DE69534549T2 - Kombination von retroviralen Proteasehemmern - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Kombinationen retroviraler Protease-Inhibitoren, die bei der Verhütung der Replikation von Säuger-Retroviren wie HIV in vitro und in vivo wirksam sind, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung retroviraler Infektionen bei einem Säuger wie dem menschlichen Immundefizienz-Virus (HIV). Diese Erfindung betrifft insbesondere Protease-Inhibitor-Verbindungen, die in der Kombinationstherapie mit weiteren Protease-Inhibitor-verbindungen verwendet werden.
  • 2. Stand der verwandten Technik
  • Während des Replikationszyklus von Retroviren werden die Gag- und Gag-Pol-Gentranskriptionsprodukte zu Proteinen translatiert. Die Proteine werden anschließend von virus-kodierten Proteasen (oder Proteinasen) zu Proteinen prozessiert, um virale Enzyme und Strukturproteine des Viruskerns bereitzustellen. Am häufigsten werden die Gag-Precursor-Proteine zu Kernproteinen und die Pol-Precursor-Proteine zu Virusenzymen prozessiert, z. B. zur reversen Transkriptase und zur retroviralen Protease. Es ist gezeigt worden, dass die korrekte Prozessierung durch die retrovirale Protease zur Assembly retroviraler Virionen erforderlich ist. Es ist zum Beispiel gezeigt worden, dass Leserahmen-Mutationen in der Protease-Region des Pol-Gens von HIV die Prozessierung des Gag-Presursor-Proteins verhindern. Es ist ebenfalls durch stellenspezifische Mutagenese am Asparaginsäure-Rest in der aktiven Region des HIV-Proteins gezeigt worden, dass die Prozessierung des Gag-Precursor-Proteins verhindert wird. Deshalb sind Versuche zur Hemmung der viralen Replikation durch Hemmung der Wirkung retroviraler Proteasen durchgeführt worden.
  • Retrovirale Protease-Inhibition umfasst typischerweise ein Übergangsstadiummimetikum, durch das die retrovirale Protease einer mimetischen Verbindung exponiert wird, die (typischerweise in reversibler Weise) kompetitiv mit dem Enzym an die Gag- und Gag-Pol-Proteine bindet, um dadurch die spezifische Prozessierung der Strukturproteine und die Freisetzung der retroviralen Protease selbst zu hemmen. Auf diese Weise können die zur retroviralen Replikation erforderlichen Proteasen wirksam gehemmt werden.
  • Mehrere Klassen mimetischer Verbindungen sind vorgeschlagen worden, insbesondere zur Hemmung von Proteasen, wie zum Beispiel der Hemmung der HIV-Protease. Solche Mimetika beinhalten Hydroxyethylaminisostere, reduzierte Amidisostere und Nicht-Peptid-Isostere. Siehe zum Beispiel EP 0 346 847 , EP 0 342 541 , Roberts et al, „Rational Design of Peptid-Based Proteinase Inhibitors," Science 248, 358 (1990), Erickson et al, „Design Activity and 2,8 Å Crystal Structure of a C2 Symmetric Inhibitor Complexed to HIV-1 Protease," Science 249, 527 (1990) und S. Thaisrivongs, "Structure-Based Design of Non-Peptide HIV Protease Inhibitors," 35th Annual Buffalo Medicinal Chemistry Meeting, State University of New York at Buffalo, Buffalo, NY, May 22–25, 1994.
  • Ein Problem bei retroviralen Protease-Inhibitoren, wie den HIV-Protease-Inhibitoren, war die Entstehung von gegenüber dem Inhibitor resistenten Virusstämmen. Zum Beispiel ist der HIV-Protease-Inhibitor L-735 524 von Merck & Co. wirksam gegen HIV-Infektionen beim Menschen, aber es entwickelten sich später in Patienten gegen L-735 524 resistente HIV-Stämme (Waldbolz, The Wall Street Journal, 25. Februar 1994, Seite B3 und Condra et al., Nature, 569–571 (1995)). Weitere Beispiele sind in Vacca et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4096–4100 (1994), Ho et al., J. Virol. 68, 2016–2020 (1994) und Dardana et al., Biochem. 33, 2004–2010 (1994) zu finden.
  • Das europäische Patent 0 580 402 und die PCT-Patentanmeldung WO 94/14436 und WO 94/05639 offenbaren Kombinationen von zwei verschiedenen retroviralen Protease-Inhibitoren, die bei der Behandlung und/oder Verhinderung der HIV-Infektion nützlich sind. Diese Referenzen beschreiben jedoch nicht die Verwendung von spezifischen Kombinationen zweier retroviraler Protease-Inhibitoren, die wenig oder keine Kreuz-Resistenz gegenüber verschiedenen HIV-Stämmen bei der Behandlung retroviraler Infektionen, wie der HIV-Infektion zeigen, wobei der zweite retrovirale Protease-Inhibitor gegen mindestens einen retroviralen Stamm wirksam ist, der gegen den ersten retroviralen Protease-Inhibitor resistent ist.
  • Die PCT-Patentanmeldung WO 93/17003 beschreibt Dipeptid-Inhibitoren retroviraler Proteasen, die zur Behandlung von Erkrankungen nützlich sind, die in Verbindung mit durch Retroviren verursachten Infektionen stehen. Die Verwendung mehrerer Protease-Inhibitoren mit geringer oder keiner Kreuz-Resistenz in der Kombinationstherapie zur Verhinderung der Replikation von Säuger-Retroviren wird weder offenbart noch vorgeschlagen.
  • Die PCT-Anmeldung WO 94/04493 beschreibt als retrovirale Protease-Inhibitoren nützliche Sulfonylalkanoylaminohydroxyethylaminosulfonamide. Weitere retrovirale Protease-Inhibitoren gegen HIV sind dem Fachmann bekannt (s. zum Beispiel Archiv der Pharmazie, Band 326, Nr. 9, S. 574, Lang, M., HIV-1-Protease Inhibitoren: eine neue Waffe gegen AIDS). Die Referenzen offenbaren jedoch nicht die Verwendung einer bestimmten Kombination von zwei oder mehr retroviralen Protease-Inhibitoren, die ausgewählt wurden, um keine oder nur geringe Kreuz-Resistenz gegen verschiedene HIV-Stämme zu zeigen.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Kombinationen retroviraler Protease-Inhibitoren zur Herstellung eines bei der Verhütung der Replikation von Retroviren in vitro oder in vivo wirksamen Medikaments zur Behandlung retroviraler Infektionen bei einem Säuger, wie zum Beispiel die Infektion durch das humane Immundefizienz-Virus (HIV). Diese Erfindung betrifft insbesondere in der Kombinationstherapie mit anderen Protease-Inhibitoren-Verbindungen verwendete Protease-Inhibitor-Verbindungen. Weiterhin kann diese Kombination in Verbindung mit weiteren anti-vitalen Mittel verwendet werden.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die retrovirale Protease ist ein kritisches Enzym im retroviralen Replikationsprozess. Die Vermehrung eines Retrovirus wie zum Beispiel HIV kann durch Exponieren des Virus gegenüber einem Inhibitor der retroviralen Protease behindert werden. Bei andauerndem Exponieren des Retrovirus gegenüber dem Protease-Inhibitor kann jedoch eine Variante des Retrovirus selektiert werden, so dass sich ein neuer vorherrschender, gegenüber dem Protease-Inhibitor resistenter Stamm des Retrovirus herausbildet. Der neue vorherrschende Stamm des Retrovirus kann eine Protease herstellen, die nicht mehr länger inhibiert oder noch häufiger unzureichend inhibiert wird und er kann sich sogar in Gegenwart des Protease-Inhibitors außer bei wesentlicher Erhöhung der Inhibitorkonzentration frei vermehren. Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines retroviralen Protease-Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments zur Überwindung der Entwicklung von retroviralen, gegenüber einem retroviralen Protease-Inhibitor resistenten Stämmen bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung einer wirksamen Menge von mindestens zwei retroviralen Protease-Inhibitoren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung retroviraler Infektionen bereit, das einem Säuger, wie zum Beispiel einem Menschen, einem Affen, einer Katze oder dergleichen verabreicht wird. Die Verabreichung kann durch Co-Verabreichung von mindestens zwei retroviralen Protease-Inhibitoren erfolgen, d.h: Verabreichung von zwei oder mehr retroviralen Inhibitoren in der Weise, dass zu jeder Zeit eine wirksame Menge von mindestens zwei retroviralen Inhibitoren in dem Säuger vorhanden sind. Alternativ kann die Verabreichung durch aufeinander folgende oder alternierende Verabreichung mindestens zweier retroviraler Protease-Inhibitoren erfolgen, d.h. Verabreichung von zwei oder mehr retroviralen Protease-Inhibitoren, so dass zu jedem Zeitpunkt jeweils nur eine wirksame Menge eines Inhibitors in dem Säuger vorliegt. Mit einer geeigneten Auswahl der retroviralen Protease-Inhibitoren kann dieses Verfahren die Vermehrung des Virus sogar in Gegenwart von Stämmen wirksam kontrollieren, die gegen irgendeinen der Inhibitoren resistent sind.
  • Die retroviralen Protease-Inhibitoren werden auf der Grundlage des Profils des resistenten Stamms/der resistenten Stämme des Retrovirus ausgewählt, die sich in vivo und in vitro durch Exposition gegenüber dem Inhibitor in einer sich vermehrenden Kultur des Retrovirus herausbilden. Die retroviralen Protease-Inhibitoren werden hinsichtlich des Fehlens von Kreuz-Resistenz bezüglich mindestens eines resistenten retroviralen Stammes selektiert. Ein retroviraler Stamm wird als gegenüber zwei Protease-Inhibitoren kreuzresistent betrachtet, wenn er gegenüber beiden Inhibitoren resistent ist. Während eine gewisse Kreuzresistenz toleriert werden kann, sollte vorzugsweise bei den als Gruppe eingesetzten ausgewählten retroviralen Protease-Inhibitoren keine Kreuz-Resistenz bestehen. Damit würde eine Variante (oder eine mutierter Stamm) des Retrovirus, die als Ergebnis der Exposition gegenüber einem ersten retroviralen Protease-Inhibitor entstehen kann, immer noch durch einen zweiten retroviralen Protease-Inhibitor gehemmt oder die als Ergebnis der Exposition sowohl gegenüber einem ersten als auch gegenüber einem zweiten retroviralen Protease-Inhibitor entsteht, immer noch durch einen dritten oder einen vierten retroviralen Protease-Inhibitor gehemmt werden und so weiter.
  • Ein Vergleich der Kreuz-Resistenz-Profile zwischen verschiedenen Protease-Inhibitoren wird durchgeführt und es werden Verbindungen für die Kombinationstherapie ausgewählt, die vorzugsweise geringe oder keine Kreuz-Resistenz zeigen. Der Arzneimittelresistenz-Phänotypus kann unterteilt werden in keine Resistenz, geringgradige Resistenz (weniger als etwa 10fache Verschiebung bei EC50 oder EC90), mittelgradige Resistenz (etwa 10 bis etwa 100fache Verschiebung bei EC50 oder EC90) und hochgradige Resistenz (größer als 100fache Verschiebung bei EC50 und EC90). Es wird erwartet, dass die Arzneimittelresistenz korreliert mit einer reduzierten Wirkung auf die Virusbelastung des Patienten, wenn die in vivo erreichbaren Inhibitor-Konzentrationen eine reduzierte Proteasehemmwirkung auf das resistente Virus haben. Somit sind die stärker bevorzugten Kombinationen von Protease-Inhibitoren diejenigen, die minimale Kreuz-Resistenzprofile (d.h. vorzugsweise nicht mehr als mittelgradige Resistenz, stärker bevorzugt nicht mehr als geringgradige Resistenz und am meisten bevorzugt keine Resistenz) und maximale intrinsische Wirksamkeit gegen den Wild-Typ und/oder gegenüber einem anderen Inhibitor selektierte resistente Viren zeigen. Zum Beispiel sind die zur Verwendung in Kombination mit einer ersten Verbindung bevorzugten Verbindungen vorzugsweise gegen Virusstämme wirksam, die eine mittelgradige, insbesondere bevorzugt eine hochgradige Resistenz gegen die erste Verbindung aufweisen. Die Pharmakologie und Toxikologie eines jeden Inhibitors und jeder Kombination sind ebenfalls Faktoren bei der Auswahl von Inhibitoren für die Kombinationstherapie.
  • Mehr bevorzugt werden retrovirale Proteaseinhibitoren ausgewählt, wenn mindestens ein gegen einen ersten retroviralen Proteaseinhibitor resistenter Virusstamm und mindestens ein gegen einen zweiten retroviralen Proteaseinhibitor resistenter Virusstamm unterschiedliche Aminosäuresubstitutionen in der Peptidsequenz der Protease haben, die sich auf dieselbe Substratbindungsstelle der Protease auswirken und zu der beobachteten Inhibitorresistenz beitragen. Somit ist die Anzahl möglicher Aminosäuresubstitutionen begrenzt, die in derselben Region der Protease auftreten können. Dies ist insbesondere dann zutreffend, wenn die Region für die Aktivität, Wirksamkeit und/oder Stabilität des Enzyms kritisch ist.
  • Dieses Ereignis wurde in Bezug auf die hier genannten HIV-Protease-Inhibitoren aus den Beispielen 1 und 2 beobachtet. Retrovirale Resistenz gegen die Verbindung aus Beispiel 1 beruhte auf einer Punktmutation bei Aminosäure 88 der HIV-Protease (Substitution von Asparagin 88 gegen Asparaginsäure 88). Retrovirale Resistenz gegen die Verbindung aus Beispiel 2 beruhte auf einer Punktmutation bei Aminosäure 88 der HIV-Protease (Substitution von Asparagin 88 durch Serin 88). Einige Substitutionen bei Aminosäure 88 sind dafür bekannt, dass sie zum Verlust der Enzymaktivität führen (Loeb et al., Nature 340, 387–400 (1989). Somit reduziert die Verabreichung beider HIV-Protease-Inhibitoren aus den Beispielen 1 und 2 die Wahrscheinlichkeit einer weiteren erfolgreichen Herausbildung eines resistenten Virusstamms mit Kreuz-Resistenz gegen beide Inhibitoren wesentlich. Während 6 Behandlungswochen wurde keine Resistenz gegenüber beiden in Kombination verwendeten Inhibitoren im Vergleich zur Herausbildung eines resistenten Phänotyps gegen einen einzelnen Inhibitor im selben Zeitrahmen nachgewiesen. Zusätzlich zu Punktmutationen, die sich auf die Enzymaktivität auswirken, können andere Punktmutationen bei derselben Stammvariante auftreten, die keine wesentliche Auswirkung auf die Enzymaktivität und/oder die Resistenz haben.
  • Alternativ und insbesondere bevorzugt werden retrovirale Protease-Inhibitoren ausgewählt, wenn mindestens ein, gegen einen ersten retroviralen Protease-Inhibitor resistenter Virusstamm eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber den zweiten Protease-Inhibitor hat oder wenn mindestens ein, gegen einen zweiten retroviralen Protease-Inhibitor resistenter Virusstamm eine erhöhte Empfindlichkeit gegen den ersten Protease-Inhibitor hat.
