HRP20020851A2 - Sodium-hydrogen exchanger type 1 inhibitor (nhe-1) - Google Patents

Description

Pozadina izuma

Ovaj izum odnosi se na inhibitor natrij-vodikovog izmjenjivača tipa 1 (NHE-1).

Kod ambulantnog pacijenta, kao i u uvjetima kirurške operacije može doći do ishemične ozljeda miokarda, koja može uzrokovati pojavu iznenadne smrti, infarkta miokarda, odnosno kongestivne srčane insuficijencije. U medicini još uvijek postoji potreba za sprječavanjem, odnosno ublažavanjem, ishemične ozljede miokarda, osobito infarkta miokarda tijekom kirurške operacije. Za takvu terapiju očekuje se da će spašavati živote, te da može smanjiti potrebu za hospitalizacijom, poboljšati kvalitetu života, kao i smanjiti ukupne troškove zdravstvene njege kod visokorizičnih pacijenata.

Farmakološka kardioprotekcija ublažila bi pojavnost i napredovanje infarkta miokarda, kao i disfunkciju do koje dolazi u ovim kirurškim uvjetima (tijekom operacije). Osim za ublažavanje oštećenja miokarda i poboljšavanje postishemične funkcije miokarda kod pacijenata s ishemičnom bolešću srca, kardioprotekcija bi također smanjila pojavnost pobola i smrtnosti u vezi sa srcem, zbog infarkta miokarda i disfunkcije kod "rizičnih" pacijenata (poput onih starijih od 65 godina, nesposobnih za fizičke napore, s bolešću koronarnih arterija, dijabetes melitusom, hipertenzijom), kod kojih je potreban kirurški zahvat kojeg se ne provodi na srcu.

Još nije posve shvaćen mehanizam, odnosno mehanizmi, odgovorni za ozljedu miokarda opaženu nakon ishemije i reperfuzije.

Niz različitih patenata otkriva upotrebu gvanidinskih derivata kao korisnih u liječenju, primjerice, aritmija.

Patentna prijava PCT/IB99/00206, objavljena 2. rujna 1999. kao WO 99/43663, čije je otkriće uključeno u ovu specifikaciju kao referenca, otkriva niz različitih inhibitora NHE-1, uključujući [5ciklopropil-1-(kinolin-5-il)-1H-pirazol-4-karbonil]gvanidin. Taj patent također iznosi da "poželjne soli neposredno gore navedenog spoja su mono- ili dimesilatne soli". Jedna grupa poželjnih spojeva, što uključuje hidroksikinolinske spojeve, opisana je u patentnom zahtjevu 102 dotičnog izuma. Naravno, neki od tih hidroksikinolinskih spojeva mogu postojati u nekoliko tautomernih oblika, poput kinolonskog oblika, kao što je opisano u tom patentu. Osim toga, zajednički naznačena US privremena patentna prijava br. 60/162,374, podnesena je 29. listopada 1999., odnosi se na kristalne oblike gore opisanog inhibitora NHE-1.

Patentna prijava PCT/JP97/04650, objavljena 25. lipnja 1998., otkriva N-[(supstituirani 5- člani heteroaril)]gvanidinske spojeve kao korisne u svojstvu inhibitora Na+/H+-izmjene, samim tim djelotvorne u liječenju niza različitih bolesti, poput hipertenzije, aritmije, angine pektoris, infarkta miokarda, arterioskleroze, kao i dijabetičnih komplikacija.

Prema tome, u ovom području tehnike postoji jasna potreba i provodi se neprestana potraga za spojevima pogodnim za liječenje ishemije miokarda tijekom kirurške operacije.

Bit izuma

Ovaj izum odnosi se na spoj Formule I

[image] ,

njegov predlijek, ili farmaceutski prihvatljivu sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka, uz uvjet da [5ciklopropil-1-(kinolin-5-il)-1H-pirazol-4-karbonil]gvanidin nije uključen.

Kao što ga se upotrebljava u ovoj specifikaciji, izraz "njegov predlijek, ili farmaceutski prihvatljiva sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka" uključuje uvjet da [5-ciklopropil-1-(kinolin-5-il)-1H-pirazol-4karbonil]gvanidin nije uključen.

Ovaj izum također se odnosi na uglavnom čist [5-ciklopropil-1-(2-kinolon-5-il)-1H-pirazol-4-karbonil]gvanidin, ili na farmaceutski prihvatljivu sol navedenog spoja.

Gore navedeni spoj je alternativno nazvan [5-ciklopropil-1-(2-kinolon-5-il)-1H-pirazol-4-karbonil]gvanidin. Poželjna sol je hidroklorid, najpoželjnije, monohidroklorid.

Sljedeća izvedba ovog izuma je postupak liječenja sisavca (npr. ljudskog bića) s bolešću ili stanjem posredovanim s NHE-1, primjenom terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka, na sisavcu.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak ublažavanja oštećenja tkiva (npr. uglavnom sprječavajući oštećenje tkiva, potičući zaštitu tkiva) nastalog zbog ishemije, koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) kojem je potrebno takvo liječenje terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Poželjna ishemična tkiva, uzeta kao takva, ili kao grupa, su srčano, moždano, jetreno, bubrežno, plućno, crijeva, skeletnih mišića, slezene, gušterače, živčano, kralježničke moždine, mrežnice, krvnih žila ili crijevno tkivo.

Osobito poželjno ishemično tkivo je srčano tkivo.

Osobito je poželjno da se spoj Formule I, njegov predlijek, ili farmaceutski prihvatljivu sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka, primjenjuje kako bi se spriječilo pojavu ishemične ozljede miokarda tijekom kirurške operacije.

Po mogućnosti se spoj Formule I, njegov predlijek, ili farmaceutski prihvatljiva sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka, primjenjuje profilaktički.

Do ishemičnog oštećenja može doći prilikom presađivanja organa, bilo na organu ili na pacijentu.

Po mogućnosti se spoj Formule I, njegov predlijek, ili farmaceutski prihvatljivu sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka primjenjuje prije, tijekom i/ili ubrzo nakon kirurškog zahvata na srcu ili kirurškog zahvata kojeg se ne provodi na srcu.

U jednoj izvedbi ovog izuma spoj Formule I, njegov predlijek, ili farmaceutski prihvatljivu sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka, primjenjuje se lokalno.

Poželjno doziranje spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka, iznosi približno 0,01-100 mg/kg dnevno. Osobito poželjno doziranje spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka, iznosi približno 0,01-50 mg/kg dnevno.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak ublažavanja oštećenja tkiva miokarda (npr. uglavnom sprječavajući oštećenje tkiva, potičući zaštitu tkiva) tijekom kirurškog zahvata (npr. kirurških zahvata presađivanja premosnica na koronarne arterije (coronary artery bypass grafting, CABG), kirurških zahvata na krvnim žilama, perkutane transluminalne koronarne angioplastike (percutaneous tansluminal coronary angioplasty, PTCA), presađivanja organa, ili bilo kojih drugih kirurških zahvata koje se ne provodi na srcu), koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak ublažavanja oštećenja tkiva miokarda (npr. uglavnom sprječavajući oštećenje tkiva, potičući zaštitu tkiva) kod pacijenata koji pokazuju postojeće srčane (akutne koronarne sindrome, npr. infarkt miokarda ili nestabilnu anginu) ili cerebralne ishemične događaje (npr. inzult), koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na kronični postupak ublažavanja oštećenja tkiva miokarda (npr. uglavnom sprječavajući oštećenje tkiva, potičući zaštitu tkiva) kod pacijenta s dijagnosticiranom koronarnom bolešću srca (npr. s pretrpljenim infarktom miokarda ili nestabilnom anginom) ili pacijenata koji su u velikoj opasnosti od infarkta miokarda (npr. starost preko 65 godina, i dva ili više čimbenika opasnosti od koronarne bolesti srca), koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak sprječavanja ishemičnog oštećenja, koji se sastoji u kroničnoj oralnoj primjeni na sisavcu, kojem je potrebno takvo liječenje, terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak liječenja kardiovaskularnih bolesti, koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak liječenja arterioskleroze, koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak liječenja hipertenzije, koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak liječenja aritmije, koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak liječenja angine pektoris, koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak liječenja hipertrofije srca, koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak liječenja bubrežnih bolesti, koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak liječenja dijabetičnih komplikacija, koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak liječenja restenoze, koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak liječenja bolesti stanične proliferacije, koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak liječenja bolesti raka, koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak liječenja fibroznih bolesti, koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak liječenja glomerulske nefroskleroze, koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak liječenja plućne fibroze, koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak liječenja cerebralnih ishemičnih poremećaja, koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak liječenja srčanog zastoja, koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak liječenja disfunkcije miokarda, koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak liječenja cerebrovaskularnih bolesti, koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Sljedeća izvedba ovog izuma odnosi se na postupak liječenja hipertrofija ili hiperplazija organa, koji se sastoji u primjeni na sisavcu (npr. ženskom ili muškom ljudskom biću) terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Ovaj izum također se odnosi na farmaceutske pripravke, koji se sastoje od količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka, i farmaceutski prihvatljive podloge, vehikuluma ili razrjeđivača.

