NO178114B - Hud-oksydasjons-forhindrende kosmetisk blanding - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse omhandler hud-oksydasjons-forhindrende, kosmetiske blandinger omfattende et kosmetisk akseptabelt bæremiddel, hvilke blandinger ytterligere omfatter de bestanddeler som er nevnt i krav l's karak-teriserende del.

Bruken av spesielle materialer for å hemme eller forhindre oksydativ nedbrytning av naturlige eller syntet-iske materialer er velkjent. Mange av de anvendte materialer for dette formål er uoppløslig i vann og toksiske for pattedyr ved både høye og lave nivå. Eksempler på slike materialer er BHA (butylert hydroksyanisol); BHT (butylert hydroksytoluen, propylgallat og alfa-tokoferol). Det er kjent at naturlige antioksydanter er bredt fordelt i plantevev. Visse av disse antioksydanter er blitt erholdt i uren form og har blitt vist seg å ha en effekt på kommer-siell soyabønne-lipoksygenase (J. Food Science, 36:571 ,1971,). Japansk patentsøknad SHO 58-42686 beskriver en alkaliorganisk løsningsmiddelekstraksjonsprosess for å erholde en antioksydant fra hvitpepperpulver. Polsk publikasjon Medycyna Weterynaryjna 28: 430-433 beskriver ekstraksjonen med kokende destillert vann av tørket høy eller Urtica. Det resulterende ekstrakt ble brukt som antioksydant for fiskemel og det er beskrevet at ekstraktet kan bli lagret for bruk i ikke mere enn 48 timer ved 4<0>C.

Søkerene har beskrevet i sin tidligere US-patentsøknad nr. 726,540 anti-oksydanter som er stabile under vanlige betingelser over lengere perioder og som erholdes ved vannekstraksjon av plantevev og slike antioksydanter absorberes perkutant og oppviser en antioksyderende effekt på de ytre og indre lag av huden. Disse effekter erholdes fordelaktig når antioksydanten påføres huden som en dispersjon i en hydrofil eller hydrofobisk base. Det kosmetiske resultat av påføringen av antioksydant omfatter en mykning av huden som kan påvises ved å berøre denne med fingertuppene. I tillegg ble det funnet at peroksydnivået i huden reduseres ved påføring av antioksydantene og at antioksy-dantene også kan anvendes for preservering av matvarer istedefor f.eks. BHT eller BHA.

Det spesielle plantevev (f.eks. bladene) nevnt i søkers ovennevnte US-patentsøknad hvorfra de vannoppløslige antioksydanter kunne ekstraheres, var Spinacia ( Spinacia oleracea; spinat), Trifolium, (kløver), Medica<g>o ( Medicaqo sativa: alfalfa), Zea ( Zea mais: korn), Nicotiana ( Nicotiana tabacum: tobakk), Pernnisetum og Allium (løk og hvitløk). I henhold til foreliggende oppfinnelse er det blitt funnet at andre spesielle arter også kan bli brukt som en kilde for antioksydantene.

Foreliggende oppfinnelse omfatter blandinger av vannopp-løslige antioksydanter avledet fra plantevev og som er i stand til å bli absorbert av pattedyrhud hvor de reduserer peroksydnivået. Antioksydantene kan også bli brukt for matvare-preservering.

Følgelig er det et hovedmål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe antioksydantmaterialer fremstilt fra foreløpig ubeskrevne kilder.

Det er enda et ytterligere viktig mål for oppfinnelsen å fremskaffe en kosmetisk blanding som kan bli brukt for påføring til huden.

Det er også et mål for oppfinnelsen å fremskaffe en blanding som kan absorberes gjennom huden for å fremskaffe en ant i oksyderende e f f ekt.

Andre mål for oppfinnelsen vil fremgå fra nedenforstående beskrivelse.

