FI118986B - Retrovirusperäisten proteaasi-inhibiittoreiden yhdistelmiä - Google Patents

Retrovirusperäisten proteaasi-inhibiittoreiden yhdistelmiä Download PDF

Info

Publication number
FI118986B
FI118986B FI964835A FI964835A FI118986B FI 118986 B FI118986 B FI 118986B FI 964835 A FI964835 A FI 964835A FI 964835 A FI964835 A FI 964835A FI 118986 B FI118986 B FI 118986B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
amino
hydroxy
phenylmethyl
methyl
propyl
Prior art date
Application number
FI964835A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI964835A0 (fi
FI964835A (fi
Inventor
Martin L Bryant
Karen E Potts
Mary Smidt
Simon P Tucker
Original Assignee
Searle & Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Searle & Co filed Critical Searle & Co
Publication of FI964835A0 publication Critical patent/FI964835A0/fi
Publication of FI964835A publication Critical patent/FI964835A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI118986B publication Critical patent/FI118986B/fi

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/27—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carbamic or thiocarbamic acids, meprobamate, carbachol, neostigmine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/63—Compounds containing para-N-benzenesulfonyl-N-groups, e.g. sulfanilamide, p-nitrobenzenesulfonyl hydrazide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Thiazole And Isothizaole Compounds (AREA)
  • Other In-Based Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