Ovaj izum također se odnosi na farmaceutske pripravke za ublažavanje oštećenja tkiva nastalog zbog ishemije, koji se sastoje od terapijski djelotvorne količine spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka, i farmaceutski prihvatljive podloge, vehikuluma ili razrjeđivača.

Namjera je da pojam "ublažavanje" uključuje djelomično sprječavanje ili sprječavanje koje je, iako djelotvornije od onog koje bi rezultiralo iz neuzimanja spoja, odnosno iz uzimanja placeba, manje od 100 %, uz praktički potpuno sprječavanje.

Pojam "oštećenje nastalo zbog ishemije", kao što ga se upotrebljava u ovoj specifikaciji, odnosi se na stanja izravno povezana sa smanjenim protokom krvi kroz tkivo, primjerice zbog ugruška ili začepljenja krvnih žila koje krvlju opskrbljuju odgovarajuće tkivo, što, između ostalog, rezultira smanjenim prijenosom kisika u takvo tkivo, slabijim radom tkiva, disfunkcijom tkiva i/ili nekrozom. Alternativno, prilikom moguće kvantitativno adekvatnog protoka krvi, odnosno perfuzije organa, sposobnost krvi, odnosno medija za perfuziju organa, da prenosi kisik može biti smanjena, npr. u hipoksičnom okolišu, tako da je opskrba tkiva kisikom smanjena, što uzrokuje slabiji rad tkiva, disfunkciju tkiva, i/ili nekrozu tkiva.

Pojmovi "liječiti", "liječenje" ili "obrada", kao što ih se upotrebljava u ovoj specifikaciji, uključuju preventivno (npr. profilaktičko) i palijativno liječenje.

Izraz "farmaceutski prihvatljiva sol" odnosi se na netoksične anionske soli koje sadrže anione, poput, no ne ograničujući se na klorid, bromid, jodid, sulfat, bisulfat, fosfat, acetat, maleat, fumarat, oksalat, laktat, tartarat, citrat, glukonat, metansulfonat (mesilat) i 4-toluensulfonat. Stoga što je tu prisutno više od jednog bazičnog ostatka ovaj izraz može uključiti višestruke soli (npr. di-sol). Ovaj izraz također se odnosi na netoksične kationske soli, poput, no ne ograničujući se na natrijeve, kalijeve, kalcijeve, magnezijeve, amonijeve ili protoniranog benzatina (N,N'dibenziletilendiamina), kolina, etanolamina, dietanolamina, etilendiamina, melamina (N-metilglukamina), benetamina (N-benzilfenetilamina), piperazina ili trometamina (2-amino-2-hidroksimetil-1,3-propandiola).

Izraz "predlijek" odnosi se na spojeve koji su preteče lijekova, iz kojih nakon primjene in vivo nastaje lijek putem nekih kemijskih ili fizioloških procesa (npr. predlijek prilikom dospijeća na fiziološki pH ili djelovanjem enzima prelazi u traženi oblik lijeka). I opet, uz uvjet da [5-ciklopropil-1-(kinolin-5-il)-1H-pirazol-4-karbonil]gvanidin nije uključen.

Pod "farmaceutski prihvatljivim" misli se da podloga, razrjeđivač, pomoćna sredstva, i/ili sol moraju biti kompatibilni s ostalim sastojcima formulacije, te da nisu štetni po primatelja.

Kao što ih se upotrebljava u ovoj specifikaciji, izrazi "reakcijski inertno otapalo" i "inertno otapalo" odnose se na otapalo, odnosno smjesu otapala, koji ne međudjeluju s polaznim materijalima, reagensima, međuproduktima ili produktima na način koji štetno utječe na prinos traženog produkta.

Treba imati na umu da spoj prema ovom izumu može postojati u radioaktivno obilježenom obliku, tj. spoj može sadržavati jedan ili više atoma atomske mase, odnosno masenog broja, koji se razlikuju od atomske mase, odnosno masenog broja, koji obično dolaze u prirodi. Radioizotopi vodika i ugljika uključuju 2H, 3H, odnosno 14C. Spojevi prema ovom izumu koji sadrži te radioizotope i/ili druge radioizotope drugih atoma ulaze u opseg zaštite ovog izuma. Zbog lakoće svog dobivanja i detektibilnosti osobito poželjni radioizotopi su tricij, tj. 3H, i ugljik-14, tj. 14C. Radioaktivno obilježeni spoj Formule I općenito se može dobiti postupcima dobro poznatim stručnjacima u ovom području tehnike. Pogodno se takve radioaktivno obilježene spojeve može dobiti postupcima iznijetim u Shemama i/ili u Primjerima, niže, zamjenom radioaktivno neobilježenog reagensa lako dostupnim radioaktivno obilježenim.

Ostale odlike i prednosti biti će očiti iz ove specifikacije, kao i patentnih zahtjeva, koji opisuju izum.

Detaljni opis izuma

Spoj Formule I metabolit je 5-ciklopropil-1-(kinolin-5-il)-1H-pirazol-4-karbonil]gvanidina, koji nastaje u ljudskom organizmu. Identificiran je iz uzoraka ljudske plazme dobivenih nakon intravenske primjene 5ciklopropil-1-(kinolin-5-il)-1H-pirazol-4-karbonil]gvanidina na ljudskim ispitanicima. Struktura ovog spoja neovisno je potvrđena kemijskom sintezom. U sljedećoj izvedbi ovog izuma [5-ciklopropil-1-(2-kinolon-5-il)-1H-pirazol-4-karbonil]gvanidin može se dobiti primjenom [5-ciklopropil-1-(kinolin-5-il)-1H-pirazol-4karbonil]gvanidina na ljudskom biću, te izdvajanjem traženog metabolita iz plazme. Alternativno metabolit ne treba izdvajati iz ljudskog bića jer nastaje in vivo.

Općenito se spoj prema ovom izumu može dobiti postupcima koji uključuju postupke analogne onima poznatim u kemijskoj tehnici, osobito u svjetlu ovdje sadržanog opisa izuma. Izvjesni postupci dobivanja spoja prema ovom izumu osigurani su kao daljnje odlike ovog izuma i prikazani su sljedećom reakcijskom shemom. Drugi postupci opisani su u eksperimentalnom dijelu.

Slijedi detaljni opis provedbe sinteze prema ovom izumu:

[image]

Prema gore prikazanoj shemi spoj formule IA (dobiven kao što je opisano u J.D. Capps i C.S. Hamilton: "J. Am. Chem. Soc.", 60, 2104, (1938.)) otopi se u protonskom otapalu, poput etanola, i obradi pogodnim reducensom, poput kositar(II)-klorid dihidrata. Dobivenu smjesu miješa se približno 30 minuta do približno 24 sata na temperaturi od približno 0-115°C. Dobivenu smjesu ohladi se do približno 23°C i filtrira. Dobiveni kruti materijal pročisti se na pogodan način, primjerice trituracijom s klorovodičnom kiselinom (primjerice 1 M vodenom otopinom), približno na temperaturi od 100°C, tijekom približno 1 sata, hlađenjem do približno 23°C, te filtriranjem, kako bi se dobilo spoj formule II, u obliku hidroklorida. Spoj formule II se alternativno može izdvojiti iz reakcijske smjese u obliku slobodne baze zaluživanjem anorganskom bazom, te ekstrakcijom pogodnim organskim otapalom. Spoj formule II također se može izdvojiti u obliku drugih soli. Stručnjacima u ovom području tehnike poznati su i drugi postupci redukcije kojima se provodi ovu redukciju, poput, primjerice, katalitičke hidrogenacije.

Spoj formule II diazotira se približno 15 minuta do približno 2 sata natrij-nitritom u klorovodičnoj kiselini i vodi, približno na temperaturi od 0°C. Dobivenu otopinu diazonijeve soli reducira se približno 30 minuta do približno 6 sati pogodnim reducensom, poput kositar(II)-klorid dihidrata u klorovodičnoj kiselini i vodi, približno na temperaturi od 0-23°C. Dobivenu krutinu prikupi se filtracijom i pročisti na pogodan način, primjerice trituracijom s klorovodičnom kiselinom (primjerice 1 M vodenom otopinom), približno na temperaturi od 23°C, tijekom približno 30 minuta. Spoj formule III prikupi se filtracijom, u obliku hidroklorida. Spoj formule III se alternativno može izdvojiti iz reakcijske smjese u obliku slobodne baze zaluživanjem anorganskom bazom, te ekstrakcijom pogodnim organskim otapalom. Spoj formule III također se može izdvojiti u obliku drugih soli. Stručnjacima u ovom području tehnike poznati su i drugi reducensi kojima se provodi ovu pretvorbu.

