PL180070B1 - Srodek farmaceutyczny do leczenia retrowirusowych infekcji PL PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest środek farmaceutyczny do leczenia retrowirusowych infekcji, zwłaszcza HIV lub HTLV, u ssaka, zwłaszcza u człowieka, małpy i kota, zawierający kombinację inhibitorów retrowirusowej proteazy skutecznych w zapobieganiu replikacji ludzkich retrowirusów, takich jak HIV, in vitro i in vivo.

W czasie cyklu replikacji retrowirusów, produkty transkrypcji genów gag i gag-pol ulegają translacji jako białka. Białka są z kolei przetwarzane przez wirusowo kodowaną proteazę (lub proteinazę) z wytworzeniem wirusowych enzymów i strukturalnych białek rdzenia wirusa. Najczęściej białka prekursorowe gag są przetwarzane w białka rdzenia, a białka prekursorowe poi są przetwarzane w enzymy wirusowe, np., odwrotną transkryptazę i retrowirusowąproteazę. Wykazano, że poprawne przetwarzanie białka prekursorowego przez retrowirusową proteazę jest konieczne do zestawienia infekcyjnych wirionów. Np., wykazano, że przesuwające ramkę mutacje w regionie proteazy genu poi HIV zapobiega przetwarzaniu białka prekursorowego gag. Wykazano też metodą skierowanej na miejsce mutagenezy reszty kwasu aspartowego w aktywnym miej scu proteazy HIV, że zapobiega się przetwarzaniu białka prekursorowego gag. Tak więc dokonano wysiłku w celu inhibicji wirusowej replikacji inhibitując działanie retrowirusowych proteaz.

Inhibicja retrowirusowej proteazy obejmuje zwykle mimetyk stanu przejściowego, kiedy retrowirusową proteaza jest wystawiana na działanie związku mimetycznego wiążącego (zwykle odwracalnie) enzym we współzawodnictwie z białkami gag i gag-pól, co inhibituje specyficzne przetwarzanie strukturalnych białek i uwalnianie samej retrowirusowej proteazy. W ten sposób można inhibitować skutecznie replikację retrowirusowej proteazy.

Zaproponowano kilka klas związków mimetycznych, szczególnie dla inhibicji proteaz, np. inhibicji proteazy HIV. Takie mimetyki obejmują izostery hydroksyetyloaminy, izostery zredukowanego amidu i izostery niepeptydowe. Patrz np., europejski opis patentowy nr 0346847;

180 070 europejski opis patentowy nr 0342541; Roberts i in., „Rational Design of Peptide-Based Proteinase Inhibitors,” Science, 248,358 (1990); Erickson i in., „Design Activity, i 2,8A Crystal Structure of a C₂ Symmetric Inhibitor Complexed to HIV-1 Protease” Science 249, 527 (1990); i S. Thaisrivongs, „Structure-Based Design of Non-Peptide HIV Protease Inhibitors,” 35th Annual Buffalo Medicinal Chemistry Meeting, State University of New York at Buffalo, Buffalo, NY, 22-25 maja 1994.

Problemem w przypadku inhibitorów retro wirusowej proteazy, jak inhibitorów proteazy HIV, było opracowanie szczepów wirusa opornych na inhibitor. Np., inhibitor proteazy HIV L-735524 Merck & Co. jest skuteczny wobec infekcji HIV u ludzi, lecz oporne na L-735524 szczepy HIV powstały później w pacjentach (Waldholz, The Wall Street Journal, 25 lutego 1994, str. B3; i Condra i in., Naturę 374:569-571 (1995)). Inne przykłady można znaleźć u Vacca i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4096-4100 (1994); Ho i in., J. Virol. 68:2016-2020 (1994); i Sardana i in., Biochem. 33:2004-2010 (1994).

Z opisu patentowego EP 580402 znana jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca dwa różne inhibitory retrowirusowej proteazy. Jednakże z publikacji tej nie wynika specyficzna kombinacja tych inhibitorów. Nie została podana również żadna informacja sugerująca sposób profilowania fenotypowego i genotypowego.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest środek farmaceutyczny do leczenia retrowirusowych infekcji, zwłaszcza HIV lub HTLV, u ssaka, zwłaszcza u człowieka, małpy i kota, charakteryzujący się tym, że zawiera: (a) skuteczną ilość pierwszego inhibitora retrowirusowej proteazy wybranego z grupy obejmującej

N-(2(R)-hydroksy-l(S)-indanylo)-2(R)-fenylometylo-4(S)-hydroksy-5-(l-(4-(3-pirydylometylo)-2(S)-N'-(t-butylokarboksyamido)piperazynylo))pentanoamid;

N-t-butylodekahydro-2-[2(R)-hydroksy-4-fenylo-3(S)[[N-(2-chinolilokarbonyIo)-L-asparaginylo]amino]butylo](4aR, 8aS)-izochinolino-3(S)-karboksyamid;

(2S,3R,4S,5S)-2,5-bis-[N-[N-[[N-metylo-N-(2-pirydynylometylo)amino]karbonylo]walinylo]amino]-3,4-dihydroksy-l,6-difenyloheksan;

(2S,3S,5S)-5-[N-[N-[N-metylo-N-[(2-izopropylo-4-tiazolil)metylo]amino]karbonylo]walinyio]amino]-2-[NCC5-tiazolil)metoksykarbonyło]amino]-3-hydroksy-l,6-difenyloheksan;

N-t-buty lodekahydro-2- [2(R)-hydroksy-4-(feny lotio) 3 (S)- [[N- [(2-mety lo-3 -hydroksyfenylo)karbonylo]amino)butylo)(4aR, 8aS)-izochinolino-3(S)karboksyamid;

[4R-(4a,5a,6P,7p)]-l,3-bis[(3-aminofenylo)metylo]-heksahydro-5,6-dihydroksy-4,7-bis(fenylometylo)-2H-1,3-diazepin-2-on;

N-[2R-hydroksy-3-[[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo](2-metylopropylo)amino)-lS-(fenylometylo)propylo)2S[[(pirolidyn-l-yl)acetylo]amino]-3,3-dimetylobutanamid;

N-[2R-hydroksy-3-[(2-metylopropylo)[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo]amino)-lS-(fenylometylo)propylo]-2S-metylo-3-(metylosulfonylo)propanamid;

[1S-[1R*(R*), 2S*]]-N-[2-hydroksy-3-[N¹-(2-metylopropylo)-N¹-(4-metoksyfenylosulfonylo)amino)-l-(fenylometylo)propylo]-2-metylo-3-(metylosulfbnylo)propanamid;

2S-[[(N-metyloamino)acetylo)amino]-N-[2R-hydroksy-3-[[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo](2-metylopropylo)amino]-lS-(fenylometylo)propylo)-3,3-dimetylobutanamid; lub (2R,3S)-3-(N-metyloaminoacetylo-L-t-butyloglicynylo)-amino-l-(N-izoamylo-N-(t-butylokarbamoilo))amino-4-fenylo-2-butanol;

i (b) skuteczną ilość drugiego inhibitora retrowirusowej proteazy wybranego z grupy obejmującej

N-(2(R)-hydroksy-l(S)-indanylo)-2(R)-fenylometylo-4(S)-hydroksy-5-(l-(4-(3-pirydylmetyło)-2(S)-N'-(t-butylokarboksyamido)piperazynylo))pentanamid;

N-t-butylodekahydro-2-[2(R)-hydroksy-4-fenylo-3(S)[[N-(2-chinolilokarbonylo)-L-asparaginylo]amino]butylo](4aR, 8aS)-izochinolino-3(S)-karboksyamid;

(2S,3R,4S,5S)-2,5-bis-[N-[N-[[N-metylo-N-(2-pirydynylo-metylo)amino]karbonylo)walinylo)amino]-3,4-dihydroksy-1,6-difenyloheksan;

180 070 (2S,3S,5S)-5-[N-[N-[N-metylo-N-[(2-izopropylo-4-tiazolilo)metylo]amino]karbonylo]walinylo]amino]-2-[N[(5-tiazolilo)metoksykarbonylo]amino)-3-hydroksy-l,6-difenyloheksan;

N-t-butyłodekahydro-2-[2(R)-hydroksy-4-(fenylotio)-3(S)-[[N-[(2-metylo-3-hydroksyfenylo)karbonyl)amino)butylo](4aR, 8aS)-izochinolino-3(S)-karboksyamid;

[4R-(4a,5a,63,7P)]-l,3-bis[(3-aminofenylo)metylo]-heksahydro-5,6-dihydroksy-4,7-bis(fenylometylo)-2H-1,3-diazepin-2-on;

N-[2R-hydroksy-3-[[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo] (2-metylopropylo)amino)-lS-(fenylometylo)propyło]-2S[[(pirolidyn-l-ylo)acetylo]amino)-3,3-dimetylobutanamid;

N-[2R-hydroksy-3-[(2-metylopropylo)[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo]amino)-lS-(fenylometylo)propylo]-2S-metylo-3-(metylosulfonylo)propanamid;

[ 1 S-[ 1 R*(R*), 2S *])-N- [2-hydroksy-3 - [N¹ -(2-mety lopropy lo)-N¹ -(4-metoksyfenylosulfonylo)amino]-l-(fenylometylo)propylo)-2-metylo-3-(metylosulfonylo)-propanamid;

2S-[[(N-metyloamino)acetylo]amino)-N-[2R-hydroksy-3-[[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo](2-metylopropylo)amino]-lS-(fenylometylo)propylo)-3,3-dimetyIobutanamid; lub (2R,3S)-3-(N-metyloaminoacetylo-L-t-butyloglicynylo)-amino-l-(N-izoamylo-N-(t-butylokarbamoilo))amino-4-fenylo-2-butanol;

przy czym drugi inhibitor retro wirusowej proteazy jest skuteczny wobec co najmniej jednego retrowirusowego szczepu opornego na pierwszy inhibitor retrowirusowej proteazy i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Korzystnie środek według wynalazku jako pierwszy inhibitor retrowirusowej proteazy zawiera

N-t-butylodekahydro-2-[2(R)-hydroksy-4-fenylo-3(S)-[[N-(2-chinolilokarbonylo)-L-asparaginylo]amino)butylo](4aR, 8aS)-izochinolino-3(S)-karboksyamid, a jako drugi inhibitor retrowirusowej proteazy zawiera (2S,3S,5S)-5-[N-[N-[N-[N-metylo-N-[(2-izopropylo-4-tiazolilo)metylo]amino]karbonylo]walinylo]amino]-2-[N[(5-tiazolilo)metoksykarbonylo]amino]-3-hydroksy-l,6-difenyloheksan.

Korzystnie środek według wynalazku ponadto zawiera co najmniej jeden antywirusowy środek inny niż inhibitor proteazy.

Korzystniej środek według wynalazku jako środek antywirusowy zawiera analog nukleozydu, nienukleozydowy inhibitor odwrotnej transkryptazy, antagonistę tat lub inhibitor glikozydazy.

Jeszcze korzystniej środek według wynalazku jako analog nukleozydu zawiera AZT, DDI, DDC, 3TC, D4T lub PMEA i jako inhibitor glikozydazy zawiera kastanosperminę lub N-butylo-1 -deoksynoj irmycynę.

Retro wirusowa proteaza jest enzymem krytycznym dla procesu retrowirusowej replikacji. Propagacja retrowirusa, takiego jak HIV, może być zahamowana przez wystawienie wirusa na działanie inhibitora retrowirusowej proteazy. Jednak po dłuższym wystawieniu retrowirusa na działanie inhibitora proteazy, mogą ulec selekcji na wariantowe retro wirusy dające początek nowemu dominującemu szczepowi retrowirusa opornego na inhibitor proteazy. Nowy dominujący szczep retrowirusa może wytwarzać proteazę, która już nie jest inhibitowana lub częściej jest niedostatecznie inhibitowana inhibitorem proteazy i może swobodnie powielać się nawet w obecności inhibitora proteazy, jeśli nie zwiększy się znacząco stężenia inhibitora. Zastosowanie środka farmaceutycznego według wynalazku pozwala na powstrzymanie rozwoju retro wirusowych szczepów opornych na inhibitor retrowirusowej proteazy.

Środek farmaceutyczny według wynalazku podaje się ssakowi, takiemu jak człowiek, małpa, kot i tym podobne, w postaci preparatu zawierającego skuteczną ilość, co najmniej dwu inhibitorów retrowirusowej proteazy. Podawanie może być jednoczesnym podawaniem co najmniej dwu inhibitorów retrowirusowej proteazy, to jest, podawanie dwu lub więcej inhibitorów retrowirusowej proteazy w taki sposób, że w dowolnym czasie w ssaku zawarta jest skuteczna ilość co najmniej dwu inhibitorów. Alternatywnie, podawanie może być kolejnym lub przemień

180 070 nym podawaniem co najmniej dwu inhibitorów retrowirusowej proteazy, to jest podawaniem dwu lub więcej inhibitorów retrowirusowej proteazy w taki sposób, że w dowolnym czasie w ssaku zawarta jest skuteczna ilość tylko jednego inhibitora. Przy właściwym doborze inhibitorów retrowirusowej proteazy, sposób ten pozwala skutecznie hamować propagacj ę retro wirusa nawet w obecności szczepów opornych na dowolny z inhibitorów.

Retrowirusowe inhibitory proteazy dobiera się w oparciu o profil opornych szczepów retrowirusa powstających in vivo lub in vitro po wystawieniu inhibitora na działanie rozwijającej się kultury retrowirusów. Inhibitory retrowirusowej proteazy dobiera się pod względem braku krzyżowej oporności na co najmniej jeden retrowirusowy oporny szczep. Retrowirusowy szczep uważa się za krzyżowo opomy na dwa inhibitory proteazy, gdy retrowirusowy szczep jest oporny na oba inhibitory. Chociaż można tolerować pewną oporność krzyżową, korzystnie, występuje brak oporności krzyżowej pomiędzy wybranymi inhibitorami retrowirusowej proteazy wziętymi jako grupa. Tak więc wariant (lub szczep mutantowy) retro wirusa, jaki może rozwinąć się w wyniku wystawienia na działanie pierwszego inhibitora retrowirusowej proteazy, powinien być nadal inhibitowany przez drugi inhibitor retrowirusowej proteazy, lub taki, który może rozwinąć się w wyniku wystawienia na działanie pierwszego i drugiego inhibitora retrowirusowej proteazy powinien być nadal inhibitowany przez trzeci inhibitor retrowirusowej proteazy lub czwarty inhibitor retrowirusowej proteazy i tak dalej.