  • Repräsentative retrovirale Protease-Inhibitoren, die zur Verwendung bei dem vorliegenden Verfahren geeignet sind, beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, die in US-Patenten 5 482 947 (eingereicht am 15. November 1993), 5 750 648 (eingereicht am 3. Juni 1994), 5 750 648 (eingereicht am 20. August 1993), 5 843 946 (eingereicht am 24. August 1993), 5 521 219 (eingereicht am 24. August 1993), 5 463 104 (eingereicht am 24. August 1993), 6 060 476 (eingereicht am 2. März 1994), 5 614 522 (eingereicht am 20. May 1992), 5 708 004 (eingereicht am 20. Mai 1992), 5 475 013 (eingereicht am 20. Mai 1992), 5 475 027 (eingereicht am 8. November 1993), 6 506 759 (eingereicht am 21. Mai 1992) und 5 514 801 (eingereicht am 29. Dezember 1992) und in den PCT-Patenten mit den internationalen Veröffentlichungsnummern WO 94/10134 (eingereicht am 29. Oktober 1993), WO 94/10133 (eingereicht am 29. Oktober 1993) und WO 94/10136 (eingereicht am 29. Oktober 1993) derselben Inhaber offenbarten und beschrieben. Zusätzliche retrovirale, zur Verwendung mit dem vorliegenden Verfahren geeignete Protease-Inhibitoren beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, die in dem US-Patent 5 157 041, EP 346 847 , US-Patent 5 717 097 (eingereicht am 15. Mai 1992), WO 93/09096, Tet. Lett. 35, 673-66 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4096–4100 (1994), Y. N. Wong et al., Biopharm & Drug Dispos. 15, 535–544 (1994), M.L. West und D.P. Fairlie, Trends Pharmacol. Sci. 16, 67–75 (1995) und S. Thaisrivongs, „HIV Protease Inhibitors", Ann. Reports Med. Che., Vol. 29, Kapitel 14, S. 133–144 (1994) (Academic Press, J. Bristol, Ed.,) offenbarten und beschriebenen.
  • Ohne dies weiter auszuführen wird angenommen, dass der Fachmann unter Verwendung der vorangegangenen Beschreibung die vorliegende Erfindung in ihrem weitesten Ausmaß anwenden kann. Die folgenden bevorzugten speziellen Ausführungsformen sollen keine erschöpfende Beschreibung aller möglichen Verbindungskombinationen, sondern einfach Beispiele für Arzneimittelkombinationen bereitstellen, von denen angenommen wird, dass sie wirksam sind. Ähnliche Tests dieser und weiterer Protease-Inhibitoren unter Verwendung viraler Isolate, ohne dass diese auf die unten aufgelisteten beschränkt sind, können helfen, geeignete Arzneimittelkombinationen zu identifizieren.
  • Beispiel 1
    Figure 00080001
  • [1S-[1R*(R*),2S*]]-N1-[3-[[[(1,1-Dimethylethyl)amino]carbonyl](2-methylpropyl)amino]-2-hydroxy-1-(phenylmethyl)propyl]-2-[(2-chinolinylcarbonyl)amino]butandiamid kann gemäß den in den US-Patenten 5 482 947 (eingereicht am 15. November 1993) und 5 872 298 (eingereicht am 23. November 1993) derselben Inhaber offenbarten Verfahren hergestellt werden.
  • Beispiel 2
    Figure 00090001
  • (2R,3S)-3-(N-Methylaminoacetyl-L-tert-butylglycinyl)amino-1-(N-isoamyl-N-(tert-butylcarbamoyl))amino-4-phenyl-2-butanol kann gemäß den in den US-Patenten 5 750 648 (eingereicht am 20. August 1993) und 5 872 298 (eingereicht am 23. November 1993) derselben Inhaber offenbarten Verfahren hergestellt werden.
  • Beispiel 3
    Figure 00090002
  • [2R-Hyroxy-3-[[(4-methoxyphenyl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]carbaminsäure-5-pyrimidylmethylester kann gemäß den in den US-Patenten 5 843 946 (eingereicht am 24. August 1993) und 5 872 298 (eingereicht am 23. November 1993) derselben Inhaber offenbarten Verfahren hergestellt werden.
  • Beispiel 4
    Figure 00100001
  • [1S-[1R*(R*),2S*]]-N-[2-Hydroxy-3-[N1-(2-methylpropyl)-N1-(4-methoxyphenylsulfonyl)amino]-1-(phenylmethyl)propyl]-2-methyl-3-(methylsulfonyl)propanamid kann gemäß den in den US-Patenten 5 521 219 (eingereicht am 24. August 1993) und 5 872 298 (eingereicht am 23. November 1993) derselben Inhaber offenbarten Verfahren hergestellt werden.
  • Beispiel 5
    Figure 00100002
  • N-(2(R)-Hydroxy-1-(S)-indanyl)-2(R)-phenylmethyl-4(S)-hydroxy-5-(1-(4-(3-pyridylmethyl)-2(S)-N'-(t-butylcarboxamido)piperazinyl))pentanamid (L-735 524) kann gemäß den in dem US-Patent 5 717 097 (eingereicht am 15. Mai 1992), in WO 93/09096, in Tet. Lett. 35, 673–676 (1994) und in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4096–4100 (1994) offenbarten Verfahren hergestellt werden.
  • Beispiel 6
    Figure 00110001
  • N-tert-Butyldecahydro-2-[2(R)-hydroxy-4-phenyl-3(S)-[[N-(2-chinolylcarbonyl)-L-asparaginyl]amino]butyl]-(4aR,8aS)-isochinolin-3(S)-carboxamid (Ro 31–8959) kann gemäß den in US-Patent 5 157 041 offenbarten Verfahren hergestellt werden.
  • Beispiel 7
    Figure 00110002
  • [1S-[1R*[R*],2S*]]-N1-[3-[[[(1,1-Dimethylethyl)amino]carbonyl](3-methylbutyl)amino]-2-hydroxy-1-(phenylmethyl)propyl] -2[(2-chinolinylcarbonyl)amino]butandiamid kann gemäß den in den US-Patenten 5 482 947 (eingereicht am 15. November 1993) und 5 872 298 (eingereicht am 23. November 1993) derselben Inhaber offenbarten Verfahren hergestellt werden.
  • Beispiel 8
    Figure 00120001
  • N-[3-[N2-[N1-(1,1-Dimethylethyl)aminosulfonyl]-N2-(2-methylpropyl)amino]-2R-hydroxy-1S-(phenylmethyl)propyl]-2S-[(2-chinolinylcarbonyl)amino]butandiamid kann gemäß den in dem PCT-Patent mit der internationalen Veröffentlichungsnummer WO 94/10134 (eingereicht am 29. Oktober 1993) und dem US-Patent 5 872 298 (eingereicht am 23. November 1993) derselben Inhaber offenbarten Verfahren hergestellt werden.
  • Beispiel 9
    Figure 00120002
  • (2S,3R,4S,5S)-2,5-Bis-[N-[N-[[N-Methyl-N-(2-pyridinylmethyl)amino]carbonyl]valinyl]amino]-3,4-dihydroxy-1,6-diphenylhexan (A-77003) kann gemäß den in J. Med. Chem 36, 320–330, (1993) offenbarten Verfahren hergestellt werden.
  • Beispiel 10
    Figure 00130001
  • (2S,3S,5S)-5-[N-[N-[N-Methyl-N-[(2-isopropyl-4-thiazolyl)methyl]amino]carbonyl]valinyl]amino]-2-[N-[(5-thiazolyl)methoxycarbonyl]amino]-3-hydroxy-1,6-diphenylhexan (A-84538, ABT-538) kann gemäß den in dem PCT-Patent mit der internationalen Veröffentlichungsnummer WO 94/14436 (eingereicht am 16: Dezember 1993) offenbarten Verfahren hergestellt werden.
  • Beispiel 11
    Figure 00130002
  • [2R-Hydroxy-3-[[(4-aminophenyl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]carbaminsäure-3S-tetrahydrofuranylester (VX-478) kann gemäß den in der PCT-Patentanmeldung mit der internationalen Veröffentlichungsnummer WO 94/05639 (eingereicht am 7. September 1993) offenbarten Verfahren hergestellt werden.
  • Beispiel 12
    Figure 00140001
  • N-tert-Butyldecahydro-2-[2(R)-hydroxy-4-(phenylthio)-3(S)-[[N-[(2-methyl-3-hydroxyphenyl)carbonyl]amino]butyl]-(4aR,8aS)-isochinolin-3(S)-carboxamid (AG-1343, AG-1350) kann gemäß den in Bioorg. & Med. Chem. Let. 5, 715–720, 5, 721–726 und 5, 727–732 (1995) offenbarten Verfahren hergestellt werden. Insbesondere kann der HOBT-aktive Ester von 3-Hydroxy-2-methylbenzoesäure (Bioorg. & Med. Chem. Let. 5, 727–732 (1995)) an N-tert-Butyldecahydro-2-[2(R)-hydroxy-4-(phenylthio)-3(S)-aminobutyl]-(4aR,8aS)-isochinolin-3(S)-carboxamid (Bioorg. & Med. Chem. Let. 5, 715–720, (1995)) gekoppelt werden.
  • Beispiel 13
    Figure 00140002
  • [4R-(4α,5α,6β,7β]-1,3-bis[(3-Aminophenyl)methyl]hexahydro-5,6-dihydroxy-4,7-bis(phenylmethyl)-2H-1,3-diazepin-2-on (DMP-450, XM-412) kann gemäß den in der PCT-Patentanmeldung WO 93/07128 offenbarten Verfahren hergestellt werden. Insbesondere werden 3-Nitrophenylmethylhalogenide wie zum Beispiel 3-Nitrophenylmethylchlorid oder -bromid mit dem Hydroxy-geschützten Derivat von [4R-(4α,5α,6β,7β)]-Hexahydro-5,6-dihydroxy-4,7-bis(phenylmethyl)-2H-1,3-diazepin-2-on umgesetzt, gefolgt von Entschützen der Hydroxy-Gruppen (s. WO 93/07128) und Reduktion der Hydroxy-Gruppen zu den Aminogruppen. Solche Reduktionen können unter Verwendung von dem Fachmann gut bekannten Standardverfahren erreicht werden.
  • Beispiel 14
    Figure 00150001
  • Herstellung von N-[2R-Hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-2S-[[pyrrolidin-1-yl)acetyl]amino]-3,3-dimethylbutanamid
  • Teil A: Herstellung von 1,3-Benzodioxol-5-sulfonylchlorid
  • Zu einer Lösung von 4,25 g wasserfreiem N,N-Dimethylformamid wurden bei 0°C unter Stickstoff 7,84 g Sulfurylchlorid gegeben, woraufhin sich ein Feststoff bildete. Nach Rühren während 15 min wurden 6,45 g 1,3-Benzodioxol zugegeben und die Mischung während 2 h auf 100°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt, in Eiswasser geschüttet, mit Methylenchlorid extrahiert, über Magnesiumchlorid getrocknet, filtriert und eingeengt, wodurch 7,32 g Rohmaterial als schwarzer Feststoff entstanden. Dieser wurde über Kieselgel unter Verwendung von 20% Methylenchlorid/Hexan chromatographisch gereinigt, wodurch 1,9 g (1,3-Benzodioxol-5-yl)sulfonylchlorid bereitgestellt wurden.
  • Alternativ wurde Schwefeltrioxid-DMF-Komplex (2778 g, 18,1 Mol) in einen mit einem mechanischen Rührer, einem Kühlkondensator, einem Wärmemantel und einem Druckausgleichstropftrichter ausgestatteten 22 l Rundkolben gegeben. Dichlorethan (4 l) wurde zugegeben und mit dem Rühren begonnen. 1,3-Benzodioxol (1905 g, 15,6 Mol) wurden dann über den Tropftrichter über einen Zeitraum von 5 min zugegeben. Die Temperatur wurde dann auf 75°C erhöht und während 22 h gehalten (NMR zeigte, dass die Reaktion nach 9 h abgeschlossen war). Das Reaktionsgemisch wurde auf 26°C abgekühlt und Oxalylchlorid (2290 g, 18,1 Mol) in einem solchen Ausmaß zugegeben (1,5 h), dass die Temperatur unter 40°C gehalten wurde. Die Reaktionsmischung wurde während 5 h auf 67°C erwärmt, gefolgt von Abkühlen auf 16°C in einem Eisbad. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser (5 l) in einem solchen Ausmaß abgeschreckt, dass die Temperatur unter 20°C gehalten wurde. Nachdem die Wasserzugabe vollständig war, wurde die Mischung während 10 min gerührt. Die Schichten wurden getrennt und die organische Phase zweimal mit Wasser gewaschen (5 l). Die organische Phase wurde mit Magnesiumsulfat (500 g) getrocknet und zum Entfernen des Trockenmittels filtriert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum bei 50°C entfernt. Die resultierende warme Lösung wurde zum Abkühlen stehengelassen, wobei sich ein Feststoff zu bilden begann. Nach einer Stunde wurde der Feststoff mit Hexan (400 ml) gewaschen, filtriert, und getrocknet, um das gewünschte Sulfonylchlorid (2823 g) bereitzustellen. Das mit Hexan gewaschene Material wurde eingeengt und der resultierende Feststoff mit 400 ml Hexan gewaschen, um zusätzliches Sulfonylchlorid (464 g) bereitzustellen. Die Gesamtausbeute war 3287 g (95,5% bezogen auf 1,3-Benzodioxol).
  • Teil B: Herstellung von 2S-[Bis(phenylmethyl)amino]-3-phenylpropanol
  • VERFAHREN 1: 2S-[Bis(phenylmethyl)amino]-3-phenylpropanol aus der DIBAL-Reduktion von N,N-Bis(phenylmethyl)-L-phenylalaninphenylmethylester
  • Schritt 1: Eine Lösung von L-Phenylalanin (50,0 g, 0,302 Mol), Natriumhydroxid (24,2 g, 0,605 Mol) und Kaliumcarbonat (83,6 g, 0,605 Mol) in Wasser (500 ml) wurde auf 97°C erwärmt. Benzylbromid (108,5 ml, 0,605 Mol) wurde dann langsam zugegeben (Zugabezeit – 25 min). Die Mischung wurde bei 97°C während 30 min unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Toluol (2 × 250 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und zu einem Öl eingeengt. N,N-Bis(phenylmethyl)-L-phenylalaninphenylmethylester kann über Säulenchromatographie gereinigt werden (Kieselgel, 15% Ethylacetat/Hexan). Üblicherweise ist das Produkt rein genug, um direkt im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung eingesetzt zu werden (EIMS: m/z 434 (M-1).