Spoj formule IV dobije se postupcima poznatim stručnjacima u ovom području tehnike, poput reakcije N,Ndialkilformamid-dialkil-acetala, primjerice N,N-dimetilformamid-dimetil-acetala, s esterom 3-ciklopropil-3oksopropanske kiseline, na temperaturi od približno 23-115°C, tijekom približno 1-4 sata, uz ili bez kiselinskog katalizatora. Za grupe R1 i R2 pogodne su bilo koja od alkilnih, cikloalkilnih, cikloalkilalkilnih ili arilalkilnih grupa. Osim toga, dvije grupe R2 mogu biti vezane zajedno kako bi tvorile cikličku strukturu.

Spoj formule IV približno 15 minuta do približno 12 sata reagira sa spojem formule III u alkoholnom otapalu, poput etanola, na temperaturi od približno 23-115°C. Kada se spoj formule III upotrebljava u obliku hidroklorida, reakciju je pogodno provesti u prisustvu nenukleofilne baze u suvišku, poput trietilamina. Spoj formule V prikupi se filtracijom. Alternativno se spoj formule V može izdvojiti i drugim postupcima, poput koncentriranja, nakon čega slijedi dodavanje vode i ekstrakcija pogodnim organskim otapalom. Alternativno se spoj formule V može dobiti upotrebom spoja formule III, kao i drugih spojeva, umjesto spoja formule IV, poput spoja u kojem je grupa (R2)2N zamijenjena grupom R2O.

Spoj formule V hidrolizira se približno 30 minuta do približno 12 sata bazom, poput natrij- ili litij-hidroksida, u otapalu poput vode i/ili metanola i/ili THF-a, po mogućnosti približno na 23°C, ili na povišenoj temperaturi, primjerice na temperaturi refluksa. Zatim se izdvoji kiselinu formule VI, primjerice uklanjanjem organskih otapala, zakiseljavanjem i filtriranjem. Alternativno se spoj formule VI može iz reakcijske smjese izdvojiti uklanjanjem organskih otapala, zakiseljavanjem, te ekstrakcijom pogodnim organskim otapalom.

Kiselina formule VI kondenzira se s gvanidinom u prisustvu pogodnog kondenzacijskog sredstva. Pogodno kondenzacijsko sredstvo je ono koje pretvara karboksilnu kiselinu u reaktivnu vrstu, koja tvori amidnu vezu prilikom reakcije s aminom.

Kondenzacijsko sredstvo može biti reagens, kojim se, prilikom miješanja zajedno s karboksilnom kiselinom i gvanidinom, ovu kondenzaciju provodi postupkom u jednoj posudi. Primjeri kondenzacijskih reagensa su 1(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid-hidroklorid/hidroksibenzotriazol (EDC/HBT), dicikloheksilkarbodiimid (DCC)/hidroksibenzotriazol (HBT), 2etoksi-1-etoksikarbonil-1,2-dihidrokinolin (EEDQ), kao i dietilfosforil-cijanid. Kondenzaciju se približno 1-48 sati provodi u inertnom otapalu, po mogućnosti neprotonskom otapalu, na temperaturi od približno -20°C do 50°C, u prisustvu gvanidina u suvišku, u svojstvu baze. Primjeri otapala uključuju acetonitril, diklormetan, dimetil-sulfoksid, dimetilformamid, kloroform, kao i njihove smjese.

Kondenzacijsko sredstvo također može biti sredstvo koje karboksilnu kiselinu prevodi u aktivirani međuprodukt kojeg se izdvoji i/ili dobije u prvom koraku, te mu se omogući da reagira s gvanidinom u drugom koraku. Primjeri takvih kondenzacijskih sredstava i aktiviranih međuprodukata su tionil-klorid odnosno oksalilklorid prilikom dobivanja kiselinskog klorida, cijanuril-fluorid prilikom dobivanja kiselinskog fluorida, ili alkilklorformijat, poput izobutil- ili izopropenil-klorformijata, ili propanfosfonski anhidrid (anhidrid propanfosfonske kiseline, PPA) s tercijarnim aminom kao bazom prilikom dobivanja miješanog anhidrida karboksilne kiseline, ili karboniidiimidazol prilikom dobivanja acilimidazola. Ako je kondenzacijsko sredstvo oksalil-klorid, pogodno je upotrijebiti malu količinu dimetilformamida kao suotapalo s drugim otapalom (poput diklormetana) radi katalize dobivanja kiselinskog klorida. Ovaj aktivirani kiselinski derivat može se kondenzirati miješanjem s međuproduktom u pogodnom otapalu, zajedno s pogodnom bazom. Pogodne kombinacije otapalo/baza su, primjerice, diklormetan, dimetilformamid ili acetonitril, ili njihove smjese u prisustvu gvanidina u suvišku, u svojstvu baze. Druge pogodne kombinacije otapalo/baza uključuju vodu ili ((C1-C5) alkohol) ili njihovu smjesu, zajedno sa suotapalom, poput diklormetana, tetrahidrofurana ili dioksana, i bazom, poput natrij-, kalij- ili litij- hidroksida, u dovoljnoj količini da se potroši kiselinu oslobođenu u reakciji. Stručnjacima u ovom području tehnike poznata je upotreba tih kondenzacijskih sredstava, uz odgovarajući odabir otapala i temperatura, ili se to u svjetlu ovog otkrića lako odredi iz literature. Ovi i drugi primjeri stanja korisnih za kondenzaciju karboksilnih kiselina opisani su u Houben Weyl, svezak XV, dio 11, izd. E. Wunsch, G. Thieme Verlag, 1974, Stuttgart; M. Bodanski: "Principles of Peptide Sinthesys", Springer-Verlag, Berlin, (1984.); i "The Peptides, Analysis, Sinthesys and Biology" (izd. E. Gross i J. Meienhofer), svezak 1-5 (Academic Press, NY, (19791983.)).

U jednoj se izvedbi kiselinu formule VI aktivira se tionil-kloridom u suvišku, približno na temperaturi refluksa, tijekom približno 15 minuta do približno 3 sata, a višak tionil-klorida ukloni koncentriranjem. Dobiveni kiselinski klorid pomiješa se s gvanidin-hidrokloridom u suvišku i anorganskom bazom, poput natrij-hidroksida u tetrahidrofuranu i vodi. Reakcijsku smjesu miješa se približno 30 minuta do približno 6 sati, po mogućnosti na 23°C ili na povišenoj temperaturi, primjerice temperaturi refluksa. Spoj formule I na različite načine se izdvaja iz ove reakcijske smjese. Primjerice, reakcijsku smjesu se koncentrira radi uklanjanja THF-a; vodenu otopinu kasnije se zakiseli do pH 9, a krutinu prikupi filtracijom. Alternativno se spoj formule I može izdvojiti ekstrakcijom organskim otapalom. Spoj formule I može se pretvoriti u odgovarajući hidroklorid obradom njegove otopine u metanolu klorovodikom u eteru, a dobivenu krutinu prikupiti filtracijom ili koncentriranjem. Druge soli može se dobiti analognim postupcima.

Stručnjaci u ovom području tehnike shvatit će da je također moguća pretvorba spoja formule V izravno u spoj formule I obradom spoja formule V gvanidinom u suvišku, u inertnom otapalu, poput alkoholnog otapala, primjerice etanola, ili, u odsustvu otapala, približno na temperaturi od 60-150°C.

Stručnjaci u ovom području tehnike shvatit će da spoj Formule I može postojati u nekoliko tautomernih oblika. Sve takve tautomerne oblike smatra se dijelom ovog izuma. Primjerice, svi tautomerni oblici karbonilgvanidinskog ostatka spoja Formule I ulaze u opseg zaštite ovog izuma. Svi tautomerni oblici 2kinolonskog ostatka spoja Formule I, poput 2-hidroksikinolinskog oblika, također ulaze u opseg zaštite ovog izuma.

Polazni materijali i reagensi za rad s gore opisanim spojevima također su lako dostupni, ili ih, konvencionalnim postupcima organske sinteze, lako mogu sintetizirati stručnjaci u ovom području tehnike.

Osim toga, kada spoj prema ovom izumu ima metabolite, njihovi hidrati ili solvati također ulaze u opseg zaštite ovog izuma.

Neki od spojeva (npr. predlijekovi) prema ovom izumu su kiseli i tvore sol s farmaceutski prihvatljivim kationom. Spojevi prema ovom izumu većinom su bazični i tvore sol s farmaceutski prihvatljivim anionom. Sve takve soli, uključujući di-soli, ulaze u opseg zaštite ovog izuma i može ih se dobiti konvencionalnim postupcima. Može ih se, primjerice, dobiti naprosto stavljanjem u međusobni dodir kiselih i bazičnih entiteta, bilo u vodenom, nevodenom ili djelomice vodenom mediju. Soli se prikupi, bilo filtracijom, taloženjem s otapalom, nakon čega slijedi filtracija, otparavanjem otapala, ili, u slučaju vodenih otopina, liofilizacijom, kako je najpogodnije.