De ovennevnte mål oppnås i henhold til foreliggende oppfinnelse som fremskaffer et materiale valgt fra vannopp-løslige ekstrakter separert fra plantevev og fraksjoner som kan separeres fra nevnte ekstrakter ved kromatografi hvor nevnte vev, fortrinnsvis erholdes fra "Bergspinat" ( Atriplex hortensis). ellers kjent som "Orach", eller "New Zealand spinat" ( Tetragonia expansa). Fig. 1 er et kart som viser de synergistiske resultater av bruken av utvalgte antioksydantfraksjoner. Fig. 2 viser en grafisk sammenligning av antioksydanteffekten til blandingen ifølge oppfinnelsen med BHT. Fig.~3 viser en infrarød kurve av antioksydantfraksjon A ifølge oppfinnelsen isolert fra spinat. Fig. 4 viser en infrarød kurve av antioksydantfraksjon B ifølge oppfinnelsen isolert fra spinat. Fig.5 viser en infrarød kurve av antioksydantfraksjon C ifølge oppfinnelsen isolert fra spinat. Fig. 6 viser en infrarød kurve av antioksydantf raks jon C- ± ifølge oppfinnelsen isolert fra spinat. Fig. 7 viser en infrarød kurve av antioksydantfraksjon h± ifølge oppfinnelsen isolert fra spinat. Fig. 8 viser en infrarød kurve av antioksydantfraksjon A ifølge oppfinnelsen isolert fra kløver. Fig. 9 viser en infrarød kurve av antioksydantfraksjon B ifølge oppfinnelsen isolert fra kløver. Fig. 10 viser en infrarød kurve av antioksydantfraksjon C ifølge oppfinnelsen isolert fra kløver. Fig. 11 viser en infrarød kurve av antioksydantfraksjon A^ ifølge oppfinnelsen isolert fra kløver.

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer kosmetiske blandinger for påføring til huden. Disse blandinger omfatter et kosmetisk akseptabelt bæremiddel og en effektiv mengde av et vannoppløslig ekstrakt av plantevev så som planteblader og stengler og som er istand til å absorberes gjennom huden og senke peroksydnivået i huden.

Plantene som spesielt ble benyttet i søkers US-patentsøknad nr. 726.540 som en kilde for det vannoppløslige ekstrakt innbefattet plantevevene til utvalgte deler så som stengler og grønne blad valgt fra gruppen bestående av Spinacia, Trifolium, Medicago, Zea, Nicotiana, Pennisetum og Allium. På en annen side anvender foreliggende oppfinnelse plantevev erholdt fra planter tilhørende artene Atriplex hortensis og Tetregonia expansa. Antioksydanteffekten bestemmes ved thiobarbitursyre (TBA)-forsøket. Dette forsøk er beskrevet i Food Res. 23: 620 (1958). Generelt kan peroksydnivået i huden bestemmes ved undersøkelse av en prøve ubehandlet hud som fjernes fra et forsøksdyr. En på forhånd veid prøve fra 10 til 50 mg homogeniseres i 0,2 M fosfatbuffer pH 6,5 og sentrifugeres. Supernatanten samles opp og peroksydnivået bestemmes ved å bruke TBA-testen. En hudprøve fra samme dyr som er blitt behandlet med anti-oksydant i henhold til oppfinnelsen, fjernes også og peroksydnivået bestemmes. En reduksjon i peroksydnivået på ca. 35% når en antioksydant i henhold til oppfinnelsen tilføres med 0,5% vekt/vekt dispersjon i en petrolatiumbase, er kriteriet for å bestemme hvorvidt et gitt planteekstrakt er anvendelig som antioksydant .

Det kosmetisk akseptable bæremiddel kan være enhver væske eller semifast materialtype som er kompatibel med plante-ekstraktet og som ikke irriterer huden.

Antioksydanten kan ekstraheres fra plantematerialet ved å bruke et plante-til-vannforhold i området 0,5:100 til 1,0:0,5 (vekt/volum) fortrinnsvis 2:1 (vekt/volum) etter finfordeling av plantematerialet. Dette kan utføres ved en temperatur innen området ca. 4°C til 100°C fortrinnsvis ved ca. 25°C ved å bruke en blander, maler eller annen type apparatur som vil fragmentere celleveggene. En spesielt foretrukken ekstraksjonsprosess omfatter koking av hele planteblad i vann i 30 til 90 min eller lenger. Det ekstraherte plantemateriale separeres ved å bruke filtre-ring, sentrifugering, dekantering, skumfIotasjon eller enhver annen konvensjonell metode brukt for å separere et fast materiale fra en væske.

Den urene antioksydant kan bli brukt som erholdt fra planten enten i fortynnet form eller som en vandig blanding eller som et renset ekstrakt. Generelt er det fore-trukket å separere det vandige ekstraherende medium av den oppløste antioksydant ved inndamping eller frysetørking av væskedelen for å fremskaffe en tørr vannoppløselig antioksydant. Grovekstraktet kan renses ved å bruke kromatografiske teknikker.

Generelt oppløses pulveret i vann for å danne en 10 til 3 0% vekt/vekt oppløsning som påføres toppen av kolonnen og til-lates å bevege seg gjennom kolonnen. De forskjellige fraksjoner elueres ved å bruke vann som vaskemedium og de forskjellige fraksjoner blir samlet opp separat. De indi-viduelle fraksjoner renses ytterligere ved en andre kromatografisk prosedyre ved å bruke et pakkemedium med mindre porestørrelse enn det foregående trinn.

