FI62306B - Foerfarande foer framstaellning av substituerade n-metylen-derivat av tienamycin anvaendbara saosom antibiotiska aemnen - Google Patents

Foerfarande foer framstaellning av substituerade n-metylen-derivat av tienamycin anvaendbara saosom antibiotiska aemnen Download PDF

Info

Publication number
FI62306B
FI62306B FI763308A FI763308A FI62306B FI 62306 B FI62306 B FI 62306B FI 763308 A FI763308 A FI 763308A FI 763308 A FI763308 A FI 763308A FI 62306 B FI62306 B FI 62306B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
solution
group
thienamycin
preparation
formula
Prior art date
Application number
FI763308A
Other languages
English (en)
Other versions
FI763308A (fi
FI62306C (fi
Inventor
Burton Grant Christensen
William Joseph Leanza
Kenneth James Wildonger
Original Assignee
Merck & Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck & Co Inc filed Critical Merck & Co Inc
Publication of FI763308A publication Critical patent/FI763308A/fi
Priority to FI821262A priority Critical patent/FI63030C/fi
Publication of FI62306B publication Critical patent/FI62306B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI62306C publication Critical patent/FI62306C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D477/00—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring
    • C07D477/10—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2
    • C07D477/12—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, attached in position 6
    • C07D477/16—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, attached in position 6 with hetero atoms or carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 3
    • C07D477/20—Sulfur atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D205/00—Heterocyclic compounds containing four-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D205/02—Heterocyclic compounds containing four-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D205/06—Heterocyclic compounds containing four-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member
    • C07D205/08—Heterocyclic compounds containing four-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with one oxygen atom directly attached in position 2, e.g. beta-lactams
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F7/00—Compounds containing elements of Groups 4 or 14 of the Periodic Table
    • C07F7/02—Silicon compounds
    • C07F7/08—Compounds having one or more C—Si linkages
    • C07F7/10—Compounds having one or more C—Si linkages containing nitrogen having a Si-N linkage

