KR101507651B1

KR101507651B1 - 소리쟁이 추출물을 포함하는 말라리아 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101507651B1
Application number: KR1020130033801A
Authority: KR
Inventors: 이기형; 이경호; 김병수; 최영호
Original assignee: 공주대학교 산학협력단
Priority date: 2013-03-28
Filing date: 2013-03-28
Publication date: 2015-03-31
Also published as: KR20140118241A

Abstract

본 발명은 소리쟁이 추출물을 포함하는 말라리아 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 천연 추출물인 소리쟁이 추출물을 포함하여 뛰어난 말라리아 치료 효과를 가지고, 종래의 합성 약학적 조성물보다 부작용이 적으며, 내성이 발생하지 않는 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

소리쟁이 추출물을 포함하는 말라리아 치료용 약학적 조성물{Composition containing extracts of Rumex crispus for treating malaria}

전 세계적으로, 41%의 인구가 아프리카, 아시아, 중동, 중부 및 남부 아메리카, 히스파니올라 및 오세아니아 지역과 같은 말라리아가 전염되는 지역에 살고 있다. 매년 3억 5천에서 5억 사이의 말라리아 환자가 세계적으로 발생하고 있으며, 백만 명 이상의 사람이 죽고 있으며, 이들 중 대부분은 아프리카 사하라 사막 이남의 어린 아이들이다. 말라리아 전염률이 높은 아프리카 지역에서, 대략 990,000 명의 사람들이 1995년에 말라리아로 죽었다. 2002년에, 말라리아는 개발도상국 어린이들의 4번째 사망 원인이었다. 게다가, 말라리아는 개발도상국에서 모든 어린이 사망 중 10.7%를 차지한다.

말라리아는 적혈구내의 원생류 기생충의 존재에 기인하는 급성 및 종종 만성 전염병이다. 플라스모디움(Plasmodium) 속의 단세포 기생충에 의해 유발되는 말라리아는 암컷 모기에게 물림으로써 개인 간에 전파된다.

한때 북아메리카 및 기타 온대 지역에서 창궐하였지만, 현재 말라리아는 대부분 열대 및 아열대 지방에서 발생한다. 해마다, 4억명 내지 6억명이 말라리아에 걸려서, 1천 5백만명 내지 2천 7백만명이 말라리아로 사망한다.

말라리아의 전파는 암컷 모기가 말라리아 기생충에 이미 감염된 사람을 무는 경우에 개시된다. 감염된 모기가 또 다른 사람을 무는 경우, 모기 타액 중의 스포로조이트가 혈액으로 전달된 후, 간으로 이동한다. 간에서, 스포로조이트는 신속히 분열한 후, 혈류로 진입하여 적혈구를 침습한다. 이러한 적혈구 내부에서, 메로조이트는 적혈구를 파열시킬 때까지 신속히 증식함으로써, 혈류내로 새로운 세대의 메로조이트를 유리시키며, 이는 그 후 다른 적혈구를 감염시킨다.

말라리아와 관련된 증상은 일반적으로 적혈구의 파열과 관련된다. 적혈구의 파괴는 폐물질, 독소, 및 그 밖의 잔해를 혈액내로 누출시킨다. 이는 극심한 발열을 일으켜서, 감염된 개체를 지치게 하여 누워있게 할 수 있다. 플라스모디움 팔시파룸에 의한 반복 감염 및/또는 감염과 관련된 더욱 심각한 증상으로는 빈혈, 심한 두통, 경련, 정신착란 및 어떤 경우에는 사망이 있다.

말라리아를 치료하는 것은 약물 내성을 나타내는 말라리아 기생충의 능력으로 인해 특히 어려웠다. 남미 기나수(cinchona tree)의 수피로부터 추출되는 항말라리아 화합물인 퀴닌은 현존하는 가장 오래되고 가장 효과적인 약제 중의 하나이다. 퀴닌의 하락기조는 이것이 단기 작용성이고, 질병의 재발을 방지하지 못한다는 데에 있다. 또한, 퀴닌은 현기증에서 청각소실에 이르는 부작용과 관련된다.

클로로퀴닌은 퀴닌과 유사한 합성 화학물질이다. 이것이 1940년대에 개발되었을 당시에 이의 유효성, 제조의 용이성 및 일반 부작용이 없으므로 인해 말라리아의 특효약이 되었다. 그러나, 지난 수 십년간, 세계의 수많은 지역의 말라리아 기생충은 클로로퀴닌에 내성을 갖게 되었다.

