HU215083B - Eljárás biotin előállítására - Google Patents

Eljárás biotin előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU215083B
HU215083B HU9302568A HU9302568A HU215083B HU 215083 B HU215083 B HU 215083B HU 9302568 A HU9302568 A HU 9302568A HU 9302568 A HU9302568 A HU 9302568A HU 215083 B HU215083 B HU 215083B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
biotin
sphingomonas
culture
medium
traces
Prior art date
Application number
HU9302568A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT67685A (en
HU9302568D0 (en
Inventor
Emiko Kawano
Kazuo Kumagai
Misao Miki
Satoshi Mitsuda
Original Assignee
Sumitomo Chemical Co. Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Chemical Co. Ltd. filed Critical Sumitomo Chemical Co. Ltd.
Publication of HU9302568D0 publication Critical patent/HU9302568D0/hu
Publication of HUT67685A publication Critical patent/HUT67685A/hu
Publication of HU215083B publication Critical patent/HU215083B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/185—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system
    • C12P17/186—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system containing a 2-oxo-thieno[3,4-d]imidazol nucleus, e.g. Biotin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

A találmány biotin előállítására szolgáló eljárásra vonatkozik.
A biotin vitamin, amely nélkülözhetetlen az emberek, az állatok, a növények és bizonyos mikroorganizmusok számára. A biotin mikrobiológiai úton történő előállítására különféle eljárások ismeretesek, melyekben Streptomyces vagy Micromonospora (JP-B 4121756 számú leírás); Sporobolomyces (JP-B 42-3074 számú leírás); Bacillus (JP-A 56-160998 számú leírás); Escherichia (JP-A 61-149091 számú leírás); Serratia (JP-A 2-27980 számú leírás); valamint Brevibacterium (JP-A 2-240489 számú leírás) fajokat alkalmaznak.
Ezek a hagyományos eljárások azonban nem mindig gazdaságosak az alkalmazott mikroorganizmusok csekély termelőképessége miatt. Szükséges ezért olyan, hatékonyabb mikroorganizmust alkalmazó eljárás kidolgozása, amely ipari méretben is alkalmas biotin előállítására.
Fentiek miatt intenzív kutatásokat folytattunk megnövekedett biotintermelő képességű mikroorganizmusok után a természetben előforduló, illetve különböző törzsgyűjteményekben fenntartott törzsek körében. Ennek eredményeképp felismertük, hogy a Sphingomonas nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok képesek igen jelentős mennyiségű biotint felhalmozni a táptalajban, eleget téve így a találmány követelményeinek.
A találmány tárgya tehát eljárás biotin előállítására, mely abban áll, hogy egy, a Sphingomonas nemzetséghez tartozó, biotin termelésére képes mikroorganizmust alkalmas táptalajon tenyésztünk, és a keletkező biotint a közegből kinyerjük. Az eljárás során használt mikroorganizmusok is a találmány tárgyát képezik.
A találmány szerinti eljárás során alkalmazott mikroorganizmusok azok a Sphingomonas nemzetséghez tartozó törzsek, amelyek képesek biotin termelésére, így például a Sphingomonas adhaeshiva, a Sphingomonas parapaucimobilis és a Sphingomonas paucimobilis. Közülük előnyösen alkalmazható a Sphingomonas sp. SC-42405 jelű törzs. A Sphingomonas nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok általánosságban az alábbi tulaj donságokkal jellemezhetők:
(1) Gram-negatív pálcák;
(2) kataláz-tesztben pozitívak;
(3) főleg sárga színű telepeket képeznek;
(4) foszfolipidként szfingolipideket tartalmaznak;
(5) izoprenoid kinonjuk típusa Q10;
(6) bakteriális zsírsavként 2-hidroxi-savakat tartalmaznak; és (7) DNS-ük G+C tartalma 60-70 mol%.
A Sphingomonas sp. SC-41405 jelű mikroorganizmust talajmintából (Oita, Japán) izoláltuk, és azt tapasztaltuk, hogy különösen nagy mennyiségű biotint képes felhalmozni a tápközegben. A törzset a Budapesti Megállapodással összhangban 1992. szeptember 3-án letétbe helyeztük a Fermentációs Kutatóintézet (új nevén „National Institute of Bioscience and Humán Technology”) Ipari Tudományos és Műszaki Ügynökségénél, ahol a FERM BP-3995 nyilvántartási számot kapta.
