ES3073133T3

ES3073133T3 - Factor xi antibodies and methods of use

Info

Publication number: ES3073133T3
Application number: ES16734042T
Authority: ES
Inventors: Jorg Eder; Stefan Ewert; Ulrich Hassiepen; Yasser Khder; Lorenz M Mayr; Samu Melkko; Nikolaus Schiering
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2015-06-26
Filing date: 2016-06-24
Publication date: 2026-07-08
Anticipated expiration: 2036-06-24
Also published as: TW202222839A; ZA201708589B; AU2019264514A1; CN114380914A; US20180355056A1; DK3313891T3; JP2018526976A; NZ738480A; PH12021551700A1; LT3313891T; CL2017003261A1; RU2020142517A; RU2018102798A3; IL295859B1; JP6698711B2; MY185813A; SG10201913262RA; MA42243A; AU2019264514B2; WO2016207858A1

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión a antígenos de los mismos que se unen al Factor XI humano y al Factor XI activado ("Factor XIa"), así como a composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento que los comprenden. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Anticuerpos del factor XI y procedimientos de utilización

[0003] La presente solicitud contiene una lista de secuencias que se ha enviado electrónicamente en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 23 de junio de 2016, se llama "PAT056955-WO-PCT_SL.txt" y tiene un tamaño de 45.685 bytes.

[0004] ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

[0005] La trombosis se refiere a la formación de trombos dentro de los vasos sanguíneos, como consecuencia de una combinación de factores de riesgo hereditarios y adquiridos, conocidos como trombofilia o estados de hipercoagulabilidad. El daño a la pared vascular, la estasis, el aumento de la reactividad plaquetaria y la activación de los factores de coagulación son algunas de las características fundamentales de la trombosis. La trombosis puede ocurrir tanto en la circulación venosa como arterial y puede dar lugar al desarrollo de trombosis venosa profunda (TVP), embolia pulmonar y accidente cerebrovascular. Si se produce un trombo en el sistema arterial, puede ocurrir isquemia distal, lo que lleva a síndromes coronarios agudos (SCA), accidente cerebrovascular isquémico e isquemia aguda de las extremidades. La formación de trombos en el sistema venoso generalmente conduce a trombosis venosa profunda, embolia pulmonar e hipertensión pulmonar tromboembólica crónica. También pueden formarse coágulos en la orejuela izquierda en pacientes con fibrilación auricular (FA), y los trombos desprendidos pueden dar lugar a complicaciones potencialmente devastadoras, como accidente cerebrovascular tromboembólico y embolia sistémica. Los fármacos antitrombóticos disponibles actualmente, como la heparina de bajo peso molecular (HBPM), los inhibidores de la trombina y los inhibidores del factor Xa (FXa), se asocian a un riesgo significativo de hemorragia (Weitz JI (2010) Thromb. Haemost.103, 62). Sería muy deseable desarrollar un agente antitrombótico que no afecte la hemostasia y, por lo tanto, no provoque complicaciones hemorrágicas.

[0006] Los anticoagulantes actuales se administran por vía inyectable o oral. El anticoagulante inyectable LMWH es ampliamente utilizado y ofrece un perfil terapéutico mejorado en comparación con la heparina no fraccionada, que se utilizaba anteriormente. Durante las últimas décadas, el anticoagulante oral más utilizado ha sido la warfarina. La warfarina tiene un estrecho margen terapéutico que requiere un control frecuente del estado de coagulación y presenta diversas interacciones farmacológicas. Más recientemente, los inhibidores directos del FXa y de la trombina, disponibles por vía oral, han entrado en el mercado de los anticoagulantes y su uso es cada vez más frecuente.

[0007] Las HBPM, los inhibidores del FXa y los inhibidores de la trombina son eficaces en la prevención de la enfermedad tromboembólica venosa posoperatoria, en el tratamiento de la TVP espontánea y la embolia pulmonar, y en la prevención del ictus en la fibrilación auricular. Sin embargo, estos anticoagulantes también se asocian con complicaciones hemorrágicas que fueron generalmente comparables a las observadas con los fármacos más antiguos warfarina y heparina no fraccionada. En el ensayo clínico ADVANCE-2, el inhibidor del FXa apixabán (Eliquis) se comparó con la HBPM enoxaparina en pacientes después de una artroplastia total de rodilla. Si bien el tratamiento agudo con apixabán fue más eficaz para prevenir la enfermedad tromboembólica venosa que la enoxaparina, ambos agentes se asociaron con un riesgo significativo de hemorragia. Se produjo hemorragia clínicamente relevante en el 4% de los pacientes que recibieron apixabán y en el 5% de los pacientes tratados con enoxaparina (Lassen, MR, et al. (2009) N. Engl. J. Med.361, 594).

[0008] En el ensayo RE-LY, el inhibidor directo de la trombina dabigatrán (Pradaxa) se comparó con la warfarina en pacientes con fibrilación auricular y riesgo de accidente cerebrovascular (Connolly, SJ, et al. (2009) N. Engl. J. Med.

[0009] 361, 1139). El tratamiento crónico con dabigatrán se asoció con un riesgo significativamente menor de accidente cerebrovascular o embolia sistémica. Sin embargo, se produjeron complicaciones hemorrágicas mayores en el 3,1 % de los pacientes que recibieron 150 mg al día de dabigatrán y en el 3,4 % de los pacientes que recibieron warfarina (p = 0,31).

[0010] La fibrilación auricular (FA) sigue siendo la arritmia cardíaca más común en la práctica clínica, representando aproximadamente un tercio de las hospitalizaciones por disritmias cardíacas. Actualmente, se estima que afecta a más de 6 millones de pacientes en Europa y a aproximadamente 2,3 millones en Estados Unidos, y esta cifra continúa creciendo rápidamente debido al aumento de la proporción de la población de edad avanzada. Se estima que aproximadamente el 5 % de la población mayor de 65 años y el 10 % de las personas mayores de 80 años desarrollarán FA; sin embargo, la prevalencia de FA está aumentando más allá de lo que se explica únicamente por la edad. Los factores de riesgo de FA, como la hipertensión, la insuficiencia cardíaca congestiva, la hipertrofia ventricular izquierda, la enfermedad arterial coronaria, la diabetes mellitus y la apnea obstructiva del sueño, también están en aumento. Por lo tanto, se espera que el número de personas afectadas por FA aumente de dos a tres veces en las próximas tres décadas en las poblaciones occidentales. (Kannel y Benjamin (2008) Med Clin North Am.2008; 92:17-40; Bunch, et al. (2012) J Innovations of Card Rhythm Manag 2012; 3: 855-63).

[0011] [0007] El principal riesgo de FA es un aumento de cuatro a cinco veces en el riesgo de accidente cerebrovascular embólico. El riesgo atribuible de accidente cerebrovascular asociado con FA aumenta drásticamente con la edad hasta el 23,5 % a los 80 a 89 años. La FA se asocia con una duplicación de la mortalidad en ambos sexos (Kannel y Benjamin 2008). La FA también se asocia de forma independiente con el deterioro cognitivo y todas las formas de demencia (Marzona, et al. (2012) CMAJ 2012; 184: 329-36; Geita et al 2013; Bunch et al 2012).

[0012] La mayoría de los pacientes con FA requieren terapia anticoagulante de por vida para prevenir el accidente cerebrovascular cardioembólico y la embolia sistémica. La puntuación de riesgo CHA2DS2-VASc es una herramienta de estratificación validada y ampliamente utilizada para predecir el riesgo tromboembólico en pacientes con fibrilación auricular y para identificar a los pacientes que deberían beneficiarse de la terapia anticoagulante (LIP 2011; Camm, et al. (2012) Eur Heart J 2012; 33: 2719-2747); la evidencia acumulada muestra que CHA2DS2-VASc es al menos tan preciso como, o posiblemente mejor que, puntuaciones, tales como CHADS2, para identificar a los pacientes que desarrollan accidente cerebrovascular y tromboembolismo y definitivamente mejor para identificar a los pacientes con FA de "riesgo verdaderamente bajo". Se estima que entre el 85 y el 90 % de los pacientes con FA requerirán terapia anticoagulante.

[0013] En un metaanálisis que comprendió 6 ensayos que evaluaron el efecto de los antagonistas de la vitamina K(AVK) en la reducción del accidente cerebrovascular y la embolia sistémica, se observó una reducción del riesgo altamente significativa en la incidencia de accidente cerebrovascular (reducción del riesgo relativo del 67% para el accidente cerebrovascular). La mortalidad por todas las causas se redujo significativamente (26%) con AVK de dosis ajustada en comparación con el control (Hart, Pearce y Aguilar (2007) Ann Intern Med 2007; 146:857-867). Un objetivo de razón normalizada internacional (INR) entre 2 y 3 se asoció con la mejor relación beneficio-riesgo (Hylek et al (2003) N Engl J Med; 349:1019-1026) y fue adoptado universalmente por las guías internacionales y nacionales.

[0014] En los últimos años, los nuevos anticoagulantes orales (NACO), también conocidos como anticoagulantes orales directos (AOD), han sido aprobados e introducidos en la práctica clínica. Estos fármacos son al menos tan eficaces o incluso mejores que la warfarina para reducir la enfermedad tromboembólica (Connolly, et al. (2009) N Engl J Med; 361:1139-51; Connolly, et al. (2011) N Engl J Med; 364:806-17; Patel, et al. (2011) N Engl J Med 2011; 365:883-91). Los NACO también se asociaron con grandes reducciones en las complicaciones más devastadoras de la warfarina, a saber, el accidente cerebrovascular hemorrágico y la hemorragia intracraneal. Los eventos de sangrado mayor fueron similares o ligeramente inferiores que la terapia con warfarina bien realizada. Además, los NACO se asocian con un menor potencial de interacción farmacológica que la warfarina y podrían usarse sin monitorización rutinaria; Se espera que esto facilite su uso en la práctica médica diaria.

[0015] A pesar de las mejoras recientes, el riesgo de hemorragia sigue siendo alto con el uso de anticoagulantes. Por ejemplo, la incidencia anual de hemorragia mayor y no mayor clínicamente relevante fue del 14,9 % y la incidencia anual de eventos de hemorragia mayor fue del 3,6 % en pacientes tratados con rivaroxabán en el estudio ROCKET (Patel et al 2011). La incidencia anual de hemorragia mayor fue > 5 % en pacientes con un alto riesgo de hemorragia definido como puntuación de riesgo HAS Bled ≥ 3 (Gallego, et al (2012) Carc Arrhythm Electrophysiol.; 5:312-318). La hemorragia mayor es un resultado clínico particularmente relevante; por ejemplo, en el estudio ROCKET, una vez que se ha producido una hemorragia mayor, la tasa de mortalidad por todas las causas fue del 20,4 % en el grupo de rivaroxabán y del 26,1 % en el grupo de warfarina. Una vez que se han producido eventos de hemorragia mayor, el accidente cerebrovascular y la embolia sistémica ocurrieron en el 4,7 % y el 5,4 % de los pacientes en los grupos de rivaroxabán y warfarina, respectivamente (Piccini, et al. (2014) Eur Heart J; 35:1873-80). La estancia hospitalaria, la transfusión de productos sanguíneos y la utilización de recursos también se vieron gravemente afectadas por la aparición de hemorragia mayor. El riesgo de hemorragia es también una razón importante para no recibir anticoagulantes en pacientes elegibles. En el Euro Heart Survey on Atrial Fibrillation que comprende datos de 182 hospitales en 35 países y 5333 pacientes con FA ambulatorios y hospitalizados, solo el 67 % de los pacientes elegibles recibieron anticoagulantes orales al alta (Nieuwlaat, et al (2005) Eur Heart J;26, 2422-2434).

[0016] Por lo tanto, existe una gran necesidad médica no satisfecha de una terapia más segura que pueda reducir las complicaciones tromboembólicas de la FA, TALES como el accidente cerebrovascular, la embolia sistémica, el deterioro cognitivo y la mortalidad, con una eficacia comparable a la de la terapia existente, pero con un menor riesgo de hemorragia.

[0017] El documento WO 2013/16769 describe anticuerpos capaces de unirse al factor XI de la coagulación y/o a su forma activada, el factor XIA, y sus usos.

[0018] RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0019] La presente invención da a conocer un anticuerpo anti-Factor XI (FXI) y anti-FXI activado (FXIa) aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une dentro del dominio catalítico de FXI y FXIa, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende

[0020] i. una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 23; una región variable de cadena pesada CDR2 de SEQ ID NO: 24; una región variable de cadena pesada CDR3 de SEQ ID NO: 25; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 33; una región variable de cadena ligera CDR2 de SEQ ID NO: 34; y una región variable de cadena ligera CDR3 de SEQ ID NO: 35;

[0021] ii. una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 26; una región variable de cadena pesada CDR2 de SEQ ID NO: 27; una región variable de cadena pesada CDR3 de SEQ ID NO: 28; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 36; una región variable de cadena ligera CDR2 de SEQ ID NO: 37; y una región variable de cadena ligera CDR3 de SEQ ID NO: 38;

[0022] iii. una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 43; una región variable de cadena pesada CDR2 de SEQ ID NO: 44; una región variable de cadena pesada CDR3 de SEQ ID NO: 45; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 47; una región variable de cadena ligera CDR2 de SEQ ID NO: 37; y una región variable de cadena ligera CDR3 de SEQ ID NO: 15 o

[0023] iv. una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 46; una región variable de cadena pesada CDR2 de SEQ ID NO: 4; una región variable de cadena pesada CDR3 de SEQ ID NO: 5; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 33; una región variable de cadena ligera CDR2 de SEQ ID NO: 14; y una región variable de cadena ligera CDR3 de SEQ ID NO: 15.

[0024] También se da a conocer un ácido nucleico que codifica uno o más de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de la invención; un vector que comprende el ácido nucleico de la invención; y una célula huésped que comprende el vector de la invención. Además, se da a conocer una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Asimismo, se da a conocer la composición farmacéutica de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno tromboembólico en un sujeto que afectado por un trastorno tromboembólico.

[0025] Esta y otras realizaciones de la presente invención se establecen en las reivindicaciones adjuntas.

[0026] DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0027] La información técnica que se presenta a continuación puede, en algunos aspectos, exceder el alcance de la invención, que se define en las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para situar la invención en un contexto técnico más amplio e ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados.

[0028] Cualquier referencia incidental a procedimientos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia y procedimientos de diagnóstico practicados en el cuerpo humano o animal no debe interpretarse como una reclamación de protección para dichos procedimientos como tales, sino que debe interpretarse como una referencia a productos, en particular sustancias o composiciones, para su uso en cualquiera de estos procedimientos.