118986
Retrovirusperäisten proteaasi-inhibiittoreiden yhdistelmiä
Keksinnön taustaa 1. Keksinnön alue 5 Tämä keksintö koskee retrovirusperäisten proteaa- si-inhibiittorien yhdistelmien käyttöä lääkkeen valmistamiseen, joka on tarkoitettu retrovirusinfektioiden, kuten ihmisen immuunikatovirusinfektion (HIV-infektion), hoitamiseen, ja joka on tehokas estettäessä nisäkkään retrovi-10 rusten, kuten HIV:n, replikaatiota in vitro ja in vivo. Tämä keksintö liittyy erityisesti proteaasi-inhibiitto-riyhdisteisiin, joita käytetään yhdistelmähoidossa muiden proteaasi-inhibiittoriyhdisteiden kanssa.
2. Läheinen ala 15 Retrovirusten replikaatiosyklin aikana gag- ja gag-pol-geenitranskriptiotuotteet translatoituvat proteiineina. Seuraavaksi proteiinit prosessoituvat viruskoodatun proteaasin (tai proteinaasin) vaikutuksesta, jolloin saadaan virusperäisiä entsyymejä ja virusytimen rakenneprote-20 iineja. Tavallisimmin gag-prekursoriproteiinit prosessoituvat ydinproteiineiksi ja pol-prekursoriproteiinit pro- • · ·.· · sessoituvat virusperäisiksi entsyymeiksi, esim. käänteis- kopioijaentsyymiksi ja retrovirusperäiseksi proteaasiksi.
:*;*· On osoitettu, että oikea prekursoriproteiinien prosessoin- • · 25 ti retrovirusperäisen proteaasin vaikutuksesta on väittä- ···· . .·. mätön infektiovirionien kokoonpanoa varten. On esimerkiksi ♦ ♦ · osoitettu, että pistemutaatiot HIV:n pol-geenin proteaasi- • ♦ · alueella estävät gag-prekursoriproteiinin prosessoimista. HIV-proteaasin aktiivisen kohdan asparagiinihappotähteen • · · ***** 30 paikkakohdistetun mutageneesin avulla on myös osoitettu, että gag-prekursoriproteiinin prosessoituminen estyy. Si- ♦J. ten on yritetty inhiboida virusreplikaatiota inhiboimalla ·«·· .···. retrovirusperäisten proteaasien toimintaa.
···* • # Retrovirusperäinen proteaasi-inhibitio käsittää * * 35 tavallisesti siirtymätilassa olevan jäljittely-yhdisteen, ***** jolloin retrovirusperäinen proteaasi altistuu jäljittely- 118986 2 yhdisteelle, joka sitoutuu (tavallisesti reversiibelillä tavalla) entsyymiin kilpailussa gag- ja gag-pol-prote-iinien kanssa siten inhiboiden rakenneproteiinien spesifistä prosessoitumista ja vapauttaen itse retroviruspe-5 räistä proteaasia. Tällä tavalla retrovirusperäiset repli-kaatioproteaasit voivat tehokkaasti inhiboitua.
On ehdotettu useita jäljittely-yhdisteiden ryhmiä, erityisesti proteaasien inhibointia varten, kuten HIV-proteaasin inhibointia varten. Tällaisia jäljittely-10 yhdisteitä ovat mm. hydroksietyyliamiini-isosteerit, pelkistyneet amidi-isosteerit ja ei-peptidi-isosteerit. Katso esimerkiksi EP-hakemusjulkaisu 0 346 847; EP-hakemus- julkaisu 0 342 541; Roberts et ai., "Rational Design of Peptide-Based Proteinase Inhibitors", Science, 248, 358 15 (1990); Erickson et ai., "Design Activity, and 2.8Ä Crys- ! tai Structure of a C2 Symmetric Inhibitor Complexed to HIV-1 Protease", Science, 249, 527 (1990); ja S. Thais- rivongs, "Structure-Based Design of Non-Peptide HIV Protease Inhibitors", 35th Annual Buffalo Medicinal Chemistry 20 Meeting, State University of New York at Buffalo, Buffalo, NY, 22. - 25. toukokuuta 1994.
• · · Ongelmana retrovirusperäisten proteaasi-inhibiit- j *♦ · • torien, kuten HIV-proteaasi-inhibiittorien, kyseessä ol- :Y: lessa on ollut inhibiittorille resistentin viruksen kanto- « · ·· 25 jen kehittäminen. Esimerkiksi Merck & Co. :n HIV-proteaasi- ···· . .·. inhibiittori L-735 524 on tehokas ihmisen HIV-infektioita * · · ··· vastaan, mutta potilaissa kehittyy myöhemmin L-735 524- • · · resistenttejä HIV-kantoja (Waldholz, The Wall Street Jour-nai, 25. helmikuuta 1994, sivu B3; ja Condra et ai., Na- · · **]’1 30 ture 374: 569 - 571 (1995)). Muita esimerkkejä voi löytää • · *··' julkaisuista Vacca et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: ··· 4096 - 4100 (1994); Ho et ai., J. Virol. 68: 2016 - 2020
*t·· I
(1994); ja Sardana et ai., Biochem. 33: 2004 - 2010 (1994) .
* 1! 35 * · 3 118986
Keksinnön lyhyt kuvaus Tämä keksintö koskee (a) ensimmäisen retrovirusperäisen proteaasi-inhibiittorin tehokkaan määrän; ja 5 (b) toisen retrovirusperäisen proteaasi-inhibiit torin tehokkaan määrän käyttöä lääkkeen valmistamiseen, joka on tarkoitettu retrovirusinfektioiden hoitamiseen, jolloin mainittu toinen retrovirusperäinen proteaasi-inhibiittori on tehokas ainakin yhtä sellaista retrovirus-10 kantaa vastaan, joka on resistentti mainitulle ensimmäiselle retrovirusperäiselle proteaasi-inhibiittorille, ja jolloin mainittu ensimmäinen retrovirusperäinen proteaasi-inhibiittori on N-(2(R)-hydroksi-1(S)-indanyyli)-2(R)-fenyylimetyyli-4(S)-15 hydroksi-5-(1-(4-(3-pyridyylimetyyli)-2(S)-N'-(t-butyyli- karboksiamido)piperatsinyyli))pentaaniamidi; N-tert-butyylidekahydro-2-[2(R)-hydroksi-4-fenyyli-3(S)-[[N-(2-kinolyylikarbonyyli)-L-asparaginyyli]amino]butyy-li] - (4aR, 8aS) -isokinoliini-3 (S) -karboksiamidi 20 (2S,3R,4S,5S)-2,5-bis-[N-[N-[[N-metyyli-N-(2-pyridinyyli- metyyli)amino]karbonyyli]valinyyli]amino]-3,4-dihydroksi- • · :.· · 1,6-difenyyliheksaani; • *φί (2S, 3S, 5S) -5- [N- [N- (N-metyyli-N- [ (2-isopropyyli-4-tiatso- :V: lyyli) metyyli] amino] karbonyyli] valinyyli] amino] -2- [N- [ (5- ··· 25 tiatsolyyli) metoksikarbonyyli] amino] -3-hydroksi-1,6-dife- ···· . nyyliheksaani; ··· .«··. [2R-hydroksi-3- [ [ (4-aminofenyyli) sulfonyyli] - (2-metyyli- ♦ * ♦ propyyli)amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]karbamiiniha- , . pon 3S-tetrahydrofuranyyliesteri; • · · **]·* 30 N-tert-butyylidekahydro-2- [2 (R) -hydroksi-4- (fenyylitio) - • ♦ *···* 3 (S) - [ [N- [ (2-metyyli-3-hydroksifenyyli) karbonyyli] amino] - 118986 4 N-[2R-hydroks i-3-[[(1,3-bentsodioksol-5-yyli)sulfonyyli]-(2-metyylipropyyli)amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]-2S-[[(pyrrolidin-l-yyli)asetyyli]amino]-3,3-dimetyylibutaani-amidi; 5 N-[2R-hydroksi-3-[(2-metyylipropyyli)-[(1,3-bentsodioksol- 5-yyli)sulfonyyli]amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]-2S-metyy1i-3-(metyy1i sulfonyy1i)propaaniamidi; [IS- [1R* (R*) ,2S*] ] -N- [2-hydroksi-3- [N1- (2-metyylipropyyli) -N1-(4-metoksifenyylisulfonyyli)amino]-1-(fenyylimetyy-10 li)propyyli]-2-metyyli-3-(metyylisulfonyyli)propaaniamidi; 2S- [ [ (N-metyyliamino)asetyyli]amino]-N-[2R-hydroksi-3-[[(1,3-bentsodioksol-5-yyli)sulfonyyli]-(2-metyylipropyy-li)amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]-3,3-dimetyylibutaa-niamidi tai 15 (2R,3S)-3-(N-metyyliaminoasetyyli-L-tert-butyyliglysinyy- li)amino-1-(N-isoamyyli-N-(tert-butyylikarbamoyyli))amino- 4-fenyyli-2-butanoli.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Retrovirusperäinen proteaasi on ratkaiseva entsyy-20 mi retrovirusreplikaatioprosessissa. Retroviruksen, kuten HIV:n, lisääntymistä voidaan estää altistamalla virus ret- • * ; rovirusperäiselle proteaasi-inhibiittorille. Kun kyseessä • · · • *#ί on retroviruksen pitkitetty altistus proteaasi-inhibiit- :V; torille, voidaan kuitenkin valita eri retroviruksia niin, • · ··· 25 että syntyy proteaasi-inhibiittorille resistentin retrovi- ···♦ . .*. ruksen uusi vallitseva kanta. Retroviruksen uusi vallitse- • · · l»« va kanta voi tuottaa proteaasia, joka ei enää inhiboidu • · · tai useammin inhiboituu riittämättömästi proteaasi-, . inhibiittorin vaikutuksesta ja voi vapaasti lisääntyä jopa • i · 30 proteaasi-inhibiittorin läsnä ollessa, ellei inhibiittorin • · *·;·* pitoisuus ole oleellisesti suurentunut. Tämä keksintö tar- •j* joaa menetelmän retrovirusperäiselle proteaasi-inhibiit- ·*"· torille resistenttien retroviruskantojen kehittymisestä • · · *. pääsemiseksi.
] 35 Tässä keksinnössä otetaan huomioon ainakin kahden retrovirusperäisen proteaasi-inhibiittorin tehokkaan mää- 118986 5 rän antaminen nisäkkäälle, kuten ihmiselle, apinalle, kissalle ja niiden kaltaisille. Antaminen voidaan toteuttaa antamalla yhdessä ainakin kahta retrovirusperäistä prote-aasi-inhibiittoria, so. antamalla kahta tai useampaa ret-5 rovirusperäistä proteaasi-inhibiittoria, niin että mainitussa nisäkkäässä on läsnä tehokas määrä ainakin kahta inhibiittoria minä tahansa ajanhetkenä. Vaihtoehtoisesti antaminen voidaan suorittaa ainakin kahden retrovirusperäi-sen proteaasi-inhibiittorin peräkkäisellä tai vuorottele-10 valla antamisella, so. antamalla kahta tai useampaa retrovirusperäistä proteaasi-inhibiittoria niin, että mainitussa nisäkkäässä on läsnä tehokas määrä vain yhtä inhibiittoria minä tahansa ajanhetkenä. Retrovirusperäisten proteaasi -inhibiittorien oikealla valinnalla tällä menetelmällä 15 voidaan tehokkaasti kontrolloida retroviruksen lisääntymistä jopa mille tahansa inhibiittoreille resistenttien kantojen läsnä ollessa.
Retrovirusperäiset proteaasi-inhibiittorit valitaan retroviruksen resistentin kannan (resistenttien kan-20 tojen) profiilin perusteella, joka kanta syntyy in vivo tai in vitro altistettaessa inhibiittori retrovirusten li- j · · : sääntyvälle viljelmälle. Retrovirusperäiset proteaasi- »· · * *.! inhibiittorit valitaan ristikkäisresistenssin puuttuessa :V: ainakin yhden retrovirusperäisen resistentin kannan avul- ··· 25 la. Retrovirusperäisen kannan katsotaan olevan ristikkäis- • »n ; resistentti kahdelle proteaasi-inhibiittorille, kun retro- ··· virusperäinen kanta on resistentti molemmille inhibiitto- • · · reille. Vaikka jonkin verran ristikkäisresistenssiä voi- ,, daan sietää, valittujen retrovirusperäisten proteaasi- *.** 30 inhibiittorien, kun niitä pidetään ryhmänä, välillä ei ♦ · *···’ edullisesti ole yhtään ristikkäisresistenssiä. Siten ret- *:* roviruksen muunnelma (tai mutantti kanta) , joka voi muo- «··· :***; dostua ensimmäiselle retrovirusperäiselle proteaasi- ··· : * . inhibiittorille altistuksen tuloksena, inhiboituisi vielä \ 35 toisen retrovirusperäisen proteaasi-inhibiittorin vaiku tuksesta, tai muunnelma, joka voi muodostua sekä ensimmäi- ! 118986 6 selle että toiselle retrovirusperäiselle proteaasi-inhibiittorille altistuksen tuloksena, inhiboituisi vielä kolmannen retrovirusperäisen proteaasi-inhibiittorin tai neljännen retrovirusperäisen proteaasi-inhibiittorin jne.
5 vaikutuksesta.
Suoritetaan ristikkäisresistenttiprofiilien vertailu eri proteaasi-inhibiittorien välillä ja yhdistelmähoitoa varten valitaan yhdisteet, joilla edullisesti on vain vähän tai ei yhtään ristikkäisresistenssiä. Lääke-10 resistenssifenotyyppi voidaan jakaa ei-resistenssiin, al haisen tason resistenssiin (vähemmän kuin noin 10-kertainen muutos EC5o:ssä tai ECgo:ssä), keskitason resistenssiin (noin 10 - noin 100 -kertainen muutos EC50:ssä tai EC90:ssä), tai korkean tason resistenssiin (suurempi 15 kuin noin 100-kertainen muutos ECso:ssä tai EC90:ssä) . On odotettavissa, että lääkeresistenssi korreloi pienentyneen vaikutuksen kanssa potilaan viruskuormaan, kun saavutettavissa olevilla in vivo -inhibiittoripitoisuuksilla on vähentynyt proteaasi-inhibitiovaikutus resistenttiin viruk-20 seen. Siten edullisempia proteaasi-inhibiittorien yhdis telmiä ovat yhdistelmät, joilla on minimaaliset ristik- • · : käisresistenssiprofiilit (so. edullisesti korkeintaan kes- • *t! kitason resistenssi, edullisemmin korkeintaan alhaisen ta- 5^:*; son resistenssi ja edullisimmin ei resistenssiä) ja maksi- ··· 25 maalinen sisäinen tehokkuus villejä tyyppejä olevia ja/tai ···· . .·. resistenttejä viruksia kohtaan, jotka on valittu toista *·« .···, inhibiittoria vastaan. Esimerkiksi edulliset yhdisteet yh- • · · distelmässä käyttöä varten ensimmäisen yhdisteen kanssa , . ovat edullisesti tehokkaita viruskantoja vastaan, joilla • · · '*[;* 30 on keskitason, edullisemmin korkean tason, resistenssi en- • *···* simmäistä yhdistettä kohtaan. Kunkin inhibiittorin ja yh- ··· distelmän farmakologia ja toksikologia ovat myös yhdistel- ·*·· .’**· mähoitoon tarkoitettujen inhibiittorien valinnassa vaikut- *» * , tavia tekijöitä.
* 35 Edullisemmin valitaan retrovirusperäisiä proteaa- ’ * si-inhibiittoreita, kun ainakin yhdessä ensimmäiselle ret- 118986 7 rovirusperäiselle proteaasi-inhibiittorille resistentissä viruskannassa ja ainakin yhdessä toiselle retrovirusperäi-selle proteaasi-inhibiittorille resistentissä viruskannassa proteaasipeptidisekvenssissä on erilaisia aminohappo-5 korvautumisia, jotka vaikuttavat proteaasin samaan sub-straattisitoutumiskohdan alueeseen ja myötävaikuttavat havaittuun inhibiittoriresistenssiin. Siten mahdollisten aminohappokorvautumisten määrä, joka voi esiintyä proteaasin samassa kohdassa, on rajoitettu. Tämä on erityisesti 10 paikkansa pitävää silloin, kun kohta on ratkaiseva entsyymin aktiivisuudelle, tehokkuudelle ja/tai stabiilisuudel-le.
Tämä seikka havaitaan tässä esitettyjen esimerkkien 1 ja 2 HIV-proteaasi-inhibiittorien yhteydessä. Retro-15 virusresistenssi esimerkin 1 yhdisteelle johtui paikkamu-taatiosta HIV-proteaasin aminohapossa 88 (asparagiinin 88 korvautuminen asparagiinihapolla 88). Retrovirusresistens-si esimerkin 2 yhdisteelle johtui myös paikkamutaatiosta HIV-proteaasin aminohapossa 88 (asparagiinin 88 korvautu-20 minen seriinillä 88). Joidenkin korvautumisten aminohapossa 88 tiedetään aiheuttavan entsyymiaktiivisuuden katoa- • f ; mistä (Loeb et ai., Nature 340: 387 - 400 (1989)). Siten ·· · • sekä esimerkin 1 että 2 HIV-proteaasi-inhibiittorien anta- :V: minen pienentää oleellisesti molemmille inhibiittoreille ··· 25 ristikkäisresistentin viruksen resistentin kannan menes- ··*· . tyksellisen jatkotuotannon todennäköisyyttä. Mitään resis- • · · tenssiä molemmille yhdistelmässä käytetyille inhibiitto- • · · reille ei ole todettu 6 viikon käsittelyn aikana verrattu- . . na yksittäiselle inhibiittorille resistentin fenotyypin *·[;* 30 syntymiseen saman ajan puitteissa. Entsyymiaktiivisuuteen • · *···* vaikuttavien paikkamutaatioiden lisäksi samassa muunnel- •j* massa voi myös syntyä muita paikkamutaatioita, jotka eivät :***· oleellisesti vaikuta entsyymiaktiivisuuteen ja/tai resis- ·♦· • . tenssiin.
35 Vaihtoehtoisesti edullisemmin valitaan retrovirus- * * peräisiä proteaasi-inhibiittoreita, kun ainakin yhdellä 118986 8 ensimmäiselle retrovirusperäiselle proteaasi-inhibiittorille resistentillä viruskannalla on lisääntynyt herkkyys mainittua toista proteaasi-inhibiittoria kohtaan tai kun ainakin yhdellä toiselle retrovirusperäiselle proteaasi-5 inhibiittorille resistentillä viruskannalla on lisääntynyt herkkyys mainittua ensimmäistä proteaasi-inhibiittoria kohtaan.
Esimerkkejä retrovirusperäisistä proteaasi-inhibiittoreista, jotka sopivat käytettäviksi nyt kyseessä 10 olevassa menetelmässä, ovat näihin kuitenkaan rajoittumatta proteaasi-inhibiittorit, jotka on esitetty ja kuvattu hakijan omissa ja samanaikaisesti vireillä olevissa US-patenttihakemuksissa sarjanumerot 08/152 934 (tehty 15. marraskuuta 1993), 08/253 531 (tehty 3. kesäkuuta 15 1994), 08/109 787 (tehty 20. elokuuta 1993), 08/110 911 (tehty 24. elokuuta 1993), 08/110 913 (tehty 24. elokuuta 1993), 08/110 912 (tehty 24. elokuuta 1993), 08/204 827 (tehty 2. maaliskuuta 1994), 07/886 556 (tehty 20. toukokuuta 1992), 07/886 663 (tehty 20. toukokuuta 1992), 20 07/886 531 (tehty 20. toukokuuta 1992), 08/148 817 (tehty 8. marraskuuta 1993), 08/886 700 (tehty 21. toukokuuta • · i,: : 1992) ja 07/998 187 (tehty 29. joulukuuta 1992) ja • \i PCT-patenttihakemuksissa nrot PCT/US93/10552 (tehty 29.
lokakuuta 1993), FCT/US93/10460 (tehty 29. lokakuuta 1993) • · ··· 25 ja PCT/US93/10461 (tehty 29. lokakuuta 1993), joista kukin • «t» . .*. sisällytetään tähän viittauksella kokonaisuudessaan. Mui- • · · ta retrovirusperäisiä proteaasi-inhibiittoreita, jotka so- • · · pivat nyt kyseessä olevassa menetelmässä käytettävik- . . si, ovat näihin kuitenkaan rajoittumatta proteaasi- • · · **];' 3 0 inhibiittorit, jotka on esitetty ja kuvattu US-patent- • · *···’ tijulkaisussa 5 157 041,- EP-hakemusjulkaisussa 346 847; *;* US-patenttihakemuksessa sarjanro 07/883 825 (tehty 15.
···· .·*·. toukokuuta 1992); W0 93/09096; ssa; Tet. Lett. 35: 673 - ", 676 (1994); Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91: 4096 - 4100 ] 35 (1994); Y.N. Wong et ai., Biopharm. & Drug Dispos. 15: 535 * * - 544 (1994); M.L. West ja D.P. Fairlie, Trends Pharmacol.
118986 9
Sei. 16: 67 - 75 (1995); ja S. Thaisrivongs, "HIV Protease Inhibitors", Ann. Reports Med. Chem., Voi. 29, kappale 14, s. 133 - 144 (1994) (Academic Press, J. Bristol, toim.), joista kukin sisällytetään tähän viittauksella kokonaisuu- 5 dessaan.
Menemättä enempää yksityiskohtiin uskotaan, että alan ammattimies pystyy edellä esitettyä kuvausta käyttäen käyttämään tätä keksintöä sen täydessä laajuudessa. Seu-raavien edullisten spesifisten toteutusmuotojen ei tarkoi-10 teta tarjoavan tyhjentävää kuvausta kaikista mahdollisista yhdisteyhdistelmistä, vaan sen tarkoitetaan ainoastaan tarjoavan esimerkkejä lääkeyhdistelmistä, joiden odotetaan olevan tehokkaita. Näiden ja muiden proteaasi-inhibiittorien samanlainen tutkiminen käyttäen resistenttejä vi-15 rusisolaatteja, jäljempänä lueteltuihin rajoittumatta, voi auttaa sopivien lääkeyhdistelmien identifioimista. Sen vuoksi seuraavien edullisten spesifisten toteutusmuotojen katsotaan olevan ainoastaan valaisevia eikä esityksen muuta osaa millään tavalla rajoittavia.
20 Esimerkki 1 U: ö :0 J oh 1^, ^ f v · o [IS-[1R*(R*),2S*]]-N1-[3-[[[(1,1-dimetyylietyyli)- • · » *·*·* amino] karbonyyli] ) -2-metyylipropyyli) amino] -2-hydroksi-l- (fenyylimetyyli) propyyli] -2- [ (2-kinolinyylikarbonyyli) ami-25 no]butaanidiamidi voidaan valmistaa hakijan omissa ja sa- ··· .···, manaikaisesti vireillä olevissa US-patenttihakemuksissa • · ** sarjanumerot 08/152 934 (tehty 15. marraskuuta 1993) ja ** * 08/156 498 (tehty 3. marraskuuta 1993) esitettyjen mene- *”’· telmien mukaisesti, jotka hakemukset sisällytetään tähän 30 viittauksella kokonaisuudessaan.
10 118986
Esimerkki 2 ^ V.
(2R,3S)-3-(N-metyyliaminoasetyyli-L-tert-butyyli-glysinyyli)amino-1-(N-isoamyyli-N-(tert-butyylikarbamoyy-5 li))amino-4-fenyyli-2-butanoli voidaan valmistaa hakijan omissa ja samanaikaisesti vireillä olevissa US-patentti-hakemuksissa sarjanumerot 08/109 787 (tehty 20. elokuuta 1993), asiamiehen viitenumero 2766/1, tehty yhdessä tämän hakemuksen kanssa, ja 08/156 498 (tehty 23. marraskuuta 10 1993) esitettyjen menetelmien mukaisesti, jotka kaikki kolme hakemusta sisällytetään tähän viittauksella kokonaisuudessaan.
Esimerkki 3 S fvJtah ;·ϊ Sr B 08 • ·· · > 15 [2R-hydroksi-3-[ [ (4-metoksifenyyli) sulfonyyli] - (2- • •e S.J · metyylipropyyli) amino] -IS- (fenyylimetyyli) propyyli] karba- miinihapon 5-pyrimidyylimetyyliesteri voidaan valmistaa hakijan omissa ja samanaikaisesti vireillä olevissa US- • · .***. patenttihakemuksissa sarjanumerot 08/110 911 (tehty 24.
*. 20 elokuuta 1993) ja 08/156 498 (tehty 23. marraskuuta 1993) • · · •••| esitettyjen menetelmien mukaisesti, jotka molemmat hake- • · *···* mukset sisällytetään tähän viittauksella kokonaisuudes- ·;··· saan.
• » 11 118986
Esimerkki 4 xtViT^cx.
[IS-[1R*(R*),2S*]]-N-[2-hydroksi-3- [N1-(2-metyyli-propyyli) -N1- (4-metoksifenyylisulfonyyli) amino] -1- (fenyy-5 1imetyyli)propyyli]-2-metyyli-3-(metyylisulfonyyli)propaa- niamidi voidaan valmistaa hakijan omissa ja samanaikaisesti vireillä olevissa US-patenttihakemuksissa sarjanumerot 08/110 913 (tehty 24. elokuuta 1993) ja 08/156 498 (tehty 23. marraskuuta 1993) esitettyjen menetelmien mukaisesti, 10 jotka molemmat hakemukset sisällytetään tähän viittauksella kokonaisuudessaan.
