FR2499588A1

FR2499588A1 - Enzyme branchante et production d'aliments ameliores

Info

Publication number: FR2499588A1
Application number: FR8201863A
Authority: FR
Inventors: Shigetaka Okada; Sumio Kitahata; Shigeharu Yoshikawa; Toshiyuki Sugimoto; Kaname Sugimoto
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1981-02-07
Filing date: 1982-02-05
Publication date: 1982-08-13
Also published as: GB2095681B; FR2499588B1; GB2095681A; US4454161A

Abstract

PRODUCTION D'UNE ENZYME BRANCHANTE A PARTIR DE MICROORGANISMES DU GENRE BACILLUS. CETTE ENZYME EST UTILISEE POUR AMELIORER LES PRODUITS ALIMENTAIRES CONTENANT DES SUBSTANCES AMYLACEES, EMPECHANT LA RETROGRADATION DE CES SUBSTANCES. LES PRODUITS ALIMENTAIRES AINSI TRAITES GARDENT LEURS QUALITES ET ONT UNE DUREE DE VIE EN POT BIEN PLUS ELEVEE.

Description

La présente invention concerne un procédé pour la production d'enzyme

branchante, ainsi quts procédé

pour améliorer, grâce à cette enzyme, la qualité de pro-

duits alimentaires.

Il est bien connu que la rétrogradation des sub- stances amylacées dans les produits alimentaires, conduit inévitablement à une diminution de leur durée de vie en

pot, et de leur digestibilité.

Au cours d'essais empiriques pour supprimer cettérétrogra-

dation, lors du traitement des aliments, on effectue habi-

tuellement une hydrolyse partielle de la substance amyla-

cée à l'aide d'o-amylase, et/ou on y ajoute des saccharides

L'utilisation de ces procédés classiques, entratne des in-

convenients pour les propriétés inhérentes des substances amylacées contenues dans ces aliments, comme par exemple l'adhésivité, l'aptitude à donner de la viscosité et à

mettre en forme, et elle entraîne une augmentation du pou-

voir édulcorant des produits.

La présente invention permet d'éviter ces incon-

vénients de l'art antérieur, et d'améliorer la qualité de produits alimentaires contenant des substances amylacées

sans nuire à leurs propriétés intéressantes. Elle est ba-

sée sur la constatation que l'on réalise ce but par utili-

sation dans ces produits alimentaires d'un produit de ré-

action obtenu en soumettant une substance amylacée à l'ac-

tion d'une enzyme branchante.

Cette enzyme branchante (EC 2.4.1.18), ou Q-enzyme, est une transférase qui agit sur certaines liaisons o-1,4 de

glucane linéaire, par exemple l'amylose, de manière à ra-

mifier ce glucane en o-1,6, comme c'est le cas pour l'amy-

lopectine ou le glucogène.

Bien qu'il existe plusieurs publications sur les enzymes branchantes, par exemple par G.S. Drumond et coll., Eur. J. Biochem. Vol. 26, pp. 168-176 (1972), et C. Boyer et coll., Biochemistry, Vol. 16, pp. 3693-3699 (1977), il n'

y est fait référence qu'à la biosynthèse in vivo et au mé-

tabolisme de l'amidon dans la pomme de terre, ou du glyco-

gène dans Escherichia coli.

Le nouveau procédé de production de produits ali-

mentaires améliorés consiste à préparer ou à additionner,

ces produits, avec le produit dqféaction obtenu en soumet-

tant une substance amylacée à l'action de l'enzyme bran-

chante. Conformément à l'invention, on peut utiliser comme enzyme branchantet toute enzyme classique provenant

de sources variées, comme animal, plante ou microorganis'-

me, dans la mesure o l'utilisation du produit de réaction obtenu par son action sur une substance amylacée, améliore

les qualités des produits alimentaires. Convient tout par-

ticulièrement, conformément à l'invention, une enzyme branchante découverte par la demanderesse, en provenance

de microorganismes du genre bacillus, qui peut être facile-

ment produite à grande échelle et qui est hautement dénuée

de risques.

Convient comme substance amylacée sur laquelle on fait agir l'enzyme branchante, toute substance amylacée dont les liaisons "-1,4 sont enzymatiquement converties par l'action de cette enzyme en a-1,6, de manière à former une nouvelle structure ramifiée: conviennent par exemple amylose, amylopectine, amidon; dextrine, et amylose de bas poids moléculaire obtenu par dégradation de l'amylopectine à l'aide d'enzyme débranchante; ainsi que degraines et

tubercules à teneur élevée en substance amylacée.