[0029] La presente divulgación se refiere a anticuerpos monoclonales que se unen al factor XI y XIa de la coagulación humana (factor XI activado) (en adelante, a veces denominados "FXI", "FXla" y términos similares), y composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos y tratamientos que comprenden la administración de los mismos. El desarrollo de un agente antitrombótico que sea eficaz en la prevención y el tratamiento de la trombosis o la enfermedad/trastorno tromboembólico (por ejemplo,accidente cerebrovascular trombótico, fibrilación auricular, prevención de accidente cerebrovascular en la fibrilación auricular (SPAF,stroke prevention in atrial fibrillation), trombosis venosa profunda, tromboembolismo venoso, embolia pulmonar, síndromes coronarios agudos (SCA), accidente cerebrovascular isquémico, isquemia aguda de las extremidades, hipertensión pulmonar tromboembólica crónica, embolia sistémica) pero que no conlleva riesgo de hemorragia o solo un riesgo mínimo satisfaría una necesidad médica considerable no cubierta.

[0030] La invención proporciona un anticuerpo anti-FXI y anti-FXIa aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une dentro del dominio catalítico de FXI y FXIa y comprende secuencias CDR como se definen en las reivindicaciones adjuntas.

[0031] En aspectos específicos, los anticuerpos (por ejemplo,humanos, quiméricos, anticuerpos monoclonales humanizados) en el presente documento revelados se unen con una afinidad igualmente alta al dominio catalítico (CD,catalytic domain) de FXla y FXI humanos e inducen una conformación inactiva del dominio de la proteasa en FXla.

[0032] [0021] Los anticuerpos anti-FXI y/o anti-FXla aislados descritos en el presente documento, por ejemplo,las IgG completas descritas en el presente documento con dos sitios de unión, se unen a FXI y/o FXla con una constante de disociación de equilibrio (K<D>) menor o igual a 100 pM. Por ejemplo, los anticuerpos aislados descritos en el presente documento pueden unirse a FXI y/o FXla humanos con una K<D>menor o igual a 100 pM, menor o igual a 50 pM, menor o igual a 45 pM, menor o igual a 40 pM, menor o igual a 35 pM, menor o igual a 20 pM o menor o igual a 10 pM. Más específicamente, los anticuerpos aislados descritos en el presente documento también pueden unirse al FXI humano y/o FXla con una K<D>menor o igual a 34 pM, según lo medido por resonancia de plasmones superficiales (SPR), por ejemplo,ensayo BIACORE<™>, o menor o igual a 4 pM, según lo medido por ensayo de titulación de equilibrio en solución (SET,solution equilibrium titration); y también pueden unirse al FXI del mono cynomolgus y/o FXla con una K<D>menor o igual a 53 pM, según lo medido por ensayo BIACORE<™>, o menor o igual a 4 pM, según lo medido por SET. En aspectos específicos, los anticuerpos aislados descritos en el presente documento (por ejemplo,NOV1401) se unen al FXI humano y FXla con una K<D>aparente menor o igual a aproximadamente 5 pM (por ejemplo,4,7 pM) y 2 pM (por ejemplo,1,3 pM), respectivamente, por ejemplo, según lo medido por ensayo de titulación de equilibrio en solución (SET). En realizaciones específicas, los anticuerpos anti-FXI/FXla descritos en el presente documento se unen al FXI/FXla del mono cynomolgus con una K<D>aparente de aproximadamente 12,5 (±6,6) pM para FXla y aproximadamente 5,0 (±0,7) pM según lo medido por SET (véase, por ejemplo,el Ejemplo 2). En realizaciones específicas, los anticuerpos anti-FXI/FXla descritos en el presente documento se unen al FXI y/o FXla del conejo con una K<D>de aproximadamente 20 (±2) nM. En aspectos específicos, los anticuerpos anti-FXI/FXla descritos en el presente documento se unen al FXI y/o FXla humano, del mono cynomolgus y del conejo, pero no se unen específicamente al FXI de ratón o rata.

[0033] Los fragmentos de unión a antígeno anti-FXI y/o anti-FXla aislados descritos en el presente documento, por ejemplo,fragmentos Fab y otros fragmentos que contienen un sitio de unión, se unen a FXI y/o FXla, con una constante de disociación de equilibrio (K<D>) menor o igual a 10 nM. Por ejemplo, los fragmentos de unión a antígeno aislados descritos en el presente documento pueden unirse a FXI y/o FXla humanos con una KD menor o igual a 10 nM, menor o igual a 5 nM, menor o igual a 1 nM, menor o igual a 500 pM, menor o igual a 305 pM, menor o igual a 62 pM. Más específicamente, los fragmentos de unión a antígeno aislados descritos en el presente documento también pueden unirse a FXI y/o FXla humanos con una KD menor o igual a 305 pM.

[0034] La presente invención se refiere a un anticuerpo aislado, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que se une a FXla humano, de conejo y de mono cynomolgus. La divulgación también se refiere a un anticuerpo aislado, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que se une dentro del dominio catalítico de FXI y/o FXla, específicamente a la superficie de la región del sitio activo. En la invención, el anticuerpo anti-FXI y anti-FXIa aislado, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, se une dentro del dominio catalítico de FXI y FXIa y comprende secuencias CDR según se definen en las reivindicaciones adjuntas.

[0035] También se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que se une a FXI y/o FXla y compite por la unión con un anticuerpo como se describe en la Tabla 1 (por ejemplo,NOV1401). Tal como se describe en el presente documento, la "competencia" entre anticuerpos y/o fragmentos de unión a antígeno del mismo significa que ambos anticuerpos (o fragmentos de unión del mismo) se unen al mismo epítopo de FXI y/o FXla, o a epítopos superpuestos (por ejemplo,según se determine mediante un ensayo de unión competitiva, por cualquiera de los procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia). Tal como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo no "compite" con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de FXI y/o FXla de la invención (por ejemplo,NOV1401 o NOV1090) a menos que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno competidor se una al mismo epítopo de FXI y/o FXla, o a un epítopo superpuesto de FXI y/o FXla, que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención. Tal como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo competidor o un fragmento de unión a antígeno del mismo no incluye uno que (i) bloquee estéricamente que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención se una a su diana (por ejemplo,si dicho anticuerpo competidor se une a un epítopo FXI y/o FXla cercano y no superpuesto e impide físicamente que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención se una a su diana); y/o (ii) se una a un epítopo FXI y/o FXla diferente y no superpuesto e induzca un cambio conformacional en la proteína FXI y/o FXla de tal manera que dicha proteína ya no pueda ser unida por un anticuerpo FXI y/o FXla o un fragmento de unión a antígeno de la invención de una manera que ocurriría en ausencia de dicho cambio conformacional.

[0036] En un caso, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen a FXI y/o FXla y compiten además por la unión con un anticuerpo como se describe en la Tabla 1, se unen a la mayoría de los aminoácidos del epítopo(s) al que se une dicho anticuerpo de la Tabla 1. En otro caso, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a FXI y/o FXla y compiten además por la unión con un anticuerpo como se describe en la Tabla 1, se unen a todos los epítopos a los que se une dicho anticuerpo de la Tabla 1.

[0037] En un caso, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen al FXI activo (FX1a) y, al unirse al dominio catalítico del FXI activo (FX1a), provocan que el FX1a cambie su conformación a una conformación inactiva. En otro caso, dichos anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos inducen además un cambio en el que los 4 residuos N-terminales, los bucles 145, 188 y 220 de dicha conformación inactiva se desplazan y/o desordenan en comparación con la conformación activa.

[0038] En un caso, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión de antígeno de los mismos, se unen al FXI (por ejemplo,FXI humano) y al unirse al FXI impiden que el dominio catalítico del FXI asuma una conformación activa, en la que los bucles 145, 188 y 220 están ordenados como en la estructura del dominio catalítico del FX1a.

[0039] En un caso, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión de antígeno de los mismos, se unen al FXI y, al unirse al FXI, impiden que el dominio catalítico del FXI adopte una conformación activa, en la que los 4 residuos N-terminales, los bucles 145, 188 y 220 están ordenados como en la estructura del dominio catalítico del FX1a.

[0040] En un caso, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen al FXI y, al unirse al FXI, impiden que el dominio catalítico del FXI adopte una conformación activa al inducir cambios conformacionales en la estructura del zimógeno, lo que conduce a una conformación inhibida del FXI muy similar a la observada al unirse al FX1a.

[0041] [0030] En un caso, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen a FXI y/o FXla y, al unirse a FXI y/o FXla y formar un complejo anticuerpo:antígeno con el dominio catalítico de FXI y/o FXla, provocan un desplazamiento y/o desorientación de los bucles 145, 188 y 220 en comparación con la estructura no compleja del dominio catalítico del Factor XI activo (FXla).

[0042] En un caso, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen a FXI y/o FXla al unirse a FXI y/o FXla y formar un complejo anticuerpo:antígeno con el dominio catalítico de FXI y/o FXla provoca un desplazamiento y/o desorientación de los 4 residuos N-terminales, bucles 145, 188 y 220 en comparación con la estructura no compleja del dominio catalítico del Factor XI activo (FXla).

[0043] En un caso, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen al FXI activo (FXla) y hacen que el dominio catalítico del FXI (FXla) cambie su conformación a una conformación inactiva, en la que los bucles 145, 188 y 220 se desplazan y/o desorientan en comparación con la conformación activa.

[0044] En un caso, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen al FXI e impiden que el dominio catalítico asuma una conformación activa al inducir cambios conformacionales en la estructura del zimógeno, lo que conduce a una conformación inhibida del FXI estrechamente relacionada con la observada cuando se une al FX1a.

[0045] La presente divulgación también se refiere a un anticuerpo aislado, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que se une al mismo epítopo que un anticuerpo como se describe en la Tabla 1 (por ejemplo,NOV1401).

[0046] La afinidad de unión de anticuerpos aislados y fragmentos de unión a antígenos puede determinarse mediante titulación de equilibrio en solución (SET). Los procedimientos para SET son conocidos en la técnica y se describen con mayor detalle a continuación. Alternativamente, la afinidad de unión de los anticuerpos aislados, o fragmentos, descritos en el presente documento puede determinarse mediante mediciones de resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo,en ensayos BIACORE<™>. Los procedimientos para ensayos cinéticos BIACORE<™>son conocidos en la técnica y se describen con mayor detalle a continuación.

[0047] Los anticuerpos anti-FXI y/o FXla aislados y los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento pueden utilizarse para inhibir la activación directa o indirecta del Factor IX (también conocido como FIX), el Factor X (FX) y/o la trombina, y/o la unión a los receptores plaquetarios, y por lo tanto pueden prevenir la activación de las rutas de coagulación intrínsecas y/o comunes.

[0048] Los anticuerpos anti-FXI y/o FXla aislados y los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento pueden utilizarse para inhibir la activación directa o indirecta del Factor IX (también conocido como FIX), el Factor X (FX) y/o la trombina con una IC<50>menor o igual a 100 nM, menor o igual a 50 nM, menor o igual a 35 nM, menor o igual a 25 nM, menor o igual a 10 nM o menor o igual a 5,2 nM. Más específicamente, un anticuerpo aislado o fragmentos de unión de antígeno del mismo, como se describe en el presente documento, pueden inhibir la activación directa o indirecta del Factor IX (también conocido como FIX), Factor X (FX) y/o trombina con una IC<50>menor o igual a 100 nM, menor o igual a 50 nM, menor o igual a 35 nM, menor o igual a 25 nM, menor o igual a 10 nM o menor o igual a 5,2 nM. Más específicamente, un anticuerpo aislado o fragmentos de unión de antígeno del mismo, como se describe en el presente documento, pueden inhibir la activación directa o indirecta del Factor IX (también conocido como FIX), Factor X (FX) y/o trombina con una IC<50>menor o igual a 100 nM, menor o igual a 50 nM, menor o igual a 35 nM, menor o igual a 25 nM, menor o igual a 20 nM o menor o igual a 18 nM. Más específicamente, un anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo, como se describe en el presente documento, pueden inhibir la activación directa o indirecta del Factor IX (también conocido como FIX), el Factor X (FX) y/o la trombina con una IC<50>menor o igual a 100 nM, menor o igual a 50 nM, menor o igual a 35 nM, menor o igual a 25 nM, menor o igual a 10 nM o menor o igual a 5 nM. En un caso específico, un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la activación mediada por FXIa de su sustrato nativo FIX con una IC<50>menor o igual a 2 nM, por ejemplo,1,8 nM.

[0049] Los anticuerpos anti-FXI y/o anti-FXla aislados, o sus fragmentos de unión a antígeno, pueden utilizarse para inhibir (por ejemplo, bloquear la activación de) las rutas de coagulación intrínsecas y/o comunes, por ejemplo,mediante la inhibición de la activación del FIX mediada por FXI y/o FXla. Por consiguiente, los anticuerpos anti-FXI/FXla aislados, o sus fragmentos de unión a antígeno, pueden utilizarse para prevenir la coagulación o la propagación de la misma. Los anticuerpos aislados, o sus fragmentos de unión a antígeno, pueden utilizarse para prevenir, tratar o mejorar trastornos de la coagulación como la trombosis venosa profunda y el accidente cerebrovascular (por ejemplo,accidente cerebrovascular isquémico) mediante la inhibición de la activación del FIX mediada por FXI.

[0050] [0039] En casos específicos, los anticuerpos anti-FXI y/o anti-FX1a, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, son capaces de prolongar el tiempo de coagulación (por ejemplo, el tiempo hasta que comienza a formarse un coágulo de sangre) del plasma humano de manera dependiente de la concentración, según lo determinado por un ensayo de TTPa, por ejemplo, como se describe en la Sección de Ejemplos. En una realización específica, el tiempo de coagulación (TTPa) se duplicó en comparación con el valor basal a una concentración total de anticuerpos anti-FXI (por ejemplo,NOV1401) en el intervalo de 10 nM a 20 nM, por ejemplo, aproximadamente 14 nM o 15 nM, según lo determinado por un ensayo de TTPa. En casos particulares, los anticuerpos anti-FXI y/o anti-FX1a, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, son capaces de prolongar el tiempo de coagulación del plasma humano de forma dependiente de la concentración, con una IC50 en el intervalo de 5 nM a 20 nM, por ejemplo, aproximadamente 13 nM, según lo determinado por el ensayo TPPa, por ejemplo, como se describe en la Sección de Ejemplos.

[0051] En casos específicos, los anticuerpos anti-FXI y/o anti-FXla descritos en el presente documento, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, son capaces de prolongar el tiempo de coagulación (por ejemplo, el tiempo hasta que comienza a formarse un coágulo de sangre) del plasma humano en al menos 1,1 veces, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 1,6 veces, 1,7 veces, 1,8 veces, 1,9 veces o 2 veces, por ejemplo, de una manera dependiente de la concentración, según lo determinado por un ensayo TPPa, por ejemplo, como se describe en la Sección de Ejemplos. En casos específicos, los anticuerpos anti-FXI y/o anti-FX1a descritos en el presente documento, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, son capaces de prolongar el tiempo de coagulación (por ejemplo,el tiempo hasta que comienza a formarse un coágulo de sangre) del plasma humano en al menos 1,4 veces, 1,5 veces, 1,6 veces o 1,7 veces, según lo determinado por un ensayo de TTPa, por ejemplo, como se describe en la sección de Ejemplos.