메플로퀴논은 말라리아의 치료에 사용되어온 퀴닌의 또 다른 합성 유사체이다. 그러나, 말라리아 기생충은 메플로퀴닌에도 내성을 갖게 되었다. 메플로퀴닌은 일부 환자에서 환각 및 생생한 악몽을 포함하는 바람직하지 못한 중추신경 부작용과 또한 관련된다.

항엽산약은 말라리아 기생충의 번식을 억제함으로써 이에 대해 효과가 있다. 기생충이 항엽산약에 대해 또한 내성을 갖게 되지만, 이러한 항엽산약은 다른 타입의 항말라리아제와 병용하여 여전히 효과적으로 사용될 수 있다. 그러나, 말라리아의 치료에 병용 요법을 이용하는 것은 불편하고 비용이 많이 든다는 단점을 지닌다.

또한, 최근에는 자연주의, 웰빙 추세에 따라 천연물을 활용한 약제에 대한 요구가 증가하고 있다. 이를 해결하기 위해 다양한 추출물 제조방법이 개발되고 이에 따라 천연물추출물을 활용한 기능성 식품, 약제 등의 개발이 이어지고 있다. 하지만 아직까지 뛰어난 말라리아 치료 효과를 가지며, 상기와 같은 종래의 합성 약학적 조성물보다 부작용이 적으며, 내성유발 가능성이 작은 천연 약학적 조성물 또는 그 원료에 대한 개발은 미비한 상황이다.

본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명은 천연물 추출물을 포함하여 내성유발 가능성이 작고 종래의 합성 약학적 조성물보다 부작용이 적으며, 뛰어난 항말라리아 효과를 가지는 약학적 조성물을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명은 말라리아 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 천연물추출물인 소리쟁이 추출물을 포함한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 본 발명의 소리쟁이 추출물은 C₁ ~ C₅ 알코올, 헥세인(hexane), 클로로폼(chloroform) 및 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 이뤄진 군에서 선택된 1종 이상으로 추출된 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 소리쟁이 추출물은 2-아세틸-1,8-디하이드로-3-메틸-나프탈렌(2-acetyl-1,8-dihydroxy-3-methyl-naphthalene)을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 말라리아 치료용 약학적 조성물을 0.5 ~ 5,000 ㎎ 포함하는 말라리아 치료제를 제공한다.

나아가, 본 발명은 소리쟁이(Rumex crispus)를 알코올로 추출하여 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 추출물을 유기용매로 분획하여 분획물을 제조하는 단계; 를 포함하는 말라리아 치료용 약학적 조성물 제조방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 분획물을 분리 또는 정제하여 소리쟁이 분리물을 얻는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 분획물의 분리 또는 정제는 얇은막 크로마토그래피(thin layer chormatography) 및 고속액체크로마토그래피(high speed liquid chromatography; HPLC)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 본원 발명의 알코올은 C₁ ~ C₅ 알코올 중 어느 하나의 알코올을 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 본원 발명의 유기용매는 C₁ ~ C₄ 알코올, 헥세인(hexane), 클로로폼(chloroform) 및 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 이뤄진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 본원 발명의 추출물 및 분획물은 2-아세틸-1,8-디하이드로-3-메틸-나프탈렌(2-acetyl-1,8-dihydroxy-3-methyl-naphthalene)을 포함할 수 있다.

본 발명의 말라리아 치료용 약학적 조성물은 천연 추출물인 소리쟁이 추출물을 포함하여 뛰어난 말라리아 치료 효과를 가지고, 종래의 합성 약학적 조성물보다 부작용이 적으며, 내성 유발이 낮아 생체안정성을 향상시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

상술한 바와 같이, 종래의 합성 약학적 조성물은 내성을 유발하며 부작용을 수반하거나, 병용 요법을 이용해야 하는데 병용 요법을 이용하는 것은 불편하고 비용이 많이 든다는 단점이 있다.

이에, 본 발명에서는 천연물추출물인 소리쟁이 추출물을 포함하는 말라리아 치료용 약학적 조성물을 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 종래의 합성 약학적 조성물보다 부작용이 적으며, 내성 유발이 낮아 생체안정성이 향상되며, 뛰어난 말라리아 치료 효과를 가지는 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 말라리아 치료용 약학적 조성물은 소리쟁이 추출물을 포함하는 것이라면 그 함량비를 특별히 제한하지 않는다. 또한, 상기 소리쟁이는 구매 가능하거나 재배한 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 말라리아 치료용 약학적 조성물은 정맥 내, 근육 내 또는 피하 주사에 의해서와 같이 투여를 위한 약제학상 허용되는 제제를 형성하도록 재구성될 수 있는 그러한 약제를 포함될 수 있다.