Sephadex G-25 kan bli brukt som et kromatografisk kolonne-separasjonsmedium for å skille grovekstraktet fra spinat i en brun fraksjon, en gul fraksjon og den orange fraksjonen. Den orange fraksjonen kan ekstraheres med vann og ytterligere separeres kromatografisk ved å bruke en Sephadex G-10 kolonne. Sephadex G-25 medium grade, er dekstran som er blitt fornettet med epiklorhydrin og har en porestørrelse på 40 til 150 nm. Sephadex G-10 er dekstran som er blitt fornettet med epiklorhydrin og har en porestørrelse på 40 til 120 pm. Tynnsjiktkromatografi anvendes for å separere en gul fraksjon fra den orange fraksjon. Sephadex materialene er beskrevet i Gel Filtration Theory and Practice, Pharmacia pp. 1-64, som er inkorporert heri per referanse.

Søkeren har isolert flere forskjellige aktive antioksydantf raks joner som kan bli brukt separat eller i kombinasjon. Flere av de kombinerte fraksjoner er blitt vist å ha høyere aktivitet enn grovfraksjonen. De relative mengder av brune, orange og gule fraksjoner kan varieres for å gi optimale resultater. Generelt kan enhver av to fraksjoner bli brukt ved vektforhold på 1:99 til 99:1 basert på den totale vekt av de kombinerte fraksjoner. Imidlertid er det også innenfor området til oppfinnelsen å kombinere flere enn to fraksjoner.

For kosmetisk bruk kan den totale mengde antioksydant som brukes variere fra ca. 0,005 til ca. 5 vektprosent, fortrinnsvis fra ca. 0,1 til ca. 1 vektprosent eiv den totale vekt av produktet.

Naturen til den kosmetiske base er ikke kritisk og enhver passende kosmetisk krem eller lotion kan brukes.

Antioksydanten kan bli brukt i leppestift, ansiktskrem, bodylotion, fuktighetskremer og lignende. Antioksydanten har en beskyttende effekt mot skade på huden som induseres av ultrafiolett lys med frekvens i området på 2 00 til 340 nm. Følgelig kan antioksydanten påføres huden for å forhindre skader forårsaket av bestrålning fra naturlige kilder så som solen eller fra kunstige kilder enten alene eller i kombinasjon med sol-skjermende midler så som PABA.

Både urensede og rensede antioksydanter i henhold til oppfinnelsen er stabile overfor høy temperatur, dvs. til temperaturer av kokende vann i 30 min. Videre har de god stabilitet over lange perioder under normale betingelser. Som eksempel hadde grovekstraktet fra spinat i pulverform blitt oppbevart i mere enn ett år i romtemperatur uten noe tap av et antioksyderende aktivitet.

Toksisitetsstudier har blitt utført ved å bruke både grove og rensede fraksjoner og ingen patologiske endringer har blitt påvist når materialene har blitt tilført ved injeksjon eller oralt.

Blad fra Spinacia oleracea ble homogenisert med H20 ved 25°C med et forhold på 2:1 (vekt/volum) i en Waring blender i 5 min. Det resulterende homogenat ble filtrert gjennom osteklede og så sentrifugert ved 15 000 x G i 10 min. Super-

natanten ble samlet opp og frysetørket.

Isoleringen og rensningen av antioksydantfraksjoner fra det grove homogenatpreparat ble foretatt ved gelfiltrering fulgt av preparativ TLC eller HPLC. 1 g av det frysetørkede pulver av det grove homogenat ble oppløst i 5 ml H20 og etter sentrifugering ved 20 000 x g i 10 min ble supernatanten tatt på en Sephadex G-25 kolonne (40 cm x 2,5 cm) ekvilibrert og eluert med vann. Fraksjoner på 5 ml ble samlet opp og hver ble undersøkt for antioksydantaktivitet. De aktive fraksjoner (A, B, C) ble slått sammen (fraksjon A har en brun, B gul og C orange farge) og frysetørket fraksjon C ble ytterligere renset. Det frysetørkede materiale fra fraksjon C ble oppløst i vann for å danne en 20% oppløsning (m/v, sentrifugert ved 20 000 x i 10 min og supernatanten ble kromatografert på en Sephadex G-10 kolonne (40 cm x 2,5 cm) og ekvilibrert med vann. Fraksjoner ble samlet opp, slått sammen og frysetørket som tidligere. Frysetørket fraksjon C (" C^") ble oppløst i en minimal mengde vann tilført 0,2 mm silikagelplater (DC-Karten SIR, Riedel-Dollaen Ag., Sleeze-Hanover) og utført i 30:60 volum/volum H20-etanol. Den aktive fraksjon ble identifisert ved sin svake (lyse) gule farge og ble ekstrahert fra silikagelplaten med vann og frysetørket.

