FI122130B - Gamma-linoleenihappo- ja linolihappojäännöksiä sisältävän triglyseridiöljyn käyttö neurodegeneratiivisen sairauden hoidossa - Google Patents

Description

Gamma-linoleenihappo- ja linolihappojäännöksiä sisältävän triglyseridiöljyn käyttö neurodegeneratiivisen sairauden hoidossa 5 Esillä oleva keksintö koskee menetelmää neurodegeneratiivisten sairauksien, erityisesti sellaisten sairauksien hoitamiseksi, joissa transformoivan kasvutekijä β:η (TGF-β), erityisesti TGF-βΙ:n, lisääntyminen on hyödyllistä. Tarkemmin sanottuna esillä oleva keksintö aikaansaa hoitokeinon sellaisille sairauksille kuin multippeliskleroosi ja päävammaan, aivohalvaukseen ja kallonsisäisiin verenvuotoihin 10 liittyvät degeneratiiviset jälkitilat, jolloin hermosolutoiminta paranee tai palautuu heikentyneestä tilasta. Lisäksi aikaansaadaan tyydyttymättömiä rasvahappo-osia käsittävien, tunnettujen ja uudenlaisten yhdisteiden uudenlainen käyttö lääkkeiden valmistamiseksi, jotka pystyvät tehokkaasti hoitamaan tällaisia sairauksia, ja jotka tarkemmin sanottuna pystyvät saavuttamaan aiemmin saavuttamattomissa olevia 15 tulostasoj a neurologisen toiminnan palautumisen suhteen.

Kirjallisuudessa on raportoitu hyvin, että n-3- ja n-6-tyydyttymättömyysrakenteen käsittävillä välttämättömillä rasvahapoilla (EFA:t) on hyödyllinen vaikutus ihmisten monissa eri fysiologisissa häiriöissä. WO 02/02105 (Laxdale Limited) kuvaa niiden 20 hyödyllistä käyttöä äärimmäisen monien sairauksien yhteydessä sekä yleisenä ravintolisänä. Harbige (1998) Proc. Nut. Soc. 57, 555 - 562 tarkasteli ruokavalion täydentämistä n-3- ja n-6-hapoilla autoimmuunisairaustiloissa, ja löysi todisteita erityisesti γ-linoleeni- (GLA) ja/tai linolihappopitoisten (LA) öljyjen, kuten purasruohoöljyn, hyödyllisyydestä reumatoidiartriitin kliinisesti merkittävien o 25 merkkien ja oireiden vähentämisessä.

(M

CD

cp in Huomiota on kiinnitetty kahteen multippeliskleroosipotilaille (MS) tehtyyn x tutkimukseen, jotka osoittavat, että sairauden uusiutumista ja vakavuutta voidaan Q_ vähentää antamalla hoitoa n-6-happo-osia sisältävillä öljyillä (Miller et ai (1973) ja o oj 30 Bates et ai (1978)), mutta eräs muu tutkimus ei kuitenkaan onnistunut vahvistamaan o tätä vaikutusta (Paty et ai (1978). Näissä tutkielmissa on raportoitu, että 0X1 ihmispotilaiden ravinnon täydentäminen noin 20 g:lla/päivä linolihappoa (18:2n-6) vaikutti multippeliskleroosin relapsien kestoon ja vakavuuteen siten, että relapseja 2 esiintyi harvemmin, ne olivat vähemmän vakavia ja lyhytkestoisempia kuin kontrolleilla. Bates totesi, että linolihapon ja γ-linoleenihapon seoksen oli esitetty tuolloin vuonna 1957 olevan mahdollisesti tehokkaampi tulehdus- ja autoimmuunisairauksien hoidossa, ja ryhtyi tutkimaan tätä kokeellisesti. Havaittiin 5 kuitenkin, että kun tätä yhdistelmää kokeiltiin antamalla 3 g öljyä päivässä (Naudicelle Evening Primrose Oil), niin relapseja kokeneet potilaat tulivat sairaammiksi kokeilussa olevasta öljystä kuin kontrollilääkkeestä.

Näiden linolihappotutkimusten meta-analyysi muiden (Dworkin et ai (1984)) toimesta 10 osoitti relapsimäärän ja vakavuuden vähenemistä sekä sairauden pitkän aikavälin etenemisasteen laskua lievää multippeliskleroosia sairastavilla potilailla. Multippeliskleroosia sairastaville potilaille myöhemmin tehdyt avoimet tutkimukset esittävät, että vähärasvainen ruokavalio ja/tai ruokavalion n-3- ja n-6-rasvahappojen muuntelu saattaa olla hyödyllistä (Swank & Grimsgaard (1988); Harbige et ai (1990). 15

Vaikka MS-taudin etiologia pysyy tuntemattomana, vahvat todisteet viittaavat autoimmuunimekanismien esiintymiseen sairauden patogeneesissä [Martino & Hartung 1999]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että MS-potilailla on paljon suurempi määrä neuroantigeenia esim. myeliinin emäksistä proteiinia (MBP) ja myeliinin 20 oligodendrosyyttiglykoproteiinia (MOG) kohtaan autoreaktiivisia T-soluja, jotka ovat kohonneessa aktivaatiotilassa terveisiin kontrolleihin verrattuna [Fredrikson et ai 1994, Kerlero de Rosbo et ai 1993,1997, Chou et ai 1992, Ota et ai 1990, Burns et ai 1999, Zhang et ai 1994, Tejada-Simon et ai 2001], Aksonivaurion varsinaiset ^ prosessit, esim. krooninen inflammaatio, demyelinaatio ja astroglioosi MS-taudissa, 25 ovat monimutkaisia, mutta valkean aineen inflammaation ja demyelinaation katsotaan ^ määrittävän taudin vakavuuden, vaikka tuoreet tutkimukset ovat viitanneet siihen, että

LO

MS-taudin aksonivaurio alkaa sairauden varhaisissa vaiheissa ja edistää

X

vammautumista (De Stefano et ai, 2001).

o 00 C\l g 30 Kokeellinen autoimmuuni enkefalomyeliitti (EAE) on yleisimmin käytetty eläinmalli S MS-taudin immuunivälitteisten vaikutusten tapauksessa. Marsulle tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet, että linolihappo osittain vähentää EAE:n esiintymistiheyttä ja vakavuutta (Meade et ai (1978)). Sieni- tai kasvilähteistä peräisin olevia γ- 3 linoleenihappopitoisia öljyjä käyttämällä osoitettiin täydellinen suoja sekä rotilla että hiirillä (Harbige et ai (1995), 1997b). Nämä tutkimukset näyttivät toteen EAE:n kliinisiin ja histopatologisiin ilmentymiin kohdistuvia linolihapon ja γ-linoleenihapon sairautta muuntavia vaikutuksia. Annoksesta riippuen γ-linoleenihappo antoi 5 täydellinen suojan rottien akuutissa EAE:ssä, kun taas linolihapolla oli annosriippuvainen vaikutus kliiniseen vakavuuteen, mutta se ei poistanut sitä.

Näistä kokeellisista havainnoista huolimatta on myönnetty, että ihmisten sairaus, multippeliskleroosi, on erittäin monimutkainen ja voi sitä vastoin pahentua ja parantua 10 T-solujen ja muiden immuunivastetekijöiden aktiivisuuden seurauksena. Yksinomaan linolihapolla saatujen tulosten perusteella on arveltu, että n-6-rasvahapot edistävät autoimmuuni- ja tulehdussairautta. TGF-β- ja PGE2-tuotannon on osoitettu lisääntyvän ei-spesifisesti γ-linoleenihapolla ruokituilla hiirillä ex vivo; mutta vaikka TGF-P:n on raportoitu kuitenkin suojaavan akuutissa ja relapsoivassa EAE:ssä 15 ((Racke et ai (1993); Santambrogio et ai (1993)), PG-inhibiittorit, kuten indometasiini, edistävät, ja siten pahentavat sairautta (Ovadia & Paterson (1982)).

Sytokiinien on osoitettu olevan osallisia MS-taudin patogeneesiin monien tutkimusten avulla, jotka osoittavat myelinotoksisten inflammatoristen sytokiinien (TNF-a, IL-Ιβ 20 ja IFN-γ) lisääntymistä, mikä voidaan yhdistää taudin relapsivaiheeseen. Anti- inflammatorisen ja immunosuppressiivisen sytokiinin transformoivan kasvutekijän beta-1 (TGF-βΙ) tasot näyttävät sen sijaan laskevan relapsivaiheen aikana ja kohoavan potilaan siirtyessä remissioon. Biologisesti aktiivisen TGF^l:n ja proinflammatorisen ^2 TNF-a:n, ΙΕ-1β:η ja IFN-y:n välillä oleva tasapaino näyttää siten olevan heikosti o , 25 säädelty MS-taudin relapsi-remissio-vaiheen aikana.

CD

o i tn ^ Luonnollisessa toipumisvaiheessa EAE:stä TGF^:aa erittävät T-solut estävät EAE-

X

efektorisoluja, TGF-β ilmentyy keskushermostossa ja, oraalisen toleranssin § aikaansaamassa suojassa EAE:ssä, TGF-β ja PGE2 ilmentyvät aivoissa (Karpus & g 30 Swanborg (1991); Khoury et ai (1992)). Harbige ((1998) on päätellyt, että ruokavalion dj γ-linoleenihapon vaikutukset EAE:iin välittyvät Th3:n kaltaisten mekanismien kautta, joissa TGF-β on osallisena, sekä mahdollisesti superoksididismutaasin antioksidanttisen vaikutuksen kautta.

4

On ehdotettu mm. γ-linoleenihappo- ja linolihappopitoisen purasruohoöljyn käyttöä keinona aikaansaada immunosuppressiota multippeliskleroosissa (US 4,058,594). Ehdotettu annos on 2,4 grammaa öljyä päivässä, mutta tehokkuudesta ei ole esitetty minkäänlaista näyttöä.

