KR20150133107A - 항산화 활성을 갖는 흑산수유 추출물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 본 발명은 항산화 활성을 증가시킨 흑산수유 추출물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 특히 알코올에 의해 흑산수유의 활성성분을 추출하여 플라보노이드와 유기산 함량이 증가하고 항산화 능력이 증가된 흑산수유 추출물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
종래의 산수유는 섭취가 어려운 문제점이 있으므로 본 발명에서는 용이하게 섭취할 수 있고, 항상화 효과를 증가시킨 새로운 흑산수유 추출물과 그 제조방법을 제안한것이며, 다양한 비교실험을 통해 그 효과를 검증하였다.
본 발명은 동결건조 분말화된 흑산수유에 용매로 알코올을 사용하여 추출하여 제조되는 항산화 활성을 갖는 흑산수유 추출물은 제안하며, 그 제조방법으로 1차 동결건조공정, 분말화 가공공정, 추출공정, 여과공정, 2차 동결건조공정을 순차적으로 진행하였다.
따라서, 본 발명에 의한 흑산수유 추출물은 알코올에 의해 추출하여 동결건조시킴으로써 생리활성 물질이 증가하고 항산화 활성이 우수하게 나타난다.

Description

항산화 활성을 갖는 흑산수유 추출물 및 그 제조방법{Black cornus fruit extract for antioxidant activity and it's manufacturing process}

본 발명은 항산화 활성을 증가시킨 흑산수유 추출물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 특히 알코올에 의해 흑산수유의 활성성분을 추출하여 플라보노이드와 유기산 함량이 증가하고 항산화 능력이 증가된 흑산수유 추출물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로 Superoxide, nitric oxide, nitrogen dioxide, hydroxyl, peroxy nitrite 등과 같은 활성산소종(ROS)들은 호기호흡을 하는 모든 생명체의 정상적인 대사과정중에 끊임없이 발생된다.

이와 같은 활성산소종은 자기방어기구인 생체내 소거메카니즘에 의해 대부분제거되지만 활성산소종이 정상적으로 소거되지 않아 산화적 스트레스가 생체내에 가해지면, 이들 활성산소종은 세포 구성성분들 인지질, 단백질, 탄수화물과 DNA 산화적 손상 및 효소활성을 변화시켜 뇌졸중, 파킨슨씨병과 같은 뇌질환뿐만아니라암, 동맥경화, 후천성면역결핍증, 심장질환, 당뇨병, 신경계질환, 염증, 류마티스등의 각종 질병을 일으키는 원인이 되는 것으로 보고되고 있다.

또한 활성산소종은 생체조직을 손상시킬뿐만아니라 노화를 촉진시킨다는 보고가 있다.

최근, 활성산소종에 의한 인체내 손상을 보호하는 항산화물질에 대한 연구는 다양하게 이루어지고 있다.

합성 항산화제는 천연항산화제 보다 항산화력이 우수하지만 간비대, 간장중microsomal 효소활성증가 등 변이원성 및 독성이 지적되면서 비교적 독성이 적고 안전성 및 관능상의 문제가 되지않는 천연항산화제 개발을 위한 연구가 활발히 이루어지고있다

특히 식물에 활성산소종을 제거할수있는 항산화성분들이 다량 함유되어있는것으로 알려져 있으며, 과일, 야채, 차, 허브 등과 같은 식물로부터 얻어진 vitamin, 페놀화합물, 카로티노이드 등의 항산화물질에 대한 많은 연구가 보고되어있다.

산수유는 늦은 가을과 이른 겨울에 과피가 빨갛게 변할때 수확하여 씨를 제거하고 과육을 말린 것을 말한다. 이것은 약초로써 한국, 일본, 그리고 중국에서 널리 쓰여져왔는데, 주요 biological activities는, anti-cancer, antioxidation, antibiosis, anti-inflammatory effects, treat tuberculosis, urination, allergy, asthma, hepatitis, lumbago, 그리고 chronic nephritis가 있다.

한의학적 특성으로서의 산수유는 맛이시고 성질은 약간 따뜻하며, 신경에 좋고, 이뇨작용, 혈압강하작용, 단백질의 소화를 돕는작용, 항암 및 항균작용 등이 있는것으로 보고 되어있다.

그러나 종래의 산수유는 맛이 시고 약간 쓰고 떫기 때문에 먹기 힘들지만, 항산화연구, 항암물질분리, 항균활성분리, 영양성분분석등 다양한 기능성 관련 연구가 보고되어 있다.

또한, 이를 개선하여 제조되는 흑산수유는 30일 가량의 짧은기간 발효에 의해 만들어지고 약간 시지만, 좀 더 달고, 좀 더 덜 쓰고, 좀 더 떫기때문에 먹기 좋으나, 그 연구가 미흡하여 항산화 효과 등이 검증되지 않았다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 흑산수유 추출물의 기능성을 입증하고, 구체적으로 흑산수유 추출물의 유기산 함량 및 항산화 기능이 증대된 추출액 제조방법을 제공함에 그 목적이 있다.

본 발명에 의한 항산화 활성을 갖는 흑산수유 추출물은 동결건조 분말화된 흑산수유에 용매로 알코올을 사용하여 추출하여 제조되는 것을 그 기술적 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 의한 항산화 활성을 갖는 흑산수유 추출물의 제조방법은 1차 동결건조공정, 분말화 가공공정, 추출공정, 여과공정, 2차 동결건조공정을 순차적으로 진행하여 제조하는 것을 그 기술적 특징으로 한다.

본 발명에 의한 흑산수유 추출물은 알코올에 의해 추출하여 동결건조시킴으로써 생리활성 물질이 증가하고 항산화 활성이 우수하게 나타난다.

도 1은 본 발명에 의한 흑산수유의 추출방법을 개략적으로 나타낸 블록도,
도 2는 산수유와 흑산수유 추출물의 유기산 함량을 나타낸 비교도,
도3는 산수유와 흑산수유 추출물의 DPPH 라디칼소거능을 나타낸 도표,
도 4은 산수유와 흑산수유 추출물의 ABTS 라디칼소거능을 나타낸 도표.

본 발명의 바람직한 실시 예를 첨부된 도면을 통해 상세히 설명한다.

<실시 예1> 흑산수유 추출물의 제조

도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명에 의한 흑산수유의 추출은 아래와 같은 공정이 순차적으로 진행된다.

1) 세척된 흑산수유의 표면 수분을 제거하는 1차 동결건조공정(S1).

2) 믹서기를 이용하여 분말화시키는 가공공정(S2).

3) 분말화된 흑산수유를 20℃에서 메탄올로 45분동안 2번 초음파 추출하는 추출공정(S3).

4) 추출된 용액에서 여과지를 통해 불순물을 걸러내는 여과공정(S4).

5) 여과된 액체를 동결건조기에서 60℃에서 감압하여 수분을 증발시는 2차 동결건조공정(S5)

이와 같은 공정을 거쳐 BCF(흑산수유)의 추출수율은 49.9%였다.

이때, 상기 추출공정에서는 흑산수유 10g당 용매인 80% 메탄올 50 ∼150ml의 비율을 유지하는 것이 바람직하며, 본 발명의 <실시 예1>에서는 메탄올 100ml를 사용하였다.

결과로 얻어진 물질들은 고속 액체 크로마토그래피(HPLC; high performance liquid chromatography) 분석과 산화방지제 분석을 위해 다이메틸설폭사이드(DMSO; dimethyl sulfoxide)로 재용해 시켰다.

상기 고속 액체 크로마토그래피는 보통의 액체크로마토그래피에서 입자를 더욱 작게 하고, 가는 분리관(分離管)을 사용해서 알맞은 압력을 가하여(입자를 작게 하면 액체의 통과가 느려지므로) 용매를 흘리면, 기체크로마토그래피와 같은 속도로, 또한 뛰어난 분리기능을 얻을 수 있다.

또한, 다이메틸설폭사이드는 무색무취의 흡습성의 액체로 각종의 유기물질에 대한 뛰어난 용제이며, 동해보호제로서 배양세포 등의 동결보존에도 사용되고 있다.

<비교 실시 예1>

건조 산수유를 <실시 예1>의 방법과 동일하게 동결건조시킨다. 건조시킨 산수유의 추출수율은 40.8%였다.

<실시예 2> 유기산 분석

산수유와 흑산수유내에 들어있는 tartaric acid, malic acid, malonic acid, citric acid 와 succinic acid의 함량을 분석하였다. 동결건조된 샘플을 증류수(pH 2)로 재분산시키고 0.45 μm 막필터(Millipore Millex-HV PVDF, Millipore, USA)를 사용하여 여과시킨 후, HPLC를 이용하여 분석하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.

CCF의 경우, 유기산의 함량은 [ 말산 (3.833±0.016 mg/g) > 숙신산 (3.156±0.097 mg/g) > 말론산 (1.154±0.049 mg/g) > 구연산 ( 0.792±0.007 mg/g) > 주석산 (0.609±0.013 mg/g)] 순서 이고,

반면에 BCF의 유기산 함량은 [ 숙신산 (11.606±0.215 mg/g) > 말산 (4.123±0.023 mg/g) > 말론산 (1.487±0.102 mg/g) > 구연산 (0.898±0.009 mg/g) > 주석산 (0.595±0.057 mg/g) ]의 순서이다.

그 결과를 비교하면, 주석산을 제외하고는 산수유보다 흑산수유로 가공했을 때 유기산들이 유의적으로 증가한 것을 볼 수 있었다.

<실시 예3> 산수유 메탄올 추출물의 항산화 활성분석

본 발명의 흑산수유추출물이 항산화 활성을 가지는지 알아보기 위해 상기 <실시예 1>에서 추출한 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성, ABTS+. 라디칼 소거활성을 측정하였다.

1) DPPH 분석

DPPH 유리기제거활성은 Blois M.S.[28]의 방법을 변형하여 수행되었다. 80% methanol (2.9 ml)에서 0.15 mM DPPH용액은 다양한 농도의 CCF와 BCF의 샘플추출물(0.1 ml) 과 섞였다. 혼합물 들은 어두운 조건에서 30분 동안 상온에서 인큐베이터에 넣어 반응시킨후 517nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

DPPH 라디칼 소거측정은 시료(산수유추출물) 첨가군과 대조군의 흡광도비를 % 값으로 환산하여 나타내었다.항유리기활성은 IC50(mg/ml)으로 표현되었으며, 그 결과를 아래의 [표 1]로 정리하였다.

[표 1]

측정결과는 [도 3]에 나타내었다.

데이터에서는 BCF가 CCF보다 DPPH 라디컬 소거를 더 억제하는 것으로 나타났다. 10 mg/ml의 CCF와 BCF는 각각 66.62와 75.62%의 억제를 나타냈고, IC50값은 CCF와 BCF에서 각각 7.088와 6.237 mg/ml로 밝혀졌다

2) ABTS+. 분석

ABTS+ 라디칼 소거활성은 Re et al [29]의 방법을 사용하여 측정하였다. ABTS+는 7 mM ABTS 용액과 2.45 mM potassium persulfate(final concentration) 을섞어 12~16시간 동안 상온, 어두운 조건에서 방치시켰다.

분석 전에, 용액은 다양한 농도에서 100 μl의 추출물들과 섞었다. 상온에서 5분 후에, 혼합물들은 734nm에서 흡광도를 측정하였고 유리기제거활성은 다음의 식으로 계산 되었다.

- 다 음 -

ABTS scavenging effect (%) = [(A0-A1)/A0]× 100

A1는현재추출물의흡광도이고 A0는컨트롤의흡광도이다.

측정결과는 도 4에 나타내었다.

5 mg/ml의 CCF와 BCF는 각각 75.60와 83.21%의 억제를 나타냈고, IC50값은 CCF와 BCF에서 각각 2.868와 2.451 mg/ml를 나타냈다.

<실시 예4> HepG2 cells에서의 항산화 효소 (antioxidant enzyme) 활성

CCF와 BCF의 항산화 특성이 항산화 효소의 활성을 유도하는 것과 연관이 있는지 조사하기 위해서, HepG2 cell에 CCF와 BCF를 처리하고 항산화 효소인 SOD, CAT, GSH 그리고 MDA의 활성을 측정했다.

세포들은 컨트롤그룹, H2O2 그룹, 2mM 비타민 C 그룹, 세가지 농도의 CCF와 BCF 그룹(5, 10 and 50 μg/ml) 9개의 그룹으로 나뉘어졌다. HepG2 세포들은 FBS와 PEST를 포함한 1ml DMEM 배지에 각배지당 세포들의 3.0 × 105의밀도로 12 well-plate에 접종되었다. 그리고, 24시간 동안 인큐베이터에서 배양하고 나서 세포들은 샘플추출물들 혹은 비타민 C를포함하는 2mM H2O2와 함께 무혈청배지에서 16시간 동안 처리되었다. 샘플을 배양한지 16시간 후에 배지는 제거되었고, PBS와 60 μlLysis Buffer (1x)을 각각의 세포에 추가하여 씻어낸 뒤에 10분동안 4 ℃에서 3,000 ×g으로원심분리했다.

샘플은 TBARS 분석법으로 상층에 부유한 액을 수거하였다. 또한 상층에부유한액은 10,000 ×g으로 15분 동안 4 ℃에서 GSH 분석을 위해 원심분리한 뒤, 냉동보관했다.

1) 슈퍼옥사이드디스뮤타아제(SOD)의 활성

SOD 활성은 SOD 분석 키트 Kit(Dojindo Molecular Technologies, 도쿄, 일본)를 사용하여 xanthine 및 xanthine 산화 효소 시스템을 사용하여 측정 하였다. Xanthine은 xanthine 산화 효소에 의해 요산으로 전환된다. 슈퍼 옥사이드래디칼 검출을 위한 A tetrazolium salt (WST-1)은 xanthine 및hypoxanthine에 의해 생성되었다.

20 μl의 샘플 용액은 각각의 샘플과 blank2(sample blank) well에 첨가하고, 20 μl의 ddH2O (double distilled water)은 blank1과 blank3 각각의 well에, 그리고 200 μl의WST working 용액을 각 well에 첨가하고 섞는다.

20 μl의 희석 버퍼를 blank2와 blank3의 well에 각각 추가하고, 20 μl의 효소 working 용액을 각각의 샘플과 blank1의 well에 첨가한 뒤 격렬하게 섞어준다.

샘플은 20 분 동안 37 ℃에서 플레이트를 항온 처리 한 후 마이크로 플레이트 판독기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. SOD 활성은 다음의 식을 사용하여 계산 하였다.

- 다 음 -

SOD 활성 (억제율 %)

= [(Ablank1 - Ablank3) - (Asample - Ablank2)] / (Ablank1 - Ablank3) × 100

샘플의 SOD 활성은control의 %으로 표현했다.

2) 카탈라아제의 활성

카탈라아제 활성은 제조업체의 설명에 따라 카탈라아제 분석 키트(Abcam, 캠브리지,영국)를 사용해 측정하였다. 카탈라아제는 거의 모든 생물에 존재하는 ubiquitious의 산화를 억제하는 효소이다. 그것은 물, 산소, 과산화수소 (H2O2)의 분해를 촉진하는 작용을 한다.

이 분석에서 카탈라아제는 먼저 물과 산소를 생산하기 위해 과산화수소와 반응하고, 전환되지 않은 과산화수소는 570nm의 생성물의 생산하기 위한 OxiRed™ probe와 반응한다. 카탈라아제 활성은 다음 식을 사용하여 계산된다.

- 다 음 -

카탈라아제활성= (샘플 희석 계수×B) /(30 × V)=nmol/ 분/ ㎖=mU/mL

B는 과산화수소 STD에서 나온 분해된 과산화수소의 양(nmol)이다.

V는 reaction well에 첨가한 전처리된 샘플의 volume(ml)이다. 30은 반응시간 30분을 말한다.

샘플의 카탈라아제 활성은 control의 %로 나타낸다.

3) 글루타티온(GSH)의 양

글루타티온은 조직 및 세포에서의 산화 스트레스에 대하여 세포 방어에서 중요한 역할을 하는 주요한 세포 저 분자량 티올이다. GSH의 양은 제조업체의 설명에 따라 글루타티온 분석kit를 사용해 측정한다.

Standard와 샘플 well에 10 μl of OPA Probe (o-phthalaldehyde)을 첨가하고 잘 섞어준 뒤 40분간 상온에서 배양한다.

Ex / Em = 420/340 nm로 갖춰진 형광 플레이트 리더에 시료와 표준을 참고한다. 샘플들은 각 샘플에서 글루타티온의 양을 얻을 수있는 표준 곡선에 판독 값을 적용 하였다. GSH 레벨은 다음의 식을 사용하여 계산 하였다.

- 다 음 -

글루타티온의 양= Ga/Sv

Ga는 표준곡선에서의 글루타티온의 양이고,Sv는 샘플 well에 첨가된 샘플의 volume이다.

4) 지질 과산화

활성 산소에 의해 유도 된 지질 과산화의 마커로서, 시료 대한 TBA 산 반응성 물질 (TBARS) 레벨 Buege 및 Aust의 방법에 따라 측정 하였다. 간단하게, 200 ㎕의 차가운 얼음 10 % 트리클로로 아세트산(TCA)을 100 ㎕의 시료에 첨가하고 얼음에 15분 동안 배양 하였다. 그리고 4 ℃에서 15 분간 2,200 × g에서 원심 분리 하였다.

상층 액200㎕를 0.67%의 동일한 부피(w/v) 대한 TBA산 (TBA)과 혼합하고, 10분간 끓는 수욕에서 항온 배양하였다.

상층 액의 흡광도는 분광 광도계로 532 nm에서 측정된다. TBARS는 표준 TMP (1,1,3,3 tetramethoxy propane) 검량선 (0-100 μM)를 사용하여 측정하고, 추출물에 의한 지질 과산화의 억제 백분율로 표현 하였다. 지질 과산화의 억제 백분율은 N/C들과 시험 화합물의 결과를 비교하여 결정 하였다

아래의 [표 2]는 HepG2 cell에서의 SOD와 카탈라아제의 활성, GSH content, 그리고 malondialdehyde (MDA) 수치에 대한 CCF와 BCF의 효과를 나타낸다. 항산화 효소의 활성은 H2O2(2mM)를 처리하자급격히 하향 조절됐다.

반면에 CCF와 BCF를 처리하자 효소 활성이 dose-dependent manner로 회복되었다. SOD와 카탈라아제의 활성은 CCF와 BCF의 농도가 높을 때 가장 많이 증가했다. Positive control (VitC), 10, 50 μg/ml CCF과 50 μg/ml BCF groups의 SOD 활성은 HP groups에 비해 상당이 회복되었다.

그리고 VitC, 5 μg/ml CCF와 10, 50 μg/ml BCF groups의 경우는 카탈라아제 활성이 크게 증진되었다. 게다가, 50 μg/ml BCF은 카탈라아제 활성을 positive control의 수준으로 회복했다

[표 2]

CCF와 BCF의 농도가 증가하면 GSH content는 높아졌다. VitC, 10, 50 μg/ml CCF 그리고 50 μg/ml BCF groups의 content는 상당히 회복됐다. 50 μg/ml groups에서는 GSH contents와 CCF 샘플의 SOD 활성은 BCF 샘플 보다 훨씬 높았다.

MDA의 수준은 H2O2을 처리했을 때 상승했고, negative control과 비교했을 때, MDA의 형성은 CCF (5, 10, 50 μg/ml)와 BCF (5, 10, 50 μg/ml) groups에서 감소했으며 심지어 positive control과 비교했을 때도 감소했다.

따라서 CCF와 BCF는 항산화 효소의 활성을 자극하고 ROS 라디칼을 직접적으로 제거함으로써 항산화 특성을 나타낸다. 본 발명에 의한 다양한 실험 및 결과 분석을 통해 CCF와 BCF의 항산화 효소 활성 특성을 처음으로 밝혀냈다.

상기와 같은 본 발명은 상술한 특정의 실시 예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변경 실시가 가능할 것이다.

Claims (5)

1. 동결건조 분말화된 흑산수유에 용매로 알코올을 사용하여 추출하여 제조되는 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 흑산수유 추출물
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 알코올은 메탄올 또는 에탄올 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 흑산수유 추출물.
   
3. 제 2항에 있어서,
   상기 메탄올은 80%인 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 흑산수유 추출물
   
4. 세척된 흑산수유의 표면 수분을 제거하는 1차 동결건조공정;
   믹서기를 이용하여 분말화시키는 가공공정;
   분말화된 흑산수유를 20℃에서 메탄올로 45분동안 2번 초음파 추출하는 추출공정;
   추출된 용액에서 여과지를 통해 불순물을 걸러내는 여과공정;
   여과된 액체를 동결건조기에서 60℃에서 감압하여 수분을 증발시는 2차 동결건조공정;
   을 순차적으로 진행하는 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 흑산수유 추출물의 제조방법.
   
5. 제 1항에 있어서,
   상기 추출공정에서는 흑산수유 10g당 용매인 80% 메탄올 50 ∼150ml의 비율을 유지하는 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 흑산수유 추출물의 제조방법.

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