En ytterligere opprensning ble utført ved å bruke DEAE cellulose (liten størrelse). Fraksjonen identifisert ovenfor som A ble oppløst i vann og passert gjennom en 5 cm x 1 cm kolonne og pakket med DEAE cellulose (liten størrelse).

(Alternativt kan kolonnepakkingen være Ecteola, et konden-sasjonprodukt av cellulose med epiklorhydrin og trietanolamin med en kapasitet på 0,3 til 0,4 meg./g og en partik-kelstørrelse på 0,05 til 0,2 mm). Kolonnen ble ekvilibrert med vann som var gjort sur til en pH på 5 til 6 med 0,2 N HC1. Kolonnen ble eluert med en oppløsning HC1 pH 2,0 og det eluerte materiale ble gjenvunnet som et pulver ved vakuuminndamping. Et rent produkt (Ax) ble erholdt som hadde den infrarøde kurven til fig. 7. Pulveret ble ytterligere

renset ved oppløsning i vann ved en konsentrasjon på 20 ug/ml og passert gjennom en høytrykks væskekromatografi-silika 60 kolonne (250 mm x 4 mm) med en 90:10 oppløsning av vann:acetonitril tilført i en hastighet på 0,5 ml per min. En fraksjon ble erholdt som hadde en retensjonsfraksjon med 5,4 nanometer (UV absorpsjon).

Ekseiflpel 1.

Fra grovekstraktet av plantematerialet, ble 3 antioksydant-aktive fraksjoner (A, B og C) erholdt etter første opp-rensningstrinn. Fraksjon C ble ytterligere renset på en kolonne pakket med Sephadex G-10 og to andre aktive fraksjoner ble erholdt ved eluering med vann (Ci - mørk brun og C2 - gulorange). Fraksjon ble endelig renset ved å bruke HPLC. Ved å studere antioksydantaktiviteten til de grove planteekstrakter og de isolerte fraksjoner, ble både inhi-ber ing av linoleatoksydering av lipooksygenase og inhibering av auto-oksydasjon av peroksyder brukt som kriterier for antioksydantaktivitet.

Antioksydantfraksjoner oppviste synergistisk aktivitet. Den erholdte synergisme med de naturlige isolerte antioksydanter er vist i fig. 1 som viser prosentvis inhibering av lipidok-sydasjonen av 1 mg hver av enkeltrensede antioksydanfrak-sjoner såvel som den analoge prosentvise inhibering ved å bruke kombinasjoner av 0,5 mg hver av to slike fraksjoner. Som eksempel kan det bli observert at denne synergisme øket virkningsgraden dannet av forbindelsene fra 167% (B + C2) opptil 250% (A + B) uten å øke det totale antioksydant-innhold.

Siden lipidperoksydering katalysert av hemeproteiner er en basisk nedbrytende og katalytisk reaksjon, ble effek-tiviteten av de isolerte fraksjoner for å forhindre slik peroksydering fulgt. Det ble funnet at de isolerte fraksjoner forhindrer slik peroksydering indusert av hemoglobin, cytochrome C og myoglobin, på lignende måte som inhiberingen

av lipoksygenase-indusert oksydering.

Rensede antioksydantfraksjoner beholdt sine antioksydative aktiviteter i måneder uten noe tap når de oppbevares i romtemperatur. Dessuten reduserte ikke koking av rensede anti-oksydanter i opptil 30 min deres antioksyderende kapasitet.

De følgende infrarøde data ble erholdt fra fraksjoner avledet fra spinat: A: (se fig. 3) bredt bånd ved 3400 cm-<1>, sterke bånd ved

1050 og 1650 cm"<1>, svake bånd ved 1250 og 1430 cm-<1>. B: (se fig. 4) bredt bånd ved 3400, 1640 og 1080 cm-<1>,

ytterligere bånd ved 1420, 1300 og 810 cm-<1>.

C: (se fig. 5) brede bånd ved 3400 og 1600 cm-<1>, sterkt bånd 1390 cm"<1>, ytterligere bånd ved 1070 og 890

cm-1.

C±: (se fig. 6) bredt bånd ved 3300 cm"<1>, sterkt bånd ved 1620 cm"<1>, ytterligere bånd ved 1390, 1320, 1080 og

770 cm"1.