5

Purasruohoöljyn (tavallisesti 23 % γ-linoleenihappoa ja 37 % linolihappoa 100 %:n rasvahappopitoisuudessa) on osoitettu huomattavassa määrin vähentävän aktiiviseen reumatoidiartriittiin liittyvän autoimmuunisairauden kliinisesti merkittäviä merkkejä ja oireita (Leventhal et ai (1993)). Purasruohoöljyn ja sieniöljyn (ks. kuvio 1) on 10 osoitettu olevan tehokkaita MS-potilaskandidaattien tunnistamiseen käytettävässä EAE-eläinmallissa, vaikka niiden ei ole koskaan osoitettu olevan huomattavan tehokkaita ihmisten sairaudessa. Alhaisia määriä γ-linoleenihappoa sisältävän linolipitoisen öljyn (EPO: linolihappo:Y-linoleenihappo 7:1) korkeat määrät vähensivät osittain EAE:n esiintymistiheyttä ja vakavuutta rotassa (Mertin & 15 Stackpoole, 1978), kun taas Naudicelle-tutkimus, johon viitattiin edellä, johti potilaiden tilan huononemiseen. Suunnilleen viimeisten 30 vuoden aikana multippeliskleroosista kärsivien potilaiden suorittamasta purasruohoöljyn ja muiden GLA/LA-pitoisten öljyjen, kuten iltahelokkiöljyn, käytöstä huolimatta, laaja enemmistö potilaista ei ole pystynyt toipumaan sairaudesta, eikä osoittamaan 20 merkittävää parantumista, jolloin taustalla oleva sairaus jatkaa etenemistään kuolemaan saakka.

Myös muiden yllättävämpien immunosuppressanttihoitojen, mukaan lukien T-solujen ^ poistajat ja modulaattorit kuten syklofosfamidi, on osoitettu olevan tehokkaita EAE- o , 25 mallissa, mutta käytettäessä näitä ihmisen multippeliskleroosisairaudessa oireet co ^ paranevat, mutta taustalla oleva sairaus jatkaa etenemistään. T-solut todellakin tuottavat ihmisessä hyödyllisiä sytokiineja, kuten TGF-βΙ :tä, kuin myös vahingollisia.

X

Q- David Baker, Ison-Britannian neurologian instituutista (Institute of Neurology, UK) § on esittänyt yhteenvedon sen eroavaisuuden välillä, mikä on tehokasta EAE:ssä ja g 30 MS:ssa, tutkielmassaan nimeltä 'Everything stops EAE, nothing stops MS' 10.

cv toukokuuta 2004 Ison-Britannian MS-järjcstön MS Frontiers -tapaamisessa Isossa-

Britanniassa.

5

On selvää, että immunosuppressio ei yksin pysty parantamaan MS-tautia. Tämä johtuu lähes varmasti MS-potilaiden perimmäisestä, taustalla olevasta aineenvaihduntahäiriöstä, joka johtaa solukalvon poikkeamiin, sytokiinin säätelyhäiriöön ja sitä seuraavaan immuunihyökkäykseen ja vaurioittamiseen. Vaikka 5 potilaat pääsevät remissioon relapsoivassa-remittoivassa sairaudessa, niin taustalla oleva demyelinaatio jatkuu.

MS-taudin hoidon 'kultaisena standardina' pysyy interferoni, kuten β-interferonia sisältävät Avonex®, Rcbif® ja muut interferonivalmisteet. Tämä kultaisen standardin 10 mukainen hoito keskittyy vain joidenkin potilaiden, esim. heistä 30 %:n, tarpeisiin ja heissäkin oireiden parantuminen on rajoittunut relapsien vakavuuden vähenemiseen. Vaikka oireet saattavat vähentyä osalla potilaista, sairauden taipumuksena on edetä myöhempään vammautumiseen ja kuolemaan taustalla olevan degeneraation vuoksi.

15 Esillä olevat keksijät ovat nyt yllättäen selvittäneet, että noudattamalla γ-linoleenihappoa sekä sopivaa rinnakkaista rasvahappopitoisuutta sisältävällä triglyseridiöljyllä suoritettavaa 'suuriannoksista' hoitoa voidaan saavuttaa merkittäviä parantumisasteita lähes kaikissa MS-taudin oireissa, mikä on esillä olevan kultaisen standardin mukaista hoitoa parempi keino. Tällainen tuloksellisuus on erityisen 20 yllättävää muiden γ-linoleenihappoa sisältävien valmisteiden aiemman käytön valossa, joilla ei ole saavutettu tällaista merkittävää tuloksellisuutta.

18-kuukautisen jakson aikana suuria annoksia valikoitua purasruohoöljyä nauttineet ^ potilaat osoittivat huomattavaa (p < 0,001) ja selvää parantumista EDSS- o , 25 pistemäärässä, vähentynyttä relapsimäärää, lihasten spastisuuden ja kivuliaiden co 1 aistioireiden symptomaattista lievittymistä sekä kognitiivisten toimintojen parantuneita objektiivisia mittaustuloksia. Pienillä annoksilla purasruohoöljyä ei ollut

X

vaikutusta.

o 00

(M

g 30 Suuria annoksia purasruohoöljyä nauttineet potilaat säilyttivät TGF-βΙ :n perifeerisen cv veren mononukleaaristen solujen tuotannon (PBMC) tasonsa koejakson aikana, heidän proinflammatoriset sytokiininsa TNF-α ja IL-Ιβ vähentyivät huomattavasti ja selvästi (< 70 %) ja heillä joko säilyi tai lisääntyi PBMC-kalvon pitkäketjuisten omega-6- 6 rasvahappojen dihomo-y-linolccnihappo (DHLA) ja arakidonihappo (AA) verrattuna lumelääkettä nauttineisiin potilaisiin, jotka osoittivat näiden rasvahappojen menetystä koejakson kuluessa.

5 Vaikka immunosuppression odotettaisiinkin vähentävän aktiivista vaurioitumista ja neurodegeneraatiota, esillä oleva hoitokeino on ilmeisesti suunnattu tärkeiden kalvolipidikomponenttien säilyttämiseen, joita muutoin menetetään erityisesti MS-taudissa, mikä viittaa metabolisen vian korjaamiseen, jota ei ole muutoin tehokkaasti hoidettu nykyisillä hoidoilla. Se seikka, että pienellä annoksella (5 grammaa/päivä) ei 10 ollut minkäänlaista vaikutusta tähän, tukee tällaista päätelmää.

Keksijät ovat erityisesti selvittäneet, että sekä γ-linoleenihaposta että linolihaposta, joilla on erityinen paikkajakauma triglyseridimolekyylien sisällä, edullisesti oleiinihapon kanssa, koostuvia triglyseridejä käsittävä triglyseridiöljy voi aikaansaada 15 ED S S-pistemäärän huomattavan laskun multippeliskleroosipotilailla useiden kuukausien ja vuosien kuluessa, mikä on tulos, joka ei ole saavutettavissa millään nykyisin annetulla hoidolla.

γ-linoleenihapon (18:3n-6, GLA) tiedetään olevan nopeasti muuttuvissa 20 pitempiketjuisten monityydyttymättömien omega-6-rasvahappojen dihomo-γ- linoleenihapoksi ja arakidonihapoksi in vivo (Phylactos et ai 1994, Harbige et ai 1995, 2000). Solukalvon pitkäketjuisten omega-6-rasvahappojen tason kohoamisen aikaansaamiseksi MS-taudissa keksijät ovat siksi tarkastelleet tuloksia, joita on saatu 21 useilla GLA:a sisältävillä öljyillä; sekä sieni- (sienestä Mucor javanicus) että kasvi- o ^ 25 (Borago officianalis), iltahelokki- Oenothera spp. tai mustaherukka- (Ribes spp) kuin (Ω 9 myös synteettisellä tri-GLA-öljyllä GLA-antojärjestelminä MS-taudin in vivo - m kokeellisessa eläinmallissa, joka tunnetaan kroonisena relapsoivana kokeellisena

X

dl autoimmuunina enkefalomyeliittinä (CREAE).

o oo

(M

J) 30 Kokeellinen autoimmuuni enkefalomyeliitti (EAE) on keskushermoston autoimmuuni o tulehdussairaus, johon liittyy tai ei liity demyelinaatiota ja joka voidaan indusoida jyrsijöissä tai muissa nisäkäslajeissa. EAE:n induktio rotissa (marsun emäksisen proteiinin avulla) ei kuitenkaan tuota histologisia ominaispiirteitä demyelinaatiosta 7 (Brosnan et ai 1988), mutta indusoi akuutin monofaasisen sairausmallin, toisin kuin MS, jolle on tunnusomaista keskushermoston demyelinaatio ja joka on kliinisesti relapsoiva-remittoiva. Krooniset, relapsoivat ja demyelinoivat EAE-mallit (CREAE), joille on tunnusomaista demyelinaatio ja relapsivaiheet, ovat siksi nykyisin MS-5 tutkimukseen valittuja eläinmalleja (Fazakerley 1997). Sen näytön myötä, että myeliinin oligodendrosyyttiglykoproteiini (MOG) on eräs merkittävä neuroantigeeninen kohde MS-taudissa (Genain et ai 1999) sekä sen näytön myötä, että perifeerisen veren autoreaktiivisilla lymfosyyteillä on MS-taudissa paljon suuremmat vasteet tätä neuroantigeenia kohtaan MBP:iin verrattuna (Keriero de Rosbo et ai 10 1993,1997), MOG-indusoitu CREAE on tullut valituksi eläinmalliksi, jonka ominaispiirteet muistuttavat läheisesti MS-taudissa havaittuja piirteitä (Fazakerely et ai 1997, Genain et ai 1999, Amor et ai 1994).