En ce qui concerne le procédé grâce auquel le produit de réaction, obtenu par soumission d'une substance amylacée à l'action de l'enzyme branchante, est incorporé dans les produits alimentaires, convient tout procédé dans la mesure o les objectifs de l'invention sont atteintes: par exemple, une solution dsubstance amylacée, préparée par gélatinisation et dispersion, est d'abord soumise à 1' action de l'enzyme branchante, et puis est mélangée sans

traitement ultérieur ou, si nécessaire, après concentra-

tion et/ou séchage, avec les produits alimentaires. Ou

bien, la substance amylacée est d'abord chauffée en pré-

sence de l'enzyme branchante afin de réaliser simultané- ment la gélatinisation et la réaction enzymatique, et le produit résultant est ensuite préparé dans les produits

alimentaires comme voulu.

Conformément à l'invention, la rétrogradation de la substance amylacée dans les produits alimentaires est suffisamment annulée en raison du traitement de la substance au moyen de l'enzyme branchante, et le traitement en rend la digestibilité satisfaisante. Ce traitement peut

aussi améliorer différentes propriétés des produits ali-

mentaires, par exemple effet croquant, adhésivité, aptitu-

de à communiquer de la viscosité ou à mettre en forme, con-

sistance, dispersibilité et éclat, et est très efficace

pour le maintien de leurs propriétés naturelles souhaita-

bles sur une longue période de temps, prolongeant beaucoup

leur durée de vie en pot.

L'invention peut s'appliquer à tous les produits alimentaires qui contiennent des substances amylacées: par

exemple, produits de confiserie et de boulangerie comme gâ-

teaux secs, biscuits, biscuits de Savoie, gâteaux de riz, produits sucrés d"boulangerie et pains; nouilles et pâtes

comme vermicelle au blé noir, vermicelle chinois et maca-

roni; et des assaisonnements comme roux au curry, et ex-

traits de compote et potage.

En plus des substances amylacées décrites plus haut, d'au-

tres substances amylacées peuvent être également soumises à l'action de l'enzyme branchante, par exemple poudre ou farine de céréale comme poudre de riz cireux, farine de blé et amidon de mais, et le produit résultant peut être

avantageusement utilisé dans les confiseries et autres pro-

duits alimentaires.

Les exemples suivants sont une illustration non

limitative de la production d'enzyme branchante et de pro-

duits alimentaires obtenus grâce à elle.

EXEMPIE A-1

Production d'enzyme branchante de bacillus La souche de bacillus megaterium 10-5, utilisée dans cet

exemple, provient d'un sol de Kita-ku, Osaka, Japon.

Elle a été déposée le 28 Janvier 1981 au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and

Technology, Ministère de l'Industrie et du commerce Inter-

national, et acceptée sous la nomenclature FERM-P NI 582i9.

Ce qui suit constitue la taxonomie de cette souche.

I. Morpholoqie a) morphologie cellulaire:

- Après 24 heures de culture sur agar nutritif in-

cliné, à 280C, on observe des baguettes de forme régulière,

aux extrémités arrondies, de 1,25 - 1,5 x -4. Ces cellu-

les comprennent des globules non colorables par le procédé

de coloration métachromatique, mais colorables par le pro-

céd"e coloration "fat staining". On observe occasionnel-

lement une forme de courte chaîne ou filiforme plus long,

et/ou "shadow-form".

- Après 24 heures de culture sur agar glucosé in-

cliné, à 280C, on observe des baguettes de forme irrégu-

lière, aux extrémités arrondies, de 1,5-2 x 2-2,5/. Les globules intercellulaires sont facilement colorables soit par "fat staining", soit par le procédé de coloration à

la fuchsine. Pratiquement toutes les cellules sont légère-

ment courtes, mais certaines sont filiformes.

b) mobilité et flagelle: au bout de 6 heures de cul-

ture sur agar nutritive inclinée, à 280C, les cellules

sont très mobiles comme le montre l'électro-microphoto-

graphie à grossissement 10 000 de la figure 1.

c) spores s - Lors de la culture sur agar nutritif incliné ou extrait de sol incliné, il y a formation aisée de spores,

c'est-à-dire au bout de 1 à 2 jours.