나아가, 본 발명에서 기술된 말라리아 치료용 약학적 조성물은 고체로서 경구로 또는 흡입을 통해 투여될 수 있거나, 용액, 현탄액 또는 에멀젼으로서 근육 내 또는 정맥 내로 투여될 수 있다. 바람직하게는 리포좀 현탁액으로서 흡액, 정맥 내 또는 근육 내로 투여될 수 있으며, 보다 바람직하게는 에어로졸로서 흡입에 의해 투여하기 적당한 약제학적 제제가 제공될 수 있다.

또한, 상기 소리쟁이 추출물을 추출하는 방법은 통상적으로 천연물에서 추출물을 추출하는 방법이라면 특별히 한정하지 않으나, 바람직하게는 C₁ ~ C₅ 알코올, 헥세인(hexane), 클로로폼(chloroform) 및 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 이뤄진 군에서 선택된 1종 이상으로 추출될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 C₁ ~ C₅ 알코올 중 어느 하나의 알코올로 추출한 후 C₁ ~ C₄ 알코올, 헥세인(hexane), 클로로폼(chloroform) 및 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상으로 추출될 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.

나아가, 본 발명의 소리쟁이 추출물은 소리쟁이에서 추출될 수 있는 성분을 포함하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 2-아세틸-1,8-디하이드로-3-메틸-나프탈렌(2-acetyl-1,8-dihydroxy-3-methyl-naphthalene)을 포함할 수 있다.

상기 말라리아 치료용 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 소리쟁이 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 말라리아 치료용 약학적 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 바람직하게는 통상 1일당 1 내지 5,000 mg의 양을 1회 또는 수회에 나누어 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 내지 1,000 mg의 양을 1일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 상기 말라리아 치료용 약학적 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 말라리아 치료제는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 소리쟁이(Rumex crispus)를 알코올로 추출하여 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 추출물을 유기용매로 분획하여 분획물을 제조하는 단계; 를 포함하는 말라리아 치료용 약학적 조성물 제조방법을 제공한다.

상기 알코올은 통상적으로 천연물에서 추출물 추출 시 사용하는 것이라면 특별히 한정하지 않으나, 바람직하게는 C₁ ~ C₅ 알코올을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 에탄올 또는 뷰테인올(butanol)을 사용할 수 있다.

나아가, 상기 추출물을 수득하는 방법으로는 통상적으로 천연물에서 추출물을 수득하는 방법이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 초음파 추출법, 여과법 및 환류 추출법으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

또한, 상기 유기 용매는 천연물 추출에 사용되는 용매라면 특별히 한정하지 않으나, 바람직하게는 C₁ ~ C₄ 알코올, 헥세인(hexane), 클로로폼(chloroform) 및 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 이뤄진 군에서 선택된 1종 이상으로 추출될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 뷰테인올(butanol), 헥세인(hexane), 클로로폼(chloroform) 및 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 사용할 수 있다.

나아가, 상기 추출물 또는 분획물은 소리쟁이에서 추출될 수 있는 성분을 포함하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 2-아세틸-1,8-디하이드로-3-메틸-나프탈렌(2-acetyl-1,8-dihydroxy-3-methyl-naphthalene)을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 일구현예에 따르면, 유기용매로 분획한 상기 분획물을 분리 및/또는 정제하여 소리쟁이 분리물을 얻는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 분획물의 분리 및/또는 정제하는 방법으로는 통상적으로 천연물에서 특정 성분을 분리 또는 정제하는데 사용되는 방법이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 얇은막 크로마토그래피(thin layer chormatography) 및/또는 고속액체크로마토그래피(high speed liquid chromatography; HPLC)를 사용할 있고, 더욱 바람직하게는 얇은막 크로마토그래피 실행 후 고속액체 크로마토그래피를 실시할 수 있다.