A^ : (se fig. 7) bredt bånd ved 3300-3400 cm"<1>, sterkt bånd ved 1650 cm"<1>, ytterligere bånd ved 1730, 1540, 1250 og 1080 cm"<1>, svake bånd ved 2920, 1400 og 1150 cm"1.

Eksempel 2.

Eksempler på kremer og passende kontroller ble tilført mus-eller rottehud i en bestemt periode. Påføringen ble foretatt én gang om dagen. Eksperimentene ble avsluttet ved avliving av dyret, fjerning av huden og frysing av denne i flytende nitrogen. Prøver på frossen hud ble homogenisert i 0,2 M fosfatbuffer, pH var 6,5. Etter sentrifugering ble super-natantene samlet opp og analysert for peroksydverdien ved å bruke TBA (thiobarbitursyre)-testen som beskrevet av Sinnhuber et. al., Food Res. 23: 620 (1958).

I eksprimentene som følger ble nyfødte (hårløse) rotter brukt. Det er generelt antatt at gjennomtrengningen gjennom huden hos nyfødte rotter er bedre enn i voksne rotter siden de på dette stadium enda ikke har utviklet noen pels.

Forsøk nr. 1.

I dette eksprimentet ble kontrollgruppen behandlet med vaselin alene, mens forsøksgruppen ble behandlet med vaselin inneholdende en fraksjon. Forsøket ble foretatt i løpet av 12 dager og resultatene er gjengitt i tabell 1.

Det er klart vist at Ci trenger gjennom huden til nyfødte rotter og følgelig reduseres peroksydnivået i huden. Siden peroksyder og de frie radikaler, innvolvert i deres dannelse og nedbrytning, danner en av hovedrutene som fører til elding kan aktiviteten til denne enestående antioksydant betraktes som en antieldingsfaktor.

Forsøk nr. 2.

I dette forsøk ble antioksydanten oppløst i Oil of Ulay erholdt i Israel (utmerket oppløslighet) og lignende ekspri-menter til den beskrevet i nr. 1 ble utført. Resultatene er fremvist i tabell 2.

Som i forsøk nr. 1 reduserte antioksydanten vesentlig peroksydnivået i huden. Det er interesant å påpeke at de nyfødte rotter reduserte også Oil of Ulay uten antioksydantperoksyd-nivået. Dette kan tilskrives de kommersielle antioksydanter som er tilstede i Oil of Ulay som ble brukt. Det er mulig at i nyfødt hud kan pga dets relativt høye permiabilitet, små mengder av disse antioksydanter også trenge gjennom huden. Imidlertid reduserte Oil of Ulay i voksne mus eller rotter som vil bli vist senere, ikke peroksydnivået i huden. Tvertimot ble generelt en liten økning i peroksydnivået funnet som kanskje kan tilskrives spor av metaller i kremen.

Eksempel 3.

I disse forsøk ble voksne mus (2 mnd. gamle) behandlet som beskrevet i eksempel 2. De voksne mus ble barbert før påfør-ing av kremene på huden. I dette eksperiment ble antioksydanten oppløst i Oil of Ulay. Mus ble avlivet etter 21 dager. Resultatene er vist i tabell 3.

Det synes som om Oil of Ulay i voksne mus øker peroksydnivået noe, mens en tilsetning av antioksydant med en konsentrasjon på 0,3 % reduserer signifakant disse peroksyder og indikerer således at selv med voksne mus trenger antioksydanten gjennom huden. Det vil gjerne påpekes at i lignende forsøk når det ble undersøkt effekten av 0,1 % BHT, BHA og alfa-tocopherol oppløst i Oil of Ulay på peroksydnivået i huden, ble ingen reduksjon i peroksydnivået observert.

Eksempel 4.

En ny model for å studere aldring ble utviklet. Den nye modell innbefatter eksponeringen av en voksen barbert mus til en UV lampe (sollampe 300 W) over en kort periode. Som et resultat blir aldringsprosessene som uttrykt ved peroksydasjonsnivået stimulert og effekten til den naturlige antioksydant ble studert. Ved å bruke denne nye teknikk ble den optimale antioksydantdose for inhibering av aldring bestemt. <1> dette eksperiment ble et grovpreparat av antioksydant (og ikke den endelige rensede antioksydant) brukt.

Voksne mus ble barbert og enkeltvis eksponert til UV lys (Philips HP 3115) , med eller uten antioksydant over en kort periode på 1 min i to dager (to eksponeringer totalt). På den tredje dag ble de avlivet og peroksydasjonsnivået i huden ble bestemt ved TBA (thiobarbitursyre)-testen. Kontroller uten eksponering til UV lys ble også innbefattet. Antioksydant ble oppløst i Oil of Ulay. Resultatene er vist i tabell 4.