- Sporanges s on note à peine un gonflement de spo-

range, et la formation de spores se trouve près de l'extré-

mité des sporanges. - Type de spore et dimension s forme éllipsoidale ou ovale; 1-1,5 x 1,25-2,5/, d) Réaction de Gram s les cellules ayant poussé en 6 ou 24 heures de culture sur milieu agar nutritif à 280C,

sont toutes gram positives.

e) Acido-résistance s les cellules ayant poussé en 24 heures de culture sur milieu nutritif à 280C, ne sont

pas acido-résistantes.

f) capsule s Après 18 heures de culture sur milieu

agar nutritif incliné, à 28eC, la coloration phosphore-

acide tungstique et l'observation électromicroscopique ultérieure, confirment l'ombre autour des cellules, ce

qui suggère l'encapsulation.

g) granules métachromatiques s négatives après 24 heu-

res de culture sur milieu agar nutritif,à 28eC.

h) globules gras: positifs, après 24 heures de cultu-

re sur milieu nutritif agar ou milieu nutritif agar glu-

cosé. II. Propriétés de la culture a) Culture sur milieu nutritif agar incliné (28eC, 5 jours): La croissance des cellules est très abondante, et forme des colonies d'un diamètre de 4 à 5 mm pendant 5

jours; ces colonies sont opaques, brillantes,jaune blan-

châtre, et entièrement annulaires, avec une surface ré-

gulière et élevée. La teneur de la cellule est homogène.

Pendant la culture on n'observe pas de formation de pig-

ment. b) Culture sur milieu nutritif agar incliné (28"C, 5 jours); Sur cette pente, la croissance cellulaire est très

facile et abondante. Les colonies sont des anneaux légè-

rement élevés avec une surface translucide, sébacée, bril-

lante, jaune blanchâtre, régulière, plate et filiforme.

c) Culture en suspension sur milieu nutritif (28 C, 2 jours): La croissance cellulaire est très abondante, et le milieu de culture devient trèstrouble en l'espace d'un jour; on observe occasionnellement une aggrégation cellulaire sous forme granulaire. Le trouble diminue au second jour de culture, entraînant la formation en grande quantité de sédiment en forme de lame. On n'observe ni

anneau superficiel, ni formation de pigment et de gaz.

d) Culture par piqûre sur agar (28eC, 5 jours) a On observe la formation de colonies autour des points de

piqûre, et dans la couche supérieure d'agar, la croissan-

ce cellulaire est filiforme.

e) Culture par piqûre sur gélatine X

- Après 5 jours de culture à 20OC, le milieu se li-

quéfie en "saccate".

- Après 10 jours de culture à 28 C, le milieu de

culture se liquéfie, et ne se solidifie guère au refroidis-

sement.

- Après 5 jours de culture à 28 C sur plaque à

stries d'agar et gélatine, on observe une large zone d'hy-

drolyse. f)-Tournesol et lait: - Après 14 jours de culture à 28 C, le tournesol vire du bleu au rouge pourpre; le pourpre de bromocrésol du bleu au jaune bleu clair; et l'on n'observe guère de

formation d'acide ni de solidification.

- Lors de la culture sur plaque agar-lait, on ob-

serve une large zone d'hydrolyse en peu de temps.

g) Croissance cellulaire sur protéose-peptone agar-

acide: La croissance cellulaire est abondante, et les cellules apparaissent jaune blanchatre, et à leur surface rugueuse.

h) Croissance cellulaire sur agar nutritif glucose, in-

cliné: Elle est identique à celle que l'on obtient sur

agar nutritif incliné.

i) Croissance cellulaire sur agar-tyrosine incliné s La croissance cellulaire est abondante et les cellules ont/une surface rugueuse. j) Croissance cellulaire sur agar-citrate, incliné:

La croissance cellulaire est identique à celle que l'on ob-

tient sur agar nutritif incliné. A mesure que les cellules

croissent, le milieu de culture devient rose et alcalin.

k) Croissance cellulaire sur bouchon de pomme de terre La croissance cellulaire est abondante. Les colonies sont jaunes, moles, épaisses et collantes, et sont rugueuses à leur surface. Une petite partie des colonies tombe au fond du tube à essai. La pomme de terre esVdécomposée et devient

grise.

1) Croissance cellulaire sur agar-soja, inclinée: La croissance est très4acile et abondante. Les colonies sont opaques, brillantes, blanc crémeux, à surfaces élevées

et filiformes avec rugosité.

m) Croissance cellulaire sur agar-glucose-acide aspar-

tique, incliné: La croissance est identique à celle que l'on obtient sur

agar nutritif incliné, et les colonies sont blanches.

n) Croissance cellulaire sur lait-tomate-levure:

Le milieu peptonise.