이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 소리쟁이 분리물 제조

소리쟁이 추출물 제조를 위해 사용한 소리쟁이(Rumex crisous L.; 샘플번호 KNU-10-08-4)는 2010년 8월말에 공주에서 수확된 것을 사용하였으며, 상기 소리쟁이는 25 ℃에서 건조하여 사용했다. 상기 건조 소리쟁이 1㎏은 70% 에탄올으로 추출하여 추출물을 제조하였다. 상기 추출물은 Whatman No.2 필터를 사용하여 여과하고, 진공 회전 농축기를 사용하여 농축하여 농축액을 제조하였다. 상기 농축액은 노말-헥산(n-hexane), 클로로폼(chloroform), 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 및 노말-뷰테인올(n-butanol)을 사용하여 각 용매별 분획물을 제조하였다.

상기 농축액에서 분획물 제조 후 남은 여액은 동결 건조한 후 물에 녹이고, Whatman No.2 필터를 사용하여 여과하였다. 상기 여과된 액체는 수(water) 분획물로 사용하였다.

헥산 분획물, 클로로폼 분획물, 에틸 아세테이트 분획물, 뷰테인올 분획물 및 수 분획물은 각각 1% 농도로 디메틸술폭사이드(dimethylsulfoxide; DMSO)에 녹여 각각의 분획물 용액으로 제조하였다. 이후 클로로폼 분획물 용액 및 에틸 아세테이트 분획물 용액은 실리카 겔 크로마토그래피 컬럼(40-63 ㎛, 200 ×650 ㎚, 60 Å)을 사용하여 얇은막 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography; TCL)를 실시하였다. 상기 얇은막 크로마토그래피 실시로 얻은 분획물은 분획물 A 150 ㎎, 분획물 B 1,200 ㎎, 분획물 C 205 ㎎, 분획물 D 1,014 ㎎, 분획물 E 189 ㎎, 분획물 F 814 ㎎, 분획물 G 102 ㎎, 분획물 H 58 ㎎, 분획물 I 753 ㎎ 및 분획물 J 54 ㎎이다. 분획물 B는 고속 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)(컬럼: agilent zorbax SB-C18, 21.2×250 ㎜, 7 ㎛)를 실시하여 소리쟁이 분리물을 얻었다.

준비예 1. 말라리아 원충의 배양

본 실험예에서 사용된 말라리아 원충인 P. falciparum(ATCC 30932, FCR-3 strain) 3D7과 S20은 Trager와 Jensen의 방법(1976)을 변형하여 사용하였다. 즉, O형 인간 적혈구세포의 5% 헤마토크리트를 RPMI 1640 배지에 현탁시키고 열로 활성화시킨 10% O형 인간혈청을 보충하였다. 플레이트를 5% CO₂ 배양기에서 37 ℃에서 배양시키고, 100개 적혈구마다 5개가 원충에 감염될 때까지 5% 기생출혈(parasitemia) 배지를 매일 바꾸어 주었다.

실험예 1.

실시예 1에서 제조한 소리쟁이 분리물은 GC-MS(Varian CP-3800 GC 및 Varian Saturn 2000 MS/MS)로 분석하였다. 또한 IR(Bruker IFS-66/S FT-IR spectrometer) 분석 및 NMR(Varian UNITY INOVA 500 NMR spectrometer; 500 MHz(1H) 및 125 MHz(13C) 기준)을 실시하였다.

상기 NMR 및 IR 스펙트럼 결과는 Colegate et al. 1985 및 Li and McLaughlin 1989와 같은 결과를 보여 상기 실시예 1에서 제조한 소리쟁이 분리물은 2-아세틸-1,8-디하이드로-3-메틸-나프탈렌(2-acetyl-1,8-dihydroxy-3-methyl-naphthalene)임을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 세포 독성 측정

세포 독성은 Carmichael의 MTT 방법(1987)에 의하여 실시하였다. 즉, 각 well에 1×105 vero cell을 넣고 24시간 전배양을 실시한 후, 실시예 1에서 제조한 소리쟁이 분리물을 각각 농도별(1, 25, 50, 100 μM)로 첨가하여 48시간 배양하여 배양액을 제조하였다. 상기 배양액에 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 500 ㎍/㎖를 첨가한 후 well당 50 ㎕ 넣어 3시간 배양하였다. 상기 배양 후 배양액을 버리고, DMSO를 100 ㎖/well씩 넣어 5분간 실온 방치하여 MTT formazan을 용해한 후, ELISA reader(540 nm)로 MTT의 흡광도를 측정하였다. 양성대조약물로는 디페닐요오드늄 클로라이드(diphenyliodonium chloride; DPI) 및 클로로퀴논 디포스페이트(chloroquine diphosphate)을 사용하였다. 상기 소리쟁이 분획물 용액의 선택성지수(selectivity index; SI)는 하기 수학식 1로 계산하였다.

