DK157401B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af substituerede n-methylenderivater af thienamycin - Google Patents

Description

x DK 157401B

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte substituerede N-metylenderivater af thienamycin eller farmaceutisk acceptable salte eller estere deraf, som har antibiotiske egenskaber.

5 Thienamycin er genstand for USA patent nr. 3 950 357. Thienamycin har vist sig at have følgende struktur: formel øverst side 1 (norsk tekst) 10

Der er et fortsat behov for nye antibiotika. Uheldigvis er der ingen statisk effektivitet af et givet anti-15 biotikum, fordi fortsat anvendelse af et hvilket som helst sådant antibiotikum selektivt bevirker dannelse af resistente stammer af patogener. Desuden lider de kendte antibiotika af den ulempe, at de kun er virksomme over for visse typer mikroorganismer. Derfor fortsætter efter-søgningen efter hidtil ukendte antibiotika.

Det har uventet vist sig, at de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser er bredspektrede antibiotika, som er nyttige i dyre- og humanterapi og i **5 ikke-levende systemer.

Det tilsigtes med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en hidtil ukendt gruppe antibiotika, som har thienamycins basiske ringstruktur, men som betegnes som 30 substituerede N-methylenderivater deraf. Disse antibiotika er virksomme mod et bredt spektrum af patogener, som repræsentativt omfatter såvel grampositive bakterier, såsom S. aureus, S. pyogenes og B. subtilis, som gramnegative bakterier, såsom E. coli, Proteus 35 morganii, Klebsiella, Serratia og Pseudomonas. Det

DK 157401 B

2 tilsigtes endvidere med opfindelsen at fremstille ikke-giftige farmaceutisk acceptable salte og estere deraf.

De substituerede N-methylenthienamycin-derivater, der 5 kan fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, har følgende strukturformel: 0H R1 Ά.-/V SCB2CT2Ni-<R2

R II

10 £ .....li_IL_cooh og p-t-butylbenzyl-, 3-methyl-2-buten-1-yl- og pivaloxy- methylestere deraf, og farmaceutisk acceptable salte deraf, hvori R1 er hydrogen, alkyl med 1-6 carbonatomer, 15 alkenyl med 2-6 carbonatomer, cyano, cycloalkyl eller cycloalkenyl med 3-6 carbonatomer, alkylthioalkyl, carbo- xyalkyl eller dialkylamino med 1-6 carbonatomer, 2 1

trifluorethyl eller benzyl, og R er hydrogen, eller R

2 12 og R er alkyl med 1-6 carbonatomer, eller R og R er 20 sammen med nitrogenatomet piperidyl, og R er hydrogen, fenyl, pyridyl, thiazolyl, amino, aminoalkyl, azidoalkyl, alkyl, trifluormethyl, alkoxyalkyl, thioalkyl eller alkyloxalimid med 1-6 carbonatomer i alkylgrupperne og alkenyl med 2-6 carbonatomer, eller hvor R er -0Ra eller 25 -SRa, hvori Ra er methylbenzyl, ethylallyl, 2-thie- nylmethallyl, p-nitrobenzyl eller CHg-O-CH^.

De omhandlede forbindelser kan fremstilles ud fra thiena-mycin I eller et egnet carboxylderivat deraf.

30 Sådanne carboxylderivater af thienamycin har formlen:

OH

/V_/N-SCH2CH2*H2 _N 'L COOR·5' 35 0 le 3 ’ hvori gruppen R omfatter konventionelle beskyttende

DK 157401 B

3 eller carboxyl-blokerende grupper. I denne forbindelse henvises til US patentskrift nr. 3 697 515.

Udgangsmaterialerne Ic kan fremstilles som angivet i det 5 følgende, men det bør bemærkes, at direkte forestring uden beskyttelse af aminogruppen også er mulig.

• OH OH OH

afblok.

1 o Th· -NR1 ' R1 ' -Th· -NR1' R1' -Th- -NH2 COOH COX'R2' COX'R2' 1 Id Ic 15 » 1' 2' hvori X = O, R og R er acyl og Th betegner thiena-3 ’ mycinkernen. R har den tidligere angivne betydning.

I almindelighed udføres reaktionen l-*Ic på konventionel 20 måde. Sådanne måder omfatter 1) Omsætning af 1 (eller I) med en diazoalkan, såsom diazomethan, phenyldiazomethan og diphenyldiazomethan, i et opløsningsmiddel, såsom dioxan, ethylacetat og 25 acetonitril, ved en temperatur på 0 °C til tilbage svalingstemperaturen i fra få minutter til 2 timer.

Omsætning af et alkalimetalsalt af 1 med et aktiveret alkylhalogenid, såsom methyliodid, methylbromid eller 30 m-phenoxybenzylbromid, p-t-butylbenzylbromid eller pivaloyloxymethylchlorid. Reaktionen kan passende udføres i et opløsningsmiddel, såsom hexamethylphos-phoramid, ved en temperatur på 0 til 60 eC i fra nogle minutter til 4 timer.

35 2

Omsætning af 1 med en alkohol, såsom methanol, ethanol eller benzylalkohol. Denne reaktion kan udføres i 4

DK 157401 B

nærværelse af et carbodiimid-kondenseringsmiddel, såsom dicyclohexylcarbodiimid. Reaktionen kan passende udføres ved en temperatur på 0 °C til tilbagesvalingstemperaturen i 15 minutter til 18 timer i et 5 opløsningsmiddel, såsom chloroform, methylchlorid el ler methylenchlorid.

4) Omsætning af et N-acyleret syreanhydrid af 1 fremstillet ved at omsætte den frie syre 1 med et syre- 10 chlorid, såsom ethylchlorformiat ellpr benzylchlor- formiat, med en alkohol som angivet under 3) under samme reaktionsbetingelser som anført under 3). Anhydridet fremstilles ved at omsætte 1 og syre-chloridet i et opløsningsmiddel, såsom tetrahydrofuran 15 eller methylenchlorid, ved en temperatur på 25 °C til tilbagesvalingstemperaturen i 15 minutter til 10 timer.

5) Omsætning af labile estere af 1, såsom trimethyl- 20 silylesteren eller dimethyl-t-butylsilylesteren, med X°, hvor X° er halogen, såsom brom eller chlor, og 3' R er som angivet i det foregående, i et opløsningsmiddel, såsom tetrahydrofuran, methylenchlorid eller lignende, ved en temperatur på 0 °C til tilbage-25 svalingstemperaturen i 15 minutter til 16 timer.

Reaktionen kan illustreres ved hjælp af følgende skema:

• —OTMS i—OTMS r-OTMS

Th—NHTMS N-acylering . Th--NR1 TMS forestring^ τίΐ._Μρ1·'φΜ<; 30 3'

L COOTMS Λ-COOTMS L COOR

— OH

mild hydrolyse^ Th- - NHR1' 35 LcOOR3' hvor TMS er triorganosilyl, såsom trimethylsilyl, og de øvrige symboler er som anført i det foregående.

DK 157401 B

5

Analogifremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte.

Passende opløsningsmidler afhængigt af thienamycin-sub-5 stratet og reagenset er vand, dioxan, tetrahydrofuran, dimethylformamid, chloroform, acetone og acetonitril eller blandinger deraf. Reaktionen udføres ved en temperatur på 0 °C til ca. 25 °C i 1 til ca. 6 timer.

Disse reaktionsbetingelser er ikke kritiske, så længe 10 reaktionsmidlet er inert eller i alt væsentligt inert over for det tilsigtede reaktionsforløb. Passende reagenser omfatter følgende: a) Imidoestere: 15 Rv

® N

R-C-X°R"

X° = O eller S

20 Methylformimidat, ethylformimidat, methylacetimidat, ethylacetimidat, methylbenzimidat, ethyl-4-pyridyl-car-boximidat, methylphenylacetimidat, methyl-3-thienylcarbo-ximidat, methylazidoacetimidat, methylchloracetimidat, methylcydohexylcarboximidat, methyl-2-furylcarboximidat, 25 methyl-p-nitrobenzimidat, methyl-2,4-dimethoxybenzimidat, ethyl-N-methylformimidat, methyl-N-methylformimidat og methyl-N-isopropyl-formimidat og lignende.