Näiden kokeiden tulosten perusteella omaksuttiin kaksi tärkeää valintakriteeriä 15 parantuneiden lipidiyhdisteiden valintaa varten nykyisten tavoitteiden saavuttamiseksi. CREAE- ja rottien EAE-syöttötutkimuksista saadut todisteet osoittavat, että rikastettu mustaherukkasiemenöljy (72 % w/w 18:3n-6, GLA) ei suojannut EAE: Itä (ks. taulukko 3). Tässä on merkittävää se, että mustaherukkasiemenöljyllä on alhainen sn-2-aseman GLA-pitoisuus pääosan GLA:sta 20 esiintyessä sn-1- ja sn-3-asemissa (Lawson ja Hughes 1988). Tämän lisäksi kolmea GLA:a sisältävä strukturoitu triasyyliglyseroli (TG-GLA) aikaansai vastaavia suojavaikutuksia kuin CREAE:ssä käytetty purasruohoöljy (taulukko 2). Tämä olisi johdonmukaista sen kanssa, että sn-2-aseman GLA:lla on tärkeä merkitys, ts. ^ ulommaisen parin sn-1- ja sn-3-aseman GLA poistuu entsymaattisesti in vivo ja sille ^ 25 tapahtuu todennäköisesti oksidaatio, jolloin jäljelle jää vain sn-2-aseman GLA. Tämä ^ selektiivinen hydrolyysi johtuu erityisten lipaasien tunnetusta kyvystä poistaa sn-1- ja sn-3-aseman rasvahappoja triasyyliglyserolimolekyyleistä, mutta ilmeisesti suojata sn-

E

2-asemaa in vivo (Lawson ja Hughes 1988, Kyle 1990).

o oo

(M

g 30 Keksijöiden tarkastelu näitä tietoja koskien osoittaa myös sen, että linolihappo- (LA) o ...

«m ja γ-linoleenihappojäännösten (GLA) suhde voi olla LA:a ja GLA:a sisältävien öljyjen tärkeä vaikutustekijä MS-taudin CREAE-mallissa (taulukko 1). Taulukko I esittää sieniöljyn, purasruohoöljyn, iltahelokkiöljyn ja safloriöljyn koostumusanalyysin ja 8 tehokkuuden CREAE:ssä. Tehokkain hoitokeino CREAE:n esiintymistiheyden vähentämisessä oli sieniöljy, jonka LA:GLA-suhde oli 0,85. Purasruohoöljy oli myös hyvin tehokas LA:GLA-suhteen ollessa 1,5. Tämän lisäksi GLA:a sn-1-, sn-2- ja sn-3-asemassa sisältävällä strukturoidulla triglyseridillä (TG-GLA) tehdyt kokeet osoittavat 5 GLA:n olevan vaikuttava aineosa. TG-GLA oli tämän lisäksi tehokas myös pienemmällä annostasolla kuin purasruohoöljy (ks. taulukko 2).

Eri purasruohosiemenöljyillä näyttää olevan myös vaihtelua sn-2-aseman GLA-tasossaan, esim. 10 % sn-2-aseman GLA:a (Liu et ai 2000) ja 40 % sn-2 (Lawson ja 10 Hughes 1988), mikä vastaa julkaisemattomia havaintojamme koskien sn-2-aseman GLA:a (vaihteluväli 38 - 46 %) ja mahdollisesti joidenkin purasruohoöljyjen kykenemättömyyttä tuottaa täysin suojaavia vaikutuksia CREAE:ssä, vaikka myös muut tekijät, kuten antioksidanttikoostumus, voivat olla tärkeitä (ei julkaistu). On raportoitu purasruohoöljy]'ä, joilla on jopa 60 % sn-2-aseman GLA:a (Huang ja Mills 15 (1996) γ-Linolenic acid: Metabolism and Its Roles in Nutrition and Medicine: luku 6) ja joiden on todettu olevan tehokkaita GLA:n toimittamisessa imunesteeseen.

Julkaisun EP 0520624 (Efamol Holdings) taulukossa 3 verrataan iltahelokki- ja purasruohoöljyjen triglyseridipitoisuutta, joista ensiksi mainitun on selvitetty olevan 20 jälkimmäiseksi mainittua terapeuttisesti tehokkaampi useissa eri GLA:lle herkissä häiriöissä. Tämä asiakirja osoittaa, että purasruohoöljyssä on kaksikymmentäseitsemän erilaista triglyseridikomponenttia, joista vain 20 %:ssa on sn-2-aseman GLA:a. Sivun 3, riveillä 40 - 42 todetaan, että biologinen testaus on ^ osoittanut, että samansuuruisilla määrillä GLA:a voi todellakin olla hyvin erilaisia o , 25 vaikutuksia, kun kyseinen GLA on hankittu erilaisina öljylähteinä. Asiakirja ohjaa co ^ sitten lukijan ratkaisevasti erääseen erityiseen fraktioon, jota esiintyy iltahelokkiöljyssä (Evening Primrose Oil, EPO), muttei purasruohoöljyssä, ja joka

X

Q- vastaa ensiksi mainitun ylivoimaisesta vaikutuksesta PGE1 :n (ks. EP 0520624, piirros, co sivu 4, ja taulukko 2) ja siten anti-inflammatorisen vaikutuksen lisäämisessä: jolloin g 30 kyseinen fraktio on di-linoeoyyli-mono-gamma-linolenyyli-glyseroli (DLMG), jota cv asiakirja toteaa olevan 18-19 % triglyseridin kokonaismäärästä EPO:ssa. Sivulla 6 perehdytetään selvästi, että GLA:n asemalla, sn-1-, -2- tai -3-asemalla, ei ole merkitystä tähän vaikutukseen.

9

Dines et ai (1994) Proceedings of the Physiological Society, Aberdeen Meeting, 14.- 16. syyskuuta 1994, raportoivat tutkimuksista koskien diabeettisen neuropatian neuronivaurion hoitoa julkaisun EP 0520624 kannattaman tyyppisiä öljyjä sisältävällä γ-linoleenihapolla ja toteavat edelleen, että purasruohoöljy ei ollut kovin tehokas 5 tämän neurodegeneraation hoitamisessa, kun taas iltahelokkiöljy oli. Tutkielmassa on päätelty, että purasruohoöljy sisältää muita aineosia, jotka häiritsevät GLA-aktiivisuutta.

Erona tähän tekniikan tasoon nähden esillä olevat keksijät käyttivät purasruohoöljyä, 10 joka oli valittu koetarkoitukseen sellaisena, että se sisälsi suurimman pitoisuuden sn-2-aseman GLA:a (> 40 %) - verrattuna sillä hetkellä saatavissa olevissa muissa näytteissä oleviin pienempiin määriin. Mustaherukkasiemenöljyn, jota oli sillä hetkellä saatavissa melko suurina määrinä, ei katsottu olevan optimaalista alhaisen sn-2-aseman GLA-pitoisuutensa vuoksi.

15

Eräänä muuna valintakriteerinä oli se, että pitkäketjuisten monoeenirasvahappojen kokonaismäärän taso pysyisi alle 5 %:n arvossa. Eri lähteistä peräisin olevien eri purasruohosiemenöljyjen (Borago officinalis) näytteissä oli merkittävä määrä erukahappoa (22:ln-9), eli 1,4 - 2,38 % rasvahappojen kokonaismäärästä, sekä muita 20 pitkäketjuisia monoeenirasvahappoja, eli 24:ln-9:a (nervonihappoa) ja 20:ln-9:a (gadoleiinihappoa) (taulukko 4).

E-vitamiinin absorptio-, aineenvaihdunta-, ja immuunitoimintoihin kohdistuvan U mahdollisen vaikutuksen vuoksi (Harbige 1996, 2003) kokeilussa oleva öljy sisälsi o , 25 lisäksi vain luonnollisia E-vitamiinitasoja (0,05 mg/g) eikä siinä ollut lisäksi lisättyä

CD

^ E-vitamiinia, kuten tavanomaisesti kaupallisten purasruohosiemenöljyjen tapauksessa (esim.l mg/g).

X

cc

CL

§ Uskotaan, että tällaisilla valikoiduilla öljyillä on immunosuppressoiva vaikutus, mutta g 30 mikä huomattavaa, niillä on myös metabolinen täydentämisvaikutus, josta on hyötyä cm vaurioihin kohdistuvien immuunihyökkäysten vähentämisessä samalla, kun ne luovat niiden kolaukseen vaadittavia tiloja, mikä on jotain, jota ei ole saavutettu millään aiemmin MS-tautiin tarjolla olleella lääkityksellä.

10

Esillä olevan keksinnön ensimmäisessä aspektissa on aikaansaatu menetelmä neurodegeneratiivisen sairauden hoidon tarpeessa olevan potilaan hoitamiseksi, joka käsittää terapeuttisesti vaikuttavan öljymäärän antamisen kyseiselle potilaalle, jolloin öljy sisältää sekä γ-linoleenihappo- että linolihappojäännöksiä triglyseridiesterinä, 5 jolloin γ-linoleenihappo- ja linolihappoj äännösten suhde triglyseridin sn-2-asemassa on vähintään 0,8; jolloin γ-linoleenihappojäännösten määrä sn-2-asemassa on vähintään 18 %, jolloin öljy annetaan annoksena, joka riittää säilyttämään tai kohottamaan potilaan TGF-P-tasoja terapeuttisille tasoille.

10 Terapeuttisilla tasoilla tarkoitetaan tasoja, jotka ovat vähintään vastaavia terveiden kohteiden kanssa. Annos on edullisesti sellainen, että se tuottaa potilaan vereen, 18 kuukauden kuluttua päivittäisestä annostelusta, TGF-β 1 /TNF-a-suhtccn, joka on 0,4 -3,0, vähintään 0,5, edullisemmin vähintään 0,75 ja edullisimmin vähintään 1. Annos on edullisesti sellainen, että se tuottaa potilaan vereen, 18 kuukauden kuluttua 15 päivittäisestä annostelusta, TGF-β 1 /IL-1 β-suhtccn, joka on vähintään 0,5, edullisemmin vähintään 0,75 ja edullisimmin vähintään 1. Mainitut tasot tuotetaan edullisesti 12 kuukauden kuluttua ja edullisemmin 6 kuukauden kuluttua.

Päivittäin annettu öljymäärä on tyypillisesti 3-30 grammaa, oraalisesti annosteltuna, 20 vielä edullisemmin 5-20 grammaa ja edullisimmin 7-18 grammaa, tyypillisesti 15 grammaa.

γ-linoleenihappoa ja linolihappoa sisältävien rasvahappojäännösten lisäksi öljy ^ sisältää edullisimmin esteröityä rasvahappoa, joka on nonstrukturaalinen, eli joka on ^ 25 metaboloitunut energian tuottamiseksi, kuten oleiinihappoj äännöksiä. Jäännöksellä ^ tarkoitetaan osaa, joka jää jäljelle sen jälkeen, kun rasvahapon karboksyyliryhmä ^ estcröityy j onkin glyseroli molekyyli n h ydroksyy 1 iryhmän kanssa.