A Sphingomonas sp. SC—42405 jelű törzs bakteriológiaijellemzői az alábbiak:
(a) Morfológia
1. Sejtek alakja és mérete
Alak: pálca
Méret: 0,4-0,8 pm x 1,5-3,0 pm
2. Polimorfizmus: nincs
3. Motilitás: aktív, poláris és peritrich flagellumok
4. Spóraképzés: nincs
5. Gram festés: negatív
6. Saválló festődés: nincs (b) Növekedés
1. Agarlemezen: kerek, domború, sárga telepek
2. Ferdeagaron: sima, enyhén fényes, sárga tenyészet
3. Folyadékban: zavarosodás
4. Zselatin elfolyósítás: negatív
5. Lakmusz tej: negatív (c) Fiziológia
1. Nitrát redukció (folyadéktenyészetben): 2. Denitrifíkálás: 3. Metilvörös próba: 4. Vosges-Proskauer próba: 5. Indolképzés: 6. Kénhidrogén képzés: +
7. Keményítő hidrolízis: 8. Citrát hasznosítás
Kóser táptalajon: +
Christensen táptalajon: +
9. Szervetlen nitrogén hasznosítás ammóniumsók: + nitrátok: +
10. Pigmentképzés Sejtpigmentáció: + (sárga)
Vízoldható pigment (King-A táptalaj): Vízoldható pigment (King-B táptalaj): 11. Ureáz aktivitás: ±
12. Oxidáz aktivitás: +
13. Kataláz aktivitás: +
14. Növekedési körülmények pH: 5,1-7,9 hőmérséklet: 10-33 °C
15. Oxigénérzékenység: enyhén aerob
16. O-F teszt: F (gyenge)
17. Sav- és gázképzés cukorból
(1) L-arabinóz Sav + Gáz
(2) D-xilóz + -
(3) D-glükóz ± -
(4) D-mannóz ± -
(5) D-fruktóz + -
(6) D-galaktóz + -
(7) maltóz ± -
(8) szaharóz ± -
(9) laktóz ± -
(10) trehalóz - -
(11) D-szorbit - -
(12) D-mannit - -
HU 215 083 Β (13) inozit - (14) glicerin - (15) keményítő ± (d) Egyéb tulajdonságok
1. Eszkulin hidrolízis: +
2. Arginin hidrolízis: 3. Lizin dekarboxilezés: 4. Omitin dekarboxilezés: —
5. DN-áz: 6. Tween-80 hidrolízis: 7. 0/129 érzékenység: 8. Nitrogenáz: 9. Poli(3-hidroxi-butirát) felhalmozás: +
10. DNS G+C tartalma: 64,8 mol%
11. Izoprenoid-kinon típusa: ubikinon Q10
12. Szfingofoszfolipid tartalom: +
13. Bakteriális zsírsav összetétel: 06:0(13,1%), 06:1(11,2%), C17:l(l,l%), C18:1(51,8%), 2-OH14:0(14,1%), 2-OH-16:0(4,5%).
A (d) pontban szereplő 10-13. tulajdonságok hagyományos kemotaxonómiai módszerekkel meghatározhatók, például az „Experiments fór Identification of Actinomycetes” kiadványban (szerkesztette és kiadta a Japanese Society fór the Research of Actinomycetes, 1985) leírtak szerint. Ezeknek a módszereknek a szokásos kivitelezését az alábbi példákkal szemléltetjük:
1. DNS G+C tartalma (mol%)
A tenyészetből (100 ml tápoldat Sakaguchi lombikban, 30 °C, 36 óra) a baktériumsejteket centrifügálással kinyerjük, és kétszeri, pufferoldattal (0,15 M NaCl, 0,1 M EDTA, pH = 8,0) végzett mosás-centrifugálás után 18 ml pufferoldatban szuszpendáljuk.
A baktériumsejteket lizozimmal kezeljük (0,5 mg/ml, 37 °C, egy óra), majd nátrium-dodecil-szulfát hozzáadása után (12% végkoncentrációra) 15 percen át 60 °C-on tartjuk. Az elegy feltisztul és viszkozitása a DNS-től megnő. Jeges hűtést követően etanolt adunk hozzá 67% végkoncentrációra. A felülúszót elöntjük, és csapadékot 20 ml SSC pufferben (0,15 M NaCl, 0,015 M trinátrium-citrát, pH = 7,0) felvesszük.
Az SSC oldathoz azonos térfogatú fenolt adunk (telítés), és lezárt lombikban rázatjuk, majd centrifugáljuk (három rétegre válik szét: vizes fázis, fehérje fázis és szerves oldószeres fázis). A vizes fázist elkülönítjük, SSC puffért adunk hozzá, majd ismét rázzuk, centrifugáljuk és újból elválasztjuk. Az oldatot jéggel hűtjük és 12000/perc fordulatszámmal, 4 °C-on, 15 percen át centrifugáljuk, majd a felülúszót akkora főzőpohárba töltjük, hogy 1 cm-es folyadékréteget kapjunk.