Sådanne imidoesterreagenser a) fremstilles passende ved 30 en vilkårlig af en række kendte metoder, såsom 1) Omsætning af et nitril, RCN, med en lavere alkanol i nærværelse af HC1 ifølge den velkendte Pinner-syntese. 1 2) Omsætning af et nitril, RCN, med en lavere alkanol i nærværelse af en base. Reaktionen udføres typisk ved 0-40 °C i nærværelse af et overskud af alkoholen med en

DK 157401 B

6 katalytisk mængde af et alkalimetaloxid på 15 minutter til 4 timer.

O

II

5 3) Omsætning af et amid, RCNHR^, med et alkylchlorfor- miat, såsom methylchlorformiat, ved 25-45 °C i 1 til 4 timer.

4) Omsætning af et N-substitueret amid,

10 O O

II II

RCNHR1 eller RCNR^R2, med et ækvivalent af et alkyleringsmiddel, såsom tri-ethyloxoniumfluorborat, i et inert opløsningsmiddel, så-15 som ether eller chloroform, ved 0 til 23 °C i 10 minutter til 2 timer.

5) Overføring af en let tilgængelig imidoester 20 25 1 35

DK 157401 B

7 RCNR' i OR", 5 hvor R kan være hydrogen, til den ønskede imidoester, RCNR1 i OR" 10 ved omsætning af førstnævnte med en alkylamin, R'NH2, i en blanding af vand og et dermed ublandbart opløsningsmiddel, såsom ether eller chloroform, ved 0 til 23 °C i 5 minutter til 1 time.

15 b) Substituerede imidohalogenider:

Chlorpiperidinomethyliumchlorid, 20 chlordimethylforminiumchlorid, chlordiethylforminiumchlorid og lignende.

Sådanne imidohalogenidreagenser (b) fremstilles passende 25 ved en vilkårlig af en række kendte metoder, såsom 1) omsætning af et Ν,Ν-disubstitueret amid, 0 30 RCNR1R2, med et halogeneringsmiddel, såsom thionylchlorid, phosgen eller phosphorpentachlorid, i et inert opløsningsmiddel, 35 såsom chloroform eller methylenchlorid, ved 0 til 40 °C i 1 til 5 timer.

DK 157401 B

8 c) -OR-pseudourinstoffer og -SR-pseudothiourinstoffer: X"R°

5 R1R2N=NR

O-methylpseudourea, S-methylpseudothiourea, S-methylpseu-dothionitrourea, 0-2,4-dichlorfenyl-pseudourea, S-p-nitrofenyl-pseudothiourea, Ο-Ν,Ν-trimethylpseudourea og 10 lignende.

Reaktionen, som involverer reagenserne (a), kan repræsenteres ved hjælp af følgende reaktionsskema: 15 or3 _A\_SCH-CH-NH- I 3' J_Λ_LU cox * o 20 1 R'

K

u R-C-OR" 25 ψ OR3 Λ—A- SCH-CH,N=C-NHR' II 2 J k __N_L COX’R3

Jy o 30 hvor OR" er den forladende gruppe fra imidoester- 3« 3 35 reagenset, R, R , R og X' er som anført i det fore- 31 gående, og R' er H eller R . Denne reaktion er særlig 3 3' velegnet til udførelsesformer, hvor R og R er hydro-

DK 157401 B

9 gen, og X' er oxygen.

Reaktionen, som involerer reagenserne (b), kan repræsenteres ved hjælp af følgende skema: 5 R Q r- 3 1 2 + 1 . OR .

R1« N =CX'_ Λ Y H i 2 “ ✓/%Y_Y/\_SCH2CH2N=C-NR R X,(S> 10 1 —:-> FZL1cox'r3' k _ O —'

OH

mild hydrolyse. /\-

16 .iJJicooH

Ό 2 20 hvor alle symboler er som ovenfor anført. Når produkt 2 3 3» ønskes, er passende betydninger af R og R trime-thylsilyl, og X' er oxygen.

25

Den reaktion, som involverer reagenserne (c), kan repræsenteres ved følgende skema: 1 35

DK 157401 B

10

OH

-/\-SQImCH^NH, , , ·,

I i il 1 λ rVnW

J_N—-i—cox'r3 i, „o

Oy 5 OH ^ i /V /nr1r2

/Y_/\-SCH2C„rcXNRlH

10 λ__h____L_cox'r3 0^ 3' 1 2 hvor X1, R , R og R er som ovenfor anført, X" er oxygen eller svovl, og R^ er som angivet og fortrinsvis lavere alkyl.

15

Passende opløsningsmidler for sådanne reaktioner omfatter vand og pufrede vandige polære organiske opløsningsmiddelblandinger ved pH 7 til 9 eller vandfrie polære organiske opløsningsmidler, såsom dimethylformamid eller 20 hexamethylphosphoramid, ved en temperatur på 0 til 40 °C i 1 til 24 timer.

Forbindelserne med formlen II danner en lang række forskellige farmakologisk acceptable salte, såsom 25 syreadditionssalte, f.eks. med saltsyre, hydrogenbromid, svovlsyre, salpetersyre, toluen-p-sulfonsyre og methan-sulfonsyre. Salte af forbindelserne er farmakologisk acceptable ikke-giftige derivater, som kan anvendes som den aktive bestanddel i passende former for farmaceutiske 30 enhedsdoser. De kan desuden kombineres med andre lægemidler til opnåelse af præparater med et bredt aktivitetssprektrum.

De hidtil ukendte forbindelser fremstillet ved fremgangs-35 måden ifølge opfindelsen er værdifulde antibiotika, som er aktive over for forskellige gram-positive og gramnegative bakterier, og som følgelig finder anvendelse i 11

DK 157401 B

humanmedicinen og veterinærmedicinen. Forbindelserne II kan derfor anvendes som antibakterielle lægemidler til behandling af infektioner forårsaget af gram-positive eller gram-negative bakterier, f.eks. mod Staphylococcus aureus, Escherishia coli, Klebsiella pneumoniae,

Serratia, Salmonella typhosa, Pseudomonas og Bacterium proteus. De antibakterielle midler kan endvidere anvendes som tilsætning til dyrefoder til at konservere foderet og som desinfektionsmidler.

Den antibakterielle aktivitet af et udvalg af forbindelserne fremgår af det følgende.

DK 157401 B

O „ in vo 5 CO VO CO C'' vo OJ (0 co - ·* * ' _k (dramorHcscoo co 2 o c

E -H

OtD m Ό C co cn i«

Oh oo vo oo o- m n Φ Φ o4 - *· - v ca CO CQ O H 04 00 o tU 2

VO

h Ίφ Η σ> ιΗ Γ4 vo

φ VO 00 N 00 'ί H

4-) Φ 04 - - - > ' omcQooooo - (0 O 2 Λ (0 o o

U H IS

φ O rji H IN oo N

4J VO Η H 04 04 H

g 04 «.·.*··> * λ ω cQ o o o o o H 2 E \ O) =i w "i vo 00 IN 00 OJ CT>

. OV 04 H 04 00 O

O . C4 '

g CQ O O O O O

O 2 04 X Ή

t-1 H

0) 0 04 _ ^ TJ Q 00 H CO CJi 00

g .^jitJOO^VOH

φ H 04 *·**·* * u m o o o o o Φ 2 Λ r| Δ

C

H

Η 'tf (0 r-l i—l r4 r4 t—l 04

g 00 O O O O O

ri ffl 04 * * - * *

g g CQ O O O O O

•Η Φ 2 E 3 Φ in • 00 00 'tf 04 <4* 04

CQ CTi O O O O O

04 V V K ». «.

CQ O O O O O

2 ^ps k . w æ o k oo

1-4 ttJ

tu ta as w o w d co Π m oi s S k z < &

TABEL II

DK 157401B

13 OH λ

,/\ Λ-SOh CH 2N=C-N/R

5 f Γ k v

_N J—COOH

O

Minimal inhibe- 10 ringskoncen tration ug/ml

Forbindelse - 1 2 (eks. 37) R R R S.aureus E.coli 15 1.) H -CH2-C=CH2 H 0,16 0,62 CH3 2. ) H H 0,05 0,3 20 /> 3. ) H _/ J H 0,06 0,56 4. ) H “^3 H 0 02 ° 38 25 5.) H -CH3 -CH(CH3)2 0,09 1,1 6. ) -CH3 -CH(CH3)2 H 0,09 0,89 7. ) -CH=CH2 Η H 0,18 0,98 30 8. ) SCH3 CH3 H - 0,29 9. ) H -C=N H 0,07 0,06

Forbindelserne med formlen II kan anvendes alene eller i kombination som aktiv bestanddel af et vilkårligt af en 35 14

DK 157401 B

række farmaceutiske præparater. Disse antibiotika og deres tilsvarende salte kan anvendes på kapselform eller som tabletter, pulvere eller flydende opløsninger eller som suspensioner eller eliksirer. De kan administreres 5 oralt, intravenøst eller intramuskulært.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere ved hjælp af efterfølgende eksempler, hvori thienamycin-kernen (I, foroven) er repræsenteret ved følgende symbol: 10

-OH

Th--NH2 15 L-cooh hvor den sekundære alkoholgruppe, aminogruppen og car-boxylgruppen er illustreret. Således kan de omhandlede forbindelser illustreres ved formlen 20 —OH R1 /

Th--N=C-N

I \ 2

25 R R

—COOH

II

1 2 30 hvor R, R og R har den ovennævnte betydning.