III. Physiologie

a) Réduction du nitrate en nitrite: positive.

b) Production anaérobique de nitrates sous forme gazeu-

se: Les cellules croissent sans formation de gaz.

c) Production d'acétyl méthyl carbinol: négative.

d) Réaction V-P: négative.

e') Production d'indole: négative.

f) Production d'H2S: positive.

g) Hydrolyse de l'amidon: positive.

h) Utilisation des citrates: positive.

i) Utilisation des sels d'ammonium et des nitrates:

les deux sont utilisés comme source d'azote.

j) Production de pigment: la formation de pigment jaune est observée dans la culture aussi bien suxmilieu agar-lait que sur bouchon de pomme de terre. La croissan- ce cellulaire sur un milieu générateur de spore, contenant

de l'extrait de sol, donne un pigment gris.

k) Production d'uréase: positive.

1) Production de catalase: positive.

m) Conditions optimales de température et pH pour la

croissance cellulaire: Les cellules croissent dans un in-

tervalle de pH de 5,5 à 9,3: la valeur optimale de crois-

sance est voisineci 7. Les cellules croissent dans un in-

tervalle de température de 100 à 40OC, avec une croissance

optimale aux alentours de 30 C. A 45 0C et plus, on n'ob-

serve aucune croissance cellulaire.

n) Action de l'oxygène sur la croissance cellulaire:

Les cellules croissent dans des conditions aérobiques.

o) Essai de Hugh-Leifson (O-F essai): oxydant.

p) Formation d'acide et de gaz à partir des sacchari-

des s On opère à 280C pendant 14 jours. On n'observe pas de formation d'acide avec sorbitol ou rhamnose, mais cette

formation se produit avec arabinose, xylose, glucose, su-

crose, lactose, mannitol, ou glycérol. Avec aucun des sac-

charides ci-dessus on n'observe de formation de gaz.

q) Hydrolyse de la cellulose: négative.

En faisant référence à la taxonomie décrite plus haut, et à "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology",

7ème et 8ème éditions, la souche peut être identifiée com-

me un microorganisme de Bacillus megaterium.

IV. Enzymologie de l'enzyme branchante du Bacillus 1) Action enzymatique: L'action de l'enzyme branchante

sur l'amylgsç à degré de polymérisation prochede 500, en-

une legere traîne/augmentation du pouvoir réducteur, mais aussi une diminution progressive de la coloration à l'iode à mesure

que se déroule la réaction, ce qui a pour résultat une di-

minution Jusqu'à 10% ou moins, dans l'absorption à 660 nm,

du résultat sans action enzymatique.

a) Après avoir soumis le produit obtenu en 1), à l'ac-

tion soit d'"-amylase saccharifiante de Bacillus, soit d' a-amylase pancréatique de volaille. On effectue l'analyse

chromatographique sur papier du produit résultant, qui con-

firme la production d'isomaltosyl maltose et de dextrines hautement ramifiées; cela suggère la production à partir de l'amylose, de produit à liaison a-1,6, dans lequel les

unités de glucose sont liées en X-1,4.

b) Après avoir soumis le produit obtenu en 1), à l'ac-

tion de l'isoamylase, on fait agir sur le produit résul-

tant une "-amylase saccharifiante de Bacillus. L'analyse

chromatographique sur papier du produit résultant, confir-

me l'absence d'isomaltosyl maltose, ce qui suggère que les

liaisons "-1,6 sont hydrolysées par l'isoamylase.

c) L'action enzymatique de l'isoamylase sur le produit obtenu en 1), conduit à une augmentation progressive de la coloration à l'iode à mesure que se déroulgla réaction, ce qui a pour résultat une augmentation de 1,1 à 10 fois dans l'absorption à 660 nm, par rapport au résultat sans cette action enzymatique. Cela suggère l'hydrolyse des liaisons a-1,6 du produit par l'isoamylase et la formation

de dextrine linéaire.

d) Après soumission du produit obtenu en 1), à l'action

de la f-amylase, le degré de dégradation s'abaisse à envi-

ron 50% de l'amylose de départ, ce qui suggère que la li-

mite de dégradation par la p-amylase diminue en raison des

liaisons "-1,6 nouvellement formées.