A DNS kinyerése érdekében kétszeres térfogatú 95%-os hideg etanolt adunk az oldathoz, miközben a főzőpohár tartalmát üvegbottal keverjük. Körülbelül 30% etanoltartalomnál a DNS elkezd felcsavarodni az üvegbotra. Az üvegbotra csavarodott DNS-t kémcsőben, 80%-os etanolban állni hagyjuk (a fenol eltávolítása érdekében), majd ugyanezt megismételjük 95%-os etanollal is. Az etanolt levegőn elpárologtatjuk és a DNS-t tízszeresre hígított SSC pufferoldatban éjszakán át hűtőszekrényben tartva lényegében homogén oldatot kapunk. A lebegő részecskéket kíméletes centrifügálással eltávolítjuk.
A DNS készítményt RN-áz kezelésnek vetjük alá (50 pg/ml RN-áz A* jelenlétében, 37 °C-on, egy órán át).
*1-2 mg/ml RN-áz koncentrációjú SSC pufferrel készült és 10 percen át °C-on tartott (DN-áz inaktiválása) törzsoldatból hozzáadva.
Ezután egytizedrész térfogatú, tízszeres töménységű SSC pufferoldatot adunk hozzá és hűtjük. A DNS-t etanoladagolás közben üvegbotra csavarjuk (ha a DNS tiszta, akkor átlátszóvá válik). A DNS-t tízszeresre hígított SSC pufferoldatba téve éjszakán át hűtőszekrényben tartjuk (ha másnap még mindig zavaros, akkor a centrifugálást, az RN-áz kezelést és a felcsavarást megismételjük).
A DNS oldatot úgy hígítjuk, hogy 260 nm-en mért abszorbanciája a 10-20 egység közötti tartományban legyen. A tisztított DNS tízszeresre hígított SSC pufferoldattal készült oldatából 100 μϊ-t mikrocentrifugacsőbe mérünk. A mintát 5 percen át 100 °C-on tartjuk, majd jéggel hűtjük. A DNS-t ezután 100 μί DN-áz oldat [0,1 mg/ml Nuclease Pl (Yamasa Shoyu, Co., Ltd.), 40 mM nátrium-acetát, 2 mM ZnSO4 (pH = 5,3)] hozzáadásával 37 °C-on, egy órán át emésztjük.
Ezután HPLC analízist végzünk.
Oszlop: Gp 08 + pBondasphere C18 (3,9* 150 mm)
Eluens: 0,2 M NH4H2PO4/MeOH (100:8)
Áramlási sebesség: 0,9 ml/perc
Detektálás: 260 nm
Mintatérfogat: 5 μί (4-7 μί)
2. Az izoprenoid-kinon molekulatípusának meghatározása
100 mg liofilizált baktériumsejtet (mely folyékony tápközegben készített tenyészetből származik) 20 ml kloroform-metanol (2:1) eleggyel keverés közben egy éjszakán át extrahálunk.
Szilikagél VRK analízis
Kifejlesztő rendszerként benzolt alkalmazva meghatározzuk, hogy ubikinont (Rf = 0,3) vagy menakinont (Rf = 0,7) tartalmaz-e a kivonat.
Kinyerés és tisztítás VRK-val
Ubikinon esetében kifejlesztő rendszerként benzolt, menakinonhoz viszont n-hexán-benzol-kloroform (5:2:1) elegyet használunk. A rétegről a megfelelő helyen lévő sávot lekapaquk és a kinonokat acetonnal eluáljuk. 100 μί acetonos oldatot készítünk.
Fordított fázisú HPLC analízis
Oszlop: YMC-PACK AM-303 (4,6*250 mm)
Eluens: 2-PrOH/MeOH (25:75)
Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc
Detektálás: 270 nm
3. Foszfoszfingolipidek kimutatása
0,5 g nedves baktériumsejtből a foszfolipideket 5 ml kloroform-metanol (2:1) eleggyel extraháljuk. A szerves fázist elválasztjuk és 88 μί 6 N KOH oldatot adunk
HU 215 083 Β hozzá. Egy órán át 40 °C-on hidrolizáljuk, majd ecetsavval közömbösítjük és szárazra pároljuk. A VRK analízist a kifejlesztést követően molibdén-reagenssel történő előhívással fejezzük be.