35 EKSEMPEL 1

DK 157401 B

15

—OTMS

5 Th--NHTMS eller TH(TMS)3

-COOTMS

TMS = trimethylsilyl 10

Præparation af silyleret thienamyoin

Thienamycin (80,0 mg) suspenderes i 40 ml tetrahydrofuran (THF) under en -atmosfære og koncentreres til 10 ml; 15 hexanmethyldisilazan (1,0 ml), og trimethylchlorsiilan (300 al) tilsættes. Blandingen omsættes i 20 minutter ved 25 °C under kraftig omrøring. Suspensionen centrifugeres herefter til fjernelse af ammoniumchlorid. Den ovenstående væske inddampes til en olie under en ni-20 trogenstrøm for yderligere reaktion.

EKSEMPEL la

Cl®

25 \ ®/-\ r-OH

yP=N / \ H f

H >V_/ i:%Q

Thienamycin ---—*-) ^ _coow 30

Præparation af thienamycin-N-piperidin-l-yl-methylenderi-vat

Thienamycin (57 mg, 162 amol) silyleres ved ovennævnte 35 procedure. Det silylerede antibiotiske stof TH(TMS)3, opløses i methylenchlorid (6 ml) i en med skillevæg lukket kolbe under positivt nitrogentryk og afkøles på

DK 157401 B

16 tøris-acetone-bad. Til opløsningen, der omrøres med magnetisk omrører, sættes en opløsning (100 ul) triethylamin (644 umol) i methylenchlorid. Dette følges af tilsætning af en opløsning af chlorpiperidinomethyliumchlorid (67 5 mg, 405 umol) i methylenchlorid (465 ul). Efter en time på tørisbad sættes reaktionsopløsningen hurtigt til en tetrahydrofuranopløsning ved pH = 7 indeholdende 0,1 N phosphatpuffer (1:1) (50 ml). Blandingen inddampes derefter under vakuum til opnåelse af 10 ml homogen 10 opløsning. Opløsningen vaskes to gange med ethylacetat (2 x 5 ml) og ether (2 x 5 ml) og evakueres i kort tid.

Denne vandige opløsning kromatograferes herefter på XAD- 2-harpikskolonne (60 ml lag). Produktet elueres i 10% vandig tetrahydrofuran (efter eluering med vand) til 15 opnåelse af 12,9 mg (22% produkt) målt i opløsning under antagelse af e s 8030 gældende for thienamycin. Papirkromatografi R£ = 0,42 (4:1:5, n-BuOH: EtOH:vand).

EKSEMPEL 2 20 *“ , Γ°ΗΗ + NH,

HjC-O-C-Ø _l.rS'

Thienamycxn v L

“ * o 25 Leo®

Præparation af N-benzimidoylthienamycin 30 Thienamycin (59 mg, 212 umol) opløses i en 33% N,N- dimethylformamid pH = 7 phosphatpuffer (0,05 N) opløsning (4,5 ml) og indstilles til pH = 9,5 med 2,5 N NaOH med en automatisk dispenseringsburette. Opløsningen omrøres med magnetisk omrører ved 25 °C, og der tilsættes straks 35 methylbenzimidat. HC1 (340 mg, 1981 mmol). Efter 30 minutter ekstraheres opløsningen to gange med samme rumfang chloroform og indstilles med fortyndet vandig

DK 157401 B

17 phosphorsyre til pH = 7,0. Den puf rede opløsning kromatograferes på XAD-2 harpiks (65 ml). Kolonnen elueres først med vand efterfulgt af 10% vandig tetrahydrofuran, som eluerer produktet. Denne fraktion 5 inddampes til halvdelen af sit rumfang og frysetørres til dannelse af 50 mg af produktet. Elektroforetisk mobilitet (50 V/cm, 20 min., pH = 7, 0,1 N phopsphorpuffer) er 1,5 cm mod anoden.

10 UV kmax=300 nm (e=6960) pH = 7 0,1 N phosphatpuffer.

EKSEMPEL 3 15 Γ0Η NH /-λ pOH ©

Th mBrCHr-< 0}~C (CH-J _ ^ -> ThT-NHC<@ LC02H —C02C?2 20 C(CH3)3 3γΘ

Præparation af N-benzimidoylthienamycin, p-tert-butylben-zylester 25

Benzimidoylthienamycin (3,2 mg) suspenderes i hexamethyl-phosphoramid (75 ul) indeholdende p-tert-butylbenzyl-bromid (3,8 ul) og omrøres magnetisk ved 22 °C. Efter 45 minutter opstår en opløsning, som omrøres i yderligere 1 30 time. Produktet udfældes derefter af opløsningen med ether, og det urene produkt kromatograferes på en 250 u tyk silicagelplade, der udvikles i 7:3 chloroform: ethanol. Båndet med Rf = 0,6 isoleres og elueres med ethanol til dannelse af N-benzimidoyl-thienamycin, p-35 tert-butylbenzylester-hydrobromid. Massespektrum m/e 521 (M+), 487, 444, 418, 341, 323, 297, 226, 147.

EKSEMPEL 4

DK 157401 B

18 5 i-OH ©

Th——I?HC

*—C0oCHo CH-, -t / 3 C =C / \ 10 H CH^ Br

Præparation af N-benzimidoylthienamycin, 3-methyl-2-bu-ten-l-yl-ester 15

Benzimidoylthienamycin (5,9 mg) opløses i hexamethyl-phosphoramid (100 til) indeholdende l-brom-3-methyl-2-buten (4,8 ul) og triethylamin (0,5 μΐ) og omrøres med magnetisk omrører ved 22 °C. Efter 1 time kromatograferes 20 dét urene reaktionsprodukt på en 250 μ tyk silica-gelplade, der udvikles i 8:2 chloroform:ethanol. Båndet med R^ = 0,1 - R^ = 0,3 isoleres og elueres med ethanol. Benzimidoylthienamycin, 3-methyl-2-buten-1-y1-ester-hy- drobromid isoleres som et fast stof efter udfældning af 25 en ethanol/chloroform-opløsning med hexan.

EKSEMPEL 5

Præparation af N-formimidoylthienamycin 30

OH

A -SCH 2CH 2N=C-NH 2

\_TJ 1_COOH

6

Thienamycin (517 mg) opløses i pH = 7 0,1 N phosphor- 35

DK 157401 B

19 puffer (25 ml) og afkøles på isbad under magnetisk omrøring. Opløsningen indstilles på pH = 8,5 ved hjælp af 2,5 N natriumhydroxidopløsning fra en automatisk burette.

Under opretholdelse af en pH-værdi på 8,5 tilsættes 5 methylformimidat-hydrochlorid (711 mg) portionsvis i løbet af 2-3 minutter, efter yderligere 10 minutter indstilles pH-værdien på 7,0 med 2,5 N saltsyre. Opløsningen kromatograferes på en kolonne af XAD-2-harpiks (150 ml), som elueres med vand. N- 10 formimidoylthienamycinderivatet elueres i 1,5 - 2,0 kolonnerumfang (200-300 ml) og lyofiliseres til et hvidt fast stof (217 mg).

UV (pH = 7 0,1 N phosphatpuffer) λ =297 nm (8590).

IiloK

15 1_ IR (Nujol mull) 1767 cm (Ø-lactam).

NMR (D20) δ 1,37 (d, J=6H, CH3-CH), 3,0-3,75 (m, -CH2-), 4,2-4,8 (m, CgH, ΟβΗ, C7H), 20

NH

II

7,86 (s,- C-H).

