DE2225647A1 - Lipase-inhibitor aus fettreichen samen, ein verfahren zu seiner herstellung sowie seine verwendung als arzneimittel - Google Patents

Description

2225647 FARBENFABRIKEN BAYER AG

LEVERKUSEN-Bayerwerk

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2 5. Mai 1972

Lipase-Inhibitor aus fettreichen Samen, ein Verfahren zu seiner Herstellung sowie seine Verwendung als Arzneimittel

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Lipase-Inhibitor aus fettreichen Samen, ein Verfahren zu seiner Herstellung aus verschiedenen fettreichen Samen sowie seine Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Verhütung von Fettgewebenekrosen.

Man kennt bereits eine Anzahl von Lipase-Inhibitoren K.Dietmann u.W.Jukran, Naunyn-Schmiedeberg Arch.exp.Pathol. Pharmacol.,269, 467 (1971); B.May U.L.Leinweber, Naunyn-Schmiedeberg Arch.exp.Pathol. Pharmacol. 269, 467 (1971); N.Klissiunis u.M.Mykoniats, Naunyn-Schmiedeberg Arch.exp.Pathol. Pharmacol. 269, 469 (1971); F.H.Mattson,R.A.Volpenhein u.L.Benjamin, I.biol.Chem. 245, 5335 (1970); G.Benzonana u.P-Desnuelle, Biochim.biophysica Acta Amsterdam 164, 4747 (1968); P.Desnuelle, M.I.Constantin u.L.Sarda, Bull. Soc.Chim.biol. 38, 625 (1956); D.K.Myers, A.Schotte, H.Boeru.H.Borsje-Bakker, Biochem.I. 6i_, 521 (1955); G.Gomorie, I. Lab.Clin.Med. 42, 445 (1953); .G.Gomori, Am.I.Clin.Pathol.. 27, 170 (1957); G.A.Overbek, Clin.Chim.Acta 2, 1 (1957);

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H. I.Henry, C.Möbel u.M.iierkman, (Jlin.Chem. JS., 77 (19^7); li.Hrockerhoff, Biouhlm. bi ophya U;a Acta Amsterdam IJ/^,

Die meldten dieuer Mubßtanzen wurden synthetisch hergeatel it, ntKi «a Liegen keine llinwelue dafür vor, daß sie al» Arzneimittel verwendet werden können.

l'lii wurde nun gefunden, daß mau einen neuen Llpaue- Inhibitor durch Kxtraktion von .fettreichen Mamen mit orpianiachen i-üiuuigiimi ttein gewinnen kann. Weiterhin wurde gefunden, daß ύον neue Mpane-Inhibitor ala Arzneimittel verwendet werden · kunn.

Hei dem erfindungsgemäßen Inhibitor handelt es sich um einen Ester, der aus Myrlstinsäure, Palmitlnsäure und Ölsäure sowie einem Polyalkohol gebildet ist. Bei seiner Methanolyse erhält man die gaschromatographisch nachweisbaren Methylester der drei genannten Säuren, während die Hydrierung Myristinsäure, Palmitinsaure und Stearinsäure ergibt. Der erfindungsgemäße Lipase-Inhibitor ist monomolekular. Von den Fetten unterscheidet er sich durch die Hemmung des Enzyms Lipase, welche sofort nach Mischen der Reaktionspartner eintritt. Der Inhibitor übt diese Hemmung permanent aus; ein Nachlassen der Hemmwirkung bei längerer Inkubationszeit ist auch bei Lipaseüberschuss nicht zu'beobachten. Die Hemmwirkung verschwindet nach alkalischer Hydrolyse, während Hydrierung nicht zum Verlust der Inhibitoreigenschaft führt.

Fig.1 zeigt die Gaschromatogramme der nach Methanolyse des Inhibitors erhaltenen Fettsäuremethylester, nativ (a) und hydriert (b).

Fig.2 zeigt die Hemmung der Lipasewirkung durch den erfindungsgemässen Inhibitor. Auf der x-Achse sind die stei-

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original

genden Mengen der Inhibitoremulsion in ml, auf der y-Achse die freigesetzten Fettsäuren (=Verbrauch an 0,05 N NaOH) angegeben.

Überraschenderweise ist der erfindungsgemäße Inhibitor stärker wirksam als die bereits bekannten Inhibitoren für Lipasen, und überraschenderweise lässt er sich in denkbar einfacher Weise aus fettreichen Samen gewinnen. Dieses Ausgangsmaterial ist ausserdem billiger und viel leichter zugänglich als die Ausgangsmaterialien für die synthetische Herstellung von Lipase-Inhibitoren.

Der neue Inhibitor wird erfindungsgemäß hergestellt, in dem man gemahlene fettreiche Samen mit organischen Lösungs- · · mitteln extrahiert, den Extrakt eindampft und das so erhaltene Rohkonzentrat chromatographiert.