Esimerkki 5
B ^ O
• « · • « · N- (2 (R) -hydroksi-1 (S) -indanyyli) -2- (R) -fenyylime- . 15 tyyli-4-(S)-hydroksi-5-(1-[4-(3-pyridyylimetyyli)-2(S)- • · · N' - (t-butyylikarboksiamido)piperatsinyyli] )pentaaniamidi · · * (L-735 524) voidaan valmistaa julkaisuissa US-patentti- hakemus sarjanumero 07/883 825 (tehty 15. toukokuuta :*V 1992), WO 93/09096, Tet. Lett. 35: 673 - 676 (1994) ja • · · 20 Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91: 4096 - 4100 (1994) esitet-tyjen menetelmien mukaisesti, joista julkaisuista kukin • · · * .··*, sisällytetään tähän viittauksella kokonaisuudessaan.
• · • · · • · • * 12 118986
Esimerkki 6 N-tert-butyylidekahydro-2-[2(R)-hydroksi-4-fenyyli-3(S)-[[N-(2-kinolyylikarbonyyli)-L-asparaginyyli]amino]-5 butyyli]-(4aR,8aS)-isokinoliini-3(S)-karboksiamidi (Ro 31-8959) voidaan valmistaa US-patenttijulkaisussa 5 157 041 esitettyjen menetelmien mukaisesti, joka patentti sisällytetään tähän viittauksella kokonaisuudessaan.
Esimerkki 7
.. “Λ A
:.: : 10 "·[ [IS- [1R1 (R1) ,2S1] ] -N1- [3- [ [ [ (1,1-dimetyylietyyli) - * · amino]karbonyyli]-(3-metyylibutyyli)amino]-2-hydroksi-l- ;
• · · I
*; (fenyylimetyyli)propyyli]-2-[[2-kinolinyylikarbonyyli)- j
ΦΦΦ I
•2| amino]butaanidiamidi voidaan valmistaa hakijan omissa ja ; * · · 15 samanaikaisesti vireillä olevissa US-patenttihakemuksissa j
·"·2 I
V · sarjanumerot 08/152 934 (tehty 15. marraskuuta 1993) ja 08/155 498 (tehty 23. marraskuuta 1993) esitettyjen mene- :V: telmien mukaisesti, jotka molemmat hakemukset sisällyte- :***: tään tähän viittauksella kokonaisuudessaan.
*··
• I
• · · • e2 **· • « * · ·1Φ • · · 2 φ 13 118986
Esimerkki 8 öOVvOyyV' 0 ) ω k/ Η’1-<0 τ Ν- [3- [N2- [N1- (1,1-dimetyylietyyli) aminosulfonyyli] -N2-(2-metyylipropyyli)amino]-2R-hydroksi-lS-(fenyylimetyy-5 li)propyyli]-2S-[(2-kinolyylikarbonyyli)amino]butaanidi-amidi voidaan valmistaa hakijan omissa ja samanaikaisesti vireillä olevissa PCT-patenttihakemuksessa nro PCT/ US93/10552 (tehty 29. lokakuuta 1993) ja US-patentti-hakemuksessa sarjanumero 08/156 498 (tehty 23. marraskuuta 10 1993) esitettyjen menetelmien mukaisesti, jotka molemmat hakemukset sisällytetään tähän viittauksella kokonaisuudessaan.
Esimerkki 9 \: chj of oh Λ0
!·:ι: O
• · · · \i.: 15 (2S,3R,4S,5S)-2,5-bis-[N-[N-[[N-metyyli-N-(2-pyri- • · · V · dinyylimetyyli)amino]karbonyyli]valinyyli]amino]-3,4-di- hydroksi-1,6-difenyyliheksaani (A-77003) voidaan valmistaa :Y: julkaisussa J. Med. Chem. 36: 320 - 330 (1993) esitettyjen ·1’1; menetelmien mukaisesti, joka julkaisu sisällytetään tähän • · 1 *, 20 viittauksella kokonaisuudessaan.
• · · •
MM
* 1 Φ • · • 1 • · · • · ·
Esimerkki 10 14 1 1 8986 ίΥ (2S,3S,5S)-5-[N-[N-[N-metyyli-N-[(2-isopropyyli-4-5 tiatsolyyli)metyyli]amino]karbonyyli]valinyyli]amino]-2-[N-[(5-tiatsolyyli)metoksikarbonyyli]amino]-3-hydroksi-l,6-difenyyliheksaani (A-84538, ABT-538) voidaan valmistaa PCT-patenttihakemuksessa sarjanumero WO 94/14436 (tehty 16. joulukuuta 1993) esitettyjen menetelmien mukaisesti, 10 joka hakemus sisällytetään tähän viittauksella kokonaisuudessaan.
Esimerkki 11 ΟΛ£ν ^'YYTll ΐ'ν " • · · 1 • · · • t ··· [2R-hydroksi-3- [ [ (4-aminofenyyli) sulfonyyli] - (2-me- *·· . 15 tyylipropyyli) amino]-IS- (fenyylimetyyli)propyyli] karbamii- ,···, nihapon 3S-tetrahydrofuranyyliesteri (VX-478) voidaan vai- • · · mistaa PCT-patenttihakemuksessa sarjanumero wo 94/05639 (tehty 7. syyskuuta 1993) esitettyjen menetelmien mukai- • · · sesti, joka hakemus sisällytetään tähän viittauksella ko- • · *···1 20 kona is uudessaan.
• · · • ·· · • · · • · • · ··· • · ·
Esimerkki 12 15 118986
I O f VV
N-tert-butyylidekahydro-3-[2(R)-hydroksi-4-(fenyy-litio)-3(S)-[[N-[(2-metyyli-3-hydroksifenyyli)karbonyyli]-5 amino]butyyli]-(4aR,8aS)-isokinoliini-3(S)-karboksiamidi (AG-1343, AG-1350) voidaan valmistaa julkaisuissa Bioorg.
& Med. chem. Let. 5: 715 - 720, 5: 721 - 726 ja 5: 727 -732 (1995) esitettyjen menetelmien mukaisesti, joista julkaisuista kukin sisällytetään tähän viittauksella kokonai-10 suudessaan. Erityisesti 3-hydroksi-2-metyylibentsoehapon aktiivinen HOBT-esteri (Bioorg. & Med. Chem. Let. 5: 727 -732 (1995)) voidaan liittää N-tert-butyylidekahydro-2- [2(R)-hydroksi-4-(fenyylitio)-3(S)-arainobutyyli](4aR,8aS)-isokinoliini-3(S)-karboksiamidiin (Bioorg. & Med. Chem.
I .*. 15 Let. 5: 715 - 720 (1995)).
* · ··· *
Esimerkki 13 O*: f\yxy\^T3\
Jr *»» e · e φ • « ··« 5,..5 [4R- (4a, 5a, 6E, 7E) ] -1,3-bis- [ (3-aminofenyyli) metyy- .:. li] heksahydro-5,6-dihydroksi-4,7-bis (fenyylimetyyli) -2H- e "**# 20 1,3-diatsepin-2-oni (DMP-450, XM-412) voidaan valmistaa • · Ί* PCT-patenttihakemuksessa WO 93/07128 esitettyjen menetel- ***** mien mukaisesti, joka hakemus sisällytetään tähän viitta- *ϊ**ί uksella kokonaisuudessaan. Erityisesti 3-nitrofenyyli- i 118986 16 metyylihalogenidi, kuten 3-nitrofenyylimetyylikloridi tai -bromidi, saatetaan reagoimaan [4R-(4a,5a,6E,7β)]-heksa-hydro-5,6-dihydroksi-4,7-bis(fenyylimetyyli)-2H-1,3-diat-sepin-2-onin hydroksisuojatun johdannaisen kanssa, minkä 5 jälkeen poistetaan hydroksiryhmien suojaus (katso W0 93/ 07128) ja pelkistetään nitroryhmät aminoryhmiksi. Tällaiset pelkistykset voidaan toteuttaa käyttäen tavanomaisia alan ammattimiehen hyvin tuntemia menetelmiä.
Esimerkki 14
. R
<yVj[Xt&o 10 ' N-[2R-hydroksi-3-[[(1,3-bentsodioksol-5-yyli)sulfo-nyyli]-(2-metyylipropyyli)amino]-IS-(fenyy1imetyyli)pro-pyyli]-2S-[[(pyrrrolidin-l-yyli)asetyyli]amino]-3,3-dime-tyylibutaaniamidin valmistus 15 Osa As 1,3-bentsodioksoli-5-sulfonyylikloridin val mistus • .·. Liuokseen, jonka muodosti 4,25 g vedetöntä N,N-di- * * · |*V metyyliformamidia 0 °C:ssa ja jossa käytettiin typpeä suo- • · *. ; jakaasuna, lisättiin 7,84 g sulfuryylikloridia, jolloin • · · *·*;* 20 muodostui kiinteä aine. Kun oli sekoitettu 15 minuuttia, • · · lisättiin 6,45 g 1,3-bentsodioksolia ja seosta kuumennet-tiin 100 °C:ssa 2 tuntia. Reaktioseos jäähdytettiin, kaa- • · · V ϊ dettiin jääveteen, uutettiin metyleenikloridilla, kuivat tiin magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja väkevöitiin, 25 jolloin saatiin 7,32 g raakatuotetta mustana öljynä. Tämä • · ·1· kromatografoitiin silikageelillä käyttäen 20-%:ista mety- ··· *. leenikloridia heksaanissa, jolloin saatiin 1,9 g (1,3- • · bentsodioksol-5-yyli) sulfonyylikloridia.
• · *·«* Vaihtoehtoisesti 22 litran pyöreäpohjaiseen kol- *:*·· 30 viin, joka oli varustettu mekaanisella sekoittimella, pa- lautusjäähdyttimellä, kuumennusvaipalla ja paineentasaus-tiputussuppilolla, lisättiin rikkitrioksidi-DMF-kompleksia 118986 17 2778 g, 18,1 mol). Sen jälkeen lisättiin dikloorietaania (4 litraa) ja sekoittaminen aloitettiin. Sitten lisättiin 1,3-bentsodioksolia (1905 g, 15,6 mol) tiputussuppilon kautta viiden minuutin aikana. Sen jälkeen lämpötila nos-5 tettiin 75 °C:seen ja pidettiin siinä 22 tuntia (NMR osoitti, että reaktio oli mennyt loppuun 9 tunnin kuluttua) . Reaktioseos jäähdytettiin 26 °C:seen ja lisättiin oksalyylikloridia (2290 g, 18,1 mol) sellaisella nopeudella, että lämpötila pysyi alle 40 °C:ssa (1,5 tuntia). Seos 10 kuumennettiin 67 °C:seen 5 tunniksi, minkä jälkeen jäähdytettiin 16 °C:seen jäähauteella. Reaktio pysäytettiin vedellä (5 1) nopeudella, jolla lämpötila pysyi alle 20 °C:ssa. Kun veden lisäys oli suoritettu, seosta sekoitettiin 10 minuuttia. Kerrokset erotettiin ja orgaaninen 15 kerros pestiin jälleen kaksi kertaa vedellä (5 1). Orgaaninen kerros kuivattiin magnesiumsulfaatilla (500 g) ja suodatettiin kuivausaineen poistamiseksi. Liuotin poistettiin tyhjössä 50 °C:ssa. Saadun lämpimän nesteen annettiin jäähtyä, minkä aikana alkoi muodostua kiinteää ainetta. 20 yhden tunnin kuluttua kiinteä aine pestiin heksaanillla (400 ml), suodatettiin ja kuivattiin, jolloin saatiin ha- • * ·.· · luttu sulfonylikloridi (2823 g) . Heksaanipesuneste väke- :*·[: voitiin ja saatu kiinteä aine pestiin 400 ml:11a heksaa- :*:*· nia, jolloin saatiin lisää sulfonyylikloridia (464 g) . Ko- • · •j. 25 konaissaanto oli 3287 g (95,5 % 1,3-bentsodioksolista las- • ees . .·. kettuna) .
• · · .···. Osa B: 2S- [bis (fenyylimetyyli) amino] -3-fenyylipro- * · · panolin valmistus . . Menetelmä 1: 2S-[bis(fenyylimetyyli)amino]-3-fenyy- • s · **V 30 lipropanoli N,N-bis(fenyylimetyyli)-L-fenyylialaniinife- e s *···* nyylimetyyliesterin DIBAL-pelkistyksellä 1 vaihe l: v«··
Liuos, jonka muodostivat L-fenyylialaniini (50,0 • · · ·. g, 0,302 mol), natriumhydroksidi (24,2 g, 0,605 mol) ja 35 kaliumkarbonaatti (83,6 g, 0,605 mol) vedessä (500 ml), ""· kuumennettiin 97 °C:seen. Sen jälkeen lisättiin hitaasti 118986 18 bentsyylibromidia (108,5 ml, 0,605 mol) (lisäysaika 25 min). Seosta sekoitettiin 97 °C:ssa 30 minuuttia typpiat-mosfäärissä. Liuos jäähdytettiin huoneenlämpötilaan ja uutettiin tolueenilla (2 x 250 ml). Yhdistetyt orgaaniset 5 kerrokset pestiin vedellä ja suolaliuoksella, kuivattiin magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja väkevöitiin öljyksi. Ν,Ν-bis(fenyylimetyyli)-L-fenyylialaniinifenyylimetyylies-teri voidaan puhdistaa pylväskromatografiällä (silikagee-li, 15 % etyyliasetaattia heksaanissa). Tavallisesti tuote 10 on riittävän puhdasta käytettäväksi suoraan seuraavassa vaiheessa ilman jatkopuhdistusta. EIMS: m/z 434 (M-l).
Vaihe 2:
Edellisestä reaktiosta saatu bentsyloitu fenyy-lialaniinifenyylimetyyliesteri (0,302 mol) liuotettiin to-15 lueeniin (750 ml) ja jäähdytettiin -55 °C:seen. Lisättiin DIBALrn 1,5 M liuos tolueenissa (443,9 ml, 0,666 mol) nopeudella, jolla lämpötila pysyi välillä -55 - -50 °C (lisäysaika 1 tunti). Seosta sekoitettiin 20 minuuttia typ-piatmosfäärissä ja sitten reaktio pysäytettiin -55 °C:ssa 20 lisäämällä hitaasti metanolia (37 ml). Sitten kylmä liuos kaadettiin kylmään (5 °C) 1,5 N HCl-liuokseen (1,8 1). Sa- • « ·,· · ostunut kiinteä aine (suunn. 138 g) suodatettiin ja pes- :*·]: tiin tolueenilla. Kiinteä aine suspendoitiin tolueenin •Y: (400 ml) ja veden (100 ml) seokseen. Seos jäähdytettiin • · 25 5 °C:seen ja sitä käsiteltiin 2,5 N NaOHrlla (186 ml) ja ·*·· , .·. sitten sekoitettiin huoneenlämpötilassa, kunnes kiinteä I « « I" aine liukeni. Tolueenikerros erotettiin vesifaasista ja • e · -* • · · * pestiin vedellä ja suolaliuoksella, kuivattiin magnesium-sulfaatilla, suodatettiin ja väkevöitiin 75 ml:n tilavuu- • e · '**·* 30 teen (89 g) . Jäännökseen lisättiin etyyliasetaattia (25 ! ml) ja heksaania (25 ml) , jolloin haluttu alkoholituote ·· alkoi kiteytyä. 30 minuutin kuluttua lisättiin vielä 50 ml #··· .···. heksaania kiteytymisen edistämiseksi edelleen. Kiinteä ai- ” ne suodatettiin ja pestiin 50 ml:11a heksaania, jolloin • e··» * * 35 saatiin 34,9 g ensimmäisen erän tuotetta. Toisen erän tuo- ***** te (5,6 g) erotettiin suodattamalla uudelleen emäliuos.
118986 19 Nämä kaksi erää yhdistettiin ja uudelleenkiteytettiin etyyliasetaatista (20 ml) ja heksaanista (30 ml) , jolloin saatiin 40 g 2S- [bis(fenyylimetyyli)amino]-3-fenyylipropa-nolia, saanto 40 % L-fenyylialaniinista. Analyysi, lasket-5 tu yhdisteelle C23H25ON: C 83,34; H 7,60; N 4,23. Todettu: C 83,43; H 7,59; N 4,22.
Menetelmä 2: SS-2-[bis(fenyylimetyyli)amino]bent-seenipropanolin valmistus L-fenyylialaninolin N,N-dibent-syloinnilla 10 L-fenyylialaninolia (176,6 g, 1,168 mol) lisättiin liuokseen, jota sekoitettiin ja jonka muodosti kaliumkarbonaatti (484,6 g, 3,506 mol) 710 ml:ssa vettä. Seos kuumennettiin 65 °C:seen typpiatmosfäärissä. Lisättiin bent-syylibromidin (400 g, 2,339 mol) liuos 3A etanolissa (305 15 ml) nopeudella, jolla lämpötila pysyi välillä 60 - 68 °C. Kaksifaasista liuosta sekoitettiin 65 °C:ssa 55 minuuttia ja sitten annettiin jäähtyä 10 °C:seen sekoittaen voimakkaasti. Öljymäinen tuote muuttui kiinteäksi pieniksi rakeiksi. Tuote laimennettiin 2,0 1:11a vesijohtovettä ja 20 sekoitettiin 5 minuuttia epäorgaanisten sivutuotteiden liuottamiseksi. Tuote erotettiin suodattamalla alipainees- • · ·.: : sa ja pestiin vedellä, kunnes pH oli 7. Saatu raakatuote ·* · ! uudelleenkiteytettiin 1,1 l:sta etyyliasetaatin ja heptaa- :*;*! nin seosta (1:10). Tuote erotettiin suodattamalla • · •S. 25 (-8 °C:ssa), pestiin 1,6 1:11a kylmää (-10 °C) etyyliase- *··« . .·. taatin ja heptaanin seosta (1:10) ja kuivattiin ilmassa, jolloin saatiin 339 g (saanto 88 %) 2S-[bis(fenyyli- • · ♦ metyyli)amino]-3-fenyylipropanolia, sp. = 71,5 - 73,0 °C.
Osa C: 2S-[bis(fenyylimetyyli)amino]-3-fenyylipro- • · s *·]·* 30 paanialdehydin valmistus • e *···* Menetelmä 1: ··· 2S- [bis (fenyylimetyyli) amino] -3-fenyylipropanolia ···· (200 g, 0,604 mol) liuotettiin trietyyliamiiniin (300 ml, e·· ·. 2,15 mol). Seos jäähdytettiin 12 °C:seen ja lisättiin rik- 35 kitrioksidi/pyridiinikompleksin liuosta (380 g, 2,39 mol) ! * DMSO:ssa (1,6 1) nopeudella, jolla lämpötila pysyi välillä
118986 I
20 8 - 17 °C. Liuosta sekoitettiin ympäristön lämpötilassa typpiatmosfäärissä 1,5 tuntia. Reaktioseos jäähdytettiin jäävedellä ja reaktio pysäytettiin 1,6 1:11a kylmää vettä (10 - 15 °C) 45 minuutin aikana. Saatua liuosta uutettiin 5 etyyliasetaatilla (2,0 1), pestiin 5-%:isella sitruunahapolla (2,0 1) ja suolaliuoksella (2,2 1), kuivattiin
MgS04:lla (280 g) ja suodatettiin. Liuotin poistettiin tyhjössä ja sitten kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin | 198,8 g 2S-[bis(fenyylimetyyli)amino]-3-fenyylipropaanial-10 dehydiä vaaleankeltaisena öljynä (99,9 %) . Saatu raaka- tuote oli riittävän puhdasta käytettäväksi suoraan seuraa-vassa vaiheessa ilman puhdistusta.
Menetelmä 2:
Oksalyylikloridin (8,4 ml, 0,096 mol) liuos di-15 kloorimetaanissa (240 ml) jäähdytettiin -74 °C:seen. Sen j jälkeen lisättiin hitaasti DMSO:n (12,0 ml, 0,155 mol) liuos dikloorimetaanissa (50 ml) nopeudella, jolla lämpötila pysyi -74 °C:ssa (lisäysaika n. 1,25 tuntia). Seosta sekoitettiin 5 minuuttia, minkä jälkeen lisättiin 20 2S-[bis(fenyylimetyyli)amino]-3-fenyylipropanolin (0,074 mol) liuos 100 ml:ssa dikloorimetaania (lisäysaika 20 mi- • · ·,· · nuuttia, lämpötila -75 °C - -68 °C) . Liuosta sekoitettiin :**]: -78 °C:ssa 35 minuuttia typpiatmosf äärissä. Sitten lisät- tiin trietyyliamiinia (41,2 ml, 0,295 mol) 10 minuutin ai- • · .·. 25 kana (lämpötila -78 °C - -68 °C) , minkä jälkeen ammonium- • ••f . ,·, suola saostui. Kylmää seosta sekoitettiin 30 minuuttia ja • · t sitten lisättiin vettä (225 ml) . Dikloorimetaanikerros • · # erotettiin vesifaasista ja pestiin vedellä, suolaliuoksel-, , la, kuivattiin magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja väke- • i · *·*·* 30 voitiin. Jäännös laimennettiin etyyliasetaatilla ja hek- • · *·.·* saanilla ja sitten suodatettiin ammoniumsuolan poistami- j
• I
·♦· seksi edelleen. Suodos väkevöitiin, jolloin saatiin 2S- ···· .···. [bis (fenyylimetyyli) amino]-3-fenyylipropaanialdehydi. AI- ··· •# dehydi vietiin seuraavaan vaiheeseen ilman puhdistusta.
• « ♦ · 118986 21
Menetelmä 3:
Seokseen, jonka muodostivat 1,0 g (3,0 mmol) 2S-[bis(fenyylimetyyli)amino]-3-fenyylipropanolia, 0,531 g (4,53 mmol) N-metyylimorfoliinia, 2,27 g molekyyliseulaa 5 (4 Ä) ja 9,1 ml asetonitriiliä, lisättiin 53 mg (0,15 mmol) tetrapropyyliammoniumperrutenaattia (TPAP). Seosta sekoitettiin 40 minuuttia huoneenlämpötilassa ja väkevöi-tiin alipaineessa. Jäännös suspendoitiin 15 ml:aan etyyliasetaattia, suodatettiin silikageelikerroksen läpi. Suodos 10 väkevöitiin alipaineessa, jolloin saatiin tuote, joka sisälsi suunnilleen 50 % 2S-[bis(fenyylimetyyli)amino]- 3-fenyylipropaanialdehydiä vaaleankeltaisena öljynä.
Menetelmä 4:
Liuokseen, jonka muodosti 1,0 g (3,02 mmol) 15 2S-[bis(fenyylimetyyli)amino]-3-fenyylipropanolia 9,0 ml:ssa tolueenia, lisättiin 4,69 mg (0,03 mmol) 2,2,6,6-tetrametyyli-l-piperidinyylioksia, vapaata radikaalia (TEMPO), 0,32 g (3,11 mmol) natriumbromidia, 9,0 ml etyyliasetaattia ja 1,5 ml vettä. Seos jäähdytettiin 0 °C:seen 20 ja lisättiin hitaasti 25 minuutin aikana vesipitoinen liuos, jossa oli 2,87 ml 5-%:ista talousvalkaisuainetta, joka • « j.» · sisälsi 0,735 g (8,75 mmol) natriumbikarbonaattia ja 8,53 !**': ml vettä. Seosta sekoitettiin 0 °C:ssa 60 minuuttia. Teh- • · •V: tiin vielä kaksi valkaisuainelisäystä (1,44 ml kumpikin), • · 25 minkä jälkeen sekoitettiin 10 minuuttia. Vesipitoista ker- . .·. rosta uutettiin kaksi kertaa 20 ml: 11a etyyliasetaattia.
• · ·
Yhdistetty orgaaninen kerros pestiin 4,0 ml:11a liuosta, • * · joka sisälsi 25 mg kaliumjodidia ja vettä (4,0 ml), 20 ml:lla 10-%:ista natriumtiosulfaatin vesiliuosta ja sitten * · * '·[·* 30 suolaliuoksella. Orgaaninen liuos kuivattiin magnesiumsul- faatilla, suodatettiin ja väkevöitiin alipaineessa, joi-··· loin saatiin 1,34 g raakatuoteöljyä, joka sisälsi pienen • ••a .··*. määrän haluttua aldehydituotetta, 2S-[bis (fenyylimetyy- • a· • # li)amino]-3-fenyylipropaanialdehydiä.
35 a • « j 118986 22
Osa D: N,N-dibentsyyli-3(S)-amino-1,2-(S)-epoksi- 4-fenyylibutaanin valmistus Menetelmä 1:
Liuos, jonka muodostivat 2S-[bis(fenyylimetyy-5 li)amino]-3-fenyylipropaanialdehydi (191,7 g, 0,58 mol) ja kloorijodimetaani (56,4 ml, 0,77 mol) tetrahydrofuraanissa (1,8 ml), jäähdytettiin -30 - -35 °C:seen ruostumatonta terästä olevassa reaktorissa typpiatmosfäärissä. Sen jälkeen lisättiin n-butyylilitiumin liuos heksaanissa (1,6 M, 10 365 ml, 0,58 mol) nopeudella, jolla lämpötila pysyi alle -25 °C:ssa. Lisäyksen jälkeen seosta sekoitettiin -30 - -35 °C:ssa 10 minuuttia. Toteutettiin lisää reagenssilisä-yksiä seuraavalla tavalla: (1) Lisättiin vielä kloorijodi- metaania (17 ml) ja sen jälkeen n-butyylilitiumia (110 ml) 15 < -25 °C:ssa. Lisäyksen jälkeen seosta sekoitettiin -30 - -35 °C:ssa 10 minuuttia. Tämä toistettiin kerran. (2) Lisättiin vielä kloorijodimetaania (8,5 ml, 0,11 mol) ja sen jälkeen n-butyylilitiumia (55 ml, 0,088 mol) < -25 °C:ssa. Lisäyksen jälkeen seosta sekoitettiin -30 - -35 °C:ssa 10 20 minuuttia. Tämä toistettiin 5 kertaa. (3) Lisättiin vielä kloori jodimetaania (8,5 ml, 0,11 mol) ja sen jälkeen n- • ;.· · butyylilitiumia (37 ml, 0,059 mol) < -25 °C:ssa. Lisäyksen :*·*: jälkeen seosta sekoitettiin -30 - -35 °C:ssa 10 minuuttia.
Tämä toistettiin kerran. Ulkoinen jäähdytys lopetettiin ja • · 25 seos lämmitettiin ympäristön lämpötilaan 4-16 tunnin ai- ···· . .·. kana, kun TLC (silikageeli, 20 % etyyliasetaattia heksaa- * · · nissa) osoitti, että reaktio oli mennyt loppuun. Reak- • * · tioseos jäähdytettiin 10 °C:seen ja reaktio pysäytettiin 1452 g:11a 16-%:ista ammoniumkloridiliuosta pitäen lämpö- • · · *·’·* 30 tila alle 23 °C:ssa. Seosta sekoitettiin 10 minuuttia ja ··♦ ** • ♦ orgaaniset ja vesipitoiset kerrokset erotettiin. Vesifaa- ··· siä uutettiin etyyliasetaatilla (2 x 500 ml) . Etyyliase- • · · # .**·. taattikerros yhdistettiin tetrahydrofuraanikerroksen kans- *·* • t sa. Yhdistetty liuos kuivattiin magnesiumsulfaatilla (220 * * 35 g) , suodatettiin ja väkevöitiin tyhjössä. Ruskeaa öljy- *·**· jäännöstä kuivattiin 70 °C:ssa tyhjössä (0,8 bar (80 kPa)) 118986 23 1 tunti, jolloin saatiin 222,8 g raakatuotetta. Raakatuote käytetään tavallisesti suoraan seuraavassa vaiheessa ilman puhdistusta.