[0052] En casos específicos, los anticuerpos anti-FXI y/o anti-FXla, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, descritos en el presente documento, son capaces de reducir la cantidad de trombina, de manera dependiente de la concentración, en un ensayo de generación de trombina (TGA) en plasma humano, que mide el efecto de la inhibición de FXla en el bucle de retroalimentación trombina→FXIa en presencia de concentraciones muy bajas de factor tisular (TF). En casos particulares, los anticuerpos anti-FXI y/o anti-FXla, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, descritos en el presente documento, son capaces de reducir la cantidad de trombina en un ensayo de generación de trombina (TGA) en plasma humano con un valor de IC<50>en el intervalo de 10 nM a 30 nM, por ejemplo, aproximadamente 20 nM o 24 nM, y una concentración residual de trombina de aproximadamente 159 nM.

[0053] En casos específicos, se divulgan en el presente documento anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos en la Tabla 1 como NOV1401 o anticuerpos que comprenden los HCDR 1-3 y LCDR 1-3 de NOV1401), o fragmentos de unión de antígeno de los mismos, que se unen específicamente al dominio catalítico de FXI y/o FXla humanos, y que tienen una semivida de eliminación terminal (t<½>) de anticuerpos totales en monos cynomolgus de aproximadamente 14-15 días. En casos específicos, dichos anticuerpos anti-FXI/FXla exhiben una biodisponibilidad subcutánea (sc) absoluta de aproximadamente 61-66%.

[0054] En un caso específico, un anticuerpo o un fragmento de unión de antígeno del mismo divulgado en el presente documento (por ejemplo,el anticuerpo descrito en la Tabla 1, como NOV1401), que se une específicamente al FXI humano y/o al FXla, exhibe una o más (por ejemplo,dos, o tres, o cuatro, o cinco, o seis, o siete), o todas, de las siguientes características:

[0055] (i) se une específicamente a un dominio catalítico (CD) de FXI y FXla humanos, por ejemplo, con una K<D>aparente de aproximadamente 1-2 pM y 4-5 pM respectivamente;

[0056] (ii) prolonga el tiempo de coagulación según lo evaluado mediante el ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada (TPPa);

[0057] (iii) inhibe la generación de trombina en el plasma humano mediante la inhibición de la activación del FXI por el factor XII activado (FX1a) y por la trombina, respectivamente;

[0058] (iv) muestra actividad antitrombótica y anticoagulante en ratones FXI-/- reconstituidos con FXI humano;

[0059] (v) reduce o prolonga la reducción de los niveles de FXI libre (FXI<f>), por ejemplo, en monos cynomolgus;

[0060] (vi) tiene una semivida de eliminación terminal del anticuerpo total de aproximadamente 14-15 días, por ejemplo, en monos cynomolgus;

[0061] (vii) se une específicamente al FXI y/o FXla humano y de mono, pero no se une específicamente al FXI y/o FXla de ratón o rata; y

[0062] (viii) contacta con uno o más (por ejemplo,dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete, o más), o con algunos o todos los siguientes residuos del FXI humano (numeración Swissprot): Pro410, Arg413, Leu415, Cys416, His431, Cys432, Tyr434, Gly435, Glu437, Tyr472-Glu476, Tyr521-Lys527, Arg548, His552, Ser575, Ser594-Glu597 y Arg602-Arg604.

[0063] Los anticuerpos anti-FXI y/o FXla aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, como se describe en el presente documento, pueden ser anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanos o humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena simple, fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos F(ab')2 o fragmentos scFv, y/o isotipos de IgG (por ejemplo,IgG1 como la IgG1 humana). En casos específicos, los anticuerpos anti-FXI y/o anti-FXla descritos en el presente documento son anticuerpos humanos recombinantes. En casos específicos, los anticuerpos anti-FXI y/o anti-FXla descritos en el presente documento son anticuerpos IgG1/lambda (A) humanos. En casos específicos, los anticuerpos anti-FXI y/o anti-FXla descritos en el presente documento son anticuerpos humanos IgG1/lambda (A) que comprenden un dominio Fc diseñado para reducir el potencial de función efectora (por ejemplo,ADCC y/o CDC), por ejemplo, un dominio Fc humano que comprende sustituciones D265A y/o P329A.

[0064] Los anticuerpos anti-FXI y/o FXla aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, tal como se describen en el presente documento, también pueden incluir una estructura en la que se ha sustituido un aminoácido en la estructura del anticuerpo a partir de la línea germinal VH o VL humana correspondiente.

[0065] [0046] El anticuerpo anti-FXI y anti-FXIa aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención se une dentro del dominio catalítico de FXI y FXIa y comprende secuencias CDR como se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0066] En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado o los fragmentos de unión a antígeno del mismo tienen las secuencias completas de cadena pesada y ligera de los Fabs descritos en la Tabla 1. Más específicamente, el anticuerpo aislado o los fragmentos de unión a antígeno del mismo pueden tener las secuencias de cadena pesada y ligera de NOV1090 y NOV1401.

[0067] En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado o los fragmentos de unión a antígeno del mismo tienen las secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera de los Fabs descritos en la Tabla 1. Más específicamente, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo puede tener la secuencia de dominio variable de cadena pesada y ligera de NOV1090 y NOV1401.

[0068] Otro aspecto de la divulgación incluye un anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo que tienen las secuencias del dominio variable de la cadena pesada CDR (es decir,HCDR1, HCDR2 y HCDR3) y del dominio variable de la cadena ligera CDR (es decir,LCDR1, LCDR2 y LCDR3) de los anticuerpos descritos en la Tabla 1, como los CDR de Kabat, los CDR de IMGT, los CDR de Chothia o los CDR combinados. Más específicamente, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo puede tener las secuencias HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de NOV1090 y NOV1401, por ejemplo, como se presenta en la Tabla 1, como los CDR de Kabat, los CDR de IMGT, los CDR de Chothia o los CDR combinados.

[0069] La divulgación también se refiere a un anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo que incluyen una cadena pesada CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3 y 23; una cadena pesada CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 y 24; y una cadena pesada CDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 y 25, donde el anticuerpo aislado o los fragmentos de unión a antígeno del mismo se unen al FXI humano y/o FXla. En otro caso, dicho anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo incluyen además una cadena ligera CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 13 y 33; una cadena ligera CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14 y 34; y una cadena ligera CDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15 y 35.

[0070] La divulgación también se refiere a un anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo que incluyen una cadena ligera CDR1 seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 13 y 33; una cadena ligera CDR2 seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 14 y 34; y una cadena ligera CDR3 seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO:15 y 35, en el que el anticuerpo aislado o los fragmentos de unión a antígeno del mismo se unen al FXI humano y/o al FX1a.

[0071] La divulgación también se refiere a un anticuerpo aislado o fragmentos de unión de antígeno del mismo que se unen a FXI y/o FX1a que tienen HCDR1, HCDR2 y HCDR3 y LCDR1, LCDR2 y LCDR3, donde HCDR1, HCDR2 y HCDR3 comprenden los SEQ ID NO: 3, 4 y 5, y LCDR1, LCDR2, LCDR3 comprenden los SEQ ID NO: 13, 14 y 15. En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo aislado o fragmento de unión de antígeno del mismo que se une a FXI y FXIa y que tiene HCDR1, HCDR2 y HCDR3 y LCDR1, LCDR2 y LCDR3, donde: HCDR1, HCDR2 y HCDR3 comprenden los SEQ ID NO: 23, 24 y 25, y LCDR1, LCDR2, LCDR3 comprenden los SEQ ID NO: 33, 34 y 35.

[0072] En otra realización, la invención se refiere a un anticuerpo aislado o fragmentos de unión de antígeno del mismo que se unen a FXI y FX1a que tienen HCDR1, HCDR2 y HCDR3 y LCDR1, LCDR2 y LCDR3, donde HCDR1, HCDR2 y HCDR3 comprenden los SEQ ID NO: 43, 44 y 45, respectivamente, y LCDR1, LCDR2 y LCDR3 comprenden los SEQ ID NO: 47, 37 y 15, respectivamente.

[0073] En otra realización, la invención se refiere a un anticuerpo aislado o fragmentos de unión de antígeno del mismo que se unen a FXI y FX1a que tienen HCDR1, HCDR2 y HCDR3 y LCDR1, LCDR2 y LCDR3, donde HCDR1, HCDR2 y HCDR3 comprenden los SEQ ID NO: 46, 4 y 5, respectivamente, y LCDR1, LCDR2 y LCDR3 comprenden los SEQ ID NO: 33, 14 y 15, respectivamente.

[0074] En una realización, el fragmento de unión de anticuerpos o antígenos tiene HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de la cadena pesada variable de los SEQ ID NO: 9 y 29, y LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de la cadena ligera variable de los SEQ ID NO: 19 y 39, como lo define Chothia. En otra realización, el fragmento de unión de anticuerpos o antígenos puede tener HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de la secuencia del dominio variable de la cadena pesada de los SEQ ID NO: 9 y 29, y LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de la secuencia del dominio variable de la cadena ligera de los SEQ ID NO: 19 y 39, como lo define Kabat.

[0075] En otra realización, el fragmento de unión de anticuerpos o antígenos puede tener HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de la cadena pesada variable de los SEQ ID NO: 9 y 29, y LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de la cadena ligera variable de los SEQ ID NO: 19 y 39, según lo definido por IMGT. En otra realización, el fragmento de unión de anticuerpos o antígenos puede tener HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de la secuencia del dominio variable de la cadena pesada de los SEQ ID NO: 9 y 29, y LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de la secuencia del dominio variable de la cadena ligera de los SEQ ID NO: 19 y 39, según lo definido por Combined.

[0076] En una realización, el anticuerpo aislado o los fragmentos de unión a antígeno del mismo incluyen una secuencia de dominio variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 9 y 29. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno también puede comprender una secuencia de dominio variable de cadena ligera en la que el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera se combinan para formar un sitio de unión a antígeno para FX1a. En particular, la secuencia de dominio variable de cadena ligera puede seleccionarse de los SEQ ID NO: 19 y 39, en los que dicho anticuerpo aislado o los fragmentos de unión a antígeno del mismo se unen a FX1 y FX1a.

[0077] En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado o los fragmentos de unión a antígeno del mismo pueden incluir una secuencia de dominio variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 19 y 39, en la que dicho anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo se unen al FXI y FXla humanos. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno puede comprender además una secuencia de dominio variable de cadena pesada en la que el dominio variable de cadena ligera y el dominio variable de cadena pesada se combinan para formar un sitio de unión a antígeno para FXI y/o FXla.

[0078] En particular, el anticuerpo aislado o los fragmentos de unión a antígeno del mismo que se unen a FXI y FX1a, pueden tener dominios variables de cadena pesada y ligera que comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 9 y 19; o 19 y 39, respectivamente.

[0079] En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos VH con ID SEQ NO: 29 y una secuencia de aminoácidos VL con ID SEQ NO: 39.

[0080] Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmentos de unión de antígeno del mismo, que incluye un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9 y 29, donde dicho anticuerpo se une a FXI y/o FX1a. En un caso, el anticuerpo aislado o los fragmentos de unión a antígeno del mismo también incluyen un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 19 y 39. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención comprende una región de cadena pesada variable (VH) de SEQ ID NO: 29 o una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad de la misma, y una región de cadena ligera variable (VL) de SEQ ID NO: 39 o una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad de la misma.

[0081] En otro caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno tiene un HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 según lo definido por Kabat y como se describe en la Tabla 1. En un caso específico, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno tiene un HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 según lo definido por Chothia, IMGT o Combined y como se describe en la Tabla 1.

[0082] La divulgación también se refiere a un anticuerpo aislado o fragmentos de unión de antígeno del mismo, que tienen un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19 y 39, donde dicho anticuerpo se une a FXI y/o FX1a.

[0083] En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que se unen a FXI y FXla pueden tener una cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 11 o 31. El anticuerpo aislado también puede incluir una cadena ligera que puede combinarse con la cadena pesada para formar un sitio de unión a antígeno para FXI y FXla humanos. En particular, la cadena ligera puede tener una secuencia que comprende SEQ ID NO: 21 o 41. En particular, el anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo que se unen a FXI y FXla, pueden tener una cadena pesada y una cadena ligera que comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 11 y 21; o 31 y 41, respectivamente. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41.

[0084] La divulgación se refiere además a un anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo que incluyen una cadena pesada que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 11 o 31, donde dicho anticuerpo se une a FXI y/o FX1a. En un caso, el anticuerpo aislado o los fragmentos de unión a antígeno del mismo también incluyen una cadena ligera que tiene al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 21 o 41.

[0085] La divulgación se refiere además a un anticuerpo aislado o fragmentos de unión de antígeno del mismo que incluyen una cadena ligera que tiene al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 21 o 41, donde dicho anticuerpo se une a FXI y/o FX1a.

[0086] En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41.

[0087] La presente divulgación también se refiere a composiciones que comprenden el anticuerpo aislado, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, descritos en el presente documento, así como composiciones de anticuerpos en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Específicamente, la divulgación incluye además composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo de la Tabla 1, como, por ejemplo, los anticuerpos NOV1090 y NOV1401.

[0088] La divulgación también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una combinación de dos o más de los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la Tabla 1.

[0089] La invención da a conocer una composición farmacéutica que comprende un antígeno o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, y un portador farmacéuticamente aceptable.

[0090] La divulgación también se refiere a una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada variable con una secuencia seleccionada de los SEQ ID NO: 9 y 29. En particular, el ácido nucleico tiene una secuencia con una identidad de secuencia de al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 10 y 30. En otro aspecto de la divulgación, la secuencia es SEQ ID NO: 10 o 30.

[0091] La divulgación también se refiere a una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica la cadena ligera variable con una secuencia seleccionada de los SEQ ID NO: 20 y 40. En particular, el ácido nucleico tiene una secuencia con una identidad de secuencia de al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 20 y 40. En otro aspecto de la divulgación, la secuencia es SEQ ID NO: 20 y 40.

[0092] La divulgación también se refiere a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que incluye un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 20 y 40.

[0093] La invención da a conocer un ácido nucleico que codifica uno o más de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la invención.

[0094] La presente divulgación también se refiere a un vector que incluye una o más de las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento. La invención da a conocer un vector que comprende el ácido nucleico de la invención.

[0095] La presente divulgación también se refiere a una célula huésped aislada que incluye una secuencia de ADN recombinante que codifica una cadena pesada del anticuerpo descrito anteriormente, y una segunda secuencia de ADN recombinante que codifica una cadena ligera del anticuerpo descrito anteriormente, donde dichas secuencias de ADN están funcionalmente unidas a un promotor y son capaces de expresarse en la célula huésped. Se contempla que el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal humano. También se contempla que la célula huésped sea una célula de mamífero no humana. La invención proporciona una célula huésped que comprende el vector de la invención.

[0096] La divulgación también se refiere a un procedimiento para reducir la expresión de FXI y/o FXla, y/o la activación de la ruta de coagulación intrínseca y/o común, en el que el procedimiento incluye el paso de poner en contacto una célula con una cantidad efectiva de una composición que comprende el anticuerpo aislado o los fragmentos de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento.