4. Bakteriális zsírsavösszetétel (1) Összes bakteriális zsírsav vizsgálata mg liofílizált baktériumsejthez (mely folyékony tápközegben, 30 °C-on készített tenyészetből származik) 2 ml 5% HCI tartalmú vízmentes metanolt (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) adunk, és három órán át forró vízben tartjuk, majd hűlni hagyjuk. Ezután hozzáadunk 1 ml vizet és 3 ml n-hexánt. A zsírsav-metil-észtereket extraháljuk (10 perc rázás), a hexános fázist elkülönítjük, és 3 ml vízzel mossuk (sav eltávolítása). A hexános fázist elválasztjuk, vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, majd szárazra pároljuk, és a maradékot feloldjuk 200 μΐ acetonitrilben.
Gázkromatográfiás analízis
Oszlop: 10% DEGS Chromosorb W 80/100 (AW-DMCS), 3 mm x 5,2 m
Vivőgáz: 40 ml/perc nitrogén Injektálási hőmérséklet: 220 °C Oszlophőmérséklet: 180 °C Detektor: FID (2) A telítetlen zsírsav-metil-észterek azonosítása μΐ összes bakteriális zsírsav-metil-észter mintát szárazra párolunk, és a maradékot feloldjuk 200 μΐ etiléterben. Hozzáadunk 5 μΐ 2% brómot tartalmazó etilétert, ledugózzuk és szobahőmérsékleten 30 percen át állni hagyjuk.
Az oldószert és a maradék brómot nitrogénáramban elpárologtatjuk és a száraz maradékot feloldjuk 60 μΐ acetonitrilben. A gázkromatográfiás analízist az (1) pontban leírtak szerint végezzük.
(3) A hidroxi-zsírsav-metil-észterek azonosítása μΐ összes bakteriális zsírsav-metil-észter mintát szilikagél vékonyrétegre viszünk. Kifejlesztő rendszerként n-hexán-etiléter (85:15) elegyet alkalmazunk. A vékonyrétegre 2’,7’-diklór-fluoreszcein 0,02%-os etanolos oldatát permetezzük. A színesen előhívott foltokat a rétegről lekaparjuk.
Rf = 0,2 3-hidroxi-zsírsav metil-észtemek;
Rf = 03, 2-hidroxi-zsírsav metil-észtemek;
Rf = 0,8 apoláros zsírsav metil-észtemek felel meg. A szilikagélből a metilésztereket etiléterrel extraháljuk, az eluátumot bepároljuk, és a száraz maradékot 20 μΐ acetonitrilben feloldjuk. A gázkromatográfiás analízist az (1) pontban leírtak szerint végezzük.
(4) A ciklo-zsírsav-metil-észterek azonosítása μΐ összes bakteriális zsírsav-metil-észter mintát szárazra párolunk, és 2 ml 5% HCI tartalmú vízmentes metanolt hozzáadva egy órán át 100 °C-on tartjuk. A zsírsavmetil-észtereket az (1) pontban leírtak szerint extraháljuk, és 20 μΐ acetonitrilben feloldjuk. A gázkromatográfiás analízist az (1) pontban leírtak szerint végezzük.
A fenti jellemzőket az irodalmi adatokkal [„Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology” (1984); Yabuuchi et al., Microbiol. Immunoi., 34,
99-119 (1990); Validation list No. 34, Int. J. Syst. Bacteriol., 40, 320-321 (1990)] összevetve megállapítottuk, hogy a találmány szerinti mikroorganizmus a Sphingomonas nemzetségbe tartozik, és így a Sphingomonas sp. SC—42 405 elnevezést kapta. Megjegyzendő, hogy mindezideig egyetlen Sphingomonas nemzetségbe tartozó mikroorganizmusról sem volt ismeretes a biotintermelő képesség. Fentiek alapján a Sphingomonas sp. SC-42 405 új törzsnek tekinthető, és variánsai, például a Sphingomonas sp. SC-41405 eredetű mutánsok, sejtfúziós és rekombináns törzsek is alkalmasak a találmány szerinti eljárás kivitelezésére.
A találmány szerinti eljárás során alkalmazott mikroorganizmus tenyészet előállítható különböző táptalajokon, amelyek nitrogén- és szénforrásokat, szerves és/vagy szervetlen sókat, valamint egyéb olyan tápanyagokat tartalmaznak, amelyek más baktériumtenyészetek előállítására általánosan használatosak.
Szénforrásként felhasználható glükóz, maltóz, glicerin, keményítő, dextrin, szaharóz, melasz, valamint növényi és állati olajok.