Wykonuje się porównanie profilów oporności krzyżowej pomiędzy różnymi inhibitorami proteazy i związki dobiera się do kombinowanego leczenia w taki sposób, że korzystnie wykazują niewielką lub żadną oporność krzyżową. Fenotyp oporności na lek można podzielić na brak oporności, niewielką oporność (mniej niż około 10-krotne przesunięcie EC₅₀ lub EC₉₀), pośrednią oporność (około 10 do około 100-krotne przesunięcie EC₅₀ lub EC₉₀) lub wysoką oporność (powyżej około 100-krotnego przesunięcia EC₅₀ lub EC₉₀). Należy się spodziewać, że oporność na lek będzie korelowała ze zredukowanym wpływem na populację wirusa w pacjencie, gdy osiągalne in vivo stężenia inhibitorów dają zmniejszoną inhibicję proteazy opornego wirusa. Tak więc korzystniejsza kombinacja inhibitorów proteazy będzie kombinacją wykazującą minimalne profile oporności krzyżowej (to jest, korzystnie, nie więcej niż pośrednią oporność, korzystniej, nie więcej niż niską oporność; i najkorzystniej, brak oporności) i maksymalną wewnętrzną zdolność wobec dzikich i/lub opornych wirusów wybranych ze względu na inny inhibitor. Np., korzy stne związki do stosowania w połączeniu z pierwszym związkiem będą korzystnie skuteczne wobec szczepów wirusa na poziomie pośrednim, korzystniej wysokim, oporności na pierwszy związek. Farmakologia i toksykologia każdego inhibitora i kombinacji jest także czynnikiem w dobieraniu inhibitorów do kombinowanego leczenia.

Korzystniej, wypiera się takie inhibitory retrowirusowej proteazy, że co najmniej jeden wirusowy szczep opomy na pierwszy inhibitor retrowirusowej proteazy i co najmniej j eden wirusowy szczep opomy na drugi inhibitor retrowirusowej proteazy ma różne aminokwasowe podstawienia w sekwencji proteazy wpływające na ten sam region miejsca wiązania z podłożem proteazy i daje wkład do obserwowanej oporności wobec inhibitora. Tak więc liczba możliwych podstawień aminokwasowych, która może zajść w tym samym miejscu w proteazie, jest ograniczona. Jest to szczególnie prawdziwe, gdy miejsce to jest krytyczne ze względu na aktywność, skuteczność i/lub trwałość enzymu.

Przypadek taki zaobserwowano w związku z inhibitorami proteazy HFV z przykładów 1 i 2 poniżej. Retrowirusowa oporność na związek z przykłądu 1 wynikała z mutacji miejsca na aminokwasie 88 proteazy HIV (podstawienie asparaginy 88 kwasem aspartowym 88). Retro wirusowa oporność na związek z przykładu 2 także wynikała z mutacji miejsca na aminokwasie 88 proteazy HIV (podstawienie asparaginy 88 seryną 88). Pewne podstawienia na aminokwasie 88 są znane z powodowania utraty aktywności enzymu (Loeb i in., Naturę 340:387-400 (1989)). Tak więc podawanie obu inhibitorów proteazy HIV w przykładów 1 i 2 znacząco zmniejsza prawdopodobieństwo następnego udanego wytworzenia opornego szczepu wirusa krzyżowo opornego na oba inhibitory. W czasie 6 tygodni leczenia wykryto brak oporności na oba inhibitory użyte w kombinacji, w porównaniu z pojawieniem się opornego fenotypu na pojedynczy inhibi

180 070 tor w tym samym czasie. Poza mutacjami miejsca wpływającymi na aktywność enzymu, mogą zajść inne mutacje miejsca w tym samym wariancie nie wpływające znacząco na aktywność enzymu i/lub oporność.

Alternatywnie, korzystniej, inhibitory retro wirusowej proteazy dobiera się tak, że co najmniej jeden wirusowy szczep oporny na pierwszy inhibitor retro wirusowej proteazy ma zwiększoną wrażliwość na drugi inhibitor proteazy, lub co najmniej jeden wirusowy szczep oporny na drugi inhibitor retrowirusowej proteazy ma zwiększoną wrażliwość na pierwszy inhibitor proteazy.

Reprezentatywne inhibitory retrowirusowej proteazy przydatne do stosowania w niniejszym sposobie obejmują między innymi inhibitory proteazy ujawnione i opisane we wspólnych zgłoszeniach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o nr kolejnych 08/152934 (złożone 17 listopada 1993), 08/253531 (złożone 3 czerwca 1994), 08/109787 (złożone 20 sierpnia 1993), 08/110911 (złożone 24 sierpnia 1993), 08/110913 (złożone 24 sierpnia 1993), 08/110912 (złożone 24 sierpnia 1993), 08/204827 (złożone 2 marca 1994), 07/886556 (złożone 20 maja 1992), 07/886663 (złożone 20 maja 1992), 07/886531 (złożone 20 maja 1992), 08/148817 (złożone 8 listopada 1993), 08/886700 (złożone 21 maja 1992) i 07/998187 (złożone 29 grudnia 1992) oraz zgłoszeniach patentowych PCT o nr PCT/US93/10552 (złożone 29 października 1993), PCT/US93/10460 (złożone 29 października 1993) i PCT/US93/10461 (złożone 29 października 1993), dołączanych niniejszym w całości jako odnośniki literaturowe. Dodatkowe inhibitory retrowirusowej proteazy, przydatne do stosowania w niniejszym sposobie, obejmują między innymi inhibitory proteazy ujawnione i opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5157041; europejskim opisie patentowym nr 346847; zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr kolejny 07/883825 (złożone 15 maja 1992); publikacji WO 93/09096; Tet. Lett. 35:673-676 (1994); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4096-4100 (1994); Y. N. Wong i in., Biopharm. & Drug Dispos. 15:535-544 (1994); M.L. West i D. P. Fairlie, Trends Pharmacol. Sci. 16:67-75 (1995); i S. Thaisrivongs, „HIV Protease Inhibitors”, Ann. Reports Med. Chem., tom 29, rozdz. 14, str. 133-144 (1994) (wyd. Academic Press, J. Bristol), dołączanych niniejszym w całości jako odnośniki literaturowe.

Bez dalszych rozważań sądzi się, że specjalista może, stosując powyższy opis, wykorzystać niniejszy wynalazek w najpełniejszym jego zakresie. Poniższe korzystne specyficzne odmiany nie majątworzyć wyczerpującego opisu wszystkich możliwych kombinacji związku, lecz być przykładami kombinacji leków uważanych za skuteczne. Podobne testy tych i innych inhibitorów proteazy z zastosowaniem opornych wirusowych izolatów, nie ograniczone do wymienionych powyżej, mogąpomóc zidentyfikować przydatne kombinacje leków. Dlatego też poniższe korzystne specyficzne odmiany są tylko ilustracją i nie ograniczająw żaden sposób reszty opisu.

Przykład 1

[1S-[1R*(R*), 2S*]]-N^ł-[3-[[[l,l-dimetyloetylo)amino]-karbonylo)2-metylopropylo)amino]-2-hydroksy-1 -(fenylometylo)propylo]-2-[(2-chinolinylokarbonylo)amino]butanodiamid można wytworzyć zgodnie ze sposobami ujawnionymi we wspólnych zgłoszeniach patentowych Stanów Zjedno

180 070 czonych Ameryki nr kolejny 08/152934 (złożone 15 listopada 1993) i 08/156498 (złożone 23 listopada 1993), dołączanych niniejszym w całości jako odnośniki literaturowe.

Przykład 2

(2R,3S)-3-(N-metyloaminoacetylo-L-t-butyloglicynylo)amino-l-(N-izoamylo-N-(t-butylokarbamoilo))amino-4-fenylo-2-butanol można wytworzyć zgodnie ze sposobami ujawnionymi we wspólnych zgłoszeniach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr kolejny 08/109787 (złożone 20 sierpnia 1993), nr sprawy 2766/1, złożone wspólnie z niniejszym, i 08/156,498 (złożone 23 listopada 1993, dołączanych niniejszym w całości jako odnośniki literaturowe.

Przykład 3

OCHEster 5-pyrimidylometylowy kwasu [2R-hydroksy-3-[((4-metoksyfenylo)sulfonylo](2-metylopropylo)amino]-l S-(fenylometylo)propyio]karbamowego można wytworzyć zgodnie ze sposobami ujawnionymi we wspólnych zgłoszeniach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr kolejny 08/110911 (złożone 24 sierpnia 1993) i 08/156498 (złożone 23 listopada 1993), dołączanych niniejszym w całości jako odnośniki literaturowe.

Przykład 4

OCH₃

180 070

[1S-[1R*(R*), 2S*)]-N-[2-hydroksy-3-(N^,-(2-metylopropylo)-N¹-(4-metoksyfenylosulfonylo)amino]-l -(fenylometylo)propylo]-2-metylo-3-(metylosulfonylo)propanamid można wytworzyć zgodnie ze sposobami ujawnionymi we wspólnych zgłoszeniach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr kolejny 08/110913 (złożone 24 sierpnia 1993) i 08/156498 (złożone 23 listopada 1993), dołączanych niniejszym w całości jako odnośniki literaturowe.

Przykład 5

N-(2(R)-Hydroksy-1 (S)-indany lo)-2(R)-feny lornety lo-4(S)-hydroksy-5-(1 -(4-(3 -pirydy lornety lo)-2(S)-N'-(t-butylokarboksyamido)-piperazynylo))-pentanamid (L-735524) można wytworzyć zgodnie ze sposobami ujawnionymi w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr kolejny 07/883,825 (złożone 15 maja 1992), publikacji WO 93/09096, Tet. Lett. 35:673:676 (1994) i Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4096-4100 (1994), dołączanych niniejszym w całości jako odnośniki literaturowe.

N-t-butylo-dekahydro-2-[2(R)-hydroksy-4-fenylo-3(S)-([N-(2-chinolilokarbonylo)-L-asparaginylo]amino]butylo]-(4aR, 8aS)- izochinolino-3(S)-karboksyamid (Ro 31-8959) można wytworzyć zgodnie ze sposobami ujawnionymi w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5157041, dołączanym w całości jako odnośnik literaturowy.

180 070

[1S-[1R*(R*), 2S‘]]-N¹-[3-[[((l,l-dimetyloetylo)amino)-karbonylo](3-metylobutylo)amino]-2-hydroksy-l-(fenylometylo)-propylo]-2-[(2-chinolinylokarbonylo)amino)butanodiamid można wytworzyć zgodnie ze sposobami ujawnionymi we wspólnych zgłoszeniach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr kolejny 08/152934 (złożone 15 listopada 1993) i 08/156498 (złożone 23 listopada 1993), dołączanych niniejszym w całości jako odnośniki literaturowe.

O

N- [3 - [N²- [N¹ -(1,1 -dimety loety lo)aminosulfony lo]-N²-(2-metylopropy lo)amino] -2R-hydroksy-1 S-(fenylometylo)propylo]-2S-[(2-chinolinylokarbonylo)amino]butanodiamid można wytworzyć zgodnie ze sposobami ujawnionymi we wspólnych zgłoszeniach patentowych PCT nr PCT/US93/10552 (złożone 29 października 1993) i zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr kolejny 08/156498 (złożone 23 listopada 1993), dołączanych niniejszym w całości jako odnośniki literaturowe.

(2S,3R,4S,5S)-2,5-bis-[N-[N-[[N-metylo-N-(2-pirydynylometylo)amino]karbonylo]walinylo]amino]-3,4-dihydroksy-l,6-difenyloheksan (A-77003) można wytworzyć zgodnie ze sposobami ujawnionymi w J. Med. Chem. 36:320-330 (1993), dołączanym w całości jako odnośnik literaturowy.

Przykład 10

180 070 (2S,3S,5S)-5-[N-[N-[N-metylo-N-[(2-izopropylo-4-tiazolilo)metylo]amino]karbonylo]walinylo]amino]-2-[N-[(5-tiazolilo)metoksykarbonylo]amino]-3-hydroksy-l,6-difenyloheksan (A-84538, ABT-538) można wytworzyć zgodnie ze sposobami ujawnionymi w zgłoszeniu patentowym PCT nr kolejny WO 94/14436 (złożone 16 grudnia 1993), dołączanym niniejszym w całości jako odnośnik literaturowy.

Ester 3S-tetrahydrofuranylowy kwasu [2R-hydroksy-3-[[(4-aminofenylo)sulfonylo] (2-metylopropylo)amino]-lS-(fenylometylo)propylo]karbamowego (VX-478) można wytworzyć zgodnie ze sposobami ujawnionymi w zgłoszeniu patetnowym PCT nr kolejny WO 94/05639 (złożone 7 września 1993), dołączanym niniejszym w całości jako odnośnik literaturowy.

Przykład 12

HO

N-t-butylo-dekahydro-2-[2(R)-hydroksy-4-(fenylotio)-3(S)[[N-[(2-metylo-3-hydroksyfenylo)karbonylo]amino]butylo]-(4a R, 8aS)-izochinolino-3(S)-karboksyamid (AG-1343, AG-1350) można wytworzyć zgodnie ze sposobami ujawnionymi w Bioorg. & Med. Chem. Let. 5:715-720,5:721-726 i 5:727-732 (1995), dołączanych niniejszym w całości jako odnośniki literaturowe. W szczególności, aktywny ester HOBT kwasu 3-hydroksy-2-metylobenzoesowego (Bioorg. & Med. Chem. Let. 5:727-732 (1995)) można sprzęgać z N-t-butylo-dekahydro-2-[2(R)-hydroksy-4-(fenylotio)-3(S)-aminobutylo]-(4aR, 8aS)-izochinolino-3(S)-karboksyamidem (Bioorg. & Med. Chem. Let. 5:715-720 (1995)).