Menetelmä 2: 5 Liuos, jonka muodostivat raakatuotealdehydi (0,074 mol) ja kloorijodimetaani (7,0 ml, 0,096 mol) tetrahydro-furaanissa (285 ml), jäähdytettiin -78 °C:seen typpiatmo-sfäärissä. Sen jälkeen lisättiin n-butyylilitiumin 1,6 M liuos heksaanissa (25 ml, 0,040 mol) nopeudella, jolla 10 lämpötila pysyi -75 °C:ssa. Ensimmäisen lisäyksen jälkeen lisättiin taas vielä kloorijodimetaania (1,6 ml, 0,022 mol) ja sen jälkeen n-butyylilitiumia (23 ml, 0,037 mol) pitäen lämpötila -75 °C:ssa. Seosta sekoitettiin 15 minuuttia. Kutakin reagenssia, kloorijodimetaania (0,70 ml, 15 0,010 mol) ja n-butyylilitiumia (5 ml, 0,008 mol), lisät tiin vielä 4 kertaa 45 minuutin aikana -75 °C:ssa. Sen jälkeen jäähdytyshaude poistettiin ja liuos lämmitettiin 22 °C:seen 1,5 tunnin aikana. Seos kaadettiin 300 ml:aan kylläistä ammoniumkloridin vesiliuosta. Tetrahydrofu-20 raanikerros erotettiin. Vesifaasia uutettiin etyyliasetaatilla (1 x 300 ml) . Yhdistetyt orgaaniset kerrokset pes- • · ·.· · tiin suolaliuoksella, kuivattiin magnesiumsulfaatilla, :*·*: suodatettiin ja väkevöitiin, jolloin saatiin ruskea öljy :*;*· (27,4 g) . Tuote voitiin käyttää seuraavassa vaiheessa il- • · 25 man puhdistusta.
• ••e . Menetelmä 3: · ·
Liuos, jonka muodostivat 2S-[bis (fenyylimetyyli) - • * · amino]-3-fenyylipropaanialdehydi (178,84 g, 0,54 mol) ja bromikloorimetaani (46 ml, 0,71 mol) tetrahydrofuraanissa • · · *·]·' 30 (1,8 1), jäähdytettiin -30 - -35 °C:seen ruostumatonta te- rästä olevassa reaktorissa typpiatmosfäärissä. Sen jälkeen * ··· lisättiin n-butyylilitiumin liuos heksaanissa (1,6 M, 340 • · · · .·*·. ml, 0,54 mol) nopeudella, jolla lämpötila pysyi alle »·« -25 °C:ssa. Lisäyksen jälkeen seosta sekoitettiin -30 - * * 35 -35 °C:ssa 10 minuuttia. Toteutettiin lisää reagenssilisä- *:*’* yksiä seuraavalla tavalla: (1) Lisättiin vielä bromikloo- 24 118986 rimetaania (14 ml) ja sen jälkeen n-butyylilitiumia (102 ml) < -25 °C:ssa. Lisäyksen jälkeen seosta sekoitettiin ' -30 - -35 °C:ssa 10 minuuttia. Tämä toistettiin kerran.
(2) Lisättiin vielä bromikloorimetaania (7 ml, 0,11 mol) 5 ja sen jälkeen n-butyylilitiumia (51 ml, 0,082 mol) < -25 °C:ssa. Lisäyksen jälkeen seosta sekoitettiin -30 --35 °0:ssa 10 minuuttia. Tämä toistettiin 5 kertaa.
(3) Lisättiin vielä bromikloorimetaania (7 ml, 0,11 mol) ja sen jälkeen n-butyylilitiumia (51 ml, 0,082 mol) 10 < -25 °C:ssa. Lisäyksen jälkeen seosta sekoitettiin -30 - 35 °C:Ssa 10 minuuttia. Tämä toistettiin kerran. Ulkoinen jäähdytys lopetettiin ja seos lämmitettiin ympäristön lämpötilaan 4-16 tunnin aikana, kun TLC (silikageeli, 20 % etyyliasetaattia heksaanissa) osoitti, että reaktio oli 15 mennyt loppuun. Reaktioseos jäähdytettiin 10 °C:seen ja reaktio pysäytettiin 1452 g:11a 16-%:ista ammoniumkloridi-liuosta pitäen lämpötila alle 23 °C:ssa. Seosta sekoitettiin 10 minuuttia ja orgaaniset ja vesipitoiset kerrokset erotettiin. Vesifaasia uutettiin etyyliasetaatilla (2 x 20 500 ml) . Etyyliasetaattikerros yhdistettiin tetrahydrofu- raanikerroksen kanssa. Yhdistetty liuos kuivattiin magne- • · ·.: · siumsulfaatilla (220 g), suodatettiin ja väkevöitiin kier- ·* · | tohaihduttimessa 65 °C:ssa. Ruskeaa öljyjäännöstä kuivat- tiin 70 °C:ssa tyhjössä (0,8 bar (80 kPa)) 1 tunti, joi- • · 25 loin saatiin 222,8 g raakatuotetta.
. .·. Osa E: N- [3 (S) - [Ν,Ν-bis (fenyylimetyyli) amino] -2 (R) - .···. hydroksi-4-fenyylibutyyli] -N-isobutyyliamiinioksaalihap- • · « posuolan valmistus . . Vaihe 1: • · · 1 30 Liuokseen, jonka muodosti raakatuot teenä oleva j ·· ^ i N,N-dibentsyyli-3 (S)-amino-1,2 (S)-epoksi-4-fenyylibutaani ··· (388,5 g, 1,13 mol) isopropanolissa (2,7 1) (tai etyyli- .··*. asetaatissa) , lisättiin isobutyyliamiinia (1,7 kg, 23,1 • · · •# mol) 2 minuutin aikana. Lämpötila nostettiin 25 °C:sta * 35 30 °C:seen. Liuos kuumennettiin 82 °C:seen ja sekoitettiin ***· tässä lämpötilassa 1,5 tuntia. Lämmin liuos väkevöitiin 118986 25 tyhjössä. Ruskeaa öljyjäännöstä kuivattiin tyhjössä (0,8 mmHg (107 Pa) ) 16 tuntia, jolloin saatiin 450 g tuotetta raakatuoteölj ynä.
Vaihe 2: 5 Oksaalihapon (8,08 g, 89,72 mmol) liuokseen meta- nolissa (76 ml) lisättiin liuos, jonka muodosti raakatuot-teena oleva 3(S)-[N,N-bis (fenyylimetyyli) amino]-1-(2-metyy-lipropyyli)amino-4-fenyylibutan-2(R)-oli etyyliasetaatissa (90 ml), 15 minuutin aikana. Seosta sekoitettiin huoneenläm-10 pötilassa noin 2 tuntia. Kiinteä aine erotettiin suodatta- maila, pestiin etyyliasetaatilla (2 x 20 ml) ja kuivattiin tyhjössä noin 1 tunnin ajan, jolloin saatiin 21,86 g dia-stereomeerisesti 97-%:isen puhdasta suolaa. Sp. = 174,99 °C; mikroanalyysi: laskettu: C 71,05 %; H 7,50 %; N 5,53 %; 15 todettu: C 71,71 %; H 7,75 %; N 5,39 %.
Vaihtoehtoisesti raakatuotteena oleva 3(S)-[N,N-bis(fenyylimetyyli)amino]-1-(2-metyylipropyyli)amino-4-fe-nyylibutan-2(R)-oli (5 g) liuotettiin metyyli-tert-butyy-lieetteriin (MTBE) (10 ml) ja lisättiin oksaalihappoa (1 g) 20 metanolissa (4 ml) . Seosta sekoitettiin noin 2 tuntia.
Saatu kiinteä aine suodatettiin, pestiin kylmällä MTBE:llä • ♦ :.· · ja kuivattiin, jolloin saatiin 2,1 g valkoista kiinteää ·* · Ϊ ainetta, joka oli noin diastereomeerisesti 98,9-%:isen :*:*· puhdasta (HPLC-piikkien pinta-aloista laskettuna) . ;
* · I
··· 25 Osa F: 1- [N- [ (1,3-bentsodioksol-5-yyli) sulfonyyli] - ···· . .·. N- (2-metyylipropyyli) amino]-3 (S) - [N,N-bis (fenyylimetyyli) - • · · * amino]-4-fenyyli-2 (R)-butanolin valmistus • · · N-[3(S)-[N,N-bis(fenyylimetyyli)amino]-2(R)-hydrok-, . si-4 - f enyylibutyyli] -N-isobutyyliamiini.oksaalihapposuo- I I t ';[·* 30 laan (354,7 g, 0,7 mol), joka oli 1,4-dioksaanissa (2 000 • * *···* ml), lisättiin kaliumkarbonaatin (241,9 g, 1,75 mol) liuos 118986 26 (1000 ml) ja vettä (500 ml) ja sekoittamista jatkettiin vielä 1 tunti. Vesipitoinen kerros erotettiin ja uutettiin edelleen etyyliasetaatilla (200 ml). Yhdistetyt etyyliase-taattikerrokset pestiin 25-%:isella suolaliuoksella (500 5 ml) ja kuivattiin vedettömällä magnesiumsulfaatilla. Kun magnesiumsulfaatti oli suodatettu ja pesty etyyliasetaatilla (200 ml), liuotin poistettiin tyhjössä, jolloin saatiin haluttu sulfonamidi viskoosina keltaisena vaahtomai-sena öljynä (440,2 g, saanto 105 %). HPLC/MS (sähkösuihku) 10 (m/z 601 [M+H] +) .
Vaihtoehtoisesti N-[3(S)-[Ν,Ν-bis(fenyylimetyyli)-amino]-2(R)-hydroksi-4-fenyylibutyyli]-N-isobutyyliamii-ni.oksaalihapposuola (2800 g, 5,53 mol) ja THF (4 1) lisättiin 22 litran pyöreäpohjaiseen kolviin, joka oli va- j 15 rustettu mekaanisella sekoittimella. Kaliumkarbonaatti (1921 g, 13,9 mol) liuotettiin veteen (2,8 1) ja lisättiin THF-lietteeseen. Sen jälkeen seosta sekoitettiin yhden tunnin ajan. l,3-bentsodioksoli-5-sulfonyylikloridi (1 281 g, 5,8 mol) liuotettiin THFriin (1,4 1) ja lisät-20 tiin reaktioseokseen 25 minuutin aikana. Käytettiin vielä 200 ml THF:a lisäyssuppilon huuhtomiseen. Reaktioseoksen • · · annettiin sekoittua 14 tuntia ja sitten lisättiin vettä • * · ‘ : (4 1). Tätä seosta sekoitettiin 30 minuuttia ja kerroksien :Y: annettiin erottua. Kerrokset poistettiin ja vesipitoinen • · ··. 25 kerros pestiin kaksi kertaa THF: 11a (500 ml). Yhdistettyjä t · * · . THF-kerroksia kuivattiin magnesiumsulfaatilla (500 g) yh- »··* den tunnin ajan. Sitten tämä liuos suodatettiin kuivausai- • · · neen poistamiseksi ja käytettiin seuraavissa reaktioissa.
.. Osa G: 1-[N-[ (1,3-bentsodioksol-5-yyli) sulfonyyli] - • · · Ι.Γ 3C) N- (2-metyylipropyyli)amino] -3 (S) -amino~4-fenyyli-2 (R) -bu-• * ’·*·’ tanoli-metaanisulfonihapposuolan valmistus ·;· Raakatuotteena oleva 1-[N-[ (1,3-bentsodioksol-5- ·«·· ;***. yyli) sulfonyyli] -N- (2-metyylipropyyli) amino] -3 (S) - [bis (fe-
• M
*, nyylimetyyli)amino]-4-fenyyli-2(R)-butanoli (62 g, 0,010 ] 35 mol) liuotettiin metanoliin (40 ml). Sen jälkeen liuokseen * * lisättiin metaanisulfonihappoa (0,969 g, 0,010 mol) ja 118986 27 vettä (5 ml) . Seos pantiin 500 ml:n Parr-hydrauspulloon, joka sisälsi 20-%:ista Pd(OH)2:a hiilellä (255 mg, vesipitoisuus 50 %). Pullo pantiin hydrauslaitteeseen ja puhdistettiin 5 kertaa typellä ja 5 kertaa vedyllä. Reaktion an-5 nettiin edetä 35 °C:ssa 63 psi:n (434 kPa:n) vetypaineessa 18 tuntia. Lisättiin vielä katalyyttiä (125 mg) ja puhdistamisen jälkeen hydrausta jatkettiin vielä 20 tuntia. Seos suodatettiin celiten läpi, joka pestiin metanolilla (2 x 10 ml). Suunnilleen kolmasosa metanolista poistettiin ali-10 paineessa. Jäljelle jäänyt metanoli poistettiin atseo-trooppisella tislauksella tolueenin kanssa 80 torrin (10,7 kPa:n) paineessa. Lisättiin tolueenia 15, 10, 10 ja 10 ml:n annokset. Tuote kiteytyi seoksesta ja se suodatettiin ja pestiin kaksi kertaa 10 ml:n erillä tolueenia. Kiinteää 15 ainetta kuivattiin huoneenlämpötilassa 1 torrin (133 Pa:n) paineessa 6 tuntia, jolloin saatiin amiinisuola (4,5 g, 84 %) ; rn/z 421 [M+H] +.
Vaihtoehtoisesti raakatuotteena olevan 1-[N-[(1,3-bentsodioksol-5-yyli)sulfonyyli]-N-(2-metyylipropyyli)ami-20 no]-3(S)-[bis(fenyylimetyyli)amino]-4-fenyyli-2(R)-butano-lin THF-liuokseen lisättiin vettä (500 ml) ja sen jälkeen : metaanisulfonihappoa (531 g, 5,5 mol). Liuosta sekoitet- ·· · • V tiin täydellisen sekoittumisen varmistamiseksi ja ja se i :φ:*: pantiin 5 gallonan (19 l:n) autoklaaviin. Autoklaaviin li- ··· 25 sättiin Pearlmanin katalyyttiä (200 g 20-%:ista Pd(OH)2:a ···♦ . C:llä / 50 % vettä) käyttäen apuna THF:a (500 ml) . Reakto- • •e ri puhdistettiin neljä kertaa typellä ja neljä kertaa ve- • · « dyllä. Reaktoriin aikaansaatiin 60 psig:n (515 kPa:n) ve-. , typaine ja aloitettiin sekoittaminen 450 rpm:llä. 16 tun- 30 nin kuluttua HPLC-analyysi osoitti, että pieni määrä mono- • * *···* bentsyylivälituotetta oli vielä läsnä. Lisättiin vielä ka- ^•j· talyyttiä (50 g) ja reaktion annettiin jatkua yön yli. Sen ·***; jälkeen liuos suodatettiin celiten (500 g) läpi katalyytin ··» • . poistamiseksi ja väkevöitiin tyhjössä viidessä erässä. Ku-
[ 35 hvinkin erään lisättiin tolueenia (500 ml) ja poistettiin J
* ’ tyhjössä jäljelle jääneen veden poistamiseksi atseotroop- 118986 28 pisesti. Saatu kiinteä aine jaettiin kolmeen erään ja kukin pestiin metyyli-t-butyylieetterillä (2 1) ja suodatettiin. Jäljelle jäänyt liuotin poistettiin huoneenlämpötilassa tyhjöuunissa alle 1 torrin (133 Pa:n) paineessa, 5 jolloin saatiin 2714 g odotettua suolaa.
Osa H: N-[2R-hydroksi-3-[[(1,3-bentsodioksol-5-yy-li)sulfonyyli]-(2-metyylipropyyli)amino]-IS-(fenyylimetyy-lUpropyyli]-2S-[(fenyylimetoksikarbonyyli)amino]-3,3-di-metyylibutaaniamidin valmistus 10 Liuokseen, jonka muodosti 118,8 g (0,776 mol) N-hydroksibentsotriatsolia ja 137,1 g (0,52 mol) N-bent-syylioksikarbonyylikarbonyyli-L-tert-leusiinia 750 ml:ssa vedetöntä DMF:a 0 °C:ssa typpiatmosfäärissä, lisättiin 109,1 g (0,57 mol) EDC:tä. Kun oli sekoitettu 0 °C:ssa 15 2 tuntia, lisättiin liuos, jonka muodosti 273 g (0,53 mol) 2R-hydroksi-3-[[(1,3-bentsodioksol-5-yyli)sulfonyyli]- (2-metyylipropyyli)amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyliamiini-metaanisulfonaattia, joka oli aikaisemmin neutraloitu 228 ml:11a (210 g, 2,08 mol) 4-metyylimorfoliinia, 250 ml.-ssa 20 vedetöntä DMF:a. Kun oli sekoitettu 0 °C:ssa 30 minuuttia, seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 18 tuntia. Liuot- • · j timet poistettiin alipaineessa 45 °C:ssa, lisättiin 1,5 1 • S · • *φϊ etyyliasetaattia, pestiin 5-%:isella sitruunahapolla, kyl- :Y: Iäisellä natriumbikarbonaatilla, suolaliuoksella, kuivat- • · ··· 25 tiin vedettömällä magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja ···· . väkevöitiin, jolloin saatiin 400 g raakatuotetta. Tämä
• •I
kromatograf oitiin 3 erässä Prep 2000 Chromatogram • * · -laitteessa silikageelillä käyttäen 20-%:ista - 50-%:ista , , etyyliasetaattia heksaanissa eluenttina, jolloin saatiin i * § *.·* 30 320 g puhdistettua ainetta, m/e = 674 (M+Li) , 98 % HPLCm *··* mukaan. j *:* Osa I: N- [2R-hydroksi-3-[ [ (1,3-bentsodioksol-5-yy- li) sulfonyyli] - (2-metyylipropyyli) amino] - IS- (fenyylimetyy- »·* *. li)propyyli]-2S-amino-3,3-dimetyylibutaaniamidin valmistus «···« ] 35 Liuosta, jonka muodosti 312 g N-[2R-hydroksi-3- ····« [[(1,3-bentsodioksol-5-yyli)sulfonyyli]-(2-metyylipropyy- 118986 29 li)amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]-2S-[(fenyylimetoksi-karbonyyli)amino]-3,3-dimetyylibutaaniamidia 1 l:ssa tet-rahydrofuraania, hydrattiin niin, että läsnä oli 100 g 4-%:ista palladium hiilellä -katalyyttiä, 60 psig:n (515 5 kPa:n) vetypaineessa 6 tuntia huoneenlämpötilassa. Katalyytti poistettiin suodattamalla ja liuottimet poistettiin alipaineessa, jolloin saatiin 240 g haluttua yhdistettä.
Osa J: N-[2R-hydroksi-3-[[(1,3-bentsodioksol-5-yy-li)sulfonyyli]-(2-metyylipropyyli)amino]-IS-(fenyylimetyy-10 li)propyyli]-2S-[(klooriasetyyli)amino]-3,3-dimetyylibutaa-niamidin valmistus
Liuokseen, jonka muodosti 234,3 g (0,439 mol) N-[2R-hydroksi-3-[[(l,3-bentsodioksol-5-yyli)sulfonyyli]-(2-metyylipropyyli)amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]-2S-15 amino-3,3-dimetyylibutaaniamidia 1 l:ssa metyleeniklori- dia, lisättiin 80 ml (59,5 g, 0,46 mol) di-isopropyyli-etyyliamiinia, minkä jälkeen lisättiin hitaasti huoneenlämpötilassa 78,8 g (0,46 mol) kloorietikkahappoanhydridiä pitäen samalla lämpötila alle 35 °C:ssa. Kun oli sekoitet-20 tu vielä 1 tunti, HPLC-analyysi osoitti pienen määrän lähtöainetta olevan vielä läsnä, ja lisättiin 1,5 g kloo- • · i.: ί rietikkahappoanhydridiä. 10 minuutin kuluttua liuottimet ·· · • poistettiin alipaineessa, lisättiin 1 1 etyyliasetaattia, :V: pestiin 5-%:isella sitruunahapolla, kylläisellä natriumbi- ··· 25 karbonaatilla, suolaliuoksella, kuivattiin vedettömällä
MO
. magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja väkevöitiin, jolloin o»# .1··, saatiin 314 g raakatuotetta. Tämä kromatografoitin 3 eräs-
• 1 I
sä Prep 2000 Chromatogram -laitteella silikageelillä käyt- .. täen 20-%:ista - 50-%:ista etyyliasetaattia heksaanissa, • · · **!Γ 30 jolloin saatiin 165 g haluttua yhdistettä, m/e = 616 *···' (M+Li) , 98 % HPLC:n mukaan.
«·· e ··· • · • · • e ! · ···· • 1 30 1 1 8986
Osa Κί N-[2R-hydroksi-3-[[(i#S-bentsodioksol-S-yy-li) sulfonyyli]-(2-metyyliProPYYli>amino]-IS-(fenyylimetyy-li)propyyll]-2S-[[(pyrrolidin-l-yyli)asetyyli]amino]-3,3-dimetyylibutaaniamidin valmistus 5 164,2 g:aan (0,27 mol) N-[2R-hydroksi-3-[[(1,3- bentsodioksol-5-yyli)sulfonyyli]-(2-metyylipropyyli)amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]-2S-[(klooriasetyyli)amino]- 3,3-dimetyylibutaaniamidia lisättiin 500 ml tetrahyd-rofuraania, liuotin poistettiin alipaineessa mahdollisen 10 etyyliasetaatin poistamiseksi, ja sitten lisättiin 350 ml tetrahydrofuraania. Tähän liuokseen, joka oli 10 °C:ssa, lisättiin 130 ml (1,56 mol) pyrrolidiiniä. 1 tunnin kuluttua liuottimet poistettiin alipaineessa, lisättiin 1 1 etyyliasetaattia, pestiin kylläisellä natriumbikarbonaa-15 tiliä, suolaliuoksella, kuivattiin vedettömällä magnesium-sulfaatilla, suodatettiin ja väkevoitiin, jolloin saatiin 185 g raakatuotetta, jonka analysoitiin HPLC:n avulla olevan 98,9-%risen puhdasta. Tämä jaettiin 3 osaan ja kroma-tografoitiin Prep 2000 Chromatogram -laitteella käyttäen 20 ensin 50-%:ista etyyiiasetaattj_a heksaanissa ja sen jäl-. keen 5-%:ista metanolia etyyliasetaatissa, jolloin saatiin \iy 160 9 Pudistettua ainetta (99 % HPLC:n mukaan) . Sitten ** tämä uudelleenkiteytettiin 460 mgrsta dietyylieetteriä ja 70 mlista heksaania, jolloin saatiin 121 g haiuttua tuo.
···· n kukaan), m/e = 651 (M+Li) , sp. = • 112 - 114 °C.
I · · ···
Esimerkki 15 « « « q , •«f 00 CH3 H OH l • * *···· • · 118986 31 N-[2R-hydroksi-3-[(2-metyylipropyyli)-[(1,3-bent-sodioksol-5-yyli)sulfonyyli] amino]-IS-{fenyylimetyyli)pro-pyyli] -2S-metyyli-3- (metyylisulfonyyli)propaaniamidin valmistus 5 Osa A: 2(S)-metyyli-3-(metyylisulfonyyli)propioni- hapon valmistus Vaihe 1:
Liuokseen, jonka muodosti 200 g (1,23 mol) D-(-)- 3-asetyli-b-merkaptoisovoihappoa 1,0 l:ssa metanolia, li-10 sättiin 161,0 g (2,47 mol) kaliumhydroksidia liuotettuna 500 ml:aan metanolia pitäen samalla lämpötila alle 10 °C:ssa ja jäähdyttäen samalla jäähauteella. Kun oli sekoitettu vielä 20 minuuttia, lisättiin 117 ml (156 g, 1,23 mol) dimetyylisulfaattia pitäen lämpötila alle 20 °C:ssa. 15 Jäähaude poistettiin ja seosta sekoitettiin vielä 60 minuuttia. Suolat poistettiin suodattamalla, liuottimet poistettiin alipaineessa ja lisättiin etyyliasetaattia. Kun vesipitoinen kerros oli erotettu, se tehtiin happamaksi väkevällä kloorivetyhapolla, uutettiin etyyliasetaatil-20 la, kuivattiin vedettömällä magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja väkevöitiin, jolloin saatiin 164 g (99 %) ha- • * luttua 2S-metyyli-3-(metyylitio)propionihappoa, m/e = 133 f V (M-H) .
ί V: Vaihe 2 : •ϊ* 25 Liuokseen, jonka muodosti 10,0 g (74,6 mmol) ···· : ·*. 2S-metyyli-3-(metyylitio)propionihappoa 150 ml:ssa aseto- ·«· nia ja 30 ml:ssa vettä ja joka oli jäähdytetty 18 °C:seen e jäähauteessa, lisättiin 161,8 g (263 mmol) Oxonea. Kun oli . lisätty suunnilleen puolet aineesta, lämpötila nousi * · · ;,* 30 24 °C:seen, lisäys lopetettiin, lämpötila laskettiin •J·' 18 °C:seen, sitten lisäämistä jatkettiin. Kun oli sekoi- tettu 15 - 20 °C:Ssa 15 minuuttia, haude poistettiin ja :***: reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa l tunti.
· · , Kiinteä aine suodatettiin ja pestiin asetonilla, suodos • · , 35 väkevöitiin suunnilleen 40 ml:ksi ja jäännös liuotettiin 4M«| 200 ml:aan etyyliasetaattia. Etyyliasetaattikerros kuivat- „ 118986
W A
tiin vedettömällä magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja väkevöitiin, jolloin saatiin 11,4 g öljyä. Tämä liuotettiin mahdollisimman pieneen määrään etyyliasetaattia ja lisättiin heksaania sakan muodostumisen aikaansaamiseksi. 5 Tämä otettiin talteen, jolloin saatin 6,95 g haluttua tuotetta, m/e = 167 (M+H).
Osa B: N-[2R-hydroksi-3-[(2-metyylipropyyli)-[ (1,3-bentsodioksol-5-yyli)sulfonyyli]amino]-IS-(fenyylimetyy-lDpropyyli] -2S-metyyli-3- (metyylisulfonyyli)propaaniani!-10 din valmistus
Liuokseen, jonka muodosti 5,0 g (30 mmol) 2S-metyyli-3-(metyylisulfonyyli)propionihappoa ja 6,90 g (45 mmol) N-hydroksibentsotriatsolia 30 ml:ssa vedetöntä DMF:a 0 °C:ssa ja jossa käytettiin typpeä suojakaasuna, lisät-15 tiin 6,34 g (33 mmol) EDC:tä. Suunnilleen 10 minuutin kuluttua kaikki EDC oli liuennut. Kun seos oli ollut 60 minuuttia 0 °C:ssa, lisättiin liuos, jonka muodosti 15,5 g (30 mmol) 2R-hydroksi-3-[[(1,3-bentsodioksol-5-yyli)sulfonyyli] - (2-metyylipropyyli) amino] -IS- (fenyylimetyyli)propyy-20 liamiinimetaanisulfonaattia 30 ml:ssa vedetöntä DMF:a, joka oli etukäteen neutraloitu 3,4 ml:11a (31,6 mmol) • s : 4-metyylimorfoliinia. Kun seos oli ollut 3 tuntia ·· s
• V 0 °C:ssa, sitä sitten sekoitettiin yön yli 17 tuntia. DMF
• · ϊφϊ#ϊ poistettiin alipaineessa, lisättiin etyyliasetaattia, pes- ^•j* 25 tiin 5-%:isella sitruunahapolla, kylläisellä natriumbikar- • ·*. bonaatilla, vedellä, suolaliuoksella, kuivattiin vedettö- ··· .*:*. mällä magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja väkevöitiin, • * jolloin saatiin 16 g raakatuotetta, joka oli HPLC:n mukaan φ. . 88-%:isen puhdasta. Tuote kromatografoitiin silikageelillä • · · I.; 30 käyttäen 20-%:ista - 80-%:ista etyyliasetaattia heksaa- • · ***** nisssa, jolloin saatiin puhdas tuote, joka uudelleenkitey- tettiin etyyliasetaatista/heksaanista, jolloin saatiin :***: 8,84 g puhdasta tuotetta, sp. 131,8 - 133,8 °C.