Den optimale dose for urenset antioksydant som skal brukes er 0,3 til 0,4 %.

Eksempel 5.

Prøver på normal hud ble erholdt fra en avdeling for plastisk kirurgi fra et sykehus. Disse prøver ble plassert i en saltoppløsning umiddelbart etter deres fjerning fra pasientene.

Hudprøvene ble eksponert til UV stråler (Philips Sun Lamps) i 5 minutters intervaller tre suksessive ganger med en 5 minutters hvileperiode mellom hver eksponering. Avstanden mellom lampen og vevet var 12 cm. Hudprøvene ble lagret i 3 dager ved 4"C hvoretter de ble fjernet og homogenisert. 20 til 30 mg av fjernet vev ble undersøkt for peroksydnivå ved å bruke den spektrofotometriske TBA test.

Resultatene viser klart at peroksydnivået (aldring) i hudvevet ble øket pga eksponeringen til UV stråler. Hud behandlet med antioksydant ifølge oppfinnelsen og eksponert til UV stråler over samme tidsperiode viste et peroksydnivå lignende den ubehandlede kontroll. Resultatene er vist i tabell 5.

Eksperimentene foretatt på human hud indikerer følgende: A) antioksydanten trenger gjennom huden; B) antioksydanten reduserer signifikant peroksydnivået. Det bemerkes at når en blanding av fraksjonene A+B+C blir brukt ble et effektivt antioksydantresultat observert.

Eksempel 6.

Grovekstraktet ble undersøkt in vivo for sin effekt på immunresponssystemet i forsøksmus. I disse forsøk ble Balb-C hannmus injisert intraperitonealt med 1 mg av grovekstraktet fra Spinacia oleracea per 0,2 ml fosfatbufferoppløsning (PBS) per dyr. Dyrene ble avlivet 1, 3 og 7 dager etter injeksjon, hvorpå milten fra disse ble fjernet. Miltceller (IO<7> celler per ml anriket RPMI) ble dyrket i 24 timer i nærvær av CON A (concavalin-A) 2 pg per ml og supernatan-tene således erholdt ble undersøkt for både IL-2 (inter-laukin-2) og CSF (koloni-stimulerende faktor). Ingen signifikante forskjeller ble funnet mellom kontrollene (dvs. dyrene som ikke mottok behandling) og forsøksdyrene i deres egenskap for å danne IL-2 såvel som CSF, noe som indikerte at antioksydanten ikke hadde noen uheldig effekt på immunsy-stemet. I tillegg ble ingen patogene funn observert i injiserte dyr.

Ytterligere forsøk bestemte at en enkel dose på 25 mg per mus i.p. kan tolereres, og at LD5q ligger i området 1400 mg/kg per mus.

Eksempel 7.

C± fraksjonen ble oppløst i PBS (50 mg per 10 ml) og 0,2 ml av denne oppløsning ble injisert i.p i hver mus to ganger om uken. C-^ fraksjonen ble også tilført oralt i en vandig opp-løsning (1 mg per ml) og musene ble tillatt og drikke opp-løsningen fra en kalibrert flaske for å tillate måling av mengden konsumert C± fraksjon av hver enkelt mus for bestemmelse. Hver mus ble derfor injisert med 0,6 mg metylcholantren, en kjent induser av fibrosarcom. Forsøksseriene A og B ble utført som følger, hvor tallene refererer til antall dyr hvor det oppsto svulster/antall dyr i gruppen: Ved uke 13 (forsøk B) etter så meget som 25-29 injeksjoner, ble en mus fra hver gruppe avlivet og undersøkt for store innvendige forandringer (dvs. lymfeknuter, milt, lever, nyre, hjerte og lunge osv): ingen signifikante forandringer og ingen patologisk skade ble observert. Dette viste at selv en forlenget behandling med C^- fraksjonen via forskjellige tilføringsruter forårsaket ingen skade på de be-handlede mus.

In vivo-eksperimentene viste at i.p eller oral tilførsel med C-l er effektiv ved å forsinke tilsynekomsten og redusere frekvensen av metylcholantren-induserte svulster.

Eksempel 8.

Hudforsøk på humane frivillige ved å bruke en 0,3 % vekt/vekt dispersjon av grovekstraktet i Oil of Ulay har resultert i forbedring i hudkvaliteten uten noen uheldige effekter i noen av forsøkspersonene.

Eksempel 9.

Dette eksempel er illustratorisk for blandinger som kan bli brukt ved utførelse av oppfinnelsen.

Eksempel 10.

