FI89330C - Foerfarande foer framstaellning av podofyllotoxin och derivat daerav - Google Patents

Description

1 89330

Menetelmä podofyllotoksiinin ja sen johdannaisten valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää farmaseuttisesti aktiivisten yhdisteiden valmistamiseksi. Nämä yhdisteet muodostuvat podofyllotoksiinista ja sen johdannaisista, joilla on kaava Γ1

A

h3co X0CH3 or2 jossa on H tai OH ja R2 on H tai CH3.

Podofyllotoksiinilla ja sen johdannaisilla on todettu olevan useita erinomaisia farmakologisia vaikutuksia. Niinpä ne vähentävät lymfaattisten T-solujen ("tappajasolujen") aktiivisuutta, joten niitä voidaan käyttää vähentämään immuuni- ja hylkimisreaktioita elinten siirrossa. Lisäksi ne inhiboivat solujen jakautumista metafaasissa, joten niitä voidaan käyttää psoriasis-sairauksien hoitoon. Yhdisteillä on myös bio-sidinen ja biostaattinen vaikutus sellaisia mikro-organismeja kuin plasmodiaa, sieniä ja viruksia vastaan, ja niitä 1 voidaan tästä syystä käyttää parasiittisairauksien, kuten ; malarian ja virustautien hoidossa. Yhdisteet vaikuttavat lisäksi madonpoistoaineina.

Yhdiste podofyllotoksiini on ennestään tunnettu ja se on uutettu kasveista, jotka pääasiassa ovat Podophyllum-sukua.

____ Yhdistettä ei kuitenkaan ole aikaisemmin käytetty keksinnön mukaisessa erittäin puhtaassa muodossa, joka on mahdollista-

2 S 9 3 3 O

nut sen käytön uusilla indikaatioaloilla. Aikaisemmin on useimmiten käytetty Podophyllum-lajeista saatua epäpuhdasta uutetta, nk. "podofylliiniä", joka on sisältänyt vain 20-40 % podofyllotoksiinia. Lisäksi uutteet sisältävät koko joukon muita komponentteja, kuten desoksipodofyllotoksiinia, dehydropodofyllotoksiinia, a- ja β-peltatiinia jne., riippuen siitä, mistä lajista uute on saatu. Useiden näistä muista komponenteista on todettu olevan huomattavan mutagee-nisiä.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle puhtaan podofyllotoksiinin ja sen johdannaisten valmistamiseksi on tunnusomaista, että Podophyllum-lajien kasvinosia uutetaan etyyliasetaatilla ja uute väkevöitetään ja suodatetaan piigeelin läpi, minkä jälkeen se kromatografoidaan happamalla alumiinioksidilla ja pääjae kromatografoidaan piigeelillä, ja haluttu tuote kiteytetään tämän jälkeen uudelleen.

Yhdisteellä podofyllotoksiini on puhtaana seuraavat fysikaaliset ominaisuudet:

Sulamispiste: 183-184°C (yhdiste vapaa liuottimesta)

Optinen kierto: [a]20D: - 132,5 (C 0,2 CHC13)

Liukoisuus veteen: 120 mg/1.

Podofyllotoksiinia ja sen johdannaisia voidaan uuttaa kasvien osista, etenkin juurista tai juurakoista, Podophyllum-suvun eri lajeista, kuten P. emodi Wall’ista ja P. peltatum L:sta. Yhdiste esiintyy myös muissa kasvilajeissa, esimerkiksi Juniperus-suvussa, kuten J. Virginiana L:ssa.

Valmistettaessa keksinnön mukaan erittäin puhdasta podofyllotoksiinia tai sen johdannaisia uutetaan esimerkiksi Podophyllum emodin tai Podophyllum peltatumin kuivattuja ja hienoksi jauhettuja juurakkoja etyyliasetaatilla ja uute väkevöitetään ja suodatetaan piigeelin läpi. Podofyllotoksiinin ja sen johdannaisten haluttu fraktio kromatogra-foidaan tämän jälkeen happamalla alumiinioksidilla, joi- 3 y9 330 loin saadaan fraktio, joka sisältää pääasiassa viittä lig-naania desoksipodofyllotoksiinia, podofyllotoksonia, iso-pikropodofylliiniä, podofyllotoksiinia ja 4'-demetyylipodo-fyllotoksiinia. Podofyllotoksiini tai muu haluttu johdannainen eristetään tästä seoksesta huolellisella kromatografiällä piigeelillä, minkä jälkeen haluttu fraktio kiteytetään uudelleen.

