FI105101B

FI105101B - Menetelmä hepariini- tai heparaanirakenteen omaavien puolisynteettisten glykoaminoglykaanien valmistamiseksi

Info

Publication number: FI105101B
Application number: FI941431A
Authority: FI
Inventors: Fabrizio Ungarelli; Silvano Piani
Original assignee: Alfa Wassermann Spa
Priority date: 1993-03-29
Filing date: 1994-03-28
Publication date: 2000-06-15
Also published as: JPH06298805A; DK0618234T3; EP0618234B1; CA2114862C; DE69403537D1; GR3024416T3; JP2731721B2; IL108689A0; AU664939B2; NO941128L; DE69403537T2; AU5508594A; IT1264101B1; ITBO930125A0; FI941431A; NO305994B1; TW266215B; ITBO930125A1; FI941431A0; ES2102087T3

Description

105101

Menetelmä hepariini- tax heparaanirakenteen omaavien puolisynteettisten glykosaminoglykaanien valmis teolliseksi

Keksinnön kohteena on menetelmä puolisynteettisten ' 5 glykosaminoglykaanien valmistamiseksi, joilla on kaava o« S1 0i^"° Ah' X -eΑϋ—/ ,Λ 10 ° il»; ‘ «o,· khso; •s 1:

JP L

— .0# coo1 /“° a-Nyi / iisy A- OH HHCOCHj 111 J n 20 jolloin glykosaminoglykaaneilla on hepariini- tai heparaa-nirakenne modifioituneena o-L-iduroni-2-O-sulfaattihapon 2-asemassa, jossa sulfaattiryhmä on kokonaan tai osittain substituoitu nukleofiilisella radikaalilla. Mainittu menetelmä toteutetaan käsittelemällä glykosaminoglykaaneja, * " 25 joilla on hepariini- tai heparaanirakenne, nukleofiilisten aineiden avulla emäksisessä väliaineessa.

US-patentti 5 010 063 kuvaa hepariini- tai heparaanirakenteen omaavien glykosaminoglykaanien rakenteellisia modifiointeja emäksisessä väliaineessa ja tämän-30 jälkeistä uusien johdannaisten eristämistä reaktioseok-* . sesta, kuten erehtymättömästi on osoitettu kemiallisten ja fysikaalisten ominaisuuksien ja erityisesti 13C-NMR spektrin perusteella.

Myöhemmässä US-patentissa 5 104 860 kuvataan edel-35 leen rakenteellista modifiointia emäksisessä tai neutraa- 2 105101 lissa väliaineessa, mikä, lähtien tuotteista, jotka oli muodostettu US-5 010 063:ssa kuvatuissa reaktio-olosuhteissa, ja glykosaminoglykaaneista, joilla on hepariini-tai heparaanirakenne ja joita käytettiin lähtöaineina sa-5 massa patentissa, aikaansai monia uusia tuotteita, jotka poikkeavat mainitussa patentissa kuvatuista ja olivat uusia verrattuna alan viimeiseen kehitykseen, kuten erehtymättömästä on osoitettu kemiallisten ja fysikaalisten ominaisuuksien ja erityisesti 13C-NMR spektrin perusteella.

10 US-patentissa 5 010 063 kuvattujen tuotteiden ke mialliset ja fysikaaliset ominaisuudet ja myöhemmät rakenteellisen tutkimuksen tulokset, joita ovat kuvanneet Ja-seia M., Rej R., Sauriol F., Periin A.S. julkaisussa Can. J. Chem (57, 1449 - 56 (1989) , joiden spesifisenä tarkoi- 15 tuksena on selittää rakenteellisten modifointien reaktio-mekanismi emäksisessä väliaineessa, ovat osoittaneet, että näissä johdannaisissa esiintyy modifiointia, joka koskee ainoastaan yhtä glykosaminoglykaaneille, joilla on hepa-riini- tai heparaanirakenne, ominaisista monosakkaridiyk-

20 siköistä, erityisemmin α-L-iduronihappoyksikköä, joka on sulfatoitu 2-asemassa ja pitää sisällään sen transformaation 2,3-epoksigulonihappoyksiköksi. Näin saatuja epoksi-deja kuvaa seuraava yleinen kaava IV