Spoj Formule I, njegov predlijek, ili farmaceutski prihvatljiva sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka, inhibira prijenosni sustav natrij/protonske (Na+/H+) izmjene, te je prema tome koristan kao terapijsko ili profilaktičko sredstvo kod bolesti uzrokovanih ubrzavanjem prijenosnog sustava natrij/protonske (Na+/H+) izmjene, primjerice kardiovaskularnih bolesti [npr. arterioskleroze, hipertenzije, aritmije (npr. ishemične aritmije, aritmije zbog infarkta miokarda, aritmije nakon PTCA ili nakon trombolize itd.), angine pektoris, hipertrofije srca, infarkta miokarda, srčane insuficijencije (npr. kongestivne srčane insuficijencije, akutne srčane insuficijencije, hipertrofije srca itd.), restenoze nakon PTCA, šoka (npr. hemoragijskog šoka, endotoksinskog šoka itd.)], bubrežnih bolesti (npr. dijabetes melitusa, dijabetične nefropatije, ishemične akutne bubrežne insuficijencije itd.) organskih poremećaja povezanih s ishemijom ili reperfuzijom nakon ishemije [(npr. poremećaja povezanih s reperfuzijom srčanog mišića nakon ishemije, akutne bubrežne insuficijencije ili poremećaja uzrokovanih kirurškom obradom, poput kirurških zahvata presađivanja premosnica na koronarne arterije (CABG), kirurških zahvata na krvnim žilama, presađivanja organa, kirurških zahvata koje se ne provodi na srcu ili perkutane transluminalne koronarne angioplastike (PTCA)], cerebrovaskularnih bolesti (npr. ishemičnog inzulta, hemoragijskog inzulta itd.), cerebralnih ishemičnih poremećaja (npr. poremećaja povezanih s cerebralnim infarktom, poremećaja uzrokovanih kao posljedica nakon cerebralne apopleksije, ili cerebralnog edema). Spoj Formule I, njegov predlijek, ili farmaceutski prihvatljiva sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka, također se može upotrijebiti kao sredstvo za zaštitu miokarda tijekom kirurških zahvata presađivanja premosnica na koronarne arterije (CABG), kirurških zahvata na krvnim žilama, perkutane transluminalne koronarne angioplastike (PTCA), presađivanja organa, ili kirurških zahvata koje se ne provodi na srcu.

Po mogućnosti, spoj Formule I, njegov predlijek, ili farmaceutski prihvatljivu sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka, može se upotrijebiti kao sredstva za zaštitu miokarda prije, tijekom, ili nakon kirurških zahvata presađivanja premosnica na koronarne arterije (CABG), kirurških zahvata na krvnim žilama, perkutane transluminalne koronarne angioplastike (PTCA), presađivanja organa, ili kirurških zahvata koje se ne provodi na srcu.

Po mogućnosti, spoj Formule I, njegov predlijek, ili farmaceutski prihvatljivu sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka, može se upotrijebiti kao sredstva za zaštitu miokarda kod pacijenata koji pokazuju postojeće srčane (akutne koronarne sindrome, npr. infarkt miokarda ili nestabilnu anginu) ili cerebralne ishemične događaje (npr. inzult).

Po mogućnosti, spoj Formule I, njegov predlijek, ili farmaceutski prihvatljivu sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka, može se upotrijebiti kao sredstva za kroničnu zaštitu miokarda kod pacijenata s dijagnosticiranom koronarnom bolešću srca (npr. s pretrpljenim infarktom miokarda ili nestabilnom anginom) ili pacijenata koji su u velikoj opasnosti od infarkta miokarda (npr. starost preko 65 godina, i dva ili više čimbenika opasnosti od koronarne bolesti srca).

Osim toga, spoj Formule I, njegov predlijek, ili farmaceutski prihvatljiva sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka, istaknuti su zbog svog snažnog inhibicijskog učinka na staničnu proliferaciju, primjerice proliferaciju fibroblastnih stanica i proliferaciju stanica glatkih mišića krvnih žila. Zbog toga su spoj Formule I, njegov predlijek, ili farmaceutski prihvatljiva sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka, vrijedna terapijska sredstva namijenjena upotrebi kod bolesti kod kojih stanična proliferacija predstavlja primarni ili sekundarni uzrok, te ih se, prema tome, može upotrijebiti kao antiaterosklerotike, te kao sredstva protiv kasnih dijabetičnih komplikacija, bolesti raka, fibroznih bolesti, poput plućne fibroze, jetrene fibroze ili bubrežne fibroze, glomerulske nefroskleroze, hipertrofija ili hiperplazija organa, osobito hiperplazije ili hipertrofije prostate, plućne fibroze, dijabetičnih komplikacija ili povratne stenoze nakon PTCA, ili bolesti uzrokovanih ozljedom stanica endotela.

Korisnost spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka, kao medicinskih sredstava u liječenju bolesti, poput onih detaljno iznijetih u ovoj specifikaciji za sisavce (npr. ljudska bića), primjerice, zaštiti miokarda tijekom kirurškog zahvata ili zaštiti miokarda kod pacijenata koji pokazuju postojeće srčane ili cerebralne ishemične događaje ili kroničnoj kardioprotekciji kod pacijenata s dijagnosticiranom koronarnom bolešću srca, dokazana je aktivnošću spoja Formule I, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja, u konvencionalnim in vitro i drugim pretkliničkim testovima na kardioprotekciju [vidjeti in vivo test u H. Klein i suradnici: "Circulation", 92, 912-917, (1995.); test s izoliranim srcem u W. Scholz i suradnici: "Cardiovascular Research", 29, 260-268, (1995.); antiaritmijski test u M. Yasutake i suradnici: "Am. J. Physiol.", 36, H2430-H2440, (1994.); NMR test u Kolke i suradnici: "J. Thorac. Cardiovasc. Surg.", 112, 765-775, (1996.)]. Takvi testovi također osiguravaju način kojim se aktivnosti spoja Formule I, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka, može usporediti s aktivnostima drugih poznatih spojeva. Rezultati tih usporedbi korisni su u određivanju razina doziranja kod sisavaca, uključujući ljudska bića, prilikom liječenja takvih bolesti.

Mjerenje aktivnosti inhibitora ljudskog NHE-1

Metodologije mjerenja aktivnosti ljudskog NHE-1 i potentnosti njegovog inhibitora temelje se na onim objavljenim u Watson i suradnici: "Am. J. Physiol.", 24, G229-G238, (1991.)), gdje se NHE-om posredovano obnavljanje unutarstaničnog pH mjeri nakon unutarstaničnog zakiseljavanja. Tako se fibroblaste koji stabilno eksprimiraju ljudski NHE-1 (L. Counillon i suradnici: "Mol. Pharmacol.", 44, 1041-1045, (1993.) nasadi na kolagenom obložene ploče s 96 jažica (50,000 po jažici) i uzgaja do konfluentnosti u mediju za rast (DMEM s visokim sadržajem glukoze, 10 % fetalni goveđi serum, 50 µg/ml penicilina i streptomicina). Konfluentne ploče inkubira se 30 minuta na 37°C s pH senzitivnom fluorescentnpm sondom, BCECF-om, (5 µM; Molecular Probes, Eugene, OR). Stanice napunjene BCECF-om 30 minuta se inkubira na 37°C u mediju za zakiseljavanje (70 mM kolin-klorid, 50 mM NHCl4, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM glukoza, 10 mM HEPES, pH 7,5), zatim prebaci u Fluorescent Imaging Plate Reader (čitač fluorescentnog prikaza s ploča) (Molecular Devices, CA). Fluorescenciju BCECF-a prati se uz valnu duljinu pobude, odnosno emisije, od 485 nM odnosno 525 nM. Unutarstanično zakiseljavanje započne se brzom zamjenom medija za zakiseljavanje medijem za obnavljanje (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM glukoza, 10 mM HEPES, pH 7,5) ± ispitivani spoj, a NHE-om posredovano obnavljanje unutarstaničnog pH prati se kao naknadni vremenski ovisni porast fluorescencije BCECF-a. Potentnost inhibitora ljudskog NHE-1 izračunava se kao koncentraciju koja 50 % smanjuje obnavljanje unutarstaničnog pH (IC50). Pod tim uvjetima vrijednosti IC50 referentnih NHE-inhibitora amilorida i HOE-642 iznose za ljudski NHE-1 50 µM odnosno 0,5 µM. Spoj Formule I u gore navedenom testu pokazuje vrijednost IC50 od 200 nM.

Objavljeno je da kratki periodi ishemije miokarda, nakon čega slijedi reperfuzija koronarnih arterija, štiti srce od naknadne teške ishemije miokarda (Murri i suradnici: "Circulation", 74, 1124-1136, (1986.)). Ta pojava poznata je kao ishemično pretkondicioniranje.