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Description

r~ Γιι1 .... KUULUTUSJULKAISU ✓ Ο 7 Π A
jjMA Μ (11) UTLAGGN I NGSSKRI FT O c. O \J O
c (4¾ Γη*?.-, iti T,ytty O i - 11-.2 w K,.*W " c'07 D *87/0* SUOMI —FINLAND (21) P»M«mlh*k*mu· —NMnttnu6fcnln| ?63308 (2¾ HakemlspaM—Araeknlngitfag l8.ll.T6 (2¾ AtkupUvt—GUtltkutsdaf 18.11.76 (41) Tullut luikituksi — Bllvit offuntHg 22.05.77
Patentti- )· reklrterihallltu· /44) NftKtivtkripanon ft kuuLJulk*lsun pvm.—
Patant· och registerstyrelsan Anseksn utlagd och uti.skriftsn pubiictrtd 31.08.82 (32)(33)(31) Pjrydutty stuoikuus—Bugtrd priorkut 21.11.75 i2.0U.76, 18.10.76 USA(US) 63U296,
67626I, 73365U
(71) Merck & Co., Inc., 126 E. Lincoln Avenue, Rahway, New Jersey, USA(US) (72) Burton Grant Christensen, Metuchen, New Jersey, William Joseph Leanza, Berkeley Heights, New Jersey, Kenneth James Wildonger,
Somerville, New Jersey, USA(US) (7¾) 0y Kolster Ah (5U) Menetelmä antibioottisina aineina käyttökelpoisten tienamysiinin substituoitujen N-metyleeni-johdannaisten valmistamiseksi - För-faran de för framställning av substituerade N-metylen-derivat av tienamycin användbara säsom antibiotiska ämnen Tämän keksinnön kohteena on menetelmä antibioottisina aineina käyttökelpoisten tienamysiinin substituoitujen N-metyleeni johdannaisten valmistamiseksi, joiden kaava on
OH
^X,-1-SCH0CH_N=C-R
1 I 2 2 f 1 2
I I NR R II
^-N--C00H
O
jossa R on vetyatomi, alempi alkyyliryhmä, fenyyli-, pyridyyli-, tiatsolyyli-, trifluorimetyyl^g, amino-, atsidoalkyyli- tai amino-alkyyliryhmä tai ryhmä , R1 on vetyatomi, alempi ^ULilo alkyyliryhmä, alempi alkenyyliryhmä, alempi alkyylitioalkyyli-ryhmä, bentsyyli-, dialkyyliaraino-, trifluorietyyli-, karboksi- 2 62306 2 metyyli-, alkoksi- tai nitroryhmä ja R on vetyatomi tai alempi 1 2 alkyyliryhmä, tai R ja R muodostavat yhdessä typpiatomin kanssa piperidyylirenkaan, ja näiden yhdisteiden farmakologisesti hyväksyttävien happoadditiosuolojen valmistamiseksi.
Tienamysiini on kuvattu US-patenttijulkaisussa 3 950 357. Tienamysiinillä on seuraava rakenne:
OH
—sch2ch2nh2 I
-N--COOH
O ^
Keksinnön mukaisesti valmistettuja substituoituja N-mety-leenitienamysiini-johdannaisia voidaan myös esittää sisäisenä suolana, jonka kaava on
°H Q
^ >-f N- SCH0CH_NiJ-i- C -^NR R
I o R 11'
^-N-j—-COO W
Yksinkertaisuuden.vuoksi keksinnön mukaisesti valmistettuja yhdisteitä esitetään esimerkeissä symbolilla:
—QH
Th--N=C-X II·
Y
*—COOH
jossa "Th" tarkoittaa tienamysiinin bisyklistä runkoa ja jossa yhdisteen hydroksyyli-, amino- ja karboksyyliryhmät on osoitettu.
Jatkuvasti tarvitaan uusia antibiootteja. Valitettavasti ei ole olemassa tietyn antibiootin mitään staattista tehokkuutta, koska minkä tahansa sellaisen antibiootin jatkuva suurimittainen käyttö selektiivisesti johtaa patogeenien vastustuskykyisten kantojen syntymiseen. Lisäksi tunnettujen antibioottien haittana on se, että ne ovat tehokkaita ainoastaan mikro-organismien määrättyjä lajeja vastaan. Näin ollen tutkimus uusien antibioottien löytämiseksi jatkuu.
62306
Yllättäen on todettu, että keksinnön mukaisesti valmistetut yhdisteet ovat laajan vaikutusspektrin omaavia antibiootteja, joita voidaan käyttää eläin- ja ihmisterapiassa ja ei-elollisis-sa järjestelmissä. Uudet antibiootit ovat hyvin laajaspektrisiä, ja ne tehoavat sekä gram-positiivisiin bakteereihin (kuten S. aureus, Strep, pyogenes ja B. subtilis) että gram-negatiivisiin bakteereihin (kuten E. coli, Proteus morganii, Klebsiella, Serratia ja Pseudomonas).
Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että yhdiste, jonka kaava on
X
111
#-N-—COOH
o tai sen sopivaa O- ja/tai karboksyyli-johdannaista saatetaan reagoimaan kaavan . 0
NR
'11 © IV R-C-X R" mukaisen imidoesterin kanssa, jossa kaavassa X°R" on poistuva ryhmä, jolloin X° on O tai S ja R" on alempi alkyyli tai vastaa-1 2 va, ja R, R ja R merkitsevät samaa kuin edellä, tai kaavan r1r2n ®=c-x' r\
! x·^ V
R
_ _ 2 mukaisen imidohalogenidin kanssa, jossa kaavassa R, R ja R merkitsevät samaa kuin edellä, tai kaavan 2 X°R"
1 2 I VI
R R N-ON-R
mukaisen yhdisteen kanssa, jossa kaavassa X°, R", R, R1 ja R2 merkitsevät samaa kuin edellä, jonka jälkeen saatu yhdiste muutetaan happoadditiosuoläksi.
Sopivia liuottimia ovat vesi, dioksaani, tetrahydrofuraa-ni (THF), dimetyyliformamidi (DMF), kloroformi, asetonitriili, asetoni tai niiden seokset. Reaktio suoritetaan lämpötilassa 62306 0 - 25°C reaktioajan ollessa 1-6 tuntia. Sopivia reagensseja ovat esimerkiksi seuraavat: a) Imidoesterit: R1 R1R2
N N
Il o Θ II o R-C-XR" R-C-X°R"
X° = O tai S
metyyliformimidaatti, etyyliformimidaatti, metyyliasetimidaatti, etyyliasetimidaatti, metyylibentsimidaatti, etyyli-4-pyridyyli-karboksi-imidaatti, metyylifenyyliasetimidaatti, metyyli-3-tienyylikarboksi-imidaatti, metyyliatsidoasetimidaatti, metyyli-klooriasetimidaatti, metyylisykloheksyylikarboksi-imidaatti, metyyli-2-furyylikarboksi-imidaatti, metyyli-p-nitrobentsimidaatti, metyyli-2,4-dimetoksibentsimidaatti, etyyli-N-metyyliformimidaatti, metyyli-N-metyyli-formimidaatti, metyyli-N-isopropyyli-imidaatti ja senkaltaiset.
Imidoesterit valmistetaan sinänsä tunnetulla tavalla, kuten: 1) Nitriilin RCN-reaktio alemman alkanolin kanssa HCl:n läsnäollessa (Pinner-synteesi).
2) Nitriilin RCN-reaktio alemman alkanolin kanssa emäksen läsnäollessa. Tyypillisesti reaktio suoritetaan 0 - 40°C:ssa alkoholin ylimäärän läsnäollessa käyttäen mukana katalyyttinen määrä alkalimetallialkoksidia 15 min - 4 tuntia.
3) Amidin RCONHR^ reaktio alkyyliklooriformiaatin, kuten metyyliklooriformiaatin kanssa 25 - 45°C:ssa 1-4 tunnin aikana.
4) N-substituoidun amidin RCONHR^ tai RCONR1R2 reaktio ekvivalentin kanssa alkyloimisainetta, kuten trietyylioksonium-fluoriboraattia, inertissä liuottimessa, kuten eetterissä tai kloroformissa, 0 - 23°C:ssa 10 min - 2 tuntia.
5) Helposti saatavissa olevan imidoesterin RC(0R")NH muutta- minen halutuksi imidoesteriksi RC(OR")NR antamalla imidoesterin reagoida alkyyliamiinin R'NH2 kanssa veden ja veteen sekoittumat-toman liuottimen, kuten eetterin tai kloroformin, seoksessa 0 -23°C:ssa 5 min - 1 tunti.
5 62306 b) Substituoidut ixnidohalogenidit:
Klooripiperidino-metyliumkloridi, kloori-dimetyyli-forminiumkloridi, klooridietyyli-forminiumkloridi ja senkaltainen.
Substituoidut imidohalogenidit (b) valmistetaan sopivasti sinänsä tunnetulla tavalla, kuten: 1 2 1} Ν,Ν-disubstituoidun amidin RCONR R reaktio halogenoi-misaineen, kuten tionyylikloridin, fosgeenin, fosforipentaklori-din tai senkaltaisen kanssa inertissä liuottimessa, kuten kloroformissa tai metyleenikloridissa, 0 - 40°C:ssa 1 - 5 tuntia.
Reagenssit (a) käsittävä reaktio voidaan esittää seuraa-valla kaaviolla: OR3 -SCH2CH2NH2 - N -- COX ' R3 ’ 0 Λ R·
N
it R-C-OR"
3 V ORJ
- sch2CH2N=C-NHR’
I | t R
0 s-n--COX 1R3 ’ jossa OR" on imidoesteri-reagenssin poistuva ryhmä ja R, R', 3 ’ 3 R , R ja X' merkitsevät samaa kuin edellä. Tämä reaktio on 3 31 erikoisen sopiva suoritusmuotoja varten, joissa R ja R ovat vety ja X1 on happi.
6 62306
Reagenssit (b) käsittävä reaktio voidaan esittää seuraa-valla kaaviolla: |r"1r2n+=cx’ χ·Θ _ or + *7 „ -f^Y-SCH2CH2N-C-NR1R2 χ,0 • —--* / I o p
^ J_N-*—COX 1 RJ
_ o
OH
lievä hvdrolvvsl^ Λ-ο- - SCH2CH2N=C-NR1R2
pH 3 - 6 II
L- n--COOH
O
2 Λ-* jossa kaikki symbolit merkitsevät samaa kuin edellä. Haluttaessa 3 3' tuote 2 on R ja R sopivasti trimetyylisilyyli ja X' on happi.
Keksinnön mukaisesti valmistetut yhdisteet (II) muodostavat suuren valikoiman farmakologisesti hyväksyttäviä suoloja, kuten happoadditiosuoloja, esim. kloorivetyhapon, bromivetyhapon, rikkihapon, typpihapon, tolueeni-p-sulfonihapon ja metyylisulfoni-hapon kanssa. Nämä suolat ovat farmakologisesti hyväksyttäviä ei-myrkyllisiä johdannaisia, joita voidaan käyttää aktiivisena aineosana sopivissa yksikköannosmuodoissa. Myöskin ne voidaan yhdistää muiden lääkkeiden kanssa koostumuksien valmistamiseksi, joilla on laajaspektrinen aktiviteetti.
Farmakologisten kokeiden tulokset Määritettiin uusien tienamysiinien ja vertailuyhdisteiden pienin vaikuttava pitoisuus käyttäen tavanomaisia gram-positiivi-sia ja gram-negatiivisia bakteereja. Tulokset on esitetty seu-raavissa taulukoissa.
7 62306 o
m ID
ro id ro r» vo o) 3 ro - - - - - 3 oo cq o r- rs ro o G O S O G E -h O σηη Ό 3 ro en in
3 ^ oo vo ro r-' in (N
(DOICN - - - - *· 0) 3 CQ o «- (N ro o
Λ S
ID
tJi r- σ> r— CN ID
1-1 ID ro CN 00 τ- 0) Q) CM - - - - -
•P 3 PQ O O O O O
υ υ s
3 3 • Λ O
10 O Ή t" Γ" oo Γ" 3 Ή CU VD r- T“ (N (N r- 0) gj +J CM *. » «· *· -
•H \ G CQ O O O O O
> tr W S
•h a
*H
+j ^ M, "3· ra ai d oo oo cm en 3 en <n T- <n ro o G 3 CM '
Q)U) -H Ö O O O O O
G ·Ή Ή S
H O O
m -P υ
H a) -H · CM
(D Oi H oo I- oo enro O -P rf ro 'i1 ID T—
A! 0* 3 CN
Ai 3 > m O O O O O
G -Q 3 S
i—! ·Η -P
3 -P -P
3 CG
EH 3 Ai ·*·
•H t— *—»—»— t— (N
G 3 ro o o o o o 0) > 0) eN ·> » * *· «
•H 3 CQ O O O O O
CG 0) 2
•H *H P
H G G
0) 0) 3 in
>i-H ® ro V N Tf M
g 0< · en o o o o o 3 W CM « » ·« - - G m o o o o o
Q> S
H
-P
0)
G -P
0) 0) CM ro
H -H PS K SS a S3 K
0) Ό u G Ä D >i —-
H
3 M
> r— ro
33PS S S S X S •P > U
-P 3 P 3 M A!
-P — ro CM
G SS K J * eh « sc u I J a z 8 62306 tn 3 3 w ή •Η -Η ·<Τ O O r* in o 'a* ^ -P u » » * - - i •h o o TT o o » Λ M v 2 3~
3 ^ rH
® m ε ·* -p \ > s -u σ> ·* = 3 3.
05 M — -P K Ή ^ Z 3 00
3 CM > CO
K 3 »- o in c U Cd) m in o oo r- Φ (N -H p « - - | * 2 S C 3 o o nr oo
\H U 3 3 TT
U tn 33 -H
Φ I (Ί dl w o M ** 8 5 a x _V-z
* -P
3 C
Ή 3 k | g ^7-1 3 ‘2 \ 3
C rO
‘d M
•'j 3 05 tn to cp -h tn tn tn co tn B M-ι Ö Ö 3 β 3 tn 3 10 W O·
β O M -H p -H -H
2 ϊ*5 -P O -P O O
*H
-p c 0) •n 3 -P n n n n ro ro +{ s 33 33 K 33 ® 33 ω α>=υυυυυυ
S -P 05 I I I I I I
s tn oooooo
3 -H UUUUUU
E-· Ό Λ >1 3 33 35 p ro ro pe aarcKooas
•H 05 O O O W W
y o o
P
3
EH
9 62306
Uudet yhdisteet ovat siis vähintään yhtä aktiiviset kuin tunnetut tienamysiinit.
Kuten tunnettua, tienamysiinillä on erinomainen anti-bakteerinen vaikutus. Valitettavasti sen kemiallinen pysyvyys on kuitenkin huono, ja lisäksi se on kääntäen verrannollinen väke-vyyteen (Kropp, H. et ai, "Thienamycin, A new ,/3-laktam Antibiotic.
II. In vitro- and in vivo Evaluation" , 16th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Chicago, 111., 1976). Tienamysiinin amidiinijohdannaisilla on 5 - 10 kertaa parempi pysyvyys kuin tienamysiinillä, ja yhtä hyvä y3-laktamaasi-pysyvyys.
Uudet yhdisteet ovat siten arvokkaita antibiootteja erilaisia gram-positiivisia ja gram-negatiivisia bakteereja vastaan ja siten niitä voidaan käyttää ihmis- ja eläinlääkkeinä. Keksinnön mukaisesti valmistettuja yhdisteitä voidaan käyttää bakteerinvastaisina lääkkeinä infektioiden hoitamiseksi, joita aiheuttavat gram-positiiviset tai gram-negatiiviset bakteerit, esim. bakteereja Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Serratia, Salmonella typhosa, Pseudomonas ja Bacterium proteus vastaan. Niitä voidaan myös käyttää vesipitoisina koostumuksina väkevyyksissä 0,1 - 100 osaa antibioottia miljoonaa osaa kohti liuosta tarkoituksella estää haitallisten bakteerien kasvu lääkärin ja hammaslääkärin laitteissa samoin kuin bakterisideina teollisuuskäytössä, esim. vesipohjaisissa maaleissa ja paperitehtaiden kiertovedessä haitallisten bakteerien kasvun estämiseksi.
Keksinnön mukaisesti valmistettuja yhdisteitä voidaan käyttää yksinään tai yhdistelmissä aktiivisena aineosana erilaisissa farmaseuttisissa valmisteissa. Näitä antibiootteja ja niiden vastaavia suoloja voidaan käyttää kapseleina tai tabletteina, jauheina tai nesteliuoksina tai suspensioina tai eliksiireinä. Niitä voidaan annostella suun kautta, laskimonsisäisesti tai lihaksensisäisesti .
Annosteltava määrä riippuu suuresti käsiteltävän kohteen tilasta ja potilaan painosta, annostavasta ja -tiheydestä, jolloin parenteraalinen annostus on edullinen tavanomaisia infektioita varten ja suun kautta tapahtuva annostus suolistoinfektioita 10 62306 varten. Yleensä päivittäinen suun kautta annettava annos käsittää noin 2 - 600 mg aktiivista aineosaa/kg kehon painoa annettavaksi yhtenä tai useampana annoksena päivässä. Edullinen päivittäinen annos täysikasvuista ihmistä varten on noin 15 - 150 mg aktiivista aineosaa/kg kehon painoa.
Keksinnön mukaisesti valmistettuja yhdisteitä voidaan annostella useina yksikköannosmuotoina esim. kiinteänä tai nestemäisenä suun kautta annettavana annosmuotona. Yksikköannostuksena käytetyt koostumukset joko nestemäisenä tai kiinteänä voivat sisältää 0,1 - 99 % aktiivista ainetta, edullisesti noin 10 - 60 %. Koostumus sisältää tavallisesti noin 15 - 1500 mg aktiivista aineosaa; kuitenkin yleensä on edullista käyttää annosmäärää noin 100 - 1000 mg. Parenteraalista annostelua varten yksikköannostus käsittää tavallisesti puhtaan yhdisteen lievästi happameksi tehdyssä steriilissä vesiliuoksessa tai liukenevan jauheen, joka on tarkoitettu liuotettavaksi ennen käyttöä.
Seuraavassa on kuvattu tienamysiinin valmistuksen koko- naissynteesi.
OH
^ -sch2ch2nh2
-N-- COOH
Vaihe A; 4-(2- asetoksivinyyli)atsetidiini-2-onin valmistus fi~C=CH-CH=CHOC-CH, + 0=C=N-S0_C1 -> l li 3 2
O
° ? CH=CHOCCH3 CHeCH0CCH„ r< —. r-r O S02cl 11 62306
Liuos, jossa on 1,0 ml tislattua kloorisulfonyyli-iso-syanaattia (1,65 g; 11,7 mmol) 2,5 ml:ssa vedetöntä dietyyli-etteriä, jäähdytetään typpisuojakaasussa -20°C:sessa hauteessa.
Liuos, jossa on 2,5 g 1-asetoksibutadieneeniä (22 mmol) 2,5 ml:ssa vedetöntä eetteriä, jäähdytetään samoin typpisuoja-kaasussa -20°C:sessa hauteessa.
Kloorisulfonyyli-isosyanaatti-liuos lisätään pisaroittain 10 min aikana asetoksibutadieeni-liuokseen teflon-putken avulla, joka on upotettu CSI-liuokseen ja saatettu paineenalaiseksi ty-pellä. Reaktioseosta sekoitetaan -20°C:ssa puoli tuntia. Liuos on kirkas ja väriltään vaaleankeltainen.
Liuos, jossa on 2 g natriumsulfidia ja 5 g I^HPO^ 20 ml:ssa vettä, valmistetaan edellä mainitun puolen tunnin reaktioajan aikana ja jäähdytetään jäähauteella; lisätään 20 ml eetteriä ja seosta sekoitetaan voimakkaasti jäähauteella. Puolen tunnin kuluttua reaktioseos siirretään käyttäen typpi-painetta ja teflon-putkea reaktiopullosta, joka pidetään -20°C:sessa hauteessa, voimakkaasti sekoitettuun hydrolyysiseokseen. Nopea pisaroittain tapahtuva lisäys kestää 5 minuuttia. Hydrolyysin annetaan jatkua vielä 5 minuuttia. Hydrolyysiseoksen pH-arvo on 6 - 8, edullisesti 8.
Faasit erotetaan, jolloin jäljelle jää keltaisenoranssia kumimaista ainetta vesipitoisen faasin kanssa. Eetterifaasi kui- ) vataan suoraan magnesiumsulfäatilla. Vesifaasi ja kumifaasi uutetaan kolmasti 50 ml:n erillä eetteriä, jolloin kukin niistä lisätään alkuperäiseen eetteri/magnesiumsulfaattiin.
Kuivatut tuotteet suodatetaan ja väkevöidään typpisuojakaasussa tilavuuteen 5 ml; osa tuotteesta on kiteistä tässä vaiheessa.
Kolonni, jossa on 10 g Baker'in silikageeliä, täytetään eetterillä, ja eetteriväkevöite johdetaan kolonnin yläosaan ja annetaan virrata kolonnin läpi. Pullon kiinteät aineet huuhdotaan kolmesti 2 ml:11a eetteriä, huuhteluneste pipetoidaan pois ja johdetaan kolonniin. Sen jälkeen eluoidaan eetterillä. Ensimmäiset 25 ml on pääasiassa eetteriä, seuraavat viisi 10 ml:n fraktiota kerätään talteen ja sen jälkeen kerätään talteen kolme 50 ml:n fraktiota. Kaikki fraktiot haihdutetaan typpivirrassa; 12 62306 tuote kiteytyy fraktioista 4 - 6, ja jälkiä löytyy fraktioista 3 ja 7. Fraktiot 1-3 sisältävät kellertävää kiteytyvää ainetta, joka hartsiutuu seistessä. Saanto: 10 mg cis- ja trans-iso-meerien seosta.
Vaihe B: 4-(2-asetoksietyyli)-2-atsetidinonin valmistus
O O
Il H
^0CCH3 ^OCCH3 I ->
NH NH
~ S
O o
Liuos, jossa on 4-(2-asetoksivinyyli)-2-atsetidinonia (10,0 g, 0,065 moolia) 200 ml:ssa etyyliasetaattia, joka sisältää 100 mg 10-% Pd/C, hydrataan Parr-ravistimessa 25°C:ssa pai- 2 neessa 2,8 kg/cm 15 minuuttia. Seos suodatetaan "Supercel"-kerrok- sen lävitse ja pestään vielä etyyliasetaatilla. Yhdistetty suo- dos haihdutetaan tyhjössä, jolloin saadaan 4-(2-asetoksietyyli)- 2-atsetidinonia (10,0 g) kiteisenä aineena. Uudelleenkiteytettä-
essä eetteristä saadaan valkoisia kiteitä, sp. 44 - 47°C; IR
(CHC13) 5,66, 5,74 pm; NMR (CDC13) γ3,44 (leveä s, 1, NH), 5,82 (m, 2, CH2OCOCH3), 6,29 (m, 1, C-4H), 6,87 (1/2 AB mallin jakaa neljään osaan C-4H ja NH, 1, J = 12,8Hz, J=4,5 H J =
gem NH
1,9Hz , 7,38 (1/2 AB mallin jakaa neljään osaan C-4H ja NH, 1,
Jgem= 12'8Hz' J = 2'3 Ez' JNH=1»0Hz), 7,93 ja 8,02 (s, m, kaikkiaan 5, OCOCHj ja C^C^OCOC^, vastaavasti).
Vaihe C: 4- (2-hydroksietyyli)-2-atsetldinonin valmistus
O
II
^ OCCH3 OH
.__NH * _NH
13 62306
Liuos, jossa on 4-(2-asetoksietyyli)-2-atsetidinonia (2,24 g, 0,014 moolia) 25 ml:ssa vedetöntä metanolia käsitellään typpisuojakaasussa 0°C:ssa natriummetoksidin (77 mg, 1,4 mmol) liuoksella 5 ml:ssa vedetöntä metanolia. Yhden tunnin sekoittamisen jälkeen neutraloidaan liuos jääetikalla. Etanoli poistetaan tyhjössä, jolloin saadaan raaka 4-(2-hydroksietyyli)-2-atsetidi-oni öljynä. Tuote puhdistetaan kromatografisesti käyttäen sili-kageeliä ja eluoiden 10-% MeOH/CHCl:11a, jolloin saadaan 1,55 g alkoholia? sp. 50°C; IR (CHC13) 5,67 uni; NMR (CDC13) Of 3,20 (leveä s, 1, NH), 6,24 ja 6,28 (m, t, kaikkiaan 3, C-4H ja CI^OH vastaavasti), 6,90 (leveä s, 1/2 AB mallissa, jonka jakaa neljään osaan C-4H ja NH, kaikkiaan 2, OH ja C-3H vastaavasti, Jgem= 13,OHz, J . = 4,2Hz, J..IT = 1,6Hz), 7,42 (1/2 AB mallin jakaa neljään
vie NH J J
osaan C-4H ja NH, 1, C-3H, Jgem = 13,0Hz, Jvic= 2,2Hz, JNH = 1,1Hz), 8,16 (m, 2, CH2CH2OH).
Vaihe D: 0-okso-2,2-dimetyyli-3-oksa-1 -atsabisyklo^, 2, Oj oktaanin valmistus -rX__ γ-τί
NH N O
o^- 0^ X
Liuosta, jossa on 4-(2-hydroksietyyli)-2-atsetidinonia (1,87 g, 0,16 moolia) ja 2,2-dimetoksipropaania (1,69 g, 0,016 moolia) 25 ml:ssa vedetöntä metyleenikloridia, käsitellään boori-trifluoridieteraatilla (0,201 ml, 0,002 moolia) 25°C:ssa. Saatua liuosta sekoitetaan 10 minuuttia, ja liuotin poistetaan alennetussa paineessa, jolloin saadaan 2,5 g öljyä. Raakatuote kromato-grafoidaan käyttäen silikageeliä ja eluaattina etyyliasetaatti/ bentseeniä 2:1, jolloin saadaan 0-okso-2,2-dimetyyli-3-oksa-1-atsabisyklo/4,2,0/oktaani (1,59 g) kiteisenä aineena. Kiteytettäessä uudelleen eetteri/heksaanista on tuotteen sulamispiste 60 -61°C. IR (CHC13) : 5,73 pm ( /!»-laktaami) NMR (CDCl^^Z : 6,02 - 6,28, m, 2H, C-4 metyleeni 6,22 - 6,62, m, 1H, C-6 metiini 6,90, ddm 1H, J_ _ = 14Hz, J, - = 4,5Hz 7, / 6,7 14 62306 C-7 protoni cis C-6H:n suhteen 7,47, dd, 1H, J_ _= 14Hz,.J£ _ = 2Hz /// O / / C-7 protoni trans C-6H:n suhteen 7,82 - 8,68, m, 2H, C-5 metyleeni 8,23, s, 3ΗΛ c_2 metyylit 8,57, s, 3HJ Vaihe E; 8-okso-2,2-dimetyyli-7 Ct- ja /S-(1 -hydroksietyyli)-3-oksa-1 -atsabisyklo/~4,2, Q7oktaanin valmistus
OH
_N 0 7 N 0