Geeignete fettreiche Samen sind vor.allem Arachis hypogea, Brassica napus var. arvensis, Papaver sommiferum u.s.w. Als Extraktionsmittel eignen sich Aceton, Aether, Petro.1-äther, CCl,, Eisessig, Trichloräthan u.s.w.

Die Extraktion, wird bei Zimmertemperatur unter Rühren durchgeführt und dauert einige Stunden.

Für die Chromatographie¹ des Rohkonzentrates, welches für diesen Zweck wiederum in Lipoidlosungsmitteln gelöst wird, kommen VerteilungsChromatographie und Gegenstromchromatographie in Frage. Geeignete stationäre Phasen sind z.B. quervernetzte Polydextrane, Silikate, Kieselgel u.s.wj

Man testet jede Fraktion, schneidet diejenige mit der besten Hemmwirkung heraus und chromatographiert sie nochmals. Schliesslich erhält man ein chromatographisch einheitliches,

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öliges Produkt.

Der erfindungsgemäße Inhibitor kann als Arzneimittel verwendet werden. Er weist starke lipasehemmende Wirkungen auf und eignet sich zur Behandlung von akuten, subakuten und chronischen Entzündungen der Bauchspeicheldrüse in Analogie zur Behandlung akuter Pankreatitiden mit Kallikrein-Trypsin-Inhibitor, insbesondere zur Verhütung von Fettgewebsnekrosen im Bereich der Bauchhöhle und ihrer Organe, die Ursache für einen DarmverSchluß oder eine Peritonitis sein können."

Der neue Wirkstoff kann in bekannter Weise in die üblichen Formulierungen übergeführt werden, wie Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen mit inerten Hilfsstoffen.

Der neue Wirkstoff kann in üblicher Weise angewendet werden, insbesondere zur intravenösen, intraperitonealen, intramuskulären und subcutanen Applikation ein- oder mehrmals täglich als Injektion, zur Infusion oder zur Spülung der Bauchhöhle in der Dosierung von 0,5 - 500 mg pro Patient.

Eine weitere Anwendungsmöglichkeit des Inhibitors liegt in seiner Verwendung als Konservierungsmittel für fettreiche Nahrungsmittel, z.B. Fette und Öle.

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Beispiel 1 i

1. Gewinnung der Lipide

Je 1000 g gemahlene Erdnüsse werden jeweils mit 1 1 Aceton 5 Stunden intensiv gerührt. Anstelle von Erdnüssen kann man in völlig gleicher Weise die Samen von Brassica Napus var. arvensis oder von Papaver somniferum verwenden. Der Acetonextrakt wird durch Filtrieren von festen Partikeln befreit und das Lösungsmittel im Vacuum entfernt.. Die acetonfreien Lipide wurden für die Untersuchung verwendet,

2. Nachweis antilipolytischer Aktivität Lipasesubstrat: 0,5 g Natriumbenzoat, 18,5 g Gummi arabicum, 250 ml Wasser. Nach Homogenisieren Zugabe von 250 ml Olivenöl. 5 Minuten homogensieren. Von den auf Hemmwirkung zu prüfenden Lipiden und Lipidfraktionen werden analog Emulsionen hergestellt, Inkubationspuffer Tris 0,05 M, pH 8,0. Substrat und Puffer werden vor Gebrauch im Verhältnis 1:1 gemischt. Die Bestimmung der Lipasewirkung bzw. deren Inhibierung erfolgt durch Titration der freigesetzten Fettsäuren, Substrat- und Inhibitoremulsion können jedoch titrierbare Acidität enthalten. Es sind deshalb Substrat- und Inhibitor-Leerwerte ; mitzuführen.

Ansätze: \. Substratleerwert: 10 ml Substrat-Puffermischung + 1 ml Thymolphtalein. 2. Lipidleerwert: 10 ml Emulsion-Puffermischung + 1 ml Thymolphtalein. 3. Lipasevergleichswert: 2 mg Enzym in 2 ml Wasser, 10 ml Substrat-Puffermischung. 4. Hemmansatz: 2 mg Lipase in 2 ml Wasser, 10 ml Substrat-Puffermischung. 5 - 10 ml Lipidemulsion. Die Ansätze werden 30 Minuten bei 37⁰C inkubiert und nach Zugabe von Thymolphtaleinlösung die freigesetzten Fettsäuren mit 0,05 η NaOH titriert.

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Auswertung:

Lipasewirkung=Titrations-Ansatz 3 minus Titrations-Ansatz

II Hemmwirkung=Titrations-Ansatz 4 minus (Titrations-Ansatz

1 plus Ansatz 2)

Hemmwirkung ist vorhanden wenn I >II.

Durch eingesetzte Lipidmenge erzielbare Hemmung in'% =

100 - 10Q X II
' I

3.Isolierung des Hemmstoffes

Zur Ermittlung der günstigsten Trennbedingungen im Säulenverfahren wurden dünnschichtchromatographisehe Vorversuche durchgeführt. Bei einer Reihe untersuchter Lösungsmittel und Lösungsmittelgemische ergab die Mischung Petroläther/ Diäthyläther/Essigsäure 9:1:0,1 die differenzierteste Auftrennung. Lokalisierung der einzelnen Lipide nach Besprühen mit Rhodamin B im UV.