Przykład 13

180 070 (4R-(4a, 5α, 6β, 7P)]-l,3-bis[(3-aminofenylo)metylo]-heksahydro-5,6-dihydroksy-4,7-bis(fenylometylo)-2H-l,3-diazepin-2-on (DMP-450, ΧΜ-412) można wytworzyć zgodnie ze sposobami ujawnionymi w zgłoszeniu patentowym PCT nr WO 93/07128, dołączanym niniejszym w całości jako odnośnik literaturowy. W szczególności, halogenek 3-nitrofenylornetylu, taki jak chlorek lub bromek 3-nitrofenylornetylu, poddaje się reakcji z hydroksyzabezpieczonąpochodną[4R-(4oc, 5α, 6β, 7β)]-heksahydro-5,6-dihydroksy-4,7-bis(fenylometylo)-2H-l,3-diazepin-2-onem, następnie odbezpiecza grupy hydroksylowe (patrz publikacja WO 93/07128) i redukuje grupy nitrowe do aminowych. Taką redukcję można prowadzić stosując standardowe procedury znane dobrze specjalistom.

Przykład 14

Wytwarzanie N-[2R-hydroksy-3-[[l ,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo] (2-metyłopropylo)amino]-lS-(fenylometylo)propylo]-2S-[[(pirolidyn-l-ylo)acetylo]amino]-3,3-dimetylobutanamid

Część A: Wytwarzanie chlorku l,3-benzodioksolo-5-sulfonylu

Do roztworu 4,25 g bezwodnego Ν,Ν-dimetyloformamidu w temperaturze 0°C w atmosferze azotu dodano 7,84 g chlorku sulfurylu, przy czym utworzyło się ciało stałe. Po wymieszaniu przez 15 minut, dodano 6,45 g 1,3-benzodioksolu i mieszaninę ogrzewano w temperaturze 100°C przez 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono, wylano na wodę z lodem, ekstrahowano chlorkiem metylenu, osuszono nad siarczanem magnezu, przesączono i zatężono z wytworzeniem 7,32 g surowej substancji jako czarnego oleju. Poddano go chromatografii na żelu krzemionkowym z zastosowaniem 20% chlorku metylenu/heksanu z wytworzeniem 1,9 g chlorku (1,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylu.

Alternatywnie, do 22-litrowej kolby okrągłodennej z mieszadłem mechanicznym, skraplaczem, płaszczem grzejnym i wkraplaczem z wyrównaniem ciśnienia dodano kompleks trójtlenek siarki/DMF (2778 g, 18,1 mol). Następnie dodano dichloroetan (41) i rozpoczęto mieszanie. Z kolei dodano przez wkraplacz 1,3-benzodioksol (1905 g, 15,6 mol) w czasie 5 minut. Temperaturę następnie podniesiono do 75°C i utrzymywano przez 22 godziny (NMR wskazał, że mieszanina reakcyjna przereagowała po 9 godzinach). Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 26° i dodano chlorek oksalilu (2290 g, 18,1 mol) z natężeniem takim, aby zachować temperaturę poniżej 40°C (1,5 godziny). Mieszaninę ogrzano do 67°C przez 5 godzin i ochłodzono do 16°C na łaźni lodowej. Mieszaninę reakcyjną zalano wodą (51) z natężeniem utrzymującym temperaturę poniżej 20°C. Po dodaniu wody mieszaninę mieszano przez 10 minut. Warstwy oddzielono i warstwę organiczną przemyto ponownie dwukrotnie wodą (5 1). Warstwę organiczną osuszono siarczanem magnezu (500 g) i przesączono w celu usunięcia środka suszącego. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniej szonym ciśnieniem w temperaturze 50°C. Powstałąciepłąciecz pozostawiono do ochłodzenia, po czym zaczęło się wytrącać ciało stałe. Po godzinie ciało stałe przemyto heksanem (400 ml), przesączono i osuszono z wytworzeniem żądanego chlorku sulfonylu (2823 g). Heksan płuczący zatężono i powstałe ciało stałe przemyto 400 ml heksanu z wytworzeniem dodatkowego chlorku sulfonylu (464 g). Całkowita wydajność wynosiła 3287 g (95,5% w przeliczeniu na 1,3-benzodioksol).

180 070

Część B: Wytwarzanie 2S-[bis(fenylometylo)amino]-3-fenylopropanolu

Sposób 1: 2S-[Bis(fenylometylo)amino]-3-fenylopropanol z redukcji DIBAL estru fenylometylowego N,N-bis(fenylometylo)-L-fenyloalaniny

Etap 1: Roztwór L-fenyloalaniny (50,0 g, 0,302 mol), wodorotlenek sodu (24,2 g, 0,605 mol) i węglan potasu (83,6 g, 0,605 mol) w wodzie (500 ml) ogrzewano do 97°C. Następnie powoli dodano bromek benzylu (108,5 ml, 0,605 mol) (czas dodawania - 25 minut). Mieszaninę mieszano w temperaturze 97°C przez 3 0 minut w atmosferze azotu. Roztwór ochłodzono do temperatury pokojowej i ekstrahowano toluenem (2 x 250 ml). Połączone warstwy organiczne przemyto wodąi solanką, osuszono nad siarczanem magnezu, przesączono i zatężono do oleju. Ester fenylometylowy N,N-bis(fenylometylo)-L-fenyloalaniny można oczyszczać metodą chromatografii kolumnowej (żel krzemionkowy, 15% octan etylu/heksan). Zwykle produkt jest na tyle czysty, aby stosować go bezpośrednio w następnym etapie bez dalszego oczyszczania. EIMS: m/z434(M-l).

Etap 2: Benzylowany ester fenylometylowy fenyloalaniny (0,302 mol) z poprzedniej reakcji rozpuszczono w toluenie (750 ml) i ochłodzono do -55°C. Dodano 1,5 M roztwór DIBAL w toluenie (443,9 ml, 0,666 mol) z natężeniem pozwalającym zachować temperaturę pomiędzy -55 i -50°C (czas dodawania - 1 godzina). Mieszaninę mieszano przez 20 minut w atmosferze azotu i następnie zatrzymano w temperaturze -55°C powolnym dodawaniem metanolu (37 ml). Zimny roztwór wylano następnie do zimnego (5°C) 1,5 N roztworu HC1 (1,81). Wytrącone ciało stałe (około 138 g) odsączono i przemyto toluenem. Stały materiał umieszczono w zawiesinie w mieszaninie toluenu (400 ml) i wody (100 ml). Mieszaninę ochłodzono do 5 °C i potraktowano 2,5 N NaOH (186 ml) i następnie mieszano w temperaturze pokojowej do rozpuszczenia ciała stałego. Warstwę toluenową oddzielono od fazy wodnej i przemyto wodąi solanką, osuszono nad siarczanem magnezu, przesączono i zatężono do objętości 75 ml (89 g). Do pozostałości dodano octan etylu (25 ml) i heksan (25 ml), przy czym zaczął krystalizować żądany alkohol. Po 30 minutach dodano jeszcze 50 ml heksanu dla ułatwienia dalszej krystalizacji. Ciało stałe odsączono i przemyto 50 ml heksanu z wytworzeniem 34,9 g pierwszego rzutu produktu. Drugi rzut produktu (5,6 g) wydzielono przefiltrowując ciecz macierzystą. Dwa rzuty połączono i rekrystalizowano z octanu etylu (20 ml) i heksanu (30 ml) z wytworzeniem 40 g 2S-[bis(fenylometylo)amino)-3-fenylopropanolu, 40% wydajność z L-fenyloalaniny.

Anal. obliczone dla C₂₃H₂₅ON:

C, 83,34; H, 7,60; N,4,23.

Znalezione: C, 83,43; H, 7,59; N,4,22.

Sposób 2: Wytwarzanie pS-2-[bis(fenylometylo)amino]-benzeno-propanolu przez N,N-dibenzylowanie L-fenyloalaninolu

L-fenyloalaninol (176,6 g, 1,168 mol) dodano do mieszanego roztworu węglanu potasu (484,6 g, 3,506 mol) w 710 ml wody. Mieszaninę ogrzewano do 65°C w atmosferze azotu. Dodano roztwór bromku benzylu (400 g, 2,339 mol) w etanolu 3A (305 ml) z natężeniem pozwalającym na utrzymanie temperatury pomiędzy 60-68°C. Dwufazowy roztwór mieszano w temperaturze 65°C przez 55 minut i następnie pozostawiono do ochłodzenia do 10°C z energicznym mieszaniem. Oleisty produkt zestalił się w małe granulki. Produkt rozcieńczono 2,01 wody wodociągowej i mieszano przez 5 minut w celu rozpuszczenia nieorganicznych produktów ubocznych. Produkt odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem i przemyto wodą do pH 7. Otrzymany surowy produkt rekrystalizowano z 1,11 octanu etylu/heptanu (1:10). Produkt odsączono (w temperaturze -8°C), przemyto 1,6 1 zimnego (-10°C) octanu etylu/heptanu (1:10) i osuszono na powietrzu z wytworzeniem 339 g (88% wydajności) 2S-[bis(fenylometylo)amino]-3-fenylopropanolu, temperatura topnienia = 71,5- 73,0°C.

Część C: Wytwarzanie 2S-[bis(fenylometylo)amino]-3-fenylopropanaldehydu

Sposób 1: 2S-[bis(fenylometylo)amino)-3-fenylopropanol (200 g, 0,604 mol) rozpuszczono w trietyloaminie (300 ml, 2,15 mol). Mieszaninę ochłodzono do 12°C i dodano roztwór kompleksu trójtlenek siarki/pirydyna (380 g, 2,39 mol) w DMSO (1,6 1) z natężeniem pozwalającym zachować temperaturę pomiędzy 8-17°C. Roztwór mieszano w temperaturze otoczenia w atmos

180 070 ferze azotu przez 1,5 godziny. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono wodą z lodem i zalano 1,61 zimnej wody (10-15°C) w czasie 45 minut. Powstały roztwór ekstrahowano octanem etylu (2,01), przemyto 5% kwasem cytrynowym (2,0 1) i solanką (2,2 1), osuszono nad MgSO₄ (280 g) i przesączono. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem 198,8 g 2S-[bis-(fenylometylo)amino]-3-fenylopropanaldehydu jako bladożółtego oleju (99,9%). Otrzymany surowy produkt był na tyle czysty, aby go zastosować bezpośrednio w następnym etapie bez oczyszczania.

Sposób 2: Roztwór chlorku oksalilu (8,4 ml, 0,096 mol) w dichlorometanie (240 ml) ochłodzono do -74°C. Następnie powoli dodano roztwór DMSO (12,0 ml, 0,155 mol) w dichlorometanie (50 ml) z natężeniem pozwalającym zachować temperaturę -74°C (czas dodawania ~1,25 godziny). Mieszaninę mieszano przez 5 minut i dodano roztwór 2S[bis(fenylometylo)amino]-3-fenylopropanolu (0,074 mol) w 100 ml dichlorometanu (czas dodawania -20 min., temp. -75°C do -68°C). Roztwór mieszano w temperaturze -78°C przez 35 minut w atmosferze azotu. Następnie dodano trietyloaminę (41,2 ml, 0,295 mol) w czasie 10 min. (temp. -78 do -68°C), przy czym wytrąciła się sól amonowa. Zimną mieszaninę mieszano przez 30 min. i następnie dodano wodę (225 ml). Warstwę dichlorometanu oddzielono od fazy wodnej i przemyto wodą, solanką, osuszono nad siarczanem magnezu, przesączono i zatężono. Pozostałość rozcieńczono octanem etylu i heksanem i następnie przesączono w celu usunięcia soli amonowej. Przesącz zatężono z wytworzeniem 2S-[bis(fenylometylo)amino]-3-fenylopropanaldehydu. Aldehyd przeniesiono do następnego etapu bez oczyszczania.

Sposób 3: Do mieszaniny 1,0 g (3,0 mmol) 2S-[bis(fenylometylo)amino]-3-fenylopropanolu, 0,531 g (4,53 mmol) N-metylomorfoliny, 2,27 g sit molekularnych (4A) i 9,1 ml acetonitrylu dodano 53 mg (0,15 mmol) nadrutenianu tetrapropylamoniowego (TPAP). Mieszaninę mieszano przez 40 minut w temperaturze pokojowej i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość umieszczono w zawiesinie w 15 ml octanu etylu, przesączono przez warstwę żelu krzemionkowego. Przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem produktu zawierającego około 50% 2S-[bis(fenylometylo)amino]-3-fenylopropanaldehydu jako bladożółtego oleju.

Sposób 4: Do roztworu 1,0 g (3,02 mmol) 2S[bis(fenylometylo)amino]-3-fenylopropanolu w 9,0 ml toluenu dodano 4,69 mg (0,03 mmol) 2,2,6,6-tetrametylo-l-piperidynyloksylu, wolnego rodnika (TEMPO), 0,32 g (3,11 mmol) bromku sodu, 9,0 ml octanu etylu i 1,5 ml wody. Mieszaninę ochłodzono do 0°C i dodano powoli roztwór wodny 2,87 ml 5% wybielacza gospodarczego zawierającego 0,735 g (8,75 mmol) wodorowęglanu sodu i 8,53 ml wody w czasie 25 minut. Mieszaninę mieszano w temperaturze 0°C przez 60 minut. Dodano jeszcze dwukrotnie (po 1,44 ml) wybielacza i mieszano przez 10 minut. Warstwę wodną ekstrahowano dwukrotnie 20 ml octanu etylu. Połączoną warstwę organiczną przemyto 4,0 ml roztworu zawierającego 25 mg jodku potasu i wodę (4,0 ml), 20 ml 10% wodnego roztworu tiosiarczanu sodu i następnie solanką. Organiczny roztwór osuszono nad siarczanem magnezu, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem 1,34 g surowego oleju zawierającego małą ilość żądanego produktu, 2S-[bis(fenylometylo)amino]-3-fenylopropanaldehydu.