25 1 35

DK 157401B

20 EKSEMPEL 6

—OH

5 ^NH

Th--NIIC"^

Lco2k 10 Præparation af N-guanylthienamycin

Thienamycin (8,9 mg) opløses i pH = 7 0,1 N phos- phatpuffer (0,7 ml) og N,N-dimethylformamid (0,3 ml), og opløsningen indstilles på pH = 9,5 ved tilsætning af 2,5 15 N natriumhydroxidopløsning. Til opløsningen sættes under magnetisk omrøring O-methylisourinstof-hydrogensulfat (43 mg), hvilket bevirker et svagt fald i pH-værdien. Mere natriumhydroxidopløsning tilsættes for at bringe pH-værdien tilbage til 9,5, og opløsningen omrøres i 30 20 minutter ved 23 °C. Opløsningen gøres derefter sur til pH = 7,0. En prøve af opløsningen indeholdende en blanding af thienamycin og N-guanylthienamycin udviser to bioaktive zoner efter elektronforese (50 V/cm, 20 minutter, 0,5 N pH = 7 phosphatpuffer) og bioautografi på 25 S. aureus-plader. 1 35 EKSEMPEL 7

DK 157401 B

21

Cl

Cljft\—Q-cf * -HCl OH

5 Thienamycin Λ!^~0 \ NHc^‘ C1 2 . ^ΝΗλ --7 2 _co2h

Præparation af N-guanylthienamycin 10

Thienamycin (11 mg) opløses pH = 7 0,1 N phosphatpuffer (1 ml) og indstilles på pH = 8,3 med 0,1 N natriumhydroxid ved hjælp af en automatisk disperseringsburette.

Til den magnetisk omrørte opløsning tilsættes 0-2,4,5-15 trichlorphenylisourinstof.hydrochlorid (76 mg) portions vis for at gøre det muligt for autoburetten at opretholde en tilnærmelsesvis konstant pH-værdi. Reaktionen forløber i 4 timer ved 22 °C, og blandingen genindstilles derpå til pH = 7,0 ved tilsætning af fortyndet syre. En prøve 20 af denne opløsning indeholdende thienamycin og N-guanylthienamycin elektroforeses (50 V/cm, 25 minutter, pH = 7 0,1 N phospha tpuf fer), og der påvises en positiv Sakaguchi-sprayzone ved 2,0 cm mod anoden og en positiv ninhydrin-sprayzone ved 1,5 cm i samme retning.

25 1 35

DK 157401B

22 EKSEMPEL 8

Cl© © p0H CH-, 5 (CH3) -R=CHC1 η 5_2η,

Th (TMS) o---7 Th il-C 3

* XH

-cof 10

Præparation af N-dimethylaminomethylenthienamycin

Thienamycin (16,5 mg) silyleres med hexamethyldisilazan (200 μ.1) og trimethylchlorsilan (60 μΐ) på kendt måde.

15 Det silylerede thienamycin suspenderes i ethanolfri chloroform (1 ml) under magnetisk omrøring i en nitrogenatmosfære. Blandingen afkøles til -45 °C, og en opløsning af triethylamin (21 <il) i chloroform (21 ul) tilsættes efterfulgt af en opløsning af (chlormethylen)-20 dimethylammoniumchlorid (11,5 mg) i chloroform (50 ul). Blandingen opvarmes til -25 °C i løbet af en time, og 0,1 N pH * 7 phosphatpuffer (5 ml) tilsættes. Blandingen omrøres kraftigt i 15 minutter. Den vandige fase fraskilles og indeholder N-dimethylaminomethylenthienamycin, 25 som har en elektroforetisk mobilitet (50 V/cm, 1 time, pH = 7 puffer) på 3,6 cm mod katoden. 1 35 EKSEMPEL 9

DK 157401 B

23

r-r °H O — OH

+ ^NH2 ]| +/NH Br

Th —NHC BrCH^OCC (CH-.) _ Th — NHC^

5 \H -2--JLL--\H

C02 _§-0-CH20?C (CH3) 3

Præparation af N-formimidoylthienamycin-pivaloxymethyles-10 ter-hydrobromid N-aminomethylenthienamycin (10 mg) opløses i hexame-thylphosphoramid (200 μΐ) indeholdende brommethylpivalat (10 nl) og triethylamin (1 al) og omrøres magnetisk ved 15 22 °C. Efter 2 timer opløses hexamethylphosphoramid- opløsningen i 2 ml methylenchlorid, og produktet udfældes med en 50% hexan-ether-opløsning. Bundfaldet opløses i vandig 10% tetrahydrofuranopløsning og kromatograferes på en XAD-2-harpiks-pakket kolonne. N-formimidoyl-thienamy- 20 cin-pivaloxymethylester isoleres som et fast stof efter eluering af kolonnen med tetrahydrofuran og lyofi-lisering.

EKSEMPEL 10 25

Præparation af N-trifluoracetimidoyl-thienamycin OH

y'V— sch2ch2n=9-nh2 30 i CF3

_tj COOH

OT

Thienamycin (199 mg) opløses i pH = 7 0,1 N phos-phatpuffer (7 ml) og indstilles på pH = 8,5 med 1 N 35 natriumhydroxidopløsning. Under opretholdelse af denne pH-værdi med en automatisk burette tilsættes en opløsning af methyltrifluoracetimidat (355 al) i dioxan (2,5 ml) på

DK 157401B

24 én gang. Efter 30 minutter indstilles pH-værdien ved tilsætning af 1 N saltsyre. Opløsningen kromatograferes derefter på Dowex 50-X4®harpiks (200 ml, Na+-cyclus, 200-400 mesh) og elueres med vand. N-trifluoracet-5 imidoylthienamycinderivatet elueres i det første halve kolonnerumfang. Dette eluat rekromatograferes på samme måde på Dowax 50-X4 (100 ml, Na+-cyclus, 200-400 mesh), og det første kolonnerumfang inddampes og kromatograferes på XAD-2-harpiks (30 ml). N-fluoracetimidoylthiena-10 mycinderivatet elueres i 2,5 - 5,0 kolonnerumfang, som lyofiliseres til et hvidt fast stof (15 mg).

UV (pH =7, IN phosphatpuffer) λ = 302 nm (e = 4450).

ΙΠ3.Χ 15 IR (Nujol mull) 1750 cm-1 (Ø-lactam).

Elektroforese: (50 V/cm, 20 min., pH = 7, 0,1 N phosphatpuffer) mobilitet 2,0 cm mod katoden.

20 EKSEMPEL 11

Præparation af N-acetimidoylthienamyoin

OH

-/V- SCH,CH,N=C-NH0 ok I z 2 i 2 25 CHo

£_N_LI_COOH J

Thienamycin (190 mg) opløses i pH = 7 0,1 N phosphatpuffer (13 ml) og afkøles på isbad under magnetisk 30 omrøring. Opløsningen indstilles til pH = 8,5 med 2,5 N natriumhydroxidopløsning, afgivet fra en automatisk burette. Under opretholdelse af en pH-værdi på 8,5 tilsættes portionsvis ethylacetimidat-hydrochlorid (400 mg) i løbet af nogle få minutter. Efter yderligere 40 35 minutter indstilles opløsningen på pH = 7,0 med 2,5 N saltsyre. Opløsningen kromatograferes derefter på Dowex 50-X8 harpiks (250 ml, Na+-cyclus, 100-200 mesh) og

DK 157401 B

25 elueres med vand. N-acetimidoyl-derivatet elueres i 1-2 kolonnerumfang (240-520 ml) og lyofiliseres til et hvidt fast stof (88 mg).

5 UV (pH = 7, 0,1 N phosphatpuffer) = 297 nm (e = 7620).

IR (Nujol mull) 1774 cm ^ (0-lactam).

10 NH

IV

NMR (D20) 6 1,27 (d, J=6 Hz, CHg-CH), 2,24 (s, -C-CH3) 3.2 - 3,5 (m, -CH2), 3,5 - 3,9 (m, -CH2-) 15 /' 4.2 - 4,6 (m, C5H, C6r, C7h).