S

0_ § Annettu öljy on edullisimmin öljylähde, joka on peräisin purasruohoöljystä tai ίο 30 sieniöljystä, esim. sienestä Mucorjavanicus.

o

CM

Tyypillisiä purasruohoöljy- ja sieniöljykoostumuksia on havainnollistettu taulukossa 11 1, jossa 18:2n-6 ja 18:3n-6 edustavat vastaavasti linoli- ja γ-linoleenihappojäännöstä prosentuaalisesti.

Purasruohoöljyt sisältävät tyypillisesti 20 - 25 % γ-linoleenihappoj äännöksiä 5 prosenttiosuutena öljyssä olevista rasvahappojäännöksistä ja 35 - 40 % linolihappojäännöksiä. Edulliset purasruohoöljyt ovat sellaisia, joissa esteröidyn γ-linoleenihapon määrä sn-2-asemassa on vähintään 35 % rasvahappoj äännöksistä kyseisessä asemassa, edullisemmin enemmän kuin 39 % ja vielä edullisemmin enemmän kuin 40 %. Edullisimmat öljyt sisältävät yli 41 %, kuten 42 - 44 % sn-2-10 aseman GLA:a, vaikka ihanteellisesti ne sisältävät sitä yli 45 %. Kuten Huang et ai ovat edellä todenneet, 60 % sn-2-aseman GLA:a sisältäviä purasruohoöljyjä on tuotettuja niitä tulisi olla saatavissa valintaa varten. Sn-1-ja sn-3-aseman jäännökset ovat edullisesti linoli-, oleiini-ja γ-linoleenihappojäännöksiä, jolloin edullisilla öljyillä on suhteellisen suuri oleiinihappopitoisuus vähintään yhdessä, ellei molemmissa, 15 näistä asemista, esim. 12 %:n ylimääränä, edullisemmin 14 %:n ylimääränä.

Esillä olevassa keksinnössä käytettäväksi soveltuvalla tyypillisellä purasruohoöljyllä on seuraavanlainen rasvahappoj akauma 20 Sn-1: 14 % 18:1 (oleiini), 54 % 18:2n-6 (linoli) ja 4 % 18:3n-6 (γ-linoleeni)

Sn-2: 14 % 18:1 (oleiini), 42 % 18:2n-6 (linoli) ja 40 % 18:3n-6 (γ-linoleeni)

Sn-3: 19 % 18:1 (oleiini), 18 % 18:2n-6 (linoli) ja 30 % 18:3n-6 (γ-linoleeni) ^ Jos käytetään sieniöljyä, kuten Mwcor-lajista peräisin olevaa, γ- o , 25 linoleenihappoj äännösten kokonaismäärä saattaa olla pienempi kuin co ^ purasruohoöljyllä, niin kauan kuin sn-2-aseman y-linoleenihappo:linolihapposuhde on vähintään 0,8, edullisemmin enemmän kuin 1. Tämä johtuu siitä, että sieniöljyjen x Q- taipumuksena on omata 'metabolisemmin' suunnattuja oleiinihappojäännöksiä kuin § linolihappojäännöksiä. Edulliset sieniöljyt ovat siten sellaisia, joissa esteröidyn γ- lÖ 30 linoleenihapon määrä sn-2-asemassa on vähintään 18 % rasvahappoj äännöksistä S kyseisessä asemassa, edullisemmin vähintään 20 % ja edullisimmin vähintään 22 %.

Edullisilla sieniöljyillä on 45 %:n ylimääränä sn-2-aseman rasvahappoj äännöksiä oleiinihappojäännöksinä, edullisemmin 50 %:n ylimääränä.

12

Sn-1: 25 % 18:1 (oleiini), 5 % 18:2n-6 (linoli) ja 13 % 18:3n-6 (γ-linoleeni)

Sn-2: 54 % 18:1 (oleiini), 19 % 18:2n-6 (linoli) ja 20 % 18:3n-6 (γ-linoleeni)

Sn-3: 40 % 18:1 (oleiini), 3 % 18:2n-6 (linoli) ja 20 % 18:3n-6 (γ-linoleeni) 5 Alan ammattilaiset ymmärtävät, että tällaisia öljyjä täytyy hankkia testaamalla mainittujen rasvahappojen prosenttiosuus kussakin asemassa keskiarvona määrätyssä öljyseoksessa olevia monia triglyseridejä koskien. Tällainen on hyvin tunnettua alan ammattilaisten keskuudessa, kuten esim. yrityksessä Mylnefiled Research Services Ltd, Lipid Analysis Unit, Mylnefiled, Inverghowrie, Dundee DD2,5DA, Skotlanti, 10 UK. Patentinhakijat ovat onnistuneet hankkimaan useita tällaisia öljyjä, jotka täyttävät edellä esitellyt kriteerit, jolloin suurimmat, noin 46 %:n, sn-2-luvut tavattiin esimerkiksi vuonna 2003 Uudesta-Seelannista hankituissa öljyissä: tämä voi luonnollisesti vaihdella vuodesta toiseen. On kuitenkin tärkeää, kun otetaan huomioon vasteen puuttuminen pienen purasruohoöljyannoksen (5g/päivä) yhteydessä, etteivät 15 potilaan toipumisyritykset heikenny aliannostusekvivalentin seurauksena annettaessa pienemmän sn-2-aseman %-osuuden GLA:a sisältävää purasruohoöljyä kuin mitä päivittäisannos vaatii.

Eräs muu NMR-menetelmä tällaisten öljyjen analysoimiseksi valintaprosessissa on 20 esitelty jäljempänä seuraavassa menetelmäosiossa. Ymmärretään kuitenkin, että jos kaikilla, määrätyllä hetkellä saatavissa olevilla öljyillä olisi alle 35 %:n sn-2-aseman GLA-luku, ja jos se olisi niillä edullisesti alle 40 tai 45 %, täydentäminen synteettisellä triglyseridillä tai triglyseridiseoksella on mahdollista. Alalla tunnetaan U useita sopivia lipidejä, jotka voivat olla esimerkiksi LGL:n, OGO:n, OGL:n, LGO:n o , 25 tai muiden purasruohoöljyssä tunnetusti esiintyvien aineosien eristettyjä tai ^ yhdistettyjä sekoituksia (ks. julkaisun EP 0520624 taulukko 3). Jopa TriGLA:a ^ voitaisiin lisätä (FR 2,617,161 (1988)), vaikka kyseisessä tarkoituksessa on edullista

X

estää sn-1- ja sn-2-aseman GLA-tasoja pääsemästä liian korkeiksi, sillä tämä § aiheuttaisi liiallisen proinflammatorisen vaikutuksen riskin ylivuodon johdosta g 30 systeemiseen GLA:oon ja siten DHGLA:oon sekä sen jälkeen cv arakidoniyhteenliittymiin. OGO:n synteesiin on perehdytty esimerkiksi teoksessa Y.- S. Huang, X. Lin, P. R. Redden ja D. F. Horrobin, J Am. Oil Chem. Soc., 72, 625 - 631 (1995) In vitro Hydrolysis of Natural and Synthetic γ-Linolenic Acid-Containing 13

Triascylglycerols by Pancreatic Lipase sekä teoksessa K. Osada, K. Takahashi, M. Hatano ja M. Hosokawa, Nippon Suisan Gakkaishi, 57, 119 - 125 (1991). Chem. Abs. 115: 278299 Molecular Species of Enzymically-synthesized Polyunsaturated Fatty acid-rich Triglycerides.

5

Hoitomenetelmien yhteydessä, joissa annetaan suuria määriä jotakin näistä korkean pitoisuuden sn-2-aseman GLA:a sisältävistä öljyistä, on suositeltu, että mahdollisesti toksisten pitkäketjuisten monoeenirasvahappojen, kuten erukahapon (22:ln-9), ja muiden pitkäketjuisten monoeenirasvahappojen, eli 24:ln-9:n (nervonihapon) ja 10 20:ln-9:n (gadoleiinihapon), määrä on mahdollisimman pieni, edullisesti vähemmän kuin 5 % rasvahappojäännöksistä, edullisemmin alle 3 % ja edullisemmin alle 2 %.

Edullisen öljyn eräs muu ominaispiirre on vähäisesti tai ei lainkaan lisätty E-vitamiini, niin että siinä esiintyy vain luonnollisia E-vitamiinitasoja (0,05 mg/g).

15

Esillä olevan keksinnön muut aspektit aikaansaavat edellä kuvattujen triglyseridiöljyjen käytön lääkkeen valmistamiseksi neurodegeneratiivisen sairauden hoitoon, tarkemmin sanottuna taustalla olevan neurodegeneraation pidättämiseksi ja hermosolutoiminnan palauttamiseksi. Tällaiset lääkkeet on tarkoitettu erityisesti 20 hermosolukalvon rakenteen normalisointiin, terveiden TGF-βΙ -/TN Fα-suhteidcn sekä muiden sytokiinien kanssa olevien TGF-pi-suhteiden palauttamiseen, multippeliskleroosissa esiintyvän neurodegeneraation pidättämiseen ja, osittain tai kokonaan, hermosolutoiminnan palauttamiseen, jota on mitattu esim. MRI- tai CAT-^2 kuvauksen avulla tai EDSS-pistemäärän avulla. Tällaiseen käyttöön kuuluu

O

, 25 aivohalvauksen, päävamman ja kallonsisäisen verenvuodon jälkeisen aivovaurion ° hoito, m

X

o- Lisäksi on aikaansaatu valikoituja triglyseridiöljyjä, jotka ovat erityisen tehokkaita § multippeliskleroosin hoidossa ja jotka aikaansaavat hyödyllisiä muutoksia sytokiinien g 30 suhteessa in vivo, jolloin nämä öljyt ovat edellä kuvatun menetelmän yhteydessä S edullisiksi esiteltyjä.

Esillä olevassa keksinnössä käytettäväksi tarkoitettuja öljyjä voidaan antaa millä 14 tahansa farmasia-alalla tunnetuilla tavanomaisilla keinoilla. Suotuisimmin niitä annetaan laimentamattomina öljyinä tai sekoitettuna moka-aineiden kanssa, kyseisiä öljyjä sisältävien kapseleiden muodossa tai enteropäällystetyissä muodoissa. Muita muotoja käy ilmi alan ammattilaisille antotekniikan kehittyessä.