Keksinnön mukaisesti valmistetulla erittäin puhtaalla podo-fyllotoksiinilla ja sen johdannaisilla on todettu olevan useita erinomaisia farmakologisia vaikutuksia ja niitä voidaan käyttää useiden sairauksien hoitoon. Voidaan muodostaa farmakologisia koostumuksia, jotka sisältävät podofyllotoksiinia ja/tai sen johdannaisia yhdessä yhden tai useamman farmakologisesti hyväksyttävän kantaja-aineen kanssa.

Kantaja-aineina voidaan käyttää kaikkia niitä aineita, joiden tiedetään olevan käyttökelpoisia farmakologisissa koostumuksissa, edellyttäen, että ne eivät reagoi epäedullisesti aktiivisen yhdisteen kanssa eivätkä aiheuta jotakin haitallista vaikutusta yhdessä sen kanssa. Farmakologisia koostumuksia voidaan valmistaa enteraalista, parenteraa-lista tai iholle antamista varten ja ne voivat esimerkiksi olla kiinteinä koostumuksina, kuten tabletteina, jauheina, kapseleina, peräpuikkoina tai emätinpuikkoina, enemmän tai vähemmän puolinestemäisinä koostumuksina, kuten voiteina, geeleinä tai salvoina, tai nestemäisinä koostumuksina, kuten liuoksina, suspensioina tai emulsioina. Ne voivat myös sisältää lisäksi tavanomaisia lisäaineita ja myös muita terapeuttisesti aktiivisia aineita. Lankeaa ammatillisen taita-‘ misen puitteisiin valmistaa sopiva koostumus kun tiedetään antotapa ja annon muut edellytykset.

. . Käytettävän annoksen voi ammattimies määrätä lähtien tavan omaisista kriteerioista, kuten sairauden vakavuudesta, antotavasta, potilaan iästä ja kunnosta jne.

4 39330

Keksinnön mukaisesti valmistettuna podofyllotoksiinia ja sen johdannaisia voidaan käyttää useiden erilaisten sairauksien hoitoon, jotka voidaan tiivistää seuraaviksi ryhmiksi.

1. Trooppiset sairaudet, kuten malaria ja skitsotomiasis.

2. Ihosairaudet, kuten psoriasis, sienitartunnat ja alopecia areata.

3. Hylkimisreaktiot elinten siirrossa.

4. Kollagenoosit (sidekudossairaudet), kuten reumaattinen niveltulehdus, systeeminen lupus erythematosus disseminatur, sklerodermia, polyarthemitis nodosa ja sarkoidoosi.

5. Mielisairaus (viruksen aiheuttama), kuten demens ja psykoosit.

6. Neurologiset sairaudet, kuten multippeli sklerosis ja myasthenia gravis.

Terapeuttiset vaikutukset edellä mainittuihin sairauksiin perustuvat podofyllotoksiinin ja sen johdannaisten useihin vaikutusmekanismeihin. Ensiksi yhdiste inhiboi lymfaattisten T-solujen (nk. "tappajasolujen") aktiivisuutta, mikä on tärkeätä torjuttaessa hylkimisreaktioita elinten siirroissa. Lisäksi yhdisteet vaikuttavat solujen jakautumista vastaan metafaasissa, mikä on erittäin merkityksellistä tietyissä ihosairauksissa, kuten psoriasis-tapauksissa. Yhdisteillä on myös biosidinen tai biostaattinen vaikutus sellaisia mikro-organismeja, kuten plasmodiaa, sieniä ja viruksia vastaan, jolloin voidaan hoitaa useita sairauksia, jotka aiheutuvat mikro-organismeista samoin kuin malariaa voidaan hoitaa. Lopuksi yhdisteillä on myös matoja torjuvia ominaisuuksia ja näin ollen niitä voidaan käyttää sisälmysmatoja ja muita parasiitteja vastaan.