  • Schritt 2: Der benzylierte Phenylalaninphenylmethylester (0,302 Mol) aus der vorigen Reaktion wurde in Toluol (750 ml) gelöst und auf –55°C abgekühlt. Ein 1,5 M Lösung von DIBAL in Toluol (443,9 ml. 0,666 Mol) wurde in einem solchen Ausmaß zugegeben (Zugabezeit – 1 h), dass die Temperatur zwischen –55°C und –50°C gehalten wurde. Die Mischung wurde während 20 min unter Stickstoffatmosphäre gerührt und dann bei –55°C durch langsame Zugabe von Methanol (37 ml) abgeschreckt. Die kalte Lösung wurde dann in kalte (5°C) 1,5 n HCl-Lösung (1,8 l) geschüttet. Der präzipitierte Feststoff (etwa 138 g) wurde abfiltriert und mit Toluol gewaschen. Das feste Material wurde in einer Mischung aus Toluol (400 ml) und Wasser (100 ml) suspendiert. Die Mischung wurde auf 5°C abgekühlt, mit 2,5 n NaOH (186 ml) behandelt und dann bei Raumtemperatur gerührt, bis sich der Feststoff auflöste. Die Toluol-Phase wurde von der wässrigen Phase getrennt und mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und zu einem Volumen von 75 ml (89 g) eingeengt. Ethylacetat (25 ml) und Hexan (25 ml) wurden zu dem Rückstand gegeben, woraufhin das gewünschte Alkoholprodukt auszukristallisieren begann. Nach 30 min wurden zusätzliche 50 ml Hexan zugegeben, um weitere Kristallisation zu fördern. Der Feststoff wurde abfiltriert und mit 50 ml Hexan gewaschen, wodurch 34,9 g einer ersten Produkternte erhalten wurden. Ein zweite Produkternte (5,6 g) wurde durch erneute Filtration der Mutterlauge isoliert. Die beiden Ernten wurden vereinigt und aus Ethylacetat (20 ml) und Hexan (30 ml) umkristallisiert, wodurch 40 g 2S-[Bis(phenylmethyl]amino]-3-phenylpropanol, 40% Ausbeute von L-Phenylalanin. Analyse berechnet für C23H25ON: C 83,34, H 7,6, N 4,23. Gefunden: C 83,43, H 7,59, N 4,22.
  • VERFAHREN 2: Herstellung von βS-2-[Bis(phenylmethyl)amino]benzolpropanol durch N,N-Dibenzylierung von L-Phenylalaninol
  • L-Phenylalaninol (176,6 g, 1,168 Mol) wurde zu einer gerührten Lösung von Kaliumcarbonat (484,6 g, 3,506 Mol) in 710 ml Wasser gegeben. Die Mischung wurde auf 65°C unter einer Stickatmosphäre erwärmt. Eine Lösung aus Benzylbromid (400 g, 2,339 Mol) in 3A Ethanol wurde in einem solchen Ausmaß zugegeben, dass die Temperatur zwischen 60 bis 68°C gehalten wurde. Die zweiphasige Lösung wurde bei 65°C während 55 min gerührt und dann unter kräftigem Rühren zum Abkühlen auf 10°C stehengelassen. Das ölige Produkt verfestigte sich zu kleinen Körnchen. Das Produkt wurde mit 2,0 l Leitungswasser verdünnt und während 5 min gerührt, um die anorganischen Nebenprodukte aufzulösen. Das Produkt wurde durch Filtration unter reduziertem Druck isoliert und mit Wasser gewaschen, bis der pH 7 war. Das erhaltene Rohprodukt wurde aus 1,1 l Ethylacetat/Heptan (1:10) umkristallisiert. Das Produkt wurde durch Filtration (bei –8°C) isoliert, mit 1,6 l kaltem (–10°C) Ethylacetat/Heptan (1:10) gewaschen und luftgetrocknet, wodurch 339 g (88% Ausbeute) 2S-[Bis(phenylmethyl)amino]-3-phenylpropanol erhalten wurden, Smp = 71,5 bis 73,0°C.
  • Teil C: Herstellung von 2S-[Bis(phenylmehtyl)amino]-3-phenylpropanaldehyd
  • VERFAHREN 1: 2S[Bis(phenylmethyl)amino]-3-phenylpropanol (200 g, 0,604 Mol) wurden in Triethylamin aufgelöst (300 ml, 2,15 Mol). Die Mischung wurde auf 12°C abgekühlt und eine Lösung von Schwefeltrioxid/Pyridin-Komplex (380 g, 2,39 Mol) in DMSO (1,6 1) in einem solchen Ausmaß zugegeben, dass die Temperatur zwischen 8 bis 17°C gehalten wurde. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre während 1,5 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Eiswasser abgekühlt und mit 1,6 l kaltem Wasser (10 bis 15°C) während 45 min abgeschreckt. Die resultierende Lösung wurde mit Ethylacetat (2,0 l) extrahiert, mit 5% Zitronensäure (2,0 l) und Kochsalzlösung (2,2 l) gewaschen, über MgSO4 (280 g) getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und dann im Vakuum getrocknet, wodurch 198,8 g 2S-[Bis(phenylmethyl)amino]-3-phenylpropanaldehyd als blassgelbes Öl (99,9%) erhalten wurden. Das erhaltene Rohprodukt war rein genug, um direkt im nächsten Schritt ohne Reinigung verwendet zu werden.
  • VERFAHREN 2: Ein Lösung aus Oxalylchlorid (8,4 ml, 0,096 Mol) in Dichlormethan (240 ml) wurde auf –74°C abgekühlt. Eine Lösung von DMSO (12,0 ml, 0,155 Mol) in Dichlormethan (50 ml) wurde dann langsam in einem solchen Ausmaß zugegeben, dass die Temperatur bei –74°C gehalten wurde (Zugabezeit ~ 1,25 h). Die Mischung wurde während 5 min gerührt, gefolgt von der Zugabe einer Lösung von 2S-[Bis(phenylmethyl)amino]-3-phenylpropanol (0,074 Mol) in 100 ml Dichlormethan (Zugabezeit –20 min, Temp. –75°C bis –68°C). Die Lösung wurde bei –78°C während 35 min unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Triethylamin (41,2 ml, 0,295 Mol) wurde dann während 10 min zugegeben (Temp. –78°C bis –68°C), woraufhin das Ammoniumsalz präzipitierte. Die kalte Mischung wurde während 30 min gerührt und dann Wasser (225 ml) zugegeben. Die Dichlormethan-Phase wurde von der wässrigen Phase abgetrennt, mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat und Hexan verdünnt und dann zur weiteren Entfernung des Ammoniumsalzes filtriert. Das Filtrat wurde eingeengt, wodurch 2S-[Bis(phenylmethyl)amino]-3-phenylpropanaldehyd erhalten wurden. Der Aldehyd wurde im nächsten Schritt ohne Reinigung eingesetzt.
  • VERFAHREN 3: Zu einer Mischung aus 1,0 g (3,0 mMol) 2S-(Bis(phenylmethyl)amino]-3-phenylpropanol (0,531 g, 4,53 mMol) von N-Methylmorpholin, 2,27 g Molekularsieb (4A) und 9,1 ml Acetonitril wurden 53 mg (0,15 mMol) Tetrapropyl-ammoniumperruthenat (TPAP) gegeben. Die Mischung wurde während 40 min bei Raumtemperatur gerührt und unter reduziertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde in 15 ml Ethylacetat suspendiert und durch ein Kieselgelkissen filtriert. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck eingeengt, wodurch ein etwa 50% 2S-[Bis(phenylmethyl)amino]-3-phenylpropanaldehyd enthaltendes Produkt als blassgelbes Öl erhalten wurde.
  • VERFAHREN 4: Zu einer Lösung aus 1,0 g (3,02 mMol) 2S-[Bis(phenylmethyl)amino]-3-phenylpropanaldehyd in 9,0 ml Toluol wurden 4,69 mg (0,03 mMol) 2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinyloxy, freies Radikal (TEMPO), 0,32 g (3,11 mMol) Natriumbromid, 9,0 ml Ethylacetat und 1,5 ml Wasser gegeben. Die Mischung wurde auf 0°C abgekühlt und eine wässrige Lösung von 2,87 ml 5% Haushaltsbleiche enthaltend 0,735 g (8,75 mMol) Natriumbicarbonat und 8,53 ml Wasser wurde langsam während 25 min zugegeben. Die Mischung wurde bei 0°C während 60 min gerührt. Es erfolgten zwei weitere Zugaben (jeweils 1,44 ml) von Bleiche, gefolgt von Rühren während 10 min. Die wässrige Phase wurde zweimal mit 20 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit 4,0 ml einer 25 mg Kaliumiodid und Wasser (4,0 ml) enthaltenden Lösung, 20 ml 10% Natriumthiosulfatlösung und dann mit Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Lösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter reduziertem Druck eingeengt, wodurch 1,34 g eines eine kleine Menge des gewünschten Aldehyd-Produktes 2S-[Bis(phenylmethyl)amino]-3-phenylpropanaldehyd enthaltenden Rohöls erhalten wurde.
  • Teil D: Herstellung von N,N-Dibenzyl-3(S)-amino-1,2-(S)-epoxy-4-phenylbutan
  • VERFAHREN 1: Eine Lösung von 2S-[Bis(phenylmethyl)amino]-3-phenylpropanaldehyd (191,7 g, 0,58 Mol) und Chloriodmethan (56,4 ml, 0,77 Mol) in Tetrahydrofuran (1,8 l) wurde in einem Reaktor aus rostfreiem Stahl unter einer Stickstoffatmosphäre auf –30°C bis –35°C abgekühlt. Eine Lösung von n-Butyllithium in Hexan (1,6 M, 365 ml, 0,58 Mol) wurde dann in einem solchen Ausmaß zugegeben, dass die Temperatur unter –25°C gehalten wurde. Nach der Zugabe wurde die Mischung bei –30°C bis –35°C während 10 min gerührt. Weitere Zugaben von Reagenzien wurden in der folgenden Weise durchgeführt: (1) zusätzliches Chloriodmethan (17 ml) wurde zugegeben, gefolgt von n-Butyllithium (110 ml) bei < –25°C. Nach der Zugabe wurde die Mischung bei –30°C bis –35°C während 10 min gerührt. Dies wurde einmal wiederholt. (2) Zusätzliches Chloriodmethan (8,5 ml, 0,11 Mol) wurde zugegeben, gefolgt von n-Butyllithium (55 ml, 0,088 Mol) bei < –25°C. Nach der Zugabe wurde die Mischung bei –30°C bis –35°C während 10 min gerührt. Diese wurde 5mal wiederholt. (3) Zusätzliches Chloriodmethan (8,5 ml, 0,11 Mol) wurde zugegeben, gefolgt von n-Buthyllithium (37 ml, 0,059 Mol) bei < –25°C. Nach der Zugabe wurde die Mischung bei –30°C bis –35°C während 10 min gerührt. Dies wurde einmal wiederholt. Die externe Kühlung wurde beendet und die Mischung während 4 bis 16 h auf Raumtemperatur erwärmt, wenn Dünnschichtchromatographie (Kieselgel, 20% Ethylacetat/Hexan) zeigte, dass die Reaktion vollständig war. Die Reaktionsmischung wurde auf 10°C abgekühlt und mit 1452 g 16% Ammoniumchlorid-Lösung abgeschreckt, wobei die Temperatur unter 23°C gehalten wurde. Die Mischung wurde während 10 min gerührt und die organische und die wässrige Phase getrennt. Die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat (2 × 500 ml) extrahiert. Die Ethylacetat-Phase wurde mit der Tetrahydrofuran-Phase vereinigt. Die vereinigte Lösung wurde über Magnesiumsulfat (220 g) getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der braune Ölrückstand wurde bei 70°C im Vakuum (0,8 bar) während 1 h getrocknet, wodurch 222,8 g Rohmaterial erhalten wurden. Das Rohprodukt wird üblicherweise direkt ohne Reinigung im nächsten Schritt eingesetzt.
  • VERFAHREN 2: Eine Lösung des Rohaldehyds (0,074 Mol) und Chloriodmethan (7,0 ml, 0,096 Mol) in Tetrahydrofuran (285 ml) wurde unter Stickstoffatmosphäre auf –78°C abgekühlt. Eine 1,6 M Lösung n-Butyllithium in Hexan (25 ml, 0,040 Mol) wurde dann in einem solchen Ausmaß zugegeben, dass die Temperatur bei –75°C gehalten wurde. Nach der ersten Zugabe wurde zusätzliches Chloroidomethan (1,6 ml, 0,022 Mol) zugegeben, gefolgt von n-Butyllithium (23 ml, 0,037 Mol), wobei die Temperatur bei –75°C gehalten wurde. Die Mischung wurde während 15 min gerührt.
  • Jedes der Reagenzien Chloriodmethan (0,70 ml, 0,010 Mol) und n-Butyllithium (5 ml, 0,008 ml) wurde 4 weitere Male während 45 min bei –75°C zugegeben. Das Kühlbad wurde dann entfernt und die Lösung während 1,5 h auf 22°C erwärmt. Die Mischung wurde in 300 ml gesättigte, wässrige Ammoniumchlorid-Lösung gegossen. Die Tetrahydrofuran-Phase wurde entfernt. Die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat (1 × 300 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt, wodurch ein braunes Öl (27,4 g) erhalten wurde. Das Produkt konnte ohne Reinigung im nächsten Schritt eingesetzt werden.
  • VERFAHREN 3: Eine Lösung von 2S-Bis(phenylmethyl)amino]-3-phenylpropanaldehyd (178,84 g, 0,54 Mol) und Bromchlormethan (46 ml, 0,71 Mol) in Tetrahydrofuran (1,8 l) wurden auf –30 bis –35°C in einem Reaktor aus rostfreiem Stahl unter einer Stickstoffatmosphäre abgekühlt. Eine Lösung von n-Butyllithium in Hexan (1,6 M, 340 ml, 0,54 Mol) wurde dann in einem solchen Ausmaß zugegeben, dass die Temperatur unter –25°C gehalten wurde. Nach der Zugabe wurde die Mischung bei –30°C bis –35°C während 10 min gerührt. Weitere Zugaben von Reagenzien wurden in der folgenden Weise durchgeführt: (1) zusätzliches Bromchlormethan (14 ml) wurde zugegeben, gefolgt von n-Butyllithium (102 ml) bei < –25°C. Nach der Zugabe wurde die Mischung bei –30 bis –35°C während 10 min gerührt. Dies wurde einmal wiederholt. (2) Zusätzliches Bromchlormethan (7 ml, 0,11 Mol) wurde zugegeben, gefolgt von n-Butyllithium (51 ml, 0,082 Mol) bei < –25°C. Nach der Zugabe wurde die Mischung während 10 min bei –30 bis –35°C gerührt. (3) Zusätzliches Bromchlormethan (7 ml, 0,11 Mol) wurde zugegeben, gefolgt von n-Buthyllithium (51 ml, 0,082 Mol) bei < –25°C. Nach der Zugabe wurde die Mischung bei –30 bis –35°C während 10 min gerührt. Dies wurde einmal wiederholt. Die externe Kühlung wurde beendet und die Mischung während 4 bis 16 h auf Raumtemperatur erwärmt, wenn Dünnschichtchromatographie (Kieselgel, 20% Ethylacetat/Hexan) zeigte, dass die Reaktion vollständig war. Die Reaktionsmischung wurde auf 10°C abgekühlt und mit 1452 g 16% Ammoniumchlorid-Lösung abgeschreckt, wobei die Temperatur unter 23°C gehalten wurde. Die Mischung wurde während 10 min gerührt und die organische und die wässrige Phase getrennt. Die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat (2 × 500 ml) extrahiert. Die Ethylacetat-Phase wurde mit der Tetrahydrofuran-Phase vereinigt. Die vereinigte Lösung wurde über Magnesiumsulfat (220 g) getrocknet, filtriert und im Rotationsverdampfer bei 65°C eingeengt. Der braune Ölrückstand wurde bei 70°C im Vakuum (0,8 bar) während 1 h getrocknet, wodurch 222,8 g Rohmaterial erhalten wurden.