e) Après soumission du produit obtenu en 1), à l'action

de l'isoamylase, le degré de polymérisation moyen du pro-

duit résultant est voisin de 14, tel que déterminé par le "Procédé classique de groupes terminaux", dans lequel le

degré de polymérisation est calculé avec le pouvoir réduc-

teur et le sucre total. Ce degré de polymérisation est plus prochide celui d'un hydrolysat de glycogène obtenu

avec de l'isoamylase (environ 12), que de celui d'un hy-

drolysat d'amylopectine obtenu avec de i'isoamylase (en-

viron 21). La méthylation complète du produit obtenu en 1),

l'hydrolyse acide et l'analyse chromatographique gaz-li-

quide, ultérieure, donne une longueur de ramification

moyenne du produit, voisine de 14, exprimé en unités glu-

cose. 2) Spécificité du substrat: L'enzyme branchante, à côté de l'amylose, agit sur amylopectine, amidon, et amylose de bas poids moléculaire, à degré de polymérisation moyen

de 18.

31 Essai d'activité branchante t

Après purification partielle de l'enzyme branchante et éli-

mination de l'"-amylase, on ajoute à 100pl de cette solu-

tion enzymatique, 100,i d'amylose à 0,1% dans du tampon phosphate 0,05 M (pH 7,5), et on met le mélange à incuber

à 250C pendant 10 minutes. On ajoute au mélange réaction-

nel 3 ml de solution d'iode 1/300 N, constituée par 0,004 M de IK et 0, 005 N HCl, puis l'on détermine l'absorption

du mélange à une longueur d'onde de 660 nm. L'unité d'ac-

tivité branchante est définie comme la quantité d'enzyme qui diminue l'absorption à 660 nm de 0,1% par minute, dans les conditions décrites plus haut. Ce procédé d'essai peut

être appliqué quand l'enzyme branchante est souillée d'o-

amylase, pourvu qu'un inhibiteur d'amylase, n'inhibant pas l'activité de l'enzyme branchante, par exemple celui qui est produit par le genre Streptomyces [s. Ueda et coll., Agr. Bio. Chem. Vol. 37, N 9, pp.20252030 (1973)] soit

utilisé simultanément.

4) pH optimal et stabilité du pH: A pH compris entre 4 et 6, on utilise un tampon acétate,

un tampon phosphate à pH compris entre 6 et 8, et un tam-

pon glycine-NaOH pour un pH de 8 à 10. La valeur optimale 1 1 de pH est déterminée par le procédé d'essai ci-dessus, dans

lequel la solution c'amylose est ajustée à différents ni-

veaux de pH. La stabilité en fonction du pH est déterminée

d'abord par mise à incuber la solution d'enzyme à diffé-

rents niveaux de pH, à 250C, pendant 25 heures, puis par

essai de l'activité résiduaire après ajustement à pH 7,5.

* Les résultats sont donnés dans la figure 2, o figurent en abscisse les valeurs de pH et en ordonnée le pourcentage

d'activité relative, la ligne continue représente le pH op-

timal et la ligne tiretée laAtabilité du pH. Le pH optimal

est voisin de 7,6, et l'enzyme est stable dans un interval-

le de pH compris entre 6,5 et 8,5.

) Température optimale et stabilité thermique: La température optimale est déterminée selon le procédé d'

essai décrit ci-dessus, dans lequel l'incubation est réali-

sée à différentes températures. La stabilité thermique

est déterminée d'abord par mise à incuber la solution d'en-

zyme à pH 7,5 et à différentes températures pendant 10 mi-

nutes, puis par essai de l'activité enzymatique résiduai-

re à 250C. Les résultats sont donnés dans la figure 3, o sont portées en abscisse les températures centigrades et en ordonnée le pourcentage d'activité relative, la ligne continue représente la température optimale, et la ligne

tiretée délimite la zone de stabilité thermique. La tempé-

rature optimale est prochEde 256C, et l'enzyme est stable

jusqu'à une température d'environ 450C.

6) Inhibition, activation, et stabilisation de l'enzyme branchante: L'activit De l'enzyme branchante est inhibée

par la présence de 295 x 10_3M d'ion zinc, mercure ou cad-

mium. La présence de 10 5 M d'acide p-mercurobenzoique inhibe également l'activité de l'enzyme branchante, en agissant de manière spécifique sur le résidu cystéine de

protéine enzymatique. On n'a pas trouvé d'activateurs ef-

ficaces: la présence d'acide citrique ou d'acide glucose-

1 phosphorique, ainsi qu'il est décrit dans de nombreux rapports, se révèle inefficace. Tous les composés-SH sont

efficaces pour stabiliser l'enzyme branchante; les pro-

duits suivants sont actifs de manière décroissante: di-

thiotréitol, mercapto-2 éthanol, glutathion de forme ré-

duite, cystéine. La présence de 20% de glycérol augmente la stabilité thermique de l'enzyme branchante. De même, la présence de 0,1% d'albumine de sérum de veau augmente légèrement la stabilité thermique, mais on ne constate pas

d'effet stabilisant avec le calcium ou le magnésium.