[0097] La divulgación también se refiere a un procedimiento para inhibir la unión de FXI y/o FX1a a FIX, en el cual el procedimiento incluye el paso de poner en contacto una célula con una cantidad efectiva de una composición que comprende el anticuerpo aislado o los fragmentos de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento.

[0098] Se contempla que la célula es una célula humana. Se contempla además que la célula está en un sujeto. En un caso, se contempla que la célula es una plaqueta. Se contempla aún más que el sujeto es humano.

[0099] La presente divulgación también se refiere a un procedimiento para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad tromboembólica en un sujeto, en el cual el procedimiento incluye la administración al sujeto de una cantidad efectiva de una composición que comprende los fragmentos de unión de anticuerpos o antígenos descritos en el presente documento. La invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno tromboembólico en un sujeto que padece dicho trastorno.

[0100] [0081] En un aspecto, la enfermedad tromboembólica es un trastorno trombótico (por ejemplo, trombosis, accidente cerebrovascular trombótico, fibrilación auricular, prevención de accidentes cerebrovasculares en la fibrilación auricular (SPAF), trombosis venosa profunda, tromboembolismo venoso y embolia pulmonar). Se contempla que el sujeto es humano.

[0101] Cualquiera de los anticuerpos aislados anteriores o fragmentos de unión de antígeno de los mismos puede ser un anticuerpo monoclonal o fragmentos de unión de antígeno del mismo.

[0102] En el presente documento se divulga un anticuerpo anti-FXI y/o anti-FXla aislado o un fragmento del mismo que se une dentro del dominio catalítico de FXI y/o FXla.

[0103] También se divulga un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que se une a uno o más epítopos de anti-FXI y/o FXla, donde el epítopo comprende dos o más residuos de aminoácidos de Pro410, Arg413, Leu415, Cys416, His431, Cys432, Tyr434, Gly435, Glu437, Tyr472, Lys473, Met474, Ala475, Glu476, Tyr521, Arg522, Lys523, Leu524, Arg525, Asp526, Lys527, Arg548, His552, Ser575, Ser594, Trp595, Gly596, Glu597, Arg602, Glu603 y Arg604.

[0104] En algunos casos, dicho epítopo comprende:

[0105] - cuatro o más residuos de aminoácidos de Pro410, Arg413, Leu415, Cys416, His431, Cys432, Tyr434, Gly435, Glu437, Tyr472, Lys473, Met474, Ala475, Glu476, Tyr521, Arg522, Lys523, Leu524, Arg525, Asp526, Lys527, Arg548, His552, Ser575, Ser594, Trp595, Gly596, Glu597, Arg602, Glu603 y Arg604;

[0106] - seis o más residuos de aminoácidos de Pro410, Arg413, Leu415, Cys416, His431, Cys432, Tyr434, Gly435, Glu437, Tyr472, Lys473, Met474, Ala475, Glu476, Tyr521, Arg522, Lys523, Leu524, Arg525, Asp526, Lys527, Arg548, His552, Ser575, Ser594, Trp595, Gly596, Glu597, Arg602, Glu603 y Arg604;

[0107] - ocho o más residuos de aminoácidos de Pro410, Arg413, Leu415, Cys416, His431, Cys432, Tyr434, Gly435, Glu437, Tyr472, Lys473, Met474, Ala475, Glu476, Tyr521, Arg522, Lys523, Leu524, Arg525, Asp526, Lys527, Arg548, His552, Ser575, Ser594, Trp595, Gly596, Glu597, Arg602, Glu603 y Arg604;

[0108] - los residuos de Pro410, Arg413, Leu415, Cys416, His431, Cys432, Tyr434, Gly435, Glu437, Tyr472, Lys473, Met474, Ala475, Glu476, Tyr521, Arg522, Lys523, Leu524, Arg525, Asp526, Lys527, Arg548, His552, Ser575, Ser594, Trp595, Gly596, Glu597, Arg602, Glu603 y Arg604;

[0109] - residuos de aminoácidos de Pro410, Arg413, Lys527 y uno o más residuos de aminoácidos de Leu415, Cys416, His431, Cys432, Tyr434, Gly435, Glu437, Tyr472, Lys473, Met474, Ala475, Glu476, Tyr521, Arg522, Lys523, Leu524, Arg525, Asp526, Arg548, His552, Ser575, Ser594, Trp595, Gly596, Glu597, Arg602, Glu603 y Arg604;

[0110] - residuos de aminoácidos de Pro410, Arg413, Lys527 y cuatro o más residuos de aminoácidos de Leu415, Cys416, His431, Cys432, Tyr434, Gly435, Glu437, Tyr472, Lys473, Met474, Ala475, Glu476, Tyr521, Arg522, Lys523, Leu524, Arg525, Asp526, Arg548, His552, Ser575, Ser594, Trp595, Gly596, Glu597, Arg602, Glu603 y Arg604; o

[0111] - residuos de aminoácidos de Pro410, Arg413, Lys527 y seis o más residuos de aminoácidos de Leu415, Cys416, His431, Cys432, Tyr434, Gly435, Glu437, Tyr472, Lys473, Met474, Ala475, Glu476, Tyr521, Arg522, Lys523, Leu524, Arg525, Asp526, Arg548, His552, Ser575, Ser594, Trp595, Gly596, Glu597, Arg602, Glu603 y Arg604.

[0112] También se divulga un anticuerpo anti-FXI y/o anti-FXla aislado o un fragmento del mismo que se une dentro del dominio catalítico de FXI y/o FXla, en el que dicho anticuerpo o fragmento bloquea la unión de FXI y/o FXla a uno o más de Factor IX, Factor Xlla y trombina.

[0113] En un caso de dicho anticuerpo o fragmento, dicho anticuerpo o fragmento bloquea la unión de FXI y/o FXla a uno o más del Factor IX, Factor Xlla o trombina, y otros componentes de la ruta de coagulación.

[0114] En algunos casos de un anticuerpo anti-FXI y/o anti-FXIa aislado o un fragmento del mismo que se une dentro del dominio catalítico de FXI y/o FXla:

[0115] - dicho anticuerpo o fragmento bloquea la unión de uno o más de los FIX, FXI y FX1a a los receptores plaquetarios; o - dicho anticuerpo o fragmento impide la activación de las rutas de coagulación intrínsecas o comunes.

[0116] También se divulga un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a una proteína FXI y/o FXla humana con una K<D>menor o igual a 34 nM, según lo medido por el ensayo BIACORE<™>, o menor o igual a 4 pM, según lo medido por el ensayo de titulación de equilibrio en solución (SET).

[0117] En algunos casos de un anticuerpo anti-FXI y/o anti-FXIa aislado o un fragmento del mismo que se une dentro del dominio catalítico de FXI y/o FXla:

[0118] - dicho anticuerpo o fragmento comprende al menos una región determinante de complementariedad que tiene al menos un 90% de identidad con al menos una de las CDR enumeradas en la Tabla 1;

[0119] - dicho anticuerpo o fragmento comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 de la Tabla 1;

[0120] - dicho anticuerpo o fragmento comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 de la Tabla 1, y en el que la variante tiene al menos uno a cuatro cambios de aminoácidos en una de las CDR1, CDR2 o CDR3.

[0121] - el anticuerpo o fragmento comprende una cadena pesada CDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 y 25;

[0122] - el anticuerpo o fragmento comprende un VH seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9 y 29 o una secuencia de aminoácidos con un 90% de identidad de la misma; y un VL seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19 y 39 o una secuencia de aminoácidos con un 90% de identidad de la misma;

[0123] - el anticuerpo o fragmento comprende un VH seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9 y 29 o una secuencia de aminoácidos con un 95 % de identidad de la misma; y un VL seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19 y 39 o una secuencia de aminoácidos con un 95 % de identidad de la misma;

[0124] - el anticuerpo o fragmento comprende un VH seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9 y 29 o una secuencia de aminoácidos con un 97% de identidad de la misma; y un VL seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19 y 39 o una secuencia de aminoácidos con un 97% de identidad de la misma;

[0125] - el anticuerpo o fragmento comprende una secuencia de cadena pesada variable seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9 y 29;

[0126] - el anticuerpo o fragmento comprende una secuencia de cadena ligera variable seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19 y 39;

[0127] - el anticuerpo o fragmento comprende una cadena pesada variable seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9 y 29; y una secuencia de cadena ligera variable seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19 y 39; - el anticuerpo o fragmento seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo o fragmento que comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO: 9 y una secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 19 y un anticuerpo o fragmento que comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO: 29 y una secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 39;

[0128] - el anticuerpo o fragmento comprende una región variable de cadena pesada CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 46; CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4; CDR3 seleccionada del grupo que consiste en 5; una región variable de cadena ligera CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 33; CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14; y CDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15;

[0129] - el anticuerpo o fragmento comprende una región variable de cadena pesada CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3 y 23; CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 y 24; CDR3 seleccionada del grupo que consiste en 5 y 25; una región variable de cadena ligera CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 13 y 33; CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14 y 34; y CDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15 y 35;

[0130] - el anticuerpo o fragmento comprende una región variable de cadena pesada CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6 y 26; CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 y 27; CDR3 seleccionada del grupo que consiste en 8 y 28; una región variable de cadena ligera CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16 y 36; CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17 y 37; y CDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18 y 38;

[0131] - el anticuerpo o fragmento comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 3; una región variable de cadena pesada CDR2 de SEQ ID NO: 4; una región variable de cadena pesada CDR3 de SEQ ID NO: 5; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 13; una región variable de cadena ligera CDR2 de SEQ ID NO: 14; y una región variable de cadena ligera CDR3 de SEQ ID NO: 15;

[0132] - el anticuerpo o fragmento comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 23; una región variable de cadena pesada CDR2 de SEQ ID NO: 24; una región variable de cadena pesada CDR3 de SEQ ID NO: 25; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 33; una región variable de cadena ligera CDR2 de SEQ ID NO: 34; y una región variable de cadena ligera CDR3 de SEQ ID NO: 35;

[0133] - el anticuerpo o fragmento comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 6; una región variable de cadena pesada CDR2 de SEQ ID NO: 7; una región variable de cadena pesada CDR3 de SEQ ID NO: 8; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 16; una región variable de cadena ligera CDR2 de SEQ ID NO: 17; y una región variable de cadena ligera CDR3 de SEQ ID NO: 18; o

[0134] - el anticuerpo o fragmento comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 26; una región variable de cadena pesada CDR2 de SEQ ID NO: 27; una región variable de cadena pesada CDR3 de SEQ ID NO: 28; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 36; una región variable de cadena ligera CDR2 de SEQ ID NO: 37; y una región variable de cadena ligera CDR3 de SEQ ID NO: 38.

[0136] También se divulga una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo como se describe anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable.

[0138] En algunos casos de un anticuerpo anti-FXI y/o anti-FXIa aislado o un fragmento del mismo que se une dentro del dominio catalítico de FXI y/o FXla:

[0139] - el anticuerpo o fragmento se une al mismo epítopo que un anticuerpo o fragmento aislado descrito anteriormente; - el anticuerpo o fragmento compite por la unión a una proteína FXI y/o FX1a humana con un anticuerpo o fragmento aislado descrito anteriormente; o

[0140] - el anticuerpo o fragmento se selecciona del grupo formado por NOV1090 y NOV1401.

[0142] También se describe un procedimiento para tratar un trastorno tromboembólico que consiste en administrar a un sujeto afectado por un trastorno tromboembólico una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento descrito anteriormente.

[0144] En algunos casos de dicho procedimiento, el sujeto está afectado por uno o más de los siguientes: accidente cerebrovascular isquémico asociado con fibrilación auricular y trombosis venosa profunda; o el sujeto está afectado por accidente cerebrovascular isquémico asociado con fibrilación auricular.

[0145] También se divulga un procedimiento para tratar un trastorno tromboembólico que comprende administrar a un sujeto afectado por un trastorno tromboembólico una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento descrito anteriormente en combinación con terapias con estatinas.

[0146] También se divulga: un medicamento que comprende un anticuerpo descrito anteriormente;

[0147] - un ácido nucleico que codifica uno o más de los anticuerpos descritos anteriormente;

[0148] - un vector que comprende dicho ácido nucleico; y

[0149] - una célula huésped que comprende dicho vector.

[0150] En algunos casos de un anticuerpo anti-FXI y/o anti-FXIa aislado o un fragmento del mismo que se une dentro del dominio catalítico de FXI y/o FXla:

[0151] - el anticuerpo o fragmento conduce, al unirse al dominio catalítico activo de FXI (FXla), a que FXla cambie su conformación a una conformación inactiva, en la que los 4 residuos N-terminales, los bucles 145, 188 y 220 están desplazados y/o desordenados en comparación con la conformación activa;

[0152] - el anticuerpo o fragmento, al unirse al FXI, impide que el dominio catalítico del FXI adopte una conformación activa, en la que los bucles 145, 188 y 220 están ordenados como en la estructura del dominio catalítico del FX1a;

[0153] - el anticuerpo o fragmento, al unirse al FXI, impide que el dominio catalítico del FXI adopte una conformación activa, en la que los 4 residuos N-terminales, los bucles 145, 188 y 220 están ordenados como en la estructura del dominio catalítico del FX1a;

[0154] - el anticuerpo o fragmento, al unirse al FXI, impide que el dominio catalítico del FXI adopte una conformación activa al inducir cambios conformacionales en la estructura del zimógeno, lo que conduce a una conformación inhibida del FXI estrechamente relacionada con la observada al unirse al FXIa;

[0155] - el anticuerpo o fragmento, al unirse a FXI y/o FXla y formar un complejo anticuerpo:antígeno con el dominio catalítico de FXI y/o FXla, provoca un desplazamiento y/o desorientación de los bucles 145, 188 y 220 en comparación con la estructura no compleja del dominio catalítico del Factor XI activo (FXla);

[0156] - el anticuerpo o fragmento, al unirse a FXI y/o FXla y formar un complejo anticuerpo-antígeno con el dominio catalítico de FXI y/o FXla, provoca un desplazamiento y/o desorientación de los 4 residuos N-terminales, bucles 145, 188 y 220 en comparación con la estructura no compleja del dominio catalítico del Factor XI (FXla) activo; o

[0157] - el anticuerpo o fragmento se une al FXI activo (FXla) y provoca que el dominio catalítico del FXI (FXla) cambie su conformación a una conformación inactiva, en la que los bucles 145, 188 y 220 se desplazan y/o desorientan en comparación con la conformación activa.

[0158] DEFINICIONES

[0159] Salvo que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por aquellos con conocimientos ordinarios en el arte al que pertenece esta invención.

[0160] Los términos "proteína FXI", "antígeno FXI" y "FXI" se utilizan indistintamente y se refieren a la proteína Factor XI en diferentes especies. El Factor XI es el factor XI de coagulación plasmática de los mamíferos, una glicoproteína presente en el plasma humano a una concentración de 25-30 nM como zimógeno que, al convertirse mediante proteólisis limitada en una serina proteasa activa, participa en la vía intrínseca de la coagulación sanguínea.