  • Teil E: Herstellung von N-[3(S)-[N,N-Bis(phenylmethyl)amino]-2(R)-hydroxy-4-phenylbutyl]-N-isobutylamin·Oxalsäuresalz
  • Schritt 1: Zu einer Lösung rohen N,N-Dibenzyl-3(S)-amino-1,2(S)-epoxy-4-phenylbutans (388,5 g, 1,13 Mol) in Isopropanol (2,7 l) (oder Ethylacetat) wurde Isobutylamin (1,7 kg, 23,1 Mol) während 2 min gegeben. Die Temperatur erhöhte sich von 25°C auf 30°C. Die Lösung wurde auf 82°C erwärmt und bei dieser Temperatur während 1,5 h gerührt. Die warme Lösung wurde im Vakuum eingeengt. Der braune Ölrückstand wurde im Vakuum (0,8 mm Hg) während 16 h getrocknet, wodurch 450 g des Produkts als rohes Öl erhalten wurden.
  • Schritt 2: Zu einer Lösung von Oxalsäure (8,08 g, 89,72 mMol) in Methanol (76 ml) wurde eine Lösung rohen 3(S)-[N,N-Bis(phenylmethyl)amino]-1-(2-methylpropyl)amino-4-phenylbutan-2(R)-ols in Ethylacetat (90 ml) während 15 min zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur während etwa 2 h gerührt. Der Feststoff wurde durch Filtration isoliert, mit Ethylacetat (2 × 20 ml) gewaschen und im Vakuum für etwa 1 h getrocknet, wodurch 21,86 g eines 97% diastereomer-reinen Salzes erhalten wurden.
    Smp: 174,99°C, Mikroanalyse: Berechnet: C 71,05%, H 7,50%, N 5,53 %. Gefunden: C 71,71 %, H 7,75%, N 5,39%.
  • Alternativ wurde rohes 3(S)-[N,N-Bis(phenylmethyl)amino]-1-(2-methylpropyl)amino-4-phenylbutan-2(R)-ol (5 g) in Methyl-tert-butylether (MTBE) (10 ml) gelöst und Oxalsäure (1 g) in Methanol (4 ml) zugegeben. Die Mischung wurde während 2 h gerührt. Der resultierende Feststoff wurde filtriert, mit kaltem MTBE gewaschen und getrocknet, wodurch 2,1 g eines weißen, etwa 98,9% diastereomer-reinen Feststoffs erhalten wurden (basierend auf den HPLC-Peakflächen).
  • Teil F: Herstellung von 1-[N-[(1,3-Benzodioxol-5-yl)sulfonyl]-N-(2-methylpropyl)amino]-3(S)-[N,N-bis(phenylmethyl)amino]-4-phenyl-2(R)-butanol
  • Zu N-[3(S)-[N,N-Bis(phenylmethyl)amino]-2(R)-hydroxy-4-phenylbutyl]-N-isobutylamin·Oxalsäuresalz (354,7 g, 0,7 Mol) in 1,4-Dioxan (2000 ml) wurde eine Lösung von Kaliumcarbonat (241,9 g, 1,75 Mol) in Wasser (250 ml) gegeben. Die Mischung wurde während 2 h bei Raumtemperatur gerührt, gefolgt von der Zugabe von 1,3-Benzodioxol-5-sulfonylchlorid (162,2 g, 0,735 Mol) in 1,4-Dioxan (250 ml) während 15 min. Die Reaktionsmischung wurde während 18 h bei Raumtemperatur gerührt. Ethylacetat (1000 ml) und Wasser (500 ml) wurden zugegeben und das Rühren für eine weitere Stunde fortgesetzt. Die wässrige Phase wurde abgetrennt und weiter mit Ethylacetat (200 ml) extrahiert. Die vereinigten Ethylacetat-Phasen wurden mit 25%iger Kochsalzlösung (500 ml) gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Filtrieren und Waschen des Magnesiumsulfats mit Ethylacetat (200 ml) wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, wodurch das gewünschte Sulfonamid als viskoses, gelbes, schaumiges Öl erhalten wurde (440,2 g, 105% Ausbeute). HPLC/MS (Elektrospray) (m/z 601 [M+H]+).
  • Alternativ wurden N-[3(S)-[N,N-Bis(phenylmethyl)amino]-2(R)-hydroxy-4-phenylbutyl]-N-isobutylamin·Oxalsäuresalz (2800 g, 5,53 Mol) und THF (4 l) in einen mit einem mechanischen Rührer ausgestatteten 22 l Rundkolben gegeben. Kaliumcarbonat (1921 g, 13,9 Mol) wurde in Wasser (2,8 l) gelöst und zu der THF-Aufschlämmung gegeben. Die Mischung wurde dann während 1 h gerührt. 1,3-Benzodioxol-5-sulfonylchlorid (1281 g, 5,8 Mol) wurden in THF (1,4 l) gelöst und während 25 min zu der Reaktionslösung gegeben. Zusätzliche 200 ml THF wurden verwendet, um den Zugabetrichter zu spülen. Die Reaktionsmischung wurde unter Rühren weitere 14 h stehengelassen und dann Wasser (4 l) zugegeben. Diese Mischung wurde während 30 min gerührt und dann zur Phasentrennung stehengelassen. Die Phasen wurde entfernt und die wässrige Phase zweimal mit THF (500 ml) gewaschen. Die vereinigten THF-Phasen wurden mit Magnesiumsulfat (500 g) während 1 h getrocknet. Diese Lösung wurde dann zur Entfernung des Trockenmittels filtriert und in den folgenden Reaktionen eingesetzt.
  • Teil G: Herstellung von 1-[N-[(1,3-Benzodioxol-5-yl)sulfonyl]-N-(2-methylpropyl)amino]-3(S)-amino-4-phenyl-2(R)-butanol·Methansulfonsäuresalz
  • Rohes 1-[N-[(1,3-Benzodioxol-5-yl)sulfonyl]-N-(2-methylpropyl)amino]-3(S)-[bis(phenylmethyl)amino]-4-phenyl-2(R)-butanol (6,2 g, 0,010 Mol) wurde in Methanol (40 ml) gelöst. Methansulfonsäure (0,969 g, 0,010 Mol) und Wasser (5 ml) wurden dann zu der Lösung gegeben. Die Mischung wurde in eine 20% Pd(OH)2 auf Kohlenstoff (255 mg, 50% Wassergehalt) enthaltende 500 ml Parr-Hydrierungsflasche eingebracht. Die Flasche wurde in die Hydrierungsvorrichtung eingebracht und mit 5mal Stickstoff und 5mal Wasserstoff gespült. Die Reaktion wurde zur Fortsetzung der Hydrierung bei 35°C mit 63 psi Wasserstoffdruck während 18 h stehengelassen. Zusätzlicher Katalysator (125 g) wurde zugegeben und die Hydrierung nach Spülen während weiterer 20 h fortgesetzt. Die Mischung wurde durch Celite filtriert, das mit Methanol (2 × 10 ml) gewaschen wurde. Etwa ein Drittel des Methanols wurde unter reduziertem Druck entfernt. Das verbleibende Methanol wurde durch azeotrope Destillation mit Toluol bei 80 Torr entfernt. Toluol wurde in 15, 10, 10 und 10 ml Portionen zugegeben. Das Produkt kristallisierte aus der Mischung aus, wurde filtriert und zweimal mit 10 ml Portionen Toluol gewaschen. Der Feststoff wurde bei Raumtemperatur bei 1 Torr während 6 h getrocknet, wodurch das Aminsalz erhalten wurde (4,5 g, 84%), m/z 421 [M+H]+.
  • Alternativ wurde Wasser (500 ml) zu einer THF-Lösung von rohem 1-[N-[(1,3-Benzodioxol-5-yl)sulfonyl]-N-(2-methylpropyl)amino]-3(S)-[bis(phenylmethyl)amino]-4-phenyl-(2R)-butanol gegeben, gefolgt von Methansulfonsäure (531 g, 5,5 Mol). Die Lösung wurde zur Sicherstellung der vollständigen Durchmischung gerührt und in einen Autoklaven von 5 Gallonen Fassungsvermögen gegeben. Pearlmans-Katalysator (200 g 20% Pd(OH)2 auf Kohlenstoff/50% Wasser) wurde mit Hilfe von THF (500 ml) in den Autoklaven gegeben. Im Reaktor wurde 4mal mit Stickstoff und 4mal mit Wasserstoff gespült. Der Reaktor wurde mit 60 psig Wasserstoff beladen und mit Rühren bei 450 rpm begonnen. Nach 16 h zeigte HPLC-Analyse, dass noch eine kleine Menge der Mono-Benzyl-Zwischenstufe vorhanden war. Zusätzlicher Katalysator (50 g) wurde zugegeben und die Reaktion über Nacht laufengelassen. Die Lösung wurde dann zum Entfernen des Katalysators durch Celite (500 g) filtriert und in fünf Portionen im Vakuum eingeengt. Zu jeder Portion wurde Toluol (500 ml) gegeben und zur Entfernung restlichen Wassers im Vakuum azeotrop entfernt. Der resultierende Feststoff wurde in drei Portionen aufgeteilt und jede mit Methyl-t-butylether (2 l) gewaschen und filtriert. Das restliche Lösungsmittel wurde bei Raumtemperatur im Vakuumofen bei weniger als 1 Torr entfernt, wodurch 2714 g des erwarteten Salzes erhalten wurden.
  • Teil H: Herstellung von N-[2R-Hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-2S-[(phenylmethoxycarbonyl)amino]-3,3-dimethylbutanamid
  • Zu einer Lösung aus 118,8 g (0,776 Mol) N-Hydroxybenzotriazol und 137,1 g (0,52 Mol) N-Carbobenzyloxycarbonyl-L-tert-leucin in 750 ml wasserfreim DMF wurden bei 0°C unter Stickstoffatmosphäre 109,1 g (0,57 Mol) EDC gegeben. Nach Rühren bei 0°C während 2 h wurde eine zuvor mit 228 ml (210 g, 2,08 Mol) 4-Methylmorpholin neutralisierte Lösung aus 273 g (0,53 Mol) 2R-Hydroxy-3-[[(1,3benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propylaminmethansulfonat in 250 ml wasserfreiem DMF zugegeben. Nach Rühren bei 0°C während 30 min wurde die Lösung während 18 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungsmittel wurden unter reduziertem Druck bei 45°C entfernt, 1,5 l Ethylacetat zugegeben, mit 5% Zitronensäure, gesättigtem Natriumbicarbonat und Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt, wodurch 400 g Rohmaterial erhalten wurden. Dieses wurde in 3 Ansätzen über eine Kieselgel-Prep-2000-Chromatogramm-Säule unter Verwendung von 20% bis 50% Ethylacetat/Hexan als Elutionslösung chromatographisch gereinigt, wodurch 320 g gereinigten Materials erhalten wurden. m/e = 674 (M+Li), 98% über HPLC.
  • Teil I: Herstellung von N-[2R-Hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-2S-amino-3,3-dimethylbutanamid
  • Eine Lösung aus 312 g N-[2R-Hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-2S-[(phenylmethoxycarbonyl)amino]-3,3-dimethylbutanamid in 1 l Tetrahydrofuran wurde in Gegenwart von 100 g 4% Palladium-auf-Kohlenstoff-Katalysator unter 60 psig Wasserstoff während 6 h bei Raumtemperatur hydriert. Der Katalysator wurde durch Filtration und die Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, wodurch 240 g der gewünschten Verbindung erhalten wurden.
  • Teil J: Herstellung von N-[2R-Hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-2S-[(chloracetyl)amino]-3,3-dimethylbutanamid
  • Zu einer Lösung aus 234,3 g (0,439 Mol) N-(2R-Hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yL)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-2S-amino-3,3-dimethylbutanamid in 1 l Methylenchlorid wurden 80 ml (59,5 g, 0,46 Mol) Diisopropylethylamin, gefolgt von langsamer Zugabe von 78,8 g (0,46 Mol) Chloressigsäureanhydrid bei Raumtemperatur gegeben, wobei die Temperatur unter 35°C gehalten wurde. Nach Rühren während einer weiteren Stunde zeigte die Analyse durch HPLC, dass ein kleiner Rest des Ausgangsmaterials noch vorhanden war und es wurden 1,5 g Chloressigsäureanhydrid zugegeben. Nach 10 min wurden die Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, 1 l Ethylacetat zugeben, mit 5% Zitronensäure, gesättigtem Natriumbicarbonat und Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt, wodurch 314 g Rohmaterial erhalten wurden. Dieses wurde in 3 Portionen über eine Kieselgel-Prep-2000-Chromatogram-Säule unter Verwendung von 20 bis 50% Ethylacetat/Hexan chromatographisch gereinigt, wodurch 165 g der gewünschten Verbindung erhalten wurden. m/e = 616, (M+Li), 98% durch HPLC.
  • Teil K: Herstellung von N-[2R-Hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethylpropyl]-2S-[[(pyrrolidin-1-yl)acetyl]amino]-3,3-dimethylbutanamid
  • Zu 164,2 g (0,27 Mol) N-[2R-Hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-2S-[(chloracetyl)amino]-3,3-dimethylbutanamid wurden 500 ml Tetrahydrofuran gegeben, das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, um alles Ethylacetat zu entfernen, und dann 350 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Zu dieser Lösung wurden bei 10°C 130 ml (1,56 Mol) Pyrrolidin gegeben. Nach 1 h wurden die Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, 1 l Ethylacetat zugegeben, mit gesättigtem Natriumbicarbonat und Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt, wodurch 185 g Rohmaterial erhalten wurden, für das eine HPLC-Untersuchung 98,9% Reinheit zeigte. Dieses wurde in 3 Portionen aufgeteilt und über eine Prep-2000-Chromatogram-Säule zuerst unter Verwendung von 50% Ethylacetat/Hexan, gefolgt von 5% Methanol/Ethylacetat chromatographisch gereinigt, wodurch 160 g gereinigtes Material (99% gemäß HPLC) erhalten wurden. Dieses wurde dann aus 460 ml Diethylether und 70 ml Hexan umkristallisiert, wodurch 121 g des gewünschten Produkts erhalten wurden (> 99% gemäß HPLC, m/e = 651 [M+Li], Smp = 112–114°C.
