THF-ban készült oldatához 10 ekvivalens Grignard-reagenst adunk, amelyet 4-bróm-l-buténből állítottunk elő [a Grignard reagens előállításához 50 ml vízmentes éterben lévő 312 mg, 13 mmól magnéziumforgácshoz 1,75 g 4-bróm-l-butént csepegtetünk olyan sebességgel, hogy az elegy visszafolyató hűtő alatt enyhén forrásban legyen], majd a fém teljes elfogyása után a Grignard-oldatot argongáz alatt fecskendőben hozzáadjuk a THF elegyhez.

A kiindulási anyagnak vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat bizonysága szerint való eltűnése után a teljes THF elegyet vizes ammónium-klóriddal elegyítjük (a vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatot Kieselgél 60 F 254, Merek üveglemezeken végezzük). A fázisokat szétválasztjuk, a szerves fázist 1 n hidrogén-kloriddal, majd vízzel mmossuk, nátrium-szulfáton szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. A visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk, eluensként etil-acetát és hexán 4:1 arányú elegyét alkalmazzuk. így a cím szerinti vegyületet tiszta olaj formájában nyerjük. MS: M/Z = 469 (M+H)⁺.

3. példa

5- BOC-4-oxo-8-tozil-guanidino-oktánsav előállítása

2,5 g, 5,3 mmól, a 2. példa szerint előállított terméket 50 ml acetonitrilben oldunk, majd 8 g, 37,5 mmól nátrium-perjódát 50 ml vízben készült oldatát adjuk hozzá. Az elegyhez 100 mg ruténium-kloridot adunk, 1 órán át szobahőmérsékleten erőteljesen keverjük, ez idő elteltével vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat szerint már nem figyelhető meg kiindulási anyag jelenléte. Az elegyet 100 ml vízzel és 100 ml éterrel hígítjuk. A fázisokat elkülönítjük, a vizes fázist éterrel tovább extraháljuk. Az egyesített szerves extraktumokat vízzel mossuk, nátrium-szulfáton szárítjuk, majd szárazra pároljuk. így 1,5 g cím szerinti vegyületet nyerünk hab formájában. M/Z = 485 (M+H)⁺.

4. példa

6- BOC-5-oxo-9-tozil-guanidino-nonánsav előállítása

A cím szerinti vegyületet az 1-3. példákban leírttal analóg módon szintetizáljuk. Röviden, az 1. példa termékét magnéziumból és 5-bróm-l-penténből készült Grignard reagenssel reagáltatjuk.

A kapott adduktumot olaj formájában, a 3. példában leírttal analóg módon izoláljuk, majd nátrium-perjodáttal és ruténium-kloriddal reagáltatjuk, így nyerjük a cím szerinti vegyületet. M/Z = 499 (M+H)⁺.

5. példa

7-BOC-6-oxo-10-tozil-guanidxno-dekánsav előállítása

A cím szerinti vegyületet az 1-4. példákban leírttal analóg módon állítjuk elő. Az 1. példa szerint előállított vegyületet magnéziumból és 6-bróm-l-hexénből készített Grignard reagenssel reagáltatjuk. Az adduktumot a 2. példában leírt módon, szilikagélen történő kromatografálással izoláljuk, majd nátrium-perjodáttal és ruténium-kloriddal reagáltatjuk.

A termék elkülönítése után a cím szerinti vegyületet olaj formájában nyerjük.

M/Z = 513 (M+H)+.

6. példa

Etil-4N-terc-BOC-3-oxo-7-tozil-guanidin-tioheptanoát [(5) képletű vegyület] előállítása (vegyes anhidríd eljárás) A vegyes anhidridet úgy állítjuk elő, hogy lg, 2,4 mmól (L)-N^a-BOC-Arg(N^w)Tos)OH és 0,66 ml, 0,48 mmól trietil-amin 15 ml vízmentes tetrahidrofuránban készült oldatához keverés közben, -20 ’C hőmérsékleten 15 perc alatt cseppenként hozzáadunk 0,40 ml, 0,3 mmól izobutil-klór-formiátot. 1 óra múlva az elegyet 15 ml éterrel hígítjuk, és a kicsapódott szilárd anyagot kiszűrjük. A vegyes anhidridet tartalmazó szűrletet 0 °C hőmérsékleten tároljuk.

Eközben 3,4 ml, 24 mmól diizopropil-amin 25 ml vízmentes éterben készült, argongáz atmoszférában tartott, kevert olda28 tához 0 °C hőmérsékleten, 30 perc alatt cseppenként hozzáadunk 1 ekvivalens tetrahidrofurános n-But Li oldatot. A reakcióelegyet -60 °C hőmérsékletre hűtjük, majd 2,5 ml etil-tioacetátot adunk hozzá. -60 °C hőmérsékleten 30 percig történő keverés után az elegyhez 6 g MgBr₂-éterátot adunk, és további 30 percig keverjük. Végül ehhez az elegyhez hozzáadjuk az előzőek szerint elkészített vegyes anhidridet, és az elegyet 5 órán át keverjük, amíg a reakció nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat szerint teljesen végbemegy.

A reakcióelegyhez cseppenként hozzáadunk 6 mól/l-es ammónium-kloridot, és a fázisokat szétválasztjuk. A szerves fázist 50 ml etil-acetáttal hígítjuk, és INHCl-dal háromszor, majd vízzel háromszor extraháljuk, nátrium-szulfáton nagy vákuumban szárítjuk, így a cím szerinti vegyületet olaj formájában nyerjük. M/Z = 515 (M+H)+.

7. példa

A 6. példa szerint előállított tioészter kapcsolása a-aminosav-észterekhez és védőcsoportjuktól megfosztott amino-acil-polisztirol-gyantákhoz

Két ekvivalens, a 6. példa szerint előállított védett arginil statont diklór-metánban oldunk, és hozzáadjuk egy a-aminosav-észter (1 ekvivalens) elegyhez vagy a növekvő polipeptidláncot tartalmazó polisztirolgyantához. Ehhez az elegyhez adunk ezután 2 ekvivalens réz(I)-jodidot és 2 ekvivalens trietil-amint. A reakció lefolyását nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálattal követjük nyomon aminoSav-észter alkalmazása esetén, vagy szokásos ninhidrin teszttel polisztirolhoz kötött peptidek esetén.

8. példa

Ο Ο

II II

A Cbz-(D)-Phe-Pro-Arg-C-(CH₂)2^-C-OCH₃ képletű peptid szintézise

200 mg, 0,4 mmól 3. példa szerinti aminosavat 10 ml etil-acetátban oldunk, és diazometán éteres oldatával reagáltatjuk addig, míg a gázfejlődés megszűnik. Az így képződött metil-észtert bepárlássál elkülönítjük, a védőcsoportokat 10 ml 50 %-os trifluor-ecetsav/diklór-metán elegyével 0 °C hőmérsékleten 1 órán át történő reagáltatással távolítjuk el. Ezután az elegyről az oldószert nagy vákuumban lepároljuk, így 200 mg viszkózus olajat nyerünk, amely nem kristályosítható, közvetlenül használjuk fel. 200 mg, 0,33 mmól kapott olajat jégfürdőbe hűtve 20 ml dimetil-formamidban oldunk, és 158 mg, 0,4 mmól Cbz-(D)-Phe-Pro-OH-val, 0,14 ml, 1 mmól TEA-val és 110 mg, 0,4 mmól DPPAval reagáltatjuk. A teljes oldatot 15 órán át 4 °C hőmérsékleten hagyjuk állni, majd nagy vákuumban bepároljuk. A visszamaradó anyagot víz és etil-acetát között megosztjuk, a fázisokat szétválasztjuk. A szerves fázist a 3. példában leírt módon kezeljük tovább, majd az oldószer lepárlása után a visszamaradó anyagot szilikagélen végzettt kromatografálással tisztítjuk,, 150 mg anyagot nyerünk.

