CN107050037A - 雷公藤甲素在制备抗疟疾药物中的应用及其药物组合物 - Google Patents

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刘裕婷
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Abstract

本发明提供了雷公藤甲素在制备抗疟疾药物中的应用，雷公藤甲素的结构式如下：并提供了含有所述的雷公藤甲素作为活性成分和药学上可以接受的载体组成的药物组合物。所述活性成分雷公藤甲素在药物组合物中的重量含量为5‑95％。通过体内外抗疟活性测定，结果显示，雷公藤甲素有较好的抗疟原虫活性。因此，可用于制备治疗疟疾的药物，有较大的临床应用价值。

Description

雷公藤甲素在制备抗疟疾药物中的应用及其药物组合物
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及化合物雷公藤甲素在制备治疗疟疾药物中的应用，尤其涉及雷公藤甲素作为活性成分以及药学上可接受的载体的药物组合物。
背景技术
疟疾(Malaria)疟疾是严重危害人民健康和生命安全的重大传染病之一，根据世界卫生组织报道目前全球有99个国家和地区流行疟疾，约33亿人受到疟疾威胁，每年约有2亿疟疾病例，66万人死于疟疾感染。疟疾由疟原虫引起，其疟原虫包括了恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫，其中以恶性疟原虫致死率最高。带有成熟子孢子的雌按蚊叮咬人体后，将疟原虫注入人体，经10～20天会发生典型的疟疾临床症状，可分为四期：前驱期、发冷(寒战)期、发热期、出汗期和间歇期。疟疾的反复发作后，病人会出现贫血、肝脾肿大，甚至出现脑型、超高热型、厥冷型和胃肠型等凶险症状，甚至危及生命。随着氯喹、哌喹和青蒿素的应用，在近几十年挽救了无数人的生命。20世纪50年代使用氯喹、哌喹等4-氨基喹啉类药物进行抗疟治疗，但是随着这些药物的应用，在使用12年后随之出现的是耐药性。在20世纪60年代开始应用抗叶酸制剂，但是这些不管是单独使用还是联合氯喹使用都出现耐药性，这些耐药性的出现，致使疟疾的发病率日益增加，促使我们尽快寻找高效、敏感、低毒的抗疟药物。
中国中药博大精深，是疟疾预防和治疗的重要组成部分，具有良好的疗效和提高生活质量的优势，成为疟疾治疗的重要手段之一。在中国著名书籍《本草纲目》和《疟疾论》记载了如常山、青蒿、鸦胆子、草果和砂仁等是在民间用来治疗疟疾的中草药。我国工作者从中药青蒿中发现的活性化合物青蒿素用于治疗疟疾取得了很好的效果，广泛用于临床，因此从中药中寻找具有抗疟活性的化合物意义重大。本发明人通过多年研究发现广泛存在于雷公藤中的化学成分雷公藤甲素(Triptolide)具有显著抗疟作用。
雷公藤甲素是从传统中药雷公藤中提取出来的环氧二萜内酯类化合物，是雷公藤的主要有效成分之一。具有免疫调节、抗炎、抗生育及抗肿瘤药理作用。随着对雷公藤甲素研究的不断深入,人们对其药理、药代学、毒理及临床应用等方面的认识也越来越深入而广泛。雷公藤甲素有相当大的潜在应用价值和市场前景，但目前尚未见雷公藤甲素具有抗疟作用的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于研究设计雷公藤甲素在制备抗疟疾药物中的应用。
本发明的一个目的是提供一种雷公藤甲素的用途，即雷公藤甲素在制备抗疟疾药物中的应用。
雷公藤甲素的结构式如下：
通过体内外抗疟活性的实验测定结果显示，雷公藤甲素有较好的体内外抗疟原虫活性。因此，可用于制备治疗疟疾的药物。
本发明的另一目的是提供以雷公藤甲素为活性成分，用于制备治疗疟疾的药物组合物，尤其用于制备治疗由疟原虫引起的疟疾的药物组合物。
本发明所述药物组合物含有治疗有效量的雷公藤甲素为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。其中活性成分在药物组合物中的重量为5-95％。