[0161] Los términos "proteína FXla", "antígeno FXla" y "FXla" se utilizan indistintamente y se refieren a la proteína FXI activada en diferentes especies. El zimógeno Factor XI se convierte en su forma activa, el factor de coagulación Xla (FXla), ya sea a través de la fase de contacto de la coagulación sanguínea o mediante la activación mediada por trombina en la superficie plaquetaria. Durante esta activación del factor XI, se escinde un enlace peptídico interno en cada una de las dos cadenas, dando como resultado el factor Xla activado, una serina proteasa compuesta por dos cadenas pesadas y dos ligeras unidas por enlaces disulfuro. Esta serina proteasa FXla convierte el Factor de coagulación IX en IXa, que posteriormente activa el Factor de coagulación X (Xa). El Xa puede entonces mediar la activación del Factor de coagulación II/Trombina. Por ejemplo, el FXI humano tiene la secuencia que se muestra en la Tabla 1 (SEQ ID NO:1) y se ha descrito en informes y literatura anteriores (Mandle RJ Jr, et al. (1979) Blood;54(4):850; Secuencia de referencia NCBI: AAA51985).

[0162] En el contexto de esta invención, los términos "FXI" y "FXla" (y similares) incluyen mutantes y variantes de la proteína FXI y FXIa naturales, respectivamente, que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la de la estructura primaria nativa (secuencia de aminoácidos) descrita en los informes mencionados anteriormente.

[0163] El término "dominio catalítico", "dominio catalítico de serina proteasa" y términos similares utilizados en el presente documento se refieren a los aminoácidos IIe370 a Val607, contados desde el Glu1 en el extremo N-terminal de la proteína madura que se encuentra en circulación. También puede describirse como los residuos 388-625 en el extremo C-terminal del FXI. En el presente documento, el término "sitio activo" se refiere a la tríada catalítica compuesta por los aminoácidos His413, Asp462 y Se557. (Bane y Gailani (2014) Drug Disc.19(9)).

[0164] El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x significa, por ejemplo, x ± 10%.

[0165] El término "anticuerpo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo completo y a cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir,"porción de unión a antígeno") o cadena individual del mismo. Un anticuerpo completo es una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable (abreviada en el presente documento como VH) y una región constante. La región constante de la cadena pesada está compuesta por tres dominios: CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable (abreviada en el presente documento como VL) y una región constante. La región constante de la cadena ligera está compuesta por un dominio: CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse aún más en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones más conservadas, denominadas regiones de armazón (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo,células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico.

[0167] El término "porción de unión a antígeno" o "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo intacto que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno determinado (por ejemplo,Factor Xla (FXla)). Las funciones de unión a antígeno de un anticuerpo pueden ser realizadas por fragmentos de un anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de unión comprendidos dentro del término porción de unión a antígeno o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab)<2>, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento de anticuerpo de dominio único (dAb) (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH o un dominio VL; y una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada.

[0169] Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, utilizando procedimientos recombinantes, mediante un péptido conector artificial que permite que se formen como una sola cadena proteica en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena simple (scFv); véase, por ejemplo,Bird et al., 1988 Science 242:423-426; y Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci.85:5879-5883). Estos anticuerpos de cadena simple incluyen una o más porciones o fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, y los fragmentos se analizan para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

[0171] Los fragmentos de unión de antígeno también pueden incorporarse a anticuerpos de dominio único, maxibodies, minibodies, intrabodies, diabodies, triabodies, tetrabodies, v-NAR y bis-scFv (véase, por ejemplo,Hollinger y Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136). Las porciones de unión de antígeno de los anticuerpos pueden injertarse en andamios (“scaffold”) basados en polipéptidos como la fibronectina tipo III (Fn3) (véase la patente estadounidense n.° 6,703,199, que describe monobodies de polipéptido de fibronectina).

[0173] Los fragmentos de unión a antígeno pueden incorporarse en moléculas de cadena simple que comprenden un par de segmentos Fv en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a antígeno (Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062; y Patente estadounidense n.° 5,641,870).

[0175] En el presente documento, el término "afinidad" se refiere a la fuerza de interacción entre el anticuerpo y el antígeno en sitios antigénicos individuales. Dentro de cada sitio antigénico, la región variable del "brazo" del anticuerpo interactúa mediante fuerzas no covalentes débiles con el antígeno en numerosos sitios; cuantas más interacciones, mayor es la afinidad. En el presente documento, el término "alta afinidad" para un anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, un fragmento Fab) generalmente se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que tiene una K<D>de 10<-9>M o menos (por ejemplo,una K<D>de 10<-10>M o menos, una K<D>de 10<-11>M o menos, una K<D>de 10<-12>M o menos, una K<D>de 10<-13>M o menos, una K<D>de 10<-14>M o menos, etc.).

[0177] El término "aminoácido" se refiere a los aminoácidos naturales y sintéticos, así como a los análogos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos naturales. Los aminoácidos naturales son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos que se modifican posteriormente, por ejemplo,la hidroxiprolina, el-carboxiglutamato y la O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural, es decir,un carbono alfa unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo,la homoserina, la norleucina, el sulfóxido de metionina y el metilsulfonio de metionina. Dichos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo,la norleucina) o esqueletos peptídicos modificados, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido natural. Los miméticos de aminoácidos son compuestos químicos que tienen una estructura diferente a la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de manera similar a un aminoácido que se encuentra de forma natural.

[0178] El término "especificidad de unión", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la capacidad de un sitio de combinación de anticuerpo individual para reaccionar con un solo determinante antigénico.

[0179] La frase “se une específicamente (o selectivamente)” a un anticuerpo (por ejemplo,un anticuerpo que se une a FXI y/o FXla) se refiere a una reacción de unión que determina la presencia de un antígeno cognado (por ejemplo,un FXI y/o FXla humano o FXI y/o FXla de cynomolgus) en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. Las frases “un anticuerpo que reconoce un antígeno” y “un anticuerpo específico para un antígeno” se utilizan indistintamente en el presente documento con el término “un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno”.

[0180] El término "mediado por FXI y/o FXla" se refiere al hecho de que FXI y/o FXla median las rutas de coagulación intrínsecas y/o comunes activando directa o indirectamente el Factor IX (también conocido como FIX), el Factor X (FX) y/o la trombina, y/o uniéndose a los receptores plaquetarios.

[0181] El término "hemostasia" representa los principales mecanismos para detener el flujo sanguíneo en los sitios de lesión y restaurar la permeabilidad vascular durante la cicatrización de heridas, respectivamente. Durante la hemostasia normal y la trombosis patológica, se activan simultáneamente tres mecanismos: la hemostasia primaria, que se refiere a las interacciones de las plaquetas activadas con la pared del vaso, la formación de fibrina y un proceso denominado fibrinólisis.

[0182] Los términos "coagulación y cascada de coagulación", "modelo de cascada de coagulación" y similares, se refieren al sistema basado en proteínas que sirve para estabilizar un coágulo que se ha formado para sellar una herida. La ruta de coagulación es una cascada proteolítica. Cada enzima de la vía está presente en el plasma como un zimógeno (en forma inactiva), que al activarse sufre una escisión proteolítica para liberar el factor activo de la molécula precursora. La cascada de coagulación funciona como una serie de bucles de retroalimentación positiva y negativa que controlan el proceso de activación. El objetivo final de la vía es producir trombina, que luego puede convertir el fibrinógeno soluble en fibrina que forma un coágulo.

[0183] El proceso de generación de trombina se puede dividir en tres fases: las vías intrínseca y extrínseca, que proporcionan rutas alternativas para la generación de un factor de coagulación activo: FXa (Factor X activado), y la vía común final, que da como resultado la formación de trombina (Hoffman MM y Monroe DM (2005) Curr Hematol Rep.4:391 -396; Johne J, et al. (2006) Biol Chem.387:173-178).

[0184] La "agregación plaquetaria" se refiere al proceso por el cual, cuando se produce una rotura en un vaso sanguíneo, se exponen sustancias que normalmente no están en contacto directo con el flujo sanguíneo. Estas sustancias (principalmente colágeno y factor de von Willebrand) permiten que las plaquetas se adhieran a la superficie dañada. Una vez que una plaqueta se adhiere a la superficie, libera sustancias químicas que atraen plaquetas adicionales a la zona afectada, proceso conocido como agregación plaquetaria. Estos dos procesos constituyen las primeras respuestas para detener la hemorragia.

[0185] Un "trastorno tromboembólico", o términos similares utilizados en el presente documento, se refiere a diversas afecciones o enfermedades en las que las rutas de coagulación intrínsecas y/o comunes se activan de forma anómala o no se desactivan de forma natural (por ejemplo,sin medios terapéuticos). Estas afecciones incluyen, entre otras, el accidente cerebrovascular trombótico, la fibrilación auricular, la prevención del accidente cerebrovascular en la fibrilación auricular (SPAF), la trombosis venosa profunda, la tromboembolia venosa y la embolia pulmonar. También pueden incluir afecciones relacionadas con catéteres (por ejemplo,catéter de Hickman en pacientes oncológicos) en las que los catéteres se trombosan, y la oxigenación por membrana extracorpórea (ECMO), en la que se forman coágulos en los tubos.

[0186] Un término "tromboembólico" o términos similares utilizados en el presente documento también puede referirse a cualquiera de los siguientes, que los anticuerpos anti-FXI y/o FX1a o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención pueden prevenir o tratar:

[0187] - tromboembolismo en sujetos con sospecha o confirmación de arritmia cardíaca, como fibrilación auricular paroxística, persistente o permanente o aleteo auricular;

[0188] - prevención de accidentes cerebrovasculares en la fibrilación auricular (SPAF), una subpoblación de la cual son los pacientes con FA sometidos a intervenciones coronarias percutáneas (ICP);

[0189] - tratamiento de eventos tromboembólicos venosos agudos (ETV) y prevención secundaria extendida de ETV en pacientes con alto riesgo de hemorragia;

[0190] - eventos cerebrales y cardiovasculares en la prevención secundaria después de un ataque isquémico transitorio (AIT) o un accidente cerebrovascular no incapacitante y prevención de eventos tromboembólicos en la insuficiencia cardíaca con ritmo sinusal;

[0191] - formación de coágulos en la aurícula izquierda y tromboembolismo en pacientes sometidos a cardioversión por arritmia cardíaca;

[0192] - trombosis antes, durante y después del procedimiento de ablación para la arritmia cardíaca;

[0193] - trombosis venosa, que incluye, pero no exclusivamente, el tratamiento y la prevención secundaria de la trombosis venosa profunda o superficial en las extremidades inferiores o superiores, la trombosis en las venas abdominales y torácicas, la trombosis del seno venoso y la trombosis de las venas yugulares;

[0194] - trombosis en cualquier superficie artificial de las venas, como los cables de catéteres o marcapasos;

[0195] - embolia pulmonar en pacientes con o sin trombosis venosa;

[0196] - hipertensión pulmonar tromboembólica crónica (HPTEC);

[0197] - trombosis arterial en placa aterosclerótica rota, trombosis en prótesis o catéter intraarterial y trombosis en arterias aparentemente normales, esto incluye, pero no se limita a síndromes coronarios agudos, infarto de miocardio con elevación del segmento ST, infarto de miocardio sin elevación del segmento ST, angina inestable, trombosis de stent, trombosis de cualquier superficie artificial en el sistema arterial y trombosis de arterias pulmonares en sujetos con o sin hipertensión pulmonar;

[0198] - trombosis y tromboembolismo en pacientes sometidos a intervenciones coronarias percutáneas (ICP);

[0199] - accidentes cerebrovasculares cardioembólicos y criptogénicos;

[0200] - trombosis en pacientes con neoplasias malignas cancerosas invasivas y no invasivas;

[0201] - trombosis sobre un catéter permanente;

[0202] - trombosis y tromboembolismo en pacientes gravemente enfermos;

[0203] - trombosis cardíaca y tromboembolismo, que incluye, pero no exclusivamente, la trombosis cardíaca después de un infarto de miocardio, la trombosis cardíaca relacionada con afecciones como aneurisma cardíaco, fibrosis miocárdica, agrandamiento e insuficiencia cardíaca, miocarditis y superficie artificial en el corazón;

[0204] - tromboembolismo en pacientes con valvulopatía cardíaca con o sin fibrilación auricular;

[0205] - tromboembolismo sobre prótesis mecánicas o biológicas valvulares;

[0206] - tromboembolia en pacientes que tenían parches cardíacos nativos o artificiales, tubos de conducción arterial o venosa después de la reparación cardíaca de malformaciones cardíacas simples o complejas;

[0207] - trombosis venosa y tromboembolismo después de cirugía de reemplazo de rodilla, cirugía de reemplazo de cadera y cirugía ortopédica, cirugía torácica o abdominal;

[0208] - trombosis arterial o venosa después de neurocirugía, incluidas las intervenciones intracraneales y de la médula espinal;

[0209] - trombofilia congénita o adquirida, incluyendo, pero no exclusivamente, factor V Leiden, mutación de protrombina, antitrombina III, deficiencias de proteína C y proteína S, mutación del factor XIII, disfibrinogenemia familiar, deficiencia congénita de plasminógeno, niveles elevados del factor XI, enfermedad de células falciformes, síndrome antifosfolípido, enfermedad autoinmune, enfermedad intestinal crónica, síndrome nefrótico, uremia hemolítica, enfermedad mieloproliferativa, coagulación intravascular diseminada, hemoglobinuria paroxística nocturna y trombocitopenia inducida por heparina;

[0210] - trombosis y tromboembolismo en la enfermedad renal crónica; y

[0211] - trombosis y tromboembolia en pacientes sometidos a hemodiálisis y en pacientes sometidos a oxigenación por membrana extracorpórea.

[0213] El término "anticuerpo quimérico" se refiere a una molécula de anticuerpo en la que (a) la región constante, o una porción de la misma, se altera, reemplaza o intercambia de manera que el sitio de unión a antígeno (región variable) se une a una región constante de una clase, función efectora y/o especie diferente o alterada, o a una molécula completamente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc.; o (b) la región variable, o una porción de la misma, se altera, reemplaza o intercambia con una región variable que posee una especificidad antigénica diferente o alterada. Por ejemplo, un anticuerpo de ratón puede modificarse reemplazando su región constante con la región constante de una inmunoglobulina humana. Debido al reemplazo con una región constante humana, el anticuerpo quimérico puede conservar su especificidad para reconocer el antígeno, aunque con una antigenicidad reducida en humanos en comparación con el anticuerpo de ratón original.

[0215] El término "variante modificada de forma conservadora" se aplica tanto a secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes modificadas de forma conservadora se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o, cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición donde un codón especifica una alanina, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas", que son un tipo de variaciones modificadas de forma conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico en el presente documento presente que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que suele ser el único codón para la metionina, y TGG, que suele ser el único codón para el triptófano) puede modificarse para generar una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

[0217] [0122] Para secuencias de polipéptidos, las "variantes modificadas de forma conservadora" incluyen sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de polipéptido que resultan en la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Dichas variantes modificadas de forma conservadora son adicionales y no excluyen las variantes polimórficas, los homólogos interespecíficos y los alelos de la invención. Los siguientes ocho grupos contienen aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, por ejemplo,Creighton, Proteins (1984)). En algunas realizaciones, el término "modificaciones de secuencia conservativas" se utiliza para referirse a modificaciones de aminoácidos que no afectan ni alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos.