Liuokseen, jossa on 1,1 ekvivalenttia juuri valmistettua litiumdiisopropyyliamidia vedettömässä tetrahydrofuraanissa typ-pisuojakaasussa -78°C:ssa lisätään 0-okso-2,2-dimetyyli-3-oksa- 1-atsabisyklo/4, 2,0_/oktaanin liuos vedettömässä tetrahydrofuraanissa, joka on jäähdytetty -78°C:een. 2 minuutin kuluttua saatua litiumenolaattia käsitellään ylimäärällä asetaldehydiä. Liuosta sekoitetaan 30 minuuttia -78°C:ssa, jonka jälkeen se kaadetaan veteen. Vesipitoinen faasi kyllästetään natriumkloridilla ja uutetaan etyyliasetaatilla ja suodatetaan; suodos haihdutetaan alennetussa paineessa raakatuotteen saamiseksi. Puhdistettaessa kromato-grafisesti käyttäen silikageeliä ja eluanttina etyyliasetaatti/ bentseeniä saadaan 8-okso-2,2-dimetyyli-7 OC- ja /3 -(1-hydroksietyyli) -3-oksa-1 -atsabisyklo/T), 2,0^7oktaani.
8-okso-2,2-dimetyyli-7(1-hydroksietyyli)-3-oksa-1-atsabisyklo^4,2, Oj oktaani: IR (CH2C12): 5,52 pm (/i-laktaami) NMR (CDC13> 'ZT : 5,53 - 6,43, m, 4H, C-4 metyleeni + C-6 metiini + C-9 metiini 6,90, dd leveällä s:llä, 2H, J? g = 9Hz 15 62306
J, n = 5,5Hz, C-7 metiini + OH
Of/
7,70 - 8,83, m, 2H, C-5 metyleeni 8,27, s, 3Hj c_2 metyyli 8,60, s, 3HJ
8,78, d, 3H, Jg = 6,5Hz, C-10 metyyli 8-okso-2,2-dimetyyli-7 Oi-(1-hydroksietyyli)-3-oksa-1-atsabisyklo/4,2,07oktaani:
IR (CHCl^) : 2,9 μια leveä O-H
5,73 /&-laktaami
NMR (asetoni - dg) 'Z : 4,23 - 3,33, m, C-9 metiini + C-4 metyleeni + C-6 metiini 3,33, leveä s, OH
2,83, dd, J = 2Hz, 6Hz ) „ n . .. .
C C-7 metiini 2,67, dd, J = 2Hz, 8Hz j 1,93 - 1,63, m, C-5 metyleeni 1,63, c_2 metyy^it
1,40, sS
1,23, d, J = 6,5Hz, C-10 metyyli
Vaihe F: 8-okso-2,2-dimetyyli-7Cy-(1-p-nitrobentsyyllkarbonyylidi-oksietyyli)-3-oksa-1-atsabisyklo/4,2,Q7oktaanin valmistus
OH OR
_N 0 ' J_N O
<T X o X
R =-C0CHo—X N00 II 2 X,— X 2 0
Liuos, jossa on 8-okso-2,2-dimetyyli-7 Oi-(1-hydroksietyy-li) -3-oksa-1-atsabisyklo/4,2,0_7oktaania (60 mg, 302 mmol) 0,5 ml:ssa eetteriä käsitellään vedettömissä olosuhteissa 0°C:ssa jauhetulla kaliumhydroksidilla (19 mg, 0,332 mmol). 15 minuutin kuluttua lisätään reaktioseokseen 1-nitrobentsyyliklooriformiaattia (65 mg, 0,302 mmol). Sekoittamista jatketaan 25°C:ssa vielä 15 tuntia.
Seosta uutetaan 1-m fosfaattipuskurilla (pH 7) ja eetterillä.
16 62306
Eetterifaasi pestään vedellä ja suolaliuoksella, kuivataan magnesiumsulfaatilla ja suodatetaan. Haihdutettaessa suodos alennetussa paineessa saadaan 67 mg väritöntä öljyä. Puhdistetaan pre-paratiivisella ohutkerros-kromatografiällä käyttäen silikagee-liä ja kehittäen etyyliasetaatti/bentseenillä (1:9) saadaan 8-okso2,2-dimetyyli-7 Oi-(1-p-nitrobentsyylikarbonyylioksietyyli)- 3-oksa-1-atsabisyklo/4,2,07oktaania (40 mg) diastereomeerien seoksena.
IR (CH2C12): 5,68 pm ( /Ä-laktaami ja karbonaatti), 6,19 ja 6,54 pm (nitro)
N MR (CDCl^^: 1,67, d, 2H, ArH
2,37, d, 2H, ArH
4,67, s, 2H, ArCH2
4,67 - 5,22, m, CH-jCH
5,98 - 6,25, m, 2H, C-4 metyleeni 6,25 - 6,62, m, 1H, C-6 metiini 6.75 - 7,12, m, 1H, C-7 metiini 7.75 - 8,83, m, 2H, C-5 metyleeni 8,22, s, 3H, C-2 metyyli 8,50 - 8,58, m, 5H, C-2 metyyli + CH3CH 7/^-diastereoisomeerit tai 7Oi- ja /3-seokset saadaan analogisella tavalla.
Vaihe G:
Cis- ja trans-3-(1-p-nltrobentsyylikarbonyylidioksietyyli)- 4-(2-hydroksietyyll)-2-atsetidinonin valmistus
,0R OR
J ^ I OH
_N O __NH
S X <f~
O
R = -C-Q-CH2 N^v>—N02 17 6 2 3 0 6 8-okso-2,2-dimetyyli-7 OC — (1-p-nitrobentsyylikarbonyyli-dioksietyyli)-2-oksa-1-atsabisyklo/4,2,0_7oktaani (1/0 g) liuotetaan 8 ml:aan etikkahappoa ja 2 mlraan vettä ja kuumennetaan 65°C:ssa 1,25 tuntia. Etikkahappo ja vesi poistetaan alennetussa paineessa ja jäännös liuotetaan bentseeniin ja haihdutetaan, jolloin saadaan trans-3-(1-p-nitrobentsyylikarbonyylidioksietyyli)- 4-(2-hydroksietyyli)-2-atsetidinoni diastereoisomeerien seoksena.
IR (CH2Cl2) : 5,67 pm (fo-laktaami), 5,72 olka, 6,20 ja 6,57 pm (nitro)
NMR (CDCl^^T : 1,73, d, 2 H, J = 8,5Hz, ArH 2,43, d, 2H, J = 8,5 Hz, ArH
3,63, leveä s, 1 H, NH 4,37 - 5,13, m, 1H, CH3CH 4,72, s, 2H, Ar CH2 6,07 - 6,53, m, 1H, C-4 metiini
6,23, t, 2H, J = 5,5Hz, CH2OH
6,73 - 6,93, m, 1H, C-3 metiini 7,63 - 8,97, m, 3H, CH2CH2OH 8,53, d, J = 6,5Hz, CH3CH
Cis-diastereoisomeerit tai cis-trans-seos saadaan analogisella tavalla.
Vaiheet D', E1, F' ja G' vaihtoehtoisina vaiheille D, E, F ja G 3-(1-p-nitrobentsyylikarbonyylidioksietyyli)-4-(2-hydroksietyyli) atsetidinonin valmistamiseksi
OR
_NH
(j> R = -COCH2 —^>— N02 18 62306
Vaiheet D1, E1» F1 ja G1 1-(2-tetrahydropyranyyli)-4-/2-(2-tetrahydropyranyyli)-oksietyyli»7-2-atsetidinonin valmistus 0^ j-\ 0\
Liuosta, jossa on 4-(2-hydroksietyyli)-2-atsetidinonia (62 mg, 0,538 mmol) 0,5 ml:ssa vedetöntä p-dioksaania käsitellään typpisuojakaasussa 25°C:ssa 2,3-dihydropyraanilla (0,98 ml, 1,08 mmol) ja p-tolueenisulfonihappo-monohydraatilla (19 mg, 0,10 mmol). Saatua liuosta sekoitetaan 60 minuuttia, jonka jälkeen uutetaan seoksella, jossa on 10 ml 0,5-m fosfaattipuskuria (pH 7) ja 10 ml etyyliasetaattia. Vesifaasi uutetaan toisen kerran etyyliasetaatilla. Yhdistetyt etyyliasetaattiuutteet pestään suolaliuoksella, kuivataan magnesiumsulfaatilla ja suodatetaan. Suodos haihdutetaan alennetussa paineessa, jolloin saadaan 216 mg raakatuotetta. Puhdistettaessa preparatiivisella ohutkerros-kromatografialla ja kehittäen etyyliasetaatilla saadaan 80 mg 1 - (2-tetrahydropyranyyli) -4-/2- (2-tetrahydropyranyyli) oksietyyli_7- 2-atsetidinonia öljynä.
NMR (CDC13)*Ζι 5,13 - 5,60, m, OCH
5,83 - 85, m, C-4 H + 0CH2 6,95, dd, J = 5Hz ja 15Hz Ϊ c_3 metyleeni
7,35, dd, J = 3Hz ja 15Hz J
7,62 - 8,95, m, CHCH2CH2CH2CH2 + CHCHjC^O
19 62306
Cis- ja trans-1-(2-tetrahydropyranyyli)-3-(1-hydroksietyyli)- 4-/2-(2-tetrahydropyranyyli)oksietyyli7-2-atsetidinonin valmistus °H .xv.
I-X-
° YD
Samalla menetelmällä, joka on kuvattu 8-okso-2,2-dimetyyli-TQ·- ja /h-(1 -hydroksietyyli)-3-oksa-1 -atsabisyklo/3, 2,0/oktaanin valmistamiseksi 8-okso-2,2-dimetyyli-3-oksa-1-atsabisyklo/3,2,ÖJ-oktaanista ja käyttämällä 1-(2-tetrahydropyranyyli)-4-/2-tetra-hydropyranyylioksietyyli7-2-atsetidinonia saadaan sekä cis- että trans-1-(2.tetrahydropyranyyli)-3-(1-hydroksietyyli)-4-/2-(2-tetra-hydropyranyyli)-oksietyyli7~2-atsetidinonin diastereomeerinen seos.
Cis- ja trans-1-(2-tetrahydropyranyyli)-3-(1-p-nitrobents-yylikarbonyylidioksietyyli)-4-/2-(2-tetrahydropyranyyli)-oksietyy-li_7~2-atsetidinonin valmistus
0H OR
° Y°x ~~^ y °Ί o R =-coch2——no2 20 62 3 0 6
Samalla menetelmällä, joka on kuvattu 8-okso-2,2-dimetyyli-.
7 Oi-(1-p-nitrobentsyylikarbonyylidioksietyyli)-3-oksa-1-atsabi-syklo/4,2,0/oktaanin valmistamiseksi 8-okso-2,2-dimetyyli-7 Q''-(1-hydroksietyyli)-3-oksa-1-atsabisyklo/4,2,07öktaanista ja käyttämällä trans-1-(2-tetrahydropyranyyli)-3-(1-hydroksietyyli) -4-/2- (2-tetrahydropyranyyli) oksietyyli_7-2-atsetidinonia saadaan trans-1-(2-tetrahydropyranyyli)-3-(1-p-nitrobentsyylikarbonyyli-dioksietyyli)-4-/2“(2-tetrahydropyranyyli)-oksietyyli/-2-atsetidi-noni. Cis-diastereoisomeerit saadaan analogisella tavalla.
Cis- ja trans-3-(1-p-nitrobentsyylikarbonyylidioksietyyli)- 4-(2-hydroksietyyli)-2-atsetidinonin valmistus
OR OR
Λ—xL_
J Y°. * oJ-NH
o R =-COCH2-------- - N02
Trans-1-(2-tetrahydropyranyyli)-3-(1-p-nitrobentsyylikarbo-nyylidioksietyyli)-4-/2-(2-tetrahydropyranyyli)oksietyyli7-2-atsetidinonin liuosta metanolissa 25°C:ssa käsitellään 0,1-m ekvivalentilla p-tolueenisulfonihappo-monohydraattia. Liuosta sekoitetaan 2 tuntia, jonka jälkeen neutraloidaan 1-m fosfaatti-puskurilla (pH 7). Tuote uutetaan etyyliasetaatilla, etyyliase-taattiliuos pestään suolaliuoksella, kuivataan magnesiumsulfaatilla ja suodatetaan. Suodos haihdutetaan alennetussa paineessa, jolloin saadaan trans-3-(1-p-nitrobentsyylikarbonyylidioksietyyli)-4-(2-hydroksietyyli)-2- atsetidinoni. Cis-diastereoisomeerit saadaan analogisella tavalla.
21 62306
Vaihe H:
Cis- ja trans-3-(1-p-nitrobentsyylikarbonyylidioksietyyli)- 4-/2,2-bis-(2-hydroksietyyli/-2-atsetidinonin valmistus OR r OR - A—A,_^
I CHC
X-NH \ NH
O 0^ -
OR L J
Λ-γγ^· _
_NH S
O* ^OH
8 A
r =-coch2 y— no2
Seosta, jossa on vedetöntä pyridiiniä (0,146 ml, 1,81 mmol) ja vedetöntä jauhettua kromitrioksidia (92 mg, 0,916 mmol) 8 mlrssa vedetöntä asetonitriiliä sekoitetaan 30 minuuttia typpisuojakaasus-sa 25°C:ssa. Saatuun tummanruskeaan liuokseen lisätään 250 mg kuivaa Superceliä sekä trans-3-(1-p-nitrobentsyylikarbonyylidioksi-etyyli)-4-(2-hydroksietyyli)-2-atsetidinonin liuos (186 mg, 550 mmol) 1 ml:ssa vedetöntä asetonitriiliä. 1 tunnin sekoittamisen jälkeen suodatetaan reaktioseos sullotun kerroksen lävitse, jossa on 2 g silikageeliä ja 2 g magnesiumsulfaattia. Kerros pestään useita kertoja kaikkiaan 30 ml:11a asetonitriiliä. Suodos väkevöi-dään alennetussa paineessa 25°C:ssa tilavuuteen 3 ml. Ohutkerros-kromatografiällä (silikageeli; etyyliasetaatti/bentseeni 2:1) · tämä liuos sisältää tuotteen (R^ = 0,38), joka on vähemmän polaarista kuin lähtöaine (R^ - 0,21).
Edellä valmistetun trans-3-(1-p-nitrobentsyylikarbonyyli-dioksietyyli)-4-(2-oksoetyyli)-2-atsetidinonin asetonitriili-liuosta käsitellään 2-merkaptoetanolilla (0,386 ml, 5,5 mmol) typpisuojakaasussa 0°C:ssa ja heti senjälkeen booritrifluoridi-eteraatilla (o,176 ml, 1,43 mmol). 5 minuutin sekoittamisen jäi- 22 6 2 3 0 6 keen liuosta uutetaan dikaliumvetyfosfaattiliuoksen (1,5 g suolaa 4 ml:ssa vettä) ja etyyliasetaatin (12 ml) seoksessa. Vesifaasi uutetaan toisen kerran etyyliasetaatilla. Yhdistetyt etyyliasetaattiuutteet pestään suolaliuoksella, kuivataan magnesiumsulfaatilla ja haihdutetaan. Suodos haihdutetaan alennetussa paineessa, jolloin saadaan 229 mg öljyä. Tuote puhdistetaan pre-paraattisella paksukerros-kromatografiällä käyttäen silikageeliä ja kehittäen etyyliasetaatilla, jolloin saadaan 118 mg trans-3-(1-p-nitrobentsyylikarbonyylidioksietyyli)-4-/2,2-bis(2-hydroksi-etyyli)-tioetyyli/-2-atsetidinonia värittömänä öljynä.
IR (CH2C12) : 5,75 pm (5,79 pm olka) ,/S-laktaami ja karbo naatti; 6,20 ja 6,55 pm (nitro)
NMR (asetoni-dg) T: 1,70, d, J = 8,5Hz, 2H, ArH
2,28, d, J = 8,5Hz, 2H, ArH 2,48 - 2,88, m, 1H, NH
4,63, s, ArCH2 3H
4.63 - 5,12, m, CH3CH
5,80, t, J = 7Hz, CH CH^" *\
1 ^ S I 13H
5,80 - 7,45, m, C-4H + C-3H +SCH2CH20hJ
7.63 - 8,33, m, 2H, CH2CH 8,53, d, J = 6,5Hz 3H, CH3CH
Cis-diastereoisomeeri saadaan analogisella tavalla.
Vaihtoehtoisesti seka-diastereoisomeerit saadaan kun lähtöaine käsittää diastereomeerien seoksen.
23 62 30 6
Vaihe I: trans-3-(1-p-nitrobentsyylikarbonyylidioksietyyli)-4-
Fl,2-bis(2-atsldoetyyli)tioetyylj7-2-atsetidinonin valmistus
<y00PNB 0H
j + 2CH3S02C1 2Et3N NaN3
NH THF DMSO
O
fOORNB /\^N3
NH
Q>
Liuokseen, jossa on 211 mg (molekyylipaino = 474; 0,445 mmol) trans--3- (1 -p-nitrobentsyylikarbonyylidioJcsietyyli) -4-/2,2-bis-(2-hydroksietyyli)tioetyyli7-2-atsetidinonia 5 mlsssa tetra-hydrofuraania (tislattu litiumaluminiumhydridistä) 0°C:ssa, lisätään 103 mg mesyylikloridia (molekyylipaino = 114; 0,904 mmol) 1 ml:ssa tetrahydrofuraania ja sen jälkeen heti 134 μΐ trietyyli-amiinia (molekyylipaino = 101; =0,729; 0.967 mmol). Reaktioseosta sekoitetaan 1 tunti typpisuojakaasussa. Trietyyliamiinihydroklori-di suodatetaan typpisuojakaasussa ja pestään muutamalla millilit-ralla tetrahydrofuraania. Kirkas väritön suodos väkevöidään typpi-virrassa ja sen jälkeen pumpataan suurtyhjössä 10 minuuttia. Di-mesylaatti liuotetaan heti 5 ml s aan dimetyylisulfoksidia (tislattu Catista paineessa 8 mm ja varastoitu 4A Linde-molekyyliseulan läsnäollessa),jossa on 347 mg NaN3 ( molekyylipaino = 65; 5,34 mmol). Sekoitetaan yli yön typpisuojakaasussa ja lisätään 10 ml vettä ja 20 ml etyyliasetaattia. Kerrokset erotetaan ja vesifaasi pestään kolmasti 10 ml:11a etyyliasetaattia, jolloin jokainen orgaaninen kerros pestään vielä 10 ml:11a vettä ja 10 ml:11a suolaliuosta. Yhdistetyt etyyliasetaattiuutteet kuivataan vedettömällä magnesiumsulfaatilla, suodatetaan ja väkevöidään typpivirrassa raa'an diatsidin saamiseksi. Preparatiivinen ohutkerros-kromato-grafia käyttäen silikageeliä antaa trans-3-(1-p-nitrobentsyyli- 24 62 30 6 karbonyylidioksietyyli)4-/2,2-bis-(2-atsidoetyyli)tioetyyli7~ 2-atsetidinonin.
Cis-diastereomeerit tai cis-transseos saadaan analogisella tavalla.
Vaihe J: co2h co2pnb C (OH) 2 + 2N02 CHN2 E^Et2° E(0H>2 C02H co2pnb +
OCOOPNB OCOOPNB
< SCH2CHoN-s C
A -aa* A.y\/SCiW3 A-N-H '®CH2CH2E3 .A, ^«=2°*2»3 0 2 o 'γ' (C02PNB)2 1 A» PNB =-CH2-<^ — N02 p-nitrofenyylidiatsometaanin (29 mmol) juuri valmistettu liuos (H. Davies ja M. Schwarz, J. O. C. 1242 (1965))150 ml:ssa eetteriä lisätään sekoittaen liuokseen, jossa on 1,0 g oksomalo-nihappo-monohydraattia (molekyylipaino = 136; 735 ramol) 50 mlrssa etyyliasetaattia 0°C:ssa. 2,5 tunnin kuluttua keltainen liuos vä-kevöidään pyörivässä haihduttimessa samalla lievästi kuumentaen noin puoleen tilavuuteen, kuivataan vedettömällä natriumsulfaatil-la, suodatetaan ja väkevöidään kuten edellä öljyksi.Raakaan p-nitro-bentsyyliesteriin 50 mltssa tolueenia lisätään 3,54 g trans-3-(1-p-nitrobentsyylikarbonyylidioksietyyli) -4-/5,, 2-bis (2-atsidoetyyli) -tioetyyli7~2-atsetidinonia (molekyylipaino = 524; 6,75 mmol). Reak-tioseosta kuumennetaan samalla sekoittaen öljyhauteella ja annetaan noin 1/3 tolueenista kiehua pois. Lisätään uuudelleen tolueenia ( kuivattu 3A 1/16" Linde-molekyyliseulan avulla) tilavuuden 25 62306 saamiseksi 50 mltksi ja atseokuivausprosessi toistetaan vielä 3 kertaa. Sen jälkeen liuosta kuumennetaan palautusjäähdyttäen typpisuojakaasussa 1 tunti, atseokuivausprosessi toistetaan vielä kerran ja palautusjäähdytystä jatketaan tunti. Väkevöitäes-sä saatu liuos typpivirrassa saadaan raaka yhdiste 1. Raakatuo-te kromatografoidaan käyttäen silikageelia yhdisteen 1 saamiseksi. Cis- diastereoisomeerit tai cis-trans-seos saadaan analogisella tavalla.
Valhe K:
OCOOPNB
\ SCH.CH.N, A—« I \ sch2ch2n3" J-Ν·\>°Η + SOCl„ -—->
>r 2 THF
(C02PNB)
J" OCOOPNB
I Γ \ SCH2CH2N3 + 0jP ag. DMF _ q/ Γ (co2pnb)2 «a
OCOOPNB
/Αη—sch2ch2n3 I ^ sch2ch2n3 <co2pnb)2 2 26 62306
Liuokseen, jossa on 2,80 g yhdistettä 1 (molekyylipaino = 912; 3,07 mmol) 35 ml:ssa tetrahydrofuraania (tislattu litiumalu-miniumhydridistä) -20°C:ssa, lisätään 0,3 ml pyridiiniä (molekyylipaino * 79; 9= 0,983; 3,73 mmol) (tislattu NaH:sta ja varastoitu 4A Linde-molekyyliseulan avulla). Samalla sekoittaen typpi-suojakaasussa lisätään pisaroittain 0,438 g tionyylikloridia (molekyylipaino = 119; 3,68 mmol) 1 mlrssa tetrahydrofuraania. Reaktioliuosta sekoitetaan typpisuojakaasussa 5 minuuttia - 20°C:ssa, sen jälkeen puoli tuntia 0°C;ssa ja lopuksi 1 tunti 25°C;ssa. Pyri-diinihydrokloridi suodatetaan typpisuojakaasussa ja pestään kahdesti bentseenillä (kuivattu 3A 1/16" Linde-molekyyliseulan avulla). Yhdistetty suodos ja pesuneste väkevöidään typpivirrassa, Imetetään pieneen tilavuuteen bentseeniä, kuivataan vedettömällä magnesiumsulfaatilla, suodatetaan typpisuojakaasussa ja sen jälkeen väkevöidään typpivirrassa. Säilytettäessä suurtyhjössä puoli tuntia saadaan öljyä. Saatuun klooriyhdisteeseen lisätään samalla sekoittaen 0,885 g trifenyylifosfiinia (molekyylipaino = 262; 3,38 mmol) 66 ml; ssa dimetyyliformamidi/vesi 9:1 ja 550 mg I^HPO^ (molekyyli-paino = 174; 3,16 mmol). Reaktioseosta sekoitetaan 25°C:ssa 35 minuuttia. Laimennetaan etyyliasetaatilla, erotetaan kerrokset suolaliuoksella ja vesipitoinen kerros uutetaan kolmasti etyyliasetaatilla. Yhdistetyt etyyliasetaattikerrokset pestään suolaliuoksella, kuivataan vedettömällä magnesiumsulfaatilla, suodatetaan ja väkevöidään typpivirrassa raa'an yhdisteen 2 saamiseksi. Aine kromato-grafoidaan käyttäen silikageeliä yhdisteen 2 saamiseksi.
Cis-diastereoisomeerit tai cis-trans-seos saadaan analogisella tavalla.
OCOOPNB
Vaihe L: 27 6230 6 SCH2CH2N3 j rV^eCH2CH2N3 + Br2 -Et20/C5H12 - - 'γ' ? (C02PNB)2 2
/V
F- - 1 OCOOPNB Br “ Br
I SCH.CH.N, L JJ
'"N-/ 2 2 3 (1)
JNXsCH2CH2N3 (2) NaH, DMF
V
(C02pnb)2
OCOOPNB
^ scH3 +
/-N. JA
(C02PNB)2 3 /N/ 28 62306 7,8 ml:aan pentaania (kuivattu 4A Linde-molekyyliseulan avulla) lisätään 0,2 ml Br2 (molekyylipaino = 160; 9= 3,12; 3,9 mmol). Liuokseen, jossa on 950 mg yhdistettä 2 (molekyylipaino = 896; 1,06 mmol) 15 mlrssa E^Orta (kuivattu 3A 1/16" Linde-molekyyliseulan avulla) 0°C:ssa typpisuojakaasussa, lisätään samalla sekoittaen pisaroittain 2,3 ml edellä mainittua 0,49-m Br2~liuosta (1,13 mmol). Sen jälkeen kun on sekoitettu 10 min 0°C:ssa lisätään 114 pl syklohekseeniä (molekyylipaino = 82; Q= 0,81; 1,13 mmol). 5 min kuluttua 0°C:ssa lisätään sekoitettuun reaktioseokseen 53 mg 57-% NaH:ta (57 % määrästä 53 mg = 30,2 mg, molekyylipaino =24; 1,26 mmol) mineraaliöljyssä. Sen jälkeen lisätään välittömästi 14 ml jääkylmää dimetyyliformamidia (tislattu vedettömän CaSO^tn läsnäollessa 40 mm ja varastoitu 4A Linde-molekyyliseulan läsnäollessa). Sekoittamista 0°C:ssa typpisuojakaasussa jatketaan 3 tuntia. Reaktioseos kaadetaan sekoitettuun jääkylmään seokseen, jossa on 2,5 ml 1-m KH2PO^ ja 40 ml vettä ja 75 ml etyyliasetaattia. Kerroksien erottamisen jälkeen vesifaasi kyllästetään NaCl:llä ja uutetaan uudelleen etyyliasetaatilla. Yhdistetyt orgaaniset faasit pestään kerran suolaliuoksella, kuivataan vedettömällä magnesiumsulfaatilla, suodatetaan ja väke-vöidään typpivirrassa ja pidetään senjälkeen suurtyhjössä, jolloin saadaan raaka yhdiste 3. Preparatiivinen ohutkerros-kromatografia käyttäen silikageeliä antaa yhdisteen 3.
Cis-diastereoisomeerit tai cis-trans-seos saadaan analogisella tavalla.
Vaihe M; 29 6 2 3 0 6
OCOOPNB
A ^ ^ch2ch2h3 Γ Et20/C5H12 __N + Br2--> ° > ('C02PNB)2 3 —
OCOOPNB
J Γ /*
e CHCH CT
SCH-CH N
I 2 2-5 DMF
+ NaH —-> (CO^PNB)2 OCOOPNB Br ΛτΛ 1 V^wSCH2CH2N3
/“V
(C02pnb)2 4 rv* 30 62306 9,16 ml:aan pentaania (kuivattu 4A Linde-molekyyliseulan avulla) lisätään 0,2 ml Br2 (molekyylipaino = 160; 3,9 mmol).
474 mg saan yhdistettä 3 ( molekyylipaino = 793; 0,598 mmol) 13 ml:ssa eetteriä (kuivattu 3A 1/16" Linde-molekyyliseulan avulla) 0°C:ssa typpisuojakaasussa lisätään samalla sekoittaen pisaroittaan 1,52 ml edellä saatua 0,42 M Br2~liuosta (0,63 mmol).
15 minuutin kuluttua 0°C:ssa lisätään 33 mg 57-% NaH:ta (57 % määrästä 33 mg = 18,8 mg; molekyylipaino = 24; 0,78 mmol) ja sen jälkeen välittömästi 6,3 ml jääkylmää dimetyyliformamidia (tislattu vedettömästä CaSO:stä paineessa 40 mm ja varastoitu 4A Linde-molekyyliseulan läsnäollessa). Reaktioseosta sekoitetaan 1,5 tuntia 0°C:ssa, sen jälkeen kaadetaan jääkylmään seokseen, jossa on 1,6 ml 1-m KI^PO^, 20 ml vettä ja 20 ml etyyliasetaattia. Kerroksien erottamisen jälkeen vesifaasi kyllästetään natriumkloridilla ja uutetaan uudelleen etyyliasetaatilla. Yhdistetyt orgaaniset uutteet pestään kerran suolaliuoksella, kuivataan vedettömällä magnesiumsulfaatilla, suodatetaan ja väke-vöidään typpivirrassa ja pidetään senjälkeen suurtyhjössä, jolloin saadaan raakayhdiste 4. Preparatiivinen ohutkerroskromatografia käyttäen silikageeliä antaa yhdisteen 4.
Cis-ja diastereoisomeerit ja cis-trans-seos saadaan analogisella tavalla.
Vaihe N; OCOOPNB ar ,__ 31 62 3 Q 6
O
I CH N + \ ^
I | / ^^"2^2 w3 N
Λ- V
(C02PNB)2 4 rv^
OCOOPNB
^"rTV