Nitrogénforrásul szolgálhatnak természetes eredetű szerves nitrogénforrások, például húsleves, pepton, élesztőkivonat, malátakivonat, szójaliszt, kukoricalekvár, gyapotmagliszt, szárított élesztő és kazeinhidrolizátum; valamint egyéb szerves vagy szervetlen nitrogénforrások, például ammónia, ammónium-klorid, nátrium-nitrát, ammónium-nitrát, ammónium-szulfát, ammónium-acetát vagy karbamid. A természetes eredetű szerves nitrogénforrások szénforrásként is hasznosíthatók.
A szerves és szervetlen sók a kálium, a nátrium, a magnézium, a vas, a mangán, a kobalt és a cink kloridjai, szulfátjai, acetátjai, karbonátjai és foszfátjai lehetnek. Konkrét példa ezekre a kálium-klorid, a nátriumklorid, a mangán-szulfát, a vas(II)-szulfát, a magnézium-szulfát, a kobalt-klorid, a cink-szulfát, a réz-szulfát, a nátrium-acetát, a kalcium-karbonát, a nátrium-karbonát, a dikálium-hidrogén-foszfát, a kálium-dihidrogénfoszfát, a dinátrium-hidrogén-foszfát és a nátriumdihidrogén-foszfát.
A találmány szerinti eljárás során használatos mikroorganizmus kiemelkedő biotintermelő képességgel rendelkezik különböző táptalajokon, melyek előnyösen alkalmazhatók ipari méretű termelésre is. Annak érdekében, hogy a találmány szerinti eljárásban szereplő mikroorganizmus biotintermelő képességét fokozzuk, valamely aminosavat - például alanint-vagy zsírsavat-például pimelinsavat-adhatunk a tenyészethez. Ezeket a vegyületeket 1 és 5 mg/1 közötti koncentrációban használhatjuk a tápközegben.
A találmány szerinti eljárás során használatos mikroorganizmus tenyészete a baktériumoknál szokásos módszerekkel állítható elő. Az ilyen szilárd vagy folyékony tenyészetek készítéséhez kémcsövet, rotációs illetve síkrázógépet, üvegfermentort, valamint tankfermentort vehetünk igénybe.
A mikroorganizmus tenyészetét rendszerint aerob körülmények között inkubáljuk. Üvegfermentor vagy
HU 215 083 Β tankfermentor alkalmazása esetén aszeptikus módon levegőt kell bevezetnünk, amelynek mennyisége a tenyészet térfogatára vonatkoztatva percenként 0,1-2,0-szeres.
Az inkubáció hőmérsékletét abban a tartományban kell megválasztani, amelyben a mikroorganizmus szaporodóképes. Ennek megfelelően a tenyésztést 20 és 40 °C között, előnyösen 25 és 35 °C között, legelőnyösebben pedig 28 és 33 °C közötti hőmérsékleten végezzük. A közeg pH-ját előnyösen 6 és 8 közötti értéken tartjuk.
A tenyésztés ideje az alkalmazott körülményektől függően változik, általában 1 és 7 nap közötti, előnyösen 3 és 4 nap közötti időtartam.
A tenyésztés befejeztével a tenyészetben keletkezett biotint - figyelembe véve fizikai és kémiai tulajdonságait - ismert, a vegyületek természetes forrásokból történő kinyerésére és tisztítására szolgáló módszerekkel elkülönítjük. A tenyészetből a baktériumsejtet például centriíugálással elválasztjuk, a felülúszóból a biotint aktívszénen vagy makroretikuláris nem-ioncserélő gyantán megkötjük, majd ioncserélő gyanta alkalmazásával illetve a biotin és a szennyezések oldhatóságának eltérését kihasználva átkristályosítással tisztítjuk.
A találmányt az alábbi példákkal szemléltetjük anélkül, hogy tárgyát ezekre korlátozni kívánnánk.
1. példa
A Sphingomonas sp. SC—41 405 (FERM BP-3995) törzs oltókacsnyi mennyiségével beoltunk nagy kémcsőben (22*220 mm) lévő 10 ml inokulumtáptalajt (1% glicerin, 2% polipepton, 0,15% K2HPO4, 0,15% MgSO4.7H2O, pH = 7,2), és 3 napon át 30 °C-on rázatjuk 200/perc fordulatszámmal. Ezután az inokulumtenyészet 2 ml-ével beoltunk egy 500 ml-es Sakaguchi lombikban lévő 50 ml táptalajt (2% glicerin, 2% élesztőkivonat, 0,5% vitaminmentes kazeinhidrolizátum, 0,15% K2HPO4, 0,05% KC1, 0,05% MgSO4.7H2O, 0,001% FeSO4.7H2O, 0,001% MnSO4.4-6H2O, 20 pg/l tiamin-hidroklorid, pH = 7,0), és 4 napon át 30 °C-on rázatjuk 130/perc fordulatszámmal. A tenyésztés befejeztekor a sejtkoncentráció (OD650) 22,0 egység, a képződött biotin koncentrációja pedig kvantitatív mikrobiológiai módszerrel, Lactobacillus plantarum IFO 3070 törzzsel (Izumi and Yamada, Methods of Vitaminological Experiments II, Water-soluble Vitamins, pp.481-499, Ed. by the Vitaminological Society of Japan, Tokyo Kagaku Dohjin, 1985) meghatározva 3,3 mg/1.