EKSEMPEL 12

20 Præparation af N-[(4-pyridyl)(imino)methyl]thienamycin OH

X\__— SCH_CHoN=C-NH0 [ ir 2 2 i 2

. „_ti ,_JJL COOH

” « V

Thienamycin (80 mg, 0,294 mmol) opløses i vandig natriumbicarbonat (24,7 mg, 0,294 mmol i 2,0 ml) ved 25 30 °C. Methylisonicotinimidat (80 mg, 0,588 mmol) opløses i opløsningen, og reaktionen følges ved periodisk udtagning af prøver, som underkastes højtryksvæskekromatografi (HPLC): Waters instrument; 0,2 x 61 cm. C^g Bondapak omvendt-kolonne; 1,5 ml/min., vandig 10% THF; UV (254 nm) 35 og R.I. monitorer. Reaktionen er i hovedsagen komplet i løbet af 40 minutter, og reaktionsopløsningen kromato-graferes direkte over en 18,4 x 270 mm XAD harpiks-

DK 157401 B

26 kolonne, idet der først elueres med afioniseret destilleret vand, hvorefter der ændres til vandig 10% tetra-hydrofuran. Det ved hjælp af UV og HPLC kontrollerede eluat anvendes til lokalisering af det rene produkt.

5 Korrekte fraktioner kombineres og lyofiliseres til opnåelse af et farveløst fnugget pulver (80 mg, 73%).

h20 UV Kmax = 298 nm (e = 7800).

10 IR (Nujol mull) 1762 cm-1 (Ø-lactam).

NMR (60 MHz, D20) 6 1,27, 3H (d, J=7 Hz, CH3.CH(0H)), 7,75 og 8,80, 4H (m, m, 4-pyridyl).

15 HPLC, 1,58 x retention af thienamycin, betingelser som ovenfor.

EKSEMPEL 13 20

Ved proceduren ifølge eksempel 12 erstattes reagenset med methylpicolinimidat, hvorved fås: N-[(2-pyridyl)(imino)methyl]thienamycin (85 mg, 77%) 25 H20 = 267, 300 nm (6 = 8150, 7600).

max IR (Nujol mull) 1764 cm”'*' (Ø-lactam).

30 NMR (60 MHz, D20) 6 1,24, 3H (d, J=7 Hz, CH3(QH), 7,80, 8,07, 8,80, 4H (m,m,m, 2- pyridyl).

HPLC, 1,8 x retention af thienamycin.

35 EKSEMPEL 14

DK 157401B

27

Ved proceduren ifølge eksempel 12 erstattes reagenset med methylnicotinimidat, hvorved fås: 5 N-[(3-pyridyl)(imino)methyl]thienamycin (77 mg, 70%): «2° UV λ = 264, 299 nm (e = 5570, 6120). max 10 IR (Nujol mull) 1766 cm-1 (Ø-lactam).

NMR (60 MHz, D20) 6 1,24, 3H (d, J=7 Hz, CH3.CH(0H)), 15 HPLC, 1,57 x retention af thienamycin.

EKSEMPEL 15

Ved proceduren ifølge eksempel 12 erstattes reagenset med 20 methyl-4-thiazolcarboximidat, hvorved fås: N-[(4-thiazolyl-imino)methyl]-thienamycin (99 mg, 89%) h2° 25 UV λ = 300 nm (e = 7530). max IR (Nujol mull) 1764 cm-1 (Ø-lactam).

NMR (60 MHz, D20) 6 1,23, 3Η (3, J=7 Hz, CH3.CH(0H)), 30 HPLC, 1,8 x retention af thienamycin.

35

Præparation af N * -(2-methylthioethyl)-N-formimidoylthi- enamycin 5 EKSEMPEL 16

DK 157401 B

28

-OH

n-ch2ch2sch3

II

Th--NHC

10 \

H

—COOH

Thienamycin (105 mg) opløses i pH = 7, 0,1 N phos- 15 phatpuffer (5 ml), og hertil sættes en opløsning af ethyl-N-2-methylthioethylformimidat (300 ni) i tetra- hydrofuran (2 ml). Opløsningens pH-værdi indstilles og opretholdes ved 8,5 ved hjælp af en autoburette, som afgiver 1 N natriumhydroxid. Efter 30 minutter indstilles 20 pH-værdien på 7,0 med 2,5 N HC1. Opløsningen kroma- tograferes på en isvand-afkølet kolonne af Dowex 50 ® + X4 harpiks (53 ml. Na -cyclus, 200-400 mesh), idet der elueres med afioniseret vand. Ν'-[2-methylthioethyl]-N-formimidoyl-derivatet elueres i 2-4 kolonnerumfang og 25 lyofiliseres til dannelse af et hvidt fast stof.

UV (pH = 7, 0,1 N phosphatpuffer) λ = 298 nm (e =

IUaX

7760). 1 35 IR (Nujol mull) 1760 cm”'*' (5-lactam).

DK 157401B

EKSEMPEL 17 29

Præparation af Ν'-tert-butyl-N-formimidoylthienamycin 5 j—OH

N”C^CH3)3 ir

Th--NHC

\

10 H

—COOH

Thienamycin (105 mg) opløses i pH = 7, 0,1 N phos- phatpuffer (5 ml), og hertil sættes en opløsning af 15 ethyl-N-tert-butylformimidat (290 mg) i tetrahydrofuran (1 ml). Opløsningens pH-værdi indstilles på og opretholdes ved 8,5 ved hjælp af en autoburette, som afgiver 1 N natriumhydroxid. Efter 30 minutter indstilles pH-værdien på 7,0 med 2,5 N HC1. Opløsningen kromatograferes 20 på en med isvand afkølet kolonne af Dowax 50-X4®harpiks (53 ml, Na+-cyclus, 200-400 mesh), der elueres med afioniseret vand. Fraktionerne indeholdende ovennævnte produkt forenes og lyo f i li-ser es.

25 1 35

Præparation af N1-[1-methyl-2-propenyl]N-formimidoylthi- enamycin 5 EKSEMPEL 18

DK 157401 B

30

i—OH

N"C(CH3)3 ! 11

Th— —NH-C-H

10 \

H

—COOH

Thienamycin (126 mg) opløses i pH = 7 0,1 N phos-15 phatpuffer (6 ml), og pH-værdien af opløsningen indstilles på 8,5 med en automatisk burette, som afgiver 1 N NaOH. Til denne opløsning sættes under omrøring ethyl-N- l-methyl-2-propenylformimidat-hydrochlorid (300 μΐ), medens pH-værdien holdes på 8,5. Efter 30 minutter 20 indstilles pH-værdien af opløsningen på 7,0 med 2,5 N saltsyre, og opløsningen kromatograferes på en med isvand afkølet kolonne af Dowex 50-X4®harpiks (49 ml, Na+-cyclus, 200-400 mesh), idet der elueres med afioniseret vand. Ν'-[1-methyl-2-propenylJ-N-formimidoylderivatet 25 elueres i 2-4 kolonnerumfang og lyofiliseres til et hvidt fast stof (59 mg).

UV (pH = 7, 0,1 N phospha tpuf fer) λ = 299 nm (e = Π13Χ 7820).

30 IR (Nujol mull) 1760 cm~^ (Ø-lactam).

35

Præparation af N *-dimethylamino-N-formimidoyl-thienamycin EKSEMPEL 19

DK 157401B

31 CH3 5 j-OH /

N-N

" \

Th--NHC CH3 \

10 H

—COOH

Thienamycin (115 mg) opløses i pH = 7, 0,1 N phos- phatpuffer (7 ml), og pH-værdien af opløsningen 15 indstilles til 8,5 med en automatisk burette, der afgiver 1 N NaOH. Til denne opløsning sættes under omrøring methyl-N-dimethylaminoformimidat-hydrochlorid (284 mg), medens pH-værdien opretholdes ved 8,5. Efter 20 minutter indstilles opløsningens pH-værdi på 7,0 med 2,5 N HC1, og €> 20 opløsningen kromatograferes på Dowex 50-X4 harpiks (53 ml, Na+-cyclus, 200-400 mesh), idet der elueres med afioniseret vand. Kromatografien udføres i en kolonne med vandkappe ved 3 °C. Ν'-dimethylamino-N-formimidoylderi-vatet elueres i 2 kolonnerumfang og lyofiliseres til et 25 hvidt fast stof (40 mg).

UV (pH * 7, 0,1 N phosphatpuffer) k ~ 298 nm (e = ΠΙοΧ 6910).

30 IR (Nujol mull) 1760 cm-1 (Ø-lactam).

NMR (D20) 6 1,29 (d, J = 6 Hz, CH^-CH), 2,59 (s, N-(CH3)2), 7,76 (s, NHC).