' 25 Γ ”1 Γ

OR OR

NHSO, OSO,' HHSOj 30 L -J P L- -Jq

OR

COO f 35 _Qj\°H / /L· OH NHCOCH, 1

IV

L Jn 3 105101

Samalla tavalla on osoitettu, että puolisynteettiset glykosaminoglykaanit, joissa on 2,3-epoksigulonihappo-yksikkö, ja myös glykosaminoglykaanit, joilla on heparii-ni- tai heparaanirakenne, reaktio-olosuhteissa, jotka vas-5 taavat US-patentissa 5 104 860 kuvattuja, läpikäyvät ra-kennemodifioinnin, joka myös koskee o-L-iduronihapon sak-karidiyksikköä, joka on sulfatoitu 2-asemassa ja käsittää sakkaridiyksikön muuttamisen ei-sulfatoiduksi a-L-iduroni-happo- tai α-L-galakturonihappoyksiköksi, käytetyissä 10 reaktio-olosuhteissa.

Täten US-patentti 5 010 063 kuvaa puolisynteettisiä glykosaminoglykaaneja, joissa on funktionaalinen epoksi-ryhmä a-L-iduroni-2-O-sulfaattihapon yksikön asemien 2 ja 3 välissä, ja tarvittavia reaktio-olosuhteita niiden ai-15 kaansaamiseksi, kun taas US-patentti 5 104 860 kuvaa tuot teita, jotka on saatu edelleen muuntamalla epoksidia, jonka on vahvistettu sisältävän yhden yksikön ei-sulfatoitua α-L-iduroni- tai α-L-galakturonihappoa, ja reaktio-olosuhteita, jotka ovat tarpeellisia näiden saamiseksi lähtien 20 itse epoksidista tai vaihtoehtoisesti lähtien glykosamino- glykaaneista, joilla on hepariini- tai heparaanirakenne ja joita käytettiin lähtötuotteina US-patentissa 5 010 063. Myöhemmin julkaistussa eurooppalaisessa patenttihakemuksessa EP 565 863 kuvataan puolisynteettisiä glykosamino-; · 25 glykaaneja, joista yksi glykosaminoglykaaneille, joilla on hepariini- tai heparaanirakenne, ominaisista sakkaridiyk-siköistä, joka spesifisemmin sisältää a-L-iduroni-2-O-sul-faattihapon, on läpikäynyt täydellisen tai osittaisen ra-kennemodifioinnin 2-asemassa, jossa sulfaattiryhmä on sub-30 stituoitu nukleofiilisellä radikaalilla. Mainitussa jul- * t kaistussa eurooppalaisessa patenttihakemuksessa kuvattu

menetelmä koskee puolisynteettisten glykosaminoglykaanien valmistusta, joilla on yleinen kaava III

» 35 4 105101

OR OR

/coo M”1 / \ /coo' \TJ ./ \ 0J\JM / (_/\oh /i_ oj\oh / lN°h 5 ^zv NHSO j* ' OSO, NHSO,' R. R .

j r L j 1

OR

10 Τ' 0 f QJ\m ? U\QH Λ_ OH NHCOCH,

-1" III

15 käsittelemällä kaavan IV epoksideja, joita on kuvattu US-patentissa 5 010 063, nukleofiilisellä aineella.

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää hepariini-tai heparaanirakenteen omaavien puolisynteettisten gly-20 kosaminoglykaanien syntetisoimiseksi, joiden kaava on

OR

A" V / \ AV. /\

25 -oA·’11 / U\°H A -οΛ°μ / uSo'1 /L

NHSO,' 050, HHSO, R. R.

Jr L Ji 30 Γ Ί C0O /

oJ\oh / lAo» y/L

OH NHCOCH, UI

35 *“ J " 5 105101 jossa p + q = m, jolloin p on muu kuin 0, ja m ja n ovat kokonaislukuja 1 - 100, R on vety tai sulfaattiryhmä S03', ja -ZiRjjR! on nukleofiilinen radikaali, joka on peräisin nukleofiilisestä reagenssista, joka on valittu ryhmästä 5 primaariset ja sekundaariset amiinit, sekundaariset he-terosykliset amiinit, aminoalkoholit, aminotiolit, aminohapot, aminoesterit, peptidit, alkoholit, fenolit, merkaptaanit, ditiolit, tiofenolit, hydroksyyliamiinit, hydratsiinit, hydratsidit ja natriumatsidi. Menetelmälle 10 on tunnusomaista, että hepariini- tai heparaanirakenteen omaava glykosaminoglykaani, jonka kaava on OR . 0.

