FR2622192A1

FR2622192A1 - Derives de lipide monophosphoryle a et leur procede de preparation

Info

Publication number: FR2622192A1
Application number: FR8813812A
Authority: FR
Inventors: Edgar E Ribi; Kent R Myers
Original assignee: Ribi Immunochem Research Inc
Current assignee: Ribi Immunochem Research Inc
Priority date: 1987-10-22
Filing date: 1988-10-21
Publication date: 1989-04-28
Also published as: GB2211502A; CH676715A5; IT1230592B; GB8824330D0; JPH075623B1; FR2622192B1; GB2211502B; DE3836006A1; IT8822399A0; BE1003250A5; NL8802595A; JPH01146891A; US4987237A; DE3836006C2; CA1308711C

Abstract

Nouveaux dérivés de lipide monophosphoryle A et procédé pour leur préparation. Ces dérivés contiennent un ou plusieurs groupes libres tels qu'une amine sur une chaîne latérale attachée aux groupes primaires hydroxyles du noyau du lipide monophosphoryle A par l'intermédiaire d'un groupe ester. Les dérivés fournissent une méthode commode pour coupler le lipide A par des agents de couplage, avec diverses solutions et matériaux biologiquement actifs et équivalents, dans lesquels on désire les propriétés immunostimulantes du lipide A.

Description

DERIVES DE LIPIDE MONOPHOSPHORYLE A ET LEUR

PROCEDE DE PREPARATION

La présente invention a pour objet en général certains nouveaux dérivés de lipide monophosphoryle A. Sous l'un de ces aspects, la présente invention est orientée vers des nouveaux dérivés de lipide monophosphoryle A contenant un ou plusieurs groupes amino substitués ou non. Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet de nouveaux dérivés qui sont

des conjugués de lipide monophosphoryle A avec certains maté-

riaux biologiquement actifs. Sous encore un autre de ces aspects, la présente invention a pour objet des procédés de préparation et d'utilisation des dérivés selon la présente invention. Avant la présente invention, de nombreux rapports ont été publiés dans la littérature qui citent la réaction de

lipopolysaccharide (LPS) avec des anhydrides cycliques, notam-

ment, l'anhydride phtalique et l'anhydride succinique. Cepen-

dant, à l'exception d'une seule référence, aucune mention n'a été faite de la combinaison du lipide monophosphoryle A (LMP)

avec ces anhydrides ou avec d'autres.

Dans un article de A. Hasegawa et coll., J. Carbohydrate Chem.5: 371, il est décrit le couplage covalent du dipeptide de muramyle (DPM) avec un dérivé de lipide A correspondant au résidu de glucosamine non réducteur. Ce dérivé de lipide A désigné sous le nom de GLA-27 dans la référence, est bloqué à la fois en position phosphate et à toutes les autres positions potentiellement réactives sauf en ce qui concerne l'hydroxyle avec lequel on souhaite le couplage (c'est-à-dire l'hydroxyle primaire en C-6). La stratégie de couplage employée dans cette référence implique l'introduction d'un groupe carboxyle libre dans le GLA-27 en position C6 par la voie de l'anhydride succinique et d'une amine libre dans le DPM, et ensuite la formation d'une liaison amide entre ces deux groupes. Une différence clé entre les enseignements de cette référence et

ceux de la présente invention réside en ce que, dans la réfé-

rence, le dérivé de. lipide A doit être complètement bloqué pour éviter des réactions secondaires pendant l'étape de condensation (c'est-à-dire l'étape de formation de la liaison amide). La présente invention évite cette difficulté par

l'introduction d'un groupe amino libre dans le LMP. Le cou-

plage du LMP à d'autres composants est alors obtenu en utili-

sant des réactifs qui réagissent spécifiquement avec les amines (par exemple les aldéhydes), ou en activant d'une autre façon un groupe approprié sur l'autre composant avant de le

combiner à l'amino LMP.

Une acylation des lipopolysaccharides par des anhydrides cycliques se produit probablement dans l'antigène-O et dans les régions du noyau qui sont absentes dans le lipide monophos phoryle A. Le but de l'acylation des LPS dans ces références de l'art antérieur est d'atténuer leur toxicité et de ne pas introduire un groupe fonctionnel afin de former des conjugués

covalents avec d'autres matériaux.

Par conséquent, un ou plusieurs des buts suivants seront obtenus par la mise en pratique de la présente invention. Un des buts de la présente invention est de procurer certains nouveaux dérivés de lipide monophosphoryle A et un procédé pour leur préparation. Un autre but de la présente invention est de procurer un nouveau procédé de préparation de dérivés de lipide monophosphoryle A qui ne nécessite pas le blocage de groupes fonctionnels quelconques en vue d'introduire les

groupes désirésdans la molécule.

Un autre but de la présente invention est encore de procurer de nouveaux dérivés qui sont des conjugués de lipide monophosphoryle A avec des matériaux biologiquement actifs tels que des antigènes, des anticorps, des immunomodulateurs ou équivalents. Un autre but est de procurer des nouveaux conjugués des dérivés avec des composés biologiques tels que,

par exemple, des antigènes qui présentent une activité biolo-

gique renforcée.

Un autre but de la présente invention est de procurer un procédé de préparation de dérivés de lipide monophosphoryle A sous une forme relativement pure et sensiblement exempte de

sous-produits de la réaction indésirables.

Un autre objet de la présente invention est de procurer des méthodes d'utilisation de ces conjugués. Ces buts et d'autres encore deviendront plus évidents pour les hommes du

métier à la lumière des descriptions de la présente invention.

Sous son aspect le plus large, la présente invention a

pour objet certains nouveaux dérivés de lipide monophospho-

ryle A, certains composés intermédiaires, un procédé pour leur préparation et leur utilisation. Les nouveaux dérivés sont représentés par la formule:

O OPO3H2

7_-R-E-o (1) HO dans laquelle:

Z et R et le cercle sont tels que définis ci-après.