상기에서 측정한 소리쟁이 분리물의 세포독성 및 선택성 지수는 하기 표 1에 나타내었다.

처리약물	CC₅₀(㎍/㎖)	3D7 SI	S20 SI
실시예 1의 소리쟁이 분리물	119.6 ± 3.9	161.6	151.4
클로로퀴논 디포스페이트	78.1 ± 2.6	95.2	13.9
디페닐요오드늄 클로라이드	98.5 ± 4.8	50.8	46.2

상기 표 1에서 확인할 수 있듯이, 실시예 1의 소리쟁이 분리물은 현재 말라리아 치료제로 사용되고 있는 클로로퀴논 디포스페이트 및 디페닐요오드늄 클로라이드 보다 낮은 세포독성을 보였다. 또한, 상기 소리쟁이 분리물은 클로로퀴논 디포스페이트 및 디페닐요오드늄 클로라이드보다 2개의 말라리아 원충(3D7 및 S20)에서 모두 더 높은 선택성을 보였다.

이는 기존 말라리아 치료제로 사용되는 클로로퀴논 디포스페이트 및 퀴논 산화환원 효소 억제제인 디페닐요로드늄 클로라이드보다 세포독성이 낮으며, 말라리아에 대한 선택성은 높아 말라리아를 치료하는데 더욱 효과적이라는 결과를 확인한 것이다. 또한, 기존 합성 말라리아 치료제인 사클로로퀴논 디포스페이트보다 P. falciparum S20에 대한 선택성이 높아 클로로퀴논 디포스페이트에 대한 저항성을 극복할 수 있는 물질로 활용할 수 있을 것이다.

실험예 3. NADP 효소 실험

퀴논 산화환원 효소(quinone oxidoreductase enzyme; PfNDH2) 에세이는 Lenaz등의 방법에 따라서 실시하였다(Lenaz et al., 2004). 96-well plate에 200 μM NADH(nicotinamide adenine dinucleotide reduced form), 10 mM 포타슘시안니드(KCN; Potassium cyanide), 1 ㎍/㎖ F571 membrane 및 20 μM 데실유비퀴논(decylubiquinone; dQ)을 첨가하였다. 이후 96-well plate에 상기 실시예 1에서 제조한 각 분획물 용액을 1, 5, 50 및 500 ㎍/㎖의 농도로 첨가하여 반응시켰다. 96-well plate에서의 총 반응용량은 200 ㎕으로 반응시켜 340 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 양성대조약물로는 디페닐 요오드늄 클로라이드(diphenyl iodonium chloride; DPI) 및 클로로퀴논 디포스페이트(chloroquine diphosphate)을 사용하였다. 실시예 1에서 제조한 각 분획물 용액의 NADH 효소 에세이(assay) 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

분획물의 용매	IC₅₀ ㎍/㎖(PfNDH₂) (3D7 말라리아원충)	IC₅₀ ㎍/㎖(PfNDH₂) (S20 말라리아원충)
노말-헥산	102 ± 2	114 ± 5
클로로폼	42 ± 6	45 ± 8
에틸 아세테이트	34 ± 3	36 ± 5
노말-뷰테인올	178 ± 6	179 ± 5

상기 표 2에서 확인되는 바와 같이, 클로로폼 분획물 및 에틸 아세테이트 분획물은 헥산 또는 뷰테인올 분획물보다 적은 양으로도 말라리아 원충을 효과적으로 제거하였다.

또한, 실시예 1에서 제조한 소리쟁이 분리물의 NADH 효소 에세이 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

처리 약물	P. falciparum 3D7	P. falciparum S20
실시예 1의 소리쟁이 분리물	0.74 ± 0.07	0.79 ± 0.06
클로로퀴논 디포스페이트	0.82 ± 0.02	5.61 ± 0.15
디페닐요오드늄 클로라이드	1.94 ± 0.08	2.13 ± 0.04

상기 표 3에서 확인되는 바와 같이, 알려진 항말라리아 약제인 클로로퀴논 디포스페이트 및 퀴논 산화환원 효소 억제제인 디페닐요로드늄 클로라이드보다 실시예 1의 소리쟁이 분리물이 더 적은 양으로 말라리아의 활성을 저해하는 효과를 확인할 수 있었다. 이는 본원 발명의 소리쟁이 분리물의 항말라리아 활성이 높은 것을 확인한 결과이다.