2. példa
Sphingomonas sp. SC—42 405 előinokulum-tenyészetet készítünk nagy kémcsőben az 1. példában leírt módon. Az előinokulumtenyészet 2-2 ml-ével három 500 ml-es Sakaguchi lombikban lévő 100-100 ml ugyanolyan összetételű inokulumtáptalajt oltunk és a lombikokat három napon át 30 °C-on rázatjuk 130/perc fordulatszámmal. Ezután 300 ml inokulumtenyészettel beoltunk egy 30 literes üvegfermentorban lévő 15 liter táptalajt (2% glicerin, 2% élesztőkivonat, 0,5% vitaminmentes kazein-hidrolizátum, 0,15% K2HPO4, 0,05% KC1, 0,05% MgSO4.7H2O, 0,001% FeSO4.7H2O, 0,001 MnSO4.4-6H2O, 20 μΐ/ΐ tiaminhidroklorid, pH = 7,0), majd négy napon át keverés és levegőztetés közben 30 °C-on inkubáljuk. Az átáramoltatott levegő mennyisége 15 1/perc, a keverés 200 és 500/perc fordulatszám közötti (úgy szabályozva, hogy a tenyészetben az oldott oxigén koncentrációja 2 ppm felett maradjon). A tenyészet habzásának mérséklését Einol habgátló (Biotto Co.) adagolásával végezzük. A tenyésztés befejeztekor a sejtkoncentráció (OD650) 38,0 egység, a képződött biotin koncentrációja pedig az 1. példában leírt kvantitatív mikrobiológiai módszerrel meghatározva 2,3 mg/1.
3. példa
A 2. példa szerint előállított tenyészet 15 literjét centrifugáljuk, a felülúszó pH-ját sósavval 3-as értékre állítjuk be, és 500 g aktívszénnel (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) töltött oszlopon vezetjük át. Az oszlopot 15 liter vízzel mossuk, majd 5 liter 0,1 N vizes ammóniaoldattal eluáljuk. Az eluátumot koncentráljuk, és 100 ml Dowex 1*8 (The Dow Chemical Co.) töltetű oszlopon vezetjük át. Az oszlopot 2 liter vízzel mossuk, majd 2 liter 1 N ecetsavval eluáljuk. Az eluátumot koncentráljuk, és 100 ml Dowex 50W-8 (The Dow Chemical Co.) töltetű oszlopon vezetjük át. Az elúciót 2 liter vízzel végezzük, és az eluátumot 50 g aktívszénnel töltött oszlopon vezetjük át. Az oszlopot 500 ml vízzel mossuk, majd 500 ml 0,1 N vizes ammóniaoldattal eluáljuk. Az eluátumot szárazra pároljuk, a maradékot feloldjuk 5 ml 0,1 N nátrium-hidroxid oldatban, és gélkromatografálással tisztítjuk 50 ml Sephadex G-10 (Pharmacia AB) töltetű oszlopon. A biotint tartalmazó frakciókat egyesítjük, a pH értékét 0,05 N sósavval 3-ra állítjuk, és éjszakán át hideg helyen tartjuk. A kiváló kristályokat elválasztva és vákuumban szárítva 13 mg biotint kapunk. Az így nyert biotin fizikokémiai tulajdonságai (például tömegspektrum, infravörös spektrum) megegyeznek az autentikus biotin mintáéval.
4. példa
A Sphingomonas nemzetségbe tartozókhoz hasonló mikroorganizmusokból 1-1 oltókacsnyi mennyiséggel beoltunk nagy kémcsőben (22*220 mm) lévő 5-5 ml inokulumtáptalajt (1% glicerin, 2% polipepton, 0,15% MgSO4.7H2O, pH = 7,2), és három napon át 30 °C-on 250/perc fordulatszámmal rázatjuk. A tenyésztés befejeztével a képződött biotin mennyiségét az 1. példában leírt kvantitatív mikrobiológiai módszerrel meghatározzuk. Az eredményeket az 1. táblázat tartalmazza.