On prépare de façon classique ces dérivés par réaction du lipide monophosphoryle A avec un composé contenant un groupe ou des groupes qui est ou sont prédisposés à subir une réaction de formation de liaison avec un groupe ou des groupes présent(s) dans le LMP. L'utilisation d'un composé qui soit

activé avant la réaction avec le LMP évite la nécessité d'in-

troduire en premier lieu des groupes protecteurs dans la

molécule de LMP.

Le lipide monophosphoryle A (LMP) est un composé poly-

hétérocyclique contenant du phosphore et comportant une longue chaîne pendante, un ester aliphatique et des groupes amides et

il est obtenu à titre d'extrait endotoxique des enterobactéria-

cées. Ce dérivé, également désigné sous le nom de "LMP" se prépare d'une façon indiquée dans les brevets américains 4 436 727 et 4 436 728 inclus ici à titre de références. Les extraits d'endotoxine du type utilisé comme matière première pour produire le LMP peuvent être obtenus à partir de n'importe quel entérobactériacée y compris les mutants et organismes apparentés. Les brevets indiqués ci-dessus décrivent le type de microorganismes que l'on peut utiliser pour obtenir la matière première et plusieurs méthodes de préparation de cette matière première. Le LMP peut également être préparé par des techniques de synthèse et de génie génétique. La méthode

d'obtention de l'extrait endotoxique que l'on préfère actuel-

lement est celle décrite par Chen, et coll. J. Infect. Dis.

128 543 (1973).

Le LMP est une composition caractérisée en ce qu'elle ne comporte pas de 2-céto-3-désoxyoctanoate détectable, entre environ 350 et 475 nmoles/mg de phosphore et entre environ 1700 à 2000 nmoles/mg d'acides gras. Bien que le procédé de préparation d'endotoxine détoxifiée raffinée (LMP) soit décrit et revendiqué dans le brevet américain 4 436 727 mentionné cidessus, sa structure chimique n'était pas complètement connue à cette époque et, par conséquent, il a été nécessaire

de décrire le LMP en tant que produit obtenu par le procédé.

La structure complète de la forme hexa-acylée du LMP obtenu à partir des lipopolysaccharides de Salmonella minnesota R595 est maintenant connue et elle a été indiquée comme suit: HO\ OHo\ P<,

HO\_ 04

'O v0H OCHa; C 0e i 0OmClé CH H24. OC'"2c 1'H-OH CH-OH

H5 CH3 ICH4 1

LIPIDE MONOPHOSPHORYLE A CHEXA-ACYLE)

LIPIDE MONOPHOSPHORYLE A (HEXA-ACYLE)

Le LMP représente une amélioration significative par rapport aux extraits endotoxiques des entérobactériacées parce que le LMP a perdu sa toxicité et ne contient donc plus les composants extrêmement toxiques qui avaient rendu les extraits endotoxiques impropres à l'utilisation thérapeutique. (See Peptides as Requirements for Immunotherapy of Guinea Pig Line-10 Tumor with Endotoxins, Ribi, et coll. Cancer Immunol. Immunother., Vol. 7, pp. 43-58, 1979, incluq ici à titre de

référence). Les effets bénéfiques du LMP par rapport à d'au-

tres extraits endotoxiques sont, par exemple, décrits dans les brevets Américains 4 436 727 et 4 436 728 et dans Ribi, E., Journal of Biological Response Modifiers, Vol. 3, pp. 1-9, 1984 (inclus ici à titre de référence). Etant donné le fait que le lipide monophosphoryle A est non toxique, il a été récemment trouvé une application comme adjuvant de vaccins et

dans d'autres compositions pharmaceutiques utiles au traite-

ment de divers désordres tels que, par exemple, les tumeurs

cancéreuses des animaux à sang chaud et équivalent.

L'efficacité du LMP comme adjuvant de certains antigènes

peut être renforcée par couplage direct de LMP à ces antigè-

nes. En outre, les conjugués covalents constitués du LMP et d'autres comparés immunopotentialisants peuvent présenter des activités biologiques améliorées par rapport aux composants

libres (non conjugués).

Les méthodes traditionnelles de formation des conjugués covalents peuvent être subdivisées en deux catégories selon que les molécules sont activées par rapport au couplage avant d'être mélangées ou qu'elles sont activées in situ après avoir été mélangées. Aucune des deux approches n'est praticable avec

le LMP non modifié à cause de sa configuration structurelle.

Par exemple, l'approche d'activation selon l'art antérieur implique l'introduction d'un groupe dans l'une des molécules qui peut réagir facilement avec un groupe qui n'est présent que dans la seconde molécule telle que, par exemple, un groupe amino ou un groupe sulfhydryle. Cette approche n'est pas praticable avec le LMP non modifié puisqu'il ne contient aucun groupe fonctionnel qui puisse être activé ou qui puisse réagir

avec des groupes préalablement activés sur d'autres molécules.

La deuxième approche ne fonctionne pas non plus avec le LMP puisque, dans les conditions généralement employées pour une activation in situ, le LMP a tendance à réagir avec lui-même, ce qui conduit à un certain nombre de produits secondaires indésirables et diminue énormément ou élimine complètement le

rendement en conjugué désiré.

Cependant, un groupe fonctionnel approprié tel qu'une amine primaire, peut être incorporé dans le LMP par le procédé selon la présente invention; ceci permet d'employer des modes opératoires de couplages normaux aux fins d'attacher d'autres

matériaux au LMP modifié résultant.