  • Beispiel 15
    Figure 00280001
  • Herstellung von N-[2R-Hydroxy-3-[(2-methylpropyl)[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl]amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-2S-methyl-3-(methylsulfonyl)propanamid
  • Teil A: Herstellung von 2(S)-Methyl-3-(methylsulfonyl)propionsäure
  • Schritt 1: Zu einer Lösung aus 200 g (1,23 Mol) D-(-)-3-Acetyl-β-mercaptoisobuttersäure in 1,0 l Methanol wurden 161,0 g (2,47 Mol) Kaliumhydroxid gelöst in 500 ml Methanol gegeben, wobei die Temperatur durch Kühlen mit einem Eisbad unter 10°C gehalten wurde. Nach Rühren für weitere 20 min wurden 117 ml (156 g, 1,23 Mol) Dimethylsulfat zugegeben, wobei die Temperatur unter 20°C gehalten wurde. Das Eisbad wurde entfernt und die Mischung für weitere 60 min gerührt. Die Salze wurden durch Filtration entfernt, die Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt und Ethylacetat zugegeben. Nach Abtrennung der wässrigen Phase wurde diese mit konzentrierter Salzsäure angesäuert, mit Ethylacetat extrahiert, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt, wodurch 164 g (99%) der gewünschten 2S-Methyl-3-(methylthio)propionsäure erhalten wurden, m/e = 133 (M – H).
  • Schritt 2: Zu einer im Eisbad auf 18°C gekühlten Lösung aus 10,0 g (74,6 mMol) 2S-Methyl-3-(methylthio)propionsäure in 150 ml Aceton und 30 ml Wasser wurden 161,8 g (263 mMol) Oxone gegeben. Nachdem etwa die Hälfte des Materials zugegeben worden war, stieg die Temperatur auf 24°C, die Zugabe wurde beendet, die Temperatur auf 18°C gesenkt und dann die Zugabe fortgesetzt. Nach Rühren bei 15 bis 20°C während 15 min wurde das Eisbad entfernt und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur während 1 h gerührt. Die Feststoffe wurden filtriert und mit Aceton gewaschen, das Filtrat auf etwa 40 ml eingeengt und der Rückstand in 200 ml Ethylacetat gelöst. Die Ethylacetat-Phase wurde mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt, wodurch 11,4 g eines Öls erhalten wurden. Dieses wurde in einem Minimum an Ethylacetat und Hexan gelöst, damit sich ein Präzipitat bilden sollte. Dieses wurde gesammelt, wodurch 6,95 g des gewünschten Produkts erhalten wurden, m/e = 167 (M + H).
  • Teil B: Herstellung von N-[2R-Hydroxy-3-[(2-methylpropyl)[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl]amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-2S-methyl-3-(methylsulfonyl)propanamid
  • Zu einer Lösung aus 5,0 g (30 mMol) 2S-Methyl-3-(methylsulfonyl)propionsäure und 6,90 g (45 mMol) N-Hydroxybenzotriazol in 30 ml wasserfreiem DMF bei 0°C unter Stickstoff wurden 6,34 g (33 mMol) EDC gegeben. Nach etwa 10 min war alles EDC gelöst. Nach 60 min bei 0°C wurde eine zuvor mit 3,4 ml (31,6 mMol) 4-Methylmorpholin neutralisierte Lösung aus 15,5 g (30 mMol) 2R-Hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propylaminmethansulfonat in 30 ml wasserfreiem DMF dazu gegeben. Nach 3 h bei 0°C wurde die Mischung anschließend über Nacht während 17 h bei Raumtemperatur gerührt. Das DMF wurde unter reduziertem Druck entfernt, Ethylacetat zugegeben, mit 5% Zitronensäure, gesättigtem Natriumbicarbonat, Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt, wodurch 16 g Rohmaterial erhalten wurden, die gemäß HPLC zu 88% rein waren. Dieses Produkt wurde über Kieselgel unter Verwendung von 20 bis 80% Ethylacetat/Hexan chromatographisch gereinigt, um das Reinprodukt zu erhalten, das aus Ethylacetat/Hexan umkristallisiert wurde, wodurch 8,84 g des Reinprodukts erhalten wurden, Smp = 131,8–133,8°C.
  • Alternativ wurden zu einer Lösung aus 35,0 g (211 mMol) 2S-Methyl-3-(methylsulfonyl)propionsäure und 48,3 g (315 mMol) N-Hydroxybenzotriazol in 210 ml wasserfreiem DMF bei 0°C unter Stickstoff 44,4 g (231 mMol) EDC gegeben. Nach etwa 30 min war alles EDC gelöst. Nach weiteren 60 min bei 0°C wurde eine zuvor mit 24 ml (22,3 g) 4-Methylmorpholin neutralisierte Lösung aus 108,8 g (211 mMol) 2R-Hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propylaminmethansulfonat in 350 ml wasserfreiem DMF zugegeben. Das DMF wurde unter reduziertem Druck entfernt, 1 l Ethylacetat zugegeben, mit 5% Zitronensäure, gesättigtem Natriumbicarbonat, Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt, wodurch 120,4 g Rohmaterial erhalten wurden, das gemäß HPLC zu 90% rein war.
  • Das Produkt wurde zweimal aus 750 bis 1000 ml Ethanol absolut umkristallisiert, wodurch 82,6 g des gewünschten Produkts erhalten wurden.
  • Beispiel 16
    Figure 00310001
  • Herstellung von 2S-[[(N-Methylamino)acetyl]aminol-N-[2R-hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-3,3-dimethylbutanamid
  • Zu 6,55 g (10,7 mMol) N-(2R-Hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-2S-[(chloracetyl)amino]-3,3-dimethylbutanamid wurden 25 ml Tetrahydrofuran gegeben, das Lösungsmittel zur Entfernung des gesamten Ethylacetats unter reduziertem Druck entfernt und dann 25 ml Tetrahydofuran zugegeben. Zu dieser Lösung wurden bei 10°C 19 ml (214 mMol) 40% wässriges Methylamin gegeben. Nach 2 h wurden die Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, 1 l Ethylacetat zugegeben, mit gesättigtem Natriumbicarbonat und Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt, wodurch 6,0 g des Produkts erhalten wurden (98 Reinheit).
  • Beispiel 17
  • Erfindungsgemäße retrovirale Protease-Inhibitorverbindungen sind wirksame HIV-Protease Inhibitoren. Der unten beschriebene Enzymassay kann bei der Auswahl der retroviralen Protease-Inhibitoren zur Verwendung in der Kombinationstherapie angewandt werden. Der IC50 (die Konzentration, bei der die Inhibitor-Verbindung die Enzymaktivität um 50% reduziert) kann für solche Verbindungen unter Verwendung dieses Verfahrens berechnet werden.
  • Das enzymatische Verfahren ist wie folgt. Das Substrat ist 2-Aminobenzoyl-Ile-Nle-Phe(p-NO2)-Gln-ArgNH2. Die Positivkontrolle ist MVT-101 (Miller, M et al., Science 246, 1149 (1989)). Der Assay-Puffer ist 20 mM Natriumphosphat, pH 6,4, 20% Glycerin, 1 mM EDTA, 1 mM DTT und 0,1 % CHAPS. Das Substrat wird in DMSO gelöst, dann 10fach in Assay-Puffer verdünnt. Die Substrat-Endkonzentration in dem Assay ist etwa 80 μM. HIV-Protease wird auf der Grundlage eines Molekulargewichts von 10780 in dem Assay-Puffer bis zu einer Endkonzentration von etwa 12,3 nanomolar verdünnt.
  • Die Endkonzentration von DMSO ist etwa 14% und die Endkonzentration des Glycerins etwa 18%. Die Testverbindung wird in DMSO gelöst und in DMSO auf die etwa 10fache Testkonzentration (10×) verdünnt, dann in 10 μl Substrat. Der Anstieg der Fluoreszenz bei Raumtemperatur wird zu 4 Zeitpunkten aufgezeichnet (0, 8, 16 und 24 Minuten). Jeder Assay wird in doppelten Cavitäten durchgeführt.
  • Beispiel 18
  • Die Wirksamkeit der ausgewählten erfindungsgemäßen HIV-Protease-Inhibitor verbindungen kann unter Verwendung des oben beschriebenen Enzymassays und des folgenden CD4+-Zell-Linienassays bestimmt werden. Antivirale Aktivitäten von Protease-Inhibitoren werden als wirksame Konzentration 50- (EC50) und/oder als wirksame Konzentration 90- (EC90) Werte ausgedrückt.
  • Das HIV-Inhibition-Assay-Verfahren akut infizierter Zellen ist ein automatisierter Tetrazolium-Assay auf der Grundlage von Kolorimetrie im Wesentlichen wie von Pauwels et al., J. Virol. Methods 20, 309–321 (1988) beschrieben. Der Assay wird in Gewebekulturschalen mit 96 Cavitäten durchgeführt. Eine CD4+-Zell-Linie wie zum Bespiel CEM, MT-2, MT-4 und dergleichen Zell-Linien werden in mit 10% fötalem Kälberserum supplementiertem RPMI-1640 Medium (Gibco) angezogen und dann mit Polybren (2 μg/ml) behandelt. In jede Cavität wird ein Volumen von 100 μl von in Gewebekulturmedium verdünnter Testverbindung gegeben (oder Medium ohne Testverbindung als Kontrolle), um die gewünschte Endkonzentration zu erzielen, und die Zellen werden bei 37°C während 1 h inkubiert. Eine tiefgefrorene Kultur von HIV-1 wird in Kulturmedium auf eine Konzentration von 5 × 104 TCID50 pro ml verdünnt (TCID50 = die Virus-Dosis, die 50% der Zellen in Gewebekultur infiziert) und ein 20 μl Volumen der Virusprobe (enthaltend 1000 TCID50 des Virus) wird zu jeder Cavität mit Testverbindung und in die nur Medium enthaltenden Cavitäten gegeben. Einige Cavitäten erhalten Kulturmedium ohne Virus (nicht infizierte Kontrollzellen). Gleichermaßen wird die intrinsische Toxizität der Testverbindung durch Zugabe von Medium ohne Virus zu einigen die Testverbindung enthaltenden Cavitäten bestimmt. Zusammengefasst enthalten die Gewebekulturschalen die folgenden Versuchsansätze:
    Figure 00330001
  • Bei den Versuchen 2 und 4 sind die Endkonzentrationen der Testverbindungen 1, 10, 100 und 500 μg/ml. Es werden entweder Azidothymidin (AZT) oder Didesoxyinosin (ddl) als positive Arzneimittelkontrolle eingeschlossen. Die Testverbindungen werden in DMSO gelöst und in Gewebekulturmedium verdünnt, so dass die DMSO-Endkonzentration 1,5% auf keinen Fall übersteigt. DMSO wird zu allen Kontroll-Cavitäten in entsprechenden Konzentration gegeben.
  • Nach der Zugabe von Virus werden die Zellen in befeuchteter Atmosphäre mit 5% CO2 bei 37°C während 7 Tagen inkubiert. Testverbindungen können falls gewünscht an den Tagen 0, 2 und 5 zugegeben werden. An Tag 7 nach Infektion werden die Zellen in allen Cavitäten resuspendiert und eine 100 μl Probe jeder Zellsuspension wird für den Assay entfernt. Ein 20 μl Volumen einer 5 mg/ml Lösung 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) wird pro μl Zellsuspension zugegeben und die Zellen werden während 4 h bei 37°C in einer 5% CO2-Umgebung inkubiert. Während dieser Inkubation wird MTT von lebenden Zellen metabolisch reduziert, was zur Herstellung eines gefärbten Formazan-Produktes in den Zellen führt. Zu jeder Probe werden 100 μl 10% Natriumdodecylsulfat in 0,01 n HCl zur Lyse der Zellen gegeben und die Proben über Nacht inkubiert. Die Absorption bei 590 nm wird für jede Probe unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegerätes von Molecular Devices bestimmt. Die Cytotoxizität und die antivirale Wirksamkeit der Testverbindungen wird durch Vergleich der infizierte und nicht infizierte, mit Testverbindungen behandelte Zellen enthaltenden Cavitäten mit den für nicht infizierte, nicht behandelte Kontroll-Cavitiäten erhaltenden Absorptionswerte bestimmt.
  • HIV-KULTURVERFAHREN
  • Stimulation durch Donor-Lymphozyten
  • Lymphozytenfilm (buffy coats) wurde vom amerikanischen Roten Kreuz oder der Blutbank der Medical School der Washington University erhalten. Die Präparate werden zuerst auf HIV- und CMV-Antikörper, das Oberflächenantigen von HBV (HBsAG) und ALT (Alanintransferase-Aktivität) als Marker für Non-A-, Non-B-Hepatitis untersucht. Leukozyten-angereichertes Blut (30 ml) wird aus dem Plastikbehälter entfernt und 15 ml in zwei 50 ml Schraubverschluss-Zentrifugenröhrchen verteilt. Jede Probe wird mit einem gleichen Volumen sterilem PBS verdünnt und durch Pipettieren durchmischt. Ficoll-Paque (15 ml) oder LSM wird unter Verwendung einer Pasteur-Pipette unter die verdünnten Blutproben eingebracht und die Lösung stehengelassen, damit sie zum Boden des Röhrchen absinken kann. Jedes der Röhrchen wird dann bei 1300 rpm (400xg) während 45 min bei 20°C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird die Lymphozyten-Bande an der Interphase entfernt und in ein 50 ml Röhrchen überführt. Steriles PBS wird zur Verdünnung der abgetrennten Lymphozyten zugegeben und dann bei 1300 rpm während 8 min zentrifugiert. Das Zell-Pellet wird zweimal durch Resuspendieren in PBS und erneutes Zentrifugieren gewaschen. Das endgültige Zell-Pellet wird in 20 ml PBS durch Pipettieren resuspendiert und die Gesamtanzahl lebender Zellen durch Trypan-Blau-Ausschluss bestimmt.
  • Akute Infektivitäts-Assays unter Verwendung klinischer Isolate
  • Etwa 3 × 107 Zellen werden während 48 h mit etwa 3 bis 5 μg/ml PHA in 10% fötales Kälberserum und IL-2 (10 U/ml) enthaltendem RPMI aktiviert. Quantifizierte Virusstamm-Kulturen werden zu der aktivierten Lymphozyten-Suspension mit einer Multiplizität der Infektion von etwa 0,001–0,01 gegeben. Die Zell-Virus-Suspension wird bei 37°C während 2 h inkubiert, um dem Virus die Absorption zu ermöglichen. Das restliche Virus-Inokulum wird durch Zentrifugation entfernt und die Zellen werden in 10% fötales Kälberserum und IL-2 (10 U/ml) enthaltendem RPMI resuspendiert. Diese infizierten Zellen werden zu der aktivierten Lymphozyten-Suspension mit einer Multiplizität der Infektion von 0,001–0,01 gegeben. Die Zell-Virus-Suspension wird bei 37°C inkubiert, um die Virusabsorption zu gestatten. Diese infizierten Zellen werden zu der aus einer Stammlösung (10 mg/ml) in DMSO in vollständigem Kulturmedium verdünnten Testverbindung in 96-Cavitäten-Mikrotiterplatten gegeben, um etwa 5 × 105 Zellen pro Cavität pro 200 μl zu ergeben. Infizierte, unbehandelte Zellen und mit DMSO (0,1 %) allein oder entweder mit AZT oder DDI behandelte Zellen wurden als Kontrollen verwendet. Die Kulturen wurden auf Synzitien-Bildung an den Tagen 7 und 11 nach Infektion oder der Überstand auf Aktivität der reversen Transkriptase oder auf das p24-Antigen untersucht.