所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等；填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如明胶、聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如碳酸钙、碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、聚乙二醇等、另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明化合物可以组合物的形式通过口服、注射、呼吸道、皮肤、鼻粘膜给和直肠的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其职称常规的固体制剂如片剂、颗粒剂、胶囊等或制成液体制剂如水或油悬浮剂、糖浆等；用于注射时可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等；用于呼吸道给药时，可制成喷雾剂；用于皮肤给药时，可将其制成软膏剂和经皮给药的剂型等；用于直肠给药时，可制成栓剂等剂型。
本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。
附图说明
图1是雷公藤甲素和阳性药物(氯喹)对3D7虫株生存率影响图。
图1中氯喹组(分别为：0、0.01、0.1、1μg/mL)，雷公藤甲素(分别为：0、1、3、10μM)，*P<0.05**P<0.01***P<0.001。
图2是雷公藤甲素和阳性药物(氯喹)在体内对伯氏疟原虫感染率影响图。
图2中空白模型组，10mg/kg氯喹组，100μg/kg雷公藤甲素组，200μg/kg雷公藤甲素组，400μg/kg雷公藤甲素组，*P<0.05**P<0.01***P<0.001。
具体实施方式
本发明公开了一种雷公藤甲素在制备抗疟疾药物中的应用，下文将以具体实施方式的形式阐述本发明。应理解，这些具体实施例仅仅是阐述性的，而非限制性的。在不偏离本发明精神和范围的情况下，可对本发明做出适当的修改和变动。这些修改和变动都在本发明的范围之内。实验中使用的各种试剂都可从市场上购得，其用量除非另有说明否则按照常规的量使用。
实施例1：雷公藤甲素提取分离方法
提取：称取雷公藤全草25kg加入15L的75％乙醇，搅拌均匀。原料浸泡设定的时间后装入萃取柱，萃取柱两端铺垫医用纱布，防止萃取柱口过滤网堵塞和物料的细小颗粒进入管道。然后将萃取柱吊入萃取釜，密封。打开设备管路，使CO2进入萃取釜中，将压力和温度调节至设定值，关闭萃取釜管路，静态保持设定的时间后，再开启管路，调节分离釜压力和温度至设定值，进行动态循环萃取。动态循环萃取开始后，从分离釜接收产品。萃取到达设定时间后即停止实验。卸压后清洗萃取柱和管路。
分离：称取约500mg雷公藤超临界提取物，用10mL无水乙醇溶解，加入100mL的设定浓度的盐酸，充分搅拌。静置10min后，抽滤，滤饼经真空干燥后即为雷公藤红素产品。往抽滤所得滤液加入NaOH溶液，充分搅拌，调节其pH至设定值。静置10min后，抽滤，不溶物经真空干燥后得雷公藤总生物碱产品。前一步抽滤所得滤液用乙酸乙酯按体积比1:1萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，旋转蒸发回收乙酸乙酯，并经真空干燥后得到雷公藤甲素产品。
雷公藤甲素鉴定：根据HPLC方法进行鉴定，结果显示分离出的雷公藤甲素的与标准品(来源于中国食品药品检定研究院)完全一致。
实施例2：雷公藤甲素体外抗疟活性测定
抗疟活性可以通过测量疟原虫dsDNA含量来确定(Corey,V.C.,et al.,A broadanalysis of resistance development in the malaria parasite.Nat Commun,2016.7:p.11901.)。在含20μL连续稀释测试样本和氯喹阳性药物(购自中国食品药品检定研究所)的96孔板的每个孔中加入感染了3D7虫株P.falciparum的红细胞混悬液(100μL，在RPMI1640培养基(Gibco)中加入5g/L AlbuMAX(Gibco)和50mg/L庆大霉素(Sigma)，使疟原虫血症达到0.5％，红细胞压积达到2％)，然后置于37℃，5％CO2培养箱培养48小时。