Les groupes fonctionnels que contient le LMP compren-

nent un hydroxyle primaire en C-6', entre 3 et 6 hydroxyles secondaires et un groupe phosphate en C-4'. Etant donné la

configuration complexe de la molécule de lipide monophos-

phoryle A et en vue de simplifier les réactions qui se produi-

sent lors du procédé selon la présente invention, la molécule de lipide monophosphoryle A sera représentée sous la forme suivante:

O P03112

IHO Z(<

VIO (II)

le groupe hydroxyle primaire unique étant représenté au en haut, un groupe hydroxyle secondaire représentatif étant représenté en bas, le groupe phosphate étant représenté par OPO3H2, et le cercle représentant le reste de la molécule de lipide monophosphoryle A. Comme indiqué ci- dessus, les dérivés selon la présente invention sont commodément représentés par la formule: 0P03li2 HO0 dans laquelle: Z représente un atome d'hydrogène ou le groupe: Y ( A) n n et dans laquelle: R représente un groupe divalent constitué de carbone, d'hydrogène et éventuellement d'un ou de plusieurs atomes d'oxygène, d'azote ou de soufre et contient de 2 à 60 atomes de carbone, de préférence de 2 à 20 atomes de carbone; A représente un groupe de couplage divalent apte à coupler

R à Y par au moins deux groupes fonctionnels indépen--

dants et dans lequel A contient de 2 à 60 atomes de

carbone et éventuellement un ou plusieurs atomes d'oxy-

gène, d'azote ou de soufre; Y représente un matériau biologiquement actif tel que, par

exemple, des antigènes, des anti-corps, des immunomodu-

lateurs et équivalents; et

n est égal à 0 ou à 1.

L'un des modes de réalisation de la présente invention est orienté vers des dérivés entrant dans le cadre de la formule générale ci-dessus, dans laquelle Z représente un atome d'hydrogène. Ces dérivés de lipide monophosphoryle A contiennent une chaîne latérale ester attachée à l'atome de carbone du lipide A qui porte le groupe hydroxyle primaire (c'est-à-dire l'atome de carbone en C-6'). Ces dérivés peuvent être représentés par la formule: Q

R-C-O OPO3H2

(III) HO dans laquelle: R représente un groupe constitué de carbone, d'hydrogène et éventuellement d'oxygène, d'azote et/ou de soufre et contient de 2 à 60 atomes de carbone, de préférence de 2

à 20 atomes de carbone.

En général, n'importe quel type de groupe fonctionnel peut être introduit dans le LMP et dans les matériaux apparen- tés par le procédé selon la présente invention, pourvu que le groupe fonctionnel fasse partie d'une molécule qui contient un

groupe carboxyle ou un groupe similaire que l'on puisse acti-

ver vis-à-vis de la formation de la liaison ester, avant la combinaison avec le LMP. Des groupes fonctionnels que l'on peut introduire par cette méthode comprennent, sans y être limités, les groupes amines, thiols, aldéhydes, carboxyles, N-hydroxyimido esters, imino esters, arylazides, maléimides,

pyridyl disulfures et halogènes actifs.

Cette exigence d'activation avant la combinaison avec le LMP est d'une importance clé à cause des nombreuses réactions secondaires qui peuvent se produire si le LMP est soumis directement à des conditions d'activation. Un exemple de cette approche d'activation antérieure est la réaction du LMP avec l'anhydride succinique qui conduit à l'introduction d'un

groupe carboxyle libre dans le LMP.

O 0- H 9 OPO3H2

HO-C-CH2-CH2-CO

(IV) HO' Ainsi, des dérivés tels que ceux de formule IV dans laquelle R de la formule III se termine par un groupe carboxyle libre et est attaché par le groupe ester à la molécule de LMP au moyen

d'un groupe aliphatique, aromatique ou hétérocyclique, peuvent.

être prépares selon les enseignements de la présente invention.

Il peut être nécessaire ou non de bloquer certains groupes fonctionnels dans la molécule qui doit être introduite dans le LMP avant l'étape d'activation. Par exemple, lorsque l'on introduit un groupe amino dans le LMP par la méthode selon la présente invention, il est nécessaire de bloquer l'amine d'un amino acide approprié avant l'activation du carboxyle en vue de la formation d'une liaison ester. Dans l'exemple donné ci-dessus impliquant l'anhydride succinique, les exigences de blocage et d'activation antérieure sont, toutes les deux, satisfaites par la formation de l'anhydride cyclique. Des modes opératoires convenables de blocage et de déblocage sont bien connus des hommes du métier. Voir par exemple, Theodora W. Green, "Protective Groups in Organic

Synthesis", John Wiley & Sons, New York, 1981, pp. 349.

Les dérivés préférés que l'on peut préparer par le procédé selon la présente invention sont les amines et les amines substituées que l'on peut représenter à titre d'exemple par la formule suivante: Rl H _N-R3_'_ o OP03H2

R2 00H

(V)

dans laquelle: R3 représente une chaîne divalente contenant du carbone, de l'hydrogène et éventuellement de l'oxygène, de l'azote et/ou du soufre; et R1 et R2 représentent indépendamment un atome d'hydrogène ou un radical alkyle inférieur ou l'un d'entre eux R1 ou R2 peut représenter le reste d'un support ou substrat

organique, y compris des liposomes ou un matériau biolo-

gique tel que, par exemple, un antigène, un immunomodula-

teur, un anti-corps et équivalent.