  • Chronische Infektivitäts-Assays
  • Mit HXB2 (Laborstamm von HIV-1) chronisch infizierte CEM-Zellen werden zu sechs Cavitäten einer Mikrotiterplatte mit 12 Cavitäten gegeben, um 5 × 104 Zellen pro Cavität zu ergeben. Die Hälfte der Cavitäten wird mit Testverbindungen in verschiedenen Konzentrationen behandelt und die gleiche Anzahl nicht infizierter CEM-Zellen wird ohne zugegebene Testverbindung in Kultur gehalten. Frisches Medium mit oder ohne Testverbindung wird jeden Tag während drei aufeinander folgender Tage zugegeben. Die Kulturen werden dann während 48 h ohne Austausch in demselben Medium inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet, 2x in PBS gewaschen und in 50 μl 0,0125 M Tris, pH 6,8, 4% SDS, 20% Glycerin, 10% β-Mercaptoethanol und 0,02% Bromphenolblau enthaltendem 2x Lämmli-Puffer resuspendiert. Kulturüberstände werden zur Entfernung von Zelltrümmern durch 0,22 μm Filter filtriert und dann bei 50 000 rpm während 90 min zentrifugiert, um die Virus-Partikel zu konzentrieren. Das Viruspellet wird in 50 μl Lämmli-Puffer resuspendiert. Die Zell- oder Virus-Suspensionen werden während 5 min gekocht und dann einer elektrophoretischen Auftrennung auf einem 10- bis 20%igen SDS-Polyacrylamid-Gradienten-Gel unterworfen. Die Proteine enthaltenden Banden des Gels werden durch Elektroblotten auf Nitrocellulose transferiert. HIV-spezifische Proteine werden unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen p24 und p17, gefolgt von an Biotin gebundenem Ziege-anti-Maus IgG und an Meerrettichperoxidase gebundenem Avidin nachgewiesen. Enzymatische Umwandlung von 4-Chlor-1-naphthol wurde verwendet, um die durch die monoklonalen Antikörper erkannten spezifischen Proteine sichtbar zu machen. Zusätzlich wurde die Infektivität der von den CEM-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindungen hergestellten Viren untersucht. Filtrierte Überstände werden serienmäßig verdünnt und zur Infektion nicht infizierter CEM-Zellen (etwa 1 × 104/Cavität) verwendet. Die Kulturen wurden an Tag 7 und 11 nach Infektion auf Synzitien-Bildung oder die Überstände auf Aktivität der reversen Transkriptase oder das p24-Antigen getestet.
  • Reverse Transkriptase (RT) Mikro-Assay
  • Der RT-Mikro-Assay ist eine Anpassung mehrerer Standard-RT-Assays. Er wurde entwickelt, um in kleinem Volumen die quantitative Messung der HIV-RT-Aktivität zu gestatten und die Bearbeitung zahlreicher Proben zu erleichtern.
  • Figure 00370001
  • VERFAHREN:
    • 1. Zugabe von RT-Cocktail pro Cavität in eine U-Boden-Mikrotiterplatte mit 96 Cavitäten
    • 2. Zugabe von 10 bis 20 μl einer zellfreien Überstandslösung pro Cavität
    • 3. Gutes Durchmischen unter Verwendung einer mechanischen Dreheinrichtung
    • 4. Inkubation bei 37°C während 2 h
    • 5. Absaugen auf DE81 oder gleichwertigem Filterpapier unter Verwendung von TOMTEK
    • 6. Viermal spülen mit 2 × SSC
    • 7. Einmal Spülen mit 95% Ethanol
    • 8. Trocknen des Filters
    • 9. Vorbereiten zur Zählung unter Verwendung eines Beta-Platten-Zählers (Pharmacia).
  • Beispiel 19
    Figure 00380001
  • Mehrere Vermehrungszyklen wurden mit steigenden Konzentrationen der Testverbindung wiederholt, bis eine Verschiebung bei EC50 beobachtet wird.
  • Das Folgende ist ein Kulturverfahren zur Selektion von HIV-Protease-Inhibitor resistenten Mutanten. Infizierte Zellen wurden kontinuierlich in Gegenwart von Protease-Inhibitor in Kultur herangezogen. Einige Kulturen wurden in alternierenden Wochen hohen und niedrigen Inhibitor-Konzentrationen unterworfen. Andere durchliefen die Kulturpassagen bei konstanter Konzentration. Die Arzneimittelkonzentrationen wurden periodisch erhöht bis eine gleichmäßige Verschiebung in der EC50 beobachtet wurde. Eine Verschiebung in der Dosis-Reaktions-Kurve wurde allgemein bei einer Arzneimittelkonzentration von 0,5 bis 1 μg/ml oder größer (das 5–10 × fache von EC90) nachgewiesen und war abhängig vom behandelten Virus-Isolat. Es wurden sowohl laborangepasste als auch primäre klinische Isolate von HIV verwendet. Dieselben Virus-Isolate wurden in der gleichen Weise in Abwesenheit von Arzneimitteln Zellkulturpassagen unterzogen, so dass direkte Nukleosidsequenzvergleiche zwischen behandelten und unbehandelten Isolaten durchgeführt werden konnten. Allgemein wurden gegenüber Protease-Inhibitoren resistente HIV-1 Varianten durch serielle Passagen (Wachstum) in Gegenwart mehrerer Hemmstoffkonzentrationen des speziellen Protease-Inhibitors selektiert (s. Markowitz et al., Journal of Virology 69, 701–706 (1995)). Die unten aufgelisteten HIV-1-Varianten zeigen die Mutationen, die in den ausgewählten Virus-Isolaten vorliegen und die in den als Kontrollen verwendeten unbehandelten Virus-Isolaten nicht vorhanden sind.
  • RF bedeutet den HIV-1-Stamm HIV-1RF und RFR eine von durch Selektion von RF gegen die Verbindung aus Beispiel 1 erhaltene Mischung resistenter Stämme. RFR umfasst eine Mischung von Virusstämmen, die die Protease-Genotypen von G48V (14/40 Klone); G48V, V82A (18/40 Klone); G48V, L90S (2/40 Klone); G48V, I54T, V82A (1/40 Klone); G48M (1/40 Klone); G48V, Q61H (1/40 Klone), V13I, G48V (1/40 Klone); G48V, F53L, V82A (1/40 Klone) und G48V, V82A, C95Y (1/40 Klone) haben. RFR2 bedeutet eine Mischung von durch Klonung von RFR über drei Wachstumsrunden bei limitierender Verdünnung erhaltener resistenter Stämme. RFR2 umfasst eine Mischung von Virus-Stämmen mit den Protease-Genotypen G48V, V82A (13/15 Klone); G17E, G48V, V82A (1/15 Klone) und G48V, V82A, N37D, N88D (1/15 Klone). RFRR bedeutet eine Mischung von durch Selektion auf RF gegen die Verbindungen aus den Beispielen 1 und 2 mit anschließender Klonierung über drei Wachstumsrunden bei limitierender Verdünnung erhaltener resistenter Stämme. RFRR umfasst eine Mischung von Virus-Stämmen mit den Protease-Genotypen G48V, I54T, L63P, V82A (7/9 Klone); G48V, I54T, L63P, V82A, N88S (1/9 Klone) und G48V, I54T, L63P, G73M, V82A (1/9) Klone. SF162 bedeutet den HIV-1-Stamm SF-162 und SF162R eine durch Selektion von SF162 gegen die Verbindung aus Beispiel 1 erhaltene Mischung resistenter Stämme. SF162R umfasst eine Mischung von Virus-Stämmen mit den Protease-Genotypen M46I, F53L, L63P, A71V, N88D (2/3 Klone) und M46I, F53L, L63P, A71V, N88D, Q92R (1/3 Klone). 89–959 bedeutet den HIV-1-Stamm 89–959 und 89–959R eine durch Selektion von 89–959 gegen die Verbindung von Beispiel 2 erhaltene Mischung resistenter Stämme. 89–959R umfasst eine Mischung von Virus-Stämmen mit den Genotypen von N88S (4/5 Klone) und D25N, T26A, D30N, D37N, R41K, G73D, R87K, N88S (1/4 Klone).
  • NL4 bedeutet den HIV-1 Stamm HIV-1NL43-3. NL4(G48V) bedeutet einen Stamm mit einer synthetisch erzeugten stellenspezifischen Mutation in der Protease bei der Aminosäureposition Nr. 48 von Glycin zu Valin. NL4(184V) bedeutet einen Stamm mit einer synthetisch erzeugten stellenspezifischen Mutation bei der Aminosäureposition Nr. 84 von Isoleucin zu Valin. NL4(R8Q,M46I) bedeutet einen Stamm mit synthetisch erzeugten stellenspezifischen Mutationen in der Protease bei der Aminosäureposition Nr. 8 von Arginin zu Glutamin und bei der Aminosäureposition Nr. 46 von Methionin zu Isoleucin. NL4(P22-538) bedeutet eine durch Selektion von HIV-1NL4-3 gegen die Verbindung von Beispiel 10 nach 22 Passagen erhaltene Mischung resistenter Stämme, umfassend die Protease-Genotypen M46I, L63P, A71V, V82F, I84V (4/10); M46I, L63P, V82F, I84V (3/10) und M46I, A71V, V82F, I84V (3/10). NL4 (P37-538) bedeutet durch Selektion von HIV-1NL4-3 gegen die Verbindung von Beispiel 10 nach 37 Passagen erhaltene resistente Stämme, umfassend den Protease-Genotypus M46I, L63, A71V, L63P, A71V, I84A. NL4(538/524) bedeutet durch Selektion von NL4(P22-538) gegen die Verbindung aus Beispiel 5 nach 24 Passagen erhaltene resistente Stämme, umfassend den Protease-Genotypus M46I, L63P, A71V, I84A. NL4(538/P7-AG) bedeutet eine durch Selektion von NL4(P22-538) gegen die Verbindung aus Beispiel 12 nach 7 Passagen erhaltene Mischung resistenter Stämme, umfassend die Protease-Genotypen M46I, L63P, A71V, I84A und V32I, V82I. NL4(538/P24-AG) bedeutet durch Selektion auf NL4(P22-538) gegen die Verbindung von Beispiel 12 nach 24 Passagen erhaltene resistente Stämme, umfassend den Protease-Genotypus M46I, L63P, A71V, I84A. NLA(P19-003) bedeutet durch Selektion von HIV-1NL4-3 gegen die Verbindung aus Beispiel 9 nach 19 Passagen erhaltene resistente Stämme, umfassend den Protease-Genotypus R8K, M46I. NL4(P34-003) bedeutet durch Selektion von HIV-1NL4-3 gegen die Verbindung aus Beispiel 9 nach 34 Passagen erhaltene resistente Stämme, umfassend den Protease-Genotypus R8K, M46I, L63P, A71V, L90M. Die Resistenzergebnisse viraler Isolate sind in den Tabellen 1 bis 11 zusammengefasst.
  • Beispiel 20
  • Die in den Tabellen 1 bis 3 zusammengefassten Resistenzergebnisse viraler Isolate wurden gemäß dem folgenden Assay-Verfahren oder geringen Abweichungen davon erzeugt. Etwa 3 × 107 Zellen werden während 48 h mit etwa 3 bis 5 μg/ml PHA in 10% fötales Kälberserum und IL-2 (10 U/ml) enthaltendem RPMI aktiviert. Quantifizierte Virus-Stammlösungen werden zu der aktivierten Lymphozytensuspension mit einer Multiplizität der Infektion von 0,001 bis 0,01 zugegeben. Die Zell-Virus-Suspension wird bei 37°C während 2 h inkubiert, um die Virus-Absorption zu gestatten. Das restliche Virus-Inokulum wird durch Zentrifugation entfernt und die Zellen werden in 10% fötales Kälberserum und 10 U/ml IL-2 enthaltendem RPMI resuspendiert. Diese infizierten Zellen werden zu der, aus einer Stammlösung (10 mg/ml) in DMSO in komplettem Kulturmedium verdünnten Testverbindung in Mikrotiterplatten mit 96 Cavitäten gegeben, um etwa 5 × 105 Zellen pro Cavität pro 200 μl zu ergeben. Infizierte, unbehandelte Zellen und mit DMSO allein (0,1 %) behandelte Zelten oder entweder mit AZT oder DDI behandelte Zellen wurden als Kontrollen verwendet. Die Kulturen wurden auf Synzitien-Bildung an den Tagen 7 und 11 nach Infektion untersucht oder die Überstände auf Aktivität der reversen Transkriptase oder p24 Antigen getestet.
  • TABELLE 1
    Figure 00410001
  • TABELLE 2
    Figure 00420001
  • TABELLE 3
    Figure 00420002
    • ✝, ⧺, § geben im selben Experiment erhaltene Werte an.
  • Beispiel 21
  • Die in den Tabellen 4 bis 6 zusammengefassten Resistenzergebnisse der Virus-Isolate wurden gemäß dem folgenden Assay-Verfahren oder geringfügigen Abweichungen davon erhalten. Die Assays werden in Gewebekulturschalen mit 96 Cavitäten durchgeführt. CEM-T4 Zellen werden in 90% RPMI-Medium (Gibco Life Technologies, Inc., Gaithsburg, MD), 10% wärmebehandeltem fötalen Kälberserum (Gibco Life Technologies, Inc., Gaithsburg, MD) bis zu einer Endkonzentration von 5 × 105 lebenden Zellen pro ml suspendiert. Ein gefrorener Aliquot einer HIV-Kultur (Stamm HIV-1RF) wird rasch aufgetaut (im 37°C Wasserbad) und zu den CEM-T4 Zellen zum Erreichen einer Endkonzentration von etwa 0,001 bis 0,01 infektiöse Einheiten pro Zelle zugegeben. Die Virus-Zell-Suspension wird durch Umschwenken rasch durchmischt und sofort 100 μl zu einer 100 μl Verdünnung jeder Testverbindung (hergestellt als 2x Konzentrat in 90% RPMI, 10% FBS) in jede Cavität der 96-Cavitäten-Kulturschale gegeben. Jede Schale enthält Kontroll cavitäten, die Zellen und Virus, aber keine Testverbindung enthalten. 3'-Azido-3'-desoxythimidin (AZT) wird als Positivkontrolle bei allen Assays eingeschlossen.
  • Die Gewebekulturschalen werden bei 37°C in einer befeuchteten, 5%igen CO2-Atmosphäre während 7 Tagen inkubiert. Der Grad der Virus-Replikation wird dann durch Messung der Aktivität der reversen Transkriptase in den Überständen unter Verwendung von Standard-Verfahren (wie unlängst beschrieben, s. zum Beispiel Techniques in HIV Research, Aldovini & Walker, Hrsg., 1990, Stockton Press, NY) festgestellt.
  • TABELLE 4
    Figure 00430001
    • ✝, ⧺ geben im selben Experiment erhaltene Werte an.