A kapottt peptidről a védőcsoportokat folyékony hidrogén-fluoriddal 0 °C hőmérsékleten 1 órán át történő reagáltatással távolítjuk el. Ezt követően a feleslegben lévő hidrogén-fluoridot lepároljuk, a visszamaradó anyagot 50 ml 10 %-os ecetsavban oldjuk, és éterrel háromszor extraháljuk. A vizes fázist liofilizáljuk, így a cím szerinti vegyületet por formájában nyerjük.

»99 · · ♦ · • * · · · ··« * *·· · · · ·

- 30 Μ/Ζ = 489,2 (Μ+Η)⁺.

9. példa

A (II) képletű szintetikus elválasztó egység alegységének előállítása

0 0

II II II

-nk-ch₂-ch=ch-ch₂-c-nh-ch₂-ch=ch-ch₂-c-hh-ch₂-ch=ch-ch₂-cA szintézist Cox M.T., Heston D.W. és Horbury J. [J. Chem. Soc. Chem. Comm., (1980), 799-800] kisebb módosításával valósítottuk meg. A teljes eljárást az alábbiakban ismertetjük.

a) Transz-B-hidromukonsav-dimetil-észter előállítása g, 153 mmól transz-B-hidromukonsavat 500 mg p-toluol- _fszulfonsavat tartalmazó 200 ml benzolban és 100 ml metanolban oldunk. Az oldatot 6 órán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk, majd 100 ml vizet adunk hozzá. A fázisokat elkülönítjük, a szerves fázist 5 %-os nátrium-hidrogén-karbonáttal és vízzel extraháljuk. Az oldatot nátrium-szulfáton szárítjuk, majd vákuumban lepároljuk róla az oldószert, és a visszamaradó anyagot 83-85 °C/64 Pa értéken desztilláljuk. így 19 g cím szerinti vegyületet nyerünk.

b) Transz-B-hidromukonsav-monometil-észter előállítása

Az a) lépés termékéből 5 g, 27,5 mmól mennyiséget 100 ml,

0,1 mól/l-es kálium-dihidrogén-foszfát oldatban szuszpendálunk, majd a szuszpenzióhoz 20 mg sertésmáj-észterázt adunk. Az oldat pH-ját 1 mól/l-es nátrium-hidroxid-oldat hozzácsepegtetésével 7 értéken tartjuk, majd az 1 mól/l-es nátrium-hidroxid adagolását folytatjuk 1 mólekvivalens diészternek megfelelően, az oldatot aktív szénnel kezeljük, 5 percig keverjük, majd Celiten szűrjük. A szűrletet éterrel extraháljuk, az egyesített szerves « · · · · · *· • ·· 4 4 » · * · ··· extraktumokat elöntjük. A vizes fázist 3 n hidrogén-kloriddal megsavanyítjuk, majd éterrel extraháljuk. Az egyesített éteres fázisokat nátrium-szulfáton szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. A visszamaradó anyagot vákuumban desztilláljuk (105110 °C/64 Pa) , így 4 g cím szerinti vegyületet nyerünk olaj formájában.

c) 4-Metoxi-karbonil-2-dehidro-butil-izocianát előállítása

A b) lépés szerinti monoészterből 1,22 g, 7,3 mmól mennyiséget 25 ml benzolban oldunk. Az oldathoz 15 perc alatt cseppenként hozzáadunk 0,76 ml, 8,7 mmól oxalil-kloridot, és az oldatot 3 órán át erőteljesen keverjük. Ezután az oldatot vákuumban bepároljuk. A visszamaradó anyagot 10 ml acetonban oldjuk, és az oldatot 1 g nátrium-azid 20 ml 50 %-os víz/aceton elegyben készült, előre 0 °C hőmérsékletre hűtött oldatához adjuk. 30 perc múlva az elegyet 50 ml vízzzel hígítjuk, és 3x20 ml benzollal extraháljuk. Az egyesített szerves extraktumokat nátrium-szulfáton szárítjuk, majd szűrjük. A szűrletet olajfürdőben 80 °C hőmérsékleten tartjuk, míg a nitrogénfejlődés megszűnését nem észleljük. Ezután az oldószert vákuumban lepároljuk az elegyről, a visszamaradó anyagot vákuumban desztilláljuk (80-85 °C/64 Pa), így 700 mg cím szerinti vegyületet nyerünk.

d) 4-N-butil-oxi-karbonil-pent-3-énsav előállítása lg, 6,1 mmól c) lépés szerinti termék 25 ml benzolban készült oldatához hozzáadunk 890 mg, 12,2 mmól terc-butanolt. Az oldatot 10 órán át visszafolyatő hűtő alatt forraljuk, majd vákuumban bepároljuk. A visszamaradó anyagot a b) lépésben leírt módon sertésmáj-észterázzal kezeljük, majd a b) lépésben leírt * · · * ··♦

- 32 módon feldolgozzuk. így 700 mg cím szerinti vegyületet nyerünk.

A d) lépés termékét ezután a szintetikus elválasztó egység (II) előállításában alegységként használjuk. Ezekből az alegységekből építjük fel ezután a (II) általános képletű elválasztó egységet szakember számára ismert módon.

10. példa

Különböző peptidek előállítása

Az I. táblázatban bemutatott P24, P51, P53, P7 3, P52 és P54 peptideket az előzőekben a peptidek szintézisénél leírt módon állítjuk elő. Az olyan (I) általános képletű szintetikus peptidnek megfelelő P79 peptidet, amelyben X jelentése D-Phe, Z jelenO

II tése -(CH2)2~C^-, D jelentése propilcsoport, Y jelentese =CO, W jelentése H és R jelentése -Glu-Gly-Tyr-Leu-Gln-OH, úgy állítjuk elő, hogy először kémiai úton 5-BOC-4-oxo-8-tozil-guanidino-oktánsavat állítunk elő a 3. példában leírt módon, majd a peptidek szintézisénél leírt eljárást alkalmazva a megfelelő peptidek összekapcsolásával állítjuk elő a fenti vegyületet.

11. példa

P79 előállítása || 50

Ac- (D) Phe-Pro-ArgY - (COCH₂) CH₂C-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-GlnOH

60 g terc-butil-oxi-karbonil-Gln-fenil-acetamidometil-gyantát (Applied Biosystems; 0,64 mmól/g) 16 szintézis cikluson viszünk át, beleértve az n^a-oldallánc védőcsoportjának eltávolítását (50 %-os TFA diklór-metánban) , és a kapcsolást, amelyet

2,5 milliekvivalens védett aminosav/DCC és N-hidroxit ·

-benzotriazol alkalmazásával végzünk. A standard aminosavak oldallánc védőcsoportjai a következők: Asp (ciklohexil), Glu (benzil) , His (benzil-oxi-metil), Tyr (bróm-benzil), Ser (benzil) .

A 3. példában szereplő szintetikus védett aminosavat Gln⁴⁹hez kapcsoljuk ugyancsak DCC/N-hidroxi-benzotriazol alkalmazásával. A legjobb eredményt akkor érjük el, ha N-BOC-(D)-PhePro-OH-t egyetlen egységként adagolunk ahelyett, hogy az egyes aminosavakat alkalmaznánk.

500 mg teljesen védett peptid-gyantát, anizolt és dimetil-szulfidot 10 térfogat% tartalmazó teflon edényben -5 °C hőmérsékleten 60 percig hidrogén-fluoriddal kezelünk. A hidrogén-fluorid feleslegét nitrogéngáz áram alatt eltávolítjuk, és a visszamaradó anyagot éterrel extraháljuk, majd szűrjük. A gyantát jégecettel és vízzel háromszor extraháljuk, majd liofilizáljuk.