Grov antioksydantent (A, B og C) ble satt til linolensyre for å danne en blanding inneholdende 20 ml av 7,5 x 10~<3> M linolensyre i 0,2M vandig natriumfosfatbuffer (pH 6,5) inneholdende 0,25 % Tween 20 (R) og 1 mg. av grovoksydanten. Kontroller ble utført som inneholdt bufferen og Tween 20, men ingen antioksydant, såvel som en prøve av linolensyre med 1 mg BHT og samme dispergerende system. Blandingen ble oppbevart ved 3 0°C og den optiske tetthet ble bestemt ved å bruke jerntiocyanatmetoden beskrevet av R.B Koch et. al. i Arch. Biochem. Biophys. 78: 165 (1959). Forsøksresultatene beskrevet i fig. 2 viser at antioksydanten ifølge oppfinnelsen er mer effektiv enn BHT i å forhindre oksydering av linolensyre.

Eksempel 11.

Isolering av antioksydantmaterialer fra kløver..

En lignende prosedyre som den beskrevet for spinat ble ut-ført for å isolere antioksydantmaterialer fra kløver- (trifolium alexandrinum) grovekstraktet ble separert på Sephadex G-25 for å gi fraksjoner A, B og C. Fraksjon A ble renset på Ecteola for å gi fraksjon A^. Fraksjon C ble adskilt på Sephadex G-10 for å gi fraksjoner og C2. Fraksjon C] ble ytterligere adskilt ved oppløsning i en minimal mengde vann før påføring til 0,2 mm silikagelplater og utvikling i 30:60 volum/volum H20-etanol for å gi fraksjoner betegnet TLC-1,

-2 og -3.

De følgende infrarøde data ble erholdt:

A: (se fig. 8) lignende den tilsvarende spinatfraksjon.

B: (se fig. 9) sterke og brede bånd ved 3300, 1560 og 1130 cm"<1>, medium bånd ved 1400 cm"<1>, svake bånd ved 1350 og 1430 cm"<1>.

C: (se fig. 10) bredt bånd ved 3430 cm"<1>, sterke bånd

ved 1600, 1380 og 1150 cm"<1>.

(se fig. 11) lignende den tilsvarende spinat-fraiksjo-

nen.

Visse av de foregående fraksjoner (0,2 mg i hvert tilfelle) avledet fra kløver ble undersøkt som antioksydant i et system som inneholdt linolensyre som substrat og enzymet lipooksygenase som katalysator. Oksygenabsorpsjon ble fulgt ved å bruke en oksygenmonitor i henhold til Grossman og Zakut i Methods of BiochemicalAnalysis (D.Glick, Ed.) 25:30*3-29 (1979) . Resultatene er vist i tabell 7.

Eksempel 12.

Isolering av antioksydantmateriale fra alger.

Et antall algeprøver ble homogenisert med destillert vann og et ekstrakt ble preparert i henhold til teknikken beskrevet ovenfor for Spinacia oleracea. Grov-homogenatet ble sentrifugert og supernatanten ble samlet opp og tørket ved fryse-tørking. De tørkede grovekstrakter ble undersøkt som anti-oksydanter i et system som inneholdt linolensyre som et substrat og enzymet lipooksygenase som katalysator. Oksygenab-sorpsjonen ble fulgt ved å bruke en oksygenmonitor i henhold til Grossman og Zakut, i Methods of Biochemical Analysis (D.Glick, Ed.) 25:303-29 (1979). Resultatene i tabell 8 ble erholdt ved å bruke 2,5 mg grovekstrakt.

Selv om oppfinnelsen er blitt beskrevet ovenfor med hensyn til sine for tiden foretrukne utførelsesformer, vil det være klart for fagmannen at mange variasjoner og modifikasjoner kan foretas. Oppfinnelsen er følgelig ikke beregnet til å være begrenset av de viste utførelsesformer, men dets omfang vil bli definert i kravene som følger.

Claims (8)

1. Hud-oksydasjons-forhindrende kosmetisk blanding omfattende et kosmetisk akseptabelt bæremiddel, karakterisert ved at det ytterligere omfatter som det aktive hud-oksydasjons-forhindrende middel, minst en av de fargede antioksydant-aktive fraksjoner som separeres kromatografisk ved opprenskning med dekstran fornettet med epiklorhydrin og med en porestør-relse fra 40 nm til 50 nm, eller med DEAE cellulose, som det kromatografiske kolonne-pakkemateriale, fra et vandig vegetabilsk ekstrakt fremskaffet ved en temperatur fra 4°C til 100 °C, fortrinnsvis ved 25°C, ved å finhak-ke, i nærvær av vann, vegetabilsk vev fra en plante valgt fra artene Atriplex hortensis og Tetraqonia expansa.