15 / lK?h λ. / lNs" A

0S0, NHS0, OH MHCOCH, * — J L J n

A B

20 jossa m, n ja R tarkoittavat samaa kuin edellä, saatetaan reagoimaan 10 - 100 mooliekvivalentin kanssa, suhteessa hepariini- tai heparaanirakenteen omaavan kaavan I mukaiseen glykosaminoglykaanin dimeeriyksikköön, edellä mainittua nukleofiilistä reagenssia vesipitoisessa liuoksessa, m· 25 jolloin läsnä on riittävä määrä epäorgaanista tai orgaanista emästä muodostamaan suola mistä tahansa nukle-ofiilisessä reagenssissa läsnäolevasta happoryhmästä ja/tai vapauttamaan kyseinen nukleofiilinen reagenssi mistä tahansa suoloista, joita ne ovat voineet muodostaa hap-30 pojen kanssa, ja muodostamaan emäksisyysylimäärä niin, ' että reaktioseoksen normaalisuus on 0,5 - IN käytetyn emäksen suhteen, ja mahdollisesti inertissä kaasuilmake-hässä sekoittaen 24 - 96 tuntia lämpötilassa 10 - 40 °C, neutraloidaan kylmän vesipitoisen liuoksen pH lisäämällä 35 vesipitoista vetykloridihappoliuosta, poistetaan mahdolli- 6 105101 sesti ylimäärä nukleofiilistä reagenssia uuttamalla liuottimena, joka ei ole veden kanssa sekoittuva, tai suodattamalla, tai suorittamalla vesipitoiselle liuokselle dialyysi juoksevalla vedellä ja tislatulla vedellä, ja tuote 5 eristetään lyofilisoimalla sitä sisältävä vesipitoinen liuos tai saostamalla lisäämällä sopivaa liuotinta.

Tällä uudella menetelmällä vältytään menetelmästä, jota on kuvattu julkaistussa eurooppalaisessa patenttihakemuksessa EP-565 863, koska tässä käytetään lähtö-10 aineena kaavan I glykosaminoglykaaneja kun taas mainitussa julkaistussa eurooppalaisessa patenttihakemuksessa läh-töainetuote on kaavan IV epoksidijohdannainen, joka vuorostaan on saatu kaavan I glykosaminoglykaanista mene telmän mukaisesti, jota on kuvattu US-patentissa 15 5 010 063. Hyöty kaavan III tuotteen saamisesta suoraan ainoastaan yhdestä reaktiosta lähtien kaavan I glykosaminoglykaanista sensijaan että käytettäisiin kahta peräkkäistä reaktiota, joista ensimmäinen käsittää kaavan IV epoksidin valmistusmenetelmän, eristämisen ja puhdis-20 tamisen lähtien kaavan I glykosaminoglykaanista, on ilmeinen ottaen huomioon kokonaissaannon ja teollisuuskus-tannukset.

Ilmaisulla glykosaminoglykaanit, joilla on hepariini- tai heparaanirakenne, tarkoitetaan polysak-25 karideja, joiden molekyylipaino on n. 3 000 - n. 50 000

Daltonia ja niille on tunnusomaista se tosiasia, että niissä on disakkaridiyksikkö, joka koostuu uronihaposta (joka voi olla α-L-iduroni- tai β-D-glukuronihappo) ja a-D-glukosamiinista, liitettyinä vuorottain 1,4-glyko-30 sidisidoksilla, kuten Lindhal U. , Kjellen L. ovat kuvanneet julkaisussa Thrombosis and Haemostasis 66, 44 - 48 (1991) ja Turnbull J.E., Gallagher J.T. julkaisussa Bio-chem. J. 273, 553 - 559 (1991) . Koska a-L-iduronihappo voidaan sulfatoida 2-asemassa ja glukosamiini voidaan 35 N-asetyloida, N-sulfatoida, 6-O-sulfatoida, 3-O-sulfatoida 7 105101 muutettavien substituenttiasemien mukaisesti, vähintäin kymmenen erilaista disakkaridiyksikköä, joiden yhdistäminen aikaansaa suuren määrän erilaisia sekvenssejä, ovat mahdollisia. Pitäen mielessä tavallisimmat disakkaridiyk-5 siköt ja yleisimmät sekvenssit, voidaan todeta kohtuullisella todennäköisyydellä, että yleinen kaava I voi kuvata glykosaminoglykaaneja, joilla on hepariini- tai heparaani-rakenne 10 Γ Ί Γ