Säulenchromatographie:

Kieselgel wird mit Petroläther/Diäthyläther/Essigsäure . 9:1:0,1 äquilibriert und in Glassäulen von 5 x 30 cm eingefüllt. Es wird 50 g Lipid, gelöst in 50 ml Lösungsmittel, aufgetragen und fraktioniert eluiert. Fraktionen zu 15 ml. Zur Lokalisierung lipidhaltiger Fraktionen werden aliquote Mengen aus jeder 5. Fraktion auf DC-Platten aufgetragen. Es wird im gleichen Lösungsmittel entwickelt. Lokalisierung mit Rhodamin B. Fraktionen, in denen durch DC Lipide mit gleichem oder ähnlichem Rf-Wert gefunden werden, werden vereinigt, das Lösungsmittel verdampft und wie unter 2. auf Lipasehemmwirkung geprüft. Polare Lipide werden am Schluß durch Fraktionierung mit Methanol eluiert. Hemmwirkung war in diesen Fraktionen nicht nach-

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weisbar.

Präparative Trennung dieses Gemisches gelingt durch Rechromatographie unter gleichen Bedingungen auf Säulen von 5 x 100 cm.

Reinheitsprüfungen durch Düfinschichtchromatographie in den Lösungsmitteln Petroläther/Diäthyläther/Essigsäure 9:1:0,1; Methyläthylketon: Aceton; Aceton/Methanol 9:1. Rf-Wert in Petroläther/Diäthyläther/Essigsäure.

Charakterisierung des Lipids

Es wurde mit Ninhydrin bzw. Phosphorwolframsäure auf das Vorliegen eines Phospholipid geprüft. Reaktionen negativ. Der Hemmstoff kann aus Äther nicht mit NaHCO, oder HCl extrahiert werden. Die Hemmwirkung verschwindet nach alkalischer Verseifung. Die Identifizierung der Fettsäuren erfolgte nach Methanolyse des Lipids durch Gaschromatographie. Bestimmung der ungesättigten Fettsäure nach Hydrierung gaschromatographisch.

Das inhibitorisch aktive Lipid stellt weniger als 1% der Gesamtlipidmenge dar. Es ist chromatögraphisch in verschiedenen Systemen einheitlich. Mit der Substanz werden die gleichen Hemmkurven wie mit Rohlipid erhalten. Die Verbindung enthält weder Phosphor noch Amin, alkalische Hydrolyse führt zum Verschwinden der Hemmwirkung.

Zur weiteren Charakterisierung wurde das Produkt der Methanolyse unterworfen und die Fettsäuremethylester durch GasChromatographie identifiziert. Es wurden die Fettsäuren ^C14'O' ^C16*O ^¹^ ^C18*1 ^{in θΐνει} äquimolaren Mengen gefunden Fig.1. Chromatographie eines aliquoten hydrierten Anteils erlaubt, die Fettsäuren als Myristinsäure, Palmitinsäure und Ölsäure zu chrarkterisieren. Hydrierung des intakten Lipids führt nicht zum Verlust der Hemmwirkung.

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Claims (10)

1. Patentansprüche:

   1} Lipase-Inhibitor aus fettreichen Samen, dadurch gekennzeichnet, daß er aus Myristinsäure, Palmitinsäure und Ölsäure sowie einem Polyalkohol gebildet ist, bei der Methanolyse die Methylester von Myristinsäure, Palmitinsäure und Ölsäure und nach der Hydrierung Myristinsäure, Palmitinsäure und Stearinsäure liefert.
2. 2) Lipase-Inhibitor gemäß Anspruch 1 aus Arachis hypogea
3. 3) Lipase-Inhibitor gemäß Anspruch 1 aus Brassica Napus var. arvensis
4. 4) Lipase-Inhibitor gemäß Anspruch 1 aus Papaver somniferum
5. 5) Verfahren zur Herstellung des Inhibitors gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man fettreiche Samen mit organischen Lösungsmitteln extrahiert, den Extrakt eindampft und das so erhaltene Rohkonzentrat chromatographiert.
6. 6) Verwendung des Inhibitors gemäß Anspruch 1 in -Arzneimitteln .
7. 7) Verwendung gemäß Anspruch 6 in Arzneimitteln zur Verhütung von Fettgewebsnekrosen.
8. 8) Verwendung gemäß Anspruch 6 in Arzneimitteln zur Unterstützung der Therapie mit Kallikrein-Trypsin-Inhibitor
9. 9) Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Inhibitor gemäß Anspruch 1.

   τ λ ,/ ,oc ο 309850/1

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10. 10) Verwendung des Inhibitors gemäß Anspruch 1 zur Konservierung von fettreichen Nahrungsmitteln.

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