5

Alan ammattilaiset ymmärtävät, että muita hyödyllisiä aineita voidaan yhdistää esillä olevassa keksinnössä käytettäväksi tarkoitettujen öljyjen kanssa. Nämä voivat olla ionikanavan salpaajia, esim. natriumkanavan salpaajia, interferoneja, T-solujen poistajia, steroideja tai muita lievittäviä aineita. Edelleen ymmärretään, että jos 10 immuuni- ja tulehdusvastetta on moduloitu, tällaisia yhdistelmiä täytyy tehdä varovasti, kun otetaan huomioon näiden järjestelmien monimutkainen luonne. Otettaessa huomioon kyseessä olevien öljyjen viivästynyt vaste lyhyempivaikutteiset aineet saattavat kuitenkin olla hyödyllisiä hoidon ensimmäisinä kuukausina ennen TGF-βΙ-tasojen normalisoitumista, mikäli lisähoito ei estä tätä 15 normalisoitumisprosessia.

Esillä olevaa keksintöä kuvataan nyt vain esimerkinomaisesti viittaamalla seuraaviin ei-rajoittaviin taulukoihin, esimerkkeihin ja kuvioihin. Keksinnön piiriin lukeutuvia muita suoritusmuotoja käy ilmi alan ammattilaisille näiden perusteella.

20

Taulukot

Taulukko 1: Esittää eri triglyseridiöljyjen rasvahappopitoisuuden kokonaismäärän ^ koostumus-% :n j a suoj avaikutuksen EAE: ssä.

™ 25

CD

^ Taulukko 2: Esittää kolmen hoitoryhmän parametrit korkean pitoisuuden sn-2-aseman GLA:a sisältävällä purasruohoöljyllä suoritetussa kokeessa, ir

CL

§ Taulukko 3: Esittää eri GLA-muotojen vaikutuksen EAE:n esiintymistiheyteen ja ίο 30 kliiniseen pistemäärään SJL-hiirillä.

o

(M

Taulukko 4: Esittää rikastetun mustaherukkaöljyn, joka on korkean pitoisuuden 15 GLA:a, mutta alhaisen pitoisuuden sn-2-aseman GLA:a sisältävä kasviöljy, kykenemättömyyden vetää vertoja sieni-ja purasruohoöljylle EAE:ssä.

Taulukko 5: Esittää kokeilussa olevan purasruohoöljyn neljän erän analyysitulokset, 5 erityisesti monoeenien osalta.

Taulukko 6: Esittää erään kokeeseen kuulumattoman öljyn analyysin, erityisesti monoeenien osalta.

10 Kuviot

Kuvio 1: Esittää perifeerisen veren mononukleaaristen solujen sytokiinituotantoa lumelääkkeellä ja kokeilussa olevalla öljyllä hoidetuilla MS-ihmispotilailla 18. kuukauden kohdalla.

15

Kuvio 2: Esittää pylväsdiagrammina kuvattuna lumelääkkeen ja pienen annoksen (5g/päivä) korkean pitoisuuden sn-2-aseman GLA:a sisältävän purasruohoöljyn vaikutuksen MS-ihmispotilaan EDSS-pistemäärään suureen annokseen (15g/päivä) verrattuna.

20

Kuvio 3: Esittää käyräcsitykscnä kuvattuna lumelääkkeen, pienen annoksen ja suuren annoksen korkean pitoisuuden sn-2-aseman GLA:a sisältävän purasruohoöljyn vaikutuksen MS-ihmispotilaan EDSS-pistemäärään.

δ , 25 Kuvio 4: Esittää pylväsdiagrammina lumelääkkeen, pienen annoksen ja suuren

CD

^ annoksen korkean pitoisuuden sn-2-aseman GLA:a sisältävän purasruohoöljyn vaikutuksen MS-ihmispotilaan keskimääräiseen relapsimäärään (%).

X

cc

CL

§ Kuvio 5: Esittää käyräesityksenä lumelääkkeen, pienen annoksen ja suuren annoksen g 30 korkean pitoisuuden sn-2-aseman GLA:a sisältävän purasruohoöljyn vaikutuksen MS- oj ihmispotilaan keskimääräiseen relapsimäärään (%).

16

Kuvio 6: Esittää öljyjen linolihappo:Y-linoleenihappo-suhteen vaikutuksen verrattuna niiden suojavaikutukseen hiirten CREAE:iin.

Menetelmät 5

Purasruohoöljynäytteissä olevan gammalinoleenihapon (GLA) paikka-analyysi kvantitatiivisen 13C-NMR:n avulla

Analyyttiset metodologiat triasyyliglyseroleissa olevan rasvahappokoostumuksen ja 10 paikkajakauman määrittämiseksi edellyttävät yleensä triasyyli glys ero lien hydrolyysiä entsyymien tai kemiallisten prosessien avulla ja sen jälkeistä mono- ja diasyyliglyscrolikomponenttien analysointia kromatografisilla tekniikoilla. Nämä menetelmät ovat destruktiivisia eivätkä mahdollista alkuperäisten näytteiden talteenottoa. Hydrolyysimenettely aiheuttaa tavallisesti joitakin asyylimigraatioita, 15 j öistä on seurauksena merkittäviä virheitä paikkaj akaumassa.

1 'i t t C -ydinmagneettisella resonanssilla (NMR) on useita ominaisuuksia, jotka tekevät sen soveltamisen paikka-analyysiin hyödylliseksi. Ensinnäkin, kemiallinen siirtymä on herkkä molekyylirakenteelle, mikä aikaansaa siten spektrin, jossa jokainen ydin 20 tunnistetaan piikin perusteella tietyssä ominaistaajuudessa. Ydinten resoluutio kussakin ympäristössä määritetään viivan leveyden ja viereisten piikkien välisten kemiallisen siirtymän erojen perusteella. Toiseksi, kustakin ytimestä nousevan piikin alapuolella oleva alue on verrannollinen kyseisessä ympäristössä olevien ydinten ^ lukumäärään nähden, koska kaikki 13C-ytimet osoittavat saman absorption. Tämän o , 25 vuoksi kemiallista siirtymää ja kunkin piikin integroitua aluetta voidaan käyttää co 1 kunkin ytimen sekä kvalitatiivisiin että kvantitatiivisiin mittauksiin. Kolmanneksi,

LO

näytteen valmistelu tätä sovellusta varten on yksinkertaista. Lopuksi, NMR on ei-x destruktiivinen tekniikka, joka mahdollistaa näytteen talteenoton muihin tarkoituksiin. § 13C-NMR-menetelmät perustuvat normaalisti karbonyylihiilten signaaliryhmien g 30 analysoimiseen. Kahden signaaliryhmän havaitaan normaalisti vastaavan sn-1,3- ja -2- ° asemissa olevia happoja. Ne erotetaan toisistaan tavallisesti helposti, koska kaksi ympäristöä aikaansaavat noin 0,4 ppm:n eron. Kummankin näiden kahden ryhmän sisällä täytyy olla erilliset signaalit kullekin hapolle tai happoryhmille. Tämä kriteeri 17 täytetään helpoiten, kun hapoilla on hiili-hiili-kaksoissidoksia (eli ne ovat tyydyttyniättömiä) karboksyyliryhmän lähellä, esim. n = 4, 5 tai 6. Saman kaksoissidosryhmän hapoista (esim. EPÄ ja AA) lähteviä karbonyylihiilten signaaleja ei normaalisti eroteta toisistaan. Tällaiset menetelmät näyttävät olevan hyödyllisiä 5 GLA:a sisältävien triasyyliglyserolien analysoimisessa ja asia on osoittautunut olevan näin.

Viitekirjallisuutta: M. M. BerganajaT. W. Lee, J. Am. Oil Chem. Soc., 73, 551 - 556 (1996) 10 G. Vlahov, Magn. Reson. Chem., 36, 359 - 362 (1998)

Kokeellinen osio

Materiaalit/näytteiden valmistelu 15 Yksiemäksistä happoa sisältäviä triasyyliglyseroleja ostettiin yrityksiltä Sigma Chemicals ja Nu-Chek-Prep Inc:

Tripalmitiini (Tri-16:0)

Tristeariini (Tri-18:0) 20 Trioleiini (Tri-18:ln-9)

Trilinoleiini (Tri-18:2n-6)

Trigammalinoleeni (Tri-18:3n-6)

Trieikoseeni (Tri-20:ln-9) 22 Trierukiini (Tri-22:ln-9)

O

^ 25 Trinervoniini (Tri-24:ln-9)

CD

o i tn ^ Noin 180 mg lipidiä 700 uL:ssa deuteriokloroformia käytettiin koko tutkimuksen

X

aikana.

o oo

CM

Jö 30 13C-NMR-tiedot o o

CM

1 Λ

Protonien irti kytkentää koskevat C-NMR-tiedot vaimennetulla NOE:llä kerättiin 21 °C:ssa 125.728 MHz:n taajuudessa toimivan Jeol 500 MHz -spektrometrin 5 mm:n 18 laajakaistaisella mittapäällä. Waltzin irti kytkentä oli valittu irtikytkentätapa ja se kytkettiin päälle vain 14,89 s keräysajan aikana. Relaksaatioviiveeksi asetettiin 30 s ja pulssin kulma oli 90°. Käytetty spektri-ikkuna oli n. 35 ppm (173,5 - 172,6 ppm) 170 ppm:n poikkeamalla. Spektrit olivat sisäisesti verrattavissa CDC^iin arvossa 77,0 5 ppm. Sopivaa signaalikohinaa varten kerätty likimääräinen ajojen lukumäärä vaihteli tyypillisesti välillä 300 - 1200 ajoa seoksen monimutkaisuudesta riippuen. Kokeiden kokonaiskeräysaika vaihteli välillä 1 - 4 h (purasruohoöljy 1272 ajoa/4h). Datapisteet 65 536.