En particulier, les dérivés raffinés de formule V sont ceux dans lesquels R1 et R2 représentent un atome d'hydrogène et R3 représente un radical divalent renfermant de 2 à 60 et

de préférence encore de 2 à 20 atomes de carbone et est compo-

sé de carbone, d'hydrogène et éventuellement d'oxygène, d'azote et/ou de soufre. Ces dérivés comprennent ceux dans lesquels R3 représente une chaîne hydrocarbonée droite ou ramifiée, et des

polypeptides contenant un ou plusieurs groupes amides récu-

rants tels que, par exemple, de dérivés di et tri-peptides de glycine du LMP. Y sont inclus ces comparés dans lesquels un amino acide est introduit dans le LMP en position C-6' et, par conséquent, procure des dérivés de LMP renfermant une chaîne latérale se terminant par une amine primaire. Les dérivés typiques de ce type comprennent:

O PO3}112

NH2- (CH2) X-t-O.

(VI) HO/ dans laquelle: x peut être égal à une valeur quelconque de 1 à environ

et plus.

L'un des exemples de ce comparé est celui dans lequel x est égal à 5, ce qui correspond à l'ester de l'acide 6-amino caproique. Ce comparé est désigné sous le nom de CAP-LMP et sa

synthèse est exposée dans les exemples 1 à 3.

Un autre comparé intéressant est le dérivé dans lequel le LMP est esterifié à l'extrémité carboxyle libre des peptides constitués de glycine ou d'alpha-amino acides apparentés. Par exemple, le comparé suivant est constitué de LMP esterifié en un tripeptide de glycine: o 0P03H2

9OPO3H2

NH2 CHi2_-N_-CH2--NH-CH2-C-O (VII) HO Par conséquent, on peut préparer toute une série de dérivés de LMP à partir d'amino-acides connus. A titre de variante, des amino-acides que l'on peut introduire dans la molécule de LMP ll par le procédé selon la présente invention, comprennent, en autre, glycine, alanine, serine, thréonine, méthionine, valine, norvaline, leucine, isoleucine, phénylalanine, tyrosine,

cystéine, acide aspartique, acide glutamique, acide hydroxyglu-

tamique, arginine, lysine, cystine, histidine, proline, hydroxy- proline, tryptophane, asparagine et glutamine. Il peut être nécessaire d'employer des modes opératoires de blocage et de déblocage convenables bien connus des hommes de métier lorsque l'on attache ces amino-acides ou leur combinaison au LMP par

le procédé selon la présente invention.

Des dérivés de LMP dans lesquels un groupe amino pri-

maire est introduit par le procédé selon la présente invention

peuvent encore être modifiés en une forme que l'on peut commo-

dément coupler à d'autres comparés intéressants tels que, par exemple, des antigènes, anticorps et des immunomodulateurs. La forme générale de ces dérivés de LMP est la suivante: O

4_ 2_ 3_"

R4-R2-N-R3-C-O OPO3H2 (VIII)

R' >

HO

dans laquelle: R1 et R3 sont tels que décrits ci-dessus; R2 représente un groupe constitué de carbone, d'hydrogène et éventuellement d'oxygène, d'azote et/ou de soufre et contient de 1 à 60 atomes de carbone, de préférence de 1 à 20 atomes de carbone; et

R4 représente un groupe apte à former une liaison covalen-

te, soit sélectivement avec des amines ou des sulfhydry-

les ou non sélectivement avec toute une série de groupes

et qui est éventuellement constitué de carbone, d'hydro-

gène, d'azote, d'oxygène et/ou de soufre.

Le radical désigné par R -R représente à titre d'exemple les

radicaux suivants: N-succinimidylsuberoyle, 6-(4'-azido-2'-nitro-

phényl)hexanoyle, 3-(2-pyridyldithiopropionoyle) et m-maléimi-

2 6 2 2 1 92

dobenzoyle. L'exemple 4 décrit la préparation du comparé suivant: O

0 0 0

O

N-O-C- (CH 2) 6-C-HN- (CH 2)5-C-0 - PO3H2

HO

SSC-LMP

dans lequel: R4 - R2 représente le N-succinimidylsuberoyle; et R1 et R3 correspondent à la désignation de données dans la

formule VIII dans laquelle X = 5.

Ci-après, on fait encore réagir le dérivé constitué de LMP avec un groupe de couplage attaché au LMP par un groupe amine tel que, SSC-LMP ci-dessus, avec un peptide contenant un groupe amine primaire pour former un conjugué:

0 0 O

il ilIt peptide-NH-C-(CH2)6-C-NH-(CH2)-C-O OPO3H2

0

Le procédé de préparation de la présente invention tel que décrit ciaprès, procure un procédé unique d'introduction d'un ou plusieurs groupes fonctionnels nouveaux dans le lipide monophosphoryle A et dans les comparés apparentés. Ces groupes

fonctionnels peuvent procurer un point d'attachement de coupla-

ge covalent du MPl et des comparés apparentés à d'autres

matériaux intéressants.

Ce procédé comprend les étapes suivantes:

(1) on bloque indépendamment le ou les autres groupes fonc-

tionnels d'un acide carboxylique approprié si néces-

saire;

(2) on active le carboxyle libre du comparé bloqué par rap-

port à la formation de la liaison ester;

(3) on fait réagir l'acide activé avec le lipide monophos-

phoryle A; et

(4) on débloque le dérivé de LMP résultant, si nécessaire.

Le procédé selon la présente invention peut être illus-

tré par la séquence suivante de réactions dans laquelle on

prépare un dérivé d'amino LMP du type représenté par la for-

mule IV. Dans cette séquence, t-BOC-ON représente le t-buto-

xycarbonyloxyimino-2-phenylacétonitrile et le LMP est tel que décrit cidessus: (1) Blocage o O t-BOC-ON + NH2-(CH2)x-C-OH > t-BOC-NH-(CH2)X-C-OH (2) Activation o 2 t-BOC-NH-(CH2)xC-OH + dicyclohexylcarbodiimide > O o It [t-BOC-NH-(CH2)x -C-2-0 (3) Réaction avec le LMP HO pyridine tt-BOC-NH<CH2)x--] 2-0.+ > H0 t-BOC-NH- ( H)Xt- t-BOC-NH- C}2)]X-C-OH t-BOC-NH(CH21 x-b-0 P 20H -DOC-NH- [CH2)x-ë-01/.-OPO (4) Déblocage o o o - H 3 N( CH2) x-8- OPOJH2 }l-C2-'OPOPO3II Bien que le t-BOC-ON soit employé dans la réaction ci-dessus en tant qu'agent bloquant dans l'étape (1), on peut aussi bien utiliser d'autres agents. Des agents de blocage typiques comprennent, sans y être limités, les agents suivants:

chloroformiate de benzyle, chloroformiate de 9-fluorényl-

méthyle et 2,2,2-chloroformiate de trichlorométhyle.