Część D: WytwarzanieN,N-dibenzylo-3(S)-amino-l,2-(S)-epoksy-4-fenylobutanu

Sposób 1: Roztwór 2S-[bis(fenylometylo)amino]-3-fenylopropanaldehydu (191,7 g, 0,58 mol) i chlorojodometanu (56,4 ml, 0,77 mol) w tetrahydrofuranie (1,81) ochłodzono od -30 do -35°C w stalowym nierdzewnym reaktorze w atmosferze azotu. Następnie dodano roztwór n-butylolitu w heksanie (1,6 M, 365 ml, 0,58 mol) z natężeniem pozwalającym na utrzymanie temperatury poniżej -25°C. Po dodaniu mieszaninę mieszano w temperaturze -30 do -3 5°C przez 10 minut. Dodawano jeszcze reagenty w następujący sposób: (1) dodano dodatkowy chlorojodometan (17 ml), następnie n-butylolit (110 ml) w temperaturze <-25°C. Po dodaniu mieszaninę mieszano w temperaturze -30 do -35°C przez 10 minut. Powtórzono to jednokrotnie. (2) Dodano dodatkowy chlorojodometan(8,5 ml, 0,11 mol), następnie n-butylolit (55 ml, 0,088 mol) wtemperaturze<-25°C. Po dodaniu mieszaninę mieszano w temperaturze -30 do -35°C przez 10 minut. Powtórzono to 5-krotnie. (3) Dodano dodatkowy chlorojodometan (8,5 ml, 0,11 mol) dodano,

180 070 następnie n-butylolit (37 ml, 0,059 mol) w temperaturze <-25°C. Po dodaniu mieszaninę mieszano w temperaturze -30 do -35°C przez 10 minut. Powtórzono to jednokrotnie. Zewnętrzne chłodzenie wyłączono i mieszaninę ogrzewano do temperatury otoczenia przez 4 do 16 godzin, gdy to TLC (żel krzemionkowy, 20% octanu etylu/heksan) wskazała, że reakcja zakończyła się. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 10°C i zalano 1452 g 16% roztworu chlorku amonu utrzymując temperaturę poniżej 23°C. Mieszaninę mieszano przez 20 minut i warstwę organiczną i wodną oddzielono. Fazę wodną ekstrahowano octanem etylu (2x 500 ml). Warstwę octanu etylu połączono z tetrahydrofuranową. Połączone roztwory osuszono nad siarczanem magnezu (220 g), przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość brunatnego oleju suszono w temperaturze 70°C pod zmniejszonym ciśnieniem 8 x 10⁴ Pa przez 1 godzinę z wytworzeniem 222,8 g surowej substancji. Surowy produkt stosuje się zwykle bezpośrednio w następnym etapie bez oczyszczania.

Sposób 2: Roztwór 0,074 mol surowego aldehydu i chlorojodometan (7,0 ml, 0,096 mol) w tetrahydrofuranie (285 ml) ochłodzono do -78°Ć, w atmosferze azotu. Następnie dodano 1,6 M roztwór n-butylolitu w heksanie (25 ml, 0,040 mol) z natężeniem pozwalającym zachować temperaturę -75°C. Po pierwszym dodawaniu, dodano ponownie dodatkowy chlorojodometan (1,6 ml, 0,022 mol), a następnie n-butylolit (23 ml, 0,037 mol), utrzymując temperaturę -75°C. Mieszaninę mieszano przez 15 min. każdy z reagentów, chlorojodometan (0,70 ml, 0,010 mol) i n-butylolit (5 ml, 0,008 mol) dodano jeszcze 4 razy w czasie 45 min. w temperaturze -75°C. łaźnię chłodzącą usunięto następnie i roztwór ogrzano do 22°C w czasie 1,5 godziny. Mieszaninę wylano do 300 ml nasyconego wodnego roztworu chlorku amonu. Warstwę tetrahydrofuranową oddzielono. Fazę wodną ekstrahowano octanem etylu (1 x 300 ml). Połączone warstwy organiczne przemyto solanką osuszoną nad siarczanem magnezu, przesączono i zatężono z wytworzeniem brunatnego oleju (27,4 g). Produkt można było stosować w następnym etapie bez oczyszczania.

Sposób 3: Roztwór 2S-[bis(fenylometylo)amino)-3-fenylopropanaldehydu (178,84 g, 0,54 mol) i bromochlorometanu (46 ml, 0,71 mol) w tetrahydrofbranie (1,81) ochłodzono od -3 0 do -35°C w stalowym nierdzewnym reaktorze w atmosferze azotu. Następnie dodano roztwór n-butylolitu w heksanie (1,6 M, 340 ml, 0,54 mol) z natężeniem pozwalającym na utrzymanie temperatury poniżej -25°C. Po dodaniu mieszaninę mieszano w temperaturze - 30 do -35°C przez 10 minut. Dodano jeszcze reagentów w następujący sposób: (1) dodano dodatkowy bromochlorometan (14 ml), następnie n-butylolit (102 ml) w temperaturze <-25°C. Po dodaniu mieszaninę mieszano w temperaturze -30 do -35°C przez 10 minut. Powtórzono to raz. (2) Dodano dodatkowy bromochlorometan (7 ml, 0,11 mol), następnie n-butylolit (51 ml, 0,082 mol) w temperaturze <-25°C. Po dodaniu mieszaninę mieszano w temperaturze -30 do -35°C przez 10 minut. Powtórzono to 5 razy. (3) Dodano dodatkowy bromochlorometan (7 ml, 0,11 mol), następnie n-butylolit (51 ml, 0,082 mol) w temperaturze <-25°C. Po dodaniu mieszaninę mieszano w temperaturze -30 do -35°C przez 10 minut. Powtórzono to raz. Usunięto zewnętrzne chłodzenie i mieszaninę ogrzano do temperatury otoczenia w czasie 4 do 16 godzin, kiedy to TLC (żel krzemionkowy, 20% octan etylu/heksan) wskazała, że reakcja zakończyła się. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 10°C i zalano 1452 g roztworu 16% chlorku amonu, utrzymując temperaturę poniżej 23°C. Mieszaninę mieszano przez 10 minut i warstwę organiczną! wodnąoddzielono. Fazę wodną ekstrahowano octanem etylu (2x 500 ml). Warstwę octanu etylu połączono z tetrahydrofuranową. Połączony roztwór osuszono nad siarczanem magnezu (220 g), przesączono i zatężono na wyparce obrotowej w temperaturze 65°C. Brunatną olejową pozostałość suszono w temperaturze 70°C pod zmniejszonym ciśnieniem 8 χ 10⁴ Pa przez 1 godzinę z wytworzeniem 222,8 g surowej substancji.

Część E: Wytwarzanie soli kwasu szczawiowego z N-[3(S)-[N,N-bis(fenylometylo)amino]-2(R)-hydroksy-4-fenylobutylo]-N-izobutylaminą

Etap 1: Do roztworu surowego N,N-dibenzylo-3(S)-amino-l,2(S)-epoksy-4-fenylobutanu (388,5 g, 1,13 mol) w izopropanolu (2,71) (lub octanie etylu) dodano izobutyloaminę (1,7 kg, 23,1 mol) w czasie 2 min. Temperatura wzrosła od 25°C do 30°C. Roztwór ogrzano do 82°C i

180 070 mieszano w tej temperaturze przez 1,5 godziny. Ciepły roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Brunatnąolejowąpozostałość suszono pod zmniejszonym ciśnieniem 1,06 χ 10² Pa przez 10 godzin z wytworzeniem 450 g produktu jako surowego oleju.

Etap 2: Do roztworu kwasu szczawiowego (8,08 g, 89,72 mmol) w metanolu (76 ml) dodano roztwór surowego 3(S)-[N,N-bis(fenylometylo)amino)-l-(2-metylopropylo)amino-4-fenylobutan-2(R)-olu w octanie etylu (90 ml) w czasie 15 minut. Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez około 2 godziny. Ciało stałe odsączono, przemyto octanem etylu (2x 20 ml) i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem przez około 1 godzinę z wytworzeniem 21,86 g 97% diastereomerycznie czystej soli. Temperatura topnienia = 174,99°C;

Mikroanaliza: Obliczone: C 71,05%, H 7,50%, N 5,53%;

Znalezione: C 71,71%, H 7,75%, N 5,39%.

Alternatywnie, surowy 3(S)-[N,N-bis(fenylometylo)amino]-l-(2-metylopropylo)amino4-fenylobutan-2(R)-ol (5 g) rozpuszczono w eterze metylo-t-butylowym (MTBE) (10 ml) i dodano kwas szczawiowy (1 g) w metanolu (4 ml). Mieszaninę mieszano przez około 2 godziny. Powstałe ciało stałe przesączono, przemyto zimnym MTBE i osuszono z wytworzeniem 2,1 g białego ciała stałego około 98,9% diastereomerycznie czystego (w oparciu o pola pików HPLC).

Część F: Wytwarzanie l-[N-[(l,3-benzodioksol-5-ilo) sulfonylo)-N-(2-metylopropylo)amino]-3(S)-[N,N-bis(fenylometylo)amino]-4-fenylo-2(R)-butanolu

Do soli kwasu szczawiowego z N-[3(S)-[N,N-bis(fenylometylo)amino]-2(R)-hydroksy-4-fenylobutylo]-N-izobutylaminą (354,7 g, 0,7 mol) w 1,4-dioksanie (2000 ml) dodano roztwór węglanu potasu (241,9 g, 1,75 mol) w wodzie (250 ml). Mieszaninę mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i dodano chlorek l,3-benzodioksolo-5-sulfonylu (162,2 g, 0,735 mol) w 1,4-dioksanie (250 ml) w czasie 15 minut. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Dodano octan etylu (1000 ml) i wodę (500 ml) i mieszano przez kolejną 1 godzinę. Warstwę wodną oddzielono i ekstrahowano octanem etylu (200 ml). Połączone warstwy octanu etylu przemyto 25% roztworem solanki (500 ml) i osuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu i przemyciu siarczanu magnezu octanem etylu (200 ml), rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem żądanego sulfonamidu jako żółtego pienistego oleju o dużej gęstości (440,2 g, 105% wydajności). HPLC/MS (elektronatryskiwanie) (m/z601 [M+H]⁺).

Alternatywnie, sól kwasu szczawiowego z N-[3(S)-[N,N-bis(fenylometylo)amino]-2(R)-hydroksy-4-fenylobutylo]-N-izobutylaminą(2800 g, 5,53 mol) i THF (41) dodano do 22-litrowej kolby okrągłodennej z mieszadłem mechanicznym. Węglan potasu (1921 g, 13,9 mol) rozpuszczono w wodzie (2,8 1) i dodano do zawiesiny w THF. Mieszaninę następnie mieszano przez godzinę. Chlorek l,3-benzodioksolo-5-sulfonylu (1281 g, 5,8 mol) rozpuszczono w THF (1,4L) i dodano do mieszaniny reakcyjnej w czasie 25 minut. Użyto dodatkowe 200 ml THF do przemycia wkraplacza. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 14 godzin i następnie dodano wodę (4 1). Mieszaninę mieszano przez 30 minut i warstwy pozostawiono do rozdzielenia. Warstwy usunięto i warstwę wodną przemyto dwukrotnie THF (500 ml). Połączone warstwy THF suszono siarczanem magnezu (500 g) przez godzinę. Roztwór przesączono następnie w celu usunięcia środka suszącego i użyto w następnych reakcjach.

Część G: Wytwarzanie soli kwasu metanosulfonowego i l-[N-[(l,3-benzodioksol-5-ylo)sulfonylo]-N-(2-metylopropylo)amino]-3(S)-amino-4-fenylo-2(R)butanolu

Surowy 1 -[N-[(l ,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo]-N-(2-metylopropylo)amino]-3(S)-[bis(fenylometylo)arnir»]-4-fenylo-2(R)-butanol (62 g,0,010mol) rozpuszczono w metanolu (40 ml). Następnie dodano do roztworu kwas metanosulfonowy (0,969 g, 0,010 mol) i wodę (5 ml). Mieszaninę umieszczono w 500 ml butli uwodornienia Parra zawierającej 20% Pd(OH)₂ na węglu (255 mg, 50% zawartość wody). Butlę umieszczono w hydrogenatorze i przedmuchano 5-krotnie azotem i 5-krotnie wodorem. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono w temperaturze 35°C pod ciśnieniem wodoru 4,34 χ 10⁵ Pa przez 18 godzin. Dodano dodatkowy katalizator (125 mg) i po przedmuchaniu, uwodornienie kontynuowano przez dodatkowe 20 godzin. Mieszaninę przesączono przez celit, który przemyto metanolem (2x 10 ml). Około jedną trzecią metanolu usunięto pod zmniej

180 070 szonym ciśnieniem. Resztę metanolu usunięto metodą azeotropowej destylacji z toluenem pod ciśnieniem 1,06 x 10⁴Pa. Toluen dodano w porcjach 15,10,10 i 10 ml. Produkt krystalizowano z mieszaniny i przesączono i przemyto dwukrotnie 10 ml porcjami toluenu. Ciało stałe osuszono w temperaturze pokojowej pod ciśnieniem 1,33 χ 10² Pa przez 6 godzin z wytworzeniem soli aminowej (4,5 g, 84%) : m/z 421 [M+H]⁺.

Alternatywnie do roztworu THF surowego l-[N-[(l,3-benzodioksol-5-ylo)sulfonylo]-N-(2-metylopropylo)amino)-3(S)[bis(fenylometylo)amino)-4-fenylo-2(R)-butanolu dodano wodę (500 ml), następnie kwas metanosulfonowy (531 g, 5,5 mol). Roztwór mieszano w celu kompletnego wymieszania i dodano do 5-galonowego autoklawu. Dodano katalizator Pearlmana (200 g 20% Pd(OH)₂ na C/50% wody) do autoklawu w THF (500 ml). Reaktor przepłukano 4x azotem i 4x wodorem. Reaktor napełniono wodorem pod nad ciśnieniem 4,1 x 10⁵ Pa i mieszano z prędkością450 obrotów na minutę. Po 16 godzinach analiza HPLC wskazała, że obecna była mała ilość mono-benzylowego związku pośredniego. Dodano dodatkowy katalizator (50 g) i mieszaninę reakcyjnąpozostawiono do reakcji na noc. Roztwór przesączono następnie przez celit (500 g) w celu usunięcia katalizatora i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem w 5 porcjach. Do każdej porcji, dodano toluen (500 ml) i usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem w celu azeotropowego usunięcia resztkowej wody. Powstałe ciało stałe podzielono na 3 porcje i każdą przemyto eterem metylo-t-butylowym (2 1) i przesączono. Powstały rozpuszczalnik usunięto w temperaturze pokojowej w piecu próżniowym pod ciśnieniem poniżej 1,3 3 χ 10² Pa z wytworzeniem 2714 g oczekiwanej soli.