10 Laskelmat 2- ja 1,3-asemassa olevat GLA:n karbonyyl isignaalit erotettiin hyvin triasyyliglyserolien spektreissä kauttaaltaan olevista karbonyylipiikeistä. Tämä mahdollisti 2-GLA/l,3-GLA-suhteen määrittämisen luotettavasti ja tarkasti kaikissa 15 tapauksissa. Menetelmä validoitiin analysoimalla testiseos, joka sisälsi 8 triasyyliglyserolia, mukaan lukien trigammalinoleenin, joiden tunnetut osuudet vastasivat purasruohoöljyn yhteydessä esitettyjä. Bruttokoostumukset oli määritelty aiemmin GLC:lla. Käytettiin kahta laskentamenetelmää. Ensimmäinen oli itsenäinen NMR-menetelmä, jolla 2-GLA:n prosenttiosuus laskettiin seuraavasti: 20 GLA:n sn-2-aseman piikin integraali x 3 x 100

Kaikkien sn-1-, -2-ja -3-integraalien kokonaismäärä δ , 25 Toisessa menetelmässä käytettiin NMR:sta saatua 2-GLA/l,3-GLA-integraalien ^ suhdetta j a GLC: 11a määriteltyä GL A-koostumusta seuraavasti: cc GLA:n sn-2-aseman piikin integraali x % GC-analyysistä saatua GLA:a x 3 o 00

(M

δ 30 GLA:n integraalien kokonaismäärä sn-1-, -2- ja -3-asemassa o

(M

Molempien laskujen tulokset olivat yhtäpitäviä. Pidämme yhdistettyä NMR-GLC-menetelmää tarkempana, koska siinä käytetään kummastakin menetelmästä saatuja 19 parametreja, joita voidaan mitata mitä suurimmalla tarkkuudella. GLA on purasruohoöljyn pääkomponentti ja siksi 2-/l,3-GLA-suhde voidaan määrittää NMRilla tarkasti, kuten tulokset osoittavat. GLC on yleensä NMR:a parempi vähäisenkin määrän rasvahappoja sisältävän koostumuksen määrityksessä, mutta se ei 5 pysty antamaan paikkaa koskevaa tietoa.

Yhteenveto

Kokeellisten tietojen yksityiskohdat on esitetty taulukoissa ja spektreissä. Niistä on 10 esitetty alla yhteenveto. Kapselit D ja B ovat jäljempänä raportoidussa kliinisessä kokeessa käytettyjä näytekapseleita.

1. 8-TG-testiseos 15 sn-2 GLA todettu 22,2 % todellinen 22,6 % virhe 1,8% 20 (n) =2

2. Kapseli-D

^ Brutto GLA todettu 21,4% (n = 3) ™ 25 GLC :11a co ° sn-2 GLA todettu 42,5 % (n = 2) LO v ' "" NMR:lla i virhe +/-1 § %

CM

S 30 o

cm 3. Kapseli-B

20

Brutto GLA todettu 21,1% (n = 3) GLC:lla sn-2 GLA todettu 40,8 % (n= 2) NMR:lla 5 virhe +/-1 % Näissä purasruohoöljynäytteissä sn-2-aseman GLA-pitoisuus on 41 - 42 %, eli lähes kaksinkertainen (1,95 x) bruttokoostumuksen pitoisuuteen nähden. Kirjallisuudessa 10 raportoitu todennäköinen tyypillinen näyte osoittaa 1,8-kertaisen rikastumisen bruttona.

NMR-menetelmää voidaan käyttää tuottamaan luotettavia analyysitietoja GLA:sta sn-2-asemassa. Se soveltuu todellakin erityisesti purasruohoöljylle, koska muut siinä 15 esiintyvät rasvahapot eivät toimi häiritsevinä tekijöinä. On mielenkiintoista, että NMR-menetelmästä saatujen tulosten on raportoitu täsmäävän vanhemmista derivatisaatio-kromatografisista menetelmistä saatujen tulosten kanssa. Näistä vanhemmista menetelmistä johdettu aiempi arviomme (40 %) täsmää myös NMR-tulosten kanssa.

20

Hoitoesimerkit

Kaksikymmentäkahdeksan aktiivisesti relapsoivaa-remittoivaa (kaksi relapsia ^ edeltävien 18 kuukauden aikana) multippeliskleroosipotilasta (iältään 18-65 v.) o , 25 otettiin kaksoissokkoutettuun, lumekontrolloituun kokeeseen kapseloidun to ^ purasruohoöljyn 18 kuukauden kuluessa aikaansaamien, kliiniseen aktiivisuuteen ja laboratorioparametreihin kohdistuvien vaikutusten tutkimiseksi. Kyseinen öljy oli x korkean sn-2-aseman γ-linoleenipitoisuuden (GLA) (> 40 % GLA:a sn-2-asemassa) § sekä alhaisen monoeenipitoisuuden (esim. erukahappoa) sisältävä ja ilman lisättyä E- lÖ 30 vitamiinia oleva, tunnettu immunomodulaattori.

o o

(M

Potilaita hankittiin neurologian potilaiden avohoitoklinikoilta kahdesta sisäkaupungin sairaalasta; sairaaloiden tietoinen suostumus saatiin ensimmäisellä (perus-)vierailulla.

21

Kieltokriteereihin kuuluivat kaikenlainen steroidi- tai immunosuppressiivinen lääkehoito, raskaus, hyperlipidemia, aspiriinin tai sen kaltaisten lääkkeiden käyttö ja vitamiini- tai rasvahappotäydentäminen edeltävien kolmen kuukauden sisällä.

5 Vain kaikki seuraavat kriteerit täyttävät potilaat otettiin mukaan kokeeseen: (a) kyky antaa tietoinen suostumus ennen hoitoa, täydellä ymmärryksellä siitä, että suostumus voidaan peruuttaa milloin tahansa haittaa tuottamatta; (b) 18 - 60-vuotias mies- tai naispuolinen avohoitopotilas; (c) potilailla on varmistettu diagnoosi kliinisesti varmasta relapsoivasta MS-taudista; (d) potilailla on ollut vähintään kolme 10 dokumentoitua kliinistä relapsia viimeisten kahden vuoden aikana; (e) potilaiden lähtökohtana olevan laajennetun toimintakyvyn rajoittuneisuusasteikon (Expanded Disability Scoring Scale, EDSS) pistemäärä on 0,0 - 5,5, edellyttäen, että heillä on hyvin dokumentoituja pahenemisvaiheita; ja (f) terve, MS-tautiin liittyviä oireita lukuun ottamatta, minkä vahvistavat sairashistoria, fyysinen tutkimus ja kliinisen 15 kemian kokeet sekä virtsa- j a verikokeet.

Farmasiaosasto jakoi potilaat satunnaisesti aina yhteen kolmesta ryhmästä, joissa oli kussakin 12 potilasta: - Yksi kliininen ryhmä (n=12), joka saa lumelääkettä (5 g polyetyleeniglykoli 400:aa) 20 - Toinen kliininen ryhmä (n=12), joka saa pienen annoksen (5 g) puhdistettua Borage officinalis -öljyä - Kolmas kliininen ryhmä (n=12), joka saa suuren annoksen (15 g) puhdistettua Borage officinalis -öljyä δ , 25 Täydentäminen tapahtui yksigrammaisten öljykapseleiden muodossa päivittäin ° (5/päivä pienen annoksen tapauksessa, 15/päivä suuren annoksen tapauksessa) 18

LO

^ kuukauden ajan. Borage officinalis -öljy ja monityydyttymättömät omega-6-

X

o- rasvahapot ovat ruoka-aineita, jotka on ihmisten elintarvikekäyttöön yleisesti § hyväksyttyjä (GRAS). EY-määräysten alaisia luokitus- tai merkintävaatimuksia ei ole.

c\i g 30 Kliiniseen arviointiin kuuluivat: laajennetun toimintakyvyn rajoittuneisuusasteikon ° pisteet (EDSS) ja kliininen relapsirekisteri. Laskimoverta (50 ml) otettiin laboratoriotutkimuksia varten täydentämisen 1., 3., 6., 15. ja 18. kuukautena.

22

Seuraavat biokemialliset ja immunologiset parametrit tutkittiin kullakin käyntikerralla vertailun vuoksi hoitoa edeltävien tietojen kanssa ja ryhmien tietojen välillä: - Stimuloitu ja stimuloimaton ex vivo perifeerisen veren mononukleaaristen solujen sytokiinituotanto: TGF-βΙ, IFN-γ, TNF-a, IL-Ιβ, IL-6 ja IFN-β, joiden on osoitettu 5 olevan osallisia MS-taudin patogeneesiin. Sytokiini ja siihen liittyvä geeniekspressio.

- Seerumissa olevat liukoiset adheesiomolekyylit, erityisesti ICAM-1 ja VCAM-1 - Perifeerisen veren mononukleaaristen solukalvojen rasvahapot ja plasman fosfolipidinrasvahappokoostumus.

10 Tulokset on esitetty taulukoissa 1 ja 2 sekä kuvioissa 1-5.

Ensisijainen tulosparametri oli kliinisten relapsien lukumäärä lähtökohdan (kuukausi 0) ja hoidon päättymisen (kuukausi 18) välillä. Toissijaisia tulosparametreja olivat: ensimmäiseen kliiniseen relapsiin saakka kuluva aika; relapsien vakavuus, arvioituna 15 ED S S-pistemäärän avulla ja steroidihoidon käyttö; sekä muutokset EDSS-pistemäärässä kuukausien 3, 6, 9, 12, ja 18 kohdalla lähtökohtaan verrattuna ja määriteltynä vähintään 1,0 pisteen nousuna EDSS-pistemäärässä, jota pidetään yllä 3 kuukauden ajan, tai vähintään 1,5 pisteen nousuna EDSS-pistemäärässä lähtökohtana olevaan ED S S-pistemäärään nähden, jota pidetään yllä 3 kuukauden ajan. Koska tälle 20 kokeelle ei myönnetty ulkoista rahoitusta, rahallisista syistä ei ollut mahdollista arvioida MS-taudin aktiivisuutta magneettiresonanssikuvauksella. 1/3

Yksitoista potilasta oli lumelääkeryhmässä, seitsemän potilasta oli nauttinut pieniä ^2 annoksia purasruohoöljyä, ja kymmenen oli nauttinut suuria annoksia o ^ 25 purasruohoöljyä. Tutkimuksen alaista lääkettä siedettiin hyvin, eikä 18-kuukautisen ° kokeen aikana ilmennyt minkäänlaisia vakavia haittailmiöitä.