35

Præparation af methyloxalimidoylthienamycin EKSEMPEL 20

DK 157401 B

32

5 i—OH

NH NH

II II

Th--NHC-C-C-OCH3 10

—COOH

Thienamycin (105 mg) opløses i pH = 7, 0,1 N phos- phatpuffer (5 ml), og opløsningens pH-værdi indstilles på 15 8,5 med en automatisk burette, der afgiver 1 N NaOH. Til denne opløsning sættes methyloxalimidat (200 ul), medens pH-værdien holdes på 8,5. Efter 30 minutter indstilles pH-værdien til 7,0 med 2,5 N HC1, og opløsningen q + kromatograferes på Dowex 50-X4 harpiks (53 ml, Na -20 cyclus, 200-400 mesh), idet der elueres med afioniseret vand. Kromatografien udføres i en kolonne med vandkappe ved 3 °C. Methyloxalimidoylderivatet elueres 2 kolonnerumfang og lyofiliseres til et hvidt fast stof (44 mg). 1 35 UV (pH = 7, 0,1 N phosphatpuffer) λ = 298 nm (s =

luoX

6230).

IR (Nujol mull) 1760 cm-1 (Ø-lactam).

30 NMR (D20) 6 1,27 (d, J = 6 Hz, CHg-CH), 3,87 (s, -OCHg).

Præparation af N1-propionimidoylthienamycin EKSEMPEL 21

DK 157401B

33

5 r-OH

NH

II

Th--NHC

\ 10 CH2CH3

—COOH

Thienamycin (114 mg) opløses i pH = 7, 0,1 N phos- phatpuffer (10 ml), og pH-værdien af opløsningen 15 indstilles på 8,5 med automatisk burette, der afgiver 1 N NaOH. Fast ethylpropionimidathydrochlorid (231 mg) tilsættes portionsvis hurtigst muligt for at holde pH-værdien nær 8,5. Efter 30 minutter indstilles pH-værdien til 7,0 med 2,5 N HC1, og opløsningen kroma tograf er es på A 4* 20 Dowex 50-X4 harpiks (72 ml, Na -cyclus, 200-400 mesh), idet der elueres med afioniseret vand. N-propionimidoyl-derivatet elueres i 2 kolonnerumfang og lyofiliseres til et hvidt fast stof (76 mg).

25 UV (pH = 7, 0,1 N phosphatpuffer) k = 298 nm (e =

IUcLX

7830).

NMR (D20) 6 1,28 (d, J = 6 Hz, CH3CH(0H)), 1,23 (t, J = 8 Hz -CH2-CH3), 2,50 (q, J - 8 Hz, CH2CH3).

30 35 34

Præparation af N'-methyl-N-formimidoylthienamycin

5 j—OH

EKSEMPEL 22 n-gh3

II

Th--NHC

\

10 H

—COOH

Thienamycin (140 mg) opløses i pH = 7, 0,1 N phos-phatpuffer (10 ml), og pH-værdien af opløsningen 15 indstilles på 8,5 med en automatisk burette, der afgiver 1 N NaOH. Til denne opløsning sættes methyl-N-methyl-formimidat-hydrochlorid (200 nl), medens pH-værdien indstilles på 8,5. Efter 40 minutter indstilles pH-værdien på 7,0 med 2,5 N HC1, og opløsningen kroma-20 tograferes på Dowex 50-X4®harpiks (53 ml, Na+-cyclus, 200-400 mesh), idet der elueres med afioniseret vand. N'~ methyl-N-formimidoyl-derivatet elueres i 2 kolonnerumfang og lyofiliseres til et hvidt fast stof (43 mg). 1 35 UV (pH = 7, 0,1 N phosphatpuffer) λ = 298 nm (e = max 7250).

IR (Nujol mull) 1765 cm ^ (Æ-lactam).

30 NMR (D20) 6 1,29 (d, J = 6 Hz, CTg-CH), 2,92 (s, N-CHg).

DK 157401 B

35 EKSEMPEL 23

Præparation af Ν'-benzyl-N-formimidoylthienamycin 5 r-OH i-i N-CH2f ? " \~rr/

Th--NHC

\

10 H

—COOH

Thienamycin (110 mg) opløses i pH = 7, 0,1 N phos-phatpuffer (7 ml), og opløsningens pH-værdi indstilles på 15 8,5 med en automatisk burette, der afgiver 1 N NaOH. En opløsning af ethyl-N-benzylformimidatfluorborat (572 mg) i p-dioxan (2 ml) sættes til den pufrede opløsning, medens pH-værdien holdes på 8,5. Efter 20 minutter indstilles pH-værdien af opløsningen på 7,0 med 2,5 N 20 HC1, og der kromatograferes på Dowex 50-X4 harpiks (53 ml, Na+-cyclus, 200-400 mesh), idet der elueres med afioniseret vand. Kromatografien udføres i en kolonne med vandkappe ved 3 °C. Ν'-benzyl-N-formimidoyIderivatet elueres i 2 kolonnerumfang og lyofiliseres til et hvidt 25 fast stof (5 mg).

UV (pH = 7, 0,1 N phosphatpuffer) λ = 295 nm (e = ΠΙαΚ 3980).

_i 30 IR (Nujol mull) 1765 cm (Ø-lactam).

NMR (D20) 6 1,29 (d, J = 6 Hz, CHg-CH), 4,44 (s, CH2-Ar), 7,37 (s, aryl), 8,14 (s, NCH).

35 EKSEMPEL· 24

DK 157401 B

36

Præparation af N *-isopropyl-N-formimidoylthienamycin 5 i—OH

nch(ch3)2

II

Th--NHC

\

10 H

—COOH

Thienamycin (110 mg) opløses i pH = 7, 0,1 N phos- phatpuffer (7 ml), og opløsningens pH-værdi indstilles på 15 8,5 med en automatisk burette, der afgiver 1 N NaOH. En opløsning af methyl-N-isopropylformimidat-hydrochlorid (300 mg) i p-dioxan (1 ml) sættes til opløsningen under magnetisk omrøring, medens pH-værdien holdes på 8,5.

Efter 25 minutter indstilles pH-værdien af opløsningen på 20 7,0 med 2,5 N HC1, og der kromatograferes på Dowex 50- X4®harpiks (53 ml, Na+-cyclus, 200-400 mesh), idet der elueres med afioniseret vand. Kromatografien udføres i en kolonne med vandkappe ved 3 °C. N*-isopropyl-N-formi- midoylderivatet elueres i 2 kolonnerumfang og lyofi-25 liseres til et hvidt fast stof (12 mg).

UV (pH = 7, 0,1 N phosphatpuffer) *max = 299 nm (e = 8130).

30 IR (Nujol mull) 1760 can (i)-lactam).

NMR (D20) δ 1,26 (d, J = 6 Hz, CHgCHfOH)), 1,29 (d, J = 6 Hz CH(CH_( 3), 7,89 (s, NHCH), 7,96 (s, NHCH).

f & 35

DK 157401 B

37 EKSEMPEL 25

Præparation af N(Nr-allylformimidoyl)thienamycin 5 p-OH

/ch2ch=ch2 n-Ch3 tr

Th--NH-C

10 \

H

—COOH

Til en for-kølet prøve af thienamycin (123 mg, 0,452 15 mmol) sættes 13 ml kold 0,1 N phosphatpuffer. Opløsningen indstilles på en pH-værdi på 9 med 1 N natriumhydroxid.

Til denne basiske opløsning ved 2 °C sættes på én gang 0,3 g ethyl-N-allylformimidat-hydrochlorid. pH-værdien falder til 7,3 og bringes tilbage til 8,5 med mere 20 natriumhydroxid. Reaktionsblandingen omrøres ved 2 °C i yderligere 30 minutter, og pH-værdien indstilles på 7 med kold 0,1 N svovlsyre. Reaktionsblandingen analyseres ved hjælp af højtryksvæskekromatografi på en C^g-Porosil- kolonne, der udvikles med 10% vandig tetrahydrofuran, og 25 viste sig kun at indeholde spor af thienamycin (retentionstid 5 minutter) og praktisk taget rent produkt (retentionstid 10,5 minutter). Reaktionsblandingen kroma- tograferes på en Dowex 50 x 4 -kolonne (6 ml, 200-400 mesh), idet der elueres med vand med en s.trømnings- 2 30 hastighed på 0,5 ml/cm harpikslag. Efter bortkastning af de første 400 ml eluat lyofiliseres de næste 150 ml til opnåelse af produktet.

Udbytte: 96 mg (63%).