Le blocage des amino-acides ou d'autres comparés est effectué dans un solvant approprié tel que, par exemple, eau, éthanol ou dioxane et à des températures comprises entre environ 0 et environ 30 0C suivant la nature de l'agent de blocage. L'activation de l'acide bloqué dans l'étape (2) pour former l'anhydride peut s'accomplir en utilisant un comparé tel que le dicyclohexylcarbodiimide ou d'autres comparés tels

que, par exemple, le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbo-

diimide et le chloroformiate d'éthyle. On met cette étape en oeuvre en présence d'un solvant inerte tel que, par exemple le

chloroforme ou le dichlorométhane et à une température d'envi-

ron 0 à 30 C selon le réactif utilisé.

La réaction de l'anhydride avec le LMP dans la troisième

étape s'accomplit dans un mélange de solvant tel qu'un mélan-

ge, pyridine chloroforme 1/1 (V/V) et à une température com-

prise entre environ 0 et environ 30 C.

Le déblocage de l'amino-acide ou d'autres comparés

introduits dans la molécule de LMP peut s'effectuer en utili-

sant un agent de déblocage tel que l'acide trifluoroacétique ou l'acide chlorhydrique (gazeux) dans un solvant approprié à

des températures comprises entre environ -15 C et environ 0 C.

Comme on l'a discuté ci-dessus, le procédé selon ce mode de réalisation de la présente invention est particulièrement utile et il procure une méthode unique d'introduction de groupes amino libres dans le lipide monophosphoryle A et les comparés apparentés lorsque d'autres groupes fonctionnels empêchent l'utilisation directe d'agents de couplage directs tels que, par exemple, les carbodiimides. Par exemple, le LMP

contient un groupe phosphate, un hydroxyle primaire et plu-

sieurs hydroxyles secondaires. En présence de carbodiimides ou d'autres agents de condensation, il se produit des réactions secondaires conduisant à des anhydrides phosphoriques, à des esters de phosphate et à d'autres produits. Le procédé selon la présente invention évite ces réactions secondaires et il procure par conséquent un procédé de préparation des dérivés

désirés sous une forme relativement pure.

Dans un autre mode de réalisation, la présente invention est orientée vers des dérivés de lipide monophosphoryle A dans

lequel un agent de couplage a été attaché au comparé de for-

mule (III) pour procurer un dérivé de formule:

0 OP03H2

A- R- C- O0

(IX)

HO dans laquelle: R est tel que défini ci-dessus; et A représente un groupe de couplage par lequel on peut réaliser un rattachement au groupe Y tel qu'indiqué ci-dessus.

Les groupes A que l'on peut employer à titre d'illustra-

tion à la présente invention comprennent sans y être limités

les groupes suivants: N-succinimidylsuberoyle, 6-(4'-azido-

2'-nitrophényl)hexanoyle, 3-(2-pyridyldithio)propionoyl,

m-maléimidobenzoyle, et équivalents.

La réaction des agents de couplage avec des comparés de formule (III) peut être effectuée par des techniques connues

et le choix des conditions particulières peut varier en fonc-

tion des réactifs particuliers employés.

Dans un autre mode de réalisation de la présente inven-

tion, on procure des dérivés de lipide monophosphoryle A qui sont constitués du comparé de formule (III) ci-dessus, couplés par les groupes divalents A à des matériaux biologiquement actifs. Ces dérivés ci-après également désignés sous le nom "conjugués" peuvent être représentés par la formule suivante:

OP03H2

Y-(A)n-R--C-O n /(X) HO dans laquelle: A et R sont tels que définis cidessus; et

Y représente un matériau biologiquement actif.

Ces comparés combinent en une seule molécule à la fois des propriétés du matériau biologique et celles du lipide monophos phoryle A. Les matériaux biologiques que l'on peut, à titre d'illus tration, coupler au dérivé LMP de formule (III) par un agent de couplage comprennent, sans y être limité, les matériaux suivants: immunopotentiateurs tels que, par exemple, tuftsinet mUramyldipeptide, squelette de paroi cellulaire, dimycolate de tréhalose et équivalents; des cytokines telles que, par exemple

interleukines, interférons, facteur d'activation de granulo-

cytes-monocytes, facteur de nécrose de tumeur et équivalents; des antigènes tels que, par exemple, en ce qui concerne la

maladie infectieuse: anti-corps spécifiques de tumeur; membra-

nes telles que membranes phospholipidiques, y compris des

structures entrant dans les membranes telles que des liposo-

mes, des véhicules et des supports tels que perles de latex,

dextrane, résine de cellulose et équivalent.

Un immunopotentiateur, la tuftsine, indiqué ci-dessus et

dans les exemples, représente le comparé suivant: la L-théro-

nyl-L-lysyl-L-prolyl-L-arginine. Ses sels et dérivés pharmaceutiquement acceptables et

certains de Ses isomères optiques sont utiles pour la stimula-

tion ou l'inhibition de la phagocytose ou de la pincytose chez

les mammifères. D'autres polypeptides non-antigéniques théra-

peutiquement utiles comprennent les suivants: L-thr-L-lys-L-

pro-L-arg-L-thr-L-lys-L-pro-L-arg, D-thr-L-lys-L-pro-D-arg-

D-thr-L-lys-L-pro-D-arg, D-thr-L-lys-L-pro-L-arg-L-thr-L-lys-

L-pro-D-arg et leurs sels et dérivés pharmaceutiquement accep-

tables.