··* *. Vaihtoehtoisesti liuokseen, jonka muodosti 35,0 g 35 (211 mmol) 2S-metyyli-3-(metyylisulfonyyli)propionihappoa «*··· ja 48,3 g (315 mmol) N-hydroksibentsotriatsolia 210 ml:ssa 33 1 1 8986 vedetöntä DMF:a O °C:ssa ja jossa käytettiin typpeä suoja-kaasuna, lisättiin 44,4 g (231 mmol) EDO:ta. Suunnilleen 30 minuutin kuluttua kaikki EDC oli liuennut. Kun seos oli ollut vielä 60 minuuttia 0 °C:ssa, lisättiin liuos, jonka 5 muodosti 108,8 g (211 mmol) 2R-hydroksi-3-[[(1, 3-bentsodi-oksol-5-yyli)sulfonyyli]-(2-metyylipropyyli)amino]-IS-(fe-nyylimetyyli)propyyliamiinimetaanisulfonaattia 350 ml:ssa vedetöntä DMF:a, joka oli etukäteen neutraloitu 24 ml:11a (22,3 g) 4-metyylimorfoliinia. Kun seos oli ollut 2 tuntia 10 0 °C:ssa, sitä sitten sekoitettiin yön yli 18 tunnin ajan.
DMF poistettiin alipaineessa, lisättiin 1 1 etyyliasetaattia, pestiin 5-%:isella sitruunahapolla, kylläisellä natriumbikarbonaatilla, vedellä, suolaliuoksella, kuivattiin vedettömällä magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja väke-15 voitiin, jolloin saatiin 120,4 g raakatuotetta, joka oli HPLC:n mukaan 90-%:isen puhdasta. Tuote kiteytettiin kaksi kertaa 750 - 1 000 ml:sta absoluuttista etanolia, jolloin saatiin 82,6 g haluttua tuotetta.
Esimerkki 16 o : i‘: H o \ Rv ,? lv “’'rrV'Y'VfVY0) h o h oh \ 2o 2S- [ [ (N-metyyliamino) asetyyli] amino] -N- [2R-hydrok- • · · ϊ,ϊ ! si-3-[[ (1,3-bentsodioksol-5-yyli) sulfonyyli] - (2-metyyli propyyli) amino] -IS-(fenyylimetyyli)propyyli]-3,3-dimetyy-
J
:*·*: libutaaniamidin valmistus .**·. 25 6,55 g:aan (10,7 mmol) N-[2R-hydroksi-3-[[(1,3- ^ bentsodioksol-5-yyli)sulfonyyli]-(2-metyylipropyyli)amino]- ··· ·**ϊ IS- (fenyylimetyyli) propyyli] -2S- [ (klooriasetyyli) amino] - s·· !...· 3,3 -dimetyylibutaaniamidia lisättiin 25 ml tetrahydrofu- raania, liuotin poistettiin alipaineessa mahdollisen etyy-30 liasetaatin poistamiseksi, ja sitten lisättiin 25 ml tet- • · rahydrofuraania. Tähän liuokseen, joka oli 10 °C:ssa, li- 118986 34 sättiin 19 ml (214 mmol) 40-%:ista vesipitoista metyyli-amiinia. 2 tunnin kuluttua liuottimet poistettiin alipaineessa, lisättiin 1 1 etyyliasetaattia, pestiin kylläisellä natriumbikarbonaatilla, suolaliuoksella, kuivattiin ve-5 dettömällä magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja väkevöi-tiin, jolloin saatiin 6,0 g tuotetta (puhtaus 98 %).
Esimerkki 17 Tämän keksinnön mukaiset retrovirusperäiset prote-aasi-inhibiittoriyhdisteet ovat tehokkaita HIV-proteaasi-10 inhibiittoreita. Jäljempänä kuvattua entsyymianalyysiä voidaan käyttää retrovirusperäisten proteaasi-inhibiittorien valinnassa yhdistelmähoidossa käyttöä varten. Tällaisten yhdisteiden IC50 (pitoisuus, jolla inhibiittoriyh-diste vähentää entsyymiaktiivisuutta 50 %:lla) voidaan 15 laskea tätä menetelmää käyttäen.
Entsyymimenetelmä on seuraavanlainen. Substraatti on 2-aminobentsoyyli-Ile-Nle-Phe(p-N02)-Gln-ArgNH2. Positiivinen vertailu on MVT-101 (Miller, M. et ai., Science 246, 1149 (1989)). Analyysipuskuri on 20 mM natriumfosfaatti, 20 pH 6,4, 20-%:inen glyseroli, 1 mM EDTA, 1 mM DTT ja 0,1-%:inen CHAPS. Substraatti liuotetaan DMS0:iin, sitten lai- • · ·.· · mennetaan 10-kertaiseksi analyysipuskuriin. Lopullinen substraattipitoisuus analyysissä on noin 80 μΜ. Hiv-:V; proteaasi laimennetaan analyysipuskuriin noin 12,3 nanomo- m · 25 laarisuuden lopulliseen entsyymipitoisuuteen moolimassasta . .·. 10 780 laskettuna.
• * · DMSO:n lopullinen pitoisuus on noin 14 % ja glyse- • · · * rolin lopullinen pitoisuus on noin 18 %. Koeyhdiste liuo- tt tetaan DMSO:iin ja laimennetaan DMSO:iin noin kymmenker- • · · '•V 30 täiseksi (10 x) koepitoisuudeksi, sitten 10 μl:aan sub- *...· straattia. Fluoresenssin suurenemista tarkkaillaan 4 ajan- * ··· hetkenä (0, 8, 16 ja 24 minuuttia) ympäristön lämpötilas- ···· .·*·. sa. Kukin analyysi toteutetaan rinnakkaiskoekuopissa.
* Esimerkki 18 * * 35 Tämän keksinnön mukaisten valittujen HXV-prote- ***’· aasi-inhibiittoriyhdisteiden tehokkuus voidaan määrittää 118986 35 käyttäen edellä kuvattua entsyymianalyysiä ja seuraavaa CD4+-solulinja-analyysiä. Proteaasi-inhibiittorien virusten vastaiset aktiivisuudet ilmaistaan tehokkaan pitoisuuden 50 (ECso) ja/tai tehokkaan pitoisuuden 90 (ECgo) arvoi-5 na. Nämä ovat inhibiittorien pitoisuuksia, jotka vaaditaan virusreplikaation inhiboimiseen 50-%:isesti tai vastaavasti 90-%:isesti.
Akuutisti infektoituneiden solujen HIV-inhibitio-analyysimenetelmä on automatisoitu tetratsoliumiin perus-10 tuva kolorimetrinen analyysi, joka on oleellisesti selostettu julkaisussa Pauwels et ai., J. Virol. Methods 20, 309 - 321 (1988). Analyysit suoritetaan 96-kuoppaisilla ku~ dosviljelylevyillä. CD4+-solulinjaa, kuten CEM:ä, MT-2:a, MT-4:ä ja niiden kaltaisia solulinjoja, kasvatetaan RPMI-15 1640-elatusaineessa (Gibco), johon on lisätty 10 % naudan-sikiöseerumia, ja sitten käsitellään polybreenillä (2 ^g/ml). Kudosviljelylevyn kuhunkin kuoppaan pannaan 80 μ1:η tilavuus elatusainetta, joka sisältää 1 x 104 solua. Kuhunkin kuoppaan lisätään 100 μΐ.-η tilavuus koeyhdistet-20 tä liuotettuna kudosviljelyelatusaineeseen (tai elatus-ainetta ilman koeyhdistettä vertailuksi), niin että saavu- • · ·.· f tetaan haluttu lopullinen pitoisuus, ja soluja inkuboidaan 37 °C:ssa 1 tunti. HIV-l:n pakastettu viljelmä liuotetaan viljelyelatusaineeseen pitoisuudeksi 5 x 104 TCID50 ml:aa • ♦ 25 kohti (TCID50 = viruksen annos, joka infektoi 50 % soluis- ···· . .·. ta kudos viljelmässä) , ja 20 μ1:η tilavuus virusnäytettä • · · (sisältää 1 000 TCID50 virusta) lisätään kuoppiin, jotka • · · * sisältävät koeyhdistettä, ja kuoppiin, jotka sisältävät ainoastaan elatusainetta (infektoidut vertailusolut).
• · · *·*·* 30 Useisiin kuoppiin pannaan viljelyelatusainetta ilman vi- φ · · rusta (infektoimattomat vertailusolut) . Samoin koeyhdis-•i. teen luontainen toksisuus määritetään lisäämällä elä- • •ti .*··. tusainetta ilman virusta useisiin kuoppiin, jotka sisältä- • · vät koeyhdistettä. Yhteenvetona esitettynä kudosviljelyle- * * 35 vyt käsittävät seuraavat kokeet: * · 36 1 1 8986
Solut Lääke Virus 1. + - 2.+ + - 3.+ - + 54. + + +
Kokeissa 2 ja 4 koeyhdisteiden lopulliset pitoisuudet ovat 1, 10, 100 ja 500 /ig/ml. Positiiviseen lääke-vertailuun sisällytetään joko atsidotymidiiniä (AZT) tai 10 dideoksi-inosiinia (ddl). Koeyhdisteet liuotetaan DMS0:iin ja laimennetaan kudosviljelyelatusaineeseen niin, että lopullinen DMSO-pitoisuus ei ylitä missään tapauksessa 1,5 %:a. Kaikkiin vertailukuoppiin lisätään DMS0:a sopivana pitoisuutena.
15 Viruksen lisäämisen jälkeen soluja inkuboidaan 37 °C:ssa kosteassa 5-%:isessa C02-atmosfäärissä 7 vuorokautta. Koeyhdisteet voidaan haluttaessa lisätä päivinä 0, 2 ja 5. Päivänä 7 infektoinnin jälkeen kunkin kuopan solut suspendoidaan uudelleen ja 100 μΐ.-n näyte kustakin so-20 lususpensiosta poistetaan analyysiä varten. 20 μ1:η tilavuus 3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetrat- • · ·.· · soliumbromidin (MTT) 5 mg/ml liuosta lisätään kuhunkin i *[: μ1:33η solususpensiota, ja soluja inkuboidaan 4 tuntia 37 °C:ssa 5-%:isessa C02-ympäristössä. Tämän inkuboinnin • · 25 aikana MTT pelkistyy metabolisesti elävien solujen vaiku- ··· . .·. tuksesta, mikä johtaa värillisen formatsaanituotteen muo- • · · dostumiseen solussa. Kuhunkin näytteeseen lisätään 100 μΐ • · · 10-%:ista natriumdodekyylisulfaattia 0,01 N HCl:ssa solu- . , jen hajottamiseksi, ja näytteitä inkuboidaan yön yli. Kul- • · · *·]·' 30 lekin näytteelle määritetään absorbanssi 590 nm:n aallon- pituudella käyttäen Molecular Devices -mikrolevylukijaa.
··· Koeyhdisteen sytotoksisuus ja virusten vastainen tehokkuus ··· .***. määritetään vertaamalla infektoituja tai infektoimat tornia ··· • # yhdisteiden kanssa inkuboituja soluja sisältäville kuopil- * * 35 le ja infektoimattornilie käsittelemättömille vertailu- * ’ kuopille saatuja absorbanssiarvoja.
118986 37 HIV-viljelyrnenetelmät
Donorilymfosyyttien stimulointi
Buffy coatit saatiin American Red Crossilta tai Washington University School of Medicine -yliopiston Blood 5 Bankilta. Nämä valmisteet on esiseulottu Hiv- ja CMV-vasta-aineiden ja HBV-pinta-antigeenin (HBsAg) ja ALT:n (alaniinitransferaasiaktiivisuuden) suhteen ei-A, ei-B-hepatiitin leimana. Paljon leukosyyttejä sisältävä veri (30 ml) poistetaan muovisäiliöstä ja 15 ml pannaan kahteen 10 50 ml:n kierrekorkilliseen sentrifugiputkeen. Kumpikin näyte laimennetaan yhtä suurella tilavuudella steriiliä PBS:ä ja sekoitetaan pipetoimalla. Ficoll-Paqueta (15 ml) tai LSM:ä pannaan laimennettujen verinäytteiden alle käyttäen Pasteur-pipettiä ja antaen liuoksen valua putken poh-15 jalle. Sen jälkeen kumpaakin putkea sentrifugoidaan 1 300 rpm:llä (400 x g) 45 minuuttia 20 °C:ssa. Sentrifugoinnin jälkeen rajapinnalla oleva lymfosyyttivyöhyke poistetaan ja siirretään 50 ml:n putkeen. Lisätään steriiliä PBS:ä erotettujen lymfosyyttien laimentamiseksi ja sitten sent-20 rifugoidaan 1300 rpm:llä 8 minuuttia. Solupelletti pestään kaksi kertaa suspendoimalla uudelleen PBS:ään ja sentrifu- • · : goimalla uudelleen. Lopullinen solupelletti suspendoidaan ·· ♦ j uudelleen 20 ml:aan PBS:ä pipetoimalla ja elävien solujen kokonaismäärä määritetään Trypan Blue -ekskluusiolla.
• i ··· 25 Akuutin infektiivisyyden analyysit kliinisiä iso- »·»« . .*. lantteja käyttäen ··· η
Suunnilleen 3 x 10 solua aktivoidaan 48 tunnin « « * ajan niin, että mukana on noin 3-5 Mg/ml PHA:a RPMI:ssä, ,, jossa on 10 % naudansikiöseerumia ja lL-2:a (10 U/ml).
t » · *·^* 30 Kvantitatiivisesti määritetyt virusten varastoerät lisä- • · *···* tään aktivoituun lymfosyyttisuspensioon moninkertaisinfek- 36 118986 tään koeaineeseen, joka on laimennettu varastoseoksesta saatuun valmiiseen kudosviljelyelatusaineeseen (10 mg/ml) DMS0:ssa 96-kuoppaisilla mikrotiitterilevyillä, jolloin saadaan noin 5 x 105 solua kuoppaa kohti 200 μl:aa kohti.
5 Vertailuina käytettiin infektoimattomia käsittelemättömiä soluja ja soluja, jotka oli käsitelty pelkästään DMSO:lla (0,1 %) tai joko AZT:llä tai DDI:llä. Viljelmistä tutkittiin solusitkosmuodostus päivinä 7 ja 11 infektoinnin jälkeen tai supernatanteista tutkittiin käänteiskopioijaent-10 syymiaktiivisuus tai p24-antigeeni.
Kroonisen infektiivisyyden analyysit CEM-soluja, jotka on kroonisesti infektoitu HXB2:11a (HIV-l:n laboratoriokanta), lisätään 12-kuop-paisen mikrotiitterilevyn kuuteen kuoppaan niin, että saa-15 daan noin 5 x 104 solua kuoppaa kohti. Puolet kuopista käsitellään koeyhdisteellä eri pitoisuuksina ja sama määrä infektoimattomia CEM-soluja jätetään ilman lisättyä yhdistettä. Lisätään tuoretta elatusainetta koeyhdisteen kanssa tai sitä ilman kunakin päivänä kolmen peräkkäisen päivän 20 ajan. Sen jälkeen viljelmiä inkuboidaan 48 tuntia vaihtamatta elatusainetta. Solut kerätään sentrifugoimalla, pes- * · · tään 2 x PBS:ssä ja suspendoidaan uudelleen 50 ^l:aan 2 x i »» · • Laemmli-puskuria, joka sisältää 0,125 M Tris:ä, pH 6,8, :V: 4 % SDS:ä, 20 % glyserolia, 10 % beta-merkaptoetanolia ja ··· 25 0,02 % bromifenolisinistä. Viljelmäsupernatantit viedään • s·· . .·. 0,22 μτα:η suodattimen läpi solujätteen poistamiseksi ja ···* .··. sentrifugoidaan 50 000 rpmillä 90 minuuttia viruspartikke- • · · lien konsentroimiseksi. Viruspelletti suspendoidaan uudel-., leen 50 ^l:aan 2 x Lammli-puskuria. Solu- tai virussuspen- t · t **·* 30 sioita keitetään 5 minuuttia ja sitten niille suoritetaan • · *···* elektroforeettinen erotus 10 - 20 -%:isessa SDS-polyakryy- ·;* liamidigradienttigeelissä. Sitten geelin sisältö siirre- • •t tään nitroselluloosalle elektroforeesin avulla. HIV- • · ··· * . spesifiset proteiinit todetaan käyttäen monoklonaalisia ] 35 vasta-aineita p24:lle ja pl7:lle ja sen jälkeen vuohi- * * anti-hiiri-IgG:tä, joka on liitetty biotiiniin, ja avidii- 118986 39 nia, joka on liitetty HRP:hen. Monoklonaalisten vasta-aineiden tunnistamien spesifisten proteiinien visualisoi-miseen käytettiin 4-kloori-l-naftolin entsymaattista konversiota. Lisäksi tutkittiin kroonisesti infektoituneiden 5 CEM-solujen tuottaman viruksen infektiivisyys koeyhdistei-den läsnä ollessa tai niitä ilman. Suodatetuista superna-tanteista tehtiin sarjalaimennokset ja ne käytettiin in-fektoimattomien CEM-solujen infektoimiseen (noin 1 x 104/kuoppa). Viljelmistä tutkittiin solusitkosmuodostus 10 päivinä 7 ja 11 infektoinnin jälkeen tai supernatanteista tutkittiin käänteiskopioijaentsyymiaktiivisuus tai p24-antigeeni.
Käänteiskopioijaentsyymin (RT) mikroanalyysi RT-mikroanalyysi on sovellutus useista standardi-15 RT-analyyseistä. Se kehitettiin HIV-RT-aktiivisuuden kvantitatiivisen pientilavuusmittauksen mahdollistamiseksi ja useiden näytteiden käsittelyn helpottamiseksi.
Materiaalit Varastokäsittelyliuos 20 (1 ml:aa kohti)
Tris (pH 7,8) 1,0 M 50 /xl • · ! kci 3,o m 25 μΐ • *.ϊ DTT (varastointi -20 °C:ssa) 0,1 M 20 μΐ :V: MgCl2 0,15 M 33 /xl ·:· 25 poly (rA)p (dT012-18) 25 U / 2,5 ml 25 μΐ ·*« . Pharmacia 27-7878 (0,5 U) NP-40 2 % 25 ui • * · 3H-TTP 2,5 Ci/ml 10 μΐ . . (NET 22IA, 80 Ci/mmol) • » i 30 H20 777 μΐ • · *···* Menetelmä: 1. Lisätään 50 μΐ RT-seosta kuoppaa kohti 96-kuoppaiselle ;***; U-pohjaiselle mikrotiitterilevylle.
·· *. 2. Lisätään 10 - 20 /xl solutonta supernatanttiliuosta | 35 kuoppaa kohti.
3. Sekoitetaan hyvin mekaanista pyöritintä käyttäen.
118986 40 4. Inkuboidaan 37 °C:ssa 2 tuntia.
5. Aspiroidaan DE81-suodatinpaperilie tai vastaavasti käyttäen TOMTEK:ä.
6. Huuhdotaan käyttäen 2x SSC:tä neljä kertaa.
5 7. Huuhdotaan 95-%:ista etanolia käyttäen kerran.
8. Kuivataan suodatin.
9. Valmistetaan Beta-levylaskijaa käyttäen suoritettavaa laskentaa varten (Pharmacia).
10 Esimerkki 19
Tuoreet elatusaineet yhdisteiden . infektoimattomat kanssa tai niitä ilman J aolut f \ Analyysisuperna- / \ tantti EC-0:tä | \ varten y HIV-infektoidut \ solut viljelmä ^ \ I PCR:ää varten \ / säästetyt solut : :*; \ Seitsemän / \ päivää /
• · X. X
* · i * · · • « » • · *·· • M* , .·, Toistetaan useita syklejä käyttäen yhdisteen suu- • · ♦ renevaa pitoisuutta, kunnes todetaan muutos EC50:ssä.
• * · * 15 Seuraavaksi esitetään viljelymenetelmä, jota käy- ,, tetään HIV-proteaasi-inhibiittoriresistenttien mutanttien t * · *·*·* valintaan. Infektoituja soluja kasvatettiin jatkuvalla ta- • * # · valla proteaasi-inhibnttorin läsnä ollessa. Joitakin vil- ··· jelmiä pidettiin vuoroviikoin suurissa ja pienissä inhi- ··*· .*··, 20 biittoripitoisuuksissa. Toiset siirrettiin vakiopitoisuu- ·* dessa. Lääkepitoisuuksia suurennettiin määräajoin, kunnes * * havaittiin tasainen muutos EC5o:ssä. Muutos annosvaste- *·’** käyrällä todettiin yleensä 0,5 - 1 jiig/ml:n tai sitä suu- | 118986 41 remmalla (5 - 10 x ECgo) lääkepitoisuudella ja se riippui käsiteltävästä virusisolaatista. Käytettiin HIV:n sekä la-boratoriosovellutus- että primäärisiä kliinisiä isolaatteja. Samat virusisolaatit siirrettiin samalla tavalla ilman 5 lääkkeitä, niin että voitiin tehdä suorat nukleosidise-kvenssivertailut käsiteltyjen ja käsittelemättömien iso-laattien välillä. Yleensä HIV-1-muunnelmat, jotka olivat resistenttejä proteaasi-inhibiittoreille, valittiin sarjasiirron (kasvu) avulla useiden ilmoitetun proteaasi-inhi-10 biittorin inhibointipitoisuuksien läsnä ollessa (katso
Markowitz et ai., Journal of Virology 69: 701 - 706 (1995)). Jäljempänä luetellut HIV-l-muunnelmat osoittavat mutaatiot, joita on läsnä valituissa virusisolaateissa ja joita ei ole läsnä vertailu-, käsittelemättömissä vi-15 rusisolaateissa.
RF tarkoittaa HIV-l-kantaa HIV-1rF ja RFR tarkoittaa esimerkin 1 yhdisteen vastaisen RF:n valinnalla saatujen resistenttien kantojen seosta. RFR käsittää seoksen viruskannoista, joilla on G48V:n (14/40 kloonia) ; G48V.-n, 20 V82A:n (18/40 kloonia); G48V:n, L90S:n (2/40 kloonia); G48V:n, I54T:n, V82A:n (1/40 kloonia); G48M:n (1/40 kloo- • · : nia) ; G48V:n, Q61H: n (1/40 kloonia); V13I:n, G48V:n (1/40 : V kloonia); G48V:n, F53L:n, V82A:n (1/40 kloonia); ja G48V:n, V82A:n, C95Y:n (1/40 kloonia) proteaasigenotyypit. ··· 25 RFR2 tarkoittaa RFR:ä kolmella kasvukierroksella rajoitta- • •M ^ i 42 118986 I54T:n, L63P:n, G73M:n, V82A:n (1/9 kloonia) proteaasige-
i notyypit. SF162 tarkoittaa HIV-l-kantaa SF-162 ja SF162R
tarkoittaa resistenttien kantojen seosta, jotka kannat on saatu valitsemalla SF162 esimerkin 1 yhdistettä vastaan.
5 SF162R käsittää seoksen viruskannoista, joilla on M46I:n, F53L:n, L63P:n, A71V:n, N88D:n (2/3 kloonia); ja M46I:n, F53L:n, L63P:n, A71V:n, N88D:n, Q92R:n (1/3 kloonia) pro- teaasigenotyypit. 89-959 tarkoittaa HIV-l-kantaa 89-959 ja 89-959R tarkoittaa resistenttien kantojen seosta, jotka 10 kannat on saatu valitsemalla 89-959 esimerkin 2 yhdistettä vastaan. 89-959R käsittää seoksen viruskannoista, joilla on N88S:n (4/5 kloonia); ja D25N:n, T26A:n, D30N:n, D37N:n, R41K:n, G73D:n, R87K:n, N88S:n (1/4 kloonia) pro- teaasigenotyypit. NL4 tarkoittaa HIV-l-kantaa HIV-1nl4-3-15 NL4(G48V) tarkoittaa kantaa, jonka proteaasissa on synteettisesti aikaansaatu paikkakohdistettu mutaatio glysii-nistä valiiniksi aminohappoasemassa numero 48. NL4(I84V) tarkoittaa kantaa, jonka proteaasissa on synteettisesti aikaansaatu paikkakohdistettu mutaatio isoleusiinista va-20 liiniksi aminohappoasemassa numero 84. NL4(R8Q,M46I) tar- i koittaa kantaa, jonka proteaasissa on synteettisesti ai-: kaansaatuja paikkakohdistettuja mutaatioita arginiinista »· · * V glutamiiniksi aminohappoasemassa numero 8 ja metioniinista • · isoleusiiniksi aminohappoasemassa numero 46. NL4(P22-538) *·· 25 tarkoittaa resistenttien kantojen seosta, jotka kannat on ···· 118986 43 X84V. NL4(538/P7-AG) tarkoittaa resistenttien kantojen seosta, jotka kannat on saatu valitsemalla NL4(P22-538) esimerkin 12 yhdistettä vastaan 7 siirron jälkeen ja jotka käsittävät proteaasigenotyypit M46I, L63P, A71V, I84V; ja 5 V32I, V82I. NL4(538/P24-AG) tarkoittaa resistenttejä kan toja, jotka on saatu valitsemalla NL4(P22-538) esimerkin 12 yhdistettä vastaan 24 siirron jälkeen ja jotka käsittävät proteaasigenotyypin M46I, L63P, A71V, I84V. NLA(P19- 003) tarkoittaa resistenttejä kantoja, jotka on saatu valo litsemalla HIV-1Nl4-3 esimerkin 9 yhdistettä vastaan 9 siirron jälkeen ja jotka käsittävät proteaasigenotyypin R8K, M46I. NL4(P34-003) tarkoittaa resistenttejä kantoja, jotka on saatu valitsemalla HIV-1nl4-3 esimerkin 9 yhdistettä vastaan 34 siirron jälkeen ja jotka käsittävät pro-15 teaasigenotyypin R8K, M46I, L63P, A71V, L90M. Vi- rusisolaattiresistenssituloksista on esitetty yhteenveto taulukoissa 1-11.
Esimerkki 20
Virusisolaattiresistenssitulokset, joista on esi-20 tetty yhteenveto taulukoissa 1-3, aikaansaatiin seuraa-van analyysimenetelmän tai sen vähäisten muunnelmien mu- • · :.J : kaisesti. Suunnilleen 3 χ 107 solua aktivoidaan 48 tunnin ·· · • *,ί ajan niin, että mukana on noin 3-5 /ig/ml PHA:a RPMItssä, :V; jossa on 10 % naudansikiöseerumia ja IL-2:a (10 U/ml).
··· 25 Kvantitatiivisesti määritetyt virusten varastoerät lisä- ·»«· • .·. tään aktivoituun lymfosyyttisuspensioon moninkertaisinfek- ··· tiolla noin 0,001 - 0,01. Soluvirussuspensiota inkuboidaan • · * 37 °C:ssa 2 tuntia virusabsorption mahdollistamiseksi.
.. Jäljelle jäänyt virussiirroste poistetaan sentrifugoimalla 30 ja solut suspendoidaan uudelleen RPMIriin, joka sisältää • · *·♦·’ 10 % FBS:ä ja 10 U/ml IL-2:a. Nämä infektoidut solut lisä- ·;· tään koeyhdisteeseen, joka on laimennettu varastoseoksesta «··« ;***· saatuun valmiiseen kudosviljelyelatusaineeseen (10 mg/ml) ··· * , DMSO:ssa 96-kuoppaisilla mikrotiitterilevyillä, jolloin ] 35 saadaan noin 5 χ 105 solua kuoppaa kohti 200 μl:aa kohti.