OR OR

-o-Nj" / lN?h Λ— -o-Nu" / Lta* /Λ- OSO, HHSO,' OH tlHCOCH, 15 L J L J n

A B I

jossa R on vety tai sulfaatti jäännös (SOj'1 ja jossa m ja n ovat kokonaislukuja 1 - 100.

20 Luonnollista alkuperää olevien hepariinirakenteis- ten glykosaminoglykaanien m-arvo on korkea ja disakkari-diyksikkö A muodostaa n. 80 % disakkaridiyksiköistä; toisaalta, luonnollista alkuperää olevien hepariinirakenteis-ten glykosaminoglykaanien n-arvo on korkea ja disakkari-25 diyksikkö B muodostaa n. 80 % disakkaridiyksiköistä.

Yleisten kaavojen I ja III tarkoituksena on esittää pääsakkaridiyksiköiden koostumus, mutta ne eivät viittaa niiden sekvenssiin.

Kuten alan asiantuntijat tietävät, on mahdollista 30 tehdä luonnollista alkuperää olevien glykosaminoglykaanien * kemiallisia modifiointeja esimerkiksi N-desulfatoimalla, mitä mahdollisesti seuraa N-asetylointi, näin aikaansaaden puolisynteettisiä N-desulfatoituja hepariineja tai N-desulf atoituj a-N-asetyloituj a hepariineja. Lisäksi nämä gly-35 kosaminoglykaanit, riippumatta siitä, ovatko ne luonnol- • β 105101 lisiä tai puolisynteettisiä, voidaan altistaa depolyme-rointimenetelmille, joissa molekyylipaino on yleisesti tasolla 3 000 - 10 000 Daltonia.

Tässä keksinnössä kuvattu rakennemodifiointi uusien 5 puolisynteettisten glykosaminoglykaanien, joilla on hepa-riini- tai heparaanirakenne, aikaansaamiseksi koskee a-L-iduroni-2-O-sulfaattihapon yksikköä, jossa tapahtuu osittainen tai täydellinen O-sulfaattiryhmän substitutio 2-asemassa nukleofiilisella jäännöksellä, riippumatta siilo tä mikä haluttu yhdiste, jolla on hepariini- tai heparaanirakenne, onkaan. Todellakin, selektiivisyyden lisäksi tässä keksinnössä kuvattua kemiallista menetelmää voidaan soveltaa glykosaminoglykaaneille, joilla on hepariini- tai heparaanirakenne, kaikilla mahdollisilla sekvensseillä; 15 ts. se on riippumaton sakkaridiyksikön funktionaalisuuden tasosta ja tyypistä, mikä edeltää tai seuraa a-L-iduroni-2-O-sulfaattihappoyksikön sekvenssiä, joka on rakennemodif iointireaktion kohde.

Uusien tuotteiden rakennetta kuvaa yleinen kaava III

20 OR -O* 0J\0H y lKj" / l/\°h /X- *· Z HMSO,' ’ 0S0,' HHSO, R; R.

Jp L -Jq 30 coo' " 0_T\?H / L/\?" /t- OH NHCOCH, _ —J n 35

III

9 105101 jossa p + q = m, p on muu kuin 0 ja m, n ja R ovat kuten edellä ja jossa -Z(R2)R! on nukleofiilinen ryhmä, joka on lisätty tämän keksinnön menetelmän avulla. Tällä tavalla saatuja yhdisteitä kutsutaan "puolisynteettisiksi glyko-5 saminoglykaaneiksi, joilla on hepariini- tai heparaanira-kenne.