A liofilizált nyers peptidet homogenitásig tisztítjuk fordított fázisú kromatografálással oktadecil-szilicium-dioxid (15 R, Vydac) töltetű üvegoszlopon (1,5 x 30 cm), 27,6 x 10³ Pa nyomáson, és az alábbi két oldószerrendszer lineáriis gradiensét alkalmazzuk: (a) 500 ml 0,1 %-os vizes TFA és (b) 1 liter 0,1 % TFA-t tartalmazó 60 %-os vizes acetonitril. A 98 % tisztaságú, vagy annál tisztább frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk.

Aminosav^analízissei a következő aminosavakat mutattuk ki: Asp (3), Ser (1), Glu (6), Gly (1), He (1), Leu (1), Tyr (1), Phe (2), His (1), Pro (2) .

A kapott peptid 2548,6 molekulatömegnek megfelelő pseudomolekulaionnak mutatkozik.

• · ***·«·« • * · · · t · * * · * « ·♦· * »»+♦ · « ·

12. példa

A P102 előállítása

0 _ω II II

Ac-(D) -Phe-Pro-Arg Ψ (C-CH₂)CH₂CH₂C-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH.

Aminosavanalízis a következő aminosavak jelenlétét mutatta: Asp (3,20), Ser (0,86), Gly (6,60), Gly (0,8), Ile (1,00), Leu (1,06), Tyr (0,86), Phe (1,84), HÍS (0,88), Pro (2,10).

Pszeudo-molekulaion: 2562,4.

13. példa

Ά P103 előállítása

0

II II

Ac-(D)-Phe-Pro-Arg V (C-CH₂)CH₂CH₂C-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH.

Aminosavanalízis a következő aminosavak jelenlétét mutatta: Asp (3,15), Ser (0,84), Gly (6,84), Gly (1,00), Ile (1,04), Leu (1,26), Tyr (0,99), Phe (2,12), His (1,00), Pro (1,55).

Pszeudo-molekulaion: 2576,8.

14. példa

A P183 előállítása o o o . II II II

Ac- (D) -Phe-Pro-Argt (C-CH₂) CH₂CH₂CH₂C- (NH-CH₂-CH=CH-CH₂-C) _T-Asp-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Leu-OH

A cím szerinti pepiidet lényegében a P79 peptidnél és hommológjainál leírt módon szintetizáljuk, és tisztítjuk, kisebb módosítások alkalmazásával, például a szilárdfázisú szintézist terc-butil-oxi-karbonil-Leu-fenil-acetamidometil-polisztirol-gyantával (Applied Biosystems, 0,64 mmól/g) kezdjük. Az Asp maradékot követő terc-BOC védőcsoport eltávolítására 10 % etil-

- 35 -metil-szulfidőt tartalmazó diklór-metánnal készült 50 %-os TFA oldatot alkalmazunk. így a cím szerinti peptid hozamát 60 % fölötti értékre javítjuk, az ellenőrzést nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással, 215 nm-nél végzett UV abszorpciós detektálással végezzük.

Aminosavanalízissel a következő aminosavakat mutattuk ki: Asp (1,000, Glu (1,07), He (0,94), Leu (1), Phe (1,82), Pro (3,29) .

Pszeudo-molekulaion: 1455.

15. példa

A P184 előállítása

0 o „ ii ii ii

Ac-(D) -Phe-Pro-Argr(C-CH₂) CH2CH₂CH₂C- (NH-CH₂-CH-CH-CH₂-C) 2“ -Asp-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Leu-0H

Aminosavanalízissel a következő aminosavak jelenlétét mutattuk ki: Asp (1,00), Glu (1,08), Ile (0,96), Leu (1,01), Phe (1,91), Pro (3,48).

Pszeudo-molekulaion: 1553.

16. példa

A P185 előállítása o o o ν II II II

Ac- (D) -Phe-Pro-Argr(C-CH₂) CH₂CH₂CH₂C- (NH-CH2-CH-CH-CH2-C) 3-Asp-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Leu-OH

Aminosavanalízissel a következő aminosavak jelenlétét mutattuk ki: Asp (1,00), Glu (1,06), Ile (0,93), Leu (0,98), Phe (1,88), Pro (3,6).

Pszeudo-molekulaion: 1647.

·« »«·

-36Trombin-aktivitás amidolitikus vizsgálata

Tos-Gly-Pro-Arg-pNA trombinnal katalizált hidrolízisét 405 nm-nél Varian Cary 2000 kétsugaras spektrofotométeren követjük nyomon 2,5, 3,5, 5 és 10 Mmól szubsztrát koncentrációt alkalmazva 1 ml végtérfogatban. A hidrolitikus reakciót 25 °C hőmérsékleten hajtjuk végre 0,1 mól/1 NaCl-t és 0,1 % PEG 6000-t tartalmazó 0,1 mól/l-es, pH = 7,8-as trisz-HCl pufferben. A reakciót úgy indítjuk meg, hogy előinkubált enzimoldathoz (0,4 vagy 0,04 nmól/liter) és változó koncentrációjú, 0,1 mól/les, pH = 7,8-as trisz-HCl pufferben oldott inhibitorhoz hozzáadjuk az azonos pufferben oldott szubsztrátot. A kezdeti sebességeket feljegyezzük, és a K_X értékeket grafikusan határozzuk meg kompetitív gátlás esetén Dixon pontok súlyozott lineáris regressziójával, hiperbolikus gátlás esetén Baici eljárásával (Baici, 1981). A fluorogén vizsgálatokat ugyanilyen körülmények mellett hajtjuk végre, és a fenti műszert alkalmazzuk fluoreszcencia üzemmódban alkalmazva ( λθ_χ = 383 nm, Aem “ ^{455 nm}) arányban. A fluoreszcencia intenzitások kalibrálását ismert koncentrációjú 7-amino-4-metil-kumarin-oldattal végezzük. A találmány szerinti szintetikus peptidek humán a-trombin iránti fajlagosságát is meghatározhatjuk humán α-trombinnal és marha a-trombinnal és tripszinnel szembeni fajlagos gátló hatásuk összehasonlításával, a trombin aktivitás amidolitikus vizsgálatában nyert K_x értékek összehasonlításával.

Ennek folytán a találmány szerinti szintetikus peptidek trombin iránti gátló hatása vizsgálható a protrombin idő meghatározásával (PT, külső út) vagy gyűjtött rekonstituált normál humán plazma aktivált parciális tromboplasztin idejének • » * · ♦ · · * · «·« · · ·

-37meghatározásával (ΑΡΤΤ, belső út), Coag-A-Mate 2001 eszköz (Generál Diagnostics Inc., Morris Planes, New Jersey) vagy más megfelelő spektrofotométer alkalmazásával.

így, a protrombin idő meghatározására 50 μΐ rekonstituált, citrátos normál humán plazmát (Sigma, St-Louis, MO., USA) 50 μΐ tromboplasztin-oldattal elegyítünk 37 ’C hőmérsékleten 400 μΐ-es küvettában. Az elegyhez ezután vagy 200 μΐ pH = 7,8-as trisz-HCl puffért (amely 0,1 mmól/1 NaCl-t és 0,1 % PEG 6000-t tartalmaz) vagy azonos pufferben felvett változó koncentrációjú inhibitort adunk. 100 μΐ 25 mmól/l-es CaC12 hozzáadása után feljegyezzük a kicsapódási időt. A kicsapódási idő az inhibitor hiányában 19 és 22 s közötti.