7) Purification: La purification de l'enzyme branchante est semblable à

celledes autres enzymes.

8) Poids moléculaire: Une ultracentrifugation utilisant un gradient de sucrose et la filtration sur gel, donnent un poids moléculaire de

000 20 000.

9) Structure cristalline et analyse élémentaire:

Non confirmées.

) Point isoélectrique:

La concentration sur l'enzyme branchante de l'électropho-

rèse, donne un point isoélectrique voisin de 4,5.

11) Electrophorèse sur pastille: L'électrophorèse de l'enzyme branchante purifiée, obtenue au

V de l'exemple A-1, à 40C et 2,5 mA par gel pendant 2 heu-

res, avec du gel de polyacrylamide à 7,5% (pH 9,4), donne un seul pic d'activité de l'enzyme, dans lequel la mobilité

contre le bleu de bromophénol est voisine de 0,19.

V. Production de l'enzyme branchante de Bacillus La souche de Bacillus megaterium 10-5 FERM-P N 5859 est ensemencée dans 15 litres d'un milieu (pH 7) constitué par

2% en poids/volume de sucrose, 1% en poids/volume de poly-

peptone, 0,5% en poids/volume d'extrait de viande, 0,1% en

poids/volume de phosphate dipotassique, 0,1% en poids/volu-

me de chlorure de sodium, 0,03% en poids/volume de sulfate de magnésium, 0,5% en poids/volume de carbonate de calcium (stérilisé séparément) et de l'eau, et l'on cultive à 280C

pendant 45 heures sous agitation et dans des conditions âé-

robiques. Le bouillon de culture est centrifugé à 3 000 x g, et les cellules récupérées sont détruites à l'aide d' un appareil à ultrasons, et le produit résultant est sou-

mis à une centrifugation de 10 000 x g, ce qui donne envi-

ron 1,7 litres de liquide surnageant contenant l'enzyme branchante (solution brute d'enzyme). Ce liquide surnageant

contient environ 9,6 unités d'enzyme branchante par ml.

Ly'purification de l'enzyme branchante ainsi obtenue s'ef-

fectue comme suit: on ajoute du sulfate d'ammonium au li-

quide surnageant, et la fraction obtenue pour un degré de saturation de 0, 3 à 0,65, est recueillie. Cette fraction est ensuite dissoute dans 10 mM de tampon Tris-HCl (pH

7,5), contenant 5 mM de mercapto-2 éthanol, et l'on dia-

lyse cette solution contre une préparation fraiche du même

tampon. L'enzyme dialysée est alors appliquée sur une co-

lonne de DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Suède) pour adsorber l'enzyme, puis on élue celle-cVavec une préparation fraîche du même tampon, contenant en plus du chlorure de sodium. La fraction à activité enzymatique est recueillie, et dialysée contre une préparation fraîche du même tampon sans chlorure de sodium. L'enzyme dialysée est fractionnée par chromatographie utilisant 4-Aminobutyl Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals AB, Suède), ce qui donne une enzyme branchante purifiée d'activité spécifique

environ 2 000 fois supérieure à l'activité avant purifica-

tion, avec un rendement de l'ordre de 3C% rapporté à l'en-

zyme brute de départ.

La diminution de coloration à l'iode d'un amylose de degré

de polymérisation égal à 100, soumis à l'action de l'enzy-

me branchante purifiée, est représentée à la figure 4,dans laquelle est portée en abscisse la durée de réaction en heure, et en ordonnée le pourcentage d'absorption relative du mélange réactionnel. Est également indiqué sur cette

même figure, l'augmentation de coloration à l'iode du pro-

duit résultant, lorsqu'on le soumet à l'action de l'isoa-

mylase, la ligne-continue représente l'action de l'enzyme branchante sur l'amylose, et la ligne tiretée, celle de 1' iso-amylase sur le produit résultant. Il ressort de cette figure 4, que l'absorption à 660 nm diminue à environ 10% ou moins de sa valeur en l'absence

d'enzyme branchante. L'action de l'isoamylase sur le pro-

duit conduit à une augmentation de 1,1 à 10 fois de l'ab-

sorption à 660 nm, par rapport à celle du produit non sou-

mis à l'isoamylase.