Le couplage du composant actif au dérivé LMP de formu-

le (IX) ci-dessus, peut s'effectuer par des réactions connues

exposées dans la littérature. Dans quelques cas, et en fonc- tion des groupes fonctionnels disponibles sur le radical R, il peut être

possible de lier directement à R le composant Y biologiquement actif, et dans ce cas, n dans la formule (X)

ci-dessus est égal à 0.

Comme on l'a indiqué précédemment, le lipide monophos-

phoryle A est un immunostimulant et lorsqu'il est couplé à d'autres comparés présentant des dérivés biologiques souhaita- bles, il peut conférer une activité biologique renforcée à ces comparés. Par exemple, l'efficacité du LMP comme adjuvant des antigènes peut être améliorée lorsque l'antigène est couplé au LMP par l'emploi des dérivés selon la présente invention. Ces

conjugués peuvent présenter une utilité comme comparés immuno-

potentiateurs plus puissants, meilleurs adjuvants pour des antigènes relativement non-immunogènes et comme outils dans la recherche immunologique. Les conjugués de formule indiquée ci-dessus sont, par conséquent, utiles dans la détection de divers composants biologiques contenus dans les fluides du corps tels que, par exemple, le sang, l'urine et également en recherche biologique. Des conjugués tels que ceux du lipide monophosphoryle A conjugués à des immunopotentiateurs ou à des

cytokines sont utiles dans la stimulation d'une réponse immuni-

taire spécifique et non-spécifique. Des conjugués comportant des anticorps couplés au LMP sont utiles dans la stimulation d'une réponse immunitaire spécifique, en chromatographie d'affinité, dans les immunoessais, en adsorption cellulaire

sur des supports solides et équivalents. Des conjugués compor-

tant des antigènes couplés au LMP sont également utiles dans les stimulations d'une réponse immunitaire spécifique. Le LMP peut également être conjugué à des supports utilisables en

* recherche biologique et dans les tests biologiques.

Les exemples suivants illustrent le meilleur mode envi-

sagé actuellement de préparation des dérivés selon la présente invention.

EXEMPLE 1

Synthèse des anhydrides N-t-butoxycarbonyl-6-aminocaproiques (anhydride tBOC-CAP) L'acide N-t-butoxycarbonyl-6-aminocaproique (t-BOC-CAP)

est préparé à partir de t-butoxycarbonyloxyimino-2-phényl-

acétonitrile (BOC-ON) et d'acide 6-aminocaproique suivant la méthode de W. J. Paleveda, F.W. Holly, D.F. Veber, Organic

Syntheses 63, 171 (1984). 100 mg (4,32 x 10-4 moles) du t-BOC-

CAP obtenu sont convertis en anhydride par traitement à l'aide de 50 mg (2,42 x 10- 4 moles) de dicyclohexylcarbodiimide dans du CHCl3 sec. En suivant les modes opératoires d'élaboration

habituelle et la recristallisation dans un mélange diéthylé-

ther/hexane, on obtient 76 mg d'anhydride t-BOC-CAP. (IR -

3480, 1821, 1751, 1719 cm; H-RMN- pas de proton carboxy-

lique).

EXEMPLE 2

Synthèse du lipide N-t-butoxycarbonyl-6-aminocaproyl- monophos phoryle A (t-BOC-CAP-LMP) Dans un ballon à fond rond de 100 ml, on ajoute 410 mg

(approximativement 2,7 x 10 4 moles) de lipide monophospho-

ryle A dissous dans un mélange chloroforme/méthanol 4/1 (v/v).

On élimine le solvant par évaporation flash et on laisse reposer le ballon sur un lyophiliseur pendant la durée d'une

nuit pour éliminer les traces finales de solvant et d'humi-

dité. Au résidu sec, on ajoute 171 mg d'anhydride de t-BOC-CAP (3,84 x 10 4 moles) et 12 ml chaque fois de chloroforme et de

pyridine, tous les deux ayant été séchés sur des tamis molécu-

o laires 4A. On agite le mélange réactionnel sous azote. On surveille le progrès de la réaction par chromatographie en couche fine (CCF) sur des plaques CCF de 60 de gel de silice (EM) en utilisant une association de solvants constitués de

chloroforme/méthanol/eau/hydroxyde d'ammonium 50/31/6/2 (v/v).

Les plaques de CCF développées sont visualisées par pulvérisa-

tion à l'aide de phosphomolybdate à 7% dans l'éthanol, ce que l'on fait suivre d'une carbonisation à 150 C. Il apparaît que la réaction est complète après les premières 24 heures. On arrête la réaction après 52 heures par addition de 30 ml de CO3Na2 de 0,10 M (pH 10) et agitation vigoureuse pendant minutes. On fait alors passer le mélange dans une ampoule à

brome de séparation, on ajoute chaque fois 12 ml de chloro-

forme et de méthanol et on secoue l'ampoule. On retire la phase organique et on extrait à nouveau la phase aqueuse avec une autre partie de mélange chloroforme/méthanol 2/1 (v/v). On rassemble les phases organiques et on lave à l'aide de HCl,1N jusqu'à ce que l'on obtienne un pH acide dans la phase aqueuse (ce qui nécessite 210 ml). On lave la phase organique une fois à l'eau, puis on soumet à une évaporation flash et on porte à siccité finale au lyophiliseur. Le poids du résidu obtenu est

de 491 mg.