A fenti eljárást alkalmazhatjuk az aktivált parciális tromboplasztin idő meghatározására is, azzal az eltéréssel, hogy a rekonstituált plazmát 3 percig cefalinnal (Sigma, St-Louis, MO, USA) aktiváljuk.

Az 1. és 4. ábrán jellemző APTT és PT gátlási görbéket mutatunk be.

Egyes találmány szerinti peptidek trombinnal szembeni gátló hatását trombin által közvetített vérlemezke aggregálódást gátló képességük mutatja, ezt a 2. ábrán mutatjuk be. Vérlemezkékben gazdag, P79 különböző koncentrációit tartalmazó plazmát kezelünk trombinnal. A vérlemezke aggregálódás megnövekedett fény-transzmisszióval jár, amit Bio Data PAP-4 aggregométeren mérünk.

Fíbrinogén alvadási vizsgálat

A fíbrinogén alvadók képződés gátlását spektrofötöméteresen, 405 nm-nél Varian DMS 90 készüléken, 37 °C-on követjük nyomon. Polisztirol küvettában 300 μΐ, 0,1 %-os fibrinogént • ·

- 38 (Sigma) (a fibrinogén oldat 0,1 mól/l-es, pH = 7,8-as, 0,1 mól/1 NaCl-t és 0,1 % PEG 600-t tartalmazó trisz-HCl oldatban készül) és a fibrinogén oldására használttal azonos pufferben készült különböző koncentrációjú inhibitort elegyítünk, és a reakciót az enzim (0,4 nmól/l-es humán vagy marha α-trombin) hozzáadásával indítjuk meg, a reakcióelegy össz-térfogata 1 ml. Feljegyezzük a különböző inhibitorkoncentrációk esetén az elegyítéstől az alvadékképződés folytán bekövetkező inflexióig eltelő időt, és az IC50 értékeket lóg probit analízissel számítjuk. A vizsgálatokban az inhibitor koncentrációját peptidtartalma alapján számítjuk.

A találmány szerinti peptidek antikoaguláns aktivitásának meghatározására különböző egyéb vizsgálatok végezhetők. így a találmány szerinti szintetikus peptidek trombin iránti gátló hatása meghatározható az aktivált parciális tromboplasztin idők gátlásának vizsgálatával (APTT belső út vagy protrombin idő PT külső út). így az antikoaguláns aktivitás meghatározható gyűjtött, normál humán plazma APTT vizsgálatával Coag-A-Mate 2001 berendezésen (Generál Diagnostics Inc., Morris Planes, New Jersey, USA).

Továbbá vizsgálható a találmány szerinti szintetikus peptidek gátló hatása tozil-Gly-Pro-Arg-P-nitroanilid tripeptidil P-nitroanilid szubsztrát (Chromozym TH, BoehringerMannheim, Indianapolis, In.) trombinnal katalizált hidrolízisére spektrofotometriás úton 420 nm-nél Cary 219 kétsugaras spektrofotométerrel. A reakcióélegyeket trombin oldatnak Tris-HCl, pH = 7,4 és NaCl pufferrel való elegyítésével készíthetjük el.

Ezen vizsgálatok a találmány szerinti szintetikus peptidek • 99 • 9 9 ·»« · • · « 9 « *·* • »♦«« 9 ·· ·· · t ·»· ···

- 39 némelyikének alkalmazása esetén azt mutatták, hogy ezek a peptidek trombin bifunkciós inhibitoraiként hatnak. Valójában kimutattuk, hogy a peptidek két kritikus régiójának a beépítése, amelyeket egymástól egy megfelelő elválasztó egység választ el, erős trombin inhibitorokat eredményez. Eredményeinket az I. táblázatban mutatjuk be.

Ennek folytán a megnövekedett enzim affinitás és az in vitro antikoaguláns hatás közvetlenül az együttműködő intramolekuláris kötő mechanizmusnak tulajdonítható, például, ha az (I) általános képletű vegyület X helyettesítője D-Phe, ez olyan (i) régiót eredményez, amely alkalmas arra, hogy kötődjön a trombin aktív helyének kiterjedt hidrofób régiójával. Az (ii) régióval szemben támasztott követelmények, amelyek ahhoz szükségesek, hogy a trombin nem-katalitikus helyéhez kötődjön, eltérnek az (i) régióval szemben támasztott követelményektől.

Nyilvánvaló, hogy ennek a két régiónak egyetlen molekulába való olyan beépítése, hogy ezek egymástól megfelelő elválasztó egységgel elválasztottak, megnöveli a vegyületek aktivitását trombinnal szemben. Valójában a két független régió külön IC₅₀dózisainak kombinálása az alvadási idő pontos megkettőzését eredményezi, míg nagyobb aktivitás érhető el, ha a két régiót egy összekötő egység kapcsolja össze. Ennélfogva úgy tűnik, hogy a találmány szerinti bifunkciós inhibitorok kettős kooperatív kötődése következik be, ha ezek trombinnal kerülnek érintkezésbe. Az összekötő egység megfelelő elválasztó egységként szolgál egy kisegítő hely [(ii) régió] és egy katalitikus hely [(i) régió] összekötésére, valamint apoláris kötési helyként a katalitikus hely szomszédságában.

- 40 ··*

A különböző vizsgálatok azt is mutatták, hogy míg a D-Phe-Pro-Arg-Pro-OH és az Ν-α-acetil-deszulfo-hirudin^55-65egymástól függetlenül IC5Q = 250 μιηόΐ/ΐ, illetve 3,5 Mmól/1 értékkel gátolják a marha α-trombin hatására bekövetkező fibrinalvadék-képződést, ezeknek egyetlen molekulába való olyan beépítése révén, ahol köztük elválasztó egységként a hirudin 49-54 egysége szerepel, olyan inhibitort eredményez, amelynek gátló hatása marha α-trombinnal szemben IC5Q = 70±20 nmól/1, és humán α-trombinnal szemben 4±0,8 nmól/liter. Hirudin⁴⁵”⁶⁵ és D-Phe-Pro-Arg-Pro-OH külön IC5Q dózisainak egyesítése csak a fibrinogén alvadási idő kettőzését eredményezi, míg az elválasztó egység hozzájárulása elhanyagolható. A P53 alvadási vizsgálatban megfigyelt szinergetikus hatását ennek az analógnak a fluorogén vizsgálati eredményei megerősítik, ez az analóg P51-hez hasonlítva tisztán kompetitív inhibitornak bizonyul, amelynek értékei legalább 50-szer alacsonyabbak az utóbbiénál. Érdeklődésre számottartó trombin inhibitor aktivitásokat nyertünk a P79, P102 és P103 peptidekkel, valamint a P184 és P185 csonkolt peptidekkel.

Antitrombotikus aktivitás arteriovénás sönt modellben

Az alábbiakban a vizsgálati eljárást ismertetjük.

Uretánnal anesztetizált patkányt hőmérsékletszabályozóval ellátott melegítőlemezen háton fekvő állapotban rögzítünk. A jobboldali nyaki artériába és a baloldali juguláris vénába rövid polietilén katétereket (Portex, PE 50) helyezünk. A katétereket fiziológiás sóoldattal megtöltjük, és elszorítjuk. A katéterek két végét 2 cm hosszú, 1,0 mm belső átmérőjű, trombogén felületként ható üvegkapillárisokhoz kapcsoljuk. A • ·

4*4« *··: .*· • ·«.

« ··

- 41 vizsgálandó anyag vagy kontrollként ennek oldószere intravénás beadását követően 5 perc múlva az arteriovénás söntöt elzáró csipeszeket kinyitjuk. A söntön átáramló vér gyorsan felmelegíti az üvegkapillárist szobahőmérsékletről testhőmérsékletre. A kapilláris hőmérséklete szolgál a sönt bizonyosságának jelzésére. A hőmérsékletet NiCrNi-hőélemmel mérjük.