Cześć H: Wytwarzanie N-[2R-hydroksy-3-[[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo) (2-metylopropylo)amino]-lS-(fenylometylo)propyło]-2S-[(fenylometoksykarbonylo)amino]-3,3-dimetylobutanamidu

Do roztworu of 118,8 g (0,776 mol) N-hydroksybenzotriazolu i 137,1 g (0,52 mol) N-karbobenzyloksykarbonylo-L-t-leucyny w 750 ml bezwodnego DMF w temperaturze 0°C w atmosferze azotu, dodano 109,1 g (0,57 mol) EDC. Po wymieszaniu w temperaturze 0°C przez 2 godziny, dodano roztwór 273 g (0,53 mol) metanosulfonianu 2R-hydroksy-3-[[(l ,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo] (2-metylopropylo)amino)-lS(fenylometylo)propylaminy, zobojętnionej 228 ml (210 g, 2,08 mol) 4-metylomorfoliny, w 250 ml bezwodnego DMF. Po wymieszaniu w temperaturze 0°C przez 30 minut, mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 45°C, dodano 1,5 1 octanu etylu, przemyto 5% kwasem cytrynowym, nasyconym wodorowęglanem sodu, solanką, osuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu, przesączono i zatężono z wytworzeniem 400 g surowej substancji. Poddano go chromatografii w 3 wsadach na urządzeniu Prep 2000 Chromatogram na żelu krzemionkowym z zastosowaniem 20-50% octanu etylu/heksanie jako eluentem z wytworzeniem 320 g oczyszczonego materiału, m/e = 674 (M+Li), 98% metodą HPLC.

Część I: Wytwarzanie N-[2R-hydroksy-3-[[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo) (2-metylopropylo)amino)-lS-(fenylometylo)-propylo]-2S-amino-3,3-dimetylobutanamid

Roztwór 312 g N-(2R-hydroksy-3-[[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo] (2-metylopropylo)amino]-lS-(fenylometylo)propylo)-2S-[(fenylometoksykarbonylo)amino)-3,3-dimetylobutanamidu w 11 tetrahydrofuranu uwodorniano w obecności 100 g katalizatora, 4% palladu na węglu, pod nad ciśnieniem 4,1 χ 10⁵ Pa wodoru przez 6 godzin w temperaturze pokojowej. Katalizator odsączono i rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem 240 g żądanego związku.

Część J: Wytwarzanie N-[2R-hydroksy-3-[[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo] (2-metylopropylo)amino]-lS-(fenylometylo)propylo]-2S-[(chloroacetylo)amino]-3,3-dimetylobutanamidu

Do roztworu 234,3 g (0,439 mol) N-[2R-hydroksy-3-[[(l ,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo] (2-metylopropylo)amino]lS-(fenylometylo)propylo]-2S-amino-3,3-dimetylobutanamidu w 1 1 chlorku metylenu, dodano 80 ml (59,5 g, 0,46 mol) diizopropyloetyloaminy, następnie powoli w temperaturze pokojowej 78,8 g (0,46 mol) bezwodnika chlorooctowego zachowując temperaturę poniżej 35°C. Po wymieszaniu przez dodatkową 1 godzinę, analiza metodą HPLC wskazała

180 070 obecność małej ilości substratu, i dodano 1,5 g bezwodnika chlorooctowego. Po 10 minutach rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, dodano 11 octanu etylu, przemyto 5% kwasem cytrynowym, nasyconym wodorowęglanem sodu, solanką osuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu, przesączono i zatężono z wytworzeniem 314 g surowej substancji. Całość poddano chromatografii w 3 porcjach na urządzeniu Prep 2000 Chromatogram na żelu krzemionkowym z zastosowaniem 20-50% octanu etylu/heksanu z wytworzeniem 165 g żądanego związku, m/e = 616 (M+Li), 98% metodą HPLC.

Część K: WytwarzanieN-[2R-hydroksy-3-[[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo) (2-metylopropylo)amino)-lS-(fenylometylo)propylo)-2S-[[(pirolidyn-l-ylo)acetylo)amino]-3,3-dimetylobutanamidu

Do 164,2 g (0,27 mol) N-[2R-hydroksy-3-[[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo) (2-metylopropyło)amino)-lS-(fenylometylo)propylo)-2S-[(chloroacetylo)amino]-3,3-dimetylobutanamidu dodano 500 ml tetrahydrofuranu, rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem w celu usunięcia octan etylu, i następnie dodano 350 ml tetrahydrofuranu. Do tego roztworu w temperaturze 10°C dodano 130 ml (1,56 mol) pirolidyny. Po 1 godzinie rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, dodano 11 octanu etylu, przemyto nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu, solanką osuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu, przesączono i zatężono z wytworzeniem 185 g surowej substancji, którą zbadano metodą HPLC określając na 98,9% czystości. Podzielono jąna 3 porcje i poddano chromatografii na urządzeniu Prep 2000 Chromatogram z zastosowaniem najpierw 50% octan etylu/heksan, następnie 5% metanolu/octan etylu z wytworzeniem 160 g oczyszczonego materiału (99% metodąHPLC). Rekrystalizowano go z 460 ml eteru dietylowego i 70 ml heksanu z wytworzeniem 121 g żądanego produktu (>99% metodą HPLC), m/e = 651 (M+Li), temperatura topnienia =112 -114°C.

Przykład 15

Wytwarzanie N-[2R-hydroksy-3-[(2-metylopropylo) [(1,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo]amino]-lS-(fenylometylo)propylo]-2S-metylo-3-(metylosulfonylo)propanamid

Część A: Wytwarzanie kwasu 2(S)-metylo-3-(metylosulfonylo)propionowego

Etap 1: Do roztworu 200 g (1,23 mol) kwasu D-(-)-3-acetylo-b-merkaptoizomasłowego w 1,01 metanolu, dodano 161,0 g (2,47 mol) wodorotlenek potasu, rozpuszczono w 500 ml metanolu zachowując temperaturę poniżej 10°C z chłodzeniem na łaźni lodowej. Po wymieszaniu przez dodatkowe 20 minut, dodano 117 ml (156 g, 1,23 mol) siarczanu dimetylu zachowując temperaturę poniżej 20°C. Łaźnię lodową usunięto i mieszaninę mieszano przez dodatkowe 60 minut. Sole odsączono, rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i dodano octan etylu. Po oddzieleniu warstwy wodnej, zakwaszono ją stężonym kwasem chlorowodorowym, ekstrahowano octanem etylu, osuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu, przesączono i zatężono z wytworzeniem 164 g (99%) żądanego kwasu 2S-metylo-3-(metylotio)propionowego, m/e = 133 (M-H).

180 070

Etap 2: Do roztworu 10,0 g (74,6 mmol) kwasu 2S-metylo-3-(metylotio)propionowego w 150 ml acetonu i 30 ml wody, ochłodzonego do 18°C na łaźni lodowej, dodano 161,8 g (263 mmol) Oxone. Po dodaniu około połowy materiału, temperatura wzrosła do 24°C, dodawanie wstrzymano, temperaturę obniżono do 18°C, i kontynuowano dodawanie. Po wymieszaniu w temperaturze 15-20°C przez 15 minut łaźnię usunięto i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Ciała stałe przesączono i przemyto acetonem, przesącz zatężono do około 40 ml i pozostałość rozpuszczono w 200 ml octanu etylu.

Warstwę octanu etylu osuszono bezwodnym siarczanem magnezu, przesączono i zatężono z wytworzeniem 11,4 g oleju. Rozpuszczono go w małej ilości octanu etylu i dodano heksan do utworzenia osadu. Osad zebrano z wytworzeniem 6,95 g żądanego produktu, m/e = 167 (M+H).

Część B: Wytwarzanie N-[2R-hydroksy-3-[(2-metylopropylo)-[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo]amino]-lS-(fenylometylo)propylo]-2S-metylo-3-(metylosulfonylo)propanamidu

Do roztworu 5,0 g (30 mmol) kwasu 2S-metylo-3-(metylosulfonylo)propionowego i 6,90 g (45 mmol) N-hydroksybenzotriazolu w 30 ml bezwodnego DMF w temperaturze 0°C w atmosferze azotu, dodano 6,34 g (33 mmol) EDC. Po około 10 minutach EDC rozpuścił się. Po 60 minutach w temperaturze 0°C, dodano roztwór 15,5 g (30 mmol) metanosulfonianu 2R-hydroksy-3-[[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo) (2-metylopropylo)amino]-lS-(fenylometylo)propylaminy w 30 ml bezwodnego DMF, uprzednio zobojętniony 3,4 ml (31,6 mmol) 4-metylomorfoliny. Po 3 godzinach w temperaturze 0°C, mieszaninę mieszano następnie przez noc przez 17 godzin. DMF usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, dodano octan etylu, przemyto 5% kwasem cytrynowym, nasyconym wodorowęglanem sodu, wodą, solanką, osuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu, przesączono i zatężono z wytworzeniem 16 g surowej substancji o czystości 88% metodą HPLC. Produkt poddano chromatografii na żelu krzemionkowym z zastosowaniem 20-80% octanu etylu/heksanu z wytworzeniem czystego produktu, który rekrystalizowano z octanu etylu/heksanu z wytworzeniem 8,84 g czystego produktu, temperatura topnienia 131,8-133,8°C.

Alternatywnie, do roztworu 35,0 g (211 mmol) kwasu 2S-metylo-3-(metylosulfonylo)propionowego i 48,3 g (315 mmol) N-hydroksybenzotriazolu w 210 ml bezwodnego DMF w temperaturze 0°C w atmosferze azotu dodano 44,4 g (231 mmol) EDC. Po około 30 minutach EDC rozpuścił się. Po jeszcze 60 minutach w temperaturze 0°C, dodano roztwór 108,8 g (211 mmol) metanosulfonianu 2R-hydroksy-3-[[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo) (2-metylopropylo)amino]-l S-(fenylometylo)propylaminy w 350 ml bezwodnego DMF, wcześniej zobojętniony 24 ml (22,3 g) 4-metylomorfoliny. Po 2 godzinach w temperaturze 0°C, mieszaninę mieszano przez noc przez 18 godzin. DMF usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, dodano 11 octan etylu, przemyto 5% kwasem cytrynowym, nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu, solanką, osuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu, przesączono i zatężono z wytworzeniem 120,4 g surowej substancji o czystości 90% metodąHPLC. Produkt krystalizowano dwukrotnie z 750-1000 ml absolutnego etanolu z wytworzeniem 82,6 g żądanego produktu.

Przykład 16

180 070

Wytwarzanie 2S-[[(N-metyloamino)acetylo]amino]-N-[2R-hydroksy-3-[[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo] (2-metylopropylo)amino]-1 S-(fenylometylo)propylo]-3,3-dimetylobutanamidu

Do 6,55 g (10,7 mmol) N-[2R-hydroksy-3-[[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo] (2-metylopropylo)amino]-lS-(fenylometylo)propylo]-2S-[(chloroacetylo)amino]-3,3-dimetylobutanamidu dodano 25 ml tetrahydrofiiranu, rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem w celu usunięcia octanu etylu, i następnie dodano 25 ml tetrahydrofiiranu. Do tego roztworu w temperaturze 10°C dodano 19 ml (214 mmol) 40% wodnego roztworu metyloaminy. Po 2 godzinach rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, dodano 1 1 octanu etylu, przemyto nasyconym wodorowęglanem sodu, solanką, osuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu, przesączono i zatężono z wytworzeniem 6,0 g produktu (czystość 98%).

Przykład 17

Inhibitory retro wirusowej proteazy według niniejszego wynalazku są skutecznymi inhibitorami proteazy HI V. Próba enzymatyczna opisana poniżej może być użyta do wybierania inhibitorów retrowirusowej proteazy do stosowania w kombinowanym leczeniu. IC₅₀ (stężenie, przy którym inhibitor redukuje aktywność enzymu o 50%) dla takich związków może być obliczone z zastosowaniem poniższej metody.

Metoda enzymatyczna jest następująca. Substratem jest 2-aminobenzoilo-Ile-Nle-P-he(p-NO₂)-Gln-ArgNH₂. Pozytywną próbą kontrolną j est MVT-101 (Miller, M. i in., Science 246, 1149 (1989)). Buforem próby jest 20 mM fosforan sodu, pH 6,4, 20% gliceryna, 1 mM ΕβΤΑ, 1 mM DTT i 0,1 °CHAPS. Substrat rozpuszcza się w DMSO, następnie rozcieńcza 10-krotnie w buforze próby. Końcowe stężenie substratu w próbie wynosi około 80 μΜ. Proteazę HIV rozcieńcza się w buforze próby do końcowego stężenia enzymu około 12,3 nanomol, względem masy cząsteczkowej 10780.

Końcowe stężenie DMSO wynosi około 14%, a końcowe stężenie gliceryny wynosi około 18%. Badany związek rozpuszcza się w DMSO i rozcieńcza DMSO do około dziesięciokrotności (10x) testowego stężenia, następnie 10pL substratu. Wzrost fluorescencji obserwuje się w 4 chwilach czasowych (0, 8,16 i 24 minuty) w temperaturze otoczenia. Każdą próbę powtarza się w dwu studzienkach.

Przykład 18

Skuteczność wybranych inhibitorów proteazy HIV według niniejszego wynalazku można określić stosując powyżej opisanąpróbę enzymatyczną! następującąpróbę linii komórek CD4+. Antywirusową aktywność inhibitorów proteazy wyraża się jako skuteczne stężenia 50 (EC₅₀) i/lub skuteczne stężenia 90 (EC₉₀). Są to stężenia inhibitorów konieczne do inhibicji wirusowej replikacji o 50% lub 90%, odpowiednio.