Keksinnön mukaisesti valmistetulla podofyllotoksiinilla ja sen johdannaisilla on suoritettu useita farmakologisia, toksikologisia ja kliinisiä tuktimuksia niiden terapeuttisten ominaisuuksien toteamiseksi. Seuraavassa esitetään näiden tutkimusten tulokset.

5 89330

Akuuttinen myrkyllisyys

Podofyllotoksiinin akuuttinen myrkyllisyys on määritetty erilaisilla koe-eläimillä ja erilaisin antotavoin. Tulokset ilmenevät seuraavasta taulukosta 1.

Taulukko 1

Koe-eläin Antotapa Akuuttinen myrkyllisyys _ _ _LD^n mg/kg_

Rotta i.v. 10

Hiiri i.v. 20

Hiiri p.o. 100

Rotta iholle 500

Kani iholle 200

Vaikutus malariaa vastaan

Vaikutus malariaa vastaan määritettiin kliinisesti useilla potilailla, jotka olivat saaneet tartunnan malariaparasii-tista Plasmodium falciparum. Podofyllotoksiinia annettiin kahtena erilaisena annoksena ja parasiittien lukumäärä potilaissa todettiin päivittäin ja merkittiin sukupuolettomien parasiittien lukumääränä veren millilitraa kohti. Tulokset ilmenevät seuraavasta taulukosta 2.

6 89330 , 3 ί :(0 fS O (0 Ö >Η fi +J ^ S a* ; .s n i I | a . -h s :ro •P -H (O E t> (1) Q) w cq g} -h c t> js sil ä| q s s,«I . .S ·* 3 1=5. S S-, S ΐ ί i

| 3 132 SS3 § 535 S S S S

s alli sai s s li s s s s aj S g -h & · r§ rä(ää-H 2 λ £ Λί cu cu *h cu cu </> i-i cu cu cu O O O O O I o o o o

r^* vO

(N1 O OO OOl oooo \o

f\J

o O OO OOl oooo f***· Ό o

Ovi SO

UI

o oo ooo oooo CM 00 vO O o

*— ^ \Q

s ^__:__ X -- 0 ^ :(0 o ooooo oooo S 5 O TS-

(0 "H vO LO

Eh to ro CU »— — — - - - - „ o o o ooo oooo <N| 00 O Ό <S|__ _ o o o ooo oooo

00 OO O r- o (M O O O

t— o tn to to LO o o

fO f- N r- N

O OO OOO OOOO

O r— ' O 00 00 OO vO 00 (M

o ^ o k) ooook)

to »- fO 't (M N vO

O r— »— I g

•H

-U UI <— <νι·«3· mot'·- to oo en o o id ·— :rd :n) .

in &> tn · tn tn O Emt) E m · cJ :rö · κΰ *h C in > -H o > ·

rij v* -H # ^ -H -P

·—I :(tf -P n :(ö — _____ a 7 89330

Vaikutus immuuni- ja hylkimisreaktioita vastaan Lampaiden ja hiirien erytrosyyttien suspensiolla annettu ruiske aiheuttaa spesifisten vasta-aineiden kehittymistä tätä * antigeeniä vastaan. Tämä reaktio, joka tavallisesti on hyvin voimakas, edellyttää eri solutyyppien, pääasiassa makrofaagien, T- ja B-lymfosyyttien välistä yhteistoimintaa ja se on helposti todettavissa koe-eläinten pernassa. Tämä reaktio on inhiboitavissa annoksesta riippuvalla tavalla podofyllotoksiinin päivittäisillä ruiskeilla erytrosyyttien antamisen jälkeen.

Ihonsiirto geneettisesti erilaisiin hiiriin aiheuttaa normaalisti hylkimisen 10 päivän kuluessa. On useissa tapauksissa todettu, että voidaan saavuttaa huomattavasti pidentynyt hengissä pysymisaika, joka on 15 päivää tai pitempi, eläimillä, joita on hoidettu keksinnön mukaisella yhdisteellä verrattuna ilman hoitoa olevaan vertailuryhmään.