Terapijske učinke spojeva prema ovom izumu u sprječavanju oštećenja srčanog tkiva nastalog zbog ishemičnog inzulta može se prikazati in vitro, prema načelima iznijetim u Liu i suradnici: ("Cardiovasc. Res.", 28, 10571061, (1994.)), kao što je specifično opisano u ovoj specifikaciji. Kardioprotekciju se, kao što je naznačeno smanjenjem infarkta miokarda, može uzrokovati farmakološki, agonistima adenozinskih receptora u izoliranim, retrogradno perfundiranim kunićjim srcima, kao modelu ishemičnog pretkondicioniranja miokarda in vitro (Liu i suradnici: "Cardiovasc. Res.", 28, 1057-1061, (1994.)). Niže opisano ispitivanje in vitro dokazuje da aktivni ispitivani spoj također može farmakološki dovesti do kardioprotekcije, tj. smanjiti veličinu infarkt miokarda, kada ga se primjenjuje na izoliranom kunićjem srcu. Učinke ispitivanog spoja uspoređuje se s ishemičnim pretkondicioniranjem, uz A1/A3 adenozinski agonist, APNEA (N6-[2-(4-aminofenil)etil]adenozin), za koji je dokazano da farmakološki dovodi do kardioprotekcije kod izoliranog kunićjeg srca (Liu i suradnici: "Cardiovasc. Res.", 28, 1057-1061, (1994.)). Točna metodologija opisana je niže.

Protokol upotrijebljen u tim eksperimentima u stopu slijedi onaj opisan u Liu i suradnici: "Cardiovasc. Res.", 28, 10571061, (1994.). Muške novozelandske bijele kuniće (3-4 kg) anestezira se pentobarbiton-natrijem (30 mg/kg, i.v.). Nakon što se postigne duboku anesteziju (određenu odsustvom refleksa žmirkanja oka) životinju se intubira i ventilira sa 100 % O2, uz upotrebu ventilacijskog uređaja za pozitivni tlak. Provede se lijevu torakotomiju, srce izloži, te labavo namjesti omču (2-0 svila) oko glavne grane lijeve koronarne arterije, približno na 2/3 udaljenosti od vrha srca. Srce se ukloni iz prsa i brzo (za <30 sekundi) priključi na Langendorffov uređaj. Srce se modificiranom Krebsovom otopinom (NaCl 118,5 mM, KCl 4,7 mM, MgSO4 1,2 mM, KH2PO4 1,2 mM, NaHCO3 24,8 mM, CaCl2 2,5 mM i glukoza 10 mM) retrogradno perfundira na nerecirculacijski način, uz stalan tlak od 10,7 kPa (80 mmHg) i temperaturu od 37°C. pH perfuzata održava se na 7,4-7,5 propuhivanjem s 95 % O2/5 % CO2. Temperaturu srca strogo se kontrolira upotrebom zagrijanih rezervoara za fiziološku otopinu, a voda oplakuje i cijevi za perfuziju i izolirano srce. Brzinu rada srca i tlakove u lijevoj klijetki određuje se gumenim balonom, umetnutim u lijevu klijetku i povezanim preko cijevi od nehrđajućeg čelika s pretvornikom tlaka. Intraventrikulski balon napuše se radi postizanja sistoličkog tlaka od 10,7-13,3 kPa (80-100 mmHg), odnosno dijastoličkog tlaka od �1,3 kPa (�10 mmHg). Ukupni koronarni protok također se neprestano prati ugrađenom sondom za mjerenje protoka i normalizira za težinu srca.

Srce se 30 minuta pusti neka se uravnoteži, za koje vrijeme srce mora pokazati stabilne tlakove u lijevoj klijetki, u okviru gore iznijetih parametara. Ako brzina rada srca padne ispod 180 otkucaja u minuti bilo kada prije 30-minutnog perioda lokalne ishemije brzinu rada srca podesi se približno na 200 otkucaja u minuti tijekom ostatka eksperimenta. Ishemično pretkondicioniranje uzrokuje se potpunim prekidom srčane perfuzije (općom ishemijom) u trajanju od 5 minuta, nakon čega slijedi reperfuzija u trajanju od 10 minuta. Lokalnu ishemiju osigurava se zatezanjem omče oko grane koronarne arterije. Nakon 30 minuta lokalne ishemije omču se otpusti, a srce reperfundira sljedećih120 minuta.

Farmakološka kardioprotekcija uzrokovana je infuzijom prethodno određene koncentracije ispitivanog spoja, počevši 30 minuta prije 30-minutne lokalne ishemije, uz nastavak do kraja 120-minutnog perioda reperfuzije. Srca koja prime ispitivani spoj ne prolaze kroz period ishemičnog pretkondicioniranja. Srca se (koja ne primaju ispitivani spoj) perfundira referentnim spojem, APNEA-om (500 nM), tijekom 5-minutnog perioda, koji završava 10 minuta prije 30-minutne lokalne ishemije.

Na kraju 120-minutnog perioda reperfuzije zategne se omču oko koronarne arterije, zatim se srce perfundira 0,5 % suspenzijom čestica fluorescentnog cink-cadmij-sulfata (1-10 µM) Duke Scientific Corp. (Palo Alto, CA); to oboji cijeli miokard, osim područja u opasnosti od razvoja infarkta (rizično područje). Srce se skine s Langendorffovog uređaja, osuši, umota u aluminijsku foliju i uskladišti preko noći na -20°C. Idućeg dana srce se izreže u 2 mm debele poprečne rezove, od vrha srca do vrha klijetki. Rezove se 20 minuta boji 1 % trifeniltetrazolijkloridom (triphenyl tetrazolium chloride, TTC) u fosfatno puferiranoj fiziološkoj otopini na 37°C. Stoga što TTC reagira s živim tkivom (koje sadrži NAD-ovisne dehidrogenaze) ova boja razlikuje između živog (crveno obojenog) tkiva i mrtvog tkiva (neobojenog, infarktom pogođenog tkiva). Infarktom pogođeno područje (bez boje) i rizično područje (bez fluorescentnih čestica) izračuna se za svaki rez lijeve klijetke pomoću prethodno kalibriranog analizatora slike. Radi normalizacije ishemičnih ozljeda u pogledu razlika u rizičnim područjima između srca podatke se izrazi kao odnos između infarktom pogođenog područja i rizičnog područje (% IA/AAR (infarct area vs. area-at-risk)). Sve podatke izrazi se kao srednju vrijednost ± standardna pogreška i statistički usporedi Mann-Whitneyevim neparametarskim testom, s Bonferronijevom korekcijom za višestruke usporedbe. Za signifikantnost se smatra da je p < 0,05.

Rezultate gore opisanog ispitivanja in vitro može se upotrijebiti kao dokaz da spojevi prema ovom izumu dovode do značajne kardioprotekcije u odnosu na kontrolnu grupu.

Primjenu spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka, može se provesti bilo kojim postupkom kojim se spoj Formule I, njegov predlijek, ili farmaceutski prihvatljivu sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka, po mogućnosti unosi u traženo tkivo (npr. jetreno i/ili srčano tkivo). Ti postupci uključuju oralni, parenteralni, intraduodenalni način unosa itd. Općenito, spoj Formule I, njegov predlijek, ili farmaceutski prihvatljivu sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka, primjenjuje se kao pojedinačnu (npr. jednom dnevno) ili višestruke doze, odnosno neprestanom infuzijom, primjerice u izotoničnoj fiziološkoj otopini.

Spoj Formule I, njegov predlijek, ili farmaceutski prihvatljiva sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka, koristan je, primjerice, u smanjivanju odnosno minimaliziranju oštećenja izravnim djelovanjem u bilo kojem tkivu koje može biti podložno ishemičnoj/reperfuzijskoj ozljedi (npr. srcu, mozgu, plućima, bubregu, jetri, crijevu, skeletnom mišiću, mrežnici), posredovanoj, primjerice, putem NHE-1, kao rezultatu ishemičnog događaja (npr. infarkta miokarda). Prema tome, aktivni spoj se korisno profilaktički upotrebljava u sprječavanju (tj. prospektivno, odnosno profilaktički), radi ublažavanja ili zaustavljanja oštećivanja tkiva (npr. tkiva miokarda), kod pacijenata u opasnosti od ishemije (npr. ishemije miokarda).

Općenito, spoj Formule I, njegov predlijek, ili farmaceutski prihvatljivu sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka, prema ovom izumu primjenjuje se oralno ili parenteralno (npr. intravenski, intramuskularno, supkutano ili intramedularno). Također može biti indicirana i topikalna primjena, primjerice kada pacijent pati od poremećaja probavnog sustava, ili kad god je lijek najpogodnije primijeniti na površinu tkiva ili organa, već kako to odredi nadležni liječnik.

Količina i vrijeme upotrebe primijenjenog spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka, ovisit će, naravno, o subjektu kojeg se liječi, o težini bolesti, o načinu primjene, te o procjeni liječnika koji propisuje lijek. Prema tome, zbog razlika između pacijenata, niže navedena doziranja su smjernice, a liječnik može istitrirati doze lijeka kako bi se postiglo učinak koji liječnik smatra pogodnim za pacijenta. Uzimajući u obzir željeni stupanj liječenja liječnik mora naći ravnotežu između niza različitih čimbenika, poput dobi pacijenta, prisustva postojeće bolesti, kao i prisustva drugih bolesti (npr. kardiovaskularne bolesti).