DMSO / SCH2CH2N3 * (C02PNB)2 A» 210 mgsaan yhdistettä 4 (moläcyylipaino = 871; 0,241 mmol) liuotettuna 0,5 ml:aan diraetyylisulfoksidia (tislattu CaH^sta paineessa 8 mm ja varastoitu 4A Linde-molekyyliseulan läsnäollessa) lisätään 25°C:ssa samalla sekoittaen 40 mg 1,5-diatsobisyklo-/5,4»07undek-5-eeniä (tislattu lämpötilassa 80°C/2 mm) (molekyyli-paino 152; 0,263 mmol) 0,7 ml:ssa dimetyylisulfoksidia. Liuosta sekoitetaan typpisuojakaasussa 4 tuntia, jonka jälkeen lisätään sekoitettuun jääkylmään seokseen, jossa on 0,48 ml 1-m KH2P0^, 7 ml vettä ja 10 ml etyyliasetaattia. Kerroksien erottamisen jälkeeen vesipitoinen kerros kyllästetään NaClrllä ja uutetaan uudelleen etyyliasetaatilla. Yhdistetyt orgaaniset kerrokset pestään kerran suolaliuoksella, kuivataan vedettömällä magnesium-sulfaatilla, suodatetaan, väkevöidään typpivirrassa, ja pidetään sitten suurtyhjössä, jolloin saadaan raakayhdiste 5. Preparatiivi-nen ohutkerros-kromatografia käyttäen silikageeliä antaa yhdisteen 5.
Cis-diastereoisomeerit tai cis-trans-seos saadaan analogisella tavalla.
OCOOPNB
Vaihe O: 62306 1 / SCH CH N + Lii —äjcollidiini ^
λ.......NV
0 I
(co2pnb)2 5
'V
OCOOPNB
Arrv | V— sch2ch2n3
s- :X
H C02PNB
6
Λ-J
Liuos, jossa on 187 mg yhdistettä 5 (molekyylipaino = 791; 0,236 mmol) 2,5 mlrssa s-kollidiinia (tislattu jauhemaisesta KOH:sta paineessa 30 mm), lisätään 45 mg:aan vedetöntä LiJ (kuivattu muutama tunti 100°C:ssa P2Oj.:llä tyhjössä) (molekyylipaino = 134; 0,336 mmol). Samalla sekoittaen typpisuojakaasussa kuumennetaan reaktioseosta öljyhauteella 120°C:ssa. 25 minuutin kuluttua reaktio-seos jäähdytetään 25°C:een, laimennetaan CH2Cl2:lla ja siirretään pyöröpohjäiseen pulloon väkevöimistä varten typpivirrassa ja sen jälkeen tyhjössä, Jäännös uutetaan seoksella, jossa on 10 ml etyyliasetaattia, 1,8 ml 1-m KH2PO^ ja 10 ml vettä, ja sen jälkeen vesi-faasi uutetaan kahdesti etyyliasetaatilla. Yhdistetyt orgaaniset faasit uutetaan suolaliuoksella, kuivataan vedettömällä magnesium-sulfaatilla, suodatetaan ja väkevöidään typpivirrassa raa'an yhdisteen 6 saamiseksi. Preparatiivinen ohutkerros-kromatografia käyttäen sili-kageeliä antaa yhdisteen 6.
Cis-diastereoisomeerit tai cis-trans-seos saadaan analogisella tavalla.
Vaihe P; 33 6 2 3 0 6
O
il
OCOPNB
+ ( j \-N -LcOjPNB \ f^Sl rv
O
II
OCOPNB
DMSO -T^>- SCH2CH2N3 -
J_N - C02PNB
Q
7 'Λ.'
Yhdisteen 6 ( 34 mg;· molekyylipaino = 612; 0,055 mmol) seka-diastereoisomeerien liuokseen 0,2 ml:ssa dimetyylisulfoksidia (tislattu CaH2:sta paineessa 8 mm ja varastoitu 4A Linde-molekyyliseulan läsnäollessa) lisätään samalla sekoittaen 9,5 μΐ 1,5-diatsobisyklo/S,4,Q7undek“5-eeniä (tislattu lämpötilassa 80°C/2 torr) (molekyylipaino = 152; 0,0625 mmol). Liuosta sekoitetaan typpisuojakaasussa 15 minuuttia ja laimennetaan 1 ml:n kokonaistilavuuteen CHCl^illa, jonka jälkeen se siirretään välittömästi 2 - 1000 μπι silikageelilevylle. Tuotenauha antaa tulokseksi yhdisteen 7 cis- ja trans-diastereomeerien seoksena.
OCOOPNB 0H
Vaihe Q: 34 62306 ^ N--r^VSCH.CH.N- , -f^V-SCH CH0NH.
! 1 2 2 3 H /2,8 kg/cm2 I 222
A-N ---CO_PNB ---> A--N-l-CO-H
O 1 o 7 8 Λ, O' 61 mg yhdistettä 7 ( molekyylipaino = 612; 0,1 mmol) 6 ml:ssa dioksaania, 6 mlrssa tetrahydrofuraania ja 3 mlrssa vettä hydrataan 2 kun läsnä on 61 mg Pt02 paineessa 2,8 kg/cm vetyä 4 tuntia. Sitten reaktioseos suodatetaan "Celite":n lävitse ja pestään 2 mlrlla 0,1-n fosfaattipuskuria (pH 7). Väkevöidään tyhjössä samennuspistee-seen saakka ja vesipitoinen seos uutetaan etyyliasetaatilla. Vesi-kerros väkevöidään pieneen tilavuuteen ja johdetaan kolonniin, jossa on 100 g XAD-2 hartsia. Eluoidaan vedellä, alkufraktiot hylätään, ja otetaan talteen tuotetta sisältävät fraktiot, jotka lyofilisoi-daan yhdisteen 8 saamiseksi cis- ja trans-diastereoisomeeriseoksena.
Seuraava menetelmä tienamysiinin entsymaattista N-deasyloin-tia varten soveltuu käytettäväksi tienamysiinin kaikkia isomeerejä, erikoisesti erillisiä N-asetyyli-isomeereja 890A, ja 890A^ varten, jotka kuvataan myöhemmin.
N-asetyyli-tienamysiinin deasetyloiminen
Valmistetaan hedelmällisen ruohoturpeen 1-% (paino/tilavuus) suspensio suspendoimalla 1 g ruohoturvetta 100 ml:aan steriiliä fosfaattipuskuri-suolaliuosta, jossa fosfaattipuskurisuolaliuok-sella on seuraava koostumus:
NaCl 8,8 g 1-m fosfaattipuskuri, pH 7,5* 10 ml tislattu vesi 1000 mk *1-m fosfaattipuskuri (pH 7,5) valmistetaan sekoittamalla 16 ml 1-m KH-PO. 84 ml:n kanssa 1-m K^HPO.. Liuoksen pH säädetään arvoon 2 4 2 4 7,5 lisäämällä pieniä määriä joko 1-m I^HPC^ taikka 1-m KH2P04· Tästä 1 —% ruohoturvesuspensiosta valmistetaan 10 x, 100 x, ja 1000 x - laimennuksia.
35 62306 1 ml suspensiota tai 1 ml 10 x, 100 x ja 1000 x laimennuksia lisätään 2 ml:aan steriiliä 1-% agar-liuosta 48°C:ssa. Seokset kaadetaan nopeasti 85 mm:n steriilien petrimaljojen pinnalle, jotka sisältävät väliainetta A 20 ml. Väliaineella A on seuraa-va koostumus: KH2P04 3,0 g K2HP04 7,0 g
MgSC>4 0,1 g tislattu vesi 1000 ml N-asetyylietanoli-amiiniliuos* 8,5 ml * N-asetyylietanoliamiiniliuos valmistetaan laimentamalla N-asetyyli-etanoliamiini vedellä 10-kertaisesti ja kalvo-steriloimalla, jonka jälkeen käsitellään autoklaavilla. pH säädetään arvoon 6 NaOHtlla. Kiinteitä väliaineita varten lisätään 20 g agaria.
Petrimaljoja viljellään 18 päivää 28°C:ssa. Hyvin eristetty kolonnin otetaan talteen ja sivellään petrimaljaan, joka sisältää väliainetta B. Väliaineella B on seuraava koostumus;
Tomaattitahna 40 g
Kaurajauho 15 g
Tislattu vesi 1000 ml pH säädetään arvoon 6 käyttäen NaOH:ta.
Kiinteitä väliaineita varten lisätään 20 g agaria.
Valitaan erillinen kolonni ja viljellään 2 päivää 28°C:ssa vinoviljelynä väliaineessa B. Osa tästä kasvusta sivellään kuuden vinoviljelyn pinnalle, jotka vinoviljelyt on valmistettu väliaineesta B. Näitä vinoviljelyjä viljellään 2 päivää 28°C:ssa; tuloksena on Protaminobacter ruber-viljelmä (deponoitu Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture-laitokseeh merkinnällä NRRL B-8143).
Osa Protaminobacter ruber MB-3528-vinoviljelyn kasvusta käytetään ymppäämään 250 ml:n Erlenmeyer-pullo, joka sisältää 50 ml väliainetta C. Väliaineella C on seuraava koostumus:
Dekstroosi 20 g
Farmamedia 8 g
Maissinliotusneste (laskettu märkänä) 5 g
Tislattu vesi 1000 ml 36 6 2 3 0 6 pH säädetään arvoon 7 käyttäen NaOH:ta tai HCl:ää N-asetyylietanoliamiini-liuos 8/5 ml 8,5 ml N-asetyylietanoljämiini-liuos N-asetyylietanoliamiini laimennetaan vedellä 10-kertaises-ti ja kalvosteriloidaan. Tämä liuos lisätään käsittelyn jälkeen autoklaavilla .
Pulloa ravistellaan 28°C:ssa(220 kierrosta minuutissa, heilahdus 5 cm) 4 päivää. 25 ml:n erä pullosta sentrifugoidaan 15 minuuttia 8000 kierrosta minuutissa. Pinnalla oleva neste poistetaan ja väliaineen pinnalla olevat solut kaavitaan pois 0,5 ml:aan 0,05-m kaliumfosfaattipuskuria, pH 7,4. Saatu suspensio saatetaan ultraääni-hajotukseen (Branson Instrument Model LS-75 Sonifier) sondin ollessa 12,5 mm asetuksella 4, käyttäen 4:n ja 15 sekunnin välejä, jolloin suspensio jäähdytetään jäävedellä hajoamisten välillä. 10 μΐ määrä sonikaatista sekoitetaan 25 μ1:η kanssa liuosta, joka sisältää 840 pg/ml N-asetyylitienamysiiniä 10-mM kaliumfosfaattipuskurissa, pH 7, ja viljellään yli yön 28°C:ssa. Suoritetaan myös kontrollikokeita, jotka sisältävät ainoastaan antibioottia ja puskuria; sekä kontrollikokeita, jotka sisältävät ääni-käsiteltyjä soluja ja puskuria ilman antibioottia. Kun on viljelty yli yön 28°C:ssa 2 μΐ määriä levitetään selluloosalla päällystetyille TLC-levyille, jotka kehitetään etanolin ja veden seoksella (70:30). TLC-levy kuivataan ilmassa, jonka jälkeen pannaan STaphylococcuc aureus ATCC 6538P analyysilevylle 5 minuutin ajaksi.
Analyysilevyt valmistetaan seuraavasti: analyysiorganismin Staphylococcus aureus ATCC 6538P yli yön suoritettu kasvu ravinto-liemessä, joka sisältää 0,2 % hiivauutetta, laimennetaan ravinto-liemellä, joka sisältää 0,2 % hiivauutetta, suspensioksi, jonka läpäisykyky on 60 % aaltopituudella 660 nm. Tämä suspensio lisätään Difco-ravintoagariin, jota on täydennetty 2,0 g:11a litraa kohti Difco-hiivauutetta, 37 - 48°C:ssa koostumuksen saamiseksi, joka sisältää 33,2 ml suspensiota litraa kohti agaria. 40 ml tätä suspensiota kaadetaan 22,5 cm x 22,5 cm petrilevyille ja nämä levyt jäähdytetään ja pidetään 4°C:ssa käyttöön saakka (korkeintaan 5 päivää).
TLC-levy poistetaan ja anlyysilevyä viljellään yli yön 37°C:ssa. Paitsi reagoimattoman bioaktiivisen N-asetyyli-tienamy-siinin täplä kohdassa = 0,7 - 0,89 todetaan tienamysiinistä 37 62306 johtuva bioaktiivinen täplä kohdassa R^ = 0,44 - 0,47. Antibiootin ja puskurin, solu-sonikaatin ja puskurin, sekä antibiootin ja puskurin, johon viimeksimainittuun solu-sonikaattia on lisätty juuri ennen TLC-lisäystä, kontrollia varten tehdyt vil-jelyseokset eivät tuota mitään bioaktiivista ainetta arvossa Rf = 0,44 - 0,47.
Erillisen isomeerin 890A^ valmistus OH
JL. ^ n ^ -s' \-SCH2CH2NHCCH3
^-N--J-COOH
Putki lyofilisoitua viljelmää Streptomyces flavogriseus Ma-4434 (NRR1 8139) avataan aseptisesti ja sisältö suspensoi-daan putkeen, joka sisältää 0,8 ml steriilejä Davis-suoloja, joilla on seuraava koostumus:
Natriumsitraatti 0,5 g K2HP04 7,0 g KH2P04 3,0 g (NH4)2S04 1,0 g
MgS04·7H20 0,1 g
Tislattu vesi 1000 ml Tätä suspensiota käytetään ymppäämään väliaineen A 4 vino-viljelmää, jolla väliaineella on seuraava koostumus:
Glyseroli 20,0 g
Primäärinen hiiva 5,0 g
Kalajauho 15,0 g
Tislattu vesi 1000 ml
Agar 20,0 g pH säädetään arvoon 7,2 käyttäen NaOH:ta.
Ympättyjä vinoviljelmiä viljellään 1 viikko 27 - 28°C:ssa ja varastoidaan 4 - 6°C:ssa käyttöön saakka.
38 62 3 0 6 1/3 edellä mainitun 3 vinoviljelyn kasvua käytetään ymppäämään 9 väliseinällä varustettua 250 ml:n Erlenmeyr-pulloa, joka sisältää 50 ml väliainetta B, jolla on seuraava koostumus: Hiiva-autolysaatti ("Ardamine ")* 10,0 g
Glukoosi 10,0 g
Fosfaattipuskuri** 2,0 ml
MgS04.7H20 50 mg
Tislattu vesi 1000 ml
pH säädetään arvoon 6,5 käyttäen HC1 tai NaOH
* Yeast Products Corporation ** Fosfaattipuskuriliuos: KH2P04 91,0 g
Na2HP04 95,0 g
Tislattu vesi 1000 ml
Siemenpulloa ravistellaan 1 päivä 27 - 28°C:ssa ravisti-messa (220 kierrosta minuutissa, heilahdus 5 cm) . Pulloa ja sen sisältöä varastoidaan 1 päivä 4°C:ssa.
33 kpl 2 litran Erlenmeyer-tuotantopulloa, joista kukin sisältää 250 ml väliainetta C, ympätään 8 ml:11a pulloa kohti siemenpullosta saatua kasvua. Väliaineella C on seuraava koostumus :
Tomaattitahna 20,0 g
Primäärinen hiiva 10,0 g
Dekstriini (amidex) 20,0 g
CoC12.6H20 5,0 mg
Tislattu vesi 1000 ml pH säädetään arvoon 7,2 - 7,4 käyttäen NaOH:ta.
Ymppääämisen jälkeen tuotantopulloja viljellään 24°C:ssa samalla sekoittaen ravistimessa(212 kierrosta minuutissa, heilahdus 5 cm) 4 päivän ajan. Pullosta otetaan sato talteen ja analysoidaan aktiviteetin määräämiseksi (standardi Salmonella gallinarum MB1287 ja Vibrio percolans ATCC 846 analyysilevyt) käyttäen 12,5 mm:n analyysimaljoja kastettuna sentrifugoituihin lieminäytteisiin. Näytteet laimennettiin 0,02-m fosfaattipuskurilla (pH 7,θ') tarvittaessa. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa: 39 62306
Taulukko
Viljelyaika 96 tuntia pH 7,2
Vyöhyke:
Salmonella gallinarum 29,5 mm
Vibrio percolans (1/10-laim.) 31 mm 890 koe 40 yksikköä 7 litraa käymislientä jäähdytetään 3°C:een ja sentrifu-goidaan 200 ml:n erissä (9000 kierrosta minuutissa, 15 minuutin ajan).
Yhdistettyihin pinnalla oleviin aineisiin lisätään 7 ml 0,1-m neutraalia EDTArta ja kokonaisnäyte adsorboidaan käyttäen Dowex ^ x 2 (Cl ), 50 - 100 mesh'in kolonnia, kerroksen koon ollessa 5,1 x 25 cm ja virtausnopeuden 40 ml tunnissa. Kolonni pestään 500 ml:11a deionisoitua vettä, joka sisältää 5 ml 1-m tris-hydrokloridi-puskuria (pH 7,0) ja 20 pmol neutraalia EDTA:ta. Antibiootti eluoidaan 1 litralla deionisoitua vettä, joka sisältää 50 g natriumkloridia ja kolonni pestään sen jälkeen 300 ml:11a deionisoitua vettä. Otetaan talteen 100 ml:n fraktioita alkaen siitä fraktiosta, jossa ensiksi esiintyy suolaa kolonnin poistossa. Bioaktiviteetti esiintyy fraktioissa 1-10 huipun ollessa fraktiossa 2. Fraktiot 2-5, jotka sisältävät 17 % lisäystä aktiviteetista, otetaan talteen.
Talteenotetut fraktiot väkevöidään tilavuuteen 110 ml pyöröhaihduttimessa alennetussa paineessa ja pH säädetään arvoon 5,8 lisäämällä 4,2 ml 1-m kloorivetyhappoa. Säädetty väkevöite lisätään kolonniin XAD-2 kerroksen koon ollessa 3,8 x 50 cm, joka kolonni on ennakolta pesty 3 litralla 60-% vesipitoista asetonia (tilavuus/tilavuus) ja sen jälkeen 3 litralla deionisoitua vettä, 3 litralla 5-% (paino/tilavuus) natriumkloridia ja 1 litralla 25-% (paino/tilavuus) natriumkloridia deionisoidussa vedessä. Lisätyn väkevöitteen annetaan valua kerrokseen. Antibiootti eluoidaan deionisoidulla vedellä virtausnopeudella 15 ml minuutissa. Otetaan talteen 22 kpl 100 ml:n frantioita alkaen näytteen ensimmäisestä fraktiosta. Bioaktiviteetti esiintyy fraktioissa 6-22 huipun ollessa fraktioissa 9 ja 10. Fraktiot 9-20 yhdistetään edelleenkäsittelyä varten. Samalla tavalla valmistetut 40 62306 fraktiot yhdistetään ja väkevöidään tilavuuteen 70 ml pyörö-haihduttimessa alennetussa paineessa.
Väkevöite adsorboidaan Dowex-1 x 4 (Cl”) 400 mesh'in kolonniin, jonka kerroskoko on 2,2 x 27 cm. Kolonnin pestään 50 ml:11a deionisoitua vettä ja antibiootti eluoidaan 2 litralla 0,070-m NaCl + 0,005-m NH4C1 + 0,0001-m NH^ deionisoidussa vedessä virtausnopeudella 2 ml minuutissa. Otetaan talteen 9,5 ml:n fraktioita.
Antibiootin pääpiikki eluoidaan fraktioissa 142 - 163. Fraktiot 146 - 157 yhdistetään edelleenkäsittelyä varten. Yhdistetyt fraktiot 146 - 157 väkevöidään tilavuuteen 3 ml pyöröhaih-duttimessa alennetussa paineessa ja väkevöite saatetaan pH-arvoon 6,5 lisäämällä 5 jul 1-m NH3- Väkevöite lisätään kolonniin (2,2 x 70 cm) Bio-Gel P-2 (200 - 400 mesh'iä), joka on pesty 20 ml:lla 5-m NaCl ja 500 ml :11a deionisoitua vettä. Kun väkevöite on juoksutettu kerrokseen, huuhdotaan kahdesti 1 ml:11a deionisoitua vettä ja annetaan valua kerrokseen, sen jälkeen kolonni eluoidaan deionisoidulla vedellä virtausnopeudella 0,6 ml minuutissa. Otetaan talteen 2,9 ml:n fraktioita.
Antibiootin pääpiikki eluoidaan fraktioissa 63 - 70.
Fraktiot 64 ja 65 otetaan talteen edelleenkäsittelyä varten. Yhdistetyt fraktiot 64 - 65 haihdutetaan pyöröhaihduttimes-sa alennetussa paineessa tilavuuteen 2 ml, jäähdytetään ja lyofi-lisoidaan 14 ml:n ruuvikierteisessä pullossa 8 tuntia, jolloin saadaan 2,25 mg olennaisesti puhdasta antibioottia 890 A^. N-ase-tyyliryhmä lohkaistaan edellä kuvatulla tavalla vapaan emäksen saamiseksi:
OH
Y^jT-SCHjCHjNHj
0 f-N--I— COOH
Erillisen isomeerin 890A3 valmistus OH
0 -SCH 2CH 2NH^CH 3 \— N-Hcooh o
Putki lyofilisoitua viljelmää Streptomyces flavogriseus MA-4434 (NRR1 8139) avataan aseptisesti ja sisältö suspensoidaan putkeen, joka sisältää 0,8 ml steriilejä Davis-suoloja, joilla on seuraava koostumus:
Natriumsitraatti 0,5 g K2HP04 7,0 g KH2P04 3,0 g (NH4)2SO 1,0 g
MgS04.7H20 0,1 g
Tislattu vesi 1000 ml Tätä suspensiota käytetään ymppäämään väliaineen A 4 vino-viljelmää, jolla väliaineella on seuraava koostumus:
Glyseroli 20,0 g
Primäärinen hiiva 5,0 g
Kalajauho 15,0 g
Tislattu vesi 1000 ml
Agar 20,0 g pH säädetään arvoon 7,2 käyttäen NaOH:ta.
Ympättyjä vinoviljelmiä viljellään 1 viikko 27 - 28°C:ssa ja sen jälkeen varastoidaan 4 - 6°C:ssa käyttöön saakka (korkein» taan 21 päivää).
Kolmas osa edellä mainitun vinoviljelyn kasvua käytetään ymppäämään 12 väliseinällä varustettua 250 ml:n Erlenmeyer-pulloa, joka sisältää 50 ml väliainetta B, jolla on seuraava koostumus: Hiiva-autolysaatti ("Ardamine")* 10,0 g
Glukoosi 10,0 g
Fosfaattipuskuri** 2,0 g
MgS04.7H20 50 mg
Tislattu vesi 1000 ml pH säädetään arvoon 6,5 käyttäen HCl:a tai NaOH:ta.
* Yeast Products Corporation 42 62306 ** Fosfaattipuskuriliuos: KH2P04 91 ,0 g
Na2HP04 95,0 g
Tislattu vesi 1000 ml
Siemenpulloa ravistellaan 1 vrk 27 - 28°C:ssa ravistimessa (220 kierrosta minuutissa, heilahdus 5 cm). Pulloa ja sen sisältöä varastoidaan 1 päivä 4°C:ssa.
44 kpl 2 litran Erlenmeyer-tuotantopulloa, joista kukin sisältää 200 ml väliainetta C, ympätään 8:ml:lla pulloa kohti siemenpullosta saatua kasvua. Väliaineella C on seuraava koostumus :
Tomaattitahna 20,0 g
Primäärinen hiiva 10,0 g
Dektsriini (Amidex) 20,0 g
CoC12-5H20 5,0 mg
Tislattu vesi 1000 ml pH säädetään arvoon 7,2 - 7,4 käyttäen NaOH:ta.
Ymppäämisen jälkeen tuotantopulloja viljellään 24°C:ssa samalla sekoittaen ravistimessa (212 kierrosta minuutissa, heilahdus 5 cm) 4 päivän ja 5 tunnin ajan. Pullosta otetaan sato talteen. ja analysoidaan aktiviteetin määräämiseksi (standardi Salmonella gallinarum MB 1287 ja Vibrio percolans ATCC 8461 analyysilevyt), käyttäen 12,5 mm:n analyysimaljoja kastettuna sentrifugoituihin lieminäytteisiin. Näytteet laimennetaan 0,02-m fosfaattipuskurilla (pH 7,0) tarvittaessa. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:
Viljelyaika 101 tuntia pH 7,2
Vyöhyke:
Salmonella gallinarum 35 mm
Vibrio percolans (1/10-laim.) 34 mm 890 koe 121 yksikköä *3 62306 Käymisestä saadaan 7,0 litraa käymislientä, joka jäähdytetään 30°C:seen ja sentrifugoidaan 200 ml:n eristä (9000 kierrosta minuutissa, 15 minuutin ajan). Yhdistettyihin pinnalla oleviin nesteisiin lisätään 1,7 ml 0,1-m neutraalia EDTArta ja panosta pidetään 3°C:ssa.
Edellä kuvattu käyminen toistetaan identtisissä olosuhteissa, paitsi että 44 kpl 2 litran Erlenmeyer-tuotantopulloa ympätään 7 ml:11a pulloa kohti siemenpullosta saatua kasvua. pH ja analyysitulokset ovat seuraavat:
Viljelyaika 101 tuntia pH 7,3
Vyöhyke:
Salmonella gallinarum 38 mm
Vibrio percolans (1/10-laim.) 39 mm 890 koe 92,8 yksikköä
Saatu 7,4 litraa käymislientä jäähdytetään 3°C:een ja sentrifugoidaan 200 ml:n erissä (9000 kierrosta minuutissa, 15 minuutin ajan). Yhdistettyihin pinnalla oleviin nesteisiin lisätään 1,8 ml 0,1-ra neutraalia EDTA:ta.
Edellä mainituista käymisistä saadusta sentrifugoidusta liemestä saatu pinnalla oleva neste yhdistetään kokonaistilavuuden 13 litran saamiseksi.
Yhdistetyt pinnalla olevat nesteet johdetaan kolonniin Dowex”^ x 2 (Cl ), 50 - 100 mesh'iä kerroskoon ollessa 4,7 x 50 cm ja virtausnopeuden 60 ml minuutissa. Kolonni pestään 1 litralla deionisoitua vettä ja antibiootti eluoidaan 5 litralla 5-% (paino/ tilavuus) NaCl-liuosta, joka sisältää 0,01-m tris-hydrokloridi-puskuria (pH 7,0) ja 20 pmol neutraalia EDTA:ta. Otetaan talteen 220 ml:n fraktioita virtausnopeudella 50 ml minuutissa ja fraktiot analysoidaan Salmonella gallinarum MB1287 levyillä.
Antibioottinen aktiviteetti esiintyy fraktioissa 3-26 huipun ollessa fraktioissa 5 ja 6. Fraktiot 5-9 yhdistetään edelleenkäsittelyä varten. Yhdistettyjen fraktioiden pH on 7,8 ja ne sisältävät 24 % alkuperäisestä bioaktiviteetista mitattuna Salmonella gallinarum MB1287 levyillä.
6 2 3 0 6 44