LO

X

Q- Tulokset o 00

(M

g 30 Kahdelle potilaalle tuli ripuli, joiden kummankin vahvistettiin myöhemmin nauttineen ° suuria annoksia purasruohoöljyä. Ripuli oli lievä ensimmäisellä potilaalla, mutta kohtalaisen vakava toisella potilaalla, joka keskeytti myöhemmin tutkimuksen alaisen lääkkeen oton. Koodia ei murrettu ja ripuli loppui lääkkeenoton keskeyttämisen 23 jälkeen, mutta ilmeni uudelleen potilaan nautittua jälleen lääkettä. Tästä syystä kyseinen potilas otettiin pois kokeesta. Jäljellejääneet potilaat, joita hoidettiin suurilla annoksilla purasruohoöljyä, osoittivat erinomaista kliinistä parantumista kaikkien ensisijaisten ja toissijaisten tuloskriteerien suhteen. Esimerkiksi heidän 5 keskimääräinen EDSS-pistemääränsä oli parantunut 6 hoitokuukauden jälkeen lähtökohtana olevasta ED S S-pistemäärästä (kuvio 1). Ja mikä vielä tärkeämpää, kliinisten relapsien keskimääräinen lukumäärä oli laskenut huomattavasti 6 hoitokuukauden jälkeen verrattuna lumelääkeryhmässä esiintyneiden relapsien lukumäärään (kuvio 4). Potilaat, jotka olivat saaneet pieniä annoksia purasruohoöljyä, 10 eivät sen sijaan osoittaneet minkäänlaista kliinistä parantumista lumelääkeryhmään verrattuna. MS-taudin aktiivisuuteen kohdistuvan hyödyllisen vaikutuksen lisäksi suuri annos purasruohoöljyä aikaansai lihasten spastisuuden (jäykkyyden) ja kivuliaiden aistioireiden jonkinasteista symptomaattista lievittymistä sekä myös kognitiivisten toimintojen parantumista.

15

Kuten nähdään jäljempänä olevista kuvioista, relapsimäärä oli laskenut 9, 12 ja 18 kuukauden kuluttua nollaan suuriannoksisessa ryhmässä. 15. kuukauden kohdalla nähtävä nousu johtui erään potilaan poisjäämisestä tästä ryhmästä.

20 Seuraavaksi esitetään kolme lyhyttä tapaushistoriaa, jotka havainnollistavat suuren annoksen korkean pitoisuuden sn-2-aseman GLA:a sisältävän purasruohoöljyn terapeuttisia hyötyjä. Ensimmäiset kaksi ovat peräisin kokeesta, kun taas kolmannessa on kyse kokeen jälkeisestä potilaasta, jolta saatiin MRI-tutkimuksia.

δ ^ 25 Potilas 1 (Hoito): co o

LO

Ensimmäinen potilas oli 48-vuotias nainen, jolla oli ollut kliinisesti aktiivinen, ^ relapsoiva-remittoiva MS-tauti 9 vuoden ajan. Hän oli toiminut alun perin § kokopäivätoimisena hallintoviranomaisena paikallisessa terveysvirastossa, mutta ei g 30 pystynyt enää hoitamaan tehtäviään vakavan MS-tautinsa vuoksi. Tästä syystä hän ^ työskenteli myöhemmin osa-aikaisena sihteerinä, mutta hänellä oli silti liikkumisvaikeuksia lihasjäykkyyden ja aistihäiriöiden vuoksi. Hän koki lisäksi vakavia kliinisiä relapseja, keskimäärin yhden aina yhdeksän kuukauden aikana.

24 Pääosa näistä relapseista johti sairaalassa käynteihin steroidihoidon vuoksi. Hänen aktiivisen MS-tautinsa perusteella hänet otettiin mukaan purasruohoöljykokeeseen. Tutkimukseen liittyviä haittailmiöitä ei ilmennyt, ja nautittuaan lääkettä neljän kuukauden ajan hän koki melkoista parannusta kävelyssään ja aistioireissaan.

5

Noin yhdeksän kuukauden kuluttua hoidosta hän oli riittävän hyvässä kunnossa aloittaakseen kokopäivätyön. Hänellä ei myöskään esiintynyt relapseja 18 kuukautta kestäneen kliinisen kokeen aikana. Kokeen päättymisen jälkeen hoitokoodi paljasti, että hän oli nauttinut suuria annoksia purasruohoöljyä.

10

Potilas 2 (Kontrolli):

Toinen tapaus oli 46-vuotias nainen, jolla oli ollut myös kliinisesti aktiivinen relapsoiva-remittoiva MS-tauti 8 vuoden ajan. Hän oli toiminut alun perin 15 myymäläapulaiscna, mutta joutui työttömäksi MS-taudin diagnosoinnin j älkeen.

Hänen oireisiinsa kuuluivat liikkumisvaikeus ja kivuliaat aistioireet molemmissa jaloissa. Hän oli kokenut kolme kliinistä relapsia kliinistä koetta edeltävän kahden vuoden aikana, ja hän oli ollut kahdesti sairaalassa steroidihoidossa. Hänet otettiin 20 täten mukaan purasruohoöljykokeeseen, mutta hänen kävelynsä heikkeneminen jatkui. Oltuaan kuusi kuukautta kokeessa hänen täytyi käyttää kävelykeppiä ja hän sai myös baklofeenihoitoa raajojen lievän spastisuuden vähentämiseksi. Noin kymmenen kuukauden kuluttua purasruohoöljykokeen aloittamisesta hän joutui sairaalaan ^2 vakavan kliinisen relapsin vuoksi, jota hoidettiin steroideilla. Hänelle kehittyi ^ 25 myöhemmin rakkohäiriöitä ja hän alkoi käyttää pyörätuolia pitkillä matkoilla.

° Hoitokoodi murrettiin 18-kuukautisen kokeen päätyttyä, ja hänen todettiin nauttineen ^ lumelääkettä. Siitä lähtien hän alkoi käyttää kävelytelinettä 50 jaardia ylittävillä

X

Q- matkoilla.

o oo

(M

lÖ 30 Potilas 3: Hoito (kokeen ulkopuolinen) o

(M

Kolmas tapaus oli 26-vuotias mies, jolla oli diagnosoitu varma MS-tauti huhtikuussa 2001. Hänen oireensa olivat alkanet vuonna 1999, kun hän oli valitellut kehonsa eri 25 osiin, erityisesti rinnan vasemmalle puolelle ja vatsaan kohdistuvaa epäselvää, vaikeaa kipua. Sitä seurasi käsien ja jalkojen ajoittainen tunnottomuus, johon liittyi vaihtelevaa heikkouden tunnetta. Lisäksi hänellä esiintyi haittaavia rakko-oireita tihentyneen virtsaamistarpeen ja virtsaamispakon muodossa. Vuonna 2001 tehdyn 5 MS-taudin diagnoosin perusteena olivat hänen relapsoivat-remittoivat oireensa, ja sen varmistivat positiivinen selkäydinnesteanalyysi ja aivojen magneettiresonanssikuvaus (MRI), joka osoitti useita valkean aineen poikkeavuuksia molemmissa aivopuoliskoissa. Oireet eivät reagoineet eri lääkehoitoihin.

10 Huhtikuussa 2003 aloitettiin oraalinen täydentäminen kyseessä olevilla suurilla annoksilla purasruohoöljyä. Potilas ilmoitti oireidensa yllättävästä parantumisesta kolmen kuukauden sisällä tämän oraalisen täydentämisen aloittamisesta. Hänen kivuliaat aistioireensa katosivat kokonaan. Hän ilmoitti, ettei hänellä ollut esiintynyt tunnottomuutta tai heikkouden tunnetta toukokuusta 2003 lähtien, ja hän totesi 15 huomattavan parannuksen rakon hallinnassaan. Oraalinen täydentäminen ei aiheuttanut minkäänlaisia haittailmiöitä. Aivojen MRI suoritettiin uudelleen herra N:n oireiden ilmoitetun parantumisen varmistamiseksi. Uudelleen suoritettu MRI osoitti valkean aineen poikkeavuuksien koon pienenemistä ja jakautumisen vähenemistä.

δ

CM

co cp

LO

X

CC

CL

O

CO

CM

LO

o o

CM

26

Taulukko 1

Eri öljyjen koostumukselliset (% rasvahappojen kokonaismäärästä) ominaisuudet ja niiden suojavaikutukset EAE:ssä 5 ______

Hoito__18:2n-6 18:3n-6 18:2n-6/18:3n-6 18:ln-9 EAE:n esiintymistiheys FGO 17 20 0,6__35 0/10_ BOO 37 24 1,5__15 3/10_ EPO 71 9A 7,5__9__7/10_ SAF 66__:__17 9/10_

Kontrollit -__-__-__-__9/10_ FGO, Sieniöljy; BOO, purasruohoöljy; EPO, helokkiöljy; SAF, safloriöljy 10 Taulukko 2

Hoitoryhmät - purasruohoöljy - MS-koe

Nainen Mies Keskimääräinen Keskimäääräinen Lukumäärä relapsimäärä perus EDSS (viimeisen kahden vuoden _____aikana)___

Ryhmä Lumelääke 7__4__A6__329__11_

Pieni 5 2 2,9 "3Ä 7 __annos______

Suuri 8 2 3,4 2,8 10 __annos______

Yhteensä___20__8 2,9__3A__28_ 15

Taulukko 3 ^2 Triglyseroli-GLA:n (TGA-GLA), ctyyli-esteri-GLA:n (EE-GLA) ja Borago cm Officinalis öljy-GLA:n (BOR-GLA) molekyylimuotojen vertailu MOG-käynistetyssä co 20 CREAE:ssa SJL-hiirissä cp

Hoito__Lukumäärä, j oilla EAE Keskimääräinen kliininen pistemäärä x Kontrolli 10/11__3,3=1=1,3_ “ EE-GLA3 5/6__3,0±0,8_ o TG-GLA3 3/6__1,0±1,3C_ c3 BOR-GLAb 3/6 1,01±1,2C_ g 3 Eläimille annettu 100 μΐ testilipidiä; Annettu 250 μΐ BOR-GLA. Eron merkittävyys ^ verrattuna kontrolleihin, c p <0,05.