Eredményeinket a II. táblázatban mutatjuk be. A táblázatban a P79 rekombináns hirudinhoz hasonlított antitrombotikus hatását ismertetjük arteriovénás sönt modellben patkányokon, 5 perccel a megadott anyag intravénás adagolása után (n = a vizsgálatba bevont állatok száma).

II. Táblázat
Anyag	*EDis ma /ka	(95 % konfidencia határ)	n
P79	0,42	(0,27 - 1,19)	15
r-hirudin	1,42	(1,14 - 1,92)	32

* az a dózis, amely a sönt elzáródásáig eltelő időt 15 perccel meghosszabbítj a.

A ppolipeptidek plazmában való stabilitása

Megvizsgáljuk a találmány szerinti peptidek in vitro plazma stabilitását proteolízissei szemben. Az ábrákon megadott eredmények jól példázzák a P53 és P79 (más jelölés szerint hirutonin II) összehasonlító stabilitását.

600 pg peptidet 250 μΐ rekonstituált normál humán plazmával, 250 μΐ tromboplasztinal, 600 μg kalcium-kloriddal és

9*·ν ···: .·· « ·· «

• *9

- 42 50 mmól/l-es, pH = 7,8-as nátrium-hidrogén-foszfát-ppufferrel elegyítünk 900 μΐ végtérfogatra.

Az elegyet 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, és 100 μΐ-es alikvot részeket veszünk belőle megjelölt időközökben. Az egyes alikvot mintákhoz 20 μΐ 10 %-os triklór-ecetsavat adunk, és az elegyet 10 percig 12 x K értéken centrifugáljuk. A felülúszót C₁₈ analitikai oszlopra injektáljuk, és standard eluciős eljárással kromatográfáijuk (azaz 60 %-os, 0,1 % TFA/H2O - 0,1 % TFA CH₃CN-ban).

A 3. ábrán bemutatott összehasonlító eredmények azt mutatják, hogy míg a P53 esetén 30 perc alatt 50 %-ot meghaladja a bomlás, a P79 (hirutonin II) minimális vagy semmi proteolízist nem mutat.

A találmány szerinti peptidek terápiás szempontból elfogadható sók formájában előállíthatok. Mivel a találmány szerinti peptidek mind savas, mind bázisos funkciós csoportokat tartalmazhatnak, ezekből szerves savakkal (például ecetsavval, tejsavval, borostyánkősavval vagy almasavval) vagy bázisokkal (például nátrium, kálium vagy kalcium) sók állíthatók elő. Az (I) általános képletű peptideknek ezek a sói biológiailag teljesen aktívak. A terápiás szempontból elfogadható sók egyik sóból egy másikká alakíthatók át megfelelő ioncserélő gyanta alkalmazásával R.A. Booissanas és munkatársai [Helv. Chim. Acta. 43, 1849 (1960)] által leírt módon.

A találmány szerinti peptideket vagy terápiás szempontból elfogadható sóikat önmagukban vagy kombinációk formájában alkalmazzuk trombózisok következtében fellépő érmegbetegedések kezelésére vagy megelőzésére. A fenti hatóanyagokat melegvérű «··« 4« • · · · • 9·«· •· * ··· V·· állatoknak, például embernek, lónak vagy kutyának szisztémásán adagoljuk gyógyászati szempontból elfogadható hordozóanyaggal együtt, a kompozíció aránya függ az oldhatóságtól és a választott adagolási úttól. A találmány szerinti peptideket intravénásán, szubkután vagy intramuszkuláris injekciók formájában adagoljuk gyógyászati szempontból elfogadható hordozóanyagokkal elegyítve. A gyógyászati szempontból elfogadható hordozóanyagok példáiként a standard gyógyszerészeti szövegekben, például a Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. kiadás, Mack Publishing Company, Easton, Penn., 1980 szakirodalmi helyen található hordozókat említjük.

A peptidek adagolt mennyisége az adagolás módjától és az adott vegyülettől függően változó. Injekció formájában beadva a peptid terápiásán hatékony dózisa mintegy 0,05 - 10 mg/testtömeg kg. A hatóanyag mellett a készítmények megfelelő puffereket, például foszfátpuffért tartalmazhatnak a megfelelő pH fenntartására, továbbá tartalmazhatnak például nátrium-kloridőt, glükózt vagy mannitot az oldat izotóniássá tételére.

A találmány szerinti peptidek adagolhatok önmagukban vagy más hatóanyagokkal kombinálva. Például a peptidek adagolhatok szövet-plazminogén-aktivátorral kombinálva a szívkoszorúverőér ismételt elzáródásának megakadályozására. Más megoldás szerint a találmány szerinti peptidek adagolhatok heparinnal vagy alacsony molekulatömegű heparinnal, az ilyen kombináció esetén előnyösen csökkenthető a heparin vagy az alacsony molekulatömegű heparin dózisa.

A találmány oltalmi körébe tartozik a (II) általános képletű vegyületek előállítása is. A (II) általános képletben n értéke 1 és 4 közötti egész szám, K és K' jelentése azonos vagy különböző, megfelelő védőcsoportok, például BOC vagy Tos.

A találmány szerinti eljárás abban áll, hogy egy olyan (IIA) általános képletű vegyületet, amelyben n értéke 1 és 4 közötti egész szám, és K és K' azonos vagy különböző, jelentésük megfelelő védőcsoport, például BOC vagy Tos, a kettőskötés oxidálásra képes oxidálószerrel reagáltatunk, majd a kívánt terméket kinyerjük.

A (II) általános képletű vegyület a találmány oltalmi körébe tartozik.

A találmány tárgyát képezi továbbá a (III) képletű vegyület előállítása.

Az eljárás abban áll, hogy egy (6) képletű vegyületet olyan enzimmel kezelünk, amely képes egy metilcsoport eltávolítására, majd a kívánt terméket kinyerjük.

A (II) általános képletű és a (III) képletű vegyületek peptidszármazékok, például a találmány szerinti peptidszármazékok előállításának hasznos köztitermékei.

Leírásunkba a 07/538 322 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást referenciaként beépítjük.

I. Táblázat

Tozil-Gly-Pro-Arg-AMC hirudin peptidekkel történő, marha és humán α-tromhin által kiváltott hidrolízisének inhibíciós disszociációs állandói o o o

43 r-H

o o

co

<p o

in i-H

ro

CN CO

co •o o

•a· rH o

CN O O

co rH

rH ·>. rH

rH

fi

'0

+1

<0

+1

ε

•rH

Ό

cn

tO

a·

+1

é

c

co

c

o

co

rH

10

CN

ss

cn

in

rH

3

co

rH

a¹

[x

*

o

in

CM

X

•rH

o

rH

CM

o

O

o

X

w

o

co

cn

o

Λ

<—H

o

O

K0

o

<c

C0

co

o

X!