EXEMPLE 3

Conversion du t-BOC-CAP-LMP en CAP-LMP 468 mg de t-BOC-CAP-LMP sont séchés dans un ballon à fond rond de 50 ml en utilisant un lyophiliseur pour éliminer les traces finales de solvant et d'humidité. Le ballon est alors équipé d'une barre d'agitation magnétique et il est

placé dans un bain neige carbonique/éthylène glycol (-15 C).

Dans le ballon on ajoute 20 ml d'acide trifluoroacétique (TFA) froid qui a préalablement été séché par distillation sous vide du P205 (ballon de distillation à -15 C, ballon de réception à -77 C). La solution réactionnelle est ajoutée vigoureusement pendant 20 minutes, temps après lequel on élimine le TFA par

distillation. On chasse les traces finales de TFA au chloro-

forme, ce qui donne 450 mg d'un résidu brun rougeâtre vitreux.

Le mélange de produit brut est fractionné par chroma-

tographie d'échange d'ion sur une colonne 2,5 x 20 cm de cellulose DEAE sous la forme acétate (Indion HA-3). Après chargement à l'aide de 447 mg de CAP-LMP brut, la colonne est

rincée à l'aide de 220 ml chaque fois d'un mélange chloro-

forme/méthanol 4/1 (v/v) et chloroforme/méthanol/eau 2/3/1 (v/v), puis éluée avec un gradient de sel linéaire composé de 900 ml d'un mélange chloroforme/méthanol/eau 2/3/1 (v/v)

contre 900 ml de mélange chloroforme/méthanol/acétate d'am-

monium 0,2M 2/3/1/ (v/v). On obtient un total de 312 mg de CAP-LMP monosubstitué dans les essais préliminaires 4/1 et 2/3/1. Une autre quantité de 116 mg de matériau correspondant surtout au LMP n'ayant pas réagi et récupéré pendant l'élution

au gradient de sel.

Un fractionnement ultérieur du CAP-LMP en composants simples est mis en oeuvre sur gel de silice (BioSil HA), utilisant un gradient linéaire de 1000 ml de chloroforme contre 1000 ml d'un mélange chloroforme/méthanol/eau 590/400/1( (v/v). Les fractions correspondant à l'homologue hexa-acylé du

CAP-LMP sont rassemblées et soumises à un purification ulté-

rieure sur plaques CCF préparatives de gel de silice 500 mi-

crons (Analtech), en utilisant un mélange chloroforme/méthanol/eau/hydroxyde d'ammonium 50/31/6/2 (v/v) comme solvant de développement. Une analyse au spectromètre de masse du CAP-LMP hexa-acylé purifié obtenu révèle un composant unique avec un m/e de 1830, ce qui correspond à la masse attendue

pour le LMP hexa-acylé associé à un groupe 6-amino caproyle.

EXEMPLE 4

Synthèse du (N-succinimidylsuberoyl)-CAP-LMP (SSC-LMP) Dans une fiole à bouchon à vis de 4 ml, on place 14,8 mg de CAP-LMP hexa-acylé (8,09 x 106 moles). On charge la fiole de 1,0 ml de chloroforme sec qui a été séché sur un tamis o moléculaire 4A. A la solution dans le chloroforme de CAPLMP, on ajoute 12,6 mg de suberate de di-(N-succinimidyle) (Pierce

Chemical Co.; 3,23 x 10-5 moles), et ensuite 1,0 ml de pyri-

dine (tamis moléculaire 4A) et une barre (flea bar). On bouche étroitement la fiole puis on agite à la température ambiante (24 C) pendant plusieurs heures jusqu'à ce que la réaction soit jugée complète par CCF. (Le produit migre avec un Rf

d'environ 0,49 dans les conditions de CCF données dans l'exem-

ple 2). A ce moment là, on élimine tout le solvant par évapo-

ration flash en utilisant un aspirateur pour éliminer le

chloroforme, et à la pompe à vide pour éliminer la pyridine.

On maintient tout le temps la température inférieure à 40 C.

Le résidu obtenu est transféré dans un tube Corex de 30 ml en utilisant une quantité minimum de chloroforme et on précipite le produit par addition de 20 ml d'acétone tout en soumettant

à un vortex. On recueille un culot de précipité par centrifu-

gation à 12 000 x g pendant 20 minutes. On met le culot en suspension dans 20 ml d'acétone et on recentrifuge à 12 000 x g pendant 20 minutes. La fraction du culot après évaporation

des dernières traces de solvant, donne 10,7 mg de produit.

(IR-1780 (w), 1810 (w) CM; CCF-Rf = 0,49 sur gel de si-

lice 60 en utilisant un mélange chloroforme/méthanol/eau/-

hydroxyde d'ammonium (50/31/6/2).

2622 1 92

EXEMPLE 5

Couplage du SSC-LMP à la Tuftsine (Thr-Lys-Pro-Arg) ,1 mg de SSC-LMP partiellement purifiés sont séchés dans un ballon à fond rond de 5 ml, ce qui donne un film mince et clair. 16,7 mg de tuftsine (Sigma; 3;34 x 10- 5 moles) sont dissous dans 1,37 ml de tampon HEPES 100 cm à pH 7,85 qui a -été préparé par titrage de la forme d'acide libre du HEPES (Sigma) à l'aide de triéthylamine. La quantité totale de solution aqueuse de tuftsine est ajoutée au ballon en même temps qu'une base magnétique d'agitation de 10 x 3 mm et l'on

agite vigoureusement la solution pendant la durée d'une nuit.

La solution est, entre temps soumise, à un bref traitement aux ultra-sons (d'environ 10 secondes) dans un bain d'ultrasons pour faciliter la rupture du film de SSC-LMP. Après 24 heures, on fait passer la solution dans un sac de dialyse (coupure 6000 à 8000 PM) et on procède à une dialyse exhaustive en présence d'eau distillée. Le dialysat obtenu est lyophilisé,

ce qui donne en dernier lieu 12,3 mg d'une poudre blanche.