UV λ = 298 nm, 24,6 O.D.-enheder/mg. (NHo0H max <5 udslukket, 90% renhed).

35

DK 157401 B

38 IR Nujol udviser C=0 ved 5,67 u og 5,90 u.

NMR 100 MHz D2O viser, at det er en 1;1 blanding af syn-og anti-N(N’-allylformimidoyl)thienamycin.

5 EKSEMPEL 26

Præparation af N(N*-trifluorethylformimidoyl)thienamycin 10 i—OH

N-CH2cf3

II

Th--NH-C

\

15 H

-C00H

Til en for-kølet prøve af thienamycin (123 mg, 0,452 mmol) sættes 15 ml kold 0,1 N phosphatpuffer. Opløsningen 20 indstilles på en pH-værdi på 9 med 1 N natriumhydroxid.

Til denne basiske opløsning ved 0-2 °C sættes 0,3 g ethyl-N-trifluorethylformimidat i 2 ml dioxan portionsvis i løbet af 30 minutter. pH-værdien af reaktionsblandingen opretholdes ved 8,5 - 9 under tilsætningen. Reaktions-25 blandingen omrøres i nogle få minutter. Efter at tilsætningen af imidat er afsluttet, og pH-værdien er indstillet på 7 med kold 0,1 N H2S0^, udviser HPLC, C^g-Porosil omvendt fase, med 10% vandig tetrahydrofuran et nyt maksimum ved 12,2 nm, der er det ønskede produkt.

30 Blandingen kromatograferes på en Dowex 50 x 4 kolonne (60 ml, 200-400 mesh). Kolonnen elueres med vand ved en 2 strømningshastighed på 0,5 ml min./cm af harpikslaget.

Et forløb bortkastes, og fraktionerne indeholdende produktet forenes og lyofiliseres til opnåelse af et 35 hydroskopisk stof, 10,2 mg, *max “ 302.

DK 157401B

EKSEMPEL 27 39

Præparation af N(N1-carboxymethylformimidoy1)thienamycin-natriumsalt 5

-OH

n-ch2cooh I»

Th--NHC

10 \

H

-COONa

Thienamycin (130 mg) opløses i pH = 7, 0,1 N phos- 15 phatpuffer (4 ml), og et fast natriumethyl-N-carboxy-methylformimidat (500 mg) tilsættes på én gang. Opløsningens pH-værdi indstilles på 8,5 med en automatisk burette, der afgiver 1 N natriumhydroxid. Efter 25 minutter ved en pH-værdi på 8,5 indstilles opløsningen 20 til pH = 7,0 med 2,5 N saltsyre. Opløsningen kromato- graferes derefter på en med isvand afkølet kolonne af ® +

Dowex 50 x 4 harpiks (51 ml. Na -cyclus, 200-400 mesh), idet der elueres med afioniseret vand. Eluatet af det første kolonnerumfang forenes og inddampes til 7 ml.

25 Denne opløsning kromatograferes derefter på en med isvand afkølet kolonne af XAD-2 harpiks (53 ml), idet der elueres med af ioniseret vand. De to til fire kolonnerumfang opsamles og forenes og lyofiliseres til opnåelse af natrium-N('-carboxymethyl-formimidoyl)thiena-30 mycin (25 mg).

UV (pH = 7, 0,1 N phosphatpuffer) λ * 300 nm (e -6390). 1 IR (Nujol mull) 1755 cm-1 (Ø-lactam).

DK 157401 B

40 NMR (D20) δ 1,29 (d, J = 6 Hz, CH3-CH), 7,85 (s, NCH).

EKSEMPEL 28 5 Præparation af N(3-åzidopropionimidoyl)thienamycin

-OH

NH

II

10 Th--NHCCH2CH3N3

—COOH

Til en opløsning af thienamycin (133 mg) i 10 ml 0,1 M

15 pH = 7,0 phosphatpuffer sættes 1,2 g 0-ethyl-3-azido-

propionimidat * HC1, medens opløsningen opretholdes ved pH

= 8,5 med 2,5 N NaOH. Blandingen omrøres ved 0 °C i 0,5 timer og neutraliseres derefter med 2,5 N HC1 til pH = 7,0, inddampes til 5 ml og kromatograferes på en Dowex €> 20 50W x 8 (Na-form) kolonne (3,8 x 30 cm), som elueres med

vand til dannelse af det ønskede produkt. Produktet udviser UV

h2° λ__„ = 300 nm; høj tryksvæskekromatografi (HPLC) 25 retentionstid på 10 minutter i sammenligning med 4,8 minutter for udgangsmaterialet under samme betingelser (3 mm x 60 cm Bondapak C^g omvendt fase kolonne elueret med 10% THF i vand ved en strømningshastighed på 1,5 ml/min.); elektroforetisk mobilitet 5 mm mod katoden ved 30 50 V/cm i 20 minutter i 0,05 M pH - 7,0 phosphatpuffer.

35 EKSEMPEL 29 41

DK 157401 B

Præparation af N(3-aminopropionimidoyl)thienamycin

OH r OH

5 Γ °H ΐ® ί?Η H?/Pd v. Th-r NHCCH0CH-NH,

Th—NHCCH2CH2N3 ——-7* λ Z i L CO 2 - C02 "Na+ 10 I 11 N- (3-azidopropionimidozyl) thienamycin I (43 mg i 40 ml vand) hydrogeneres under 1 atm. H2 i nærværelse af 0,1 g Pd-katalysator (10% palladium på aktivt kul) i 30 minutter. Elektroforese af den dannede blanding udviser 15 et nyt bioaktivt produkt, som bevæger sig 30 mm imod katoden (50 V/cm i 20 minutter i 0,05 M pH = 7,0 phosphatpuffer) foruden udgangsmaterialet I, som bevæger sig 5 mm mod katoden. Den elektroforetiske mobilitet af produktet er i overensstemmelse med mobiliteten for det 20 ventede produkt II. Den dannede reaktionsblanding fra hydrogeneringsaktionen neutraliseres med 2,5 N HC1 og filtreres fra katalysatoren. Filtratet inddampes til 10 ml og kromatograferes på XAD-2 harpiks (2,3 x 16 cm kolonne). Kolonnen elueres med vand til opnåelse af det 25 ønskede produkt II som et hydrochlorid efter lyofi- 1isering, 23 mg, N-(3-aminopropionimidoyl)-thienamycin-hydrochlorid.

H2° 30 UV kmax = 301 nm (e = 7080).) IR: Nujol mull 1765 citf1* NMR 60 MHz (D20) δ 1,30 ppm, (3), 2,60 - 3,72 ppm, (11), 35 4,18 ppm (2).

DK 157401 B

42 EKSEMPEL 30

Præparation af N-nitroguanylthienamycin 5 Thienamycin (131 mg) opløses i en opløsning af dimethyl-sulfoxid (10 ml), tri-n-butylamin (0,30 ml) og 2-methyl- l-nitro-2-thiopseudourinstof (0,3 g). Opløsningen opvarmes på vandbad ved 45 °C, medens en strøm af nitrogen bobles livligt gennem opløsningen. Efter 50 minutter 10 inddampes opløsningen under højvakuum til 1,0 ml og opløses i 0,05 N pH = 7 phosphatpuffer (7 ml). Det ikke-omsatte thiopseudourinstof udfældes og frafiltreres.

Opløsningen kromatograferes derefter på Dowez 50-X4 resin 3 + (53 cm , 200-400 mesh, Na -cyclus) og elueres med vand.

15 N-nitroguanylderivatet elueres i første kolonnerumfang og lyofiliseres til et fast stof (23%).

UV (pH = 7, 0,1 N phosphatpuffer) λ = 269 nm (e = 11000) 20

Elektroforese (40 V/cm, pH = 7, 0,1 N phosphatpuffer, 20 min.) 3,0 cm mod katoden.

EKSEMPEL 31 25

Præparation af N-isobutyrimidoylthienamycin

Proceduren ifølge eksempel 11 følges, idet ethylacetimi-dat-hydrochlorid erstattes med isobutyrimidat-hydro-30 chlorid, og reaktionen bringes til at forløbe ved 20 °C og pH = 8,2, hvorved fås N-isobutyrimidoylthienamycin (14%) UV (pH = 7, 0,1 N phosphatbuffer) *max = 298 nm (s = 35 8290)

DK 157401 B

43 NMR (D20 δ 1,27 (d, J = 7Hz, CH(CH3)2, 1,29 (d, J = 6Hz, CH3CH(OH), 2,79 (heptet, J = 7 Hz, CH(CH3)2).

5 EKSEMPEL 32

Præparation af Ν'-methyl-N-acetimidoylthienamycin

Proceduren ifølge eksempel 11 gentages, idet ethylacet-10 imidat-hydrochlorid erstattes med ethyl-N-methylformimi- dat-hydrochlorid, hvorved fås Ν'-methyl-N-formimidoyl-thienamycin (10%).