  • TABELLE 5
    Figure 00430002
  • TABELLE 6
    Figure 00440001
  • Beispiel 22
  • Die in den Tabellen 7 bis 11 zusammengefassten Resistenzergebnisse der viralen Isolate wurden gemäß den von Markowitz et al., Journal of Virology, Bd. 69, S. 701–706 (1995) beschriebenen oder durch geringfügige Änderungen davon ermittelt.
  • TABELLE 7
    Figure 00440002
  • TABELLE 8
    Figure 00450001
  • TABELLE 9
    Figure 00450002
  • TABELLE 10
    Figure 00450003
  • TABELLE 11
    Figure 00460001
  • Beispiel 23
  • Die ein einzelnes Hydroxyethylharnstoff-Isoster enthaltenden Protease-Inhibitoren der Beispiele 1 und 2 werden zur Selektion von arzneimittel-resistenten HIV-1 Varianten in vitro verwendet. HIV-1 Stämme aus Klinik und Labor wurden Zellkulturpassagen in T-Zell-Linien oder mononukleären Zellen aus peripherem Blut (PBMCs) in Gegenwart steigender Arzneimittelkonzentrationen unterworfen. Resistente Varianten zeigten einheitlich mindestens 10fach höhere EC50-Werte als in Abwesenheit von Inhibitor während eines identischen Zeitabschnitts in Zellkultur passagiertes Kontroll-Virus. Virale DNA wurde mit PCR amplifizierf und die Nukleotidsequenz des für die Protease kodierenden Gens unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt. Bei gegen die Protease-Inhibitoren der Beispiele 2 bzw. 1 resistenten Viren wurde eine einheitliche Aminosäuresubstitution an Position 88 bei vielen der ausgewählten Varianten beobachtet. Der Asn-Rest bei 88 liegt innerhalb einer strukturell konservierten helikalen Domäne, die sowohl in monomeren als auch in dimeren Asparagin-Proteinasen vorhanden ist. Die entsprechende Carboxy-terminale Sequenz Gly-Arg-Asp/Asn (Reste 86–88) ist einzigartig bei retroviralen Asparagin-Proteinasen. Währende alle Erklärungen für diese Ergebnisse nur Spekulation sind, scheinen Modellstudien basierend auf aus hochauflösenden Röntgenstrukturen stammenden Modellstudien von an rekombinante HIV-1-Protease gebundenen prototypischen Hydroxyethylharnstoff-Inhibitoren nahezulegen, dass die Asn88-Mutationen die Konformation der Protease verändern können.
  • Erfindungsgemäße retrovirale Protease-Inhibitorverbindungen sind vorteilhafterweise wirksame antivirale Verbindungen und insbesondere sind sie wirksame Inhibitoren von Retroviren, besonders von Lentiviren wie oben gezeigt. Daher sind die erfindungsgemäßen Verbindungen wirksame Inhibitoren von HIV. Es wird in Betracht gezogen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen ebenfalls weitere HIV-Stämme, wie zum Beispiel HIV-2 and andere Viren wie zum Beispiel das VISNA- und das Simian-Immundefizienz-Virus (SIV), HTLV-1 und HTLV-2 hemmen. Daher sind die erfindungsgemäßen Verbindungen wirksam bei der Behandlung und/oder Prophylaxe von retroviralen Infektionen.
  • Die vorliegende Erfindung soll wenn möglich ebenfalls die Solvate oder Hydrate retroviraler Inhibitorverbindungen beinhalten und diese werden in dem Fachmann bekannter Weise hergestellt oder isoliert.
  • Die retroviralen Protease-Inhibitorverbindungen können in Form von von anorganischen oder organischen Säure stammenden Salzen verwendet werden. Diese Salze beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, die folgenden: Acetat, Adipat, Alginat, Citrat, Aspartat, Benzoat, Benzolsulfonat, Bisulfat, Butyrat, Kampferat, Kampfersulfonat, Digluconat, Cyclopentanpropionat, Dodecylsulfat, Ethansulfonat, Glucoheptanoat, Glycerophosphat, Hemisulfat, Heptanoat, Hexanoat, Fumarat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydroiodid, 2-Hydroxyethansulfonat, Lactat, Maleat, Methansulfonat, Nicotinat, 2-Naphthalinsulfonat, Oxalat, Palmoat, Pectinat, Persulfat, 3-Phenylpropionat, Picrat, Pivalat, Propionat, Succinat, Tartrat, Thiocyanat, Tosylat, Mesylat und Undecanoat.
  • Beispiele von Säuren, die zur Bildung pharmazeutisch annehmbarer Säureadditionssalze verwendet werden können, beinhalten solche anorganischen Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure und solche organischen Säuren wie Oxasäure, Maleinsäure, Succininsäure und Zitronensäure, vorzugsweise Salzsäuresalz. Weitere Beispiele beinhalten Salze mit Alkalimetallen oder Erdalkalimetallen, wie zum Beispiel Natrium, Kalium, Calcium oder Magnesium oder mit organischen Basen.
  • Die einem Patienten täglich als Einzeldosis oder in geteilten Dosen zu verabreichende Menge kann zum Beispiel zwischen 0,01 bis 50 mg/kg Körpergewicht täglich und häufiger zwischen 0,1 bis 30 mg liegen. Einheitsdosisverbindungen können Teilmengen dieser Mengen enthalten und deshalb die tägliche Gesamtdosis ergeben.
  • Die Wirkstoffmenge, die mit dem Trägermaterial zur Herstellung einer Einzeldosisform kombiniert werden kann, kann in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Patienten und der besonderen Verabreichungsart unterschiedlich sein.
  • Das Dosierungsschema zur Behandlung von Erkrankungen mit den retroviralen Protease-Inhibitorverbindungen und/oder -zusammensetzungen wird in Übereinstimmung mit einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich Typus, Alter, Gewicht, Geschlecht, Ernährungsgewohnheiten und dem medizinischen Zustand des Patienten, der Schwere der Erkrankung, dem Verabreichungsweg, pharmakologischen Überlegungen wie Aktivität, Wirksamkeit, pharmakokinetische und toxikologische Profile der speziellen eingesetzten Verbindung, ob ein Arzneimittelbereitstellungssystem verwendet wird und ob die Verbindung als Teil einer Arzneimittelkombination verwendet wird. Damit kann das tatsächlich verwendete Dosierungsschema stark variieren und kann deshalb von dem oben dargelegten bevorzugten Dosierungsschema abweichen.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können oral, parenteral, durch Inhalationsspray, rektal oder topisch, falls gewünscht als konventionelle, nicht toxische, pharmazeutisch annehmbare Träger, Adjuvantien und Vehikel enthaltende Einheitsdosisformulierungen verabreicht werden. Topische Verabreichung kann ebenfalls die Verwendung von transdermaler Verabreichung wie zum Beispiel als transdermale Pflaster oder mit Iontophorese-Vorrichtungen umfassen. Der Begriff parenteral wie hierin verwendet beinhaltet subkutane Injektionen, intravenöse, intramuskuläre, intrasternale Injektion oder Infusionsverfahren.
  • Injizierfähige Zubereitungen zum Beispiel sterile, injizierfähige, wässrige oder ölige Suspensionen können in dem Fachmann bekannter Weise unter Verwendung geeigneter Dispersions- oder Benetzungs- und Suspensionsmittel zubereitet werden. Die sterile injizierfähige Zubereitung kann ebenfalls eine sterile injizierfähige Lösung oder Suspension in einem nicht toxischen, parenteral annehmbaren Verdünnungs- oder Lösungsmittel, z. B. eine Lösung in 1,3-Butandiol, sein. Unter den annehmbaren Vehikeln oder Lösungsmitteln, die verwendet werden können, sind Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Zusätzlich werden sterile fixierte Öle herkömmlich als Lösungs- oder Suspensionsmittel eingesetzt. Zu diesem Zweck kann jedes neutrale fixierte Öl einschließlich synthetischer Mono- und Diglyceride verwendet werden. Zusätzlich finden Fettsäuren wie zum Beispiel Ölsäure bei der Herstellung von Injektionslösungen Verwendung.
  • Suppositorien zur rektalen Verabreichung des Arzneimittels können durch Mischen des Arzneimittels mit einem geeigneten, nicht reizenden Hilfsstoff wie Kakaobutter und Polyethylglycol hergestellt werden, die bei normalen Temperaturen fest, aber bei Rektaltemperatur flüssig sind und deshalb im Rektum schmelzen und das Arzneimittel freisetzen.
  • Feste Dosisformen zur oralen Verabreichung können Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granula beinhalten. In solchen festen Dosisformen kann der Wirkstoff mit mindestens einem inerten Verdünnungsmittel wie Saccharose, Lactose oder Stärke vermischt sein. Solche Dosisformen können ebenfalls in der gängigen Praxis weitere zusätzliche Substanzen wie inerte Verdünnungsmittel, zum Beispiel Gleitmittel wie zum Beispiel Magnesiumstearat umfassen. Im Fall von Kapseln, Tabletten und Pillen kann die Dosisform ebenfalls Puffermittel umfassen. Tabletten und Pillen können zusätzlich mit einer dünndarmlöslichen Beschichtung hergestellt werden.
  • Flüssige Dosisformen zur oralen Verabreichung können pharmazeutisch annehmbare, vom Fachmann häufig verwendete Verdünnungsmittel, wie zum Beispiel Wasser, enthaltende Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere umfassen. Solche Zusammensetzungen können ebenfalls Adjuvantien, wie zum Beispiel Benetzungsmittel, Emulgatoren und Suspensionsmittel, Süß-, Aroma- und Duftstoffe umfassen.
  • Während die erfindungsgemäßen retroviralen Protease-Inhibitorverbindungen als einziger pharmazeutischer Wirkstoff verabreicht werden können, können sie ebenfalls in Verbindung mit weiteren antiviralen, gegen Retroviren wie HIV-1 wirksamen Mitteln verabreicht werden. Solche Verbindungen beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, weitere HIV-1-Proteaseinhibitoren, verschiedene Nukleosidanaloga, Inhibitoren der reversen Transkriptase auf Nicht-Nukleosidbasis, Tat-Antagonisten und Glycosidase-Inhibitoren.
  • Beispiele von HIV-1-Protease-Inhibitoren beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Ro 31–859 (Roberts, N.A. et Al., Science 1990, 248, 258–261 and Drugs of the Future 1991, 16(3), 210–212, KNI-272, (Kagayama, S., et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1993, 810–817), die cyclischen Harnstoffserien (Lam, P. et al., „De novo Design and Discovery of Potent, Nonpeptidal HIV-1 Protease Inhibitors," Paper 96 beim 205ten American Chemical Society National Meeting, Medicinal Chemistry Division, Denver, CO, 28. März bis 2. April 1993), L-735 524 (Dorsey, B.D. et al., "L-735,524: The Rational Design of a Potent and Orally Bioavailabe HIV Protease Inhibitor," Paper 6 beim 206ten American Chemical Society National Meeting, Medicinal Chemistry Division, Chicago, IL, 22. bis 27. August 1993) und Analoga davon.
  • Beispiele kompetitiver Nukleoside beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Azidothymidin (AZT), Didesoxyinosin (DDI), DDC, 3TC, D4T und PMEA. Beispiele von nicht-nukleosid, nicht-kompetitiven Inhibitoren der reversen Transkriptase beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, die Pyridon-Klasse (Wei, J.S. et al., J. Med. Chem. 1993, 36, 249–255; Hoffman, J.M., et al., J. Med. Chem. 1992, 35, 3784–3791; Saari et al., J. Med. Chem. 1992, 35, 3792–3802; Drugs of the future 1992, 17(4), 283–285, und Analoga davon), die Bis-(heteroaryl)piperazin-Klasse (Romero, D.L. et al., J. Med. Chem. 1993, 36, 1505–1508; Romero, D.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 34, 746–751 und 3187–3198 und Analoga davon) und die tricyclischen Pyridobenzo- und Dipyridodiazepinone (Hargrave, K.D., J. Med. Chem. 1991, 34, 2231–2241), Meriuzzi, M.J., Science 1990, 250, 1411–1413 und Analoga davon) und 5-Chlor-3-(phenylsulfonyl)indol-2-carboxamid und dessen Analoga (Williams, T.M. et al., J. Med. Chem. 1993, 36, 1291–1294). Beispiele von Tat-Antagonisten beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Ro 5–3335 und Ro 24–7429 (Hsu, M.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 909, 6395–6399, Tam, S. et al., „TAT-INHIBITORS: A New Class of Anti-HIV Agents," Paper 372 beim 204ten American Chemical Society National Meeting, Organic Chemistry Division, Washington, DC, 23. bis 28. August 1992) und Analoga davon. Beispiele für Glycosidase-Inhibitoren beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Castanospermin, Castanospermin-6-butrylester, N-Butyl-1-desoxynojirimycin, N-Butyl-1-desoxynojirimycinperbutrylester und Analoga und Proarzneimittel davon.
  • Die therapeutischen Mittel können als separate Zusammensetzungen formuliert werden, die im Wesentlichen zur selben Zeit gegeben werden oder es können die therapeutischen Mittel als Einzelzusammensetzungen gegeben werden, so dass alle Wirkstoffe in therapeutisch wirksamer Menge in dem Patienten vorhanden sind. Alternativ kann das therapeutische Mittel dem Patienten zu verschiedenen Zeiten verabreicht werden, so dass nur ein oder zwei Wirkstoffe zu einer Zeit in einer therapeutisch wirksamen Menge in dem Patienten vorhanden sind.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen und Verfahren sind wirksame antivirale Verbindungen und sind insbesondere wie oben gezeigt wirksame retrovirale Inhibitoren. Es wird in Betracht gezogen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen auch weitere Retroviren hemmen werden, wie zum Beispiel weitere Lentiviren, insbesondere weitere Stämme von HIV, zum Beispiel HIV-2, das menschliche T-Zell-Leukämie-Virus, das Rous-Sarkoma-Virus, das Katzen-Immundefizienz-Virus und dergleichen. Daher sind die erfindungsgemäßen Verbindungen bei der Behandlung und/oder Prophylaxe retroviraler Infektionen wirksam.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen und Verfahren sind ebenfalls bei der Verhütung des Wachstums von Retroviren in einer Lösung wirksam. Sowohl mensch liche als tierischen Zellkulturen, wie T-Lymphozyten-Kulturen, werden für eine Vielzahl gut bekannter Zwecke verwendet, wie zum Beispiel für Forschungs- und Diagnoseverfahren einschließlich als Kalibratoren und Kontrollen. Vor und während des Wachstums und der Lagerung einer Zellkultur können die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer wirksamen Konzentration zum Zellkulturmedium gegeben werden, um unerwartete und unerwünschte Replikation eines Retrovirus zu verhüten, das unabsichtlich und unwissentlich in der Kultur zugegen sein kann. Das Virus kann ursprünglich in der Zellkultur zugegen gewesen sein, so ist zum Beispiel für HIV bekannt, dass es in menschlichen T-Lymphozyten vorliegt, lange bevor es im Blut nachweisbar ist oder durch Exposition gegenüber dem Virus in die Kultur gelangt sein. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen und Verfahren verhüten die unwissentliche oder unbeabsichtigte Exposition des Forschers oder Arztes gegenüber einem potentiell tödlichen Retrovirus.