* * Vertailuina käytettiin infektoimattomia käsittelemättömiä 118986 44 soluja ja soluja, jotka oli käsitelty pelkästään DMSO:lla (0,1 %) tai joko AZT:llä tai DDItllä. Viljelmistä tutkittiin solusitkosmuodostus päivinä 7 ja 11 infektoinnin jälkeen tai supernatanteista tutkittiin käänteiskopioijaent-5 syymiaktiivisuus tai p24-antigeeni.
Taulukko 1
Esim. Virusisolaatti (ECso, ng/ml)
nro SF162 SF162R
10 1 31 443 2 2 6 5 4 4 6 2 11 15 Taulukko 2
Esim. Virusisolaatti (ECso, ng/ml)
nro SF162 SF162R
1 2 111 20 7 1 108 8 1 98 • · • · · • I · • I» · :*·*: Taulukko 3 • · * m • » · • · · · 25 Esim. Virusisolaatti (ECso/ ng/ml)
"!·. nro 89-959 89-959R 89-959R
ι 9β+ 5+ 37++ • · · 2 100+ 395+ 872++ 5 36+ 5+ 38++ • · • · * V.* 30 6 4 6 :...: 7 13s 12s ' 8 12s IIs !
* I
···· • · · • · • · *·’ +, ++, s osoittavat samassa kokeessa saadut arvot.
’Σ”: 35 ♦ ♦ ♦ 118986 45
Esimerkki 21
Virusisolaattiresistenssitulokset, joista on esitetty yhteenveto taulukoissa 4 - 6, aikaansaatiin seuraa-van analyysimenetelmän tai sen vähäisten muunnelmien mu-5 kaisesti. Analyysit suoritetaan 96-kuoppaisilla kudosvil-jelylevyillä. CEM-T4-solut suspendoidaan 90-%:iseen RPMI-elatusaineeseen (Gibco BRL Life Technologies, Inc., Gaithsburg, MD), 10-%:iseen lämpökäsiteltyyn naudansikiö-seerumiin (Gibco BRL Life Technologies, Inc., Gaithsburg, 10 MD) lopulliseksi pitoisuudeksi 5 x 105 elävää solua ml:aa kohti. HIV-viljelmän (kanta HIV-1RF) pakastettu erä sulatetaan nopeasti (37-°C:isessa vesihauteessa) ja lisätään CEM-T4-soluihin, niin että saadaan lopullinen pitoisuus noin 0,001 - 0,01 infektioyksikköä solua kohti. Virus- 15 solususpensiota sekoitetaan nopeasti pyörittämällä ja 100 μΐ lisätään välittömästi 100 ^l:aan kutakin koeyhdisteen (valmistettu kaksinkertaisena konsentraattina 90-%:isessa RFMI:ssä, 10-%:isessa FBS:ssä) laimennosta 96-kuoppaisen kudosviljelylevyn kussakin kuopassa. Kukin levy sisältää 20 vertailukuopat, jotka sisältävät soluja ja virusta, mutta eivät koeyhdistettä. 3'-atsido-3'-deoksitymidiini (AZT) • · |t; j sisältyy positiivisena vertailuna kaikkiin analyyseihin.
:*·*: Kudosviljelylevyjä inkuboidaan 37 °C:ssa kosteassa 5- ·*·*. %: isessa C02-atmosf äärissä 7 vuorokautta. Virusreplikaa- • · 25 tioaste määritetään sitten mittaamalla supernatanteista *··· ..·. käänteiskopioijaentsyymiaktiivisuus käyttäen standardime- • · · I** netelmiä (kuten edellä on kuvattu ja katso esimerkiksi • · · • · ·
Techniques in HIV Research, Aldovini & Walker, toim., . . 1990, Stockton Press, NY).
• · · · · • · ··· • · • · ··« Φ ··· • · · * • · · · • · ··· • ♦ ····« • · 118986 46
Taulukko 4
Esim. Virusisolaatti (ECso# ng/ml)
nro RF RFR
51 30 223+ 2 40 8+ 3 5 2+ 4 10 0,4+ 5 44++ 7+ 10 6 12++ 15+ + ja ++ osoittavat samassa kokeessa saadut arvot.
Taulukko 5 15 Esim. Virusisolaatti (ECso# ng/ml)
nro RF RFR
1 24 394 7 2 78 8 2 1 20 ·,· | Taulukko 6 !’**: Esim. Virusisolaatti (ECso# ng/ml) ·
··;*; nro RF RFR2 RFRR
.1. 25 1 19 880 5609 !"*. 2 35 367 1111 .*" 5 6 57 982 • · · 6 6 31 962 14 1 6 39 • · :.V 30 15 5 9 21 M· 16 3 19 • · · • «•ft .***. Esimerkki 22 • * '·* Virusisolaattiresistenssitulokset, joista on esi- * * 35 tetty yhteenveto taulukoissa 7-11, aikaansaatiin julkai- *·**· sussa Markowitz et ai., Journal of Virology, voi. 69, 118986 47 701 - 706 (1995) kuvattujen analyysimenetelmien tai niiden vähäisten muunnelmien mukaisesti, joka julkaisu sisällytetään tähän viittauksella kokonaisuudessaan.
5 Taulukko 7
Esim. Virusisolaatti (ECgo, nM) nro NL4 NL4(G48V) NL4(I84V) 5 80 160 640 10 6 30 150 90 10 80 160 800 12 25 125 125 13 250 1000 6250 14 8 8 72 15 15 60 60 60 16 8 8 8
Taulukko 8 20 Esim. virusisolaatti (ECso, nM) nro NL4 NL4(R80,M46I) 5 80 240 6 30 30 • · :Yj 10 80 240 25 12 25 125 !"·. 13 250 750 • · · “I 16 8 8 • * · • · · , . Taulukko 9 • · · *·**· 30 • a· *·*.* Esim. Virusisolaatti (ECso# nM) ·:. nro NL4 NL4(P22-538) NL4(P37-538) .···. 5 80 800 6400 • · *♦’ 6 30 150 2400 *r*: 35 10 80 1600 6400 12 25 500 >3125 118986 48 13 250 5000 >31250 14 60 60 1000 15 8 400 1000 16 8 8 40 5
Taulukko 10
Esim. Virusisolaatti (EC50# nM) nro NL4 NL4(538/524) NL4(538/P7-AG) NL4(538/P24-AG) 10 5 80 6400 6400 6400 6 30 2400 2400 2400 10 80 6400 6400 6400 12 25 >3125 >3125 >3125 13 250 >31250 >31250 >31250 15 16 8 40 40 40
Taulukko 11
Esim. Virusisolaatti (EC50# nM) 20 nro NL4 NLA(P19-003) NL4(P34-003) 5 80 240 400 j.;‘; 6 3 0 30 30 10 80 400 400 • · 12 25 150 375 • 25 13 250 1250 1250 !’!*. 16 8 8 8 • · · * · · • · · • · ·
Esimerkki 23 , , Esimerkkien 1 ja 2 proteaasi-inhibiittoreita, jot- • · · **]·* 30 ka sisältävät ainutlaatuisen hydroksietyyliureaisosteerin, • · *·..* käytettiin lääkeresistenttien HIV-1-muunnelmien valitsemi- ·· seksi in vitro. Kliiniset ja laboratorio-HIV-1-kannat • · · · .***. siirrettiin T-solulinjoihin tai perifeerisiin veren mono- • •e • # nukleaarisiin soluihin (PBMC:t) suurenevien lääkepitoi- 35 suuksien läsnä ollessa. Resistenteillä muunnelmilla oli * * johdonmukaisesti EC5o-arvot, jotka olivat vähintään 10 49 118986 kertaa suurempia kuin vertailuviruksella, joka oli siirretty samana aikana, mutta ilman inhibiittoria. Virus-DNA amplifioitiin PCR:llä ja proteaasia koodaavan geenin nuk-leotidisekvenssi määritettiin tavanomaisia menetelmiä 5 käyttäen. Viruksissa, jotka olivat resistenttejä esimerkkien 2 ja vastaavasti 1 proteaasi-inhibiittoreille, todettiin johdonmukaisesti aminohappomuutos asemassa 88 monissa valituissa muunnelmissa. Asn-tähde asemassa 88 on rakenteellisesti säilyneen kierredomeenin sisällä, joka on läs-10 nä sekä monomeerisissä että dimeerisissä asparagiinipro-teinaaseissa. Vastaava karboksipäätteinen sekvenssi Gly-Arg-Asp/Asn (tähteet 86 - 88) on ainutlaatuinen retrovi-rusperäisille asparagiiniproteinaaseille. Vaikka mikä tahansa selitys näille tuloksille on vain spekulointia, re-15 kombinantti-HIV-l-proteaasiin sitoutuneiden prototyyppi-hydroksietyyliureainhibiittorien korkean erotuskyvyn rönt-genrakenteista johdettuihin templaatteihin perustuvat mal-lituskokeet näyttävät viittaavan siihen, että Asn88-mutaa-tiot voivat muuttaa proteaasin konformaatiota.
20 Tämän keksinnön mukaiset retrovirusperäiset prote- aasi-inhibiittoriyhdisteet ovat edullisesti tehokkaita vi- • · · rusten vastaisia yhdisteitä ja erityisesti ne ovat tehok- ·· f * *ti kaita retrovirus ten, erityisesti lentivirusten, inhibiit- :V: toreita, kuten edellä on esitetty. Siten nämä yhdisteet ··· 25 ovat tehokkaita HIV:n inhibiittoreita. On mahdollista, et- **·· . ta nämä yhdisteet inhiboivat myös muita HIV:n kantoja, ku- .···, ten HIV-2:a ja muita viruksia, kuten esimerkiksi VISNA- • · · virusta ja ihmisapinan immuunikatovirusta (SlV:ä), HTLV- . . 1:ä ja HTLV-2:a. Siten nämä yhdisteet ovat tehokkaita ret- • · » **V 30 rovirusperäisten infektioiden hoidossa ja/tai ennaltaeh- • ♦ *···" käisyssä.
··· Tämän keksinnön tarkoitetaan myös käsittävän ret- ···» .**·. rovirusperäisten proteaasi-inhibiittoriyhdisteiden soivaa- • ·· • , tin tai hydraatit, mikäli se on mahdollista, ja ne valmis- 35 tetaan tai erotetaan alalla tunnetuilla menetelmillä.
• * 50 118986
Retrovirusperäisiä proteaasi-inhibiittoriyhdistei-tä voidaan käyttää epäorgaanisista tai orgaanisista ha-| poista johdettujen suolojen muodossa. Näitä suoloja ovat 1 näihin kuitenkaan rajoittumatta seuraavat: asetaatti, adi- 5 paatti, alginaatti, sitraatti, aspartaatti, bentsoaatti, bentseenisulfonaatti, bisulfaatti, butyraatti, kamforaat-ti, kamferisulfonaatti, diglukonaatti, syklopentaanipro-pionaatti, dodekyylisulfaatti, etaanisulfonaatti, gluko-heptanoaatti, glyserofosfaatti, hemisulfaatti, heptanoaat-10 ti, heksanoaatti, fumaraatti, vetykloridi, vetybromidi, vetyjodidi, 2-hydroksietaanisulfonaatti, laktaatti, male-aatti, metaanisulfonaatti, nikotinaatti, 2-naftaleenisul-fonaatti, oksalaatti, palmoaatti, pektinaatti, persulfaat-ti, 3-fenyylipropionaatti, pikraatti, pivalaatti, propio-15 naatti, sukkinaatti, tartraatti, tiosyanaatti, tosylaatti, mesylaatti ja undekanoaatti.
Esimerkkejä hapoista, joita voidaan käyttää farmaseuttisesti hyväksyttävien happoadditiosuolojen muodostamiseen, ovat mm. sellaiset epäorgaaniset hapot kuin 20 kloorivetyhappo, rikkihappo ja ortofosforihappo ja sellaiset orgaaniset hapot kuin oksaalihappo, maleiinihappo, me- * · ί.ί · ripihkahappo ja sitruunahappo, edullisesti vetykloridisuo- t· · • la. Muita esimerkkejä ovat mm. suolat alkalimetallien tai maa-alkalimetallien, kuten natriumin, kaliumin, kalsiumin • · ··· 25 tai magnesiumin, tai orgaanisten emästen kanssa.
• ·· · ! . .·. Kokonaisvuorokausiannos, joka annetaan potilaalle .··· yhtenä annoksena tai jaettuina annoksina, voi olla määräl- • ♦ ♦ tään esimerkiksi 0,01 - 50 mg/kg kehon painosta vuorokau- .. dessa ja tavallisemmin 0,1 - 30 mg. Annostusyksikkökoostu- • · » *·*·* 30 mukset voivat sisältää sellaiset määrät niiden osa- ··· • ♦ *···* annoksia, että aikaansaadaan vuorokausiannos.
··· Aktiivisen aineosan määrä, joka voidaan yhdistää kantaja-aineiden kanssa, niin että muodostuu yksittäinen ·»· • φ annostusmuoto, riippuu hoidettavasta potilaasta ja kysees- 35 sä olevasta antotavasta.
• · i 51 118986
Annostushoito-ohje sairaustilan hoitoa varten ret- rovirusperäisillä proteaasi-inhibiittoriyhdisteillä ja/tai -koostumuksilla valitaan eri tekijöiden mukaan, joita ovat mm. potilaan tyyppi, ikä, paino, sukupuoli, ruokavalio ja 5 lääketieteellinen tila, sairauden vakavuus, antotapa, farmakologiset seikat, kuten kyseessä olevan käytettävän yhdisteen aktiivisuus, tehokkuus, farmakokineettiset ja tok-sikologiaprofiilit, se, käytetäänkö lääkkeen antosystee-miä, ja se, annetaanko yhdiste lääkeyhdistelmän osana. Si-10 ten todellinen käytettävä annostushoito-ohje voi vaihdella laajasti ja sen vuoksi se voi poiketa edellä esitetystä edullisesta annostushoito-ohj eesta.
Tämän keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan antaa oraalisesti, parenteraalisesti, inhalaatiosuihkeena, rek-15 taalisesti tai paikallisesti annostusyksikköformulaatloissa, jotka sisältävät haluttaessa tavanomaisia ei-toksisia farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantajia, adjuvantteja ja vehikkelejä. Paikallinen antaminen voi myös käsittää ihon läpi vaikuttavan antamisen käytön, kuten ihon läpi vaikut-20 tavat laastarit tai iontoforeesilaitteet. Termi "parente-raalinen" tässä käytettynä käsittää ihonalaiset injektiot, • ·*· ϊ·ί ί laskimonsisaiset, lihaksensisäiset, rmtalastansisäiset « · : V injektio- tai infuusiotekniikat.
• » V,! Injektoitavat valmisteet, esimerkiksi steriilit >t*:* 25 injektoitavat vesipitoiset tai öljypitoiset suspensiot, : j*. voidaan formuloida tunnetun tekniikan mukaisesti käyttäen M· sopivia dispergointi- tai kostutusaineita ja suspendointi- aineita. Steriili injektoitava valmiste voi myös olla ste- .. riili injektoitava liuos tai suspensio ei-toksisessa pa- ;!*' 30 renteraalisesti hyväksyttävässä laimentimessa tai liuotti- • · *··* messa, esimerkiksi liuoksena 1,3-butaanidiolissa. Hyväksi* syttäviä vehikkelejä ja liuottimia, joita voidaan käyttää, • ••i ·*“. ovat vesi, Ringerin liuos ja isotoninen natriumkloridiliu- »·· •, os. Lisäksi steriilejä sitoutuneita öljyjä käytetään ta- 35 vallisesti liuottimena tai suspendointiväliaineena. Tätä ·«··· * * tarkoitusta varten voidaan käyttää mitä tahansa mietoa si- 118986 52 toutunutta öljyä, synteettiset mono- tai diglyseridit mukaan luettuina. Lisäksi rasvahapoilla, kuten öljyhapolla, on käyttöä injektioiden valmistuksessa.
Lääkkeen rektaaliseen antamiseen tarkoitetut perä-5 puikot voidaan valmistaa sekoittamalla lääke sopivan ei-ärsyttävän täyteaineen kanssa, kuten kaakaovoin ja poly-etyleeniglykolien kanssa, jotka ovat kiinteitä tavallisissa lämpötiloissa, mutta nestemäisiä peräsuolen lämpötilassa, ja jotka sen vuoksi sulavat peräsuolessa ja vapautta-10 vat lääkkeen.
Kiinteitä annostusmuotoja oraalista antamista varten voivat olla kapselit, tabletit, pillerit, jauheet ja rakeet. Tällaisissa kiinteissä annostusmuodoissa aktiivinen yhdiste voi olla sekoitettuna ainakin yhden inertin 15 laimentimen, kuten sakkaroosin, laktoosin tai tärkkelyksen, kanssa. Tällaiset annostusmuodot voivat myös sisältää, kuten normaalissa käytännössä, muita aineosia kuin inerttejä laimentimia, esim. voiteluaineita, kuten magne-siumstearaattia. Kapselien, tablettien ja pillerien ky-20 seessä ollessa annostusmuodot voivat myös sisältää pusku-rointiaineita. Tabletit ja pillerit voidaan lisäksi vai- • ♦ · mistaa enteropinnoitteiden kanssa.
M · • \i Nestemäisiä annostusmuotoja oraalista antamista | ϊΥ: varten voivat olla farmasettisesti hyväksyttävät emulsiot, ··· 25 liuokset, suspensiot, siirapit ja eliksiirit, jotka sisäl- ·*·· . .·, tävät alalla tavallisesti käytettyjä inerttejä laimenti- ··· .·*·, mia, kuten vettä. Tällaiset koostumukset voivat myös si- • · · sältää adjuvantteja, kuten kostutusaineita, emulgointi- ja . . suspendointlaineita, ja makeutus-, aromi- ja hajusteainei- * · · V 30 ta.
• et • · **;·* Vaikka tämän keksinnön mukaiset retrovirusperäiset •j· proteaasi-inhibiittoriyhdisteet voidaan antaa ainoina ak- ·"'· tiivisina farmaseuttisina aineina, niitä voidaan myös M· * . käyttää yhdistelmässä muiden virusten vastaisten aineiden | 35 kanssa, jotka ovat tehokkaita retroviruksia, kuten HIV- * * 1:ä, vastaan. Tällaisia yhdisteitä ovat näihin kuitenkaan 118986 53 rajoittumatta muut HIV-1-proteaasi-inhibiittorit, erilaiset nukleosidianalogit, ei-nukleosidikäänteiskopioijaent-syymi-inhibiittorit, tat-antagonistit ja glykosidaasi- inhibiittorit.
5 Esimerkkejä HIV-1-proteaasi-inhibiittoreista ovat näihin kuitenkaan rajoittumatta Ro 31-859 (Roberts, N.A. et ai. Science 1990, 248, 258 - 261, ja Drugs of the Future 1991, 16(3), 210 - 212), KNI-272 (Kagayama, S. et ai., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1993, 810 - 817), 10 sykliset ureasarjat (Lam, P. et ai., "De Novo Design and Discovery of Potent, Nonpeptidal HIV-1 Protease Inhibitors", tutkielma 96, 205th American Chemical Society Na tional Meeting, Medicinal Chemistry Division, Denver, CO, 28. maaliskuuta - 2. huhtikuuta 1993), L-735,524 (Dorsey, 15 B.D. et al., "L-735,524: The Rational Design of a Potent and Orally Bioavailable HXV Protease Inhibitor", tutkielma 6, 206th American Chemical Society National Meeting, Medicinal Chemistry Division, Chicago, IL, 22. - 27. elo kuuta 1993) ja niiden analogit.
20 Esimerkkejä kilpailevista nukleosidianalogeista ovat näihin kuitenkaan rajoittumatta atsidotymidiini !.ί I (AZT) , dideoksi-inosiini (DDI) , DDC, 3TC, D4T ja PMEA.
·* » i • V Esimerkkejä ei-nukleosidi-, ei-kilpailevista käänteisko- ϊ,ϊβϊ pioijaentsyymi-inhibiittoreista ovat näihin kuitenkaan ra- ··· 25 joittumatta pyridoniryhmä (Wei, J.S. et ai., J. Med. Chem.
···· • ·*· 1993, 36, 249 - 255; Hoffman, J.M. et ai., J. Med. Chem.
1992, 35, 3784 - 3791; Saari et ai., J. Med. Chem. 1992, ! 35, 3792 - 3802; Drugs of the Future 1992, 17(4), 283 - ! 285, ja sen analogit); bis-(heteroaryyli) piperatsiinien 30 ryhmä (Romero, D.L. et ai., J. Med. Chem. 1993, 36, 1505 - • »
*“·’ 1508; Romero, D.L. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA
f#*j* 1991, 34, 746 - 751 ja 3187 - 3198; ja niiden analogit) ja trisykliset pyridobentso- ja depyridodiatsepinonit (Hargrave, K.D., J. Med. Chem. 1991, 34, 2231 - 2241; Mer-* 35 luzzi, M.J., Science 1990, 250, 1411 - 1413; ja niiden ! • e··· analogit) ja 5-kloori-3-(fenyylisulfonyyli)-indoli-2-kar- 118986 54 boksiamidi ja sen analogit (Williams, T.M. et ai., J. Med.
Chem. 1993, 36, 1291 - 1294). Esimerkkejä tat-antagonis
teista ovat näihin kuitenkaan rajoittumatta Ro 5-3335 ja Ro 24-7429 (Hsu, M.C. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 5 1993, 909, 6395 - 6399; Tam, S. et ai., "TAT INHIBITORS: A
NEW CLASS OF ANTI-HIV AGENTS", tutkielma 372, 204th American Chemical Society National Meeting, Organic Chemistry Division, Washington, DC, 23. - 28. elokuuta 1992) ja niiden analogit. Esimerkkejä glykosidaasi-inhibiittoreista 10 ovat näihin kuitenkaan rajoittumatta kastanospermiini, kastanospermiini-6-butryyliesteri, N-butyyli-l-deoksinoji-rimysiini, N-butyyli-l-deoksinoj irimysiiniperbutryylieste-ri ja niiden analogit ja aihiolääkkeet.
Terapeuttiset aineet voidaan formuloida erillisik-15 si koostumuksiksi, jotka annetaan oleellisesti samaan aikaan, tai terapeuttiset aineet voidaan antaa yksittäisinä koostumuksina niin, että kaikkia aktiivisia aineita on potilaassa terapeuttisesti tehokkaana määränä. Vaihtoehtoisesti terapeuttiset aineet voidaan antaa potilaalle eri 20 aikoina niin, että on potilaassa on kerrallaan vain yhtä tai kahta aktiivista ainetta terapeuttisesti tehokkaana • » • · ® ·»·»· m : maarana.
·· · • Tämän keksinnön mukaiset yhdisteet ja menetelmät ;Y: ovat tehokkaita virusten vastaisia yhdisteitä ja erityi- ··· 25 sesti ne ovat tehokkaita retrovirusinhibiittoreita, kuten ···· . .·. edellä on esitetty. Siten nämä yhdisteet ovat tehokkaita .···, HIV-proteaasi-inhibiittoreita. On mahdollista, että nämä • · ♦ yhdisteet inhiboivat myös muita retroviruksia, kuten muita . . lentiviruksia, erityisesti muita HIV:n kantoja, esim. HIV- • · * *Y 30 2:a, ihmisen T-soluleukemiavirusta, rous-sarkoomavirusta, * · **··* ihmisapinan immuunikatovirusta, kissan leukemiavirusta, •e j **· kissan immuunikatovirusta ja niiden kaltaisia. Siten nämä ! ···· yhdisteet ovat tehokkaita retrovirusperäisten infektioiden ··· * . hoidossa ja/tai ennaltaehkäisyssä.
\ 35 Nämä yhdisteet ja menetelmät ovat myös tehokkaita estettäessä retrovirusten kasvua liuoksessa. Sekä ihmis- 118986 55 että eläinsoluviljelmiä, kuten T-lymfosyyttiviljelmiä, käytetään erilaisiin hyvin tunnettuihin tarkoituksiin, kuten tutkimus- ja diagnostisiin menetelmiin, jotka käsittävät kalibraattorit ja vertailut. Ennen soluviljelmän kas-5 vatusta ja varastointia ja sen jälkeen nämä yhdisteet voidaan lisätä soluviljelyelatusaineeseen tehokkaana pitoisuutena soluviljelmässä tahattomasti tai tietämättä mahdollisesti läsnä olevan retroviruksen odottamattoman tai ei-toivotun replikaation estämiseksi. Virus voi olla läsnä 10 soluviljelmässä alun perin, esimerkiksi HIV:tä tiedetään olevan läsnä ihmisen T-lymfosyyteissä kauan ennen kuin se on verestä todettavissa, tai virukselle altistumisen kautta. Tämä näiden yhdisteiden ja menetelmien käyttö estää tutkijan tai kliinikon tiedostamattoman tai tahattoman al-15 tistumisen mahdollisesti tappavalle retrovirukselle.
Edellä esitetty on ainoastaan keksintöä valaisevaa, eikä sen tarkoiteta rajoittavan keksintöä esitettyihin yhdisteisiin. Alan ammattimiehelle ilmeisten muunnelmien ja muutosten tarkoitetaan kuuluvan keksinnön piiriin 20 ja luonteeseen, jotka määritellään oheisissa patenttivaatimuksissa.
• i : Edellä esitetyn kuvauksen avulla alan ammattimies »« · • V pystyy helposti saamaan selville tämän keksinnön oleelli- iVi set ominaisuudet ja pystyy sen ajatuksesta ja piiristä ··· 25 poikkeamatta tekemään erilaisia muutoksia ja modifikaati- *·*· • »*♦ oita keksintöön sen soveltamiseksi erilaisiin käyttötar- M·
koituksiin ja olosuhteisiin. I
• · # • · • · · • · I • · ··· • · • · ··· • ·« ·*·
• I
• I • · * • · • ·