UV (pH = 7, 0,1 N phosphatpuffer) kmax =298 nm.

15 IR (Nujol mull) 1750 cnT^ (Ø-lactam), 1660 cm-^ (C=NCH3).

NMR (D20) 6 1,27 (d, J = 6Hz, CH3CH(0H), 2,22 og 2,25 20 N

II

(s, N-CCH3, 2,97 (S, NCHg).

EKSEMPEL 33 25

Præparation af N'-methyl-N-formimidoylthienamycin

Proceduren ifølge eksempel 11 gentages, idet ethyl-acetimidat-hydrochlorid erstattes med ethyl-N-methyl-30 formimidat-hydrochlorid, hvorved fås Ν'-methyl-N-formimidoyl-thienamycin (10%).

UV (pH = 7, 0,1 N phosphatpuffer) λ = 298 nm.

ΠΙαΧ 1 NMR (D20) 6 1,30 (d, J = 6Hz, CH3 CH(OH), 2,92 (s, n-ch3),

DK 157401 B

44

N

II

7,78 (s, -CH) 5 EKSEMPEL 34

Proceduren ifølge eksempel 11 følges, idet reagenset erstattes med en ækvivalent mængde methylmethoxy-acetimidat, hvorved fås N(methocyacetimidoyl)thienamycin 10 (34%).

H2° UV k = 198, 301 nm (e = 16180, 8700). max 15 IR (Nujol mull) 1760 cm-1 (Ø-lactam).

NMR (60 MHz, D20) 6 1,28, 3H, (d, J = 6Hz, CH3‘CH(0H), 3,50, 3H (s, CH3 0 CH2) 4,35, 2H, (s, CH3 0 0¾) 20 HPLC, 1,50 x retentionstid for thienamycin.

EKSEMPEL 35

Præparation af N-[Ν'-ethylformimidoyl]thienamycin 25

-OH

r

Th--NHC-H .

_C0,H

30 z

Thienamycin (100 mg) i 10 ml 0,1 M pH = 7,0 phosphat- puffer indstilles og opretholdes på pH = 8,5 - 9,0 med 35 2,5 N natriumhydroxid. Til opløsningen sættes 300 mg ethyl-N-ethylformimidat-hydrochlorid. Blandingen omrøres ved 23 °C i 20 minutter, neutraliseres derefter ved pH = 45

DK 157401B

7,0 med 2,5 N HC1 og kromatograferes på en Dowex 50 X 8 (Na-form) ionbytterharpikskolonne (3,8 x 25 cm). Kolonnen eleueres med vand, idet der tages 6,7 ml fraktioner. Fraktionerne 40 - 90 forenes, inddampes og 5 frysetørres, hvorved opnås 15 mg af det faste produkt.

Ved elektroforese af produktet ved 50 V/cm i 20 minutter i 0,1 M, pH = 7,0 phosphatpuffer ses en enkelt bioaktiv zone, der bevæger sig 2 mm mod katoden.

10 h2o UV λ__»301 nm.

max NMR (100 MHz, D20) 6 7,77 (s) og 7,82 (s) (formimidoyl CH).

15 EKSEMPEL 36

Præparation af η-[N'-coclopropylformimidoyl]thienamycin 20 PK]

1¾--NHC

XH

-COOH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 2

Thienamycin (100 mg) i 10 ml 0,1 M pH = 7,0 phosphatpuf 3 fer indstilles og opretholdes på pH = 8,5 - 9,0 medens 4 300 mg ethyl-N-ethylformimidat-hydrochlorid sættes dråbe 5 vis til opløsningen. Blandingen omrøres ved 23 °C i 40 6 minutter, neutraliseres derefter og kromatograferes på en 7 β 8

Dowex 50 X 8 (Na-form) ionbytterharpikskolonne (3,8 x 9 25 cm). Kolonnen eleueres med vand, idet der tages 6,7 ml 10 fraktioner. Fraktionerne 40 - 95 forenes, inddampes og frysetørres til dannelse af 54 mg fast produkt. Elek- 11 troforese af produktet udviser en enkelt bioaktiv zone, der bevæger sig 10 mm mod katoden (50 V/cm, 1 time i 0,05 M pH = 7,0 phosphatpuffer).

DK 157401 B

46 h2° UV λ =301 ran. max 5 NMR (100 MHz, D20): 60 - 1,30 ppm (m cyclopropyl) og 7,80 ppm (formimidoyl CH) EKSEMPEL 37 10 På samme måde som i de foregående eksempler fremstilles de i det følgende nævnte forbindelser.

15 20 25 30 35

DK 157401B

47

Hp h' _L-λ ^ ^r1 H T>^ Vr2 5

o C07K

Forbind. R R2 07 IR NMR

10 1. H CHnCH=CH2 H 300 (8500) ingen åi3 2. H j=\ H Mujoi 10GL MHz neH 1750 στΓ1 (0,0) : 1,25 (d, 301 nm 15 j = 6,2 Hz ) '2,40 - 2,80 (n) 2,90 - 3,20 (::l) 3,33 (q, J = 2,8, J = 6,2 Hz) 20 4,1 - 4,4 (m), '> 5,73 (m), 6,16 (n) , 7,76 (s) 3. H i-v Η ρΗ,Ο Nujol 100'MHz U ma5c 3150 (br), (D,0) S 1,3 (d, 29S niti 1760, 1700, CF^CKOH, J = 6Hz), 3,38 25 C=6560 1690, (dd, H6, j = 3,6 Hz) (Ηο0/ΝΗ20Η, 1585 cm”1 7,68 (s, NHCH=N) hci/k^ipo4) λ max 298 nm £*6400 4. Η Ι^'Ί) ’ H Nujol ingen 293 nm 1765 cm-1 £=7674 35

DK 157401B

48 5 For-

bind. R R* R* UV m NMR

CH λΗ O

5. H —ζ CH3 'idk ingen 100 Mfe ^3 £ = 5878 tøf» 1'30 (d, 9H, J = 6,2Hz, 10 N^0*3 , 2,97 >v æ3 (s, 3H, N-CH3) 3,05-3,15 (m), 3,20 (q, IH, j = 6,2, J = 3,0 Hz) 15 3,50 - 4,40 (n) 7,90 (s, CH-N) 6. h —*C^3 η λ^. Nujol ioo: mz 3 298 nm . 3200 (br)r (D20) S 1,38 - 1,40 20 8010 1760, (ra, CHjCHDH, (H20/NH20H, 1660, CH(CH3)2), 2,42 HC1/K2HP04> 1590 cm"1 (s, NC(CH3)=N-), *max 2,45 (s, KC(CH3)=N-) 298 ran 25 f - 7850 7. -CH„-CH„ Η H AH2? Nujol ingen * z irax _i 300 ran 1760 can £8500- 30 8. SCH-, -CH-, Η λΗ2? Nujol ingen 3 3 ϊκβχ J , 302 ran 1760 on ^ £ = 9000 9. H -CN Η λΗ2? Nujol 2185 ingen ΠΒΧ 302 ran 1757 cm £6930 35

Claims (2)

1. 30 A /x X \--/ V- SCH-CH-NH- li 222 X_N il COOH T i 1 1 eller et passende carboxylderivat deraf omsættes med en imidoester med formlen: DK 157401 B NR1R2 J-xV 5 eller et imidohalogenid med formlen:
2. 10 AA&c-x· n | Χ·Θ v R 15 hvor -X°R" er en fraspaltelig gruppe, X' er halogen, og X° er 0 eller S, og R1, Rz og R har den i det foregående angivne betydning, eller omsættes med en forbindelse med formlen: 20 x"r° rVn-on-r1 VI 25 hvor X" er O eller S, og -X"R° er en fraspaltelig gruppe, 1 2 og R og R er H eller C^-Cg alkyl, hvorpå de opnåede forbindelser om ønsket forestres eller omdannes til salte deraf på i og for sig kendt måde. 2 35 2