[0218] El término "epítopo" se refiere a un determinante proteico capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. Los epítopos suelen consistir en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y generalmente poseen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión a los primeros, pero no a los segundos, se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. Se dice que dos anticuerpos "compiten" si se demuestra que un anticuerpo se une al mismo epítopo que el segundo anticuerpo en un ensayo de unión competitiva, mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia.

[0219] El término "anticuerpo humano", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a anticuerpos con regiones variables en las que tanto la región armazón como la región CDR derivan de secuencias de origen humano. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, esta también deriva de dichas secuencias humanas, por ejemplo, secuencias de la línea germinal humana o versiones mutadas de secuencias de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas (por ejemplo,mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o sitio-específicain vitroo por mutación somáticain vivo).

[0220] El término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que presentan una especificidad de unión única y que poseen regiones variables en las que tanto la región armazón como la región CDR derivan de secuencias humanas. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos se preparan utilizando procedimientos de visualización de fagos para el cribado de bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana.

[0221] Un anticuerpo "humanizado" es un anticuerpo que conserva la reactividad de un anticuerpo no humano, pero que es menos inmunogénico en humanos. Esto se puede lograr, por ejemplo, conservando las regiones CDR no humanas y reemplazando las partes restantes del anticuerpo con sus contrapartes humanas (es decir,la región constante, así como las porciones de armazón de la región variable). Véase, por ejemplo,Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun, 28:489-498, 1991; y Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994. Otros ejemplos de tecnología de ingeniería humana incluyen, pero no se limitan a, la tecnología Xoma divulgada en la patente estadounidense 5,766,886.

[0222] Los términos "idéntica" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos iguales (es decir,60% de identidad, opcionalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de identidad en una región específica o, cuando no se especifica, en toda la secuencia), cuando se comparan y alinean para obtener la máxima correspondencia en una ventana de comparación o región designada, según se mida utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineación manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad existe en una región que tiene al menos unos 50 nucleótidos (o 10 aminoácidos) de longitud, o más preferiblemente en una región que tiene de 100 a 500 o 1000 o más nucleótidos (o 20, 50, 200 o más aminoácidos) de longitud.

[0223] Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Al utilizar un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de prueba y de referencia en un ordenador, se especifican las coordenadas de las subsecuencias, si es necesario, y se definen los parámetros del programa del algoritmo. Se pueden utilizar los parámetros predeterminados del programa o bien especificar parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de las secuencias de prueba con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

[0224] [0129] Una "ventana de comparación", tal como se usa en el presente documento, incluye referencia a un segmento de cualquiera de las posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en 20 a 600, generalmente de 50 a 200, más comúnmente de 100 a 150 en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alinean de manera óptima. Los procedimientos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en el arte. La alineación óptima de secuencias para comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1970) Adv. Appl. Math.2:482c, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol.48:443, 1970, mediante el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software de genética de Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo,Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ed. Ringbou, 2003)).

[0226] Dos ejemplos de algoritmos adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res.25:3389-3402; y Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica. Este algoritmo implica primero identificar pares de secuencias de alta puntuación (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen una puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se denomina umbral de puntuación de palabra vecina (Altschulet al.,supra). Estos resultados iniciales de palabras vecinas actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que las contengan. Las coincidencias de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde se pueda aumentar la puntuación de alineación acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para residuos que no coinciden; siempre < 0). Para secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de las coincidencias de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulativa disminuye en la cantidad X desde su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulativa llega a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos con puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989) alineaciones (B) de 50, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras.

[0228] El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos ocurriría por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0,2, preferiblemente menor que aproximadamente 0,01, y aún mejor menor que aproximadamente 0,001.

[0230] El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos también se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos ponderados PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol, Biol.48:444-453, 1970) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en la web mundial en gcg.com), utilizando una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

[0232] Además del porcentaje de identidad de secuencia mencionado anteriormente, otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos son sustancialmente idénticos es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente reactivo cruzado con los anticuerpos generados contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe a continuación. Por lo tanto, un polipéptido es típicamente sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solo por sustituciones conservativas. Otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus complementos se hibridan entre sí bajo condiciones rigurosas, como se describe a continuación. Otra indicación más de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que se pueden usar los mismos cebadores para amplificar la secuencia.

[0234] El término "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo que está prácticamente libre de otros anticuerpos con especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a FXI y/o FXla está prácticamente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de FXI y/o FXla). Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a FXI y/o FXla puede presentar reactividad cruzada con otros antígenos. Además, un anticuerpo aislado puede estar prácticamente libre de otros materiales celulares y/o sustancias químicas.

[0236] [0135] El término "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM, IgE, IgG tal como IgG1 o IgG4) que proporcionan los genes de la región constante de la cadena pesada. El isotipo también incluye versiones modificadas de una de estas clases, en las que se han realizado modificaciones para alterar la función Fc, por ejemplo, para potenciar o reducir las funciones efectoras o la unión a los receptores Fc.

[0237] El término "k<asoc>" o "k<a>", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la velocidad de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular, mientras que el término "k<dis>" o "k<d>", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la velocidad de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular.

[0238] El término "K<D>", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la constante de disociación, que se obtiene a partir de la relación entre K<d>y K<a>(es decir, K<d>/k<a>) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de K<D>para anticuerpos pueden determinarse mediante procedimientos bien establecidos en la técnica. Los procedimientos para determinar el K<D>de un anticuerpo incluyen la medición de la resonancia de plasmones superficiales mediante un sistema de biosensor como el sistema BIACORE<™>, o la medición de la afinidad en solución mediante titulación de equilibrio en solución (SET).

[0239] Los términos “anticuerpo monoclonal” o “composición de anticuerpos monoclonales”, tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpos de composición molecular única. Una composición de anticuerpos monoclonales muestra una especificidad y afinidad de unión únicas para un epítopo particular.

[0240] El término "ácido nucleico" se utiliza en el presente documento indistintamente con el término "polinucleótido" y se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y sus polímeros en forma de cadena simple o doble. El término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o residuos o enlaces de la cadena principal modificados, que son sintéticos, naturales y no naturales, que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de manera similar a los nucleótidos de referencia. Ejemplos de tales análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de metilo quirales, ribonucleótidos 2-O-metilo, ácidos nucleicos peptídicos (ANP).

[0241] Salvo que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes modificadas de forma conservadora (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, como se detalla a continuación, las sustituciones de codones degenerados pueden lograrse generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de bases mixtas y/o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res.19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem.260:2605-2608, 1985; y Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).

[0242] El término "unido operativamente" se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de polinucleótidos (por ejemplo, ADN). Típicamente, el término se refiere a la relación funcional de una secuencia reguladora transcripcional con una secuencia transcrita. Por ejemplo, una secuencia promotora o potenciadora está unida operativamente a una secuencia codificante si estimula o modula la transcripción de dicha secuencia en una célula huésped apropiada u otro sistema de expresión. Generalmente, las secuencias reguladoras transcripcionales promotoras que están unidas operativamente a una secuencia transcrita son físicamente contiguas a la secuencia transcrita, es decir,actúan en cis. Sin embargo, algunas secuencias reguladoras transcripcionales, como los potenciadores, no necesitan ser físicamente contiguas ni estar ubicadas muy cerca de las secuencias codificantes cuya transcripción potencian.

[0243] En el presente documento, el término "optimizado" significa que una secuencia de nucleótidos ha sido modificada para codificar una secuencia de aminoácidos utilizando codones preferidos en la célula u organismo productor, generalmente una célula eucariota, por ejemplo, una célula de Pichia, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula humana. La secuencia de nucleótidos optimizada se diseña para conservar completa o en la mayor medida posible la secuencia de aminoácidos codificada originalmente por la secuencia de nucleótidos inicial, también conocida como secuencia "parental". Las secuencias optimizadas en el presente documento descritas se han diseñado para tener codones preferidos en células de mamíferos. Sin embargo, también se contempla la expresión optimizada de estas secuencias en otras células eucariotas o procariotas. Las secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de nucleótidos optimizadas también se denominan optimizadas.

[0244] Los términos “polipéptido” y “proteína” se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Estos términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son imitaciones químicas artificiales de un aminoácido natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos naturales y polímeros de aminoácidos no naturales. Salvo que se indique lo contrario, una secuencia de polipéptidos en particular también incluye implícitamente variantes modificadas de forma conservativa.

[0245] [0144] El término "anticuerpo humano recombinante", tal como se utiliza en el presente documento, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, como los anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo,un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de él, anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo,de un transfectoma, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos recombinantes y combinatorios, y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana, total o parcial, a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las que las regiones armazón y CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Sin embargo, en ciertas realizaciones, estos anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagénesisin vitro(o, cuando se utiliza un animal transgénico con secuencias de Ig humanas, a mutagénesis somáticain vivo) y, por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, si bien derivan de las secuencias VH y VL de la línea germinal humana y están relacionadas con ellas, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de anticuerpos de la línea germinal humanain vivo.

[0246] El término “célula huésped recombinante” (o simplemente “célula huésped”) se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Cabe señalar que estos términos se refieren no solo a la célula en cuestión, sino también a su descendencia. Dado que pueden producirse ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, dicha descendencia puede no ser idéntica a la célula progenitora, pero aun así se incluye dentro del alcance del término “célula huésped” utilizado en el presente documento.

[0247] El término “sujeto” incluye animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados (por ejemplo:mamíferos y no mamíferos), como primates no humanos (por ejemplo: mono cynomolgus), ovejas, conejos, perros, vacas, pollos, anfibios y reptiles. Salvo que se indique lo contrario, los términos “paciente” o “sujeto” se utilizan en el presente documento indistintamente. En el presente documento, los términos “cyno” o “cynomolgus” se refieren al mono cynomolgus (Macaca fascicularis). En aspectos específicos, un paciente o sujeto es un ser humano.

[0248] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "tratar" o "tratamiento" de cualquier enfermedad o trastorno (por ejemplo,un trastorno tromboembólico) se refiere, en una realización, a mejorar la enfermedad o el trastorno (es decir,ralentizar, detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o al menos uno de sus síntomas clínicos). En otra realización, "tratar" o "tratamiento" se refiere a aliviar o mejorar al menos un parámetro físico, incluidos aquellos que pueden no ser discernibles por el paciente. En otra realización más, "tratar" o "tratamiento" se refiere a modular la enfermedad o el trastorno, ya sea físicamente (por ejemplo, estabilización de un síntoma discernible), fisiológicamente (por ejemplo,estabilización de un parámetro físico) o ambas. En otra realización más, "tratar" o "tratamiento" se refiere a prevenir o retrasar el inicio, el desarrollo o la progresión de la enfermedad o el trastorno.

[0249] "Prevención" en lo que respecta a las indicaciones descritas en el presente documento, incluyendo, por ejemplo,un trastorno tromboembólico, significa cualquier acción que prevenga o ralentice un empeoramiento de, por ejemplo,los parámetros de una enfermedad tromboembólica, como se describe a continuación, en un paciente en riesgo de dicho empeoramiento.

[0250] El término “vector” se refiere a una molécula de polinucleótido capaz de transportar otro polinucleótido al que se ha unido. Un tipo de vector es el “plásmido”, que consiste en una cadena circular de ADN bicatenario en la que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es el vector viral, como el vector viral adenoasociado (AAV o AAV2), en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales al genoma viral. Algunos vectores son capaces de replicarse de forma autónoma en la célula huésped en la que se introducen (por ejemplo,vectores bacterianos con origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamíferos) pueden integrarse en el genoma de la célula huésped al introducirse en ella y, por lo tanto, se replican junto con el genoma del huésped. Además, algunos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento “vectores de expresión recombinantes” (o simplemente “vectores de expresión”). En general, los vectores de expresión útiles en las técnicas de ADN recombinante suelen tener forma de plásmidos. En la presente descripción, los términos "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente, ya que el plásmido es la forma de vector más común. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión, como los vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos en la replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que cumplen funciones equivalentes.

[0251] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0252]

[0253] Las figuras 1A-Cmuestran el efecto de NOV1401 sobre la trombosis inducida por FeCl<3>en ratones FXI -</->reconstituidos con proteína FXI humana. NOV1401 inhibió la trombosis de forma dosis-dependiente. El anticuerpo prolongó el tiempo de tromboplastina parcial activada (TPPa) en la misma medida que en los ratones FXI<-/->no tratados .

[0254] Las figuras 2A-Bmuestran el efecto de múltiples dosis intravenosas (iv) (A; N=2) o subcutáneas (sc) (B; N=2) de 3 mg/kg, 10 mg/kg y 30 mg/kg de NOV1401 sobre el TPPa (rombos) y su relación con los niveles plasmáticos totales de NOV1401 (cuadrados) en monos cynomolgus. Una dosis única de 3 mg/kg produjo un TPPa de aproximadamente el doble que se mantuvo durante 5-6 semanas. Todas las dosis probadas prolongaron el TPPa en una magnitud similar, y las dosis más altas probadas no parecieron aumentar la magnitud de la prolongación del TPPa observada con la dosis de 3 mg/kg.

[0255] Las figuras 3A-Bmuestran el efecto de múltiples dosis intravenosas (A; N=2) o subcutáneas (B; N=2) de 3 mg/kg, 10 mg/kg y 30 mg/kg de NOV1401 sobre el FXI libre plasmático (cuadrados) y su relación con el TPPa (rombos) en monos cynomolgus. Una dosis única de 3 mg/kg redujo el FXI libre en aproximadamente un 90% durante 5-6 semanas. Todas las dosis probadas redujeron el FXI libre en una magnitud similar, y las dosis más altas probadas no parecieron aumentar la magnitud de la reducción del FXI libre observada con la dosis de 3 mg/kg.

[0256] Las figuras 4A-Bmuestran la estructura de rayos X del Fab del anticuerpo NOV1401 de la invención unido a FXI.La figura 4Amuestra la estructura de rayos X del complejo NOV1401 Fab-FXI CD. El dominio catalítico de FXI se muestra como una superficie gris, el Fab como una cinta en gris claro (cadena ligera) y gris oscuro (cadena pesada).La figura 4Bmuestra la estructura de rayos X del complejo NOV1401 Fab-FXI CD superpuesta con el zimógeno de FXI. El dominio catalítico de FXI se muestra como una cinta gris. Los dominios variables del Fab se muestran como una cinta en gris claro (VL) y gris oscuro (VH). Superpuesta está la estructura del zimógeno, incluyendo los cuatro dominios de manzana como una cinta gris oscuro en la parte inferior de la estructura (PDB 2F83). Se indica el sitio de escisión de activación (IIe370).