Próba inhibicji HIV dla ostrej infekcji komórek jest zautomatyzowaną kolorymetryczną próbą tetrazoliową zasadniczo taką, jak opisuje Pauwels i in., J. Virol. Methods 20, 309-321 (1988). Próby wykonuje się w 96-studzienkowych płytkach do kultur tkanek. Linię komórek CD4+, takich jak CEM, MT-2, MT-4 i tym podobne linie komórek, hoduje się w pożywce RPMI-1640 (Gibco) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, a następnie traktuje polybrene (2 pg/ml). 80 μΐ pożywki zawierającej 1 χ 10⁴ komórek wprowadza się do każdej studzienki płytki do kultur tkanek. Do każdej studzienki dodaj e się 100 μΐ badanego związku rozpuszczonego wpożywce do kultur tkanek (lub pożywce bez badanego związkujako kontrolnej) dla uzyskania żądanego końcowego stężenia i komórki inkubuje się w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Zamrożoną kulturę HIV-1 rozcieńcza się w pożywce kultury do stężenia 5 χ 10⁴ TCID₅₀ na ml (TCID₅₀ - dawka wirusa infekująca 50% komórek w kulturze tkankowej), i 20 pL objętości próbki wirusa (zawierającej 1000 TCID₅₀ wirusa) dodaje się do studzienek zawierających badany związek i do studzienek zawierających tylko pożywkę (infekowane kontrolne komórki). Kilka studzienek otrzymuje pożywkę kultury bez wirusa (nieinfekowane kontrolne komórki). Podobnie, wewnętrzną toksyczność badanego związku określa się dodając pożywkę bez wirusa do kilku studzienek zawierających badany związek. Podsumowując, płytki do kultur tkanek zawierają następujące eksperymenty:

180 070

	Komórki	Lek	Wirus
1.	+	-	-
2.	+	+	-
3.	+	-	+
4.	+	+	+

W eksperymentach 2 i 4 końcowe stężenia testowych związków wynoszą 1, 10, 100 i 500 pg/ml. Azydotymidyna (AZT) lub dideoksyinozyna (ddl) jest włączana jako pozytywny lek kontrolny. Testowe związki rozpuszcza się w DMSO i rozcieńcza w pożywce do kultur tkanek, aby końcowe stężenia DMSO nie przekraczały 1,5% w żadnym przypadku. DMSO dodaje się do wszystkich kontrolnych studzienek przy właściwych stężeniach.

Po dodaniu wirusa, komórki inkubuje się w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze z 5% CO₂ przez 7 dni. Testowe związki można dodawać w dniu 0,2, i 5 w razie potrzeby. W dniu 7 po infekcji komórki w każdej studzience umieszcza się w zawiesinie i 100 μΐ próbkę każdej zawiesiny komórkowej usuwa się do testu. Do każdego pL zawiesiny komórek dodaje się 20 pL 5 mg/ml roztworu bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowego (MTT), i komórki inkubuje się przez 4 godziny w temperaturze 37° w środowisku 5% CO₂. W czasie tej inkubacj i, MTT j est metabolicznie usuwany przez żywe komórki, powoduj ąc wytwarzanie w komórkach zabarwionego formazanowego produktu. Do każdej próbki dodaje się 100 pl 10% dodecylosulfonianu sodu w 0,01 N HC1 dla dokonania lizy komórek i próbki inkubuje się przez noc. Absorbancję w temperaturze 590 nm określa się dla każdej próbki przy pomocy mikroczytnika płytek Molecular Devices. Cytotoksyczność i antywirusową skuteczność badanego związku określa się porównując absorbancję otrzymaną dla studzienek zawierających zainfekowane lub nieinfekowane komórki inkubowane ze związkami i nieinfekowane, nieleczone studzienki kontrolne.

Procedury dla kultur HIV

Stymulacja limfocytów donora

Warstwy z górnej części skrzepu otrzymano z American Red Cross lub Blood Bank z Washington University School of Medicine. Preparaty te są przesiane na przeciwciała HIV i CMV i powierzchniowy antygen HBV (HBsAg) i ALT (aktywność transferazy alaniny) jako znaczniki zapalenia wątroby nie-A, nie-B. Wzbogaconą w leukocyty krew (30 ml) pobiera się z pojemnika z tworzywa i 15 ml wprowadza się do dwu 50 ml zakręcanych probówek do wirowania. Każdą próbkę rozcieńcza się równą objętością sterylnego PBS i miesza się przez pipetowanie. Pod rozcieńczonymi próbkami krwi umieszcza się Ficoll-Paque (15 ml) lub LSM przy pomocy pipety Pasteura i pozostawia się roztwór do spłynięcia na dno probówki. Każdą z probówek następnie odwirowuje się przy 1300 obrotach na minutę (400x g) przez 45 minut w temperaturze 20°C. Po odwirowaniu warstwę limfocytów z powierzchni usuwa się i przenosi do 50 ml probówki. Sterylny PBS dodaje się w celu rozcieńczenia wydzielonych limfocytów i następnie odwirowuje się przy 1300 obrotach na minutę przez 8 minut. Granulkę komórkową przemywa się 2x zawieszając w PBS i ponownie odwirowując. Końcową granulkę komórkową zawiesza się w 20 ml PBS przez pipetowanie i określa się łączną liczbę żywotnych komórek metodą wykluczania błękitu trypanowego.

Próby ostrej infekcyjności na klinicznych izolatach

Około 3 x 10⁷ komórek aktywuje się przez 48 godzin około 3- 5 pg/ml PHA w RPMI z 10% płodowej surowicy bydlęcej i IL-2 (10 U/ml). Odliczone porcje wirusa dodaje się do aktywowanej zawiesiny limfocytów różnorodności infekcji około 0,001-0,01. Zawiesinę komórek z wirusem inkubuje się w temperaturze 37°C przez 2 godziny dla umożliwienia absorpcji wirusa. Resztę szczepiącego wirusa usuwa się przez odwirowanie i komórki zawiesza się w RPMI zawieraj ącym 10% FBS i 10 U/ml IL-2. Takie zainfekowane komórki dodaje się do badanej substancji rozcieńczonej w kompletnej pożywce do kultur tkanek z zapasu (10 mg/ml) w DMSO na 96-studzienkowych płytkach mikromiareczkowych, umieszczając około 5 x 10⁵ komórek na studzienkę na 200 μΐ. Infekowane, nieleczone komórki i komórki potraktowane tylko DMSO (0,1%) lub

180 070

AZT lub DDI użyto jako kontrolne. Kultury zbadano na tworzenie zespólni w dniach 7 i 11 po infekcji lub supemanty testowano na aktywność odwrotnej transkryptazy lub antygen p24.

Próby chronicznej infekcyjności

Komórki CEM chronicznie infekowane ΗΧΒ2 (laboratoryjny szczep HIV-1) dodaje się do 6 studzienek 12-studzienkowej płytki mikromiareczkowej umieszczając około 5 χ 10⁴ komórek na studzienkę. Połowę studzienek traktuje się badanym związkiem w różnych stężeniach i tę samąliczbę nieinfekowanych komórek CEM pozostawia się bez dodatku związku. Świeżąpożywkę z lub bez badanego związku dodaje się każdego dnia przez 3 kolejne dni. Kultury inkubuje się następnie przez 48 godzin nie zmieniając pożywki. Komórki odwirowuje się, przemywa 2x PBS i zawiesza w 50 pl 2x buforze Laemmli zawierającym 0,125 M Tris pH 6,8,4% SDS, 20% gliceryny, 10% beta-merkaptoetanolu i 0,02% błękitu bromofenolowego. Supematanty kultury przepuszcza się przez filtr 0,22 pm w celu usunięcia resztek komórek i odwirowuje przy 50000 obrotów na minutę przez 90 minut w celu zatężenia cząstek wirusa. Granulkę wirusa zawiesza się w 50 pl 2x bufora Laemmli. Zawiesiny komórek lub wirusa gotuje się przez 5 minut i następnie poddaje elektroforetycznemu rozdzielaniu na żelu poliakryloamidowym z gradientem 10-20% SDS. Zawartość żelu przenosi się następnie na nitrocelulozę metodą elektroblottingu. Specyficzne dla HIV białka wykrywa się z zastosowaniem monoklonalnych przeciwciał wobec p24 i pl7, następnie IgG koziej-anty-mysiej związanej z biotyną, i awidyny związanej z HRP. Enzymatyczną konwersję 4-chloro-l-naftolu wykorzystano do wizualizacji specyficznych białek rozpoznawanych przez monoklonalne przeciwciała. Dodatkowo zbadano infekcyjność wirusa wytwarzanego przez chronicznie infekowane komórki CEM w obecności lub nieobecności testowanych związków. Przesączone supematanty seryjnie rozcieńczono i użyto do infekowania nieinfekowanych komórek CEM (około 1x10⁴/studzienkę). Kultury zbadano na tworzenie zespólni w dniu 7 i 11 po infekcji lub supemanty testowano na aktywność odwrotnej transkryptazy lub antygen p24.

Próba mikroodwrotnej transkryptazy (RT)

Próba mikro-RT j est adaptacj ąkilku standardowych prób RT. Opracowano j ą, aby umożliwić pomiar ilościowy z małej objętości aktywności HIV RT i ułatwić przetwarzanie próbek o dużej liczebności.

Materiały	Roztwory robocze (na 1 ml)
Tris (pH 7,8)	1,0 M	50 μΐ
KCI	3,0 M	25 μΐ
DTT (w -20°C	0,1 M	20 μΐ
MgCh	0,15 M	33 μΐ
poli(rA)p(dT012-18)	25 U/2,5 ml	25 μΐ
Pharmacia 27-7878		(0,5 U)
NP-40	2%	25 μΐ
3h-ttp	2,5 Ci/ml	10 μΐ
(NET 221 A, 80 Ci/mmol) H2O		777 μΐ

Metodyka:

1. Dodać 50 μΐ mieszaniny RT na studzienkę do 96-studzienkowej U-dennej płytki mikromiareczkowej.

2. Dodać 10-20 μΐ na studzienkę roztworu supematanta bez komórek.

3. Zmieszać dobrze z zastosowaniem mieszadła mechanicznego.

4. Inkubować w temperaturze 37°C przez 2 godziny.

5. Aspirować na bibułę DE81 lub równoważną, z zastosowaniem TOMTEK.

6. Przemyć 2X SSC cztery razy.

180 070

7. Przemyć 95% etanolem raz.

8. Osuszyć sączek.

9. Przygotować do zliczania z zastosowaniem licznika beta do płytek (Pharmacia).

Przykład 19

Cykle są powtarzane wielokrotnie z rosnącym stężeniem związku do zaobserwowania przesunięcia EC₅₀.

Poniżej przedstawiono sposób hodowli do selekcji mutantów opornych na inhibitor proteazy HIV. Infekowane komórki hodowano w sposób ciągły w obecności inhibitora proteazy. Pewne kultury poddawano co drugi tydzień działaniu wysokich i niskich stężeń inhibitora. Inne hodowano w stałym stężeniu. Stężenia leków zwiększano periodycznie aż do spójnego przesunięcia EC₅₀. Przesunięcie krzywej odpowiedzi na dawkę wykrywano zwykle przy stężeniu leku 0,5 do 1 pg/ml lub większym (5-10x EC₉₀) i zależało ono od traktowanego izolatu wirusowego. Stosowano laboratoryjnie adaptowane i pierwotne kliniczne izolaty HIV. Te same izolaty wirusa potraktowano w taki sam sposób w nieobecności leków, a więc można było porównać bezpośrednio sekwencje nucleotydowe pomiędzy traktowanymi i nietraktowanymi izolatami. Ogólnie, warianty HIV-1 oporne na inhibitory proteazy wybrano dzięki kolejnemu pasażowi (wzrostowi) w obecności kilku stężeń wskazanych inhibitorów proteazy (patrz Markowitz i in., Journal of Virology 69:701 -706 (1995)). Warianty HIV-1 wymienione poniżej wskazująna mutacje obecne w wybranych izolatach wirusa, a nieobecne w kontrolnych, nietraktowanych izolatach wirusa.

RF reprezentuje szczep HIV-1_RF i RFR reprezentuje mieszaninę opornych szczepów otrzymanych przez selekcj ę RF wobec związku z przykładu 1. RFR obejmuj e mieszaninę wirusowych szczepów mających genotypy proteazęG4 8 V (klony 14/40); G48V,V82 A (klony 18/40); G48V, L90S (klony 2/40); G48V, IS4T, V82A (klony 1/40); G48M (klony 1/40); G49V, Q61H (klony 1/40); VI31, G48V (klony 1/40); G48V, F53L, V82A (klony 1/40); i G48V, V82A, C95Y (klony 1/40). RFR2 reprezentuje mieszaninę opornych szczepów otrzymanych przez klonowanie RFR w trzech rundach wzrostu przy ograniczającym rozcieńczeniu. RFR2 obejmuje mieszaninę wirusowych szczepów mających genotypy proteazy G48V, V82A (klony 13/15); G17E, G48V, V82A (klony 1/15); i G48V, V82A, N37D, N88D (klony 1/15). RFRR reprezentuje mieszaninę opornych szczepów otrzymanych przez selekcję RF wobec związków z przykładów 1 i 2 i następnie klonuj ąc w trzech rundach wzrostu przy ograniczaj ącym rozcieńczeniu. RFRR obejmuj e mieszaninę wirusowych szczepów mających genotypy proteazy G48V, I54T, L63P, V82A (klony 1/9); G48V, I54T, L63P, V82A, N88S (klony 1/9); i G48V, I54T, L63P, G73M, V82A (klony 1/9). SF162 reprezentuje szczep HIV-1 SF-162 i SF162R reprezentuje mieszaninę opornych szczepów otrzymanych przez selekcję SF162 wobec związku z przykładu 1. SF162R obejmuje mieszaninę wirusowych szczepów mających genotypy proteazy M46I, F53L, L63P, A71V, N88D

180 070 (klony 2/3); i M46I, F53L, L63P, A71V, N88D, Q92R (klony 1/3). 89-95R reprezentuje szczep HIV-1 89-959 i 89-959R reprezentuje mieszaninę opornych szczepów otrzymanych przez selekcję 89-559 wobec związku z przykładu 2.89-959R obejmuje mieszaninę wirusowych szczepów mających genotypy proteazy N88S (klony 4/5); i D25N, T26A, D30N, D37N, R41K, G73D, R87K., N88S (klony 1/4). NL4 reprezentuje szczep HIV-1 HIV-1_NL4.₃. NL4(G48V) reprezentuje szczep mający syntetycznie utworzoną ukierunkowaną na miejsce mutację w proteazie z glicyny na walinę w aminokwasie na pozycji 48. NL4 (I84V) reprezentuje szczep mający syntetycznie utworzoną ukierunkowaną na miejsce mutację w proteazie z izoleucyny na walinę w aminokwasie na pozycji 84. NL4(R8Q, M46I) reprezentuje szczep mających syntetycznie utworzoną ukierunkowaną na miej sce mutację w proteazie z argininy na glutaminę w aminokwasie na pozycj i 8 i metioniny na izoleucynę w aminokwasie na pozycji 46. NL4(P22-538) reprezentuje mieszaninę opornych szczepów otrzymanych przez selekcję HIV-1_NL4_₃ wobec związku z przykładu 10 po 22 pasażach obejmującą genotypy proteazy M46I, L63P, A71V, V82F, I84V (4/10); M46I, L63P, V82F, I84V (3/10); i M46I, A71V, V82F, I84V (3/10). NL4 (P37-538) reprezentuje oporne szczepy otrzymane przez selekcję HIV-1_NL4.₃ wobec związku z przykładu 10 po 37 pasażach obejmujący genotyp proteazy M46I, L63P, A71V, I84A. NL4 (538/524) reprezentuje oporne szczepy otrzymane przez selekcję NL4 (P22-538) wobec związku z przykładu 5 po 24 pasażach obejmujący genotyp proteazy M46I, L63P, A71V, I84A. NL4 (538/P7-AG) reprezentuje mieszaninę opornych szczepów otrzymanych przez selekcję NL4 (P22-538) wobec związku z przykładu 12 po 7 pasażach obejmujący genotypy proteazy M46I, L63P, A71V, I84A; i V32I, VB2I. NL4 (538/P24-AG) reprezentuje oporne szczepy otrzymane przez selekcję NL4 (P22-538) wobec związku z przykładu 12 po 24 pasażach obejmujący genotyp proteazy M46I, L63P, A71V, I84A. NLA (P19-003) reprezentuje oporne szczepy otrzymane przez selekcję HIV-1_NL4.₃ wobec związku z przykładu 9 po 19 pasażach obejmujący genotyp proteazy R8K, M46I. NL4 (P34-003) reprezentuj e oporne szczepy otrzymane przez selekcj ę HIV-1 _NL4.₃ wobec związku z przykładu 9 po 34 pasażach obejmujący genotyp proteazy R8K, M46I, L63P, A71V, L90M. Oporności wirusowych izolatów podsumowano w tabelach 1-11.