27

Taulukko 4

Rikastetun mustaherukkasiemenöljyn (73 % GLA) vaikutus EAE:n esiintymistiheyteen 5 _ % EAE:n esiintyminen (päiviä immunisaation jälkeen) _13_\J__21

Kontrollit (n=10) 60 90 10

Mustaherukka (n=10) 10_80_70_

Huomautus: Mustaherukkaöljy viivästyttää esiintymistä, mutta ei aikaansaa täydellistä suojaa. Eläimet syötettiin 7 päivää herkistyksen (immunisaation) jälkeen.

10 Taulukko 5

Kokeilussa olevan purasruohoöljyn analyysitulokset (% rasvahappojen kokonaismäärästä) __Näyte 1 Näyte 2 Näyte 3 Näyte 4

Rasvahapot %

16:0 13,29 13,47 12,86 ~13JT

16:ln7__0,21 0,22 0,21 0,21 18:0__3,50 3,47 3,54 3,50 18:ln9__16,22 16,22 16,33 16,22 18:ln7__0,64 0,66 0,65 0,64 18:2n6__38,00 38,01 38,25 37,96 18:3n6__22,59 22,66 22,69 22,56 18:3n3__0,18 0,18 0,17 0,19 20:0__0,20 0,18 0,20 0,21 20.1n9__2,96 2M 3,06 3,06 22:ln9__1,55 1,71 1,50 1,58 24:ln9 0,60 0,63 0,52 0,71 15 δ

(M

CD

O

tn

X

en

CL

O

00

(M

δ o o

(M

Taulukko 6 28

Erään kokeeseen kuulumattoman purasruohoöljyn analyysi (% rasvahappojen kokonaismäärästä) 5 __

Rasvahapot % Rasvahappojen kokonaismäärästä 16:0 11,07 16:ln-7 0,17_ 18:0__3/70_ 18:ln-9 16,37_ 18:ln-7 0,66_ 18:2n-6 37,71_ 18:3n-6 21,89_ 18:3n-3 0,17_ 20:0__0,25_ 20:ln-9 1111111_ 22:ln-9___ 24:ln-9 l|||llll δ

(M

i

CD

O

tn

X

en

CL

O

00

(M

δ o o

(M

Claims (34)

1. Triglyseridiöljyn käyttö lääkkeen valmistamiseksi neurodegeneratiivisen sairauden hoitoon, joka triglyseridiöljy sisältää sekä γ-linoleenihappo- että 5 linolihappojäännöksiä triglyseridiesterinä, tunnettu siitä, että γ-linoleenihappo- ja linolihappojäännösten suhde triglyseridin sn-2-asemassa on vähintään 0,8; γ-linoleenihappoj äännösten määrä sn-2-asemassa on vähintään 40 %, rasvahappojäännöksistä kyseisessä asemassa ja jossa öljy annetaan annoksena, joka riittää antamaan vähintään 1 gramman γ-linoleenihappoj äännöksiä, sn-2-aseman 10 jäännöksinä, pois lukien öljyn muu γ-linoleenihappopitoisuus ja riittää säilyttämään tai kohottamaan potilaan TGF-βΙ-tasoja terapeuttiselle tasolle.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, jossa terapeuttinen taso on sellainen, että se tuottaa potilaan vereen, 18 kuukauden kuluttua päivittäisestä annostelusta, TGF- 15 β 1 /TNF-α-suhteen, j oka on vähintään 0,5.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen käyttö, jossa TGF-βΙ/ΤΝΡ-α-suhde on vähintään 0. 75.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen käyttö, jossa TGF^ l/TNF-a-suhdc on vähintään 1.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, jossa annetun öljyn määrä on 3 - 30 ^ grammaa päivässä, o ™ 25 co

^ 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, jossa öljy annetaan oraalisesti. X

7. Jonkin edellä olevista patenttivaatimuksista mukainen käyttö, jossa öljyannoksessa § olevan γ-linoleenihapon määrä sn-2-asemassa riittää antamaan vähintään 2 grammaa iö 30 mainittua sn-2-aseman γ-linoleenihappoa. o (M

8. Jonkin edellä olevista patenttivaatimuksista mukainen käyttö, jossa öljyannos on 8 - 20 grammaa.

9. Jonkin edellä olevista patenttivaatimuksista mukainen käyttö, jossa γ-linoleenihappoa ja linolihappoa sisältävien rasvahappojäännösten lisäksi triglyseridi sisältää esteröidyn rasvahapon, joka on metaboloitu tuottamaan energiaa. 5

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen käyttö, jossa triglyseridi sisältää oleiinihappoj äännöksiä.

11. Patenttivaatimuksen mukainen 1 käyttö, jossa öljy on sellainen, joka on saatu 10 kasvista, j oka on valittu Borago-lajista.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen käyttö, jossa kasvi on Borago officinalis.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, jossa esteröidyn γ-linoleenihapon 15 prosenttiosuus sn-2-asemassa on vähintään 45 % rasvahappoj äännöksistä kyseisessä asemassa.

14. Jonkin edellä olevista patenttivaatimuksista mukainen käyttö, jossa sn-1- ja sn-3- asemassa oleviin rasvahappoj äännöksiin kuuluu lino li-, oleiini- ja γ- 20 linoleenihappojäännöksiä.

15. Jonkin edellä olevista patenttivaatimuksista mukainen käyttö, jossa triglyseridiöljyllä on oleiinihappopitoisuus toisessa tai molemmissa sn-1- ja sn-3- ^ asemissa 12 %:n ylimääränä. ™ 25 CD

^ 16. Jonkin edellä olevista patenttivaatimuksista mukainen käyttö, jossa triglyseridiöljy ^ sisältää alle 5 % monoeenirasvahappoj äännöksiä %:eina rasvahappoj äännösten ^ kokonaismäärästä. o oo (M g 30

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen käyttö, jossa triglyseridiöljy sisältää yhteensä cv alle 5 % erukahappoa (22:ln-9), 24:ln-9:a (nervonihappoa) ja 20:ln-9:a (gadoleiinihappoa) prosenttiosuutena rasvahappoj äännösten kokonaismäärästä.

18. Patenttivaatimuksen 16 tai 17 mukainen käyttö, jossa mainitun hapon määrä on 1 % - 5 % öljyssä olevista rasvahappojäännöksistä.

19. Jonkin edellä olevista patenttivaatimuksista mukainen käyttö, jossa öljyssä ei ole 5 lisättyä E-vitamiinia.

20. Jonkin edellä olevista patenttivaatimuksista mukainen käyttö, jossa E-vitamiinin määrä on 0 - 0,1 mg/g.

21. Jonkin edellä olevista patenttivaatimuksista mukainen käyttö, jossa lääke on tarkoitettu neurodegeneratiivisen sairauden pysäyttämistä varten tai hermosolutoiminnan palauttamista varten.

22. Jonkin edellä olevista patenttivaatimuksista mukainen käyttö, jossa lääke on 15 tarkoitettu multippeliskleroosin tai päävammaan, aivohalvauksiin ja kallonsisäisiin verenvuotoihin liittyvien degeneratiivisten jälkitilojen hoitoon.

23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen käyttö, jossa lääke on tarkoitettu vaurioiden kolaamista varten. 20

24. Patenttivaatimuksen 1 tai 22 mukainen käyttö, jossa lääke on tarkoitettu käytettävän hoidossa annoksena, joka riittää lievittämään lihasten spastisuutta ja/tai kipua. δ , 25

25. Patenttivaatimuksen 1 tai 22 mukainen käyttö, jossa lääkeannos riittää ^ parantamaan kognitiivista toimintaa. LO X Q-

26. Patenttivaatimuksen 1 tai 22 mukainen käyttö, jossa lääkeannos riittää poistamaan co relapseja. δ 30 o cm

27. Patenttivaatimuksen 1 tai 22 mukainen käyttö, jossa lääkeannos riittää parantamaan potilaiden ED S S-pistemäärää vähintään 1 yksiköllä 1 vuoden hoitojakson kuluessa.

28. Patenttivaatimuksen 1 tai 22 mukainen käyttö, jossa lääkeannos riittää palauttamaan potilaan, jolla on arvon 2,5 ylittävä EDSS-pistemäärä, EDSS-pistemäärän arvon 2 alapuolelle 1 vuoden hoitojakson kuluessa. 5

29. Triglyseridiöljy, joka öljy sisältää sekä γ-linoleenihappo- että linolihappojäännöksiä triglyseridiesterinä, γ-linoleenihappo- ja linolihappojäännösten suhde triglyseridin sn-2-asemassa on vähintään 0,8; γ-linoleenihappojäännösten määrä sn-2-asemassa on vähintään 40 % rasvahappoj äännöksistä kyseisessä asemassa, 10 tunnettu siitä, että öljy sisältää 0 - 0,1 mg/g E-vitamiinia käytettäväksi terapiassa.

30. Triglyseridiöljyn käsittävä farmaseuttinen koostumus, joka triglyseridiöljy sisältää sekä γ-linoleenihappo- että linolihappoj äännöksiä triglyseridiesterinä, γ-linoleenihappo- ja linolihappojäännösten suhteen triglyseridin sn-2-asemassa ollessa 15 vähintään 0,8; γ-linoleenihappoj äännösten määrän sn-2-asemassa ollessa vähintään 40 % rasvahappoj äännöksistä kyseisessä asemassa, tunnettu siitä, että koostumus sisältää 0 - 0,1 mg/g E-vitamiinia.

31. Patenttivaatimuksen 30 mukainen farmaseuttinen koostumus, jossa öljy on 20 i/orago-lajista.

32. Patenttivaatimuksen 30 mukainen farmaseuttinen koostumus, jossa esteröidyn γ- linoleenihapon prosenttiosuus sn-2-asemassa on vähintään 45 % ^ rasvahappoj äännöksistä kyseisessä asemassa. CM ώ 25 O

^ 33. Patenttivaatimuksen 30 mukainen farmaseuttinen koostumus, joka lisäksi käsittää eristetyn tai yhdistetyn triglyseridiseoksen, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat “ LGL, OGO, OGL, LGO ja GGG. o 00 CM § 30

34. Patenttivaatimuksen 30 mukainen farmaseuttinen koostumus, joka sisältää o ^ yhteensä alle 5 % erukahappoa (22:ln-9), 24:ln-9:a (nervonihappoa) ja 20:ln-9:a (gadoleiinihappoa) prosenttiosuutena rasvahappoj äännösten kokonaismäärästä.