[0257] Las figuras 5A y 5Bmuestran los cambios estructurales de FXla tras la unión del fragmento Fab de NOV1401.La figura 5Amuestra una vista del sitio activo de FXla antes de la unión del Fab. FXla se representa como una cinta con una superficie transparente. Se indican las secciones de la estructura que cambian de conformación tras la unión del Fab (bucle 145, bucle 188 y bucle 220). Se señalan los subbolsillos S1 y S1'.La figura 5Bmuestra la conformación inactiva de FXI en el complejo Fab (Fab no se muestra).

[0258] Las figuras 6A-Cmuestran curvas de respuesta compuesta de un anticuerpo anti-FXI/FXla.La figura 6Amuestra la inhibición de la actividad del Factor Xla por NOV1401. Curva de respuesta compuesta representativa del anticuerpo NOV1401 que inhibe la actividad enzimática del FXla humano de longitud completa. El ensayo mide la escisión de un péptido marcado con fluorescencia como se describe en el ejemplo 3. Usando el ajuste de curva no lineal con un modelo de ajuste logístico [y = A2+ (A1- A2)/ (1+ (x/ IC50)^p), donde y es el % de inhibición a la concentración del inhibidor, x. A1 es el valor de inhibición más bajo y A2 el valor de inhibición máximo. El exponente, p, es el coeficiente de Hill] en este conjunto de datos representativo conduce a un valor de IC<50>de 160 pM.La figura 6Bmuestra una curva de respuesta compuesta de TPPa. Curva de respuesta compuesta representativa del anticuerpo NOV1401 que prolonga el tiempo de coagulación en el ensayo TPPa usando plasma humano agrupado. El ensayo mide el tiempo de coagulación después de iniciar la cascada de coagulación intrínseca en presencia de diferentes concentraciones de NOV1401, como se describe en el Ejemplo 4. La línea negra representa un ajuste usando un modelo de ajuste no lineal logístico. La línea punteada representa el tiempo de coagulación basal del plasma humano agrupado en ausencia de NOV1401. El tiempo de coagulación basal es de 32,3 segundos y se indica con una línea discontinua gris en el gráfico. La línea punteada gris indica la concentración de anticuerpos en la que el tiempo de coagulación se duplica en comparación con el basal, es decir, el valor de 2 x TPPa, que es 14 nM.La Figura 6Cmuestra una curva de respuesta TGA. Se muestra una curva de respuesta del compuesto representativa del anticuerpo NOV1401 que inhibe la generación de trombina en el TGA con plasma humano agrupado. El ensayo mide los efectos de diferentes concentraciones de NOV1401 sobre la generación de trombina dependiente de FXI a través del llamado bucle de retroalimentación positiva trombina→FXIa, que puede ser activado por concentraciones muy bajas de factor tisular (TF), como se describe en el Ejemplo 4. La línea negra representa un ajuste mediante un modelo de curva dosisrespuesta de cuatro parámetros. La línea punteada representa la concentración residual de trombina debida a la generación de trombina inducida por pequeñas cantidades de TF. Se calculó un valor de IC<50>de 24 nM y una concentración residual de trombina de 159 nM (línea punteada) para esta curva de respuesta del compuesto.

[0259] Las figuras 7A-Bmuestran el efecto de dosis semanales de NOV1401 de 10 mg/kg (N=3) y 100 mg/kg (N=5) sc durante 13 semanas (14 dosis) o a 50 mg/kg (N=3) iv durante 4 semanas (5 dosis) sobre TPPa y actividad FXI (FXI:C).La figura 7Amuestra el efecto sobre TPPa, medido en los días 2, 23 y 79 del estudio. El TPPa aumentó de 2,1 a 3 veces en todos los animales que recibieron NOV1401 y se mantuvo elevado durante toda la fase de dosificación del estudio. No se observó dependencia de la dosis ni diferencias relacionadas con el sexo.La figura 7Bmuestra el efecto sobre FXI:C, medido en los días 2, 23 y 79 del estudio y representado como porcentaje de la actividad FXI plasmática. La concentración de FXI:C disminuyó en todos los animales que recibieron NOV1401 hasta alcanzar niveles del 5-12%, manteniéndose en estos niveles durante toda la fase de administración del fármaco. No se observó dependencia de la dosis ni diferencias relacionadas con el sexo.

[0261] DESCRIPCIÓN MÁS DETALLADA

[0263] La presente divulgación se basa, en parte, en el descubrimiento de moléculas de anticuerpos que se unen específicamente a FX1a e inhiben sus actividades biológicas. La divulgación se refiere tanto a anticuerpos completos en formato IgG, así como a fragmentos de unión a antígeno de los mismos, tales como los fragmentos Fab (por ejemplo,los anticuerpos NOV1090 y NOV1401).

[0265] En consecuencia, en el presente documento se divulgan anticuerpos que se unen específicamente a FXI y/o FXla (por ejemplo,FXI y/o FXla humanos, de conejo y de mono cynomolgus), composiciones farmacéuticas, procedimientos de producción y procedimientos de uso de dichos anticuerpos y composiciones.

[0267] [0153] En particular, la presente invención da a conocer un anticuerpo anti-FXI y anti-FXIa aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une dentro del dominio catalítico de FXI y FXIa y comprende secuencias CDR tal como se definen en las reivindicaciones adjuntas.

[0268] Factor XI

[0269] El FXI desempeña funciones importantes tanto en las rutas de coagulación intrínsecas como extrínsecas y en la conexión de las fases de iniciación y amplificación de la hemostasia plasmática. Tanto el Factor Xlla como la trombina pueden activar el FXI, lo que resulta en una generación sostenida de trombina e inhibición de la fibrinólisis. El FXI desempeña un papel menor en la hemostasia normal en un entorno con alto factor tisular "después de una lesión vascular", mientras que parece desempeñar un papel clave en la trombosis. La deficiencia grave del Factor XI se asocia con una menor incidencia de accidente cerebrovascular isquémico y eventos tromboembólicos venosos (Salomon et al 2008; Salomon, et al (2011) Thromb Haemost.; 105:269-73). Las manifestaciones hemorrágicas en sujetos con deficiencia grave del factor XI son infrecuentes, a menudo leves, inducidas por lesiones y afectan preferentemente a tejidos con mayor actividad fibrinolítica como la mucosa oral, la mucosa nasal y el tracto urinario (Salomon et al 2011). Las hemorragias en órganos vitales son extremadamente raras o inexistentes.

[0270] La coagulación plasmática es un proceso secuencial mediante el cual los factores de coagulación en la sangre interactúan y se activan, lo que finalmente resulta en la generación de fibrina y la formación de coágulos. En el modelo clásico de cascada de la coagulación, el proceso de generación de fibrina puede iniciarse por dos vías distintas, es decir, la vía intrínseca y la vía extrínseca, respectivamente (Mackman, 2008).

[0271] En la vía extrínseca, la lesión vascular permite que el factor tisular extravascular (FT) interactúe con el factor VII (FVII) y lo active, lo que a su vez conduce a la activación del factor X y la protrombina. La trombina activa finalmente convierte el fibrinógeno soluble en fibrina. La vía extrínseca es fundamental para la hemostasia; la interferencia con los factores de coagulación en esta vía conlleva un riesgo de hemorragia.

[0272] En la vía intrínseca, el factor XII puede activarse en algunos casos mediante un proceso denominado activación por contacto. La generación del factor Xlla activado conduce a las activaciones secuenciales del factor XI y el factor IX. A medida que el factor IXa activa el factor X, las vías extrínseca e intrínseca convergen en esta etapa (en la vía común). La actividad de la trombina se ve potenciada al amplificar su propia generación a través de un bucle de retroalimentación positiva en el que la trombina activa el factor XI independientemente del factor XII. Este bucle de retroalimentación positiva contribuye al crecimiento sostenido del trombo, pero participa mínimamente en la hemostasia, ya que la fuerte activación por el factor tisular extravascular es suficiente para la formación del coágulo. Por lo tanto, la vía intrínseca no participa sustancialmente en la hemostasia (Gailani y Renné (2007) Arterioscler Thromb Vasc Biol.2007, 27(12):2507-13, Müller, Gailiani y Renné 2011).

[0273] Los estudios preclínicos que utilizan una variedad de enfoques para inhibir FXI o FXla en diversas especies han contribuido a la validación de este objetivo. Los ratones FXI-/- son resistentes a la trombosis venosa experimental (Wang, et al. (2006) J Thromb Haemost; 4:1982-8) y arterial (Wang, et al. (2005) J Thromb Haemost; 3:695-702). El tratamiento de ratones con un anticuerpo (Ab, 14E11) que bloquea la activación de FXI por FXlla resultó en la inhibición de la trombosis experimental (Cheng, et al. (2010) Blood, 116:3981-9) y redujo el tamaño del infarto cerebral en un modelo de ratón de accidente cerebrovascular isquémico (Leung, et al. (2012) Transl Stroke Res 2012; 3:381-9). En babuinos a los que se les administró un anticuerpo anti-FXI que bloquea la unión y activación del FIX por el FX1a, se observó una reducción del crecimiento de trombos ricos en plaquetas en injertos vasculares recubiertos de colágeno (Tucker, et al. (2009) Blood 2009; 113:936-44), y se obtuvieron resultados similares con 14E11 en este modelo (Cheng 2010). No se observó sangrado excesivo en ninguno de estos estudios.

[0274] El bloqueo de la síntesis de FXI con oligonucleótidos antisentido en ratones (Zhang, et al. (2010) Blood 2010; 116:4684-92), monos cynomolgus (Younis, et al. (2012) Blood 2012; 119:2401-8) y babuinos (Crosby, et al. (2013) Arterioscler Thromb Vasc Biol 2013; 33:1670-8) resultó en efectos antitrombóticos y anticoagulantes sin sangrado excesivo. Además, se han producido efectos similares al bloquear FXla con inhibidores de bajo peso molecular en modelos venosos y arteriales de trombosis en ratas (Schumacher, et al. (2007) Eur J Pharmacol 2007; 570:167-74) y conejos (Wong, et al. (2011) J Thromb Thrombolysis 2011; 32:129-37).

[0275] Los pacientes con deficiencia grave de FXI rara vez sangran espontáneamente y solo muestran sangrado leve inducido por traumatismos, excepto en tejidos con alta actividad fibrinolítica. La rareza de la deficiencia grave de FXI hace necesario el uso de estudios poblacionales para revelar el perfil trombótico de estos pacientes en relación con la población general. Cabe destacar que dichos estudios informan que la incidencia de accidente cerebrovascular isquémico (Salomon 2008) y trombosis venosa profunda (TVP) (Salomon, et al. (2011) Blood 2008; 111: 4113-17) es reducida en estos pacientes. Así, el número de accidentes cerebrovasculares isquémicos (N = 1) observado en 115 pacientes con deficiencia grave de FXI fue menor (p < 0,003) que la incidencia esperada (N = 8,6) en la población general de Israel, mientras que la incidencia de TVP (N = 0) fue menor (p < 0,019) en pacientes con deficiencia grave de FXI que la esperada en la población de control (N = 4,7). Por el contrario, los individuos con niveles de FXI por encima del percentil 90 tuvieron un riesgo dos veces mayor de desarrollar TVP (Meijers, et al. (2000) N Engl J Med.

[0276] 2000; 342:696-701).

[0277] [0161] Recientemente, pacientes sometidos a reemplazo total de rodilla, un procedimiento que predispone a la TVP, fueron tratados con terapia antisentido de FXI o con el tratamiento estándar (enoxaparina). El grupo de antisentido (300 mg) mostró una incidencia 7 veces menor de trombosis venosa y menos eventos hemorrágicos (no significativos) en comparación con el tratamiento estándar (Büller et al, (2014) N Engl J Med. 372(3):232-40. doi: 10.1056/NEJMoa1405760. Epub 2014 Dec 7).

[0278] En conjunto, los estudios anteriores respaldan firmemente al FXI como diana válida para la terapia antitrombótica.

[0279] Anticuerpos FXla y fragmentos de unión al antígeno

[0280] En el presente documento se describen anticuerpos que se unen específicamente a FXI y/o FXla.

[0281] Los anticuerpos pueden unirse específicamente al FXI y/o FXla humanos, de conejo y de mono cynomolgus. Los anticuerpos descritos en la presente divulgación incluyen, entre otros, los anticuerpos monoclonales humanos y los Fab, aislados como se describe en los Ejemplos.

[0282] Se describen en el presente documento anticuerpos que se unen específicamente a una proteína FXI y/o FXla (por ejemplo, FXI y/o FXla humana, de conejo y de mono cynomolgus), donde los anticuerpos comprenden un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y 29. También se describen en el presente documento anticuerpos que se unen específicamente a una proteína FXI y/o FXla, donde los anticuerpos comprenden una CDR VH que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de los CDR VH enumerados en la Tabla 1,infra.En particular, se describen anticuerpos que se unen específicamente a una proteína FXI y/o FXla (por ejemplo,FXI y/o FXla humana, de conejo y de mono cynomolgus), donde los anticuerpos comprenden (o alternativamente, consisten en) uno, dos, tres o más CDR VH que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de los CDR VH enumerados en la Tabla 1,infra.

[0283] La presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen específicamente a una proteína FXla, dichos anticuerpos comprenden un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 o 39. La presente divulgación también proporciona anticuerpos que se unen específicamente a una proteína FXI y/o FXla (por ejemplo, FXI y/o FXla humana, de conejo y de mono cynomolgus), dichos anticuerpos comprenden un VL CDR que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de los VL CDR enumerados en la Tabla 1,infra.La divulgación también proporciona anticuerpos que se unen específicamente a una proteína FXIa (por ejemplo, FXI y/o FXla humana, de conejo y de mono cynomolgus), dichos anticuerpos comprenden (o alternativamente, consisten en) uno, dos, tres o más VL CDR que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de los VL CDR enumerados en la Tabla 1,infra.

[0284] Otros anticuerpos de la divulgación incluyen aminoácidos que han sido mutados, pero que tienen al menos un 60, 70, 80, 85, 90 o 95 por ciento de identidad en las regiones CDR con las regiones CDR representadas en las secuencias descritas en la Tabla 1. En algunos casos, incluye secuencias de aminoácidos mutantes en las que no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos han sido mutados en las regiones CDR en comparación con las regiones CDR representadas en la secuencia descrita en la Tabla 1.

[0285] La presente divulgación también proporciona secuencias de ácidos nucleicos que codifican VH, VL, la cadena pesada completa y la cadena ligera completa de los anticuerpos que se unen específicamente a una proteína FXI y/o FXla (por ejemplo,FXla humana, de conejo y de mono cynomolgus). Dichas secuencias de ácidos nucleicos pueden optimizarse para su expresión en células de mamíferos (por ejemplo, la Tabla 1 muestra las secuencias de ácidos nucleicos optimizadas para la cadena pesada y la cadena ligera de los anticuerpos de la invención).