rH

id

rH

(Ö

rH

F

'0

•H

+1

•H

+1

1

I

1

<0

fi

o

H

c

o

1

I

1

s

c

CN

cn

IX

CN

1

a·

CO

•rH

□ tP '0 rH <0 fi

CN
>	in	in
	10	ιο 1
fi	in	in
•rH	in	a*
15	fi	C
3	•rH	•rH
F	Ό	15
•rH	3	3
X	F	F
t	•rH	-H
F	X	X

	rH ΙΟ I	rH <0	rH IO I
								1 in	in	1 in
								a·	a·	a·
								β	β	β
								rH	•rH	H
								u	Ό	15
								β	3	β
								Ft	F	F
								•rH	•rH	•rH
								X	X	X
								r—'	í1	<-----1
								rH	rH	rH
								«3	IO	10
								β	β	3
								V	Φ	Φ
								X	J

								co	co	co
								in	in	in
								O	0	0
								Ft	F	F
								CF	Λ	CF
								rH	CN	co
							in		><x>X	x~x
							10	o	o	o
							1	o	υ	o
						in	in	CN	CN	CN
						Ό	M·	X	X	X
						1	β	u	u	u
					in	in	•rH	X	X	X
					io	a·	15	u	o	u
					1	β	3	II	II	II
					in	rH	Ft	X	X	X
					•a·	u	•H	o	u	o
				in	β	3	X	CN	CN	CN
				<o	•rH	F	tx	X	X	X
				\|	15	•<H	a*	u	u	u
				in	3	β	O	X	X	X
				M·	F	ιχ	Q	X	X	X
		in		β	•rH	a·	CN	X-*	·—*
		10		rH	β	O	X	1	1	1
		I	in	Ό		U	U	r·
		in	<o	3	•a	CN	CN	•a·	•a-	a·
			1	F	O	X	X	o	O	O
		G	in	•rH	O	υ	u	u	o	υ
		•rH	a·	XI	CN	CN	CN	co	cn	co
		15	β		X	X	X	Z—.
in	in	3	rH	[X	U	u	u	CN	CN	CN
IO	φ	F	Ό	a*	CN	CN	CN	X	X	X
\|	1	•H	3	O	X	X	X	o	u	o
in	in	β	F	u	o	u	u	'—		x*·
a·		l—f	•<H							·—^
fi	c	co	β	CN	CN	CM	CN	CN	CN	CN
•rl	•<H	a·	r—“>	X	X	X	X	X	X	X
Ό	Ό	o	CO	o	o	u	o	o	u	u
	3	F	a·	o	o	o	o	o	o	o
F	F	CF	O	u	υ	u	u	o	u	u
•rH	•rH	1	F	s-z	•x		X·/	X—		>—<
β	X	Q	dl		3-	>-
r—·i	r—i		1
Γ	fx	tx	Q		tx	tx	tx	r-		>
a*	•a·	a·		a·	a·	a·	a·	a·	•a*	a·
tp	(C	tp >	tP	tP	tP	tP	tP	tP	tP
F	rH	F	a·	F	F	F	Ft	FI	M	F
			CP			<
	•k		F						*
in	in	in		in	in	in	in	in	in	in
a*	•a·	«a·		a·	a·	a*	a·	a·	a·	a·
Φ	Φ	0	in	Φ	Φ	a)	Φ	Φ	Φ	Φ
X	β	X	a·	X	β	X	X	X	X	X
Λ	Λ	Ch	F fi	CF	Λ í	cf	Ch	Pc \|	fF	(F
Q L_i	1 Q	1 Q U-U	A	Q L__*	1 Q	Q	Q	1 Q	Q	Q U,J

CP

CN

CO

a·

in

a·

rH

CO

co

CN

a·

o

<P

o

co

CO

CN

tn

in

(x

tn

in

rH

tx

rH

fF

IF

(F

CF

(F

ÍF

CF

ni, nincs gátlás; ^b három mérés átlaga ± SEM; ^c minden peptidről pontos aminosavanalízist végeztünk és ezek pszeudo-molekulaionokat mutattak; nem határoztuk meg.

<0

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Trombin inhibitor, azzal jellemezve, hogy összetevői:

a) egy első, terjedelmes hidrofób rész, amely olyan hidrofób csoportot tartalmaz, amely a proteolízisért felelős trombin katalitikus helyének komplementer hidrofób régiójához képes kapcsolódni;

b) egy második rész, amely legalább megőrzi az N-acetil-hirudin^45-65 C-terminális nem-katalitikus régiójánál lévő natív hirudin 55-60 aminosavak hidrofób és savas jellegét, és a két rész között

c) egy bivalens összekötő egység, amely legalább 10 szénatomos.
2. Az 1. igénypont szerinti trombin inhibitor, azzal jellemezve, hogy terjedelmes hidrofób része legalább egy D konfigurációjú aminosavat tartalmaz.
3. Az 1. igénypont szerinti trombin inhibitor, azzal jellemezve, hogy bivalens összekötő egysége olyan szénláncból áll, amelyet egy vagy több -0-, -S- vagy -NH- szakít meg, és egy vagy több helyettesítőt hordoz, amely helyettesítők alkil-, alkoxi-, alkoxi-alkil-, aril- vagy araikilesöpörtök, amelyek további amid, hidroxil, imidazol vagy karboxilcscoport vagy halogénatom helyettesítőket hordozhatnak, és a lánc terminális atomja egy olyan szénatom, amely egy peptidkötést alkotó karbonilesöpört része.
4. Az 1. igénypont szerinti trombin inhibitor, azzal jellemezve, hogy terjedelmes hidrofób része a (7) általános képlettel jellemezhető, ahol

X jelentése egy hidrofób csoport;

B jelentése egy hidrofób aminosav maradéka;

D jelentése 2-4 szénatomos lineáris szénlánc, amely rövidszénláncú alkilcsoporttal helyettesített lehet, vagy D jelentése p-fenil-metil- vagy p-fenil-etil-csoport;

Y jelentése karbonilcsoport, hidroxi-metil-csoport, amely lehet D- vagy L-konfigurációjú, vagy -CH2-; és

W jelentése hidrogénatom, vagy egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, arilcsoport vagy aralkilcsoport.
5. A 4. igénypont szerinti trombin inhibitor, azzal jellemezve, hogy (7) általános képletében

X jelentése egy hidrofób csoport;

B jelentése egy hidrofób aminosav maradéka;

D jelentése 2-4 szénatomos egyenes szénlánc, amely rövidszénláncú alkilcsoporttal helyettesített lehet, vagy D jelentése p-fenil-metil- vagy p-fenil-etil-csoport;

W jelentése hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, aril- vagy aralkilcsoport.
6. A 4. igénypont szerinti trombin inhibitor, azzal jellemezve, hogy (7) általános képletében

X jelentése D konfigurációjú hidrofób α-aminosav, amely peptidkötéssel kapcsolódik a B helyettesítőhöz, vagy

X jelentése egy hidrofób csoport, amely a B helyettesítő nitrogénatomjához kötődik;

B jelentése egy L-konfigurációjú hidrofób α-aminosav maradéka vagy egy gyűrűs iminosav maradéka, amely utóbbi a gyűrűhöz kapcsolódva egy vagy több alkilcsoport helyettesítőt hordozhat, és a helyettesítők egymással összekapcsolódva gyűrűs szerkezetet alkothatnak;

D jelentése p-fenil-metil-, p-fenil-etil-, etilén-, butilén-, vagy propiléncsoport;

W jelentése hidrogénatom vagy rövidszénláncú alkilcsoport, aril- vagy aralkilcsoport, amely helyettesítők a piperidinvagy pirrolidingyűrű 3-, 4- vagy 5-helyzetében helyezkednek el.
7. A 4. igénypont szerinti trombin inhibitor, azzal jellemezve, hogy (7) általános képletében

X jelentése D-Phe, D-4FPhe vagy D-4ClPhe, ahol az a-aminocsoport acetilezéssel vagy benzoilezéssel semlegesített, vagy

X jelentése naftalinszulfonil-, benzolszulfonil- vagy toluolszulfonil-csoport;

B jelentése Val, pipekolinsav vagy Pro;

W jelentése hidrogénatom vagy rövidszénláncú alkilcsoport, aril- vagy aralkilcsoport, amelyek a gyűrű 3-, 4- vagy 5-helyzetében helyezkednek el, ha B jelentése Pro vagy pipekolinsav;

D jelentése propilén- vagy fenil-metil-csoport.