실험예 4. In Vivo 항말라리아 효과 측정

C57BL/6 마우스(6 주령, 수컷)를 이용한 동물모델에서의 항말라리아 효과는 Soh 등(2009)의 방법을 응용하여 실시하였다. 즉, P. berghei ANKA 감염시킨 적혈구 세포 1×106 cell을 모든 시험군의 각 마우스의 복강에 주사하였다. 실시예 1에서 제조한 소리쟁이 분리물는 P. falciparum 감염시킨 적혈구 접종 24시간 후부터 매일 1회씩 총 4회 복강으로 투여하였다. 실시예 1에서 제조한 소리쟁이 분리물의 용해를 위한 DMSO 농도는 투여 시 1%로 하였으며, 상기 소리쟁이 분리물의 투여는 각 쥐의 복강으로 10, 50 및 250 ㎎/㎏씩 투여하였다. 투여시간은 4 시간(day 0), 24 시간(day 1), 48 시간(day 2) 및 72 시간(day 3)으로 하였다. 기생출혈(Parasitemia)의 측정은 면적당 약 200 적혈구에서 현미경으로 측정하였다. Parasitemia 억제효과(PS)는 하기 수학식 2로 계산하였다. 측정 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

(A는 시험종료 시점의 음성대조군의 평균 기생출혈 및 B는 시험군의 기생출혈)

처리 약물	처리양(㎎/㎏)	기생출혈(%)	기생출혈 억제률(%)	평균 생존 시간(일; days)
실시예 1의 소리쟁이 분리물	250	0.35 ± 0.31	99.1 ± 2.6	19.8 ± 1.7
	50	0.41 ± 0.35	99.1 ± 3.7	16.2 ± 1.5
	10	1.21 ± 0.58	97.1 ± 3.3	14.6 ± 3.9
클로로퀴논 디포스페이트	10	0.40 ± 0.27	89.9 ± 2.4	16.5 ± 2.8
디페닐요오드늄 클로라이드	10	0.67 ±0.31	98.1 ± 3.1	15.1 ± 2.5
PBS(Phosphate buffer solution)	-	36.47 ± 5.9	0.00	6.7 ± 1.4

상기 표 4에서 확인되는 바와 같이, 알려진 항말라리아 약제인 클로로퀴논 디포스페이트 10 ㎎/㎏과 실시예 1의 소리쟁이 분리물 50 ㎎/㎏이 거의 같은 기생출혈 및 평균 생존 시간을 나타냈다. 또한, 및 퀴논 산화환원 효소 억제제인 디페닐요로드늄 클로라이드 10 ㎎/㎏ 보다 실시예 1의 소리쟁이 분리물 50 ㎎/㎏은 더 높은 기생출혈 및 긴 평균 생존 시간을 확인할 수 있었다. 나아가, 실시예 1의 소리쟁이 분리물은 모든 농도(10 ㎎/㎏, 50 ㎎/㎏ 및 250 ㎎/㎏)에서 95% 이상의 높은 기생출혈 억제률을 보였다.

이는 합성 항말라리아제인 클로로퀴논 디포스페이트에 비슷한 항말라리아 효과를 가지는 천연추출물인 소리쟁이 추출물의 항말라리아 효과를 확인한 결과이다.

[ 제조예 ]

제조예 : 약학적 조성물의 제조

본 발명의 실시예 1에서 제조한 소리쟁이 분리물(하기, "소리쟁이 분리물"로 기재함)을 포함하는 약학적 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제조예 1-1. 산제의 제조

소리쟁이 분리물 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제조예 1-2. 정제의 제조

소리쟁이 분리물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제조예 1-3. 캡슐제의 제조

소리쟁이 분리물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제조예 1-4. 환의 제조

소리쟁이 분리물 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

제조예 1-5. 과립의 제조

소리쟁이 분리물 150 ㎎

대두추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

Claims

삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
소리쟁이(Rumex crispus) 유래 2-아세틸-1,8-디하이드로-3-메틸-나프탈렌(2-acetyl-1,8-dihydroxy-3-methyl-naphthalene)을 0.5 ~ 5,000 ㎎ 포함하는 말라리아 치료용 약학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 2-아세틸-1,8-디하이드로-3-메틸-나프탈렌은 C₁ ~ C₅ 알코올, 헥세인(hexane), 클로로폼(chloroform) 및 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 이뤄진 군에서 선택된 1종 이상으로 추출된 것을 특징으로 하는 말라리아 치료용 약학적 조성물.
삭제
삭제