Yhdistetyt fraktiot 5-9 väkevöidään tilavuuteen 150 ml pyöröhaihduttimessa alennetussa paineessa ja syötetään kolonniin (kerroskoko 4,9 x 47 cm) XAD-2, joka on pesty 5 litralla 60-% (tilavuus/tilavuus) vesipitoista asetonia ja sen jälkeen 5 litralla NaCl-liuosta (50 g/1) deionisoidussa vedessä. Näyte lisätään 20 ml:n erissä, jolloin kolonni juoksutetaan kerrostasoon joka kerta. Lisäyksen päätyttyä syötetään kolme 20 ral:n erää de-ionisoitua vettä ja annetaan juosta kerrostasoon joka kerta. Näyte eluoidaan deionisoidulla vedellä virtausnopeudella 20 ml/min. Kaikki käsittelyt käyttäen XAD-kolonnia suoritetaan huoneenlämpötilassa (24°C) ja eluoidut fraktiot jäähdytetään nopeasti jää-hauteella heti talteenottamisen jälkeen. Fraktiot 95 - 230 ml otetaan talteen.
Antibioottinen aktiviteetti esiintyy fraktioissa 2-21 (mitattuna analyysillä Salmonella gallinarum MB1287 levyillä) huipun ollessa fraktioissa 5-7 (käsittää 510 - 895 ml eluoi-tua tilavuutta laskettuna deionisoidun veden ensimmäisestä lisäyksestä) . Fraktiot 6-21 otetaan talteen ja väkevöidään tilavuuteen 28 ml pyöröhaihduttimessa alennetussa paineessa ja sitten laimennetaan tilavuuteen 112 ml lisäämällä deionisoitua vettä. Väkevöite syötetään kolonniin (2,2 x 21 cm kerroskoko) Dowex-^ x 4 (Cl ), 400 mesh'iä. Kolonni pestään 20 ml:lla deionisoitua vettä ja antibiootti eluoidaan 2 litralla 0,07-m NaCl + 0,005-m NH^Cl + 0,0001-m NH^ deionisoidussa vedessä virtausnopeudella 1,6 ml/min. Otetaan talteen 8ml:n fraktioita. Fraktiot 157 - 179, joilla on suurin aktiviteetti, yhdistetään. Nämä fraktiot väkevöidään pyöröhaihduttimessa alennetussa paineessa tilavuuteen 7 ml ja pH säädetään arvoon 7,5 lisäämällä 20 μΐ 1-m natriumhydroksidia.
Liuos väkevöidään edelleen tilavuuteen 5 ml ja syötetään kolonniin (2,2 x 75 cm) Bio-Gel P-2, 200 - 400 mesh'iä. Näyte pestään kolonnikerrokseen huuhtomalla kahdesti 1 ml:11a deionisoitua vettä ja eluoidaan deionisoidulla vedellä virtausnopeudella 0,6 ml minuutissa. Otetaan talteen 10 kpl 3,3 ml:n fraktioita, 60 kpl 2,65 ml:n fraktioita ja 10 kpl 2,0 ml:n fraktioita.
Fraktiot säädetään pH-arvoon 7,5 - 8,0 lisäämällä 1,5 - 2,5 pl 0,1-m natriumhydroksidia. Fraktiot 62, 63, 64 ja 65 jäähdytetään ja lyofilisoidaan erikseen 14 ml:n lasipulloissa ja varastoidaan -20°C:ssa tyhjössä.
62306 45
Antibiootin 890A^ eristämiseksi vapaaksi antibiootista 890A.J käytetään hyväksi antibiootin 890A^ suhteellisesti suurempaa vastustuskykyä penisillinaasin aiheuttamaa hajoamista vastaan seuraavasti:
Bio-Gel fraktio 63 yhdistetään fraktioiden 61, 66 ja 67 kanssa, jotka saadaan Bio-Gel kolonnista. Näihin neljään yhdistettyyn fraktioon lisätään 0,2 ml 1-m tris-hydrokloridi-pusku-ria (pH 7,5) ja 0,2 ml penisillinaasia (Difco "Bacto-Penase"). Pidetään 113 minuuttia 23°C:ssa ja lisätään vielä 0,2 ml penisillinaasia. 7 tunnin kuluttua huoneen lämpötilassa lisätään vielä 0,2 ml penisillinaasia ja 2 tunnin kuluttua jäähdytetään reaktioseos jäähauteella, jonka jälkeen reaktioseos laimennetaan 15 ml:n tilavuuteen lisäämällä 5 ml deionisoitua vettä.
Reaktioseos adsorboidaan Dowex x 4 (Cl ), 400 mesh'in kolonniin, jonka kerroskoko on 2,15 x 40 cm. Antibiootti 890A^ eluoidaan käyttäen 0,07-m NaCl + 0,005-m NH^Cl + 0,0001-m NH^ deionisoidussa vedessä virtausnopeudella 3ml/min. Otetaan talteen 13,8 ml:n fraktioita, fraktiot 187 - 200 yhdistetään.
Yhdistetyt fraktiot väkevöidään tilavuuteen 4 ml pyörö-haihduttimessa alennetussa paineessa ja väkevöite lisätään kolonniin (2,2 x 70 cm) Bio-Gel P-2, 200 - 400 mesh'iä. Antibiootti 890Ä2 eluoidaan deionisoidulla vedellä virtausnopeudella 0,6 ml/min. Otetaan talteen 30 fraktiota, kooltaan 3,3 ml ja sen jälkeen 50 fraktiota, kooltaan 2,65 ml.
Fraktiot 66 - 70 yhdistetään ja yhdistetyt näytteet väkevöidään tilavuuteen 1,5 ml pyöröhaihduttimessa alennetussa paineessa ja väkevöite jäähdytetään ja lyofilisoidaan, jolloin saadaan 5,4 mg kiinteätä ainetta, joka sisältää antibiootin δΟΟΑ^ sekä jäljellä olevia suoloja. N-asyyliryhmä lohkaistaan edellä kuvatulla tavalla vapaan emäksen
OH
-- — sch2ch2nh2
I- N--C00H
0^ saamiseksi.
46 62306
Seuraavat esimerkit kuvaavat keksinnön mukaista menetelmää.
Esimerkki 1 ci® clx ΘΑ-\ Γοη
H/C W h H
Th--N =C
Θ \^\ ---* — CO(0
Tienamysiini-N-piperidin-1-yyli-metyleenijohdannaisen valmistus
Tienamysiini (57 mg, 162 pmol) silyloidaan edellä kuvatun menetelmän mukaisesti. Silyloitu antibiootti liuotetaan metyleenikloridiin (6 ml) suljetussa pullossa typpiaineen alaisena ja jäähdytetään kuivalla jää-asetonihauteella. Magneettisesti sekoitettuun liuokseen lisätään liuos ( 180 pl), jossa on trietyyliamiinia (660 pmol) metyleenikloridissa. Sen jälkeen lisätään liuos, jossa on klooripiperidinometyliumkloridia (67 mg, 405 pmol) metyleenikloridissa (465 pmol). Pidetään 1 tunti kuivassa jäähauteessa, jonka jälkeen reaktioseos lisätään nopeasti tetrahydrofuraanin ja 0,1-n (pH 7,0) fosfaattipuskurin (1:1)-seokseen (50 ml), ja väkevöidään seos tyhjössä tilavuuteen 10 ml homogeenisen liuoksen saamiseksi. Liuos pestään kahdesti etyyliasetaatilla (2x5 ml) ja sitten eetterillä (2x5 ml) ja haihdutetaan tyhjössä. Tämä vesipitoinen liuos kromatografoidaan käyttäen XAD-2 hartsikolonnia (60 ml, kerran). Tuote eluoidaan 10-% vesipitoisella tetrahydrofuraanilla (sen jälkeen suoritetaan elu-oiminen vedellä), jolloin saadaan 12,9 mg (22 %) tuotetta (mitattuna liuoksessa, olettaen, että arvo € 8 030 on sama kuin tiena-mysiinin). Paperikromatografinen analyysi: = 0,42 (4:1:5, n-BuOH:EtOH:vesi).
47 6 2 3 0 6 Lähtöaineen, silyloidun tienamysiinin valmistus
- OTMS
Th--NHTMS
-COOTMS
TMS = trimetyylisilyyli
Tienamysiini (80,0 mg) suspensoidaan 40 ml:aan tetra-hydrofuraania typpisuojakaasussa ja väkevöidään tilavuuteen 10 ml, ja lisätään heksametyylidisilatsaania (1,0 ml) ja tri-metyylikloorisilaania (300 μΐ). Seoksen annetaan reagoida 20 minuuttia 25°C:ssa samalla voimakkaasti sekoittaen. Sen jälkeen suspensio sentrifugoidaan ammoniumkloridin poistamiseksi. Päällä oleva neste haihdutetaan öljyksi typpivirrassa tulevaa reaktiota varten.
Esimerkki 2
"OH
il" H >NH2 H3C~°~C~^ Th-- N-bensimidoyyli-tienamysiinin valmistus
Tienamysiini (59 mg, 212 pmol) liuotetaan 33-% N,N-di-metyyliformanidin ja 0,05-n (pH 7,0) fosfaattipuskurin liuokseen (4,5 ml) ja pH säädetään arvoon 9,5 käyttäen 2,5-n natriumhydr-oksidia ja automaattista annostusbyrettiä. Liuosta sekoitetaan magneettisesti 25°C:ssa ja lisätään yhdellä kertaa metyylibents-imidaattihydrokloridia (340 mg, 1981 pmol). 30 minuutin kuluttua liuos uutetaan kahdesti yhtä suurella tilavuudella kloroformia ja pH säädetään laimealla fosforihappoliuoksella arvoon 7,0. Puskuroitu liuos kromatografoidaan käyttäen XAD-2 hartsia (65 ml). Ko-lonni eluoidaan ensin vedellä ja sen jälkeen 10-% tetrahydrofu-raanin vesiliuoksella. Tämä fraktio väkevöidään puoleen tilavuu- 48 6 2 3 0 6 vuuteen ja jäähdytyskuivataan, jolloin saadaan 50 mg tuotetta. Elektroforeettinen liikkuvuus (50 V/cm, 20 min, pH 7/0,1-n fosfaattipuskuri) on 1,5 cm kohti anodia. uvJt mafcs = 300 11111 (£ 6960), pH 7/0,1-n fosfaattipuskuri.
Esimerkki 3 N-formimidoyyli-tienamysiinin valmistus
OH
SCH CH N=C-NH_ li 2 2 L 2
¢¢7-N COOH
Tienamysiini (517 mg) liuotetaan 0,1-n fosfaattipuskuriin (pH 7, 25 ml) ja jäähdytetään jäähauteella samalla magneettisesti sekoittaen. Liuos säädetään pH-arvoon 8,5 käyttäen 2,5-n natriumhydroksidiliuosta (automaattisesta byretistä). Samalla kun pH pidetään arvossa 8,5 lisätään annoksittain me-tyyli-formimidaattihydrokloridia (711 mg) 2-3 minuutin aikana . Kun on kulunut 10 minuuttia saatetaan liuoksen pH arvoon 7,0 käyttäen 2,5-n kloorivetyhappoa. Liuos kromatografoidaan XAD-2 hartsikolonnissa (150 ml), joka eluoidaan vedellä. N-formimidoyyli-tienamysiinijohdannainen eluoidaan 1,5 - 2,0 kolonnitilavuuksissa (200 - 300 ml) ja lyofilisoidaan valkeaksi aineeksi (217 mg). UV (pH 7, 0,1-n fosfaattipuskuri) \ _ λ J\ maJcs = 297 nm (8590). IR (Nujoli) 1767 cm ( /3-laktaami) .
NMR (D20)61,37 (d, J = 6Hz, CH^CH) , 3,0 - 3,75 (m, -CH2-), 4,2 - 4,8 (m, C5R, C6R, C?R), 7,86
NH
II
(S, -C-H)
Esimerkki 4 -0H ^NH Th--NHC^ _C02H NH2 N-guanyyli-tienamysiinin valmistus
Tienamysiini (8,9 mg) liuotetaan seokseen, jossa on 0,7 ml 0,1-n fosfaattipuskuria (pH 7) ja 0,3 ml N,N-dimetyyli-formamidia ja liuos saatetaan pH-arvoon 9,5 lisäämällä 2,5-n 49 62306 natriumhydroksidiliuosta. Magneettisesti sekoitettuun liuokseen lisätään O-metyyli-isoureavetysulfaattia (43 mg), jolloin pH-arvo laskee hiukan. Sen jälkeen lisätään natriumhydroksidiliuosta ρΗ-arvon saamiseksi takaisin 9,5:een ja liuosta sekoitetaan 30 minuuttia 23°C:ssa. Sen jälkeen liuos tehdään happamek-si pH-arvoon 7,0. Näyte liuoksesta, joka sisältää tienamysiinin ja N-guanyyli-tienamysiinin seoksen, osoittaa kahta bioaktiivista vyöhykettä elektroforeesin (50 V/cm, 20 minuuttia, 0,05-n fosfaattipuskuri, pH 7) ja S. aureus levyllä suoritetun bioauto-grafian mukaisesti.
Esimerkki 5
C1 OH
N_ NH p0H
ci-<öy-o-cf *hci ^nh
\_/ ^NH2 Th--NHC
tienamysiini ^NH
^ 2
— C02H
N-guanyyli-tienamysiinin valmistus
Tienamysiini (11 mg) liuotetaan 0,1-n fosfaattipuskuriin (pH 7, 1 ml) ja säädetään pH-arvoon 8,3 käyttäen 0,1-n natrium-hydroksidia ja automaattista annostusbyrettiä. Magneettisesti sekoitettuun liuokseen lisätään 0-2,4,5-trikloorifenyyli-isourea-hydrokloridia (76 mg) annoksittain automaattisen byretin avulla pitäen pH lähes muuttumattomassa arvossa. Reaktion annetaan kestää 4 tuntia 22°C:ssa ja sen jälkeen säädetään pH uudelleen arvoon 7.0 laimealla hapolla. Näyte tästä liuoksesta, joka sisältää tienamysiinin ja N-guanyyli-tienamysiinin, saatetaan elektroforeesiin (50 V/cm, 25 minuuttia, pH 7/0,1-n fosfaattipuskuri), joka osoittaa positiivista Sakaguchi-suihkuvyöhykettä kohdassa 2.0 cm kohti anodia ja positiivista ninhydriini-suihkuvyöhykettä kohdassa 1,5 cm samaan suuntaan.
so 62 3 0 6 Lähtöaineen, 0-2,4,5-trikloorifenyyli-isourea-hydroklori-din valmistus ~-<C^0H J!^ -HC1
Cl cl
Liuos, jossa on syanamidia (0,28 mg) eetterissä (0,50 ml), sekoitetaan 2,4,5-trikloorifenolin (12,5 g) kanssa; seos kuumennetaan 70°C:een ja sulatetta sekoitetaan magneettisesti samalla kun reaktiopulloa huuhdotaan typellä. Sen jälkeen annetaan kuivan kloorivetykaasun hitaasti kuplia sulatteeseen ja reaktion annetaan jäähtyä 22°C:een. Saatu kiinteä aine pestään hyvin eetterillä ja suodatetaan, jolloin 0-2,4,5-trikloorifenyyli-isourea-hydro-kloridi saadaan valkoisena aineena, sp. 205 - 206°C.
Esimerkki 6
Cl© r0H ί"3
0 H
(CH ) N=CHC1 \ /
Th (TMS) -—-* in W
-CC^ N-dimetyyliaminometyleeni-tienamysiinin valmistus
Tienamysiini (16,5 mg) silyloidaan heksametyylidisilat-saanilla (200 μΐ) ja trimetyylikloorisilaanilla (60 μΐ). Sily-loitu tienamysiini suspendoidaan (etanolista) vapaaseen kloroformiin (1 ml) samalla magneettisesti sekoittaen typpisuojakaa-sussa. Seos jäähdytetään -45°C:een ja lisätään liuos, jossa on trietyyliamiinia (21 μΐ) kloroformissa (21 μΐ), sekä liuos, jossa on (kloorimetyleeni)-dimetyyliammoniumkloridia (11,5 mg) kloroformissa (50 μΐ). Seos lämmitetään -25°C;een tunnin aikana ja lisätään 0,1-n fosfaattipuskuria (pH 7, 5 ml). Seosta sekoitetaan voimakkaasti 15 minuuttia. Erotetaan vesipitoinen faasi, joka sisältää N-dimetyyliaminometyleenitienamysiiniä, jolla on elektroforeettinen liikkuvuus (50 V/cm, 1 tunti, pH 8-puskuri) 3,6 cm kohti katodia.
51 62306
Esimerkki 7 OH
__-SCH CH_N=C-NH_ | 2 2)2 I CF3
J- N--COOH
O ' N-trifluoriasetimidoyyli-tienamysiinin valmistus
Tienamysiini ( 199 mg) liuotetaan 0,1-n fosfaattipuskuriin (pH 7, 7 ml) ja säädetään pH-arvoon 8,5 käyttäen 1-n nat-riumhydroksidiliuosta. Samalla kun pH-arvo säilytetään automaattisen byretin avulla, lisätään liuos, jossa on metyylitrifluori-asetimidaattia (355 μΐ) dioksaanissa (2,5 ml). 30 minuutin kuluttua pH säädetään uudelleen arvoon 7,0 lisäämällä 1-n kloori-vetyhappoa. Liuos kromatografoidaan käyttäen Dowex 50-X4 hartsia (200 cc, Na+-sykli, 200 - 400 mesh'iä) ja eluoidaan vedellä.
N-trifluoriasetimidoyyli-tienamysiini-johdannainen eluoituu ensimmäisessä puoliskossa kolonnin tilavuutta. Eluaatti kromatografoidaan uudelleen samalla tavalla käyttäen Dowex 50-X4 (100 cc, Na+-sykli, 200 - 400 mesh'iä) ja ensimmäinen kolonnitilavuus väkevöidään ja kromatografoidaan käyttäen XAD-2 hartsia (30 ml). N-trifluoriasetimidoyyli-tienamysiini-johdannainen eluoituu 2,5 - 5,0 kolonnitilavuudessa ja lyofilisoidaan, jolloin saadaan valkoista ainetta (15 mg).
UV (pH 7/0,1-n fosfaattipuskuri) .j^^g 302 nm (£ 4450).
IR (Nujol) 1750 cm ^ -laktaami) .
Elektroforeesi: (50 V/cm, 20 min, pH 7/ 0,1-n fosfaattipuskuri) liikuvuus 2,0 cm (kohti katodia).
62306
Esimerkki 8 OH
— SCH2CH2N=C-NH2 I | ch3
J-N --COOH
O
N-asetimidoyyli-tienamyslinin valmistus
Tienamysiini (190 mg) liuotetaan 0,1-n fosfaattipuskuriin (pH 7, 13 ml) ja jäähdytetään jäähauteella samalla magneettisesti sekoittaen. Liuoksen pH säädetään arvoon 8,5 käyttäen 2,5-n natriumhydroksidiliuosta annosteltuna automaattisesta byretistä. Pidetään pH arvossa· 8,5, sekä lisätään annoksittain etyyliaset-imidaatti-hydrokloridia (400 mg) muutaman minuutin aikana.
40 minuutin kuluttua säädetään liuos pH-arvoon 7,0 käyttäen 2,5-n kloorivetyhappoa. Liuos kromatografoidaan käyttäen Dowex 50-X8 hartsia (250 cc, Na+-sykli, 100 - 200 mesh'iä) ja eluoidaan vedellä. N-asetimidoyyli-johdannainen eluoituu 1-2 kolonnitila-vuudessa (240 - 520 cc) ja lyofilisoidaan, jolloin saadaan valkoista ainetta (88 mg).
UV ( pH 7/0,1-n fosfaattipuskuri) ^makg 297 nm (£ 7620).
IR (Nujoi) 1774 cm 1 (^-laktaami) . NH
NMR (D20) 6 1,27 (d, J = 6Hz, CH3~CH) 2,24 (S, -C-CH3 3.2 - 3,5 (m, -CH2), 3.5 - 3,9 (m, -CH2-) 4.2 - 4,6 (m, C5H, C6H, C?H).
Esimerkki 9 N-isobutyrimidoyyli-tienmysiinin valmistus
Esimerkin 8 menetelmän mukaisesti, mutta korvaamalla etyyli-asetimidaatti-hydrokloridi isobutyrimidaatti-hydroklori-dilla ja antamalla reaktion tapahtua 20°C:ssa ja pH-arvossa 8,2 saadaan N-isobutyrimidoyyli-tienamysiini (14 %).
UV (pH 7/0,1-n fosfaattipuskuri) ^ ^ 298 nm (6 8290) NMR (D20) β 1,27 (d, J = 7Hz, CH(CH3)2, 1,29 (d, J = 6Hz, CH2CH(OH), 2,79 (heptetti, J = 7Hz, ch(ch3)2).
53 6 2 3 0 6
Esimerkki 10 N1-metyyli-N-asetimidoyyli-tienamysiinin valmistus Esimerkin 8 menetelmän mukaisesti, mutta korvaamalla etyy-li-asetimidaatti-hydrokloridi metyyli-N-metyyliasetimidaatilla saadaan N-metyyli-N'-asetimidoyyli-tienamysiini (10 %) .
UV (pH 7/0,1-n fosfaattipuskuri) Amaks 298 nm (£ 6700) IR (Nujol) 1750 cm 1 (β-laktaami), 1660 cm 1 (c=nch3) NMR (D20) 6 1/27 (d, J = 6Hz, CH3CH(0H), 2,22 ja 2,25
N
(S, N-CCH3), 2,97 (S, NCH3).
Esimerkki 11 N1-rnetyyli-N-formimidoyyli-tienamysiinin valmistus Esimerkin 8 menetelmän mukaisesti, mutta korvaamalla etyyli-ase timidaatti-hydrokloridi etyyli-N-metyyli-formimidaatti-hydro-kloridilla saadaan N'-metyyli-N-formimidoyyli-tienamysiini (10 %) . UV (pH 7/0,1-n fosfaattipuskuri) A^^g 198 nm NMR (D20) 6 1/30 (d, J = 6Hz, CH3CH(0H), 2,92 (S, N-CH3), ti 7,78 (S, -CH)
Esimerkki 12 N-(metoksiasetirnidoyyli)-tienamysiinin valmistus Esimerkin 8 menetelmän mukaisesti, mutta korvaamalla rea-genssi ekvivalentilla määrällä metyyli-metoksiasetimidaattia saadaan N-(metoksiasetirnidoyyli)tienamysiini (34 %); UV Xmaks 1 98, 301 nm <£16180' 8700) IR (Nujol) 1760 cm"1 (/S -laktaami) NMR (60 MHz, D20) 6 1,28, 3H, (d, J = 6Hz, CH3.CH(OH) 03,50, 3H, (S, CH3.O.CH2) 04,35, 2H, (S, CH3.O.CH2) HPLC, 1,50 x tienamysiinin reaktioaika.
S4 62306
Esimerkki 13 X ^ ^ -p η— sch2ch2n=c-nh2 J- N--COOH jl
o I
N-Z^-pyridyyli)~<imino)metyyli7-tienamyslinin valmistus Tienamysiini (80 mg, 0294 mmol) liuotetaan natriumkarbo-naattiliuokseen (24,7 mg, 0,294 millimoolia NaCO^ 2 ml:ssa vettä) 25°C:ssa. Metyyli-isonikotiini-imidaatti (80 mg, 0,588 mmol) lisätään sekoittaen ja reaktion edistymistä seurataan käyttämällä suuritehoista nestekromatografiaa, HPLC (Water's instrument) 0,2 x 61 cm, C1Q Bondapak käänteisfaasikolonni? 1,5 ml/min 10-%
I O
tetrahydrofuraani; UV (254 nm) ja IR-monitorit. Reaktio on käytännöllisesti katsoen päättynyt 40 minuutissa. Reaktioliuos kro-matografoidaan suoraan käyttäen 18,4 x 270 mm XAD-hartsikolonnia; ensin eluoidaan deionisoidulla tislatulla vedellä ja sen jälkeen vesipitoisella 10-% tetrahydrofuraanilla. Eluaatti monitoroidaan UV:n avulla ja HPLC:tä käytetään puhtaan tuotteen paikallistamiseksi. Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistetään ja lyofilisoidaan, jolloin saadaan väritöntä kuohkeaa ainetta (80 mg = 73 %).
UV <*"aks 2M m» (S 7800) IR (Nujol) 1762 cm (^4>-laktaami) NMR (60 MHz, D20), 6 1,27, 3H (d, J = 7Hz, CH3CH(OH))? ^7,75 ja 8,80, 4H, (m, m, 4-pyridyyli) HPLC, 1,58 x tienamysiinin retentioaika.
Esimerkki 14 N-Z~(2-pyridyyli) - (imino)metyyli7tienamysiinin valmistus Esimerkin 13 menetelmän mukaisesti, mutta korvaamalla rea-genssi metyylipikoliini-imidaatilla saadaan N-^"(2-pyridyyli)-(imino)metyyli7tienamysiini (85 mg, 77 %) V H,0 UV Λ 267, 300 nm (£ 8150, 7600) maks IR (Nujol) 1764 cm ( ^-laktaami) NMR (60 MHz, D20) 01,24, 3H, (d, J = 7Hz, CH3.CH(OH)) 07,80, 8,07, 8,80, 4H, (m, m, m, 2-pyridyyli) HPLC, 1,8 x tienamysiinin retentibaika.
55 6 2 3 0 6
Esimerkki 15 N-/~( 3-pyridyyll (imino) metyyll7tienamysiinin valmistus Esimerkin 1 3 menetelmän mukaisesti, mutta korvaamalla reagenssi metyylinikotiini-imidaatilla saadaan N-/13-pyridyyli-(imino)metyyli7tienamysiini (77 mg, 70 %) , «2° UV A maks 264' 299 nm' ( 6 5570, 6120) IR (Nujol) 1766 cm 1 (yj-laktaami) NMR (60 mHz, D20) 61,24, 3 H, (d, J = 7Hz, CH3.CH(OH)) 6 7,6, 8,2, 8,9, 4H (m, m, m, 3-pyridyyli) HPLC, 1,57 x tienamysiinin retentioaika.
Esimerkki 16 N-/~(4-tiatsolyyli-imino)metyylj7tienamysiinin valmistus Esimerkin 13 menetelmän mukaisesti, mutta korvaamalla reagenssi metyyli-4-tiatsolikarboksi-imidaatilla saadaan N-/"(4-tiatsolyyli-imino)metyyl47tienamysiini (99 mg, 89 %) UV^”aL 300 nm, (6 7530) IR (Nujol) 1764 cm (yä-laktaami) NMR (60 MHz, D20) 6 1,23, 3H, (d, J = 7Hz, CH3.CH(OH)) δ 8,60, 9,17, 2H, (d, d, J = 2Hz 4-tiatsolyyli) HPLC, 1,8 x tienamysiinin retentioaika.
Esimerkki 17
i—OH
^N-CH,CH,SCH
Th--NH<
^*H
-COOH
N1-(2-metyylitioetyyli)-N-formimidoyyli-tienmysiinin valmistus
Tienamysiini (105 mg) liuotetaan 0,1-n fosfaattipuskuriin (pH 7, 5 ml) ja tähän lisätään liuos, jossa on etyyli-N-2-metyyli-tioetyyliformimidaattia (300 pl) tetrahydrofuraanissa (2 ml). Liuoksen pH säädetään arvoon 8,5 ja pidetään siinä käyttämällä automaatista annostusbyrettiä ja 0,1-n NaOHita. 30 minuutin kuluttua pH säädetään arvoon 7,0 käyttäen 2,5-n HCl.
Liuos kromatografoidaan jäävedellä jäähdytetyssä kolonnissa käyttäen Dowex 50-X4 hartsia (53 cc, Na+-sykli, 200 - 400 mesh'iä) 56 62 30 6 ja eluoimalla deionisoidulla vedellä. N'-/2-metyylitioetyyli7N-formimidoyyli-johdannainen eluoituu 2-4 kolonnitilavuudessa ja lyofilisoidaan valkoisen aineen saamiseksi.
UV (pH 7/0,1-n fosfaattipuskuri) ^ ^ 298 nm (£ 7760) IR (Nujol) 1760 cm-1 (yS-laktaami) Lähtöaineen, etyyli-N-2-metyylitioetyyli-formimidaatin valmistus 60 ml:n erotussuppiloon lisätäänetyyliformimidaatti-hydrokloridia (0,97 g, 8,8 mmol),/^-metyylitioetyyliamiinin (0,80 g, 8,8 mmol) liuos CH^^tssa (35 ml) ja vettä (35 ml). Seosta ravistellaan voimakkaasti 5 minuuttia. CH^^-kerros erotetaan, pestään suolaliuoksella, kuivataan MgS04:llä, suodatetaan ja haihdutetaan alennetussa paineessa, jolloin saadaan raaka imidaatti (0,59 g) vaaleankeltaisena sameana nesteenä.
IR 1660 ja 1230 cm-1.
Esimerkki 18
— OH
N-CH(CH-)CH=CH- ^32
Th--NHC-H
-COOH
N'-(1-metyyli-2-propenyyli)-N-formimidoyyli-tienamysiinin valmistus
Tienamysiini (126 mg) liuotetaan 0,1-n fosfaattipuskuriin (pH 7, 6 ml) ja liuoksen pH säädetään arvoon 8,5 ja pidetään siinä käyttämällä automaattista annostusbyrettiä ja 1-n natrium-hydroksidia. Tähän sekoitettuun liuokseen lisätään etyyli-N- 1- metyyli-2-propenyyliformimidaatti-hydrokloridia (300 jul).
30 minuutin kuluttua pH säädetään arvoon 7,0 käyttäen 2,5-n HC1 ja liuos kromatografoidaan jäävedellä jäähdytetyssä kolonnissa käyttäen Dowex 50-X4 hartsia (49 cc, Na+-sykli, 200 - 400 mesh'iä) jaeLuoidaan deionisoidulla vedellä. N'-£l-metyyli- 2- propenyyli7-N-formimidoyyli-johdannainen eluoituu 2-4 kolonnitilavuudessa ja lyofilisoidaan valkoisen aineen saamiseksi (59 mg).
UV (pH 7/0,1-n fosfaattipuskuri) \ ^ 299 nm (€ 7820) IR (Nujol) 1760 cm ^ (^-laktaami) 62306
Esimerkki 19 —OH
rc(cH 3» 3
Th--NHC
\
—COOH
N'-tert.-butyyli-N-formimidoyyli-tienamysiinin valmistus
Tienamysiini (105 mg) liuotetaan 0,1-n fosfaattipuskuriin (pH 7, 5 ml) ja tähän lisätään liuos, jossa on etyyli-N-tert.-butyyliformimidaattia (290 mg) tetrahydrofuraanissa (1 ml). Liuoksen pH säädetään arvoon 8,5 ja pidetään siinä lisäämällä 1-n natriumhydroksidia annostusbyretistä. 30 minuutin kuluttua pH säädetään arvoon 7,0 käyttäen Dowex 50-X4 hartsia (53 ml, Na+-sykli, 200 - 400 mesh'iä) ja eluoidaan deionisoidulla vedellä. Otsikkotuotteen sisältävät fraktiot yhdistetään ja lyofili-soidaan.
Esimerkki 20
i— OH
rN<cH33
Th--NHC J
—COOH
N1-dimetyyliamino-N-formimidoyyli-tienamysiinin valmistus
Tienamysiini (115 mg) liuotetaan 0,1-n fosfaattipuskuriin (pH 7, 7 ml) ja liuoksen pH säädetään arvoon 8,5 lisäämällä 1-n natriumhydroksidia automaattisesta byretistä. Tähän sekoitettuun liuokseen lisätään metyyli-N-dimetyyliaminoformimidaattihydro-kloridia (284 mg) samalla pitäen pH arvossa 8,5. 20 minuutin kuluttua liuoksen pH säädetään arvoon 7,0 2,5-n kloorivetyha-polla ja liuos kromatografoidaan käyttäen Dowex 50-X4 hartsia (53 ml, Na+-sykli, 200 - 400 mesh'iä) ja eluoidaan deionisoidulla vedellä. Kromatografia suoritetaan vesivaipan ympäröimässä kolonnissa 3°C:ssa. N'-dimetyyliamino-N-formimidoyyli-johdannainen eluoituu 2 kolonnitilavuudessa ja lyofilisoidaan, jolloin saadaan valkoista ainetta (40 mg).
58 6 2 3 0 6 UV (pH 7/0,1-n fosfaattipuskuri) ^maks 298 nm (£6910) IR (Nujol) 1760 cm ^ -laktaami) NMR (D20) 6 1/29 (d, J = 6Hz, CH^CH) 2,59 (s, N(CH3)2, 7,76 (s, NCH).
Lähtöaineen, metyyli-N-dimetyyliaminoformimidaatin valmistus
Sekoitettuun liuokseen, jossa on 0,22 g N,N-dimetyyli-formhydratsidia 2,0 mlrssa kloroformia lisätään typpisuojakaa-sussa metyyliklooriformaattia (0,5 ml). Seosta kuumennetaan 40°C:ssa 3 tuntia,jonka jälkeen haihdutetaan typpisuojakaasussa. Seos trituroidaan vedettömän eetterin kanssa, päällä oleva liuos dekantoidaan ja jäännös kuivataan typpivirrassa. Saanto: 284 mg. NMR CDC13 6, 9,13 (CH), 3,80 (OCH3), 3,01 (N(CH3)2).
Esimerkki 21 “OH
NH NH
ii i
Th--NHC - C - OCH3
-COOH
Metyyli-oksalimidoyyli-tienamysiinin valmistus Tienamysiini (105 mg) liuotetaan 0,1-n fosfaattipuskuriin (pH 7, 5 ml) ja liuoksen pH säädetään arvoon 8,5 lisäämällä 1-n natriumhydroksidia automaattisesta byretistä. Tähän liuokseen lisätään metyylioksalimidaattia (200 μΐ) samalla pitäen pH arvossa 8,5. 30 minuutin kuluttua liuoksen pH säädetään arvoon 7,0 2,5-n kloorivetyhapolla ja liuos kromatografoidaan käyttäen Dowex 50-X4 hartsia (53 ml, Na+-sykli, 200 - 400 mesh'iä) ja eluoidaan deionisoidulla vedellä. Kromatografia suoritetaan vesivaipan ympäröimässä kolonnissa 3°C:ssa. Metyyli-oksalimido-johdannainen eluoituu 2 kolonnitilavuudessa ja lyofilisoidaan valkoiseksi aineeksi (44 mg).
UV (pH 7/0,1-n fosfaattipuskuri) 298 nm (£ 6230) IR (Nujol) 1760 cm-1 (/^-laktaami) NMR (D20) 6 1,27 (d, J = 6Hz, CH3~CH), 3,87 (s, -OCH3) 59 62306
Esimerkki 22
-OH
NH
K
Th--NHC ^ οη2οη3
^-COOH
N-propionimidoyyli-tienamysiinin valmistus Tienamysiini ( 114 mg ) liuotetaan 0,1-n fosfaattipuskuriin (pH 7, 10 ml) ja liuoksen pH säädetään arvoon 8,5 lisäämällä 1-n natriumhydroksidia automaattisesta byretistä. Tähän lisätään kiinteätä etyyli-propionimidaattihydrokloridia (231 mg) samalla pitäen pH arvossa 8,5. 30 minuutin kuluttua liuoksen pH säädetään arvoon 7,0 2,5-n kloorivetyhapolla ja liuos kromatografoidaan käyttäen Dowex 50-X4 hartsia (72 ml, Na+-sykli, 200 - 400 mesh'iä) ja eluoidaan deionisoidulla vedellä. Kromatografia suoritetaan vesivaipan ympäröimässä kolonnissa 3°C:ssa. N-propionimidoyyli-johdannainen eluoituu 2 kolonnitilavuudessa ja lyofilisoidaan valkoiseksi aineeksi (76 mg).
UV (pH 7/0,1-n fosfaattipuskuri) A maj,s 298 nm (€ 7830) NMR (D20)6l,28 (d, J = 6Hz, CH3CH(OH)), 1,23 (t, J = 8Hz,-CH2-CH3) 2,50 (q, J = 8Hz, CH^H-j) .
Esimerkki 23 -OH
N-CH,
Il 3
Th--NHC
N
-COOH
N'-metyyli-N-formimidoyyli-tienamysiinin valmistus
Tienamysiini (140 mg) liuotetaan 0,1-n fosfaattipuskuriin (pH 7, 10 ml) ja liuoksen pH säädetään arvoon 8,5 lisäämällä 1-n natriumhydroksidia automaattisesta byretistä. Tähän liuokseen lisätään metyyli-N-metyyli-formimidaattihydrokloridia (200 pl) samalla pitäen pH arvossa 8,5. 40 minuutin kuluttua liuoksen pH säädetään arvoon 7,0 2,5-n kloorivetyhapolla ja liuos kromatogra- so 62306 foidaan käyttäen Dowex 50-X4 hartsia (72 ml, Na+-sykli, 200 -400 mesh'iä) ja eluoidaan deionisoidulla vedellä. N'-metyyli-N-formimidoyyli-johdannainen eluoituu 2 kolonnitilavuudessa ja lyofilisoidaan valkoiseksi aineeksi (43 mg).
UV(pH7/0,1-n fosfaattipuskuri)^makg 298 nm (£ 7250) IR (Nujol) 1765 cm 1 ( /¾ -laktaami) NMR (D20)61f29 (d, J = 6Hz, CH-j-CH) , 2,92 (s, N-CH3) , 7,80 (s, N-CH).
Esimerkki 24
— OH
Γ’Ό
Th--NHC
— COOH
N *-bentsyyli-N-formimidoyyli-tienamysiinin valmistus Tienamysiini (110 mg) liuotetaan 0,1-n fosfaattipuskuriin (pH 7, 7 ml) ja liuoksen pH säädetään arvoon 8,5 lisäämällä 1-n natriumhydroksidia automaattisesta byretistä. Tähän puskuroituun liuokseen lisätään etyyli-N-bentsyyli-formimidaattifluoriboraa-tin (572 mg) liuos p-dioksaanissa (2 ml) pitäen pH arvossa 8,5.
20 minuutin kuluttua säädetään liuoksen pH arvoon 7,0 2,5-n kloo-rivetyhapolla ja liuos kromatografoidaan käyttäen Dowex 50-X4 hartsia (53 cc, Na+-sykli, 200 - 400 mesh'iä) ja eluoidaan deionisoidulla vedellä. Kromatografia suoritetaan vesivaipan ympäröimässä kolonnissa 3°C:ssa. N'-bentsyyli-N-formimidoyyli-johdannainen eluoituu 2 kolonnitilavuudessa ja lyofilisoidaan valkoiseksi aineeksi ( 5 mg).
UV (pH 7/0,1-n fosfaattipuskuri) ^ 295 nm (£ 3980) IR (Nujol) 1765 cm ^ (/¾-laktaami) NMR (D20) 6 1,29 (d, J = 6Hz, CH3CH) , 4,44 (s, CH^Ar) , 7,37 (s, aryyli), 8,14 (s, NCH).
61 62306 Lähtöaineen, etyyli-N-bentsyyliformimidaatin, valmistus
Liuos, jossa on 690 mg (5,1 mmol) N-bentsyyliformamidia 5 ml:ssa metyleenikloridia, jäähdytetään jää-vesihauteella ja pannaan argon-suojakaasuun. Liuosta sekoitetaan samalla lisäten pisaroittain 4,9 ml (4,9 mmol) 1-m trietyylioksonium-fluori-boraattia metyleenikloridissa. 45 minuutin reaktioajan jälkeen seos väkevöidään kuiviin alennetussa paineessa huoneen lämpötilassa ja jäännös kuivataan alennetussa paineessa käyttäen fosfori-pentoksidia. Tuotteen ydinmagneettinen resonanssispektri deutero-kloroformissa on täysin yhdenmukainen etyyli-N-bentsyyliformimi-daatin fluoriboraatti-eteraatti-kompleksin kanssa.
Esimerkki 25
—OH
NCH(CH_)_ (I 3 2
Th--NHC
""H — COOH
N'isopropyyli-N-formimidoyyli-tienamysiinin valmistus
Tienamysiini (110 mg) liuotetaan 0,1-n fosfaattipuskuriin (pH 7, 7 ml) ja liuoksen pH säädetään arvoon 8,5 lisäämällä 1-n natriumhydroksidia automaattisesta byretistä. Tähän magneettisesti sekoitettuun puskuroituun liuokseen lisätään metyyli-N-isopropyyliformimidaattihydrokloridia (300 mg) p-dioksaanissa (1 ml) pitäen pH samalla arvossa 8,5. 25 minuutin kuluttua liuoksen pH säädetään arvoon 7,0 2,5-n kloorivetyhapolla ja liuos kromatografoidaan käyttäen Dowex 50-X4 hartsia (53 ml, Na+-sykli, 200 - 400 mesh'iä) ja eluoidaan deionisoidulla vedellä. Kromato-grafia suoritetaan vesivaipan ympäröimässä kolonnissa 3°C:ssa.
N'-isopropyyli-N-formimidoyyli-johdannainen eluoituu 2 kolonni-tilavuudessa ja lyofilisoidaan, jolloin saadaan valkoista ainetta (12 mg) .
UV (pH 7/0,1-n fosfaattipuskuri) \ maks 299 nm (¢8130) IR (Nujol) 1760 cm ^ (y3-laktaami) NMR (D20) 6 1,26 (d, J = 6Hz, CH3CH(OH)), 1,29 (d, J = 6Hz, CH(CH3)3), 7,89 (s, NHCH), 7,96 (s, NHCH).
62 6 2 3 0 6 Lähtöaineen, metyyli-N-isopropyyli-formimidaatin, valmistus Isopropyyliformamidia (535 mg) käsitellään ekvivalentilla määrällä etyyliklooriformiaattia (440 jul) 2-3 tuntia typpisuo-jakaasussa 40 - 45°C:ssa. Seos pestään peräkkäin petrolieette-rillä, vedettömällä eetterillä ja bentseenillä, jolloin tuote jää jäljelle öljynä.
Esimerkki 26
— OH JZ H9CH=CH
* * il
Th--NH-C
— COOH
N-(N'-allyyli-formimidoyyli)tianmysiinin valmistus Tienamysiinin jäähdytettyyn näytteeseen (123 mg, 0,452 mmol) lisätään 13 ml kylmää 0,1-n fosfaattipuskuria (pH 7).
Liuos säädetään pH-arvoon 9 käyttäen 1-n natriumhydroksidia. Tähän emäksiseen liuokseen 2°C:ssa lisätään yhdellä kertaa etyyli-N-allyyliformimidaatti-hydrokloridia (0,3 g). pH laskee arvoon 7,3 ja saatetaan takaisin arvoon 8,5 lisäämällä natriumhydroksidia. Reaktioseosta sekoitetaan 2°C:ssa vielä 30 min ja pH säädetään arvoon 7 kylmällä 0,1-n rikkihapolla. Reaktio-seos analysoidaan käyttäen suurpainenestekromatografiaa C^g-Porosil-kolonnissa, joka on kehitetty 10-% vesipitoisella tetra-hydrofuraanilla, ja analyysi osoittaa ainoastaan jälkiä tiena-mysiinistä (retentioaika 5 minuuttia) ja olennaisesti puhdasta tuotetta (retentioaika 10,5 minuuttia). Reaktioseos kromato-grafoidaan käyttäen Dowex 50-X4 kolonnia (60 ml, Na+-sykli, 200 - 400 mesh'iä) ja eluoidaan vedellä virtausnopeudella 2 0,5 ml/cm /min. Hylätään ensimmäiset 400 ml eluaattia ja lyofi-lisoidaan seuraavat 150 ml tuotteen saamiseksi. Saanto 96 mg (69 %) .
UV ^maks 3°1 nm, 24,6 opt. tiheysyks. /mg, (N^OH sammutus), 90 % puhtaus IR (Nujol) antaa C = 0 kohdassa 5,67 um ja 5,90 um NMR (100 MHz, D^O) osoittaa tuotteen olevan syn- ja anti-N(N'- allyyliformimidoyyli)tienamysiinin 1:1 seosta.
63 62306 Lähtöaineen, etyyli-N-allyyli-formimidaatti-hydrokloridin valmistus
Etyyliklooriformiaatti (2,66 g, 24,47 mmol) lisätään ruiskun avulla N-allyyliformamidiin (2,08 g, 24,47 mmol) kuivassa pullossa typpisuojakaasussa. Saatua seosta sekoitetaan 25°C:ssa 2 tuntia,jona aikana kehittyy nopeasti CC^ita. Reaktioseosta kuumennetaan 45 C:ssa, kunnes kaasua ei enää kehity.
Esimerkki 27
f—OH
| N-CH.CF-Il 2 3
Th--NH-C^
H
— COOH
N-(N'-trifluorietyyli-formimidoyyli)tienamysiinin valmistus Tienamysiinin jäähdytettyyn näytteeseen (123 mg, 0,452 mmol) lisätään 15 ml kylmää 0,1-n fosfaattipuskuria (pH 7). Liuos säädetään pH-arvoon 9 lisäämällä 1-n natriumhydroksidia. Tähän emäksiseen liuokseen 0 - 2°C:ssa lisätään etyyli-N-(2,2,2-tri-fluorietyyli)formimidaattia (0,3 ml) dioksaanissa (2 ml) annoksittain 30 minuutin aikana. Reaktioseoksen pH pidetään arvossa 8,5 - 9 lisäyksen aikana, ja sekoitetaan seosta muutama minuutti. Imidaatin lisäyksen päätyttyä ja kun on saatettu pH arvoon 7 kylmällä 0,1-n rikkihapolla, HPLC g-”Porosil,,-käänteisfaasi, 10-% tetrahydrofuraania osoittaa uutta huippua kohdassa 12,2 min, mikä vastaa haluttua tuotetta. Seos kromatografoidaan käyttäen
Dowex 50x4 kolonnia (60 ml, 200 - 400 mesh'iä). Kolonni eluoidaan 2 vedellä virtausnopeudella 0,5 ml/cm /min. Esijuoksu hylätään ja tuotettan sisältävät fraktiot yhdistetään ja lyofilisoidaan, jolloin saadaan hydroskooppista kiinteätä ainetta 10,2 mg.
UV X . 302 nm.
maks Lähtöaineen, etyyli-N-(2,2,2-trifluorietyyli)formimidaatin valmistus
Etyyli-formimidaatti-hydrokloridia (0,555 g, 5 mmol), 2,2,2-trifluorietyyliamiini-hydrokloridia (0,677 g, 5 mmol) ja kaliumkarbonaattia (0,345 g, 2,5 mmol) suspendoidaan 20 ml:aan CH2CI2 ja käsitellään 2 ml:11a vettä. Seosta ravistellaan voimakkaasti 3 minuuttia. Orgaaninen faasi erotetaan ja vesifaasi 64 62306 uutetaan kahdesti 10 ml:n erillä CH2Cl2:ta. Yhdistetty orgaaninen faasi kuivataan ja CH2C12 tislataan Vigraeux-kolonnin kautta, jolloin saadaan etyyli-N-(2,2,2-trifluorietyyli)form-imidaatti.
NMR 6 1,33 X (CH3CH2); 3,8 q ( J = 10Hz, CF3CH2) 4,23 q (J = 7,5 Hz, CH3CH2), 7,6 S (H-C=N).
Esimerkki 28 — OH
N-CH COOH
t! 2
Th--NH-C
Ή COONa N-(N’-karboksimetyy li-ibrmimidoyy li)tienamysilni-natrium-suolan valmistus
Tienamysiini (130 mg) liuotetaan 0,1-n fosfaattipuskuriin (pH 7, 4 ml) ja lisätään yhdellä kertaa kiinteää natriummetyyli-N-karboksimetyyli-formimidaattia (500 mg). Liuoksen pH säädetään arvoon 8,5 käyttämällä 1-n natriumhydroksidia automaattisen byre-tin avulla. Sen jälkeen, kun on pidetty pH arvossa 8,5 25 minuuttia, se säädetään arvoon 7,0 käyttäen 2,5-n kloorivetyhappoa.
Liuos kromatografoidaan jäävedellä jäähdytetyssä kolonnissa Dowex 50-X4 hartsia ( 51 ml, Na+--sykli, 200 - 400 mesh'iä) ja eluoidaan deionisoidulla vedellä. Ensimmäinen kolonnitilavuus eluaattia yhdistetään ja väkevöidään tilavuuteen 7 ml. Tämä liuos kromatografoidaan jäävedellä jäähdytetyssä kolonnissa XAD-2 hartsia (53 ml).
2-4 kolonnitilavuudet otetaan talteen, ja yhdistetään ja lyo-filisoidaan, jolloin saadaan natrium-N-(N'-karboksimetyyli-form-imidoyyli) tienamysiini (25 mg).
UV (pH 7/0,1-n fosfaattipuskuri) ^ 300 nm (£-6390) IR (Nujol) 1755 cm-”' ( -laktaami) NMR (D20) 6 1,29 (d, J = 6Hz, CH2CH), 7,85 (s, NCH) 65 62306
Esimerkki 29 -OH
NH
H
Th--nhcch2ch2n3
-COOH
N-(-atsidopropioni-imidoyyli)tienamysiinin valmistus
Tienamysiinin (135 mg) liuokseen 10 ml:ssa 0,1-m fosfaatti- puskuria (pH 7) lisätään 1,2 g O-etyyli-3-atsidopropioni-imidaatti- hydrokloridia samalla pitäen liuoksen pH arvossa 8,5 lisäämällä 2,5-n natriumhydroksidia. Seosta sekoitetaan 0°C:ssa 0,5 tuntia, ja neutraloidaan 2,5-n kloorivetyhapolla pH arvoon 7,0, väke- vöidään tilavuuteen 5 ml ja kromatografoidaan käyttäen Dowex 50W x 8 (Na+ -muodossa) kolonnia (pituus 30 cm, halkaisija 3,8 cm).
Eluoidaan vedellä, jolloin saadaan 30 mg haluttua tuotetta.
Tuote osoittaa \ ΗτΟ UV A maks 300 nm HPLC osoittaa retentioaikaa 10 minuuttia verrattuna lähtöaineen arvoon 4,8 minuuttia samoissa olosuhteissa. (1,8" x 2', 'Bondapak" C^g-käänteisfaasikolonnin eluoituna 10-% tetrahydrofuraanilla virtausnopeudella 1,5 ml/min); elektroforeettinen liikkuvuus 5 mm kohti katodia arvoilla 50 V/cm, 20 min,0,05-m fosfaattipuskuri (pH 7) .
Esimerkki 30
—oh r0H
NH F
|l H iO)
Th--NHCCH2CH2N3 H2/Pd TH--NHCCH^H^H^ " —>
Leo® (I) (II) N-(3-aminopropioni-imidoyyli)tienamysiinin valmistus N-(3-atsidopropiomi-imidoyyli)tianmysiini (1)(49 mg 40 ml:ssa vettä) hydrataan vedyllä (1 atm) käyttäen katalysaattorina 10-% palladiumhiiltä 40 minuutin ajan. Saadun seoksen elektroforeesi- 66 623 06 analyysi osoittaa uutta tuotetta, joka liikkuu 30 mm kohti katodia ( 50 V/cm, 20 min, 0,05-m fosfaattipuskuri, pH 7) lähtöaineen (I) liikkuessa 5 mm kohti katodia. Tuotteen elektroforeettinen liikkuvuus vastaa odotetun tuotteen (II) liikkuvuutta.
Hydrauksesta saatu reaktioseos neutraloidaan 2,5-n kloori-vetyhapolla ja katalyytti suodatetaan pois. Suodos väkevöidään tilavuuteen 20 ml ja kromatografoidaan käyttäen XAD-2 hartsia (2,3 x 16 cm). Kolonnin eluoidaan vedellä ja lyofilisoidaan, jolloin saadaan tuote (II) hydrokloridina, saanto 23 mg.
UV^mi£s 301 n» (ε 7080) IR (Nujol) 1765 cm NMR (69 MHz, D20) 6 1,30 ppm (dubletti, 3), 2,60 - 3,72 ppm (multipletti, 11) ja 4,18 ppm (multipletti, 2). Esimerkki 31 N-nitroguanyyli-tienamysiinin valmistus Tienamysiini (131 mg) liuotetaan dimetyylisulfoksidin (10 ml), tri-n-butyyliamiinin (0.30 ml) ja 2-metyyli-1-nitro-2-tiopseudourean (0,3 g) liuokseen. Liuosta kuumennetaan vesihauteella 45°C:ssa samalla kun annetaan typpivirran voimakkaasti kuplia liuokseen. 50 minuutin kuluttua liuos väkevöidään suurtyhjössä tilavuuteen 1,0 ml ja liuotetaan 0,05-n fosfaattipuskurilla (pH 7, 7 ml). Reagoimaton tiopseudourea saostetaan ja poistetaan suodattamalla. Sen jälkeen kromatografoidaan liuos käyttäen Dowex 50-X4 hartsia ( 53 cm^, 200 - 400 mesh'iä, Na+-sykli) ja eluoidaan vedellä. N-nitroguanyyli-johdannainen eluoituu ensimmäisessä kolonniti-lavuudessa ja lyofilisoidaan kiinteän aineen saamiseksi (23 %).
UV (pH 7/0,1-n fosfaattipuskuri) λ 269 nm (€1000)
Elektroforeesi ( 40 V/cm, pH 7/0,1-n fosfaattipuskuri, 20 min) 3,0 cm kohti katodia.
Esimerkki 32
— OH
N-CH.-CH Il 2 3
Th--NHC-H
—co2h N-/N1 -etyyliformimidoyyljL/fclenamysiinin valmistus Tienamysiini (100 mg) liuotetaan 10 ml:aan 0,1-m fosfaatti-puskuria (pH 7,0) ja säädetään pH arvoon 8,5 - 9,0 2,5-n natrium- 67 62306 hydroksidilla ja pidetään pH arvo samana. Liuokseen lisätään 300 mg etyyli-N-etyyli-formimidaatti-hydrokloridia. Seosta sekoitetaan 23°C:ssa 10 minuuttia, sen jälkeen neutraloidaan pH-arvoon 7,0 käyttäen 2,5-n kloorivetyhappoa ja kromatografoi-daan käyttäen Dowex 50-X8 (Na-muoto) ioninvaihtokolonnia (pituus 25 cm, halkaisija 3,8 cm). Kolonni eluoidaan vedellä, jolloin otetaan 6,7 ml:na fraktioita. Fraktiot 40 - 90 yhdistetään, väkevöidään ja jäähdytyskuivataan, jolloin saadaan 15 mg kiinteää tuotetta. Tuotteen elektroforeesi arvoilla 50 V/cm, 20 min, 0,1-m fosfaattipuskuri (pH 7) osoittaa yhtä bioaktiivista vyöhykettä, joka liikkuu 2 mm kohti katodia.
UV λ H2? 301 nm mäks NMR (100 MHz, D20) 5 7,77 (S) ja 7,82 (S) formimidoyyli-CH). Esimerkki 33
— OH
N-
Th--J
Ti
— COOH
N-/N1-syklopropyyliformimidoyyli7tienamysiinin valmistus Tienamysiini (100 mg) liuotetaan 10 ml:aan 0,1-m fosfaatti-puskuria (pH 7) ja säädetään pH arvoon 8,5 - 9,0 pitäen pH tässä arvossa samalla lisäten pisaroittain 300 mg etyyli-N-syklopropyy-liformimidaatti-hydrokloridia. Seosta sekoitetaan 23°C:ssa 40 minuuttia,jonka jälkeen se neutraloidaan ja kromatografoidaan käyttäen Dowex 50x8 (Na+-rauodossa) ioninvaihtokolonnia (pituus 25 cm, halkaisija 3,8 cm). Kolonni eluoidaan vedellä, ja otetaan 6,5 ml:n fraktioita. Fraktiot 43-95 yhdistetään, väkevöidään ja jäähdytyskuivataan, jolloin saadaan 54 mg kiinteää tuotetta. Tuotteen elektroforeesi osoittaa yhtä bioaktiivista vyöhykettä, joka liikkuu 10 mm kohti katodia (50 V/cm, 1 tunti, 0,05-m fosfaattipuskuri, pH 7).
OTÄ"iks 301 nm NMR (100 MHz, D20) 0,60 - 1,30 ppm (m, syklopropyyli) ja 7,80 ppm (formimidoyyli-CH).
se 6230 6 Lähtöaineen, etyyli-N-syklopropyyliformimidaatin, valmistus Etyyliklooriformimdaattia (4,078 g, 37,58 mmol) lisätään ruiskun avulla N.syklopropyyliformamidiin (3,194 g, 37,58 mmol) kuivassa pullossa typpisuojakaasussa. 30 sekunnin kuluttua alkaa kaasun voimakas kehittyminen. Saatua reaktioseosta sekoitetaan 25°C:ssa kunnes kaasun muodostumista ei enää todeta (n. 4 tuntia) ja saatetaan viskoosi sen jälkeen tyhjöön (0,5 torr) tunnin ajaksi reagoimattoman etyyliklooriformiaatin poistamiseksi.
Tuotteen NMR-analyysi osoittaa formyyli-protonia kohdassa S 9,37 (leveä singletti, CDCl^-liuos).

Claims (2)

  1. 69 6 2 3 0 6 Patenttivaatimus: Menetelmä antibioottisina aineina käyttökelpoisten tienamysii-nin substituoitujen N-metyleeni-johdannaisten valmistamiseksi, joiden kaava on OH _/N_SCH-CH N=C-R λ Δ I 1 2 NR R II J-N-J-COOH O jossa R on vetyatomi, alempi alkyyliryhmä, fenyyli-, pyridyyli-, tiatsolyyli-, trifluorimetyyli-,^amino-, atsidoalkyyli- tai aminoalkyyliryhmä tai ryhmä , R1 on vetyatomi, alempi alkyyliryhmä, alempi alkenyyliryhmä, alempi alkyylitioalkyyli- ryhmä, bentsyyli-, dialkyy1iamino-, trifluorietyyli-, karboksi- 2 metyyli-, alkoksi- tai nitroryhmä, ja R on vetyatomi tai alempi 1 2 alkyyliryhmä, tai R ja R muodostavat yhdessä typpiatomin kanssa piperidyylirenkaan, ja näiden yhdisteiden farmakologisesti hyväksyttävien happoadditiosuolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että yhdiste, jonka kaava on OH -f'N—SCH2CH2NH2 ^- N.-—COOH 111 tai sen sopivaa O- ja/tai karboksyyli-johdannaista saatetaan reagoimaan kaavan NR1R2 H o R-C-X R’* IV mukaisen imidoesterin kanssa, jossa kaavassa X°R" on poistuva ryhmä, jolloin X° on 0 tai S ja R" on alempi alkyyli tai vastaa-12 va, ja R, R ja R merkitsevät samaa kuin edellä, tai kaavan 70 62306 R1R2N®=C-X· f-N | X'^ V R mukaisen imidohalogenidin kanssa, jossa kaavassa X' on halogeeni, 1 2 R, R ja R merkitsevät samaa kuin edellä, tai kaavan X°R" 1. f R RN-C=N-R VI o 12 mukaisen yhdisteen kanssa, jossa kaavassa X , R", R, R ja R merkitsevät samaa kuin edellä, jonka jälkeen saatu yhdiste muutetaan happoadditiosuolaksi. 62306 71 Förfarande för framställning av säsom antibiotiska medel användbara substituerade N-metylen-derivat av tienamycin, vilka har formeIn OH " ^---rX^s>-SCH-CH_N=C-R Z Z I
  2. 12 II NR R i--n------i—COOH O ^ där R är en väteatom, en lägre alkylgrupp, en fenyl-, pyridyl-, tiazolyl-, trifluormetyl-/ amino-, azidoalkyl- eller aminoalkyl- grupp eller gruppen , R^ är en väteatom, en lägre alkyl- grupp, en lägre alkenylgrupp, en lägre alkyltioalkylgrupp, en bensyl-, dialkylamino-, trifluoretyl-, karboximetyl-, alkoxi- 2 eller nitrogrupp, och R är en väteatom eller en lägre alkylgrupp, 1 2 eller R och R bildar tillsammans med kväveatomen en piperidyl-ring, och av dessa föreningars farmakologiskt godtagbara syraad-ditionssalter, kännetecknat därav, att en förening med formeIn OH -f^N-SCH CH NH \ III J-N--i—COOH QT eller ett lämpligt O- och/eller karboxylderivat av denna omsättes med en imidoester med formeIn NR1R2 R-C-X°R" IV där X°R" är en avgäende grupp, varvid X° är 0 eller S och R” är 1 2 en lägre alkyl eller motsvarande, och R, R och R betecknar det-samma som tidigare, eller med en imidohalogenid med formeln
FI763308A 1975-11-21 1976-11-18 Foerfarande foer framstaellning av substituerade n-metylen-derivat av tienamycin anvaendbara saosom antibiotiska aemnen FI62306C (fi)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI821262A FI63030C (fi) 1975-11-21 1982-04-08 Foerfarande foer framstaellning av som antibioter anvaendbara substituerade n-metylenderivat av tienamycin

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US63429675A 1975-11-21 1975-11-21
US63429675 1975-11-21
US67626176A 1976-04-12 1976-04-12
US67626176 1976-04-12
US73365476A 1976-10-18 1976-10-18
US73365476 1976-10-18

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI763308A FI763308A (fi) 1977-05-22
FI62306B true FI62306B (fi) 1982-08-31
FI62306C FI62306C (fi) 1982-12-10

Family

ID=27417545

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI763308A FI62306C (fi) 1975-11-21 1976-11-18 Foerfarande foer framstaellning av substituerade n-metylen-derivat av tienamycin anvaendbara saosom antibiotiska aemnen

Country Status (27)

Country Link
AT (1) AT358168B (fi)
AU (1) AU512383B2 (fi)
BG (1) BG34037A3 (fi)
CA (1) CA1083577A (fi)
CH (2) CH632510A5 (fi)
DD (1) DD127742A5 (fi)
DE (1) DE2652679A1 (fi)
DK (1) DK157401C (fi)
EG (1) EG12261A (fi)
ES (1) ES453501A1 (fi)
FI (1) FI62306C (fi)
FR (1) FR2332012A1 (fi)
GB (1) GB1570990A (fi)
GR (1) GR62072B (fi)
HK (1) HK29683A (fi)
HU (1) HU180865B (fi)
IE (1) IE44433B1 (fi)
IL (1) IL50911A (fi)
KE (1) KE3286A (fi)
NL (1) NL189297C (fi)
NO (1) NO153298C (fi)
NZ (1) NZ182630A (fi)
PH (1) PH16714A (fi)
PL (1) PL110937B1 (fi)
PT (1) PT65865B (fi)
SE (1) SE427841B (fi)
SG (1) SG10983G (fi)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1593524A (en) * 1976-11-19 1981-07-15 Merck & Co Inc 1-carba-2-penem-3-carboxylic acids
DK170778A (da) * 1977-05-05 1979-01-15 Merck & Co Inc Fremgangsmaade til fremstilling af n-alkyl-n-iminomethyl-derivater af thienamycin
US4232030A (en) * 1977-09-15 1980-11-04 Merck & Co., Inc. Substituted N-methylene derivatives of thienamycin sulfoxide and sulfone
DK153486C (da) * 1978-07-03 1988-11-28 Merck & Co Inc Analogifremgangsmaade til fremstilling af krystallinsk n-formimidoyl-thienamycin-monohydrat
EP0044170A1 (en) * 1980-07-11 1982-01-20 Beecham Group Plc Beta-lactam antibiotics, their preparation and use
WO1992004054A1 (en) * 1990-08-30 1992-03-19 STATE OF OREGON, acting by and through THE OREGON STATE BOARD OF HIGHER EDUCATION, acting for and on behalf of THE OREGON HEALTH SCIENCES UNIVERSITY, PORTLAND, OREGON, and THE UNIVERSITY OF OREGON, EUGENE, OREGON, Johnson Hall, University of Oregon Substituted amidines having high binding to the sigma receptor and the use thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1004670A (en) * 1963-04-23 1965-09-15 Beecham Res Lab Penicillins
GB1348985A (en) * 1970-06-16 1974-03-27 Merck & Co Inc Esters of cephalosporin compounds
US3950357A (en) * 1974-11-25 1976-04-13 Merck & Co., Inc. Antibiotics

Also Published As

Publication number Publication date
HK29683A (en) 1983-08-26
PT65865A (en) 1976-12-01
NL189297C (nl) 1993-03-01
NO153298C (no) 1986-02-19
PL110937B1 (en) 1980-08-30
NL189297B (nl) 1992-10-01
FI763308A (fi) 1977-05-22
AT358168B (de) 1980-08-25
DK157401C (da) 1990-05-21
HU180865B (en) 1983-04-29
SE427841B (sv) 1983-05-09
NO763958L (fi) 1977-05-24
CH632510A5 (en) 1982-10-15
IL50911A0 (en) 1977-01-31
CA1083577A (en) 1980-08-12
IL50911A (en) 1981-01-30
PL193809A1 (pl) 1978-01-16
EG12261A (en) 1978-12-31
FI62306C (fi) 1982-12-10
DD127742A5 (de) 1977-10-12
GR62072B (en) 1979-02-20
DK157401B (da) 1990-01-02
NO153298B (no) 1985-11-11
PH16714A (en) 1984-01-25
DE2652679C2 (fi) 1990-03-01
CH633800A5 (en) 1982-12-31
DE2652679A1 (de) 1977-06-02
IE44433L (en) 1977-05-21
KE3286A (en) 1983-06-17
NZ182630A (en) 1979-07-11
DK523576A (da) 1977-05-22
NL7612939A (nl) 1977-05-24
ATA863476A (de) 1980-01-15
SG10983G (en) 1983-12-16
FR2332012B1 (fi) 1978-11-17
FR2332012A1 (fr) 1977-06-17
BG34037A3 (en) 1983-06-15
GB1570990A (en) 1980-07-09
AU512383B2 (en) 1980-10-09
ES453501A1 (es) 1978-03-01
IE44433B1 (en) 1981-12-02
PT65865B (en) 1978-10-12
AU1964776A (en) 1978-05-25
SE7612963L (sv) 1977-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3587126T2 (de) Carbapenem-Derivate und sie enthaltende Zusammensetzung.
FI84826B (fi) Foerfarande foer framstaellning av 6 -(1-hydroxietyl-2-substituerad-2-karbapenem-3-karboxylsyror anvaendbara som laekemedel.
US4337199A (en) Antibiotic β-lactam compounds, production thereof, and their use as antimicrobial agent
KR100325562B1 (ko) 리파마이신의36-유도체및항미생물제로서의그의용도
NO870981L (no) Mellomprodukter.
FI62306B (fi) Foerfarande foer framstaellning av substituerade n-metylen-derivat av tienamycin anvaendbara saosom antibiotiska aemnen
KR880001069B1 (ko) 카르바페넴 유도체및 그의 제조방법
NO177714B (no) Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive peptidderivater
JPS60233077A (ja) １‐テヘロ‐６‐〔１‐ヒドロキシエチル〕‐２‐ｓｒ↑８‐１‐カルバデチアペン‐２‐エム‐３‐カルボン酸
CH628051A5 (en) Process for the preparation of N-alkylated derivatives of thienamycin
EP0318767A2 (de) Unter physiologischen Bedingungen spaltbare Ester von pharmakologisch wirksamen Carbonsäuren
JPS6259107B2 (fi)
BE848545A (fr) Derives n-methylene substitues de thienamycine,
DE2815157A1 (de) 3-(2-aminoaethylthio)-6-aethyl-7-oxo-1- azabicyclo eckige klammer auf 3.2.0 eckige klammer zu hept-2-en-2-carbonsaeure
US4560508A (en) 4-Cyano-2-azetidinones and production thereof
DE2652675C2 (fi)
DE3833693A1 (de) Stabile oxapenem-3-carbonsaeuren und ihre verwendung als ss-lactamasehemmer
US6482818B2 (en) C-2 S/O-and S/N formaldehyde acetal derivatives of carbapenem-3-carboxylic acids and their use as antibiotics and β-lactamase inhibitors
GB1570987A (en) Thienamycin derivatives
KR800001674B1 (ko) 티에나마이신의 치환된 n-메틸렌 유도체 제법
DE2724560A1 (de) O-derivate von thienamycin
JPS58183693A (ja) ペニシリン誘導体、その製法及びそれを含む製薬組成物
DE3346775A1 (de) Oxacephalosporine und verfahren zu ihrer herstellung
JPH034554B2 (fi)
CZ2001277A3 (cs) Nové C2 S/O- a S/N-formaldehydacetalové deriváty karbapenem-3-karboxylových kyselin a jejich použití jako antibiotik a inhibitorů Blaktamáz

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired
MA Patent expired

Owner name: MERCK & CO., INC.