HU 215 083 Β
1. táblázat
Mikroorganizmus Biotintermelés (ág/l) Növekedés 30 °C-on
Flavobacterium flavescens JCM 7456 nyomokban +
Flavobacterium okeanokoites IFO 12536 nyomokban +
Pseudomonas auricularis IFO 13334 Nyomokban +
Pseudomonas bathycetes JCM 6308 nyomokban +
Pseudomonas chlororaphis IFO 3904 nyomokban +
Pseudomonas diminuta JCM 2788 nyomokban +
Pseudomonas fluorescens IFO 14160 nyomokban +
Pseudomonas fragi IFO 3458 nyomokban +
Pseudomonas mucidolens JCM 2781 nyomokban +
Pseudomonas nitroreducens JCM 2782 nyomokban +
Pseudomonas oxalaticus IFO 13593 nyomokban +
Pseudomonas pertucinogena IFO 14163 nyomokban +
Pseudomonas putida IFO 14164 nyomokban +
Pseudomonas riboflavina IFO 13584 nyomokban +
Pseudomonas straminea JCM 2783 nyomokban +
Pseudomonas vesicularis JCM 1477 nyomokban +
Pseudomonas fluorescens nyomokban* +*
Pseudomonas aeruginosa nyomokban* +*
Pseudomonas taetrolens IFO 3460 nyomokban* * +**
Sphingomonas adhaeshiva JCM 7370 2,3 +
Sphingomonas parapaucimobilis JCM 7512 3,1 +
Sphingomonas paucimobilis IFO 13935 9,8 +
Sphingomonas paucimobilis IFO 13936 6,4 +
Sphingomonas paucimobilis JCM 7509 5,8 +
Sphingomonas paucimobilis JCM 7511 12,4 +
Sphingomonas paucimobilis JCM 7515 13,7 +
Sphingomonas paucimobilis JCM 7519 15,5
Sphingomonas paucimobilis JCM 7521 9,5 +
Sphingomonas sp. JCM 7513 2,7 +
Sphingomonas sp. JCM 7514 4,2 +
Sphingomonas sp. (FERM BP-3995) SC-41405 17,4 +
Xanthomonas campestris IFO 13551 — -
Xanthomonas maltophilia JCM 1975 — -
* Agr. Bioi. Chem. 29. 10, 889-894 (1965), *♦ Agr. Bioi. Chem. 45. 9, 1983-1989(1981).

Claims (2)

1. Eljárás biotin előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) valamely a Sphingomonas nemzetségbe tartozó, biotintermelő képességgel rendelkező mikroorganizmust alkalmas tápközegben tenyésztünk; és (b) a képződő biotint a tápközegből kinyerjük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Sphingomonas nemzetségbe tartozó, biotinter50 melő képességgel rendelkező mikroorganizmusként
Sphingomonas sp. SC-42405 (FERM BP—3995) jelű törzset vagy annak mutánsát alkalmazzuk.
HU9302568A 1992-09-10 1993-09-10 Eljárás biotin előállítására HU215083B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP24174892 1992-09-10

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9302568D0 HU9302568D0 (en) 1993-11-29
HUT67685A HUT67685A (en) 1995-04-28
HU215083B true HU215083B (hu) 1998-09-28

Family

ID=17078957

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9302568A HU215083B (hu) 1992-09-10 1993-09-10 Eljárás biotin előállítására

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5432067A (hu)
EP (1) EP0589285B1 (hu)
JP (1) JP3428078B2 (hu)
KR (1) KR100297619B1 (hu)
CN (1) CN1050153C (hu)
AT (1) ATE174966T1 (hu)
DE (1) DE69322720T2 (hu)
DK (1) DK0589285T3 (hu)
ES (1) ES2126619T3 (hu)
HU (1) HU215083B (hu)
TW (1) TW255913B (hu)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4329129B2 (ja) 1997-03-03 2009-09-09 住友化学株式会社 ビオチン生合成遺伝子を含むｄｎａ断片およびその利用
AU3677100A (en) * 1999-04-12 2000-11-14 Arkray, Inc. Alpha-glycated amino acid releasing enzyme
US20100145116A1 (en) 2007-03-08 2010-06-10 Frederik Van Keulen Production of High-Purity Carotenoids by Fermenting Selected Bacterial Strains
CN102491908A (zh) * 2011-12-16 2012-06-13 华东理工大学 一种生物素生产废水中手性胺的回收方法