Rakennemodifiointireaktio, joka käsittää nukleofii-lisen radikaalin osittaisen tai täydellisen lisäämisen α-L-iduronihapon 2-asemaan, ei johda glykosaminoglykaanien 10 depolymeroitumiseen tai polysakkaridiketjujen, jotka muodostavat niitä, molekyylipainojakaantuman muutokseen ja tästä syystä tätä reaktiota voidaan soveltaa minkä tahansa molekyylipainon glykosaminoglykaaneille, joilla on hepariini- tai heparaanirakenne. Näin saadut tuotteet voidaan 15 kuitenkin altistaa tunnetuille kemiallisille tai entsymaa-ttisille depolymerointimenetelmille.

Nukleofiilisessa radikaalissa -Z(R2)R! (kaava II) on erityisesti happi, rikki tai typpi, R! on haarautumaton tai haarautunut alkyyli-, amiini-, aromaattinen, diatso- 2 0 tai hydroksyyliradikaali, joka on substituoitu tai sub- stituoimaton ja R2 on ei mitään tai vety tai haarautumaton tai haarautunut (C^g)alkyyliradikaali tai muodostaa Rx:n kanssa heterosyklisen renkaan.

Erityisen edullisia tämän keksinnön toteuttamises-25 sa ovat radikaalit -Z(R2)Rlf jotka on johdettu seuraavista nukleofiilisistä reagensseista: glysiini, glysyyligly- siini, L-systeiini, asetyyli-L-systeiini, L-systeiinie-tyyliesteri, 2-aminotiofenoli, 1,3-propaaniditioli, syste-amiini, natriumatsidi, 2-aminoetyylibisulfaatti, tauriini, 30 tioglykolihappo, β-alaniinietyyliesteri, L-systiini, hydr- oksyyliamiini, glysyylitauriini, systeinyylitauriini, gly-syylisysteiini, glysyylifenyylialaniini, glysyylityro-» siini, 2-aminoetanoli, glysiiniesteri 2-aminoetanolilla, glysiiniamidi 2-aminoetanolilla, arginyylilysiini,argi-35 niini, lysiini, 2-aminoetanoliesteri etikkahapolla, sali- • 10 105101 syylihappo, metioniini, glysyyliproliini, gamma-amino-butyyrihappo, lysyyliprolyyliarginiini, treonyylilysyyli-proliini, treonyylilysiini, prolyyliarginiini, lysyyli-proliini, koliini, 4-(3-aminopropyyli)-2-hydroksibentsoe-5 happo ja 4-(2-aminoetyyli)-2-hydroksibentsoehappo.

Valmistusmenetelmässä puolisynteettisten glykosami-noglykaanien, joilla on hepariini- tai heparaanirakenne ja joilla on yleinen kaava III, valmistamiseksi saatetaan glykosaminoglykaani, jolla on hepariini- tai heparaanira-10 kenne ja jolla on yleinen kaava I, reagoimaan kaavan II nukleofiilisen reagenssin kanssa vesipitoisessa liuoksessa jolloin läsnä on epäorgaaninen tai orgaaninen emäs, joka pystyy muodostamaan suolaksi minkä tahansa nukleofiilisis-sä reagenssissa olevan happoryhmän ja/tai vapauttamaan 15 kyseiset nukleofiiliset reagenssit mistä tahansa suolasta, joita niillä voi olla hapon kaltaisten aineiden kanssa, ja muodostamaan voimakkaan emäksisyyden reaktioseoksessa alueella 0,5 N - IN riippuen käytetystä emäksestä. Reaktio toteutetaan liuottamalla veteen pitoisuutena 1 % - 5 % 20 kaavan I glykosaminoglykaania, jolla on hepariini- tai heparaanirakenne ja lisäämällä tähän liuokseen vesipitoista liuosta, jossa on nukleofiilistä reagenssia ja epäorgaanista tai orgaanista emästä. Nukleofiilisen aineen määrä on 10 - 100 mooliekvivalenttia, suhteessa kaavan I 25 glykosaminoglykaanin dimeeriseen yksikköön.

Alkali- tai maa-alkalimetallihydroksideja, edullisesti natrium- tai kaliumhydroksidia käytetään epäorgaanisina emäksinä, kun taas tertiaarisia amiineja, kuten trietyyliamiinia käytetään edullisesti orgaanisina emäk-30 sinä.