8. Az 1. igénypont szerinti trombin inhibitor, azzal jellemezve, hogy második része a

W

-G-X'-G-Q-Ile-Pro-R általános képletnek megfelelő, ahol

G és G' jelentése azonos vagy különböző, jelentésük olyan L-a-aminosav, amelynek pK értéke 5 vagy annál kisebb;

X' jelentése hidrofób L-a-aminosav;

Q jelentése L-a-aminosav vagy gyűrűs L-iminosav maradék;

W jelentése hidrogénatom, vagy egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, aril- vagy aralkilcsoport;

R jelentése 1-5 aminosavat tartalmazó hidrofób csoport, vagy alkil-, aril- vagy aralkilcsoport, amely egy karboxil- vagy amid funkcióval helyettesített lehet, vagy

jelentése Glu-Glu-Phe-Leu-R’ 1 , Glu-Glu- -Phe-Leu-Gln-R', 1 1 c 1 c Glu-Glu-Phe-Leu-Glu-R’, 1 1 c ahol 0 0 0 II II II C jelentése H, OH, -O-S-OH, -ch₂-s-oh vagy -O-P-OH vagy II II II 0 0 0

II

-CHo-P-OH,

II o a C helyettesítő a fenilgyűrűhöz para-helyzetben kapcsolódik, vagy

R és R' azonos vagy különböző, jelentésük aminosav, vagy egy általános képletű amincsoport, ahol

R₂ és R3 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, rövidszénláncú alkilcsoport, aril- vagy alkoxi-alkil-csoport, és a két helyettesítő egymással összekapcsolódva olyan 5vagy 6-tagú gyűrűt alkothat, amely gyűrű adott esetben egy további -0-, -S- és -NH- heteroatomot tartalmazhat, valamint ezek gyógyászati szempontból elfogadható sói, vagy R' jelentése hidroxilcsoport, amely Leu-hoz kapcsolódik, és karboxilcsoportot alkot, valamint ezek gyógyászati szempontból elfogadható sói.

9. A 8. igénypont szerinti trombin inhibitor, azzal jellemezve, hogy második részében lévő G és G' helyettesítő azonos vagy különböző, jelentésük Asp, Glu, (1) vagy (2) általános képletű csoport, ahol n értéke 1 vagy 2,

X' jelentése L-Phe, L-4FPhe vagy L-4ClPhe;

Q jelentése prolin, pipekolinsav, szarkozin vagy Glu;

W jelentése hidrogénatom, vagy rövidszénláncú alkilcsoport, aril- vagy aralkilcsoport, amelyek a piperidin vagy pirrolidingyűrű 3-, 4- vagy 5-helyzetében helyezkednek el;

R jelentése Glu-Glu-Phe-Leu-R’ vagy Leu-R', ahol

I c

0 II 0 II 0 II c jelentése H, -CHo-S-OH, II 0 -OH, -O-S-OH, II 0 -O-P-OH vagy II 0

o

II

-ch₂-p-oh,

II o

ahol a C helyettesítő a fenilcsoporton para-helyzetben kapcsolódik; és

R' jelentése hidroxilcsoport, vagy

-N általános képletű csoport, ahol R₂ és R₃ egyenes vagy elágazó láncú 1-6 szénatomos alkilcsoport, és a két helyettesítő összekapcsolódva egy 5- vagy 6-tagú gyűrűt alkothat.
10. Egy (I) általános képletű peptidszármazék, ahol

X jelentése egy hidrofób csoport;

B jelentése egy hidrofób aminosav maradéka;

D jelentése lineáris, 2-4 szénatomos szénlánc, amely adott esetben rövidszénláncú alkilcsoporttal helyettesített, vagy D jelentése p-fenil-metil- vagy p-fenil-etil-csoport;

Y jelentése karbonilesöpört, D- vagy L-konfigurációjú hidroxi-metil-csoport, vagy -CH₂-;

Z jelentése kétértékű egyenesláncú összekötő egység, amelynek lánchossza legalább 10 atomos, és abban az esetben, ha Y jelentése karbonilesöpört vagy hidroxi-metil-csoport, az Y helyettesítő szénatomjával szomszédos atom lehet helyettesítő nélküli vagy fluoratommal mono- vagy diszubsztituált, továbbá Z lehet egy olyan szénlánc, amelyet egy vagy több -0-, -S-, -NH-, karbonil-, észter- vagy amidcsoport szakít meg, és ez a helyettesítő adott esetben egy vagy több helyettesítőt hordozhat, amelyek jelentése alkil-, alkoxi-, alkoxi-alkil-, aril- vagy aralkilcsoport, amelyek további helyettesítőként amid-, hidroxi-, imidazol- vagy karboxilesöpört vagy halogénatom helyettesítőket hordozhatnak, a lánc terminális atomja egy szénatom, amely egy olyan karbonilcsoport része, amely a G L-a-aminosawal peptidkötést alkot;

G és G' azonos vagy különböző, jelentésük L-a-aminosav, amelynek pK értéke 5 vagy az alatti;

X' jelentése hidrofób L-a-aminosav;

Q jelentése egy L-a-aminosav vagy egy gyűrűs L-iminosav maradéka;

W jelentése hidrogénatom, vagy egyenes vagy elágazó láncú alkil-, aril- vagy aralkilcsoport;

jelentése 1-5 aminosavból álló hidrofób csoport vagy alkil-, aril- vagy aralkilcsoport, amelyek egy karboxilvagy amid-funkcióval helyettesítettek lehetnek, vagy ahol vagy

II

-O-P-OH vagy

II o

amely helyettesítők a fenilgyűrűhöz para-helyzetben kapcsolódnak, vagy

R és R* azonos vagy különböző, jelentésük egy aminosav, vagy egy

R2 *3 általános képletű amincsoport, ahol R₂ és R3 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, rövidszénláncú alkil-, aril- vagy alkoxi-alkil-csoport, vagy R₂ és R3 a nitrogénatommal, amelyhez kapcsolódnak, egy 5- vagy 6-tagú gyűrűt alkothatnak, amely gyűrű adott esetben egy további heteroatomot tartalmazhat, a lehetséges heteroatom -0-, —S— vagy -NH-, valamint gyógyászati szempontból elfogadható sói, vagy

R' jelentése hidroxilcsoport, amely Leu-hoz kapcsolódva egy karboxilcsoportot alkot, valamint terápiás szempontból elfogadható sói.
11. A 10. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy (I) általános képletében

X jelentése egy D-konfigurációjú hidrofób α-aminosav, amely a B helyettesitőhöz peptidkötéssel kapcsolódik, vagy egy hidrofób csoport, amely a B helyettesítő nitrogénatomjához kapcsolódik;

B jelentése egy L-konfigurációjú hidrofób a-aminosav-maradék vagy gyűrűs iminosav-maradék, amely utóbbi a gyűrűhöz kapcsolódva egy vagy több alkilcsoport helyettesítőt hordozhat, és ezek a helyettesítők egymással összekapcsolódva gyűrűs szerkezetet hozhatnak létre;

D jelentése p-fenil-metil-, ρ-fenil-etil-, etilén-, butilénvagy propiléncsoport;

Y jelentése karbonilesöpört,

Z jelentése egy 12-40 szénatomos, előnyösen 20 szénatomos lánc;

G és G' azonos vagy különböző, jelentésük Asp, Glu, (1), vagy (2) általános képletű csoport, ahol n értéke 1 vagy 2;

X' jelentése L-Phe, L-4FPhe vagy L-4ClPhe;

Q jelentése prolin, pipekolinsav, szarkozin vagy Glu;