细胞用裂解液(Tris 2.4g/L,EDTA 1.86g/L,Saponin 0.08g/L,TritonX-100 0.8mL/L)进行裂解，来源于Sigma，dsDNA含量用10000X SYBR Green I试剂(invitrogen)测定，测定程序参照文献(Plouffe,D.,et al.,In silico activity profiling reveals the mechanism ofaction of antimalarials discovered in a high-throughput screen.Proc Natl AcadSci U S A,2008.105(26):p.9059-64.)。简要说来，就是将100μL培育的混合物和按文献说明配制好100μL SYBR Green I试剂混合，在室温下避光培育30-60分钟.然后100μL转移至黑色酶标板中。将酶标板放入EnSpire荧光酶标仪(Perkin Elmer)中，在485nm和535nm的吸光值下读取酵标板中每孔的荧光信号值。从剂量-效应曲线中计算出IC50。雷公藤甲素的对3D7的IC50值如下表：
结果显示，雷公藤甲素具有较好的体外抗疟原虫活性。
实施例3：体外对哺乳动物细胞的毒性测试
在96孔组织培养板中进行(J.Mustafa,S.I.Khan,G.Ma,L.A.Walker andI.A.Khan,Synthesis and Anticancer Activities of Fatty Acid Analogs ofPodophyllotoxin.Lipids.2004,39(2):167-172.)。在96孔板中以25x103个/孔的密度种植非洲绿猴肾异倍体细胞(Vero)并培育24小时。加入不同浓度的样品，即雷公藤甲素化合物溶液，浓度为1μM、3μM、10μM，继续培育48小时。利用Neutral Red assay方法测定存活细胞数，从剂量-效应曲线中计算出IC50。用阿霉素作为阳性对照药物。雷公藤甲素的对Vero的IC50值如下表：
结果显示，雷公藤甲素在体外1-10μM无明显细胞毒性。
实施例4：雷公藤甲素体内抗疟活性测定
伯氏疟原虫伯氏株培养，其所用红细胞为昆明小鼠红细胞，其他培养条件与疟原虫3D7培养方法一致。本发明用的动物是来自中山大学实验动物中心，品系为昆明种小鼠，所有的动物实验过程中对实验动物保护和使用根据NIH标准进行。对小鼠进行输血感染，抽取雄性小鼠心脏血液，用5％葡萄糖盐水将血液稀释成每0.2mL内含1×106个受感染红细胞的悬液，腹腔接种小鼠。接种伯氏疟原虫3小时后，进行分组给药，每组8只，组别为：1、空白对照组(灌胃给予生理盐水)，2、氯喹阳性对照组(灌胃给予10mg/kg)，3、雷公藤甲素(灌胃给予100μg/kg、200μg/kg、400μg/kg)。每天测量体重无明显差异，在接种感染后第0、2、4、6天尾静脉取血涂膜检查减虫率，结果显示(如图2所示)，雷公藤甲素有较好的体内抗疟原虫活性。
由上可知，通过实施例1-4的实验结果表明，雷公藤甲素有较好的体内外抗疟原虫活性。因此可以证实，雷公藤甲素可用于制备治疗疟疾的药物。

Claims (6)

1.雷公藤甲素在制备抗疟疾药物中的应用，其特征在于雷公藤甲素的结构式如下：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物为治疗由疟原虫引起的疟疾的药物。
3.一种抗疟疾药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为由雷公藤甲素作为活性成分，以及与药学上可以接受的载体制成的药物组合物。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述抗疟疾药物组合物还包括一种或多种药学上或食品学上可接受的稀释剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、调节剂以及其他辅料。
5.根据权利要求3或4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物剂型可为口服给药剂型、注射给药剂型、呼吸道给药剂型、皮肤给药剂型、鼻粘膜给药剂型和直肠给药剂型。
6.根据权利要求3或4所述的药物组合物，其特征在于，活性成分雷公藤甲素在药物组合物中的重量含量为5-95％。
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