(CCF-Rf = 0,12, 0,21 (majeur) et 0,45 (mineur) sur gel de

silice 60 développé à l'aide d'un mélange chloroforme/méthanol/-

eau 65/25/4. Le SSC-LMP migre à Rf = 0,53 dans ce système de CCF).

On fractionne le mélange de produit brut par CCF prépa-

rative sur gel de silice 500 microns en plaques préparatives H (Analtech), en utilisant le système de solvant 50/31/6/2 pour

développer les plaques. Les bandes sont visualisées par rétro-

éclairage et les produits sont récupérés par des techniques classiques. Deux bandes de produit relativement pur sont récupérées, correspondant à Rf = 0,12 (2,3 mg) et Rf = 0,21

(4,5 mg) dans le système CCF 65/25/4.

EXEMPLE 6

Synthèse du succinoyl-LMP A une fiole à bouchon vissé de 2,0 ml, on ajoute une solution dans le chloroforme/méthanol 4/1 (v/v) contenant 29 mg (1,68 x 10-5 moles) de LMP hexa-acylé. On évapore tout

le solvant, les traces finales étant éliminées sur lyophi-

liseur. On pèse 3,4 mg (3,36 x 10-5 moles) d'anhydride succi-

nique dans la fiole et l'on ajoute une barre (fléa bar) et ensuite 0,2 ml chaque fois de chloroforme et de pyridine qui O ont été séchés par stockage sur tamis moléculaires 4A. On agite la solution pendant 5 heures puis on la transfère dans

un tube de centrifuge Corex de 15 ml et on trempe par agita-

tion en présence de 1,0 ml de CO3Na2 0,1M (pH 10,0) pendant minutes. On ajoute 2 ml de chloroforme et 1 ml de méthanol au mélange réactionnel trempé et on centrifuge à 3000 tours/minute pendant 10 minutes pour séparer les phases. On lave alors la phase organique deux fois à l'aide de HCt,1N, une fois à l'eau et on évapore sous un courant d'azote, ce qui donne 27,4 mg d'un résidu vitreux. Tel qu'estimé par CCF sur gel de silice (voir exemple 2, ci-dessus), ce matériau est constitué de LMP monosuccinyle à 50%, de LMP di-succinyle à

% et LMP n'ayant pas réagi à concurrence de 30%.

Bien entendu, la présente invention n'est pas limitée aux modes de réalisation décrits et représentés mais elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de

l'art sans que l'on ne s'écarte de l'esprit de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS

1.- Un dérivé de lipide monophosphoryle A de formule:

Q

Z -R-C-O- 0 OP03H2

HO dans laquelle: R représente un groupe divalent constitué de carbone, d'hydrogène et éventuellement d'un ou plusieurs d'entre - oxygène, azote ou soufre et contient de 2 à 60 atomes de carbone; Z représente un atome d'hydrogène ou:

Y--At-

n dans lequel: A représente un groupe de couplage divalent susceptible de coupler R à Y par au moins deux groupes fonctionnels indépendants A contenant de 2 à 60 atomes de carbone et éventuellement un ou plusieurs atomes d'entre oxygène, azote ou soufre;

Y représente un atome d'hydrogène ou un matériau biologi-

quement actif; n est égal à 0 ou 1 et le cercle représente un noyau de lipide monophosphoryle A, et incluant la forme hexa-acylée du lipide monophosphoryle A de formule:

CHI H-GM

* - O

Glt 2.- Le dérivé selon la revendication 1, dans lequel R représente le résidu d'un acide dicarboxylique ou un amino acide contenant au moins un groupe amino libre, l'amino acide étant l'un des suivants: glycine, alanine, serine, méthionine, acide 6-aminocaproique ou tyrosine. 3.- Le dérivé selon la revendication 1 présentant la formule suivante: -o A OP03H2 HO dans laquelle: A contient de 2 à 6 atomes de carbone et éventuellement un ou plusieurs atomes d'entre oxygène, azote ou soufre et

spécifiquement dans lequel A représente un groupe N-suc-

cinimidylsuberoyle ou 6-(4'-azido-2'-nitrophényl)hexa-

noyle ou 3-(2-pyridyl-dithio)propionoyle) ou m-maléi-

midobenzoyle; et

R est tel qu'indiqué ci-dessus.

4.- Le dérivé selon la revendication 1, dans lequel Y représente un substrat organique ou minéral tel que des perles de latex ou une membrane ou un matériau biologique du groupe

des immunomodulateurs, anti-corps ou antigènes.

5.- Un procédé de préparation d'un dérivé de lipide monophosphoryle A qui comprend les étapes suivantes: (1) on bloque le groupe amino d'un amino acide à l'aide d'un agent de blocage d'amine; (2) on active l'amino acide bloqué par conversion de cet amino acide bloqué en anhydride d'acide correspondant;

(3) on fait réagir l'anhydride d'acide avec le lipide mono-

phosphoryle A; (4) on débloque le groupe amino bloqué à l'aide d'un agent de déblocage d'amine; et (5) on récupère ledit dérivé de lipide monophosphoryle A. 6.- Le procédé selon la revendication 5, dans lequel

l'agent de blocage d'amine est l'acétonitrite de t-butoxy-

carbonyloxyimino-2-phényle, le chloroformiate de benzyl, le chloroformiate de 9-fluorénylméthyle ou le chloroformiate de 2,2,2- trichlorométhyle et l'agent de déblocage d'amine est l'acide chlorhydrique et l'amino acide est l'un des suivants:

glycine, alanine, serine, méthionine., ou tyrosine.