KR102130241B1 (ko) 2019-01-09 2020-07-03 강명구 빙상용 썰매
WO2021050371A1 (en) * 2019-09-09 2021-03-18 Albert Einstein College Of Medicine Biotin synthases for efficient production of biotin
KR102712136B1 (ko) * 2021-11-15 2024-09-27 씨제이제일제당 (주) 바이오틴 신타제 활성을 갖는 폴리펩티드 변이체 및 이를 이용한 바이오틴 생산 방법

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3393129A (en) * 1964-12-23 1968-07-16 Takeda Chemical Industries Ltd Method for producing d-biotin
HU168313B (hu) * 1972-06-13 1976-03-28
JPS56160998A (en) * 1980-05-15 1981-12-11 Nippon Zeon Co Ltd Production of biotin active substance biotin vitamer
CA1322735C (en) * 1987-11-07 1993-10-05 Shinichiro Haze Microorganism having low acetate forming capability, and process for production of useful substrate using same
JP2722504B2 (ja) * 1988-07-14 1998-03-04 田辺製薬株式会社 新規微生物及びそれを用いるｄ−ビオチンの製法
CN1053217C (zh) * 1990-03-27 2000-06-07 资生堂株式会社 新的微生物以及利用这些微生物生产生物素同效维生素的方法
JP3006847B2 (ja) * 1990-03-27 2000-02-07 株式会社資生堂 新規微生物およびそれを用いるビオチン類の製造方法
DE4106375A1 (de) * 1991-02-28 1992-09-03 Degussa Eine l-carnitin-amidase produzierender mikroorganismus, l-carnitin-amidase, verfahren zu deren gewinnung und deren verwendung

Also Published As

Publication number Publication date
EP0589285A2 (en) 1994-03-30
US5432067A (en) 1995-07-11
DE69322720T2 (de) 1999-07-08
HUT67685A (en) 1995-04-28
KR100297619B1 (ko) 2001-10-24
CN1084217A (zh) 1994-03-23
HU9302568D0 (en) 1993-11-29
KR940007188A (ko) 1994-04-26
DE69322720D1 (de) 1999-02-04
EP0589285A3 (en) 1995-02-15
ES2126619T3 (es) 1999-04-01
DK0589285T3 (da) 1999-08-23
EP0589285B1 (en) 1998-12-23
JP3428078B2 (ja) 2003-07-22
TW255913B (hu) 1995-09-01
ATE174966T1 (de) 1999-01-15
JPH06133790A (ja) 1994-05-17
CN1050153C (zh) 2000-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ikeda et al. Safracins, New Antitumor Antibiotics I. Producing Organism, Fermentation and Isolation
CA2143545C (en) Process for producing optically active 4-hydroxy-2-ketoglutaric acids
WO2005098014A1 (fr) Procédé microbien de production de valiénamine et de validamine
HU215083B (hu) Eljárás biotin előállítására
HU202918B (en) Process for producing acidic urease
Wakisaka et al. Hygromycin and epihygromycin from a bacterium, Corynebacterium equi No. 2841
Kawai et al. Bacterial assimilation of polytetramethylene glycol
CA1336414C (en) D-amidase and process for producing d-–-alanine and/or l-–-alanineamide
US4751182A (en) Process for preparing L-carnitine from DL-carnitine
JPH022589B2 (hu)
JP3117294B2 (ja) 新規抗生物質及びその製造法
JP2936663B2 (ja) Ｆｒ９０１２２８物質の製造方法
US5869319A (en) Bile acid-converting microorganism Bacillus sp. and a method of use
JP3012922B2 (ja) 多糖の生産方法
AU706847B2 (en) Novel bile acid-converting microorganism
EP0275065A2 (en) New phosphorylase producing microorganism
JPH0691831B2 (ja) １３β−１３−デオキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチン−Ｂｌａ／Ｂｌｂアグリコンの微生物学的製造
US4393047A (en) Antibiotic cytophagin and a process for producing the same
JP3796539B2 (ja) グリセロ糖脂質の製造方法及びそれに用いる微生物
JP3712290B2 (ja) ｄ−デチオビオチンの製造法
JP2857936B2 (ja) 光学活性なα−メチルベンジルアミンの製造法
JPH02306992A (ja) 抗生物質ｒｋ―１０６１ｇ及びｒｋ―１０６１ｈ並びにその製造法
JP2000270887A (ja) Ｄ−３−（２−ナフチル）アラニンの製造方法
JPH08196288A (ja) 長鎖脂肪酸の製造法
EP0187869A1 (en) Process for preparing lipase

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee