FI86688C

FI86688C - Antioxidantkompositioner och anvaendning av dessa

Info

Publication number: FI86688C
Application number: FI861707A
Authority: FI
Inventors: Michael Albeck; Shlomo Grossman
Original assignee: Univ Bar Ilan
Priority date: 1985-04-24
Filing date: 1986-04-23
Publication date: 1992-10-12
Also published as: ES8800688A1; NO173609C; IE861059L; IL78592A; US4857325A; FI861707A; IL78592A0; AU5673986A; FI861707A0; CA1291711C; US4997666A; IN165736B; IE62352B1; DK190786D0; DK168981B1; ES554272A0; KR860008252A; KR950004696B1; AU602307B2; NO861606L

Description

1 86688

Antioksidanttikoostumukset ja niiden käyttö Tämä keksintö koskee uusia koostumuksia ja niiden käyttöä kosmetiikassa ja elintarvikkeiden säilönnässä.

5 Ennestään on tunnettua käyttää määrättyjä aineksia inhiboimaan tai ehkäisemään luonnon tai synteettisten ainesten hajoamista. Monet tähän tarkoitukseen käytetyt ainekset ovat veteen liukenemattomia ja haitallisia nisäkkäille sekä suurina että pieninä pitoisuuksina. Tällais-10 ten ainesten esimerkkejä ovat BHA (Butyloitu hydroksiani-soli), BHT (butyloitu hydroksitolueeni), propyyligallaatti ja alfa-tokoferoli. On tunnettua, että monet kasvikudok-set sisältävät luonnollisia antioksidantteja. Näistä anti-oksidanteista on joitakin pystytty eristämään epäpuhtaassa 15 muodossa ja on voitu osoittaa niiden vaikuttavan kaupalliseen soijapapuentsyymiin lipoksygenaasiin (J. Food Science, V. 36 s. 571, 1971). JP-patenttihakemuksessa SHO 58-42686 on julkistettu uuttoprosessi alkalisella orgaanisella liuottimena, jolla saadaan antioksidantti valkopip-20 purijauheesta.

Medycyna Weterynaryjna'ssa 28:430-433 on julkistettu menetelmä kuivan heinän tai Urtican uuttamiseksi kiehuvalla tislatulla vedellä. Tuote käytettiin 48 tunnin kuluessa antioksidanttina kalajauheessa.

25 Patentinhakijat ovat havainneet, että antioksidan- tit, jotka voidaan saada uuttamalla kasvikudoksia vedellä, imeytyvät perkutaanisti eli ihon läpi ja vaikuttavat anti-oksidatiivisesti ihon uiko- ja sisäkerroksissa. Tällainen antioksidanttivaikutus saavutetaan edullisesti siten, että 30 antioksidantti levitetään iholle dispersiona hydrofiili- sessä tai hydrofobisessa perusvoiteessa. Kosmeettinen tulos antioksidantin käytöstä on ihon pehmentyminen, mikä voidaan todeta sormenpäiden kosketuksella. On myös havaittu, että antioksidantin käyttö vähentää ihon peroksidipi-35 toisuutta. Näitä koostumuksia voidaan käyttää elintarvik- 2 86688 keiden säilöntäaineina antioksidanttien, kuten BHT:n ja BHA:n asemasta.

Keksintö muodostuu vesiliukoisen, kasvikudoksista eristetyn antioksidantin koostumuksista ja käyttötavoista, 5 koostumusten pystyessä imeytymään nisäkkään ihoon, jossa se vähentää peroksidipitoisuutta. Antioksidantteja voidaan myös käyttää elintarvikkeiden säilöntäaineina.

Kasvikudokset, joista nämä vesiliukoiset antioksi-dantit voidaan saada, ovat seuraavien kasvien lehdet: 10 Spinacia oleracea (pinaatti), Trifolium (apila), Medicago sativa (alfalfa), Zea mays (maissi), Nicotiana tabacum (tupakka), Penicillaria ja Allium (sipuli ja valkosipuli).

Niinpä tämän keksinnön ensisijaisena tehtävänä on tarjota uusi antioksidanttimateriaali.

15 Tämän keksinnön tehtävänä on tarjota kosmeettinen koostumus ja menetelmä ihon pintarakenteen pehmentämiseksi .

Tämän keksinnön tehtävänä on tarjota koostumus, joka pystyy imeytymään ihon läpi ja joka vaikuttaa anti-20 oksidatiivisesti.

Tehtävähä on myös tarjota koostumuksia ja tapoja hapettumisen estämiseksi elintarvikkeissa.

Keksinnölle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa esitetään.

25 Kuvio 1 on diagrammi, josta ilmenee synergistinen vaikutus käytettäessä valikoituja antioksidanttijakeita.

Kuviossa 2 verrataan graafisesti keksinnön koostumuksen ja BHT:n antioksidanttivaikutusta.

Kuvio 3 esittää keksinnön mukaisen, pinaatista 30 eristetyn antioksidanttijae A:n infrapunakäyrää.

Kuvio 4 esittää keksinnön mukaisen, pinaatista eristetyn antioksidanttijae B:n infrapunakäyrää.

Kuvio 5 esittää keksinnön mukaisen, pinaatista eristetyn antioksidanttijae C:n infrapunakäyrää.

35 Kuvio 6 esittää keksinnön mukaisen, pinaatista eristetyn antioksidanttijae C^rn infrapunakäyrää.

3 86688

Kuvio 7 esittää keksinnön mukaisen, pinaatista eristetyn antioksidanttijae A^n infrapunakäyrää.

Kuvio 8 esittää keksinnön mukaisen, apilasta eristetyn antioksidanttijae A:n infrapunakäyrää.

5 Kuvio 9 esittää keksinnön mukaisen, apilasta eris tetyn antioksidanttijae B:n infrapunakäyrää.

Kuvio 10 esittää keksinnön mukaisen, apilasta eristetyn antioksidanttijae C:n infrapunakäyrää.

Kuvio 11 esittää keksinnön mukaisen, apilasta eris-10 tetyn antioksidanttijae Ax:n infrapunakäyrää.

Käsiteltävänä oleva keksintö tarjoaa iholle levitettäviä kosmeettisia koostumuksia. Nämä koostumukset muodostuvat kosmeettisesti hyväksyttävästä kantajasta ja tehokkaasta määrästä vesiliukoista, kasvikudoksesta kuten 15 kasvien lehdistä ja varsista eristettyä uutetta, joka pystyy imeytymään ihon läpi ja alentamaan ihon peroksidipi-toisuutta.

Kasvit, joista vesiliukoinen uute eristetään, valitaan määrätyistä lajeista, joista käytetään esim. varret 20 ja vihreät lehdet. Nämä lajit kuuluvat ryhmään Spinacia, Trifolium, Medicago, Zea, Penicillaria ja Nicotiana. Muitakin kasveja voidaan käyttää, mikäli niiden vihreistä lehdistä saatu vesiuute iholle levitettynä vaikuttaa anti-oksidatiivisesti. Antioksidanttivaikutus määritettiin tio-25 barbituraatti(TBA)testillä. Tämä testi on kuvattu lähtees sä Food Res. V. 23. s. 620 (1958). Peroksidipitoisuus ihossa voidaan yleisesti ottaen määrittää käsittelemättömän ihon näytteellä, joka kuoritaan koe-eläimestä. Näyte, jonka paino on 10 - 50 mg, homogenoidaan 0,2 M fosfaatti-30 puskurissa pH 6,5 ja sentrifugoidaan. Supernatantti otetaan talteen ja peroksidipitoisuus määritetään TBA-testillä. Samalla tavoin kuoritaan ihonäyte samasta, keksinnön mukaisesti käsitellystä eläimestä ja määritetään peroksidipitoisuus. Kriteerinä sille, että määrätyn kasvin 35 uute on käsiteltävänä olevan keksinnön mukaisesti käyttökelpoinen, on peroksidipitoisuuden väheneminen noin 4 86688 35 %:lla, kun kasvista saatua antioksidanttia käytetään 0,5 paino-%:isena dispersiona vaseliinivoiteessa.

Kosmeettisesti hyväksyttävänä kantajana voi olla mikä tahansa nestemäinen tai puolinestemäinen aines, joka 5 sopii yhteen kasviuutteen kanssa ja joka ei ärsytä ihoa.

Vesiliukoinen antioksidantti voidaan uuttaa kasvi-materiaalista hienontamisen jälkeen kasvimateriaalin ja veden suhteessa 0,5:100 - 1,0:5 (paino/tilavuus g/ml), mieluiten 2:1 (paino/tilavuus g/ml). Hienontaminen voi-10 daan suorittaa lämpötilassa 4 - 100 °C, mieluiten 25 °C, sekoituslaitteella, jauhatuslaitteella tai millä tahansa laitteella, jolla voidaan rikkoa soluseinämä. Uutettu kasvimateriaali poistetaan suodattamalla, linkoamalla, dekan-toimalla, vaahdottamalla tai muulla tavanomaisella tavalla 15 kiintoaineen erottamiseksi nesteestä.

Epäpuhdas antioksidantti voidaan käyttää sellaisenaan kuin se saadaan kasvista joko laimennettuna tai ve-dellisenä seoksena tai puhdistettuna uutteena. Yleensä on suositeltavaa erottaa vedellinen uuttoväliaine liuenneesta 20 antioksidantista haihduttamalla tai kylmäkuivaarnalla nes- teosa, jolloin saadaan kuiva, vesiliukoinen antioksidantti. Epäpuhdas uute voidaan puhdistaa kromatografisesti.

Jauhe liuotetaan yleensä veteen muodostamaan 10 -30 paino-%:inen liuos, joka kaadetaan kolonnin yläpäästä 25 ja annetaan kulkea kolonnin läpi. Eri jakeet eluoituvat vedellä ja jokainen jae otetaan erikseen talteen. Yksittäis jakeet voidaan puhdistaa edelleen toisella kromatografisella menettelyllä, jossa kolonnitäytteen huokoskoko on pienempi.

30 Kromatografiakolonnin erotusväliaineena voidaan käyttää Sephadex G-25:ta erottamaan pinaatista saatu epäpuhdas uute ruskeaksi jakeeksi (A), keltaiseksi jakeeksi (B) ja oranssinväriseksi jakeeksi (C). Oranssinvärinen jae voidaan uuttaa vedellä ja erottaa edelleen kromatografi-35 sesti Sephadex G-10 -kolonnilla. Sephadex G-25, keskikoko, on dekstraani, joka on silloitettu epikloorihydriinillä ja 5 8 6 6 8 8 sen huokoskoko on 50 - 150 pm. Sephadex G-10 on dekstraa-ni, joka on silloitettu epikloorihydriinillä ja sen huokoskoko on 40 - 120 pm. Keltainen jae erotetaan oranssinvärisestä jakeesta ohutkerroskromatografiällä. Sephadex-5 materiaalit on kuvattu kirjassa Gel Filtration Theory and Practice, Pharmacia, s. 1 - 64, joka on liitetty käsiteltävänä olevaan patenttihakemukseen viitteenä.

Patenttihakijat ovat eristäneet useita erilaisia aktiviisia antioksidanttijakeita, jotka voidaan käyttää 10 erikseen tai yhdessä. Monet jaeyhdistelmät ovat osoittautuneet aktiivisemmiksi kuin epäpuhdas jae.

Ruskean, oranssinvärisen ja keltaisen jakeen suhteellisia määriä voidaan vaihdella optimituloksen saavuttamiseksi. Mitä tahansa kahta jaetta voidaan yleensä käyt-15 tää painosuhteessa 1:99 - 99:1 jaeyhdistelmän kokonaispainosta laskettuna. Haluttaessa voidaan yhdistää useampiakin jakeita halutussa suhteessa.

Kosmeettisessa käytössä antioksidantin kokonaismäärä voi vaihdella välillä 0,005 ja 5 paino-% tuotteen koko-20 naispainosta laskettuna. Suositeltava alue on 0,1 - 1 %.

Kosmeettisen perusaineksen luonne ei ole kriittinen ja voidaan käyttää sopivaa kosmeettista voidetta tai lo-tiota.

Antioksidanttia voidaan käyttää huulipuikoissa, 25 kasvovoiteissa, body lotioissa, kostutusvoiteissa ja vastaavissa. Antioksidantti suojaa ihoa vaurioilta eli UV-valon, jonka aallonpituus on alueella 200 - 340 nm, aiheuttamilta vaurioilta. Niinpä antioksidanttia voidaan levittää iholle suojaamaan luonnon tai keinotekoisen sä-30 teilyn, kuten auringon aiheuttamilta vaurioilta joko yksinään tai yhdistelminä auringonvaloa suodattavien aineiden, kuten PABA:n kanssa.

Säilöttäessä elintarvikkeita keksinnön koostumuksilla on käytettävä määrää, joka antaa tehokkaan hapettu-35 missuojan. Yleensä voidaan käyttää 0,001 - 1 paino-% ja mieluiten 0,005 - 0,1 paino-% elintarvikkeen ja antioksi- 6 86688 dantin yhteispainosta laskettuna elintarvikkeesta ja inhiboitavan hapetusaktiivisuuden tyypistä riippuen.

Vesiliukoisella antioksidantilla voidaan säilöä elintarvikkeita, jotka sisältävät rasvoja tai öljyjä, ku-5 ten rasvahappoestereitä tai vapaita rasvahappoja, jotka ovat tyydyttyneitä tai tyydyttymättömiä. Rasvahapot ovat tunnettuja ja ne on lueteltu teoksessa Noller, Textbook of Organic Chemistry, 2nd Ed., s. 108 - 113 ja 138 - 146 (1958), joka on liitetty käsiteltävänä olevaan patentti-10 hakemukseen viitteenä. Tyypillisiä, näitä rasvoja sisältäviä elintarvikkeita ovat soijaöljy, maissiöljy, puuvillan-siemenöljy, oliiviöljy, voi, margariini, maitotuotteet, jäätelö, pakastevihannekset, keitot, ruskistetut elintarvikkeet ja vastaavat. Keksinnön yhdisteillä voidaan lisäk-15 si suojata elintarvikkeita, joissa jotkut yhdisteet voivat hapettua vapaiden radikaalien kautta. Tällaiset elintarvikkeet sisältävät flavoneja, karotenoideja, tokoferoleja ja vastaavia yhdisteitä.

On myös havaittu, että sekä epäpuhtaat että puhdis-20 tetut uutteet ovat pysyviä kohonneessa lämpötilassa eli kiehuvassa vedessä 30 minuuttia ja niiden pysyvyys on hyvä pitkähköjä aikoja ympäristölämpötilassa. Sekä epäpuhtailla että puhdistetuilla jakeilla on suoritettu toksisuusteste-jä. Ainesten ruiske- tai suun kautta annon jälkeen ei ole 25 voitu havaita patologisia muutoksia.

Spinacia oleracean lehtiä homogenoitiin veden kera suhteessa 2:1 (paino/tilavuus g/ml) 5 minuuttia 25 °C:ssa Waring-sekoittimessa. Muodostunut homogenaatti suodatettiin juustoliinan läpi ja sentrifugoitiin sitten g-arvolla 30 15 000 10 minuuttia. Supernatantti otettiin talteen ja kylmäkuivattiin.

Antioksidanttijakeet erotettiin epäpuhtaasta homo-genaattivalmisteesta ja puhdistettiin geelisuodattamalla ja sitten TLC:llä ja HPLC:llä. Liuotettiin 1 g epäpuhtaas-35 ta homogenaatista saatua kylmäkuivattua jauhetta 5 ml:aan vettä, sentrifugoitiin 10 minuuttia g-arvolla 20 000 ja 7 86688 supernatantti kaadettiin Sephadex G-25 -kolonniin (40 cm x 2,5 cm), joka oli tasapainotettu vedellä ja eluoitiin vedellä. Otettiin talteen 5 ml:n jakeita ja jokaisesta määritettiin antioksidanttiaktiivisuus. Aktiivijakeet (A, B 5 ja C) yhdistettiin (jae A oli väriltään ruskea, jae B keltainen ja jae C oranssi) ja kylmäkuivattiin. Jaetta C puhdistettiin edelleen. Jakeen C muodostava kylmäkuivattu aines liuotettiin 20 %:iseksi (paino/tilavuus) vesiliuokseksi, sentrifugoitiin 10 minuuttia g-arvolla 20 000 ja 10 supernatantti kromatografioitiin Sephadex G-10 -kolonnissa (40 cm x 2,5 cm), joka oli tasapainotettu vedellä. Jakeet C1 ja C2 otettiin erikseen talteen ja kylmäkuivattiin kuten yllä. Kylmäkuivattu jae Ca liuotettiin minimimäärään vettä ja liuos annosteltiin 0,2 mm silikageelilevyille (DC-Kar-15 ten SIF, Riedel-Dollaen Ag, sleeze Hanover) ja kehitettiin vesi-etanolissa (30:60 t/t). Aktiivijae identifioitiin heikosti (vaalean) keltaisen värin avulla ja uutettiin si-likageelilevystä vedellä ja kylmäkuivattiin.

Puhdistusta jatkettiin DEAE-selluloosalla (pieni 20 hiukkaskoko). Jae, joka yllä todettiin jae A:ksi, liuotet tiin veteen ja liuos valutettiin DEAE-selluloosalla (pieni hiukkaskoko) pakatun kolonnin (5 cm x 1 cm) läpi, joka oli tasapainotettu vedellä joka oli hapotettu pH-arvoon 5-6 0,2 N HCl:llä. Sitten kolonni pestiin ensin noin 50 ml:11a 25 vettä ja tämän jälkeen 50 ml:11a HCl-vesiliuosta, pH 4.

Kolonni eluoitiin HCl-liuoksella pH 2,0 ja eluoitu aines saatiin talteen jauheena vakuumissa haihduttamisen jälkeen ja identifoitiin jakeeksi Ax. Jauhe liuotettiin veteen kon-sentraationa 20 pg/ml ja syötettiin HPLC silika 60-kolon-30 nin (250 mm x 4 mm) läpi ja eluoitiin veden ja asetonit-riilin 90:10-seoksella nopeudella 0,5 ml/min. Saatiin jae, jonka retentioarvo oli 5,4 nanometriä (UV-absorptio).

Jae Ax:n infrapunakäyrä ilmenee kuviosta 7 ja sen alkuaineanalyysi oli CeH ^,0^, saatu C 42,02 %, H 4,80 %, 35 N 6,38 %, 0 40,09 %.

8 86688

Vaihtoehtoinen kolonnitäyte on Ecteola, joka on kaupallinen, selluloosasta sekä epikloorihydriinistä ja trietanoliamiinista muodostuva kondensaatiotuote, kapasiteetti 0,3 - 0,4 mekv/g ja hiukkaskoko 0,05 - 0,2 mm.

5 Esimerkki 1

Ensimmäisen puhdistusvaiheen jälkeen saatiin kasvi-materiaalin epäpuhtaasta uutteesta kolme aktiivista anti-oksidanttijaetta (A, B ja C), Jae C puhdistettiin edelleen Sephadex G-10:llä pakatussa kolonnissa ja kaksi muuta ak-10 tiivijaetta saatiin eluoimalla vedellä (C^ tummanruskea ja C2 keltaisenoranssi). Jae C^n lopullinen puhdistus tapahtui HPLC:llä. Epäpuhtaan kasviuutteen ja eristettyjen ja-keiden antioksidanttiaktiivisuuden tutkimuksissa käytettiin antioksidanttiaktiivisuuden kriteereinä sekä lipoksy-15 genaasin aiheuttaman linoleaatin hapettumisen inhibitiota että peroksidien itsehapettumisen inhibitiota.

Antioksidanttijakeilla oli synergistivaikutus. Luonnosta eristetyillä antioksidanteilla saavutettu syner-gismi on kuvattu kuviossa 1, josta ilmenevät lipidihapet-20 tumisen prosentuaalinen inhibitio käytettäessä 1 mg: aa kutakin yksittäistä puhdistettua antioksidanttijaetta sekä vastaava prosentuaalinen inhibitio käytettäessä kahden tällaisen jakeen yhdistelmiä, joissa kumpaakin jaetta on 0,5 mg. Voidaan esim. todeta, että tämän synergismin an-25 siosta yhdisteiden vaikutus kasvoi määrällä, joka oli 167 % lista (B + C2) 250 %:iin (A + B = ilman antioksidanttien kokonaismäärän kasvua.

Koska hemiproteiinien katalysoima lipidiperoksi-daatio on hajottava perusreaktio, seurattiin eristettyjen 30 jakeiden kykyä estää tällainen peroksidaatio. Havaittiin, että eristetyt jakeet estivät tällaisen hemoglobiinin, sytokromi C:n ja myoglobiinin indusoiman peroksidaation samalla tavoin kuin ne inhiboivat lipoksygenaasin indusoiman hapettumisen.

35 Puhdistetut antioksidantti jakeet säilyttivät hapet tumisen estotehonsa kuukausia huoneenlämpötilassa ilman 9 Βή 688 aktiivisuushukkaa. Lisäksi puhdistettujen antioksidant-tien keittäminen jopa 30 minuuttia ei vähentänyt niiden antioksidanttitehoa.

Pinaatista eristettyjen jakeiden infrapunaspektrit 5 olivat seuraavat: A: (ks. kuvio 3) leveä kaista 3400 cm'1, voimakkaat kaistat 1050 ja 1650 cm'1, heikot kaistat 1250 ja 1430 cm'1.

B: (ks. kuvio 4) leveät kaistat 3400, 1640 ja 1080 cm'1, lisäkaistat 1420, 1300 ja 810 cm'1.

10 C: (ks. kuvio 5) leveät kaistat 3400 ja 1600 cm'1, voimakas kaista 1390 cm"1, lisäkaistat 1070 ja 820 cm'1.

Cx (ks. kuvio 6) leveä kaista 3300 cm'1 voimakas kaista 1620 cm'1, lisäkaistat 1390, 1320, 1080 ja 770 cm'1.

A2: (ks. kuvio 7) leveä kaista 3300 - 3400 cm'1, voimakas 15 kaista 1650 cm*1, lisäkaistat 1730, 1540, 1250 ja 1080 cm'1, heikot kaistat 2920, 1400 ja 1150 cm'1.

Esimerkki 2

Rotan iholle levitettiin määräajaksi voidenäytteitä ja asianmukaisia kontrollinäytteitä. Levitys tapahtui ker-20 ran päivässä. Kokeiden päätyttyä eläimet tapettiin ja nahka nyljettiin ja jäädytettiin nestetypessä. Jäähdytetystä nahasta otetut näytteet homogenoitiin 0,2 M fosfaattipuskurissa, pH 6,5. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti otettiin talteen ja määritettiin siitä peroksidipitoisuus 25 TBA(tiobarbituurihappo)testillä, jonka ovat kuvanneet

Sinnhuber et ai., Food Res. V. 23, s. 620 (1958).

Testit vastasyntyneillä rotilla Näissä kokeet suoritettiin vastasyntyneillä (karvattomilla) rotilla. Yleinen olettamus on, että tunkeutu-30 minen vastasyntyneen rotan ihon läpi on helpompaa kuin aikuisella rotalla. Tällaisten rottien käytön etuna on, että ne tässä varhaisvaiheessa ovat karvattomia.

Testi nro 1 Tässä testissä kontrolliryhmää käsiteltiin pelkällä 35 vaseliinilla ja testiryhmää käsiteltiin jae C^-pitoisella vaseliinilla. Vaseliiniin suspendoitiin suhteellisen suuri ίο 8 6 6 8 8 määrä jaetta Cx. Testin kesto oli 12 vrk. Tulokset ilmenevät taulukosta 1.

Taulukko 1 TBA Absorbanssi532/- Peroksidaa- P-arvo1 5 Ryhmä_1 g kudosta_tiotaso_(n = 3 )

Kontrolli 0,295 100 % 0,002 + C3 (0,5 %) 0,188 64 % 0,002 10 1 keskihajonta

On osoitettu selvästi, että C3 tunkeutuu vastasyntyneiden rottien ihon läpi ja vähentää siten peroksidipitoi-suutta ihossa. Koska peroksidit ja niiden muodostumiseen ja hajoamiseen osallistuvat vapaat radikaalit ovat tär-15 keimpiä vanhenemiseen johtavia tekijöitä, tämän ainutlaatuisen antioksidantin aktiivisuutta voidaan pitää vanhenemista estävänä tekijänä.

Testi nro 2 Tässä testissä antioksidantti liuotettiin Israelis-20 ta saatavaan olay-öljyyn (erinomainen liukoisuus) ja suo ritettiin samat kokeet kuin testissä nro 1. Tulokset ilmenevät taulukosta 2.

Taulukko 2 TBA Absorbanssi532/- Peroksi- P-arvo1 25 Ryhmä_1 g kudosta_daatiotaso (n = 3)

Kontrolli 0,295 100 % 0,002 (ei käsittelyä )

Kontrolli 0,230 78 % 0,005 30 (olay-öljy) C3 (0,15 %) 0,200 68 % 0,011 C3 (1,5 %) 0,191 65 % 0,010 keskihajonta 35 Kuten testissä nro 1 antioksidantti vähensi merkit sevästi ihon peroksidipitoisuutta. Mielenkiintoinen ha- il 36688 vainto on, että vastasyntyneissä rotissa myös olay-öljy ilman antioksidantteja vähensi peroksidipitoisuutta. Tämä saattaa johtua käytetyssä olay-öljyssä olevista kaupallisista antioksidanteista. On mahdollista, että vastasynty-5 neen rotan ihon suhteellisen suuren läpäisevyyden vuoksi myös pienet määrät näitä antioksidantteja pystyvät läpäisemään ihon. Mutta kuten myöhemmin osoitetaan, olay-öljy ei pystynyt vähentämään aikuisten rottien ihon peroksidipitoisuutta. Voitiin jopa havaita peroksidipitoisuuden 10 pientä kasvua (mikä voi johtua voiteen sisältämistä metal-lihivenistä).

Esimerkki 3 Näissä kokeissa aikuisia hiiriä (ikä 2 kuukautta) käsiteltiin kuten esimerkissä 2. Täysikasvuisten hiirien 15 karva ajettiin ennen voiteiden levittämistä iholle.

Tässä kokeessa antioksidantti liuotettiin olay-öl-jyyn. Hiiret tapettiin 21 vrk kuluttua. Tulokset ilmenevät taulukosta 3.

Taulukko 3 20 TBA Absorbanssi532/- Peroksi- P-arvo*

Ryhmä 1 g kudosta__daatiotaso_( n = 3)

Kontrolli 0,338 100 % 0,019 (ilman voidetta) 25 Olay-öljy 0,400 118 % 0,026

Cx (0,3 %) 0,240 71 % 0,002 ♦keskipoikkeama Näyttää siltä, että täysikasvuisissa hiirissä olay-30 öljy lisää hieman peroksidipitoisuutta ja antioksidantin lisääminen konsentraationa 0,3 % vähentää merkitsevästi näiden peroksidien määrää osoituksena siitä, että antioksidantti tunkeutuu myös täysikasvuisten hiirien ihon läpi. Haluamme korostaa, että samanlaisissa kokeissa, joissa 35 tutkimme konsentraatiolla 0,1 % olay-öljyyn liuotetun BHT:n, BHA:n ja alfa-tokoferolin vaikutusta peroksidipi- 12 86688 toisuuteen ihossa, ei voitu havaita mitään vähenemistä peroksidipitoisuudessa.

Esimerkki 4

Kehitettiin uusi malli vanhenemisen tutkimiseksi.

5 Uudessa mallissa annetaan UV-valon (aurinkolamppu 300 W) vaikuttaa lyhyen ajan aikuisiin, hiiriin, joiden karva on ajettu. Tämä stimuloi vanhenemisprosessia, joka voidaan ilmaista peroksidaatiotason avulla. Mallilla tutkittiin luonnonantioksidantin vaikutusta. Tällä uudella tekniikal-10 la voitiin määrittää vanhenemisinhibitiossa tarvittava antioksidantin optimiannos.

Tässä kokeessa käytettiin epäpuhdasta antioksidant-tivalmistetta (eikä lopullista puhdistettua antioksi-dant-tia).

15 Aikuisista hiiristä ajettiin karva ja niitä sätei- lytettiin UV-valolla (Philips HP 3115) (antioksidantin kera tai ilman sitä) lyhyen eli yhden minuutin ajan kaksi päivää (yhteensä kaksi säteilytystä). Kolmantena päivänä hiiret tapettiin ja ihosta määritettiin peroksidaatiotaso 20 TBA-(tiobarbituurihappo)testillä.

Kokeet käsittivät myös kontrollit, joita ei sätei-lytetty UV-valolla. Antioksidantti liuotettiin olay-öl-jyyn. Tulokset ilmenevät taulukosta 4.

i3 86688

Taulukko 4

Antioksidanttiannostusten vaikutus vanhenemiseen (jokainen ryhmä käsitti 7 eläintä) TBA Absorbanssi Peroksidaa- P-arvo* 5 Ryhmä_532/1 g kudosta tiotaso_( n = 3 ) 1. Ei säteilytystä 0,147 16,7 % 0,010 2. Säteilytys + olay-öljy 0,880 100 % 0,027 3. Säteilytys + 0,740 84 % 0,006 10 0,3 % antioksi- danttia olay-öljyssä 4. Säteilytys + 0,680 77 % 0,020 0,4 % antioksi- 15 danttia olay- öl jyssä 5. Säteilytys + 0,680 77 % 0,011 0,5 % antioksi- danttia olay-20 öljyssä 6. Säteilytys + 0,700 79 % 0,006 1 % antioksidant- tia olay-öljyssä 25 * keskipoikkeama

Epäpuhtaan antioksidantin optimaalinen käyttöannos on 0,3 - 0,4 %.

Esimerkki 5

Ihmisihonäytteet saatiin sairaalan plastiikkakirur-30 gian osastolta. Nämä näytteet asetettiin keittosuolaliuok seen välittömästi potilaista poistamisen jälkeen.

Ihonäytteitä säteilytettiin UV-valolla (Philips aurinkolamput) viisi minuuttia kolme peräkkäistä kertaa siten, että säteilytysten välissä oli viiden minuutin le-35 potauko. Lampun ja kudoksen välinen etäisyys oli 12 cm. Ihonäytteitä pidettiin 3 vrk 4 °C:ssa ja sitten ne kuorit- i4 8 6 6 8 8 tiin ja homogenoitiin. Peroksidipitoisuus määritettiin 20 - 30 mg:sta kuorittua kudosta spektrofotometrisella TBA-menetelmällä.

Tulokset osoittavat selvästi, että ihokudoksen pe-5 roksidipitoisuus (vanheneminen) kasvoi UV-säteilytyksen vaikutuksesta. Luonnonantioksidantilla käsitellyn ja yhtä kauan UV-säteilytetyn ihon peroksidipitoisuus oli sama kuin käsittelemättömällä kontrollilla.

Nämä tulokset ilmenevät taulukosta 5.

10 Taulukko 5 TBA (absorbanssi532/- Peroksi- Näyte_1 g kudosta)_daatiotaso Säteilyttämätön 0,050 62,5 Säteilytetty 0,080 100 15 Säteilytetty + olay-öljy 0,100 125 Säteilytetty + 0,050 62,5 olay-öljy + (A+B+C) 20

Ihmisiholla suoritettujen kokeiden perusteella voidaan päätellä, että a) antioksidantti tunkeutui ihon läpi, b) antioksidantti vähensi merkitsevästi peroksidi- 25 pitoisuutta.

On huomattava, että käytettäessä jakeiden A, B ja C seosta voitiin havaita antioksidantin tehonneen ihoon.

Esimerkki 6

Epäpuhtaasta uutteesta testattiin in vivo vaikutus 30 koehiirien immuunivastesysteemiin. Näissä kokeissa

Balb-C -koirashiiriin ruiskutettiin intraperitoneaalisti 1 mg Spinacia oleraceasta saatua epäpuhdasta uutetta 0,2 mlrssa fosfaattipuskuruliuosta (PBS) eläintä kohti. Eläimet tapettiin 1, 3 ja 7 vrk ruiskeen jälkeen ja niiden 35 perna irrotettiin. Pernasoluja (107 solua/ml rikastettua RPMIrtä), joihin oli lisätty 2 pg/ml Con A:ta (konkavalii- is 8 6 6 8 8 ni-A), viljeltiin 24 tuntia ja saaduista supernatanteista määritettiin sekä IL-2 (interlukiini-2) että CSF (pesäkkeitä stimuloiva tekijä). Kontrollien (ts. käsittelemättömien eläimien) välillä ei havaittu merkitseviä eroja ja 5 koe-eläimien kyky tuottaa IL-2:ta ja CSF:ää osoitti, että antioksidantti ei vaikuttanut haitallisesti immuunisysteemiin. Ruiskutetuissa eläimissä ei myöskään voitu havaita patologisia muutoksia.

Lisäkokeilla voitiin todeta, että 25 mg/hiiri int-10 raperitoneaalisti yhtenä annoksena oli siedettävissä ja että LD50 oli hiirellä alueella 1400 - 1500 mg/kg.

Esimerkki 7

Ihotestit, jotka suoritettiin vapaaehtoisilla henkilöillä ja joissa käytettiin epäpuhtaan uutteen olay-15 öljydispersiota, osoittivat ihon rakenteen parantuneen subjektiivisesti arvostellen ilman haitallisia vaikutuksia koehenkilöihin.

Esimerkki 8 Tässä esimerkissä kuvataan erilaisia keksinnön to-20 teuttamisessa käyttökelpoisia koostumuksia.

Lotio

Antioksidanttia (50 mg jaetta 10 ml:ssa PBS) 1,0 g

Perusvoidetta* 99,0 g 100,0 g 25 *Steariinihappoa 1,4 g

Trietanoliamiinia 0,6 g

Glyseryylimonostearaattia 4,0 g

Lanoliinia, vedellinen 1,0 g

Setyylialkoholia 0,4 g 30 Mineraaliöljyä 2,0 g

Metyyliparahydroksibentsoaattia 0,1 g

Tislattua vettä 90,5 g

Hajustetta q.s. 100,0 g 16 8 6 6 88

Voide

Antioksidanttia 1,0 g

Setyylialkoholia 6,4 g

Stearyylialkoholia 7,4 g 5 Isopropyylimyristaattia 2,0 g

Natriumlauryylisulfaattia 1,4 g

Valkoista vaseliinia 27,6 g

Propyleeniglykolia 9,2 g

Vettä ad 100,0 g 10 Esimerkki 9

Epäpuhdasta antioksidanttia (A, B ja C) lisättiin linoleenihappoon muodostamaan seos, jossa oli 20 ml 7,5 x 10'3 linoleenihappoa 0,2 M vedellisessä natriumfosfaatti-puskurissa (pH 6,5), joka sisälsi 0,25 % Tween 20:ta ja 15 1 mg epäpuhdasta antioksidanttia. Ajettiin kontrollit, jotka sisälsivät puskurissa ja Tweeniä, muttei antioksidanttia, sekä linoleenihapponäyte, joka sisälsi 1 mg BHT:tä ja samaa dispergointisysteemiä. Seos pidettiin 30°:ssa ja absorbanssi mitattiin ferritiosyanaattimenetel-20 mällä, jonka ovat kuvanneet Koch et ai., Arch. Biochem. Biophys. voi. 78, s. 165 (1959). Kuvion 2 testitulokset osoittivat, että keksinnön antioksidantti suojaa tehokkaammin linoleenihappoa hapettumiselta kuin BHT.

Esimerkki 10 25 Antioksidanttiaines eristettiin Trifolium alexandrinumista samalla tavoin kuin pinaatista. Epäpuhdas uute erotettiin komponenteikseen Sephadex G-25:llä ja saatiin jakeet A, B ja C. Jae A puhdistettiin Ecteolalla ja saatiin jae Ax. Jae C erotettiin komponenteikseen Sephadex 30 G-10:llä ja saatiin jakeet Cx ja C2. Jae C2 erotettiin edelleen komponenteikseen liuottamalla minimimäärään vettä, annostelemalla 0,2 mm silikageelilevyille ja kehittämällä vesi-etanolilla 30:60 t/t, jolloin saatiin jakeet, jotka merkittiin TLC-1, -2 ja -3.

35 Ajettiin seuraavat infrapunaspektrit: i7 86688 A: (ks. kuvio 8), B: (ks- kuvio 9) voimakkaat ja leveät kaistat 3300, 1560 ja 1130 cm'1, keskikokoinen kaista 1400 cm'1, pienet kaistat 1350 ja 1430 cm'1.

5 C: (ks. kuvio 10) leveä kaista 1370 cm'1, voimakkaat kaistat 1600, 1380 ja 1150 cm"1.

Ax: (ks. kuvio 11).

Joistakin yllä mainituista, apilasta eristetyistä jakeista (kukin 0,2 mg) testattiin antioksidantti systee-10 missä, joka sisälsi linoleenihappoa substraattina ja li-poksygenaasientsyymiä katalyyttinä. Hapen absorptiota seurattiin happimonitorilla menetelmän Grossman ja Zakut, Methods of Biochemical Analysis (D. Glick, Ed.) 25:303-329 (1979) mukaan. Tulokset olivat seuraavat: 15 Lipidiperoksidaation inhibitio apilasta eristetyil lä antioksidanteilla

Jae Inhibitio %

Epäpuhdas uute 20 A 9 20 B 16 C 30 TLC-1 42 TLC-3 46 25 Joskin keksintöä on kuvattu yllä sen tällä hetkellä suositeltavien toteuttamismuotojensa avulla, ammattimiehelle on selvää, että monet muunnokset ovat mahdollisia.

Claims

1. Hapettumista estävä kosmeettisesta käyttökelpoinen tai elintarvikkeiden säilöntään käyttökelpoinen mate-5 riaali, tunnettu siitä, että se käsittää kasviku-doksen vesiliukoista uutetta kasveista, jotka kuuluvat ryhmään Spinacia, Trifolium, Medicago, Nicotiana, Zea, Penicillaria ja Allium, tai uutteen selvästi erotettvia fraktioita, jolloin uute on kromatografisesti erotettavis-10 sa dekstraanilla, joka on silloitettu epikloorihydriinillä ja jonka huokoskoko on 50 - 150 pm, fraktioihin, jotka ovat ruskeita (A), keltaisia (B) ja oransseja (C), ja joista fraktio A on kromatografisesti puhdistettavissa aineella, joka on joko 15 i) selluloosan kondensaatiotuote epikloorihydrii- nin ja trietanoliamiinin kanssa jonka kapasiteetti on 0,3 - 0,4 mekv/g ja hiukkaskoko 0,05 - 0,2 mm, tai ii) dekstraani, joka on silloitettu epikloorihydriinillä ja jonka huokoskoko on 40 - 120 pm fraktion (AT) 20 saamiseksi, jonka infrapunaspektrillä on olennaisesti seu-raavat ominaisuudet: leveä vyöhyke 3300 - 3400 cm"1:ssa, voimakas vyöhyke 1650 cm'1:ssa, lisä vyöhykkeet 1730, 1540, 1250 ja 1080 cm^rssa, heikot vyöhykkeet 2920, 1400 ja 1150 cm^rssa, ja 25 fraktio C, joka on kromatografisesti erotettavissa dekstraanilla, joka on silloitettu epikloorihydriinillä ja jonka huokoskoko on 40 - 120 pm, fraktioiksi, jotka ovat tummanruskeita ja kellertävän oransseja ja joita merkitään C^llä ja C2:lla vastaavasti.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hapettumista es tävä materiaali, tunnettu siitä, että kasvikudok-sen vesiliukoinen uute on oranssinvärinen fraktio, joka on kromatografisesti erotettu kasvikudoksesta vesiuutolla saadusta supernatantista käyttämällä dekstraania, joka oli 35 silloitettu epikloorihydriinillä ja jonka huokoskoko oli 50 - 150 pm, kromatografiapylvään pakkaamiseen. i9 8 6 6 88

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hapettumista estävä materiaali, tunnettu siitä, että kasvikudok-sen vesiliukoinen uute on ruskea fraktio, joka on kromatografisesti erotettu kasvikudoksesta vesiuutolla 5 saadusta supernatantista käyttämällä dekstraania, joka oli silloitettu epikloorihydriinillä ja jonka huokoskoko oli 40 - 120 pm, kromatografiapylvään pakkaamiseen.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hapettumista estävä materiaali, tunnettu siitä, että kasvikudok- 10 sen vesiliukoinen uute on keltainen fraktio, joka on kromatograf isesti erotettu kasvikudoksesta vesiuutolla saadusta supernatantista käyttämällä dekstraania, joka oli silloitettu epikloorihydriinillä ja jonka huokoskoko oli 50 - 150 pm, kromatografiapylvään pakkaamiseen.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hapettumista es tävä materiaali, tunnettu siitä, että kasvikudok-sen vesiliukoinen uute käsittää kahden tai useamman oranssinvärisen, keltaisen ja ruskean fraktion seos, jotka fraktiot on kromatografisesti erotettu kasvikudoksesta 20 vesiuutolla saadusta supernatantista käyttämällä dekstraania, joka oli silloitettu epikloorihydriinillä ja jonka huokoskoko oli 40 - 120 pm, kromatografiapylvään pakkaamiseen.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hapettumista es-25 tävä materiaali, tunnettu siitä, että sillä on kuviossa 3, 4, 5, 6, tai 7 esitetty infrapunakäyrä.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hapettumista estävä materiaali, tunnettu siitä, että kasvikudos käsittää tuoreita lehtiä ja/tai varsia.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hapettumista es tävä materiaali, tunnettu siitä, että se käsittää vähintään yhden aineen ryhmästä, joka koostuu fraktioista A, hir B, Ci ja C2.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hapettumista es-35 tävä materiaali, tunnettu siitä, että se käsittää 20 86 688 hapettumista estävän synergistisen yhdistelmän fraktioista A, Aw B, Cx ja C2.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hapettumista estävä materiaali, tunnettu siitä, että se on ve-5 siliukoisen uutteen kromatografisesti erotettu fraktio, jonka infrapunaspektrillä on seuraavissa kohdissa a)-g) mainitut ominaisuudet, nimittäin: a) leveä vyöhyke 3400 cm'1: ssa, voimakkaat vyöhykkeet 1050 ja 1650 cm"1: ssa, heikot vyöhykkeet 1250 ja 1430 10 cm'1:ssa, b) leveät vyöhykkeet 3400, 1640 ja 1080 emoissa, lisävyöhykkeet 1420, 1300 ja 810 cm_1:ssa, c) leveä vyöhyke 3300 cm"1: ssa, vahva vyöhyke 1390 cm"1: ssa, lisävyöhykkeet 1070 ja 820 cm'1: ssa, 15 d) leveä vyöhyke 3300 cm'1: ssa, voimakas vyöhyke 1620 cm"1: ssa, lisävyöhykkeet 1390, 1320, 1080 ja 770 cm"1: ssa, e) leveä vyöhyke 3300 - 3400 cm"1:ssa, voimakas vyöhyke 1650 cm"1:ssa, lisävyöhykkeet 1730, 1540, 1250 ja 1080 20 cm"1: ssa, heikot vyöhykkeet 2920, 1400 ja 1150 cm"1: ssa, f) leveä vyöhyke 3430 cm"1:ssa, voimakas vyöhyke 1600, 1380 ja 1150 cm"1:ssa, tai g) leveä vyöhyke 3430 cm"1:ssa, voimakas vyöhyke 1600, 1380 ja 1150 cm"1:ssa.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hapettumista estävä materiaali, tunnettu siitä, että vesiliukoinen uute on saatu menetelmällä, jossa tuoreita lehtiä ja varsia uutetaan pääasiassa vedellä lämpötilassa 4 °C -100 °C, edullisesti ympäristön lämpötilassa.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hapettumista estävä materiaali, tunnettu siitä, että se kestää kiehuvaa vettä 30 minuutin ajan.

13. Koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaista hapettumista estävää 35 materiaalia ja kosmeettisesti hyväksyttävän kantajan tai inertin ohenteen. 2i 86688

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää noin 0,005 -5 paino-% hapettumista estävää materiaalia, laskettuna koostumuksen kokonaispainosta.

15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että kosmeettisesta hyväksyttävä kantaja on hydroftiilinen voide, hydrofiilinen lotioni, hydrofobinen voide tai hydrofobinen lotioni.

16. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen hapettumista 10 estävän materiaalin käyttö kosmeettisissa aineissa, jotka alentavat ihon peroksidaasitasoa ja pehmittävät ihon pintarakennetta .

17. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen hapettumista estävän materiaalin käyttö elintarvikkeiden säilöntäainee- 15 na.

18. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen hapettumista estävän materiaalin valmistamiseksi, tunnet-t u siitä, että uutetaan kasvikudosta kasveista, jotka kuuluvat ryhmään Spinacia, Trifolium, Medicago, Nlcotiana,

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kasvikudos jauhetaan ennen uuttamista.

20. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että uuttaminen suoritetaan lämpö tilassa noin 4 eC - 100 °C, edullisesti noin 25 °C.

20 Zea, Penicillaria ja Allium vedellä ja mahdollisesti erotetaan siitä fraktiot kromatografisesti dekstraanilla, joka on silloitettu epikloorihydriinillä ja jonka huokoskoko on 50 - 150 pm, fraktioihin, jotka ovat ruskeita (A), keltaisia (B) ja oransseja (C), ja joista fraktio A mah-: 25 dollisesti puhdistetaan kromatografisesti aineella, joka on joko i) selluloosan kondensaatiotuote epikloorihydrii-nin ja trietanoliamiinin kanssa, jonka kapasiteetti on 0,3-0,4 mekv/g ja hiukkaskoko 0,05 - 0,2 mm, tai 30 ii) dekstraani, joka on silloitettu epikloorihyd riinillä ja jonka huokoskoko on 40 - 120 pm fraktion (Aj) saamiseksi, jonka infrapunaspektrillä on olennaisesti seu-raavat ominaisuudet: leveä vyöhyke 3300 - 3400 ongissa, voimakas vyöhyke 1650 35 cm_1:ssa, lisävyöhykkeet 1730, 1540, 1250 ja 1080 cm"1:ssa, heikot vyöhykkeet 2920, 1400 ja 1150 cm_1:ssa, ja mahdol- 22 86688 lisesti fraktio C erotetaan kromatografisesti dekstraanil-la, joka on silloitettu epikloorihydriinillä ja jonka huokoskoko on 40 - 120 pm, fraktioiksi, jotka ovat tummanruskeita ja kellertävän oransseja ja joita merkitään C1:llä 5 ja C2:lla vastaavasti.

21. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsitellään tuoreita lehtiä ja/tai varsia.

22. Menetelmä ihon pintarakenteen pehmentämiseksi, tunnettu siitä, että iholle levitetään koostumus, joka käsittää kosmeettisesti hyväksyttävän kantajan ja minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-12 mukaista hapettumista estävää materiaalia.

23 B 6 6 8 8