Tipično se upotrebljava količinu spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka, djelotvornu u zaštiti od ishemije. Poželjno doziranje iznosi približno 0,01-100 mg/kg dnevno spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka, prema ovom izumu. Osobito poželjno doziranje iznosi približno 0,01-50 mg/kg dnevno spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka, prema ovom izumu.

U jednom režimu primjene spoj Formule I, njegov predlijek, ili farmaceutski prihvatljivu sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka, može se, kada postoji opasnost od ishemije miokarda, primijeniti neposredno prije kirurškog zahvata na srcu (npr. unutar 24 sata prije kirurškog zahvata), tijekom ili nakon kirurškog zahvata na srcu (npr. unutar 24 sata nakon kirurškog zahvata). U osobito poželjnom režimu infuziju se primjenjuje u udarnoj dozi od približno 1-300 mg, tijekom približno 1 minute do približno 1 sat prije kirurškog zahvata, nakon čega slijedi neprestana infuzija od približno 1-100 mg/kg dnevno tijekom ostatka perioda prije kirurškog zahvata, tijekom kirurškog zahvata, te i nakon kirurškog zahvata, uključujući, primjerice, približno 2-7 dana nakon kirurške obrade. Spoj prema ovom izumu također se može primijeniti u kroničnom dnevnom režimu.

Spoj Formule I, njegov predlijek, ili farmaceutski prihvatljivu sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka, općenito se primjenjuje u obliku farmaceutskog pripravka, koji se sastoji od spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka, zajedno s farmaceutski prihvatljivim vehikulumom, podlogom ili razrjeđivačem. Prema tome, spoj Formule I, njegov predlijek, ili farmaceutski prihvatljivu sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka, može se primijeniti u bilo kojem konvencionalnom oralnom, parenteralnom, rektalnom ili transdermalnom obliku doziranja.

Prilikom oralne primjene farmaceutski pripravak može biti u obliku otopina, suspenzija, tableta, pilula, kapsula, prašaka i slično. Tablete koje sadrže različita pomoćna sredstva, poput natrij-citrata, kalcij-karbonata i kalcijfosfata, upotrebljava se zajedno s različitim sredstvima za raspadanje, poput škroba, po mogućnosti krumpirovog ili tapiokinog škroba, i izvjesnih složenih silikata, zajedno s vezivima, poput polivinilpirolidona, saharoze, želatine i arapske gume. Osim toga, prilikom tabletiranja su često vrlo korisna i maziva, poput magnezij-stearata, natrij-lauril-sulfata i talka. Krute pripravke sličnog tipa također se upotrebljava kao punila za meke i tvrde želatinske kapsule; poželjni materijali s tim u vezi također uključuju laktozu (mliječni šećer), kao i visokomolekulske polietilen-glikole. Kada se prilikom oralne primjene želi upotrijebite vodene suspenzije i/ili ljekovite napitke, spojeve prema ovom izumu može se kombinirati s različitim sladilima, aromama, bojama, emulgatorima i/ili suspendirajućim sredstvima, kao i razrjeđivačima poput vode, etanola, propilen-glikola, glicerola i njihovih različitih kombinacija.

Prilikom parenteralne primjene može se upotrijebiti otopine, primjerice u sezamovom ili kikirikijevom ulju, ili u vodenoj otopini propilen-glikola, kao i sterilne vodene otopine odgovarajućih vodotopivih soli. Takve vodene otopine može se, po potrebi, pogodno puferirati, a tekući razrjeđivač najprije izotonizirati dovoljnom količinom fiziološke otopine ili glukoze. Te vodene otopine osobito su pogodne prilikom intravenskih, intramuskularnih, supkutanih i intraperitonealnih injekcija. S tim u vezi, sve upotrebljavane sterilne vodene medije lako se načini standardnim tehnikama dobro poznatim stručnjacima u ovom području tehnike.

Prilikom transdermalne (npr. topikalne) primjene načini se razrijeđene sterilne vodene otopine ili djelomice vodene otopine (obično u koncentraciji od približno 0,1-5 %), inače slične gore navedenim parenteralnim otopinama.

Stručnjacima u ovom području tehnike poznati su postupci priprave različitih farmaceutskih pripravaka s određenom količinom aktivnog sastojka, ili će im biti očiti u svjetlu ovog otkrića. U pogledu primjera postupaka priprave farmaceutskih pripravaka vidjeti Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easter, Pa., 15. izdanje, (1975.).

Farmaceutski pripravci prema ovom izumu mogu, primjerice, sadržavati 0,0001-95 % spoja Formule I, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka. U svakom slučaju, pripravak odnosno formulacija koje će se primijeniti sadržavat će količinu djelotvornu u liječenju bolesti/stanja kod subjekta kojeg se liječi.

Spoj Formule I, njegov predlijek, ili farmaceutski prihvatljivu sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka, općenito će se primijeniti u pogodnoj formulaciji. Primjeri sljedećih formulacija samo su ilustrativni i nije im cilj ograničiti opseg zaštite ovog izuma.

U sljedećim formulacijama "aktivni sastojak" se odnosi na spoj Formule I, njegov predlijek, ili farmaceutski prihvatljivu sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

Formulacija 1: Želatinske kapsule

Uz upotrebu sljedećeg načini se tvrde želatinske kapsule:

[image]

Uz upotrebu sljedećih sastojaka načini se tabletnu formulaciju:

Formulacija 2: Tablete

[image]

Kako bi se načinilo tablete, komponente se pomiješa i komprimira.

Alternativno, na sljedeći način načini se tablete, od kojih svaka sadrži 0,25-100 mg aktivnih sastojaka:

Formulacija 3: Tablete

[image]

Aktivni sastojak, škrob i celulozu propusti se kroz sito US mesh-broj 45 (aperture 0,36 mm) i temeljito miješa. Otopinu polivinilpirolidona pomiješa se s dobivenim prašcima, koje se zatim propusti kroz sito US mesh-broj 14 (aperture 1,14 mm). Tako dobivene granule osuši se na 50-60°C i propusti kroz sito US mesh-broj 18 (aperture 0,89 mm). Kako bi se načinilo tablete, natrij-karboksimetilškrob, magnezij-stearat i talk najprije se propusti kroz sito US meshbroj 60 (aperture 0,27 mm), zatim ih se doda granulama koje se, nakon miješanja, komprimira na stroju za tabletiranje.

Suspenzije, od kojih svaka sadrži 0,25-100 mg aktivnog sastojka po dozi od 5 ml načini se na sljedeći način:

Formulacija 4: Suspenzije

[image]

Kako bi se dobilo glatku pastu aktivni sastojak propusti se kroz sito US mesh-broj 45 (aperture 0,36 mm) i miješa s natrijkarboksimetilcelulozom i sirupom. Otopinu benzojeve kiseline, aromu i boju razrijedi se s nešto vode, te doda uz miješanje. Zatim se doda dovoljno vode radi postizanja potrebnog volumena.

Načini se otopinu za aerosol koja sadrži sljedeće sastojke:

Formulacija 5: Aerosol

[image]

Aktivni sastojak pomiješa se s etanolom, a tu smjesu doda se dijelu freona 22, ohladi do 30°C, te prebaci u uređaj za punjenje. Zatim se spremnik od nehrđajućeg čelika napuni traženom količinom, koju se razrijedi ostatkom pogonskog plina. Spremnik se zatim opremi ventilnim uređajem.

Supozitorije se načini na sljedeći način:

Formulacija 6: Supozitoriji

[image]

Aktivni sastojak propusti se kroz sito US meshbroj 60 (aperture 0,27 mm) i suspendira u gliceridima zasićenih masnih kiselina, prethodno rastaljenim uz najblaže nužno zagrijavanje. Smjesu se zatim izlije u kalup za supozitorije nominalnog kapaciteta 2 g, te je se pusti neka se ohladi.

Intravensku formulaciju dobije se na sljedeći način:

Formulacija 7: Intravenska otopina

[image]

Otopinu gore navedenih sastojaka intravenski se primijeni na pacijentu.

Opći eksperimentalni postupci

300 i 400 MHz 1H NMR spektri snimljeni su spektrometrom Varian Uniti+ 300 ili 400 (Varian Co., Palo Alto, CA), opremljenim s dva RF kanala, posrednom detekcija, uz gradijente pulsirajućeg polja (samo po z-osi). Spektre se općenito dobije na temperaturi blizu sobne (21°C), uz upotrebu standardnih auto-lock i auto-shim postupaka za krivudajuće uzorke. Kemijski pomaci izraženi su u dijelovima na milijun niz polje od trimetilsilana. Oblike vršnih vrijednosti označava se na sljedeći način: s, singlet; d, dublet; t, triplet, q, kvartet (quartet); m, multiplet; bs, široki (broad) singlet. Rezonance označene kao izmjenjive ne pojavljuju se u odvojenom NMR eksperimentu u kojem se uzorak protrese s nekoliko kapi D2O u istom otapalu. Spektri masa uz kemijsku ionizaciju na atmosferskom tlaku (atmospheric pressure chemical ionization mass spectra, APCIMS) dobiveni su na Fisons Platform II ili Micromass ZMD spektrometru (Micromass, Manchester, GB). Kada se opisuje intenzitet iona koji sadrže klor ili brom opaža se očekivani odnos intenziteta (približno 3:1 za ione koji sadrže 35Cl/37Cl, odnosno 1:1 za ione koji sadrže 79Br/81Br), a M se temelji na 35Cl odnosno 79Br. U izvjesnim slučajevima daje se samo reprezentativne vršne vrijednosti za 1H NMR i APCIMS.