W jelentése hidrogénatom vagy rövidszénláncú alkilcsoport, aril- vagy aralkilesöpört, amelyek a piperidin- vagy pírrólidingyűrű 3-, 4- vagy 5-helyzetében helyezkednek el;

R jelentése Glu-Glu-Phe-Leu-R' vagy Leu-R', ahol

I

C

0 00

II IIII

C jelentése H, -CH₂-S-OH, -OH, -O-S-OH, -O-P-OH vagy

II IIII

0 00 o

II

-ch₂-p-oh,

II o

ahol a C helyettesítők a fenilgyűrűhöz para-helyzetben kapcsolódnak; és

R' jelentése hidroxilesöpört, vagy *2 általános képletű csoport, ahol R₂ és R₃ egyenes vagy elágazó láncú 1-6 szénatomos alkilcsoport, és a két helyettesítő egymással kapcsolódva egy 5- vagy 6-tagú gyűrűt alkothat.
12. A 10. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy (I) általános képletében

X jelentése D-Phe, D-4FPhe vagy D-4ClPhe, ahol az a-amino~ csoport acetilezéssel vagy benzoilezéssel semlegesített, *> vagy

X jelentése naftalinszulfonil-, benzolszulfonil- vagy toluolszulfonil-csoport;

B jelentése Val, pipekolinsav vagy Pro;

W jelentése hidrogénatom vagy rövidszénláncú alkilcsoport, aril- vagy aralkilcsoport, amely helyettesítők a 3-, 4vagy 5-helyzetben kapcsolódnak;

D jelentése B Pro vagy pipekolinsav jelentése esetén propiléncsoport, vagy D lehet fenil-metil-csoport;

Y jelentése karbonilcsoport;

II

Z jelentése -(CH₂)_nC-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-, ahol n értéke 1 és 4 közötti egész szám, a natív hirudin⁴⁸”⁵⁴szekvenciája vagy egy

0 0

II II (-CH₂-)_nC-NH-L-Cáltalános képletű elválasztó egység, ahol

Π értéke 1 és 4 közötti egész szám, és

L jelentése egy hexapeptid vagy egy telített vagy telítetlen lánc, amely a hexapeptid 18 vagy annál kevesebb atomjának megfelelő;

R jelentése Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH, Leu-OH vagy Glu-Glu-Tyr-Leu-R', ahol

R' jelentése hidroxilcsoport vagy

R₃ általános képletű csoport, ahol

- 56 R₂ jelentése -CH3 vagy fenetil-csoport,

R3 jelentése H vagy -CH3 vagy R₂ és R3 együtt -CH₂-CH₂-CH₂—CH₂—, -CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂- vagy -CH₂-CH₂-O-CH₂“CH₂-csoportot alkothat.
13. A 12. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy

Z helyettesítője a (3) általános képlettel jellemezhető, ahol n és m 1 és 4 közötti egész számok, és

Ai és A₂ jelentése egymástól függetlenül cisz- vagy transz-konfigurációban előforduló hidrogénatom vagy dehidrogén;

azzal a megkötéssel, hogy ha m értéke 1, akkor n értéke 3 vagy 4;

ha Aj és A₂ jelentése dehidrogén, akkor Z jelentése (4) általános képletű csoport, ahol p értéke 1 és 4 közötti egész szám.
14. A 10. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy

X jelentése D-Phe;

B jelentése prolin, jelentése propiléncsoport, jelentése karbonilesöpört,

G jelentése Asp,

G' jelentése Glu,

X' jelentése Phe;

jelentése Glu vagy Pro;

O O

II II jelentése -(CH₂)₂-C-Gln-Ser-His-Asp-Asp-Gly-, -(CH₂)3-C-Gln-Ser-His-Asp-Asp-Gly-,

0 II

-(CH₂)4-C-Gln-Ser-His-Asp-Asp-Gly-,

4· ·

Λ ~ 57 οο

IIII

-(CH₂)4 c-(nhch₂ ch=chch₂c) -, οο

IIII (CH₂)4C-(NHCH₂CH=CHCH₂C)₂-, vagy

ΟΟ

IIII

-(CH₂)4 c-(NHCH₂ CH=CHCH₂ c)3-;

W jelentése hidrogénatom, n-butil- vagy metilcsoport és

R* jelentése Glu-Glu-Tyr-Leu-OH vagy -Leu-OH.
15. A 10. igénypont szerinti peptidszármazék, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képlet az alábbi vegyületek valamelyikének megfelelő:

P52 [D-Phe⁴⁵,Arg⁴⁷,D-Pro⁴⁸]hirudin^45-65

P53 [D-Phe⁴⁵,Arg⁴⁷]hirudin^45-65

P54 [Thr⁴⁵,Arg⁴⁷,D-Pro⁴⁸]hirudin^45-65

P79 [D-Phe⁴⁵,Arg⁴⁷ f(COCH₂)CH₂CH₂CO⁴⁷hÍrudin^45-65

P109 [D-Phe⁴⁵,Arg⁴⁷ψ (COCH₂)CO⁴⁷]hirudin^45-65

P103 [D-Phe⁴⁵,Arg⁴⁷ Ϋ(COCH₂)CH₂CH₂CH₂CH₂CO⁴⁷hirudin^45-65

P183 [D-Phe⁴⁵,Arg⁴⁷ ψ(COCH2)(CH2)3CO⁴⁷-(NHCH2CH=CHCH₂CO)jPro⁵⁸,Leu^6x]hirudin^45-61

P184 [D-Phe⁴⁵,Arg⁴⁷ (COCH2)(CH2)3CO⁴⁷-(NHCH2CH=CHCH₂CO)2Pro⁵⁸,Leu^6x]hirudin^45-61

P185 [D-Phe⁴⁵,Arg⁴⁷ ΐ(COCH2)(CH2)3CO⁴⁷-(NHCH2CH=CHCH₂CO)₃Pro⁵⁸,Leu⁶¹]hirudin^45-61.
16. Trombotikus rendellenességek kezelésére alkalmas készítmény, azzal jellemezve, hogy a 10. igénypont szerinti szintetikus peptid hatékony mennyiségét tartalmazza gyógyászati célra alkalmas hordozóanyaggal elegyítve.
17. Eljárás trombózissal kapcsolatos érmegbetegedések 'ί

- 58 kezelésére vagy megelőzésére, azzal jellemezve, hogy a betegnek a 16. igénypont szerinti készítmény hatásos mennyiségét adjuk.
18. Eljárás a (II) általános képletű vegyületek előállítására - a képletben n értéke 1 és 4 közötti egész szám, K és K' jelentése azonos vagy különböző, jelentésük megfelelő védőcsoport, például BOC vagy Tos, azzal jellemezve, hogy egy (IIA) általános képletű vegyületet - a képletben n értéke 1 és 4 közötti egész szám, K és K* azonos vagy különböző, jelentésük megfelelő védőcsoport, például BOC vagy Tos - kettőskötés oxidálására képes oxidálószerrel reagáltatunk, majd a kívánt terméket kinyerjük.
19. A (II) általános képletű vegyület - a képletben n értéke 1 és 4 közötti egész szám, K és K' azonos vagy különböző, jelentésük megfelelő védőcsoport.
20. Eljárás a (III) képletű vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy egy (6) képletű vegyületet egy metilcsoport eltávolítására alkalmas enzimmel reagáltatunk, és a kívánt terméket kinyerjük.
21. A (III) képletű vegyület, azzal jellemezve, hogy a 20. igénypont szerint állítjuk elő, vagy ennek a vegyületnek egy nyilvánvaló kémiai ekvivalense.

A meghatalmazott:

danubja ilrni és VédjoQX fcyaa Kftb 7.