EXEMPLE A-2

Enzyme branchante d'Escherichia coli On ensemence Escherichia coli IFO 3366 dans 1m3 de milieu à pH 7, constitué par 0,85% en poids/volume de KH2PO4,

1,t% en poids/volume de K2HPO4, 0,6% en poids/volume d'ex-

trait de levure, 0,4% en poids/volume d'acétate de sodium, 0,1% en poids/volume de glucose et de l'eau, et on cultive à 370C pendant 16 heures. Lorsque la culture est achevée, le bouillon de culture est centrifugé afin de recueillir les cellules, qui sont ensuite détruites en présence de

tampon glycyl glycine (pH 7,5) contenant 5 mM de dithio-

tréitol, avec un homogénéiseur. Après centrifugation, la

partie surnageante est fractionnée avec du sulfate d'am-

monium, et la fraction obtenue dans l'intervalle de satu-

ration de 30 à 60%, est recueillie. Cette fraction est a-

lors dialysée contre 50 mM de tampon Tris-HCl (pH 7,5) con-

tenant 5 mM de dithiotrétol.

L'enzyme dialysée est ensuite appliquée sur une colonne de

DEAE-cellulose, qui adsorbe l'enzyme, que l'on élue ensui-

te avec un gradient NaCl (0-0,6N). La fraction a activité

enzymatique est récoltée et soumise à filtration sur mem-

brane, ce qui donne une solution concentrée d'enzyme bran-

chante avec un rendement de 11 000 unités environ.

EXEMPLE A-3

Enzyme branchante de pomme de terre kg de pomme de terre coupées en tranches, sont plongées dans une solution aqueuse contenant 0,5% en poids/volume de dithionite de sodium et 0,5% en poids/volume de citrate de sodium, pendant 30 minutes. Les tranches de pommes de

terre sont ensuite broyées dans un homogénéiseur, et le pro-

duit résultant est centrifugé. On ajoute à la partie sur-

nageante une petite quantité d'une solution aqueuse d'acé- tate de plomb pour former un précipité qui est éliminé par centrifugation.

La partie surnageante est alors soumise, comme dans l'exemple A-2 successivement à un relargage, une dialyse, un fractionnement chromatographique au moyen

de DEAE-cellulose et une concentration à l'aide d'une mem-

brane filtrante, ce qui donne une solution d'enzyme bran-

chante avec un rendement voisin de 900 unités.

Les exemples suivants concernent la production

de produits alimentaires.

EXEMPLE B-1

"UIRO"

A 460 g de "SHIRATAMOKO", une farine de riz, on ajoute 000 unités d'enzyme branchante purifiée, obtenue comme dans l'exemple A-1 V, dans 220 ml d'eau, et l'on pétrit

suffisamment ce mélange, puis, on y ajoute 930 g de sucro-

se et 280 g de "JOSHINKO", une farine de riz et l'on re-

pétrit. Le produit résultant est alors couvert d'un linge de coton

humide, et cuit à l'étuvée pendant 30 minutes selon un pro-

cédé classique. Leroduit résultant est refroidi, coupé et façonné pour donner "UIRO", un type de confiserie à base de pâte de riz de style japonais. Ce produit est un "UIRO" semi-transparent, très croquant et à goût excellent, qui garde sa qualité pendant longtemps en raison du fait qu'il

n'est que faiblement susceptible de rétrograder.

EXEMPLE B-2

Pain A 680 g de farine de froment on mélange 4 000 unités d'une enzyme branchante, obtenue comme dans l'exemple A-1 V et l'on y ajoute 20 g de sucrose et 11 g de NaCl dans une pe-

tite quantité d'eau. Après un pétrissage suffisant on ad-

ditionne ce mélange de 13 g de levure comprimée, 13 g d' huile, 2 g de levure alimentaire et une quantité minimale

d'eau, et l'on pétrit afin d'obtenir la pâte pour le pro-

duit voulu.

Suivant un procédé classique, on laisse fermenter cette pâte à 260C pendant 2 heures, on laisse vieillir pendant minutes, et après 15 minutes de durée d'exposition on

le fait cuire dans un four à 200C environ pendant 40 mi-

nutes.

Le produit obtenu est un pain de go t excellent etde tex-

ture appropriée, qui conserve ses qualités pendant long-

temps.