2. Kosmetisk blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte aktive hud-oksydasjons-forhindrende middel er den orange fraksjon som separeres kromatografisk fra supernatanten fremskaffet ved vandig ekstraksjon av det aktuelle plantevev ved å bruke dekstran som er blitt fornettet med epiklorhydrin og med en porestørrelse fra 50 jim til 150 nm som det kromatografiske kolonnepakkemateriale.

3. Kosmetisk blanding ifølge krav l, karakterisert ved at nevnte aktive hud-oksydasjons-forhindrende middel er en brun fraksjon som separeres kromatografisk fra supernatanten fremskaffet ved vandig ekstraksjon av det aktuelle plantevev ved å bruke dekstran som er blitt fornettet med epiklorhydrin og har en porestørrelse fra 40 nm til 120 nm som det kromatografiske kolonnepakkemateriale.

4. Kosmetisk blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at det aktive hud-oksydasjons-forhindrende middel er en gul fraksjon som separeres kromatografisk fra supernatanten fremskaffet ved vandig ekstraksjon av det aktuelle plantevev ved å bruke dekstran som er blitt fornettet med epiklorhydrin og som har en pore-størrelse fra 50 til 150 nm som det kromatografiske kolonnepakkmateriale.

5. Kosmetisk blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte aktive hud-oksydasjons-forhindrende middel er en blanding av minst to av de orange, gule og brune fraksjoner som er blitt kromatografisk separert fra supernatanten fremskaffet ved vandig ekstraksjon av det aktuelle plantevev, med dekstran fornettet med epiklorhydrin og med en porestørrelse fra 40 |im til 120 \ im som det kromatografiske kolonnepakkemateriale.

6. Kosmetisk blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at det aktive hud-oksydasjons-forhindrende middel er fremskaffet ved kromatografisk å separere fra nevnte vegetabilske vandige ekstrakt ved opprensing med dekstran som er blitt fornettet med epiklorhydrin og med en porestørrelse fra 50 til 150 nm, fraksjoner som er farget brune (A), gule (B) og orange (C), og hvorav fraksjon (A) er kromatografisk spaltet med et middel valgt fra (1) et kondensasjons-produkt av cellulose med epiklorhydrin og trietanolamin med en kapasitet på fra 0,3 milliekvivalenter per gram til 0,4 milliekvivalenter per gram og med en partikkel-størrelse fra 0,05 mm til 0,2 mm og (2) dekstran som er blitt fornettet med epiklorhydrin og har en porestør-relse fra 4 0 \ na til 120 nm for å gi en fraksjon (A,) som har et infrarødt spektrum med et bredt bånd fra 3300 cm'<1 >til 3400 cm'<1>, et sterkt bånd ved 1650 cm'<1>, ytterligere bånd ved 1730, 1540, 1250 og 1080 cm'<1>, svake bånd ved 2920, 1400, 1250 og 1080 cm"<1>, fraksjon (C) er kromatografisk spaltet på dekstran som er blitt fornettet med epiklorhydrin og med en porestørrelse fra 40 jim til 12 0 Hm til en mørkebrunt farget fraksjon (C.,) og en gulorange fraksjon (C2) .

7. Kosmetisk blanding ifølge krav 1 og 6, karakterisert ved at nevnte aktive hud-oksydasjons-forhindrende middel er valgt fra fraksjonene A, A,, C1 og C2.

8. Kosmetisk blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte aktive hud-oksydasjons-forhidrende middel er valgt fra de kromatografiske fraksjoner som har de følgende infrarøde spektral-karakteristika:

(1) et bredt bånd ved 3400 cm"<1>, sterke bånd ved 1050 og 1650 cm"<1>, svake bånd ved 1250 og 1430 cm"<1>;

(2) brede bånd ved 3400, 1640 og 1080 cm'<1>, ytterligere bånd ved 1420, 1300 og 810 cm"<1>;

(3) brede bånd ved 3300 cm'<1>, et sterkt bånd ved 1390 cm"<1>, ytterligere bånd ved 1070 og 820 cm"<1>;

(4) et bredt bånd ved 3300 cm'<1>, et sterkt bånd ved 1620 cm'<1>, ytterligere bånd ved 1390, 1320, 1080 og 770 cm'<1>, og

(5) brede bånd ved 330-3400 cm'<1>, et sterkt bånd ved 1650 cm'<1>, ytterligere bånd ved 1730, 1540, 1250 og 1080 cm'<1>, svake bånd ved 2920, 1400 og 1150 cm"<1>.