Przykład 20

Oporności wirusowych izolatów podsumowane w tabelach 1-3 otrzymano na podstawie następującej próby lub jej niewielkiej modyfikacji. Około 3 χ 10⁷ komórek aktywuje się przez 48 godzin z około 3-5 pg/ml PHA w RPMI zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej i IL-2 (10 U/ml). Dodaje się ilościowo roztwory wirusa do aktywowanej zawiesiny limfocytów przy różnorodności infekcji około 0,001-0,01. Zawiesinę komórka-wirus inkubuje się w temperaturze 37°C przez 2 godziny pozwalając na absorpcję wirusa. Resztę szczepiącego wirusa odwirowuje się i komórki zawiesza się w RPMI zawierającym 10% FBS i 10 U/ml IL-2. Infekowane komórki dodaje się do testowego związku rozcieńczonego w kompletnej pożywce do kultur tkanek (10 mg/ml) w DMSO w 96-studzienkowych płytkach mikromiareczkowych przy około 5 χ 10⁵ komórkach na studzienkę na 200 μΐ. Infekowane, nietraktowane komórki i komórki potraktowane tylko DMSO (0,1%) lub AZT lub DDI użyto jako kontrolne. Kultury badano na tworzenie zespólni w dniach 7 i 11 po infekcji lub supemanty testowano na aktywność odwrotnej transkryptazy lub antygen p24.

Tabela 1

Prz. nr	Izolat wirusa (EC50 ng/ml)
SF162	SF162R
1	31	443
2	2	6
5	4	4
6	2	11

180 070

Tabela 2

Prz. nr	Izolat wirusa (EC50 ng/ml)
SF162	SF162R
1	2	111
7	1	108
8	1	98

Tabela 3

Prz. nr	Izolat wirusa (EC50 ng/ml)
89-959	89-959R	89-959R
1	96+	5+	37ł+
2	100+	395+	872++
5	36+	5+	38^
6	4		6”
7	13§	12§
8	12§	11§

+, ++ i § oznaczają wartości otrzymane w tym samym eksperymencie

Przykład 21

Oporności wirusowych izolatów podsumowane w tabelach 4-6 otrzymano na podstawie następującej próby lub jej niewielkiej modyfikacji. Próby prowadzono w 96-studzienkowych płytkach do kultur tkanek. Komórki CEM-T4 zawiesza się w 90% pożywki RPMI (Gibco BRL Life Technologies, Inc., Gaithsburg, MD), 10% ogrzanej płodowej surowicy bydlęcej (Gibco BRL Life Technologies, Inc., Gaithsburg, MD) do końcowego stężenia of 5 χ 10⁵ żywotnych komórek na ml. Zamrożoną próbkę kultury HIV (szczep HIY-l^) rozmraża się gwałtownie (w łaźni wodnej 37°C) i dodaj e do komórek CEM-T4 do końcowego stężenia około 0,001-0,01 infekcyjnych jednostek na komórkę. Zawiesiny wirus-komórka szybko miesza się i zaraz dodaje 100 pl do 100 μΐ rozcieńczenia każdego testowego związku (wytworzonego jako 2x koncentrat w 90% RPMI, 10% FBS) w każdej studzience 96-studzienkowej płytki do kultur tkanek. Każda płytka zawiera kontrolne studzienki zawierające komórki i wirusa, ale nie testowy związek. 3'-azydo-3'-deoksytymidyna (AZT) jest dołączana jako pozytywna kontrola dla każdej próby.

Płytki do kultur tkanek inkubuje się w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze z 5% CO₂ przez 7 dni. Poziom wirusowej replikacji określa się następnie mierząc aktywność odwrotnej transkryptazy w supematantach z zastosowaniem standardowych metod (jak opisano powyżej i w, np., Techniąues in HIV Research, wyd. Aldovini i Walker, 1990, Stockton Press, NY).

180 070

Tabela 4

Prz. nr	Izolat wirusa (EC50 ng/ml)
RF	RFR
1	30	223+
2	40	8+
3	5	2+
4	10	0,4+
5	44”	7+
6	12”	15+

+,++ oznaczają wartości otrzymane w tym samym eksperymencie

Tabela 5

Prz. nr	Izolat wirusa (EC50 ng/ml)
RF	RFR
1	24	394
7	2	78
8	2	1

Tabela 6

Prz. nr	Izolat wirusa (EC50 ng/ml)
RF	RFR2	RFRR
1	19	880	5609
2	35	367	1111
5	6	57	982
6	6	31	962
14	1	6	39
15	5	9	21
16	3	1	9

Przykład 22

Oporności wirusowych izolatów podsumowane w tabelach 7-11 otrzymano na podstawie procedur prób opisanych przez Markowitza i in., Journal of Virology, tom 69, 701-706 (1995), dołączany w całości jako odnośnik literaturowy, lub ich niewielkiej modyfikacji.

180 070

Tabela 7

Prz. nr	Izolat wirusa (EC50 ng/ml)
NL4	NL4(G48V)	NL4(I84V)
5	80	160	640
6	30	150	90
10	80	160	800
12	25	125	125
14	8	8	72
15	60	60	60
16	8	8	8

Tabela 8

Prz. nr	Izolat wirusa (EC50 ng/ml)
NL4	NL4 (R80, M46I)
5	80	240
6	30	30
10	80	240
12	25	125
13	250	750
16	8	8

Tabela 9

Prz. nr	Izolat wirusa (ECS0 ng/ml)
NL4	NL4 (P22-538)	NL4 (P37-538)
5	80	800	6400
6	30	150	2400
10	80	1600	6400
12	25	500	>3125
13	250	5000	>31250
14	60	60	1000
15	8	400	1000
16	8	8	40

180 070

Tabela 10

nr	NL4	NL4 (538/524)	NL4 (P7-AG)	NL4 (538/P24-AG)
5	80	6400	6400	6400
6	30	2400	2400	2400
10	80	6400	6400	6400
12	25	>3125	>3125	>3125
13	250	>31250	>31250	>31250
16	8	40	40	40

Tabela 11

Prz. nr	Izolat wirusa (ECS0 ng/ml)
NL4	NL4 (PI9-003)	NL4 (P34-003)
5	80	240	400
6	30	30	30
10	80	400	400
12	25	150	375
13	250	1250	1250
16	8	8	6

Przykład 23

Inhibitory proteazy z przykładów 1 i 2, zawierające unikalny hydroksyetylomocznikowy izoster, zastosowano do selekcji lekoopomych wariantów HIV-1 invitro. Kliniczne i laboratoryjne szczepy HIV-1 poddano pasażowi w linii komórek T lub monojądrowych komórek krwi obwodowej (PBMC) w obecności rosnących stężeń leku. Oporne warianty spójnie wykazywały wartości EC₅₀, co najmniej 10-krotnie wyższe niż kontrolne wirusy poddane pasażowi na identyczny okres, lecz w nieobecności inhibitora. Wirusowe DNA wzmocniono metodąPCR i określono nukleotydowe sekwencje genu kodującego proteazę z zastosowaniem standardowych metod. W wirusach opornych na inhibitory proteazy z przykładów 2 i 1, odpowiednio, stale obserwowano zmianę aminokwasu na pozycji 88 w wielu wybranych wariantach. Reszta Asn w 88 leży wewnątrz strukturalnie zachowawczej domenie helisy, obecnej w monomerycznej i dimerycznej aspartowej proteinazie. Odpowiednia karboksy-terminalna sekwencja Gly-Arg-Asp/Asn (reszty 86-88) jest unikalna dla retrowirusowych aspartowych proteinaz. Chociaż wszelkie wyjaśnienia tych wyników są tylko spekulacjami, badania modelowe w oparciu o wzorce z wysokorozdzielczych rentgenowskich struktur prototypowych hydroksyetylomocznikowych inhibitorów związanych z rekombinacyjnąproteaząHIV-l wydają się sugerować, że mutacje Asn88 mogą zmienić konformację proteazy.

Inhibitory retro wirusowej proteazy według niniejszego wynalazku są korzystnie skutecznymi związkami antywirusowymi i w szczególności są skutecznymi inhibitorami retrowirusów, szczególnie lentiwirusów, w sposób pokazany powyżej. Tak więc związki te sąskutecznymi inhibitorami HIV. Należy sądzić, że związki te będą także inhibitowały inne szczepy HIV, takie jak HIV-2 i inne wirusy, takie jak np., wirus VISNA i wirus małpiego braku odporności (SIV), HTLV-1 i HTLV-2. Tak więc związki te sąskuteczne w leczeniu i/lub zapobieganiu infekcjom retrowirusowym.

180 070

W środku według wynalazku można stosować także solwaty lub hydraty inhibitorów retrowirusowej proteazy, gdy są one możliwe, wytwarzane lub wydzielane znanymi sposobami.

Inhibitory retrowirusowej proteazy można stosować w postaci soli nieorganicznych lub organicznych kwasów. Sole takie obejmują między innymi następujące: octany, adypiniany, alginiany, cytryniany, aspartany, benzoesany, benzenosulfoniany, wodorosiarczany, maślany, kamforany, kamforosulfoniany, diglukoniany, cyklopentanopropioniany, dodecylosiarczany, etanosulfoniany, glukoheptaniany, glicerofosforany, hemisiarczany, heptaniany, heksaniany, fumarany, chlorowodorki, bromowodorki, jodowodorki, 2-hydroksy-etanosulfoniany, mleczany, jabłczany, metanosulfoniany, nikotyniany, 2-naftalenosulfoniany, szczawiany, palmityniany, pektyniany, nadsiarczany, 3-fenylopropioniany, pikryniany, piwalany, propioniany, bursztyniany, winiany, tiocyjaniany, tosylany, mezylany i undekaniany.

Przykłady kwasów, jakie można wykorzystać do wytwarzania farmaceutycznie dopuszczalnych soli addycyjnych obejmują takie kwasy nieorganiczne, jak kwas chlorowodorowy, kwas siarkowy i kwas fosforowy i takie kwasy organiczne jak kwas szczawiowy, kwas maleinowy, kwas bursztynowy i kwas cytrynowy, korzystnie chlorowodorek. Inne przykłady obejmują sole z metalami alkalicznymi lub wapniowcami, takimi jak sód, potas, wapń lub magnez lub z zasadami organicznymi.

Łączne dzienne dawki podawane pacjentowi w jednej lub wielu porcjach mogą osiągać, np., od 0,01 do 50 mg/kg masy ciała dziennie i częściej 0,1 do 30 mg. Jednostkowe kompozycje mogą zawierać takie ilości poddawek, które tworzą dzienną dawkę.

Ilość aktywnego składnika, którą można połączyć z nośnikami w celu wytworzenia pojedynczej postaci dawki, będzie się wahała w zależności od leczonego pacjenta i danego sposobu podawania.

Reżim dawkowania przy leczeniu stanu chorobowego inhibitorem retrowirusowej proteazy i/lub kompozycją dobiera się w zależności od wielu czynników, w tym rodzaju, wieku, wagi, płci, diety i stanu medycznego pacjenta, ostrości choroby, drogi podawania, farmakologicznych czynników takich jak aktywność, skuteczność, profile farmakokinetyczne i toksykologiczne danego użytego związku, czy stosuje się układ podawania leku i czy związek podaje się jako część kombinacji leków. Tak więc reżim dawkowania rzeczywiście stosowany może się znacznie wahać i odchylać od korzystnych wymienionych wyżej dawek.

Związki według niniejszego wynalazku można podawać doustnie, pozajelitowo, inhalacyjnie, doodbytniczo, lub miejscowo w pojedynczych dawkach zawierających konwencjonalne nietoksyczne farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, adiuwanty, i nośniki w miarę potrzeby. Miejscowe podawanie może też obejmować stosowanie podawania przezskómego, takiego jak plastry lub urządzenia jonoforetyczne. Termin pozajelitowe stosowany tutaj obejmuje zastrzyki podskórne, dożylne, domięśniowe, domostkowe, lub infuzje.

Preparaty do zastrzyków, np., sterylne wodne roztwory lub olejowe zawiesiny do zastrzyków można komponować w znany sposób z zastosowaniem przydatnych środków dyspergujących lub zwilżających oraz zawiesinujących. Sterylny preparat do zastrzyków może też być sterylnym roztworem lub zawiesiną do zastrzyków w nietoksycznym pozajelitowo dopuszczalnym rozcieńczalniku lub rozpuszczalniku, np., jako roztwór w 1,3-butanodiolu. Pośród dopuszczalnych nośników i rozpuszczalników nadających się do użycia jest woda, roztwór Ringera, i izotoniczny roztwór chlorku sodu. Ponadto sterylne oleje roślinne są konwencjonalnie stosowane jako rozpuszczalniki lub środowiska zawiesin. W tym celu można stosować dowolny oczyszczony olej roślinny, w tym syntetyczne mono- lub diglicerydy. Ponadto kwasy tłuszczowe, takie jak oleinowy, znajdują zastosowanie do wytwarzania płynów do zastrzyków.