Kromatografiju na stupcu provodi se bilo s Baker Silica Gel (40 µm) (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) ili Silica Gel 60 (EM Sciences, Gibbstown, NJ) na staklenim stupcima ili na Flash 12, 40 ili 75 (Biotage) (Charlottesville, VA) stupcima, pod niskim tlakom dušika. Radijalnu kromatografiju provodi se na uređaju Chromatotron, (Harrison Research, Palo Alto, CA.) Ako se drugačije ne navede, upotrebljava se reagense dobivene na tržištu. Dimetilformamid, 2-propanol, metanol, dimetil-sulfoksid, 1,2-dikloretan, tetrahidrofuran, toluen, diklormetan, kao i druga reakcijska otapala, u bezvodnim su obliku dobavljena od strane Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wisconsin). Mikroanalize su provedene u Schwarzkopf Microanalitical Laboratory (Schwarzkopf mikroanalitički laboratorij), Woodside, NY. Izrazi "koncentriran u vakuumu" i "uklonjen u vakuumu" odnose se na uklanjanje otapala pod sniženim tlakom na rotacijskom otparivaču, uz temperaturu kupelji nižu od 90°C. Reakcije provedene na "0-20°C" odnosno "0-25°C" provodi uz početno hlađenje posude u izoliranoj ledenoj kupelji, koju se tijekom nekoliko sati pusti neka se zagrije na sobnu temperaturu. Kratice "min" i "h" odnose se na "minute" odnosno "sate".

Primjer 1

5-amino-2-kinolon-hidroklorid

Otopinu 5-nitro-2-kinolona (12,37 g, 65 mmol) (dobivenog kao što je opisano u J.D. Capps i C.S. Hamilton: "J. Am. Chem. Soc.", 60, 2104, (1938.)) u EtOH (176 ml) u atmosferi dušika obradi se s SnCl2·2H2O (73,4 g, 325 mmol). Heterogenu reakcijsku smjesu pusti se neka se 2 sata miješa na 23°C, te je se 2 sata grije na refluksu. Dobivenu heterogenu smjesu ohladi se do 23°C i filtrira. Kruti materijal 1 sat se triturira u HCl (1 M vodena otopina, 78 ml, 78 mmol) na refluksu, ohladi do 23°C, te filtrira kako bi se dobilo 10,08 g traženog produkta (prinos 78 %).

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) � 6,42 (d, J = 10, 1H), 6,71 (d, J = 7,6, 1H), 6,81 (d, J = 8, 1H), 7,27 (d, J = 8, 1H), 8,04 (d, J = 10, 1H), 11,71 (bs, 1H).

APCIMS 161 [M + 1]+

Primjer 2

5-hidrazino-2-kinolon-hidroklorid

Otopinu 5-amino-2-kinolon-hidroklorida (10,08 g, 51,2 mmol) u HCl (koncentrirana, 42,7 ml) i H2O (18,2 ml) na 0°C obradi se ukapavanjem otopine NaNO2 (3,53 g, 51,2 mmol) u H2O (26,4 ml), uz održavanje temperature ispod 5°C. Dobivenu crvenu suspenziju pusti se neka se 1 sat miješa na 0°C.

U odvojenoj trogrloj tikvici okruglog dna, opremljenoj mehaničkim miješalom, mulj SnCl2·2H2O (25,41 g, 112,6 mmol) u HCl (koncentrirana, 34,2 ml) i H2O (93,9 ml) ohladi se do 0°C. Tu suspenziju obradi se ukapavanjem suspenzije crvene diazonijeve soli dobivene gore, uz održavanje temperature ispod 5°C. Reakcijsku smjesu zagrije se do 23°C, te je se pusti neka se miješa 3 sata. Dobivenu suspenziju se filtrira. Prikupljenu krutinu 30 minuta se triturira s HCl (1 M vodena otopina, 61,4 ml, 61,4 mmol) na 23°C. Krutinu se prikupi filtracijom kako bi se dobilo 7,88 g traženog produkta (prinos 73 %).

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) � 6,43 (d, J = 10, 1H), 6,63 (d, J = 8, 1H), 6,88 (d, J = 8, 1H), 7,38 (t, J = 8, 1H), 7,98 (d, J = 10, 1H), 8,97 (bs, 1H), 10,40 (bs, 1 H), 11,77 (bs, 1 H).

APCIMS 176 [M + 1]+

Primjer 3

metil-5-ciklopropil-1-(2-kinolon-5-il)-1H-pirazol-4-karboksilat

Otopinu metil-3-ciklopropil-2-(dimetilaminometilen)-3-oksopropanoata (7,85 g, 39,8 mmol) u EtOH (257 ml) obradi se u atmosferi dušika trietilaminom (7,77 ml, 55,8 mmol), nakon čega slijedi 5-hidrazino-2-kinolon-hidroklorid (7,88 g, 37,2 mmol). Dobivenu heterogenu reakcijsku smjesu 4 sata se grije na refluksu, te ohladi do 23 °C. Blijedožutu krutinu istaloži se i prikupi filtracijom kako bi se dobilo 5,06 g traženog produkta (prinos 44 %).

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) � 0,59-0,73 (m, 4H), 1,87 (m, 1H), 3,79 (s, 1 H), 6,54 (d, J = 10, 1H), 7,17 (d, J = 10, 1H), 7,34 (d, J = 7,5, 1H), 7,49 (d, J = 8, 1H), 7,66 (t, J = 8, 1H), 8,08 (s, 1H), 12,10 (bs, 1H).

APCIMS 310 [M + 1]+

Primjer 4

5-ciklopropil-1-(2-kinolon-5-il)-1H-pirazol-4-karboksilna kiselina

Mulj metil-5-ciklopropil-1-(2-kinolon-5-il)-1H-pirazol-4-karboksilata (5,06 g, 16,4 mmol) u THF-u (81,8 ml) i MeOH (40,9 ml) obradi se s LiOH (1 M vodena otopina, 81,8 ml, 81,8 mmol), te 2,5 sati grije na refluksu. Dobivenu heterogenu smjesu ohladi se do 23 °C. MeOH i THF ukloni se u vakuumu. Dobiveni mulj ohladi se do 0°C, te s HCl (koncentrirana) zakiseli do pH 3-4. Smjesu se filtrira. Krutinu se osuši kako bi se dobilo 4,94 g traženog produkta (prinos 100 %).

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) � 0,58 (d, J = 4,4, 2H), 0,64 (d, J = 8, 2H), 1,82 (m, 1H), 6,50 (d, J = 10, 1H), 7,12 (d, J = 10, 1H), 7,27 (d, J = 7,6, 1H), 7,44 (d, J = 8,4, 1 H), 7,60 (t, J = 8, 1H), 7,97 (s, 1H), 12,03 (bs, 1H), 12,38 (bs, 1H).

APCIMS 296 [M + 1]+

Primjer 5

[5-ciklopropil-1-(2-kinolon-5-il)-1H-pirazol-4-karbonil]gvanidin-hidroklorid

Otopinu 5-ciklopropil-1-(2-kinolon-5-il)-1H-pirazol-4-karboksilne kiseline (13,27 g, 45,0 mmol) u SOCl2 (60 ml) grije se na refluksu 1 sat. Višak SOCl2 ukloni se u vakuumu. Ostatak se obradi suhim toluenom i koncentrira u vakuumu. Otopinu krutog ostatka u THF-u (50 ml) obradi se otopinom gvanidin-hidroklorida (15,47 g, 162 mmol) u NaOH (2 M vodena otopina, 162 ml, 324 mmol) u atmosferi dušika. Dobivenu smjesu 2 sata se miješa na 23 °C. Reakcijsku smjesu se zatim koncentrira u vakuumu radi uklanjanja THF-a. Vodeni sloj ohladi se do 0°C i zakiseli do pH 9. Istaloži se blijedožuta krutina, koju se prikupi kako bi se dobilo 11,41 g slobodne baze traženog spoja. Otopinu krutine u MeOH (700 ml) obradi se s HCl (1 M u eteru, 84,9 ml, 84,9 mmol). Otapalo volumen smanji se u vakuumu. Prikupi se dobiveni blijedosmeđi talog kako bi se dobilo 8,49 g (prinos 51 %). (Nusprodukt u obliku slobodne baze može se dobiti ekstrakcijom vodenog sloja smjesom EtOAc/THF (1:1)).