Claims (16)

118986 1.(a) Ensimmäisen retrovirusperäisen proteaasi-inhibiittorin tehokkaan määrän; ja 5 (b) toisen retrovirusperäisen proteaasi-inhibiit torin tehokkaan määrän käyttö lääkkeen valmistamiseen, joka on tarkoitettu retrovirusinfektioiden hoitamiseen, jolloin mainittu toinen retrovirusperäinen proteaasi-inhibiittori on tehokas ainakin yhtä sellaista retroviruskan-10 taa vastaan, joka on resistentti mainitulle ensimmäiselle retrovirusperäiselle proteaasi-inhibiittorille, ja jolloin mainittu ensimmäinen retrovirusperäinen proteaasi-inhibiittori on N-(2(R)-hydroksi-1(S)-indanyyli)-2(R)-fenyylimetyyli-4(S)-15 hydroksi-5-(1-(4-(3-pyridyylimetyyli)-2(s)-N'-(t-butyyli-karboksiamido)piperatsinyyli))pentaaniamidi; N-tert-butyylidekahydro-2-[2(R)-hydroksi-4-fenyyli-3(S)-[[N-(2-kinolyylikarbonyyli)-L-asparaginyyli]amino]butyy-li]-(4aR,8aS)-isokinoliini-3(S)-karboksiamidi; 20 (2S,3R,4S,5S)-2,5-bis-[N-[N-[[N-metyyli-N-(2-pyridinyyli- metyyli)amino]karbonyyli]valinyyli]amino]-3,4-dihydroksi- • · : 1,6-difenyyliheksaani; • (2S, 3S, 5S) -5- [N- [N- [N-metyyli-N- [ (2-isopropyyli-4-tiatso- SeS*: lyyli) metyyli] amino] karbonyyli] valinyyli] amino] -2- [N- [ (5- *·· 25 tiatsolyyli)metoksikarbonyyli] amino] -3-hydroksi-1,6-dife- ···· . nyyliheksaani; • * » [2R-hydroksi-3- [ [ (4-aminofenyyli) sulfonyyli] - (2-metyyli- • · · propyyli)amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]karbamiiniha-pon 3S-tetrahydrofuranyyliesteri; '.S 30 N-tert-butyylidekahydro-2- [2 (R) -hydroksi-4- (fenyylitio) - • t 3(S)-[[N-[(2-metyyli-3-hydroksifenyyli)karbonyyli]amino]-·;· butyyli] - (4aR, 8aS) - isokinoliini-3 (S) -karboksiamidi; [4R- (4a, 5a, 6S, 7S) ] -1,3-bis- [ (3-aminofenyyli)metyyli] heksa- • · · * , hydro-5,6-dihydroksi-4,7-bis(fenyylimetyyli)-2H-1,3- 3. diatsepin-2-oni; • · 118986 N-[2R-hydroksi-3-[[(1,3-bentsodioksol-5-yyli)sulfonyyli]- ! (2-metyylipropyyli)amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]-2S- ! [[(pyrrolidin-l-yyli)asetyyli]amino]-3,3-dimetyylibutaani-amidi ;
5 N-[2R-hydroksi-3-[(2-metyylipropyyli)-[(1,3-bentsodioksol- 5-yyli)sulfonyyli]amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]-2S-metyyli-3-(metyylisulfonyyli)propaaniamidi; [IS- [1R1 (R*) , 2S1] ] -N- [2-hydroksi-3- [N1- (2-metyylipropyy- ! li) -N1- (4-metoksifenyylisulfonyyli) amino] -1- (fenyylimetyy- i 1 10 li)propyyli]-2-metyyli-3-(metyylisulfonyyli)propaaniamidi; I 2S-[[(N-metyyliamino)asetyyli]amino]-N-[2R-hydroksi-3- [[(1,3-bentsodioksol-5-yyli)sulfonyyli]-(2-metyylipropyyli) amino] -IS-(fenyylimetyyli)propyyli]-3,3-dimetyylibutaa-! niamidi tai 15 (2R,3S)-3-(N-metyyliaminoasetyyli-L-tert-butyyliglysinyy- li)amino-l-(N-isoamyyli-N-(tert-butyylikarbamoyyli))amino- 4-fenyyli-2-butanoli.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, jossa mainitut ensimmäinen ja toinen inhibiittori annetaan niin, 20 että mainitussa nisäkkäässä on läsnä tehokas määrä molempia inhibiittoreita. • * : 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, jossa ·· · • mainittujen ensimmäisen ja toisen inhibiittorin antamista vuorotellaan, niin että mainitussa nisäkkäässä on läsnä • 1 ··· 25 kerrallaan tehokas määrä yhtä inhibiittoria. ···* . 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, jossa mainittu toinen retrovirusperäinen proteaasi-inhibiittori • · · on . , N-(2(R)-hydroksi-1(S)-indanyyli)-2(R)-fenyylimetyyli-4(S)- • · « *£1 30 hydroksi-5-(1-(4-(3-pyridyylimetyyli)-2(S)-N'-(t-butyyli- • · ’···* karboksiamido) piperatsinyyli) ) pentaaniamidi; ··· N-tert-butyylidekahydro-2- [2 (R) -hydroksi-4-fenyyli-3 (S) - ···» •***j [ [N- (2-kinolyylikarbonyyli) -L-asparaginyyli] amino] butyy- ··· * . li]-(4aR,8aS)-isokinoliini-3(S)-karboksiamidi; * · · 118986 i (2S,3R,4S,5S)-2,5-bis-[N-[N-[[N-metyyli-N-(2-pyridinyyli-metyyli)amino]karbonyyli]valinyyli]amino]-3,4-dihydroksi- 1,6-di fenyy1iheksaani; (2S,3S,5S)-5-[N-[N-[N-metyyli-N-[(2-isopropyyli-4-tiatso-5 lyyli)metyyli]amino]karbonyyli]valinyyli]amino]-2-[N-[(5-tiatsolyyli)metoksikarbonyyli]amino]-3-hydroksi-l,6-dife-nyyliheksaani; [2R-hydroksi-3-[[(4-aminofenyyli)sulfonyyli]-(2-metyyli-propyyli)amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]karbamiini-10 hapon 3S-tetrahydrofuranyyliesteri; N-tert-butyylidekahydro-2-[2(R)-hydroksi-4-(fenyylitio)-3(S)-[[N-[(2-metyyli-3-hydroksifenyyli)karbonyyli]amino]-butyyli]-(4aR,8aS)-isokinoliini-3(S)-karboksiamidi; [4R-(4a,5a,6β,7β)]—1,3 —bis —[(3-aminofenyyli)metyyli]heksa-15 hydro-5,6-dihydroksi-4,7-bis(fenyylimetyyli)-2H-1,3-diat- i sepin-2-oni; j N-[2R-hydroksi-3-[[(1,3-bentsodioksol-5-yyli)sulfonyyli]- | (2-metyylipropyyli)amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]-2S-[[(pyrrolidin-1-yyli)asetyyli]amino]-3,3-dimetyylibutaani-2 0 amidi; N-[2R-hydroksi-3-[(2-metyylipropyyli)-[(1,3-bentsodioksol- • · ·,· j 5-yyli) sulfonyyli] amino] -IS- (fenyylimetyyli)propyyli] -2S- :*·*: metyyli-3- (metyylisulfonyyli)propaaniamidi; • *;’j [IS- [1R* (R*) , 2S*] ] -N- [2-hydroksi-3- [N1- (2-metyylipropyy- • · .:. 25 li)-N1-(4-metoksifenyylisulfonyyli) amino]-1-(fenyylimetyy- I » * · . li)propyyli]-2-metyyli-3-(metyylisulfonyyli)propaaniamidi; * · · 2S-[[ (N-metyyliamino) asetyyli] amino]-N-[2R-hydroksi-3- * * * * [[(1,3-bentsodioksol-5-yyli)sulfonyyli]-(2-metyylipropyy- , # li)amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]-3,3-dimetyylibutaa- '·*·* 30 niamidi tai • · · ·...* (2R, 3S) -3- (N-metyyliaminoasetyyli-L-tert-butyyliglysinyy- ... li)amino-1-(N-isoamyyli-N-(tert-butyylikarbamoyyli)) amino- ···· .··*. 4-f enyyli - 2-butanoli . ··· • 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, jossa * * 35 mainittu ensimmäinen retrovirusperäinen proteaasi-inhi- ’·**· biittori on 59 1 1 8986 N-(2(R)-hydroksi-i(S)-indanyyli)-2(R)-fenyylimetyyli-4(S)-hydroksi-5-(1-(4-(3-pyridyylimetyyli)-2(S)-N'-(t-butyyli-karboksiamido)piperatsinyyli))pentaaniamidi; N-tert-butyylidekahydro-2-[2(R)-hydroksi-4-fenyyli-3(S)-5 [[N-(2-kinolyylikarbonyyli)-L-asparaginyyli]amino]butyy- li] -(4aR,8aS)-isokinoliini-3(S)-karboksiamidi; (2S,3R,4S,5S)-2,5-bis-[N-[N-[[N-metyyli-N-(2-pyridinyyli-metyyli)amino]karbonyyli]valinyyli]amino]-3,4-dihydroksi- ! 1,6-difenyyliheksaani,- 10 (2S,3S,5S)-5-[N-[N-[N-metyyli-N-[(2-isopropyyli-4-tiatso- lyyli)metyyli]amino]karbonyyli]valinyyli]amino]-2-[N-[(5-tiatsolyyli)metoksikarbonyyli]amino]-3-hydroksi-l,6-dife-nyyliheksaani; [2R-hydroksi-3-[[(4-aminofenyyli)sulfonyyli]-(2-metyyli-15 propyyli)amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]karbamiini-hapon 3S-tetrahydrofuranyyliesteri; N-tert-butyylidekahydro-2-[2(R)-hydroksi-4-(fenyylitio)-3(S)-[[N-[(2-metyyli-3-hydroksifenyyli)karbonyyli]amino]-butyyli]-(4aR,8aS)-isokinoliini-3(S)-karboksiamidi; 20 [4R-(4a,5a,6£,7fi)]-1,3-bis-[(3-aminofenyyli)metyyli]heksa- hydro-5,6-dihydroksi-4,7-bis(fenyylimetyyli)-2H-1,3- • m ;.· · diatsepin-2-oni; [**]: N- [2R-hydroksi-3- [ [ (1,3-bentsodioksol-5-yyli) sulfonyyli] - :Y: (2-metyylipropyyli)amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]-2S- • · •j. 25 [ [ (pyrrolidin-l-yyli) asetyyli] amino]-3,3-dimetyylibutaani- ···· . amidi; • t · ,···. N- [2R-hydroksi-3- [(2-metyylipropyyli) - [ (1,3-bentsodioksol- • ® · 5-yyli)sulfonyyli]amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]-2S- . . metyyli-3-(metyylisulfonyyli)propaaniamidi; *l!l* 30 [IS- [1R* (R*) , 2S*] ] -N- [2-hydroksi-3-[N1- (2-metyylipropyy- *·..* li)-N - (4-metoksifenyylisulfonyyli) amino]-1-(fenyylime- ··· tyyli)propyyli] -2-metyyli-3- (metyylisulfonyyli)propaani- ···· .·**. amidi tai • · (2R,3S)-3-(N-metyyliaminoasetyyli-L-tert-butyyliglysi-35 nyyli)amino-1-(N-isoamyyli-N-(tert-butyylikarbamoyyli))- · 118986 1 amino-4-fenyyli-2-butanoli ja mainittu toinen retrovirus-peräinen proteaasi-inhibiittori on 2S-[[(N-metyyliamino)asetyyli]amino]-N-[2R-hydroksi-3-[[(1,3-bentsodioksol-5-yyli)sulfonyyli]-(2-metyylipro-5 pyyli)amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]-3,3-dimetyylibutaaniamidi.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, jossa mainittu ensimmäinen retrovirusperäinen proteaasi-inhibiittori on
10 N-(2(R)-hydroksi-1(S)-indanyyli)-2(R)-fenyylimetyyli-4(S)-hydroksi-5-(1-(4-(3-pyridyylimetyyli)-2(S)-N'-(t-butyyli-karboksiamido)piperatsinyyli))pentaaniamidi ja mainittu toinen retrovirusperäinen proteaasi-inhibiittori on (2R,3S)-3-(N-metyyliaminoasetyyli-L-tert-butyyliglysinyy-15 li)amino-1-(N-isoamyyli-N-(tert-butyylikarbamoyyli))amino-4 - f enyyl i - 2 - butanol i N-[2R-hydroksi-3-[(2-metyylipropyyli)-[(1,3-bentsodioksol- 5-yyli)sulfonyyli]amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]-2S-metyyli-3-(metyylisulfonyyli)propaaniamidi; 20 [IS- [1R* (R*) ,2S*] ] -N- [2-hydroksi-3- [N1- (2-metyylipropyyli) -N1-(4-metoksifenyylisulfonyyli)amino]-1-(fenyylimetyyli)- • · :.· · propyyli]-2-metyyli-3-(metyylisulfonyyli)propaaniamidi tai • 2S-[[(N-metyyliamino)asetyyli]amino]-N-[2R-hydroksi-3- [ [ (1,3-bentsodioksol-5-yyli) sulfonyyli] - (2-metyylipropyy- .·· 25 li) amino]-IS-(fenyylimetyyli) propyyli]-3,3-dimetyylibutaa- ···· . niamidi, • · · ,···, 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, jossa • · · mainittu ensimmäinen retrovirusperäinen proteaasi-inhi-, , biittori on *·[·* 30 (2S, 3S, 5S) -5- [N- [N- [N-metyyli-N- [ (2-isopropyyli-4-tiatso- • · *·..* lyyli) metyyli] amino] karbonyyli] valinyyli] amino] -2- [N- [(5- ··· tiatsolyyli)metoksikarbonyyli] amino] -3-hydroksi-1,6-dife- ··«« .·**. nyyliheksaani ja mainittu toinen retrovirusperäinen prote- • * · • aasi-inhibiittori on i · • t j 1 1 8986 '' (2R,3S)-3-(N-metyyliaminoasetyyli-L-tert-butyyliglysinyy-li)amino-1-(N-isoamyyli-N-(tert-butyylikarbamoyyli))amino- 4-fenyy1i-2-butanoii; N-[2R-hydroksi-3-[[(1,3-bentsodioksol-5-yyli)sulfonyyli]-5 (2-metyylipropyyli)amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]-2S-[[(pyrrolidin-l-yyli)asetyyli]amino]-3,3-dimetyylibutaani-amidi tai 2S-[[(N-metyyliamino)asetyyli]amino]-N-[2R-hydroksi-3-[[(1,3-bentsodioksol-5-yyli)sulfonyyli]-(2-metyylipropyy-10 li)amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]-3,3-dimetyylibutaa-niamidi.
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, jossa käytetään kolmatta retrovirusperäistä proteaasi-inhibiittoria, jolloin mainittu kolmas retrovirusperäinen proteaa- 15 si-inhibiittori on tehokas ainakin yhtä sekä ensimmäiselle että toiselle retrovirusperäiselle proteaasi-inhibiittorille resistenttiä viruskantaa vastaan.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen käyttö, jossa mainittu kolmas retrovirusperäinen proteaasi-inhibiittori 20 on N-(2(R)-hydroksi-1(S)-indanyyli)-2(R)-fenyylimetyyli-4(S)- • · ; hydroksi-5- (1- (4- (3-pyridyylimetyyli) -2 (S) -N' - (t-butyyli- ·* * ; karboksiamido)piperatsinyyli))pentaaniamidi; :*:*: N-tert-butyylidekahydro-2- [2 (R) -hydroksi-4-fenyyli-3 (S) - •ί. 25 [ [N-(2-kinolyylikarbonyyli)-L-asparaginyyli] amino] butyy- ···· , .·. li] - (4aR,8aS) -isokinoliini-3 (S) -karboksiamidi; * · · (2S, 3R, 4S, 5S) -2,5-bis- [N- [N- [ [N-metyyli-N- (2-pyridinyyli- • · · metyyli)amino] karbonyyli]valinyyli]amino]-3,4-dihydroksi- 1,6-difenyyliheksaani; *·]·* 30 (2S, 3S, 5S) -5- [N- [N- [N-metyyli-N- [ (2-isopropyyli-4-tiatso- • · *...* lyyli) metyyli] amino] karbonyyli] valinyyli] amino] -2- [N- [ (5- ··· tiatsolyyli)metoksikarbonyyli] amino] -3-hydroksi-1,6- ··· · .···. difenyyliheksaani; ·*φ [2R-hydroksi-3- [ [ (4-aminofenyyli) sulfonyyli] - (2-metyyli- * * 35 propyyli)amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]karbamiini- « ***** hapon 3S-tetrahydrofuranyyliesteri; 118986 N-tert-butyylidekahydro-2-[2(R)-hydroksi-4-(fenyylitio)-3(S)-[[N-[(2-metyyli~3-hydroksifenyyli)karbonyyli]amino]-butyyli]-(4aR,8aS)-isokinoliini-3(S)-karboksiamidi; [4R-(4a,5a,6β,7β)]-1,3-bis-[(3-aminofenyyli)metyyli]heksa-5 hydro-5,6-dihydroksi-4,7-bis(fenyylimetyyli)-2H-1,3-diatsepin-2-oni; N-[2R-hydroksi-3-[[(1,3-bentsodioksol-5-yyli)sulfonyyli]-(2-metyylipropyyli)amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]-2S-11(pyrrolidin-1-yyli)asetyyli]amino]-3,3-dimetyylibutaani-10 amidi; N-[2R-hydroksi-3-[(2-metyylipropyyli)-[(1,3-bentsodioksol- 5-yyli)sulfonyyli]amino]-IS-(fenyylimetyyli)propyyli]-2S-metyy1i-3- (metyy1i sulfonyy1i)propaaniamidi; [IS- [1R1 (R1) ,2S1] ] -N- [2-hydroksi-3- [N1- (2-metyylipropyy-15 li) -N1-(4-metoksifenyylisulfonyyli)amino]-1-(fenyylimetyyli) propyyli] -2-metyyli-3-(metyylisulfonyyli)propaaniamidi; 2S-[[(N-metyyliamino)asetyyli]amino]-N-[2R-hydroksi-3-[[(1,3-bentsodioksol-5-yyli)sulfonyyli]-(2-metyylipropyyli) amino] -IS-(fenyylimetyyli)propyyli]-3,3-dimetyylibutaa-20 niamidi tai (2R,3S)-3-(N-metyyliaminoasetyyli-L-tert-butyyliglysinyy- · : li)amino-l- (N-isoamyyli-N- (tert-butyylikarbamoyyli)) amino- ·# · • 4-fenyyli-2-butanoli. :V: 10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, jossa •;· 25 ainakin yksi mainitulle ensimmäiselle retrovirusperäiselle ··· proteaasi-inhibiittorille resistentti viruskanta ja aina- · · kin yksi mainitulle toiselle retrovirusperäiselle proteaa- 118986
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen käyttö, jossa mainittu virusten vastainen aine on nukleosidoanalogi, ei-nukleosidikäänteiskopioijaentsyymi-inhibiittori, tat-anta-gonisti tai glykosidaasi-inhibiittori.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen käyttö, jossa mainittu nukleosidianalogi on AZT, DDI, DDC, 3TC, D4T tai PMEA ja mainittu glykosidaasi-inhibiittori on kastanosper-miini tai N-butyyli-l-deoksinojirimysiini.
14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, jossa 10 mainittu nisäkäs on ihminen, apina tai kissa.
15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa mainittu retrovirus on HIV tai HTLV.
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, jossa mainittu retrovirus on HIV-1 tai HIV-2. 15 • · • ♦ ♦ • « « ·· · ·· • · · • · • · • · • · · * · · * * ··« »M* • · · • · 4 ··· • · · • · · » • · · • · · • * ·«· • · • · ··· • ** ··· • · • · • · · • · * * 118986 Fatentkrav
FI964835A 1994-06-03 1996-12-03 Retrovirusperäisten proteaasi-inhibiittoreiden yhdistelmiä FI118986B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25363894A 1994-06-03 1994-06-03
US25363894 1994-06-03
PCT/US1995/006673 WO1995033464A2 (en) 1994-06-03 1995-06-02 Retroviral protease inhibitor combinations
US9506673 1995-06-02