Czopki do doodbytniczego podawania leku można wytwarzać mieszając lek z przydatną niedrażniącązaróbką, taką jak masło kakaowe i glikole polietylenowe stałe w zwykłej temperaturze, ale ciekłe w temperaturze odbytu, a więc ulegające stopieniu w odbycie i uwalniające lek.

Stałe postaci dawek do doustnego podawania mogą obejmować kapsułki, tabletki, pigułki, proszki i granulki. W takich stałych postaciach dawek, aktywny związek można zmieszać z co najmniej jednym obojętnym rozcieńczalnikiem, takim jak sacharoza, laktoza lub skrobia. Takie

180 070 postaci dawek mogą także obejmować, jak się to praktykuje, dodatkowe substancje inne niż obojętne rozcieńczalniki np., środki smarujące, takie jak stearyniany magnezu. W przypadku kapsułek, tabletek i pigułek, postaci dawek mogą także obejmować środki buforujące. Tabletki i pigułki mogą ponadto mieć jelitowe powłoki.

Ciekłe postaci dawek do doustnego podawania mogą obejmować farmaceutycznie dopuszczalne emulsje, roztwory, zawiesiny, syropy i eliksiry zawierające obojętny rozcieńczalnik stosowany zwykle, taki jak woda. Takie kompozycje mogą też obejmować adiuwanty, takie jak środki zwilżające, emulgujące i zawiesinujące, oraz słodzące, smakowe i zapachowe.

Chociaż inhibitory retrowirusowej proteazy według niniejszego wynalazku można podawać jako jedyne aktywne środki farmaceutyczne, możnaje także stosować w kombinacji z innymi antywirusowymi środkami skutecznymi wobec retrowirusów, takich jak HIV-1. Takie związki obejmują, między innymi, inne inhibitory proteazy HIV-l, różne analogi nukleozydów, nienukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy, antagoniści tat i inhibitory glikozydazy.

Przykłady inhibitorów proteazy HIV-1 obejmują, między innymi, Ro 31-859 (Roberts, N.A. i in., Science 1990 248,258-261 i Drugs of the Futurę 1991,16(3), 210-212 KNI-272, (Kagayama, S., i in., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1993,810-817), cykliczne moczniki, (Lam, P., i in., „De Novo Design and Discovery of Potent, Nonpeptidal HIV-1 Protease Inhibitors,” wykład 96 na 205 American Chemical Society National Meeting, Medicinal Chemistry Division, Denver, CO, 28 marca-2 kwietnia 1993), L735524 (Dorsey, B.D., i in., „L-735524: The Rational Design of a Potent and Orally Bioavailable HIV Protease Inhibitor,” wykład 6 na 206 American Chemical Society National Meeting, Medicinal Chemistry Division, Chicago, IL, 22-27 sierpnia 1993) i ich analogi.

Przykłady współzawodniczących analogów nukleozydów obejmują między innymi azydotymidynę (AZT), dideoksyinozynę (DDI), DDC, 3TC, D4T i PMEA. Przykłady nienukleozydowych niewspółzawodniczących inhibitorów odwrotnej transkryptazy obejmują, między innymi, klasę pirydonu (Wei, J.S., i in. J. Med. Chem. 1993,36,249-255; Hoffman, J. M., i in., J. Med. Chem. 1992,35,3784-3791; Saari i in., J. Med. Chem. 1992,35 3792-3802; Drugs of the Futurę 1992,17(4), 283-285, i ich analogi); klasę bis-(heteroarylo)piperazyn (Romero, D.L., i in., J. Med. Chem. 1993,36,1505-1508; Romero, D.L., i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991,34, 746-751 13187-3198; i ich analogi) i tricykliczne pirydobenzo- i depirydodiazepinony (Hargrave, K.D., J. Med. Chem. 1991 34,2231 -2241; Merłuzzi, M. J. Science 1990,250,1411 -1413 i ich analogi) i 5-chloro-3-(fenylosulfonylo)indólo-2-karboksyamid i jego analogi (Williams, T.M. i in., J. Med. Chem. 1993, 36,1291-1294). Przykłady antagonistów tat obejmują między innymi Ro 5-3335 i Ro 24-7429 (Hsu, M.C. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993,909,6395-6399; Tam, S. i in., „TAT INHIBITORS: A NEW CLASS OF ANTI-HIV AGENTS,” wykład 372, na 204 American Chemical Society National Meeting, Organie Chemistry Division, Washington, DC, 23-28 sierpnia 1992) i ich analogi. Przykłady inhibitorów glikozydazy obejmująmiędzy innymi, kastanosperminę, 6-butrylowy ester kastanosperminy,N-butylo-l-deoksynojirymycynę, perbutrylowy ester N-butylo-l-deoksynojirymycyny oraz ich analogi i prekursory.

Lecznicze środki można komponować jako odrębne kompozycje podawane zasadniczo jednocześnie lub możnaje podawać jako pojedyncze kompozycje takie, że wszystkie aktywne środki znajdują się w pacjencie w leczniczo skutecznej ilości. Alternatywnie, lecznicze środki można podawać pacjentowi w różnym czasie, tak że tylko jeden lub dwa aktywne środki jednocześnie znajdują się w pacjencie w leczniczo skutecznej ilości.

Środki farmaceutyczne według niniejszego wynalazku są skuteczne przeciw wirusom i w szczególności, są skutecznymi inhibitorami retrowirusów w sposób pokazany powyżej. Tak więc, środki te są skutecznymi inhibitorami proteazy HIV. Należy sądzić, że związki te będą też inhibitorami innych retrowirusów takich j ak inne lentiwirusy, w szczególności inne szczepy HIV, np. HIV-2, wirus ludzkiej białaczki komórek T, wirusa mięsaka Rousa, wirus małpiego braku odporności, koci wirus białaczki, wirus kociego braku odporności i tym podobne. Tak więc środki te są skuteczne w leczeniu i/lub zapobieganiu retrowirusowych infekcji.

180 070

Środki według wynalazku są także skuteczne w zapobieganiu wzrostowi retro wirusów w roztworze. Zarówno ludzkie, jak i zwierzęce kultury komórkowe, takie jak kultury limfocytów T, wykorzystuje się do różnych znanych celów, takich jak badania i procedury diagnostyczne, w tym kalibracje i próby kontrolne. Przed i w czasie wzrostu i przechowywania kultur komórkowych, związki można dodawać do pożywki kultury w skutecznym stężeniu dla zapobiegania niespodziewanej lub niepożądanej replikacji retrowirusa, który może mimowolnie lub niespodziewanie być obecny w kulturach komórkowych. Wirus może być początkowo obecny w kulturach komórkowych, np. HIV znajduje się w ludzkich limfocytach T na długo przed wykrywalnością we krwi, lub wskutek wystawienia na działanie wirusa. Takie zastosowanie środków według wynalazku zapobiega nieświadomemu lub mimowolnemu działaniu potencjalnie śmiertelnego retrowirusa na badacza lub lekarza.

Claims (5)

1. Środek farmaceutyczny do leczenia retrowirusowych infekcji, zwłaszcza HIV lub HTLV, u ssaka, zwłaszcza u człowieka, małpy i kota, znamienny tym, że zawiera:

(a) skuteczną ilość pierwszego inhibitora retrowirusowej proteazy wybranego z grupy obejmującej

N-(2(R)-hydroksy-1 (S)-indanylo)-2(R)-fenylometylo-4(S)-hydroksy-5-(l -(4-(3-pirydylometylo)-2(S)-N'-(t-butylokarboksyamido)piperazynylo))pentanoamid;

N-t-butylodekahydro-2-[2(R)-hydroksy-4-fenylo-3(S)[[N-(2-chinolilokarbonylo)-L-asparaginy lo] amino] buty lo] (4aR, 8aS)-izochinolino-3 (S)-karboksy amid (2S,3R,4S,5S)-2,5-bis-[N-[N-[[N-metylo-N-(2-pirydynylometylo)amino]karbonylo]walinylo]amino]-3,4-dihydroksy-l,6-difenyloheksan;

(2S,3S,5S)-5-[N-[N-[N-metylo-N-[(2-izopropylo-4-tiazolil)metylo]amino]karbonylo]walinylo]amino]-2-[NCC5-tiazolil)metoksykarbonylo]amino]-3-hydroksy-l,6-difenyloheksan;

N-t-buty lodekahy dro-2- [2(R)-hydroksy-4-(fenylotio)3 (S)- [[N- [(2-metylo-3 -hydroksyfenylo)karbonyIo]amino)butylo)-(4aR,8aS)-izochinolino-3(S)karboksyamid;

[4R-(4a,5'a,6p,7P)]-l,3-bis[(3-aminofenylo)metylo]-heksahydro-5,6-dihydroksy-4,7-bis(fenylometylo)-2H-l,3-diazepin-2-on;

N-[2R-hydroksy-3-[[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo](2-metylopropylo)amino)-lS-(fenylometylo)propylo)2S[[(pirolidyn-l-yl)acetylo]amino]-3,3-dimetylobutanamid;

N-[2R-hydroksy-3-[(2-metylopropylo)[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo]amino)-lS-(fenylometylo)propylo]-2S-metylo-3-(metylosulfonylo)propanamid;

[lS-[lR*(R*),2S*]]-N-[2-hydroksy-3-[N¹-(2-metylopropylo)-N¹-(4-metoksyfenylosulfonylo)amino)-l-(fenylometylo)propylo]-2-metylo-3-(metylosulfonylo)propanamid;

2S-[[(N-metyloamino)acetylo)amino]-N-[2R-hydroksy-3-[[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo](2-metylopropylo)amino]-1 S-(fenylometylo)propylo)-3,3-dimetylobutanamid; lub (2R,3S)-3-(N-metyloaminoacetylo-L-t-butyloglicynylo)-amino-l-(N-izoamylo-N-(t-butylokarbamoilo))amino-4-fenylo-2-butanol;

i (b) skuteczną ilość drugiego inhibitora retrowirusowej proteazy wybranego z grupy obejmującej

N-(2(R)-hydroksy-1 (S)-indanylo)-2(R)-fenylometylo-4(S)-hydroksy-5-( 1 -(4-(3-pirydylmetylo)-2(S)-N'-(t-butylokarboksyamido)piperazynylo))pentanamid;

N-t-butylodekahydro-2-[2(R)-hydroksy-4-fenylo-3(S)[[N-(2-chinolilokarbonylo)-L-asparaginy lo] amino] buty lo] (4aR, 8aS)-izochinolino-3 (S)-karboksyamid;

(2S,3R,4S,5S)-2,5-bis-[N-[N-[[N-metylo-N-(2-pirydynylometylo)amino]karbonylo)walinylo)amino]-3,4-dihydroksy-1,6-difenyloheksan;

(2S,3S,5S)-5-[N-[N-[N-metylo-Ń-[(2-izopropylo-4-tiazolilo)metylo]amino]karbonylo]walinylo]amino]-2-[N[(5-tiazolilo)metoksykarbonylo]amino)-3-hydroksy-l,6-difenyloheksan;

N-t-butylodekahydro-2-[2(R)-hydroksy-4-(fenylotio)-3(S)-[[N-[(2-metylo-3-hydroksyfenylo)karbonyl)amino)butylo]-(4aR,8aS)-izochinolino-3(S)-karboksyamid [4R-(4a,5a,6p,7P)]-l,3-bis[(3-aminofenylo)metylo]-heksahydro-5,6-dihydroksy-4,7-bis(fenylometyło)-2H-l,3-diazepin-2-on;

N-[2R-hydroksy-3-[[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo](2-metylopropylo)amino)-lS-(fenylometylo)propylo]-2S[[(pirolidyn-l-ylo)acetylo]amino)-3,3-dimetylobutanamid;

N-[2R-hydroksy-3-[(2-metylopropylo)[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo]amino)-lS-(fenylometylo)propylo]-2S-metylo-3-(metylosulfonylo)propanamid;

180 070 [ 1S- [ 1 R*(R*), 2S*])-N- [2-hydroksy-3 -[N¹ -(2-mety lopropy lo)-N¹ -(4-metoksy fenylosulfonylo)amino]-l-(fenylometylo)propylo)-2-metylo-3-(metylosulfonylo)propanamid;

2S-[[(N-metyloamino)acetylo]amino)-N-[2R-hydroksy-3-[[(l,3-benzodioksol-5-ilo)sulfonylo](2-metylopropylo)amino]-lS-(fenylometylo)propylo)-3,3-dimetylobutanamid; lub (2R,3S)-3-(N-metyloaminoacetylo-L-t-butyloglicynylo)-amino-l-(N-izoamylo-N-(t-butylokarbamoilo))amino-4-fenylo-2-butanol;

przy czym drugi inhibitor retrowirusowej proteazy jest skuteczny wobec co najmniej jednego retrowirusowego szczepu opornego na pierwszy inhibitor retrowirusowej proteazy i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

2. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że jako pierwszy inhibitor retrowirusowej proteazy zawiera

N-t-butylodekahydro-2-[2(R)-hydroksy-4-fenylo-3(S)-[[N-(2-chinolilokarbonylo)-L-asparaginylo]amino)butylo]-(4aR, 8aS)-izochinolino-3(S)-karboksyamid, a jako drugi inhibitor retrowirusowej proteazy zawiera (2S,3S,5S)-5-[N-[N-[N-[N-metylo-N-[(2-izopropylo-4-tiazolilo)metylo]amino]karbonylo]walinylo]amino]-2-[N[(5-tiazolilo)metoksykarbonylo]amino]-3-hydroksy-l,6-difenyloheksan.

3. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że ponadto zawiera co najmniej jeden antywirusowy środek inny niż inhibitor proteazy.

4. Środek według zastrz. 3, znamienny tym, że jako środek antywirusowy zawiera analog nukleozydu, nienukleozydowy inhibitor odwrotnej transkryptazy, antagonistę tat lub inhibitor glikozydazy.

5. Środek według zastrz. 4, znamienny tym, że jako analog nukleozydu zawiera AZT, DDI, DDC, 3TC, D4T lub PMEA i jako inhibitor glikozydazy zawiera kastanosperminę lub N-butylo-1 -deoksynojirmycynę.