EXEMPLE B-3

"KAMABOKO"

On mélange 4 kg de "Alaska pollack meat" dégelée, hâchée avec 2 000 unités d'une enzyme branchante obtenue comme dans l'exemple A-1 V, 20 g de pullulane dans 400 ml d'eau glacée, 200 g d'amidon de pomme de terre, 80 g de sucrose, 80 g de glutamate de sodium, 12 g de tripolyphosphate de

sodium et 120 g de NaCl, et l'on pétrit suffisamment.

Leroduit résultant est façonné par un procédé classique,

et cuit à l'étuvée pendant environ 30 minutes à une tempé-

rature du produit proche de 800C.

Après refroidissement à température ambiante, on laisse re-

poser à 4 C pendant 24 heures, pour obtenir le produit in-

titulé "KAMABOKO" produit typiquement japonais à base de

chair de poisson.

Ce kamaboko présente une texture fine, un éclat et un cro-

quant excellents. -

EXEMPLE B-4

"Convenient" Potage 1 kg de farine de "weak" est pétri suffisamment dans 360 ml de solution aqueuse contenant 30 g de NaCl et 8 000 unités d'une enzyme branchante, obtenue comme dans l'exemple A-1 V, eVce mélange est façonné en chapelets. Ces chapelets

sont cuits à l'étuvée pendant 2 minutes environ, et chauf-

fée dans une huile à 140O-145eC pour réaliser une déshydra-

tation, suivie d'une pulvérisation. La poudre résultante est mélangée de façon homogène avec 100 g de NaCl, 350 g de glutamate de sodium, 5 g d'inosinate de sodium, 200 g de lait en poudre et 10 g d'épice, ce qui donne le potage en question. L'addition de 130 ml d'eau chaude à 20 g de ce

produit, dans un récipient, en entraîne la dissolution fa-

cilement, et donne instantanément un très délicieux pota-

ge de consistance appropriée.

EXEMPLE B-5

"MUSHIYOKANN

On mélange avec 600 g de farine, 250 g de "KATAKURIKO", une farine d'amidon de racine provenant d'Erythronium Japonicum, 20 g de NaCl, 400 g de "SARASHIAN", une pâte

obtenue à partir de fèves, 1 kg de sucrose, 1,4 kg de mal-

tose et 2,4 litres d'une solution aqueuse contenant 6 000

unités d'une enzyme branchante obtenue comme dans l'exem-

ple A-2, et l'on pétrit suffisamment. Leroduit résultant est façonné et cuit à l'étuvée pendant environ 40 minutes, selon un procédé classique,ce qui donne "MUSHIYCKAN", une

confiserie typiquement japonaise.

Le produit est excellent au point de vue goût et propriété

de croquant, et conserve sa qualité supérieure pendant long-

temps en raison de sa faible propension à la rétrograda-

tion.

EXEMPLE B-6

Crème renversée 400 g d'amidon de mais sont mélangés avec 800 unités d'une enzyme branchante obtenue comme dans l'exemple A-3 dans ml de solution aqueuse, 1,5 kg de maltose, 1,5 kg de

sucrose et 10 g de NaCl, puis on ajoute peu-à-peu à ce mé-

lange 7 kg de lait bouillant, sous agitation et à feu doux.

On poursuit le chauffage jusqu'à ce que l'amidon de mars se gélifie et que le contenu devienne semi-transparent. Le

contenu refroidi est ensuite mélangé avec une petite quan-

tité de parfum à la vanille.

Le produit ainsi obtenu est une crème renversée de consis-

tance appropriée, dotée d'un éclat excellent et dont la

qualité ne change guère après une longue période.

Claims

Revendications

1. Procédé pour la production d'enzyme branchante par culture de microorganismes capable de produire cette enzyme,

dans un milieu nutritif, suivie de la récolte de ladite en-

zyme à partir de ce milieu, caractérisé en ce que le micro-

organisme appartient au genre Bacillus

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme est Bacillus megaterium 10-5 FERM-P

NO 5859.

3. Procédé pour améliorer la qualité de produits ali-

mentaires contenant des substances amylacées, caractérisé en ce que la substance amylacée contenue dans, ou ajoutée à la substance alimentaire, est soumise à l'action d'une

enzyme branchante selon une des revendications 1 ou 2.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en

ce que le produit alimentaire est une confiserie.

5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en

ce que le produit alimentaire est un produit de boulangerie.

6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en

ce que le produit alimentaire est constitué par des nouil-

les.

7. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en

ce que lesproduits alimentaires sont des "convenient" ali-

ments.