In vitro-tutkimuksissa on myös todettu, että podofyllotoksiini inhiboi lisääntymistä tai ei-sukua olevan yksilön mitogee-nisten lektiinien tai solujen aiheuttamaa solujen lisääntymistä ja myös inhiboi sytotoksisten solujen kehittymistä. Merkittävästi pienemmillä annoksilla nämä vaikutukset kasvavat kuitenkin. Toiset tutkimukset osoittavat, että podofyllotok-siinilla käsitellyt solut voivat saada takaisin täydellisen reaktiokyvyn näihin ärsykkeisiin 24 tunnin kuluessa.

Vaikutus psoriasista vastaan

Suoritettiin kliininen tutkimus kaiken kaikkiaan 152 potilaalle, joiden ikä oli 19 ja 71 vuoden välillä (keskiarvo 46,1 vuotta), jotka kärsivät psoriasis vulgariksesta. Potilaat jettiin kolmeen 50, 51 ja 51 henkilön ryhmään, joita hoidettiin ulkonaisesti voiteella, joka sisälsi 0,1, 0,25 ja 0,5 % podofyllotoksiinia. Jokaista potilasta käsiteltiin vain kehon erityisellä sairastuneella alueella, toisten sairastuneiden saaneiden alueiden toimiessa vertailuna. Sairauden vakavuus arvioitiin hoidon alussa sekä 2, 4, 6, 8, 12 ja 16 viikon kuluttua siitä, jolloin mitään hoitoa ei annettu viimeisenä 4 viikon jaksona. Tutkimus suoritettiin käyttäen kaksinker taista sokkotekniikkaa ja tuloksia käsiteltiin statistisesti.

β 89330

Kaikilla kolmella annostasolla saatiin statistisesti merkittävät parannukset (p < 0,001) hoidettujen vammojen vakavuuteen ja siitä johtuviin oireisiin nähden. Niin aikaisin kuin kahden viikon hoitoajan jälkeen ilmeni statistisesti merkittävä ero (p < 0,001) hoidettujen ja hoitamattomien vammojen välillä, ja tämä ero kasvoi hoidon kuluessa. Viidentenä tarkkailuna 70-75 % potilaista olivat oireettomia tai esiintyi vain lieviä oireita, kun taas vain kahdessa potilaassa ilmeni vastaava edistys hoitamattomissa vammoissa. Seuranta-aikana, viikkoina 13-16, ei ilmennyt huonontumista hoidettujen vammojen oireiden vakavuuteen nähden. Vain 11 potilasta ilmoitti sivuvaikutuksista, kuten ihottumasta. Nämä sivuvaikutukset hävisivät kun hoito keskeytettiin. Kolmen hoidetun ryhmän väliset erot sivuvaikutustapausten lukumäärään nähden eivät ole statistisesti merkittäviä (p noin 0,50).

Claims (2)

1. 9 39330 Patenttivaatimus Menetelmä podofyllotoksiinin tai sen johdannaisen valmistamiseksi, jolla on kaava f1 H3 CO OCH3 0R2 jossa Rj^ on H tai OH ja R2 on H tai CH3, tunnettu siitä, että Podophyllum-lajien kasvinosia uutetaan etyyliasetaatilla ja uute väkevöitetään ja suodatetaan piigeelin läpi, minkä jälkeen se kromatografoidaan happamalla alumiinioksidilla ja pääjae kromatografoidaan piigeelillä, ja haluttu tuote kiteytetään tämän jälkeen uudelleen. Förfarande för framställning av podofyllotoxin eller ett derivat därav med formeln f1 I o X 0 '' CO' " j I h3co OCH3 or2 väri Rj^ betecknar H eller OH, och R2 betecknar H eller CH3, kännetecknat av att växtdelar frän Podophyllumarter extrahe-ras med etylacetat och extraktet koncentreras och filtre-
2. 10 B933Q ras genom kiselgel, varefter det kromatograferas pä sur aluminiumoxid och huvudfraktionen kromatograferas ρά kiselgel, och den önskade produkten sedan omkristalliseras.