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) � 0,51 (m, 2H), 0,70 (dd, J = 2, 8,4, 2H), 1,92 (m, 1H), 6,53 (dd, J = 1,6, 10, 1H), 7,17 (d, J = 10, 1H), 7,32 (d, J = 7, 1H), 7,48 (d, J = 8,4, 1H), 7,64 (t, J = 8,2, 1H), 8,34 (bs, 2H), 8,60 (bs, 3H), 11,64 (s, 1H), 12,10 (s, 1H).

APCIMS 337 [M + 1]+

Primjer 6

Identifikacija [5-ciklopropil-1-(2-kinolon-5-il)-1H-pirazol-4-karbonil]gvanidina u uzorcima ljudske plazme tekućinskom kromatografijom (liquid chromatography, LC)/spektroskopijom masa (mass spectroscopy, MS)/MS, odnosno LC/NMR-om

Ljudskim ispitanicima intravenski se dozira 5-ciklopropil-1-(kinolin-5-il)-1H-pirazol-4-karbonil]gvanidin-monohidroklorid monohidrat. Uzorke ljudske plazme prikupi se zajedno, a proteine istaloži dodatkom 2 volumena acetonitrila. Nakon centrifugiranja supernatant se koncentrira u vodenoj kupelji u atmosferi N2, na 40 °C.

Alikvot (100 µl odnosno 50 µl) koncentriranog uzorka injicira se na uređaj za LC/MS/MS, opremljen Zorbax Rx-C8 4,6 × 150 mm stupcem, analizira PE Sciex API 2000 ili Finnigan LCQ spektrometarom masa, te prati UV-detektorom na 254 nm. Eluens se nakon stupca tako podijeli da se 5 % eluensa skrene na spektrometar masa, a ostatak propusti na UV-detektor. Analize su provedene uz brzinu protoka pokretne faze od 1 ml u minuti, gdje pokretnu fazu čini 5 mM amonij-formijat (pH 3,0) kao otapalo A i acetonitril kao otapalo B. Gradijent smjese B/A se, nakon početnog zastoja od 3 minute, u roku od 20 minuta kretao od 5/95 do 40/60. Pod takvim uvjetima LC metabolit je detektiran uz vrijeme zadržavanja od 11,8 minuta ([5-ciklopropil-1-(kinolin-5il)-1H-pirazol-4-karbonil]gvanidin je detektiran na 13,7 minuta). Razlika od 16 jedinica mase između 5ciklopropil-1-(kinolin-5-il)-1H-pirazol-4-karbonil]gvanidina (m/z 321) i metabolita (m/z 337) u ljudskoj plazmi ukazuje da potonji nastaje oksidacijom. Ionski spektar LC/MS/MS produkta protoniranog metabolita na m/z 337 ([M + H]+) pokazuje ionske fragmente kod m/z 278, 260, 250, 236, 223 i 208.

Iz gore opisanog koncentriranog uzorka soli se ukloni izdvajanjem krute faze. Uzorak se koncentrira do sadržaja od približno 5-10 µg metabolita. 50 µl ovog uzorka injicira se na LC/NMR uređaj, opremljen Zorbax Rx-C8 4,6 × 150 mm stupcem, analizira na Bruker 500 MHz NMR spektrometru, te prati UV-detektorom na 235 nm. Analize su provedene uz brzinu protoka pokretne faze od 1 ml u minuti, gdje pokretnu fazu čini 15 mM deuterirana vodena otopina mravlje kiseline, podešena do pH 3,3 deuteriranim amonij-hidroksidom u D2O kao otapalo C i acetonitril-d3 kao otapalo D. Gradijent smjese D/C se, nakon početnog zastoja od 3 minute, u roku od 17 minuta kretao od 5/95 do 20/80. Traženi metabolit zadržan je u NMR sondi tehnikom zaustavljanja protoka kod vršne vrijednosti nakon 13,6 minuta. Protonski NMR spektri i COSY spektri ljudskog metabolita sadrže 2 međusobno spregnuta dubleta (6,64 i 7,41 ppm) no niti jednu drugu vršnu vrijednost. Odsustvo niz polje smještene vršne vrijednosti na 8,92 ppm, prisutne kod [5-ciklopropil-1-(kinolin-5-il)-1H-pirazol-4karbonil]gvanidina, ukazuje da je položaj 2 na kinolinskom prstenu mjesto oksidacije. Na osnovu tih podataka strukturu metabolita navodi se kao [5-ciklopropil-1-(2-kinolon-5-il)-1H-pirazol-4-karbonil]gvanidin. Usporedba 1H LC/NMR spektra metabolita s onim sintetičkog standarda [5-ciklopropil-1-(2-kinolon-5-il)-1H-pirazol-4karbonil]gvanidin-hidroklorida, dobivenog kao što je opisano u Primjeru 5, potvrđuje strukturnu naznaku.

Claims (31)

1. Spoj, naznačen time što isti je spoj Formule I [image] njegov predlijek ili farmaceutski prihvatljiva sol navedenog spoja ili navedenog predlijeka, uz uvjet da [5ciklopropil-1-(kinolin-5-il)-1H-pirazol-4-karbonil]gvanidin nije uključen.

2. Spoj, naznačen time što isti je [5-ciklopropil-1-(2-kinolon-5-il)-1H-pirazol-4-karbonil]gvanidin, ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol.

3. Postupak ublažavanja oštećenja tkiva nastalog zbog ishemije ili hipoksije, naznačen time što se sastoji u primjeni na sisavcu, kojem je potrebno takvo liječenje, terapijski djelotvorne količine spoja prema zahtjevu 1, njegovog predlijeka ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka.

4. Postupak prema zahtjevu 3, naznačen time što tkivo je srčano, moždano, jetreno, bubrežno, plućno, crijeva, skeletnih mišića, slezene, gušterače, živčano, kralježničke moždine, mrežnice, krvnih žila ili crijevno.

5. Postupak prema zahtjevu 3, naznačen time što količina spoja prema zahtjevu 1, njegovog predlijeka ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka, iznosi približno 0,01-50 mg/kg dnevno.

6. Postupak prema zahtjevu 5, naznačen time što sisavac je žensko ili muško ljudsko biće.

7. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time što navedeno tkivo je srčano tkivo.

8. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time što navedeno tkivo je moždano tkivo.

9. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time što navedeno tkivo je jetreno tkivo.

10. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time što navedeno tkivo je bubrežno tkivo.

11. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time što navedeno tkivo je plućno tkivo.

12. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time što navedeno tkivo je tkivo crijeva.

13. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time što navedeno tkivo je tkivo skeletnih mišića.

14. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time što navedeno tkivo je tkivo slezene.

15. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time što navedeno tkivo je tkivo gušterače.

16. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time što navedeno tkivo je tkivo mrežnice.

17. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time što spoj se primjenjuje profilaktički.

18. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time što spoj se primjenjuje prije kirurškog zahvata.

19. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time što spoj se primjenjuje prije kirurškog zahvata na srcu.

20. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time što spoj se primjenjuje tijekom kirurškog zahvata.

21. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time što spoj se primjenjuje tijekom kirurškog zahvata na srcu.

22. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time što spoj se primjenjuje unutar 24 sata nakon kirurškog zahvata.

23. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time što spoj se primjenjuje unutar 24 sata nakon kirurškog zahvata na srcu.

24. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time što oštećenje tkiva kao rezultat ishemije je ishemično oštećenje do kojeg dolazi tijekom presađivanja organa.

25. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time što spoj se primjenjuje radi spriječavanja ishemične ozljede miokarda tijekom kirurške operacije.

26. Farmaceutski pripravak, naznačen time što se sastoji od određene količine spoja prema zahtjevu 1, njegovog predlijeka ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka, i farmaceutski prihvatljive podloge, vehikuluma ili razrjeđivača.

27. Farmaceutski pripravak namijenjen ublažavanju oštećenja tkiva nastalog zbog ishemije ili hipoksije, naznačen time što se sastoji od terapijski djelotvorne količine spoja prema zahtjevu 1, njegovog predlijeka, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog spoja ili navedenog predlijeka, i farmaceutski prihvatljive podloge, vehikuluma ili razrjeđivača.

28. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time što spoj se primjenjuje prije, tijekom i nakon kirurškog zahvata.

29. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time što spoj se primjenjuje prije, tijekom i nakon kirurškog zahvata na srcu.

30. Postupak dobivanja [5-ciklopropil-1-(2-kinolon-5-il)-1H-pirazol-4-karbonil]gvanidina, naznačen time što ga se provodi primjenom [5ciklopropil-1-(kinolin-5-il)-1H-pirazol-4-karbonil]gvanidina na čovjeku.

31. Spoj, naznačen time što isti je uglavnom čist [5-ciklopropil-1-(2-kinolon-5-il)-1H-pirazol-4-karbonil]gvanidin, ili farmaceutski prihvatljiva sol navedenog spoja.