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI964835A0 FI964835A0 (fi) 1996-12-03
FI964835A FI964835A (fi) 1997-01-29
FI118986B true FI118986B (fi) 2008-06-13

Family

ID=22961095

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI964835A FI118986B (fi) 1994-06-03 1996-12-03 Retrovirusperäisten proteaasi-inhibiittoreiden yhdistelmiä
FI20085256A FI20085256A (fi) 1994-06-03 2008-03-28 Retrovirusperäisten proteaasi-inhibiittoreiden yhdistelmä

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20085256A FI20085256A (fi) 1994-06-03 2008-03-28 Retrovirusperäisten proteaasi-inhibiittoreiden yhdistelmä

Country Status (22)

Country Link
US (1) US6100277A (fi)
EP (2) EP0762880B1 (fi)
JP (2) JP3896159B2 (fi)
KR (1) KR100386754B1 (fi)
CN (1) CN1290500C (fi)
AT (1) ATE307581T1 (fi)
AU (1) AU696299B2 (fi)
BR (1) BR9507912A (fi)
CA (1) CA2191948A1 (fi)
CZ (1) CZ296149B6 (fi)
DE (1) DE69534549T2 (fi)
DK (1) DK0762880T3 (fi)
ES (1) ES2252742T3 (fi)
FI (2) FI118986B (fi)
HU (1) HUT76979A (fi)
MX (1) MX9700237A (fi)
NO (1) NO322963B1 (fi)
NZ (1) NZ287702A (fi)
PL (1) PL180070B1 (fi)
RU (1) RU2166317C2 (fi)
UA (1) UA49803C2 (fi)
WO (1) WO1995033464A2 (fi)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5610294A (en) * 1991-10-11 1997-03-11 The Du Pont Merck Pharmaceutical Company Substituted cyclic carbonyls and derivatives thereof useful as retroviral protease inhibitors
US7141609B2 (en) 1992-08-25 2006-11-28 G.D. Searle & Co. α- and β-amino acid hydroxyethylamino sulfonamides useful as retroviral protease inhibitors
ES2123065T3 (es) 1992-08-25 1999-01-01 Searle & Co Hidroxietilamino-sulfonamidas utiles como inhibidores de proteasas retroviricas.
US5723490A (en) * 1992-09-08 1998-03-03 Vertex Pharmaceuticals Incorporated THF-containing sulfonamide inhibitors of aspartyl protease
US5714518A (en) * 1993-01-15 1998-02-03 Agouron Pharmaceuticals HIV protease inhibitors and methods of making the same
US20030207813A1 (en) * 1996-12-09 2003-11-06 G.D. Searle Retroviral protease inhibitor combinations
US5756533A (en) * 1995-03-10 1998-05-26 G.D. Searle & Co. Amino acid hydroxyethylamino sulfonamide retroviral protease inhibitors
GB9503850D0 (en) * 1995-02-25 1995-04-19 Glaxo Group Ltd Medicaments
US5776971A (en) 1995-03-10 1998-07-07 G.D. Searle & Co. Heterocyclecarbonyl amino acid hydroxyethylamino sulfonamide retroviral protease inhibitors
US5985870A (en) * 1995-03-10 1999-11-16 G.D. Searle & Co. Sulfonylalkanoylamino hydroxyethylamino sulfonamide retroviral protease inhibitors
US6667307B2 (en) 1997-12-19 2003-12-23 G.D. Searle & Co. Sulfonylalkanoylamino hydroxyethylamino sulfonamide retroviral protease inhibitors
US7339078B2 (en) 1995-03-10 2008-03-04 G.D. Searle Llc Bis-amino acid hydroxyethylamino sulfonamide retroviral protease inhibitors
US6143788A (en) * 1995-03-10 2000-11-07 G.D. Searle & Co. Bis-amino acid hydroxyethlamino sulfonamide retroviral protease inhibitors
US6150556A (en) * 1995-03-10 2000-11-21 G. D. Dearle & Co. Bis-amino acid hydroxyethylamino sulfonamide retroviral protease inhibitors
US6861539B1 (en) 1995-03-10 2005-03-01 G. D. Searle & Co. Bis-amino acid hydroxyethylamino sulfonamide retroviral protease inhibitors
RU2174519C2 (ru) 1995-03-10 2001-10-10 Джи. Ди. Сирл Энд Ко. Гидроксиэтиламино сульфонамиды гетероциклокарбонил аминокислоты, ингибирующие ретровирусную протеазу
US6407134B1 (en) 1995-03-10 2002-06-18 G. D. Searle & Co. Heterocyclecarbonyl amino acid hydroxyethylamino sulfonamide retroviral protease inhibitors
US6169085B1 (en) 1995-03-10 2001-01-02 G. D. Searle & Company Sulfonylalkanoylamino hydroxyethylamino sulfonamide retroviral protease inhibitors
US5705500A (en) * 1995-03-10 1998-01-06 G.D. Searle & Co. Sulfonylalkanoylamino hydroxyethylamino sulfonamide retroviral protease inhibitors
EP1188766A1 (en) 1995-03-10 2002-03-20 G.D. Searle & Co. Bis-amino acid hydroxyethylamino sulfonamide retroviral protease inhibitors
US5691372A (en) * 1995-04-19 1997-11-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Oxygenated-Heterocycle containing sulfonamide inhibitors of aspartyl protease
AU759386B2 (en) * 1995-06-29 2003-04-10 Abbvie Inc. Use of Ritonavir (ABT-538) for improving the pharmacokinetics of drugs metabolized by cytochrome P450 in a method of treating AIDS
US6037157A (en) * 1995-06-29 2000-03-14 Abbott Laboratories Method for improving pharmacokinetics
WO1997018205A1 (en) * 1995-11-15 1997-05-22 G.D. Searle & Co. Substituted sulfonylalkanoylamino hydroxyethylamino sulfonamide retroviral protease inhibitors
ATE230267T1 (de) * 1996-06-25 2003-01-15 Glaxo Group Ltd Zusammensetzungen enthaltend vx478, zidovudine und 159u89 für die verwendung in der behandlung von hiv
NZ333099A (en) * 1996-06-25 2000-06-23 Glaxo Group Ltd synergistic combinations comprising 141W94, zidovudine and 3TC for use in the treatment of HIV
US6113920A (en) * 1996-10-31 2000-09-05 Glaxo Wellcome Inc. Pharmaceutical compositions
AU716760B2 (en) * 1996-11-08 2000-03-09 Japan Energy Corporation Aids therapeutic composition
US6045829A (en) * 1997-02-13 2000-04-04 Elan Pharma International Limited Nanocrystalline formulations of human immunodeficiency virus (HIV) protease inhibitors using cellulosic surface stabilizers
US6180634B1 (en) 1997-11-13 2001-01-30 Merck & Co., Inc. Combination therapy for the treatment of AIDS
WO1999067417A2 (en) 1998-06-23 1999-12-29 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Fitness assay and associated methods
EP1095022A1 (en) 1998-07-08 2001-05-02 G.D. Searle & Co. Retroviral protease inhibitors
GB9815567D0 (en) * 1998-07-18 1998-09-16 Glaxo Group Ltd Antiviral compound
US20010042866A1 (en) * 1999-02-05 2001-11-22 Carrie Carter Coman Inxalygazn optical emitters fabricated via substrate removal
OA12053A (en) * 1999-10-06 2006-05-02 Tibotec Pharm Ltd HexahydrofuroÄ2,3-bÜfuran-3-yl-N-ä3-Ä(1,3-benzodioxol-5-ylsulfonyl)(isobutyl)aminoÜ-1-benzyl-2-hydroxypropylücarbamate as retroviral protease inhibitor.
US6617310B2 (en) 2000-07-19 2003-09-09 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Phosphate esters of bis-amino acid sulfonamides containing substituted benzyl amines
US6696488B2 (en) 2000-08-11 2004-02-24 The Brigham And Women's Hospital, Inc. (Hydroxyethyl)ureas as inhibitors of alzheimer's β-amyloid production
US7157489B2 (en) 2002-03-12 2007-01-02 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois HIV protease inhibitors
US20030180279A1 (en) * 2002-03-19 2003-09-25 Tibor Sipos Composition and method to prevent or reduce diarrhea and steatorrhea in HIV patients
US20040197321A1 (en) * 2002-03-19 2004-10-07 Tibor Sipos Composition and method to prevent or reduce diarrhea and steatorrhea in HIV patients
US8193227B2 (en) 2003-12-11 2012-06-05 Abbott Laboratories HIV protease inhibiting compounds
US20050131042A1 (en) * 2003-12-11 2005-06-16 Flentge Charles A. HIV protease inhibiting compounds
US20050148523A1 (en) * 2003-12-15 2005-07-07 Colonno Richard J. Method of treating HIV infection in atazanavir-resistant patients using a combination of atazanavir and another protease inhibitor
US8173144B2 (en) * 2004-11-04 2012-05-08 L'oreal Administration of urea compounds for combating signs of cutaneous aging
EP2049506B2 (en) * 2006-07-07 2024-05-08 Gilead Sciences, Inc. Modulators of pharmacokinetic properties of therapeutics
EP2178512B1 (en) * 2007-06-22 2011-03-09 Bristol-Myers Squibb Company Tableted compositions containing atazanavir
SI2178513T1 (sl) * 2007-06-22 2011-05-31 Bristol Myers Squibb Co Tabletni sestavki vsebujoäśi atazanavir
PT2170292E (pt) * 2007-06-22 2014-03-06 Bristol Myers Squibb Holdings Ireland Composições de comprimido contendo atazanavir
DE602008005316D1 (de) * 2007-06-22 2011-04-14 Bristol Myers Squibb Co Tablettierte atazanavirhaltige zusammensetzungen
US20100021505A1 (en) * 2008-07-28 2010-01-28 Tibor Sipos Composition and method to prevent or reduce diarrhea and steatorrhea in HIV patients
EP2151450A1 (de) * 2008-07-29 2010-02-10 Sandoz AG Verfahren zur Aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten zyklischen Oligopeptiden
KR20170078868A (ko) 2010-01-27 2017-07-07 비이브 헬쓰케어 컴퍼니 항바이러스 치료
US10889411B2 (en) 2017-02-03 2021-01-12 Berry Plastics Corporation Container with lid and detachable lid collar

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5142056A (en) * 1989-05-23 1992-08-25 Abbott Laboratories Retroviral protease inhibiting compounds
US4652552A (en) * 1984-09-10 1987-03-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Tetrapeptide methyl ketone inhibitors of viral proteases
US4644055A (en) * 1984-12-17 1987-02-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for preparing specific inhibitors of virus-specified proteases
US4857511A (en) * 1985-09-17 1989-08-15 Burroughs Wellcome Co. Treatment of human viral infections
US5458889A (en) * 1986-05-22 1995-10-17 Atlantic Pharmaceutical Products Limited Methods and compositions for inhibiting or destroying viruses or retroviruses
USH1649H (en) * 1987-07-31 1997-05-06 Barrish; Joel C. HIV protease inhibitor combinations
DE3830825A1 (de) * 1987-09-15 1989-03-23 Sandoz Ag Hydrophile reninhemmer, ihre herstellung und verwendung
IL89900A0 (en) * 1988-04-12 1989-12-15 Merck & Co Inc Hiv protease inhibitors useful for the treatment of aids and pharmaceutical compositions containing them
IL90218A0 (en) * 1988-05-13 1989-12-15 Abbott Lab Retroviral protease inhibitors
US5122517A (en) * 1988-06-10 1992-06-16 Regents Of The University Of Minnesota Antiviral combination comprising nucleoside analogs
CA1340588C (en) * 1988-06-13 1999-06-08 Balraj Krishan Handa Amino acid derivatives
DE3912829A1 (de) * 1989-04-19 1990-10-25 Bayer Ag Verwendung von renininhibitorischen peptiden als mittel gegen retroviren
EP0558603B1 (en) * 1990-11-19 1998-08-26 Monsanto Company Retroviral protease inhibitors
US5413999A (en) * 1991-11-08 1995-05-09 Merck & Co., Inc. HIV protease inhibitors useful for the treatment of AIDS
DK0541168T3 (da) * 1991-11-08 1998-05-11 Merck & Co Inc HIV-proteaseinhibitorer, som er egnede til behandling af AIDS
EP0628035A4 (en) * 1992-02-26 1995-03-29 Smithkline Beecham Corp RETROVIRAL PROTEASE INHIBITORS.
US5559256A (en) * 1992-07-20 1996-09-24 E. R. Squibb & Sons, Inc. Aminediol protease inhibitors
AU669223B2 (en) * 1992-08-25 1996-05-30 G.D. Searle & Co. Sulfonylalkanoylamino hydroxyethylamino sulfonamides useful as retroviral protease inhibitors
IS2334B (is) * 1992-09-08 2008-02-15 Vertex Pharmaceuticals Inc., (A Massachusetts Corporation) Aspartyl próteasi hemjari af nýjum flokki súlfonamíða
US5484926A (en) * 1993-10-07 1996-01-16 Agouron Pharmaceuticals, Inc. HIV protease inhibitors
CN1090186C (zh) * 1993-03-31 2002-09-04 麦克公司 治疗aids药物组合物中的hiv蛋白酶抑制剂
US5504104A (en) * 1993-11-19 1996-04-02 Warner-Lambert Company Tricyclic pyrone derivatives as protease inhibitors and antiviral agents
US5476874A (en) * 1994-06-22 1995-12-19 Merck & Co., Inc. New HIV protease inhibitors
IL114808A (en) * 1994-08-11 1999-10-28 Merck & Co Inc Combinations of protease inhibitors for the treatment of hiv infection and aids
US6037157A (en) * 1995-06-29 2000-03-14 Abbott Laboratories Method for improving pharmacokinetics

Also Published As

Publication number Publication date
CN1290500C (zh) 2006-12-20
ES2252742T3 (es) 2006-05-16
CA2191948A1 (en) 1995-12-14
FI964835A0 (fi) 1996-12-03
FI964835A (fi) 1997-01-29
NZ287702A (en) 2000-06-23
CN1166786A (zh) 1997-12-03
EP0762880B1 (en) 2005-10-26
JP3896159B2 (ja) 2007-03-22
KR100386754B1 (ko) 2003-08-21
JP2007020576A (ja) 2007-02-01
MX9700237A (es) 1997-04-30
NO965136D0 (no) 1996-12-02
EP0762880A1 (en) 1997-03-19
CZ296149B6 (cs) 2006-01-11
RU2166317C2 (ru) 2001-05-10
NO965136L (no) 1997-01-20
DE69534549T2 (de) 2006-07-20
US6100277A (en) 2000-08-08
EP1649871A1 (en) 2006-04-26
BR9507912A (pt) 1997-08-12
DK0762880T3 (da) 2006-03-06
PL180070B1 (pl) 2000-12-29
WO1995033464A3 (en) 1996-01-04
FI20085256A (fi) 2008-03-28
PL317425A1 (en) 1997-04-14
HU9603328D0 (en) 1997-01-28
JPH10505324A (ja) 1998-05-26
UA49803C2 (uk) 2002-10-15
WO1995033464A2 (en) 1995-12-14
ATE307581T1 (de) 2005-11-15
CZ352596A3 (en) 1997-10-15
AU696299B2 (en) 1998-09-03
AU2651095A (en) 1996-01-04
NO322963B1 (no) 2006-12-18
HUT76979A (hu) 1998-01-28
DE69534549D1 (de) 2005-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI118986B (fi) Retrovirusperäisten proteaasi-inhibiittoreiden yhdistelmiä
RU2203658C2 (ru) Лечение поражения центральной нервной системы, вызванного вич, с помощью vx-478, изолированно либо в комбинации с azt или зтс
US6046228A (en) Anti-viral pharmaceutical compositions containing saturated 1,2-dithiaheterocyclic compounds and uses thereof
US6593362B2 (en) Non-peptidic cyclophilin binding compounds and their use
KR20000070543A (ko) Ａｉｄｓ를 치료하기 위한 의약으로서 단백질 분해효소 억제제및 역전사효소 억제제와 3중 조합으로 사용되는 퀴녹살린
HU229224B1 (en) 2-(substituted-amino)-benzothiazole sulfonamide compounds having broadspectrum hiv protease inhibitor activity and medicaments containing them
JPH08245392A (ja) Ａｉｄｓ及び／又はｈｉｖ感染症の処置のための薬剤としてのプロテアーゼ阻害剤と組み合わされたキノキサリン類の利用
Lambert et al. Synergistic drug interactions of an HIV-1 protease inhibitor with AZT in different in vitro models of HIV-1 infection
US20060240410A1 (en) Retroviral protease inhibitor combinations
KR20010032055A (ko) Ａｉｄｓ 치료를 위한 혼합물 치료방법
KR20010101478A (ko) Ｈｉｖ 프로테아제 억제제로서 ｎ-말단에 치환된 벤질기를갖는 비스-아미노산 술폰아미드
EA011946B1 (ru) Замещённый бензимидазолсульфонамид, ингибитор вич протеазы широкого спектра действия
EP2945930A1 (en) Novel ddp-iv inhibitors
KR0161140B1 (ko) 항 에이즈 효과를 갖는 비가역적 hiv 프로테아제 억제제, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 조성물
KR0161144B1 (ko) 항 에이즈 효과를 갖는 비가역적 hiv 프로테아제 억제제, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 조성물
CN101015695A (zh) 逆转录病毒蛋白酶抑制剂的联合
CZ20001752A3 (cs) Farmaceutické prostředky obsahující kombinaci pro léčbu AIDS
WO2006017369A2 (en) Use of a farnesyl transferase inhibitor in the treatment of viral infections
CA2302144A1 (en) Hydroxyphenyl derivatives with hiv integrase inhibitory properties
MXPA99007077A (en) Quinoxaline in triple combination with protease inhibitors and reverse transcriptase inhibitors as medicines for treating aids

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 118986

Country of ref document: FI