Reaktioseosta sekoitetaan mahdollisesti inertin kaasun ilmakehässä, edullisesti typen ilmakehässä, kun nukleofiilinen reagenssi hapettuu helposti, lämpötilassa 10 °C - 40 °C 24 - 96 tuntia. Reaktion lopulla mahdollisen 35 jäähdyttämisen jälkeen reaktioseos tehdään neutraaliksi u 105101 lisäämällä vesipitoista vetykloridihappoa. Ylimäärä nuk-leofiilistä reagenssia voidaan valinnaisesti poistaa esimerkiksi uuttamalla liuottimella, joka ei sekoitu veden kanssa, kloroformilla tai dietyylieetterillä tai suodat-' 5 tamalla, kun se ei ole liukoinen vesipitoiseen väliainee seen, jolla on neutraali pH. Kirkasta vesipitoista liuosta voidaan edelleen puhdistaa myöhemmässä vaiheesa dialyysillä, rajana 3000 Daltonia, ensin vesijohtovedessä ja sitten tislatussa vedessä. Lopuksi puolisynteettinen glykos-10 aminoglykaani, jolla on hepariini- tai heparaanirakenne ja yleinen kaava III, eristetään lyofilisoimalla vesipitoinen liuos, joka sisältää sitä, tai saostamalla lisäämällä sopivaa liuotinta.

Seuraavat esimerkit kuvaavat edelleen tätä keksin- 15 töä.

Esimerkki 1

Puolisynteettinen glykosaminoglykaani, jolla on hepariinirakenne ja yleinen kaava III, jossa -ZiRjJRj on N-glysyyli 20 Liuos, jossa oli 3760 mg glysiiniä ja 2500 mg nat- riumhydroksidia 22,5 ml-.ssa vettä, lisättiin huoneenlämpö-tilassa liuokseen, jossa oli 2,5 ml vettä 500 mg:ssa hepariini natriumsuolaa.

Reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 48 25 tuntia ja neutraloitiin sitten lisäämällä vetykloridihap poa ja sitten liuosta dialysoitiin, rajana 3000 Daltonia 12 tuntia vesijohtovedessä ja kuusi tuntia tislatussa vedessä. Liuos lyofilisoitiin sitten ja saatiin 480 mg tuotetta .

3 0 Esimerkki 2

Puolisynteettinen glykosaminoglykaani, jolla on hepariinirakenne ja jolla on yleinen kaava III, jossa -2(1¾)¾ on L-p-amino-p-karboksietyylitio

Reaktio toteutettiin samoissa esimerkissä 1 kuva-35 tuissa olosuhteissa käyttäen 8780 mg L-systeiini monohyd- 12 105101 raattihydrokloridia 3760 mg:n asemasta glysiiniä ja 4500 mg natriumhydroksidia 2500 mg:n asemesta.

Saatiin 520 mg tuotetta.

Esimerkki 3 5 Puolisynteettinen glykosaminoglykaani, jolla on hepariinirakenne ja jolla on yleinen kaava III, jossa -Z (R2) Rx on 2-aminofenyylitio

Reaktio toteutettiin samoissa esimerkissä 1 kuvatuissa olosuhteissa käyttäen 6300 mg 2-aminotiofenolia 10 3760 mg:n asemesta glysiiniä ja reaktioaika pidennettiin 72 tunniksi. Reaktion lopulla pH:n neutraloinnin jälkeen lisäämällä vetykloridihappoa, ylimäärä aminotiofenolia eliminoitiin uuttamalla kloroformilla. Vesipitoinen liuos dialysoitiin ja lyofilisoitiin sitten, kuten esimekissä 1 15 antamaan 530 mg tuotetta.

Esimerkki 4

Puolisynteettinen glykosaminoglykaani, jolla on hepariinirakenne ja jolla on yleinen kaava III, jossa -Z(R2)R1 on karboksimetyylitio 20 Reaktio toteutettiin typen ilmakehässä samoissa esimerkissä 1 kuvatuissa olosuhteissa käyttäen 7416 mg tioglykolihappoa ja 6 900 mg natriumhydroksidia 20 ml.-ssa vettä ja reaktioaika pidennettiin 72 tunniksi.

Saatiin 400 mg tuotetta.