Claims (16)

  1. Verwendung (a) einer wirksamen Menge eines ersten retroviralen Protease-Inhibitors und (b) einer wirksamen Menge eines zweiten retroviralen Protease-Inhibitors, worin der zweite retrovirale Protease-Inhibitor gegen mindestens einen retroviralen Stamm wirksam ist, der gegen den ersten retroviralen Protease-Inhibitor resistent ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung retroviraler Infektionen in einem Säuger, worin der erste retrovirale Protease-Inhibitor N-(2(R)-Hydroxy-1(S)-indanyl)-2(R)-phenylmethyl-4(S)-hydroxy-5-(1-(4-(3-pyridylmethyl)-2(S)-N'-(t-butylcarboxamido)piperazinyl))pentanamid, N-tert-Butyldecahydro-2-[2(R)-hydroxy-4-phenyl-3(S)-[[N-(2-chinolylcarbonyl)-L-asparaginyl]amino]butyl]-(4aR,8aS)-isochinolin-3(S)-carboxamid, (2S,3R,4S,5S)-2,5-Bis-[N-[N-[[N-methyl-N-(2-pyridinylmethyl)amino]carbonyl]valinyl]amino]-3,4-dihydroxy-1,6-diphenylhexan, (2S,3S,5S)-5-[N-[N-[N-Methyl-N-[(2-isopropyl-4-thiazolyl)methyl]amino]carbonyl]valinyl]amino]-2-[N-[(5-thiazolyl)methoxycarbonyl]amino]-3-hydroxy-1,6-diphenylhexan, [2R-Nydroxy-3-[[(4-aminophenyl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]carbaminsäure-3S-tetrahydrofuranylester, N-tert-Butyldecahydro-2-[2(R)-hydroxy-4-(phenylthio)-3(S)-[[N-[(2-methyl-3-hydroxyphenyl)carbonyl]amino]butyl]-(4aR,8aS)-isochinolin-3(S)-carboxamid, [4R-(4α,5α,6β,7β)]-1,3-Bis[(3-aminophenyl)methyl]hexahydro-5,6-dihydroxy-4,7-bis(phenylmethyl)-2H-1,3-diazepin-2-on, N-[2R-Hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-2S-[[(pyrrolidin-1-yl)acetyl]amino]-3,3-dimethylbutanamid, N-[2R-Hydroxy-3-[(2-methylpropyl)[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl]amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-2S-methyl-3-(methylsulfonyl)propanamid, [1S-[1R*(R*),2S*]]-N-[2-hydroxy-3-[N1-(2-methylpropyl)-N1-(4-methoxyphenylsulfonyl)amino]-1-(phenylmethyl)propyl]-2-methyl-3-(methylsulfonyl)propanamid, 2S-[[(N-Methylamino)acetyl]amino]-N-[2R-hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-3,3-dimethylbutanamid oder (2R,3S)-3-(N-Methylaminoacetyl-L-tert-butylglycinyl)amino-1-(N-isoamyl-N-(tert-butylcarbamoyl))amino-4-phenyl-2-butanol ist.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, worin der erste und der zweite Inhibitor in einer solchen Menge verabreicht werden, dass beide Inhibitoren in einer wirksamen Menge in dem Säuger vorhanden sind.
  3. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Verabreichung sowohl des ersten und als auch des zweiten Inhibitors abgewechselt wird, so dass jeweils eine wirksame Menge eines der Inhibitoren in dem Säuger vorhanden ist.
  4. Verwendung nach Anspruch 1, worin der zweite retrovirale Protease-Inhibitor N-(2(R)-Hydroxy-1(S)-indanyl)-2(R)-phenylmethyl-4(S)-hydroxy-5-(1-(4-(3-pyridylmethyl)-2(S)-N'-(t-butylcarboxamido)piperazinyl))pentanamid, N-tert-Butyldecahydro-2-[2(R)-hydroxy-4-phenyl-3(S)-[[N-(2-chinolylcarbonyl)-L-asparaginyl]amino]butyl]-(4aR,8aS)-isochinolin-3(S)-carboxamid, (2S,3R,4S,5S)-2,5-Bis-[N-[N-[[N-methyl-N-(2-pyridinylmethyl)amino]carbonyl]valinyl]amino]-3,4-dihydroxy-1,6-diplienylhexan, (2S,3S,5S)-5-[N-[N-[N-Methy-N-[(2-isopropyl-4-thiazolyl)methyl]amino]carbonyl]valinyl]amino]-2-[N-[(5-thiazolyl)methoxycarbonyl]amino]-3-hydroxy-1,6-diphenylhexan, [2R-Hydroxy-3-[[(4-aminophenyl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]carbaminsäure-3S-tetrahydrofuranylester, N-tert-Butyldecahydro-2-[2(R)-hydroxy-4-(phenylthio)-3(S)-[[N-[(2-methyl-3-hydroxyphenyl)carbonyl]amino]butyl]-(4aR,8aS)-isochinolin-3(S)-carboxamid, [4R-(4α,5α,6β,7β)]-1,3-Bis[(3-aminophenyl)methyl]hexahydro-5,6-dihydroxy-4,7-bis(phenylmethyl)-2H-1,3-diazepin-2-on, N-[2R-Hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-2S-[[(pyrrolidin-1-yl)acetyl]amino]-3,3-dimethylbutanamid, N-[2R-Hydroxy-3-[(2-methylpropyl)[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl]amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-2S-methyl-3-(methylsulfonyl)propanamid, [1S-[1R*(R*),2S*]]-N-[2-Hydxoxy-3-[N1-(2-methylpropyl)-N1-(4-methoxyphenylsulfonyl)amino]-1-(phenylmethyl)propyl]-2-methyl-3-(methylsulfonyl)propanamid, 2S-[[(N-Methylamino)acetyl]amino]-N-[2R-hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-3,3-dimethylbutanamid oder (2R,3S)-3-(N-Methylaminoacetyl-L-tert-butylglycinyl)amino-1-(N-isoamyl-N-(tert-butylcarbamoyl))amino-4-phenyl-2-butanol ist.
  5. Verwendung nach Anspruch 1, worin der erste retrovirale Protease-Inhibitor N-(2(R)-Hydroxy-1(S)-indanyl)-2(R)-phenylmethyl-4(S)-hydroxy-5-(1-(4-(3-pyridylmethyl)-2(S)-N'-(t-butylcarboxamido)piperazinyl))pentanamid, N-tert-Butyldecahydro-2-[2(R)-hydroxy-4-phenyl-3(S)-[[N-(2-chinolylcarbonyl)-L-asparaginyl]amino]butyl]-(4aR,8aS)-isochinolin-3(S)-carboxamid, (2S,3R,4S,5S)-2,5-Bis-[N-[N-[[N-methyl-N-(2-pyridinylmethyl)amino]carbonyl]valinyl]amino]-3,4-dihydroxy-1,6-diphenylhexan, (2S,3S,5S)-5-[N-[N-[N-Methyl-N-[(2-isopropyl-4-thiazolyl)methyl]amino]carbonyl]valinyl]amino]-2-[N-[(5-thiazolyl)methoxycarbonyl]amino]-3-hydroxy-1,6-diphenylhexan, [2R-Hydroxy-3-[[(4-aminophenyl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]carbaminsäure-3S-tetrahydrofuranylester, N-tert-Butyldecahydro-2-[2(R)-hydroxy-4-(phenylthio)-3(S)-[[N-[(2-methyl-3-hydroxyphenyl)carbonyl]amino]butyl]-(4aR,8aS)-isochinolin-3(S)-carboxamid, [4R-(4α,5α,6β,7β)]-1,3-Bis[(3-aminophenyl)methyl]hexahydro-5,6-dihydroxy-4,7-bis(phenylmethyl)-2H-1,3-diazepin-2-on, N-[2R-Hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-2S-[[(pyrrolidin-1-yl)acetyl]amino]-3,3-dimethylbutanamid, N-[2R-Hydroxy-3-[(2-methylpropyl)[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl]amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-2S-methyl-3-(methylsulfonyl)propanamid, [1S-[1R*(R*),2S*]]-N-[2-Hydroxy-3-(N1-(2-methylpropyl)-N1-(4-methoxyphenylsulfonyl)amino]-1-(phenylmethyl)propyl]-2-methyl-3-(methylsulfonyl)propanamid oder (2R,3S)-3-(N-Methylaminoacetyl-L-tert-butylglycinyl)amino-1-(N-isoamyl-N-(tert-butylcarbamoyl))amino-4-phenyl-2-butanol und der zweite retrovirale Protease-Inhibitor 2S-[[(N-Methylamino)acetyl]amino]-N-[2R-hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-3,3-dimethylbutanamid ist.
  6. Verwendung nach Anspruch 1, worin der erste retrovirale Protease-Inhibitor N-(2(R)-Hydroxy-1(S)-indanyl)-2(R)-phenylmethyl-4(S)-hydroxy-5-(1-(4-(3-pyridylmethyl)-2(S)-N'-(t-butylcarboxamido)piperazinyl))pentanamid und der zweite retrovirale Protease-Inhibitor (2R,3S)-3-(N-Methylaminoacetyl-L-tert-butylglycinyl)amino-1-(N-isoamyl-N-(tert-butylcarbamoyl))amino-4-phenyl-2-butanol, N-[2R-Hydroxy-3-[(2-methylpropyl)[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl]amino]-1S-(phenylmethyl)propyl-2S-methyl-3-(methylsulfonyl)propanamid, [1S-[1R*(R*),2S*]]-N-[2-hydxoxy-3-[N1-(2-methylpropyl)-N1-(4-methoxyphenylsulfonyl)amino]-1-(phenylmethyl)propyl]-2-methyl-3-(methylsulfonyl)propanamid oder 2S-[[(N-Methylamino)acetyl]amino]-N-[2R-hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-3,3-dimethylbutanamid ist.
  7. Verwendung nach Anspruch 1, worin der erste retrovirale Protease-Inhibitor (2S,3S,5S)-5-[N-[N-[N-Methyl-N-[(2-isopropyl-4-thiazolyl)methyl]amino]carbonyl]valinyl]amino]-2-[N-[(5-thiazolyl)methoxycarbonyl]amino]-3-hydroxy-1,6-diphenylhexan und der zweite retrovirale Protease-Inhibitor (2R,3S)-3-(N-Methylaminoacetyl-L-tert-butylglycinyl)amino-1-(N-isoamyl-N-(tert-butylcarbamoyl))amino-4-phenyl-2-butanol, N-[2R-Hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-2S-[[(pyrrolidin-1-yl)acetyl]amino]-3,3-dimethylbutanamid oder 2S-[[(N-Methylamino)acetyl]amino]-N-[2R-hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-3,3-dimethylbutanamid ist.
  8. Verwendung nach Anspruch 1, worin ein dritter retroviraler Protease-Inhibitor verwendet wird, wobei der dritte retrovirale Protease-Inhibitor gegen mindestens einen Virusstamm wirksam ist, der sowohl gegen den ersten als auch gegen den zweiten retroviralen Protease-Inhibitor resistent ist.
  9. Verwendung nach Anspruch 8, worin der dritte retrovirale Protease-Inhibitor N-(2(R)-Hydroxy-1(S)-indanyl)-2(R)-phenylmethyl-4(S)-hydroxy-5-(1-(4-(3-pyridylmethyl)-2(S)-N'-(t-butylcarboxamido)piperazinyl))pentanamid, N-tert-Butyldecahydro-2-[2(R)-hydroxy-4-phenyl-3(S)-[[N-(2-chinolylcarbonyl)-L-asparaginyl]amino]butyl]-(4aR,8aS)-isochinolin-3(S)-carboxamid, (2S,3R,4S,5S)-2,5-Bis-[N-[N-[[N-methyl-N-(2-pyridinylmethyl)amino]carbonyl]valinyl]amino-3,4-dihydroxy-1,6-diphenylhexan, (2S,3S,5S)-5-[N-[N-[N-Methyl-N-[(2-isopropyl-4-thiazolyl)methyl]amino]carbonyl]valinyl]amino]-2-[N-[(5-thiazolyl)methoxycarbonyl]amino]-3-hydroxy-1,6-diphenylhexan, [2R-Hydroxy-3-[[(4-aminophenyl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]carbaminsäure-3S-tetrahydrofuranylester, N-tert-Butyldecahydro-2-[2(R)-hydroxy-4-(phenylthio)-3(S)-[[N-[(2-methyl-3-hydroxyphenyl)carbonyl]amino]butyl]-(4aR,8aS)-isochinolin-3(S)-carboxamid, [4R-(4α,5α,6β,7β)]-1,3-Bis[(3-aminophenyl)methyl]hexahydro-5,6-dihydroxy-4,7-bis(phenylmethyl)-2H-1,3-diazepin-2-on, N-[2R-Hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-2S-[[(pyrrolidin-1-yl)acetyl]amino]-3,3-dimethylbutanamid, N-[2R-Hydroxy-3-[(2-methylpropyl)[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl]amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-2S-methyl-3-(methylsulfonyl)propanamid, [1S-[1R*(R*),2S*]]-N-[2-Hydroxy-3-[N1-(2-methylpropyl)-N1-(4-methoxyphenylsulfonyl)amino]-1-(phenylmethyl)propyl]-2-methyl-3-(methylsulfonyl)propanamid, 2S-[[(N-Methylamino)acetyl]amino]-N-[2R-hydroxy-3-[[(1,3-benzodioxol-5-yl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-1S-(phenylmethyl)propyl]-3,3-dimethylbutanamid oder (2R,3S)-3-(N-Methylaminoacetyl-L-tert-butylglycinyl)amino-1-(N-isoamyl-N-(tert-butylcarbamoyl))amino-4-phenyl-2-butanol ist.
  10. Verwendung nach Anspruch 1, worin mindestens ein gegenüber dem ersten retroviralen Protease-Inhibitor resistenter Virusstamm und mindestens ein gegenüber dem zweiten Protease-Inhibitor resistenter Virusstamm jeweils retrovirale Proteasen herstellen, die mindestens eine Aminosäuresubstitution in der Peptidsequenz der Protease aufweisen, wobei diese Substitution dieselbe Substratbindungsregion der Protease betrifft und zur beobachteten Inhibitorresistenz beiträgt.
  11. Verwendung nach Anspruch 1 weiter umfassend die Verwendung mindestens eines antiviralen Mittels, das kein Protease-Inhibitor ist.
  12. Verwendung nach Anspruch 11, worin das antivirale Mittel ein Nukleosid-Analogon, ein Inhibitor der reversen Transkription, der kein Nukleosid ist, ein Tat-Antagonist oder ein Glycosidase-Inhibitor ist.
  13. Verwendung nach Anspruch 12, worin das Nukleosid-Analogon AZT, DDI, DDC, 3TC, D4T oder PMEA und der Glycosidase-Inhibitor Castanospermin oder N-Butyl-1-deoxynojirmycin ist.
  14. Verwendung nach Anspruch 1, worin der Säuger ein Mensch, ein Affe oder eine Katze ist.
  15. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Retrovirus HIV oder HTLV ist.
  16. Verwendung nach Anspruch 15, worin das Retrovirus HIV-1 oder HIV-2 ist.
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