« 1 • 1

Claims

105101

1. Menetelmä hepariini- tai heparaanirakenteen omaavien puolisynteettisten glykosaminoglykaanien synte-5 tisoimiseksi, joiden kaava on os "Ί /ST / \ /cm' \Γ"> / \ οΛ?11 / u\qh /[_ -oA?H / lK°h A. 10 r''Zs1 NHSO," 1 OSO,· NHSO,' — —'rl— — 1 OK

15 J°° O / o _0J\OH ? lKoII y4_ OH HHCOCHj jjj — «J fl 20 jossa p + q = m, jolloin p on muu kuin 0, ja m ja n ovat kokonaislukuja 1 - 100, R on vety tai sulfaattiryhmä S03", ja -Z(R2)R1 on nukleofiilinen radikaali, joka on peräisin nukleofiilisestä reagenssista, joka on valittu ryhmästä primaariset ja sekundaariset amiinit, sekundaariset he-. 25 terosykliset amiinit, aminoalkoholit, aminotiolit, aminohapot, aminoesterit, peptidit, alkoholit, fenolit, merkaptaanit, ditiolit, tiofenolit, hydroksyyliamiinit, hydratsiinit, hydratsidit ja natriumatsidi, tunnet-t u siitä, että hepariini- tai heparaanirakenteen omaava 30 glykosaminoglykaani, jonka kaava on OR JOK -0i\011 / lN°h A -A011 / A.

35 OSO, MMSO, I OM HHCUCII, I 1 — — n L_ J A B 105101 jossa m, n ja R tarkoittavat samaa kuin edellä, saatetaan reagoimaan 10 - 100 mooliekvivalentin kanssa, suhteessa hepariini- tai heparaanirakenteen omaavan kaavan I mukaiseen glykosaminoglykaanin dimeeriyksikköön, edellä mainit-5 tua nukleofiilistä reagenssia vesipitoisessa liuoksessa, jolloin läsnä on riittävä määrä epäorgaanista tai orgaanista emästä muodostamaan suola mistä tahansa nukle-ofiilisessä reagenssissa läsnäolevasta happoryhmästä ja/tai vapauttamaan kyseinen nukleofiilinen reagenssi mis-10 tä tahansa suoloista, joita ne ovat voineet muodostaa happojen kanssa, ja muodostamaan emäksisyysylimäärä niin, että reaktioseoksen normaalisuus on 0,5 - 1 N käytetyn emäksen suhteen, ja mahdollisesti inertissä kaasuilmake-hässä sekoittaen 24 - 96 tuntia lämpötilassa 10 - 40 °C, 15 neutraloidaan kylmän vesipitoisen liuoksen pH lisäämällä vesipitoista vetykloridihappoliuosta, poistetaan mahdollisesti ylimäärä nukleofiilistä reagenssia uuttamalla liuottimena, joka ei ole veden kanssa sekoittuva, tai suodattamalla, tai suorittamalla vesipitoiselle liuokselle dia-20 lyysi juoksevalla vedellä ja tislatulla vedellä, ja tuote eristetään lyofilisoimalla sitä sisältävä vesipitoinen liuos tai saostamalla lisäämällä sopivaa liuotinta.

2 Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetty emäs on natriumhydroksidi, 25 kaliumhydroksidi tai trietyyliamiini.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että radikaali -ZiRjRj. on johdettu ryhmästä glysiini, glysyyliglysiini, L-kysteiini, asetyyli-L-kysteiini, L-kysteiinietyyliesteri, 2-aminotiofenoli, 1,3-30 propaaniditioli, kysteamiini, natriumatsidi, 2-aminoetyy- libisulfaatti, tauriini, tioglykolihappo, β-alaniinietyy-liesteri, L-kystiini, hydroksyyliamiini, glysyylitauriini, kysteinyylitauriini, glysyylikysteiini, glysyylifenyyli-alaniini, glysyylityrosiini, 2-aminoetanoli, glysiinieste-35 ri 2-aminoetanolilla, glysiiniamidi 2-aminoetanolilla, 105101 arginyylilysiini, arginiini, lysiini, 2-aminoetanoliesteri etikkahapolla, salisyylihappo, metioniini, glysyyliprolii-ni, γ-aminobutyyrihappo, lysyyliprolyyliarginiini, treo-nyylilysyyliproliini, treonyylilysiini, prolyyliarginiini, 5 lysyyliproliini, koliini, 4-(3-aminopropyyli)-2-hydroksi-bentsoehappo ja 4-(2-aminoetyyli)-2-hydroksibentsoehappo. 1 » ” 4 4 i£ 105101