[0286] T l 1. E m l n i r n r FXI1 r ín F FXI

[0287]

[0288]

[0291] 

[0292]

[0293]

[0294]

[0295]

[0296]

[0299] Otros anticuerpos de la divulgación incluyen aquellos en los que los aminoácidos o ácidos nucleicos que codifican los aminoácidos han sido mutados, pero tienen al menos un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 por ciento de identidad con las secuencias descritas en la Tabla 1. Algunos casos incluyen secuencias de aminoácidos mutantes en las que no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos han sido mutados en las regiones variables en comparación con las regiones variables representadas en la secuencia descrita en la Tabla 1, mientras que conservan sustancialmente la misma actividad de unión a antígeno.

[0301] [0170] Dado que cada uno de estos anticuerpos puede unirse a FXI y/o FXla, las secuencias VH, VL, de cadena ligera de longitud completa y de cadena pesada de longitud completa (secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos) pueden "combinarse" para crear otros anticuerpos que se unan a FXI y/o FXla. Dichos anticuerpos "combinados" que se unen a FXI y/o FXla pueden probarse utilizando los ensayos de unión conocidos en la técnica (por ejemplo, ELISA y otros ensayos descritos en la sección Ejemplo). Cuando estas cadenas se combinan, una secuencia VH de un par VH/VL particular debe reemplazarse con una secuencia VH estructuralmente similar. De igual manera, una secuencia de cadena pesada de longitud completa de un par de cadena pesada de longitud completa/cadena ligera de longitud completa debe reemplazarse con una secuencia de cadena pesada de longitud completa estructuralmente similar. De igual manera, una secuencia VL de un par VH/VL particular debe reemplazarse con una secuencia VL estructuralmente similar. De igual modo, una secuencia de cadena ligera de longitud completa de un emparejamiento particular de cadena pesada de longitud completa / cadena ligera de longitud completa debe reemplazarse con una secuencia de cadena ligera de longitud completa estructuralmente similar.

[0302] En consecuencia, en un caso, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o una región de unión a antígeno del mismo que tiene: un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 9 y 29, y un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 19 y 39, donde el anticuerpo se une específicamente a FXI y/o FXla (por ejemplo,FXla humano, de conejo y de mono cynomolgus).

[0303] Más específicamente, en ciertos aspectos, la invención proporciona un anticuerpo aislado o una región de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que comprende secuencias de aminoácidos seleccionadas de los SEQ ID NO: 9 y 29; o 19 y 39, respectivamente.

[0304] En un caso específico, un anticuerpo o fragmento de unión de antígeno del mismo proporcionado en el presente documento que se une específicamente al FXI humano y/o FXla, comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

[0305] En un caso específico, un anticuerpo o fragmento de unión de antígeno del mismo proporcionado en el presente documento que se une específicamente al FXI humano y/o FXla, comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39.

[0306] También se proporcionan (i) un anticuerpo aislado que tiene: una cadena pesada de longitud completa que comprende una secuencia de aminoácidos que ha sido optimizada para su expresión en una célula de mamífero seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 11 o 31, y una cadena ligera de longitud completa que comprende una secuencia de aminoácidos que ha sido optimizada para su expresión en una célula de mamífero seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 21 o 41; o (ii) una proteína funcional que comprende una porción de unión a antígeno de la misma.

[0307] También se proporciona un anticuerpo aislado o una región de unión a antígeno del mismo que tiene una cadena pesada y una cadena ligera que comprende secuencias de aminoácidos seleccionadas de los SEQ ID NO: 11 y 31; o 19 y 39, respectivamente.

[0308] En un caso específico, un anticuerpo o fragmento de unión de antígeno del mismo proporcionado en el presente documento que se une específicamente al FXI humano y/o FXla, comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

[0309] En un caso específico, un anticuerpo o fragmento de unión de antígeno del mismo proporcionado en el presente documento que se une específicamente al FXI humano y/o FXla, comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41.

[0310] Los términos "región determinante de la complementariedad" y "CDR", tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a las secuencias de aminoácidos dentro de las regiones variables de los anticuerpos que confieren especificidad antigénica y afinidad de unión. En general, hay tres CDR en cada región variable de la cadena pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) y tres CDR en cada región variable de la cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCDR3).

[0311] Los límites precisos de la secuencia de aminoácidos de una CDR dado se pueden determinar fácilmente utilizando cualquiera de varios esquemas bien conocidos, incluidos los descritos por Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5.ª ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (esquema de numeración "Kabat"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948 (esquema de numeración "Chothia"), Lefranc et al., (2003) Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (esquema de numeración "IMGT"), o el sistema "Combinado".

[0312] [0181] Por ejemplo, en Kabat, los residuos de aminoácidos CDR del anticuerpo NOV1090 en el dominio variable de la cadena pesada (VH) están numerados del 31 al 35 (HCDR1), del 50 al 66 (HCDR2) y del 99 al 111 (HCDR3); y los residuos de aminoácidos CDR en el dominio variable de la cadena ligera (VL) están numerados del 22 al 35 (LCDR1), del 51 al 57 (LCDR2) y del 90 al 100 (LCDR3). En Chothia, los aminoácidos CDR en el VH están numerados del 26 al 32 (HCDR1), del 52 al 57 (HCDR2) y del 99 al 111 (HCDR3); y los residuos de aminoácidos en el VL están numerados del 25 al 33 (LCDR1), del 51 al 53 (LCDR2) y del 92 al 99 (LCDR3). Al combinar las definiciones de CDR de Kabat y Chothia, los CDR consisten en los residuos de aminoácidos 26-35 (HCDR1), 50-66 (HCDR2) y 99-111 (HCDR3) en VH humano y los residuos de aminoácidos 22-35 (LCDR1), 51-57 (LCDR2) y 90-100 (LCDR3) en VL humano. Al combinar las definiciones de CDR de Kabat y Chothia, los CDR "combinados" consisten en los residuos de aminoácidos 26-35 (HCDR1), 50-66 (HCDR2) y 99-108 (HCDR3) en VH humano y los residuos de aminoácidos 24-38 (LCDR1), 54-60 (LCDR2) y 93-101 (LCDR3) en VL humano. Como otro ejemplo, en IMGT, los residuos de aminoácidos CDR en el dominio variable de la cadena pesada (VH) están numerados del 26 al 33 (HCDR1), del 51 al 58 (HCDR2) y del 97 al 108 (HCDR3); y los residuos de aminoácidos CDR en el dominio variable de la cadena ligera (VL) están numerados del 27 al 36 (LCDR1), del 54 al 56 (LCDR2) y del 93 al 101 (LCDR3). La Tabla 1 proporciona ejemplos de Kabat, Chothia, Combined e IMGT HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 para anticuerpos anti-FXI/FXla, por ejemplo, NOV1090 y NOV1401. En otro aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos de unión a FXla que comprenden los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y la cadena ligera como se describe en la Tabla 1, o combinaciones de los mismos. Las secuencias de aminoácidos de los CDR1 de VH de los anticuerpos se muestran en los ID SEQ n.° 3 y 23. Las secuencias de aminoácidos de los CDR2 de VH de los anticuerpos se muestran en los ID SEQ n.° 4 y 24. Las secuencias de aminoácidos de los CDR3 de VH de los anticuerpos se muestran en los ID SEQ n.° 5 y 25. Las secuencias de aminoácidos de los CDR1 de VL de los anticuerpos se muestran en los ID SEQ n.° 13 y 33. Las secuencias de aminoácidos de los CDR2 de VL de los anticuerpos se muestran en los ID SEQ n.° 14 y 34. Las secuencias de aminoácidos de los CDR3 de VL de los anticuerpos se muestran en los ID SEQ n.° 15 y 35. Estas regiones CDR se delimitan utilizando el sistema Kabat.

[0314] Alternativamente, según se define utilizando el sistema Chothia (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948), las secuencias de aminoácidos de los CDR1 VH de los anticuerpos se muestran en los ID SEQ NO: 6 y 26. Las secuencias de aminoácidos de los CDR2 VH de los anticuerpos se muestran en los ID SEQ NO: 7 y 27. Las secuencias de aminoácidos de los CDR3 VH de los anticuerpos se muestran en los ID SEQ NO: 8 y 28. Las secuencias de aminoácidos de los CDR1 VL de los anticuerpos se muestran en los ID SEQ NO: 16 y 36. Las secuencias de aminoácidos de los CDR2 VL de los anticuerpos se muestran en los ID SEQ NO: 17 y 37. Las secuencias de aminoácidos de los CDR3 VL de los anticuerpos se muestran en los ID SEQ NO: 18 y 38.

[0316] Alternativamente, según se define utilizando el sistema combinado, las secuencias de aminoácidos del VH CDR1 de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 46. Las secuencias de aminoácidos del VH CDR2 de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 4. Las secuencias de aminoácidos del VH CDR3 de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 5. Las secuencias de aminoácidos del VL CDR1 de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 33. Las secuencias de aminoácidos del VL CDR2 de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 14. Las secuencias de aminoácidos del VL CDR3 de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 15.

[0318] Alternativamente, según se define utilizando el esquema de numeración IMGT, las secuencias de aminoácidos del VH CDR1 de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 43. Las secuencias de aminoácidos del VH CDR2 de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 44. Las secuencias de aminoácidos del VH CDR3 de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 45. Las secuencias de aminoácidos del VL CDR1 de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 47. Las secuencias de aminoácidos del VL CDR2 de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 37. Las secuencias de aminoácidos del VL CDR3 de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 15.

[0320] Dado que cada uno de estos anticuerpos puede unirse a FXI y/o FXla y que la especificidad de unión a antígeno la proporcionan principalmente las regiones CDR1, 2 y 3, las secuencias VH CDR1, 2 y 3 y VL CDR1, 2 y 3 pueden "combinarse" (es decir,se pueden combinar CDR de diferentes anticuerpos, aunque cada anticuerpo contiene preferiblemente VH CDR1, 2 y 3 y VL CDR1, 2 y 3 para crear otras moléculas de unión a FXI y/o FXla de la presente divulgación). Dichos anticuerpos de unión a FXI y/o FXla "combinados" pueden probarse utilizando los ensayos de unión conocidos en la técnica y los descritos en los ejemplos (por ejemplo,ELISA, SET, ensayos BIACORE<™>). Cuando se combinan secuencias VH CDR, la secuencia CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia VH particular debe reemplazarse por una estructuralmente similar. Secuencia(s) CDR. De igual modo, cuando se combinan secuencias CDR de VL, la secuencia CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia VL particular debe reemplazarse con una o más secuencias CDR estructuralmente similares. Será evidente para el técnico experto que se pueden crear nuevas secuencias VH y VL sustituyendo una o más secuencias de la región CDR de VH y/o VL con secuencias estructuralmente similares de las secuencias CDR que se muestran en el presente documento para los anticuerpos monoclonales de la presente divulgación. Además de lo anterior, en un caso, los fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos descritos en el presente documento pueden comprender un VH CDR1, 2 y 3, o un VL CDR 1, 2 y 3, donde el fragmento se une a FXI y/o FXla como un único dominio variable.

[0322] En ciertas realizaciones de la invención, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden tener las secuencias de cadena pesada y ligera de los Fab descritos en la Tabla 1. Más específicamente, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden tener las secuencias pesada y ligera de NOV1090 y NOV1401.

[0324] [0187] En otros casos de la divulgación, el fragmento de unión de anticuerpos o antígenos que se une específicamente a FXI y/o FXla comprende una región variable de cadena pesada CDR1, una región variable de cadena pesada CDR2, una región variable de cadena pesada CDR3, una región variable de cadena ligera CDR1, una región variable de cadena ligera CDR2 y una región variable de cadena ligera CDR3 según lo definido por Kabat y descrito en la Tabla 1. En otros casos de la divulgación, el fragmento de unión de anticuerpos o antígenos que se une específicamente a FXI y/o FXla comprende una región variable de cadena pesada CDR1, una región variable de cadena pesada CDR2, una región variable de cadena pesada CDR3, una región variable de cadena ligera CDR1, una región variable de cadena ligera CDR2 y una región variable de cadena ligera CDR3 según lo definido por Chothia y descrito en la Tabla 1. En otros casos, el fragmento de unión de anticuerpos o antígenos que se une específicamente a FXI y/o FXla comprende una región variable de cadena pesada CDR1, una región variable de cadena pesada CDR2, una región variable de cadena pesada CDR3, una región variable de cadena ligera CDR1, una región variable de cadena ligera CDR2 y una región variable de cadena ligera CDR3 según lo definido por el sistema combinado y descrito en la Tabla 1. En otros casos de la divulgación, el fragmento de unión de anticuerpo o antígeno que se une específicamente a FXI y/o FX1a comprende una región variable de cadena pesada CDR1, una región variable de cadena pesada CDR2, una región variable de cadena pesada CDR3, una región variable de cadena ligera CDR1, una región variable de cadena ligera CDR2 y una región variable de cadena ligera CDR3 según lo definido por IMGT y descrito en la Tabla 1.

[0325] En un caso específico, la divulgación incluye un anticuerpo que se une específicamente a FXI y/o FX1a que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 3; una región variable de cadena pesada CDR2 de SEQ ID NO: 4; una región variable de cadena pesada CDR3 de SEQ ID NO: 5; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 13; una región variable de cadena ligera CDR2 de SEQ ID NO: 14; y una región variable de cadena ligera CDR3 de SEQ ID NO: 15.

[0326] En una realización específica, la invención incluye un anticuerpo que se une específicamente a FXI y FX1a que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 23; una región variable de cadena pesada CDR2 de SEQ ID NO: 24; una región variable de cadena pesada CDR3 de SEQ ID NO: 25; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 33; una región variable de cadena ligera CDR2 de SEQ ID NO: 34; y una región variable de cadena ligera CDR3 de SEQ ID NO: 35.

[0327] En un caso específico, la divulgación incluye un anticuerpo que se une específicamente a FXI y/o FX1a que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 6; una región variable de cadena pesada CDR2 de SEQ ID NO: 7; una región variable de cadena pesada CDR3 de SEQ ID NO: 8; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 16; una región variable de cadena ligera CDR2 de SEQ ID NO: 17; y una región variable de cadena ligera CDR3 de SEQ ID NO: 18.

[0328] En una realización específica, la invención incluye un anticuerpo que se une específicamente a FXI y FX1a que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 26; una región variable de cadena pesada CDR2 de SEQ ID NO: 27; una región variable de cadena pesada CDR3 de SEQ ID NO: 28; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 36; una región variable de cadena ligera CDR2 de SEQ ID NO: 37; y una región variable de cadena ligera CDR3 de SEQ ID NO: 38.

[0329] En una realización específica, se proporciona en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a FXI y FX1a que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 43; una región variable de cadena pesada CDR2 de SEQ ID NO: 44; una región variable de cadena pesada CDR3 de SEQ ID NO: 45; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 47; una región variable de cadena ligera CDR2 de SEQ ID NO: 37 y una región variable de cadena ligera CDR3 de SEQ ID NO: 15.

[0330] En una realización específica, se proporciona en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a FXI y FX1a que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 46; una región variable de cadena pesada CDR2 de SEQ ID NO: 4; una región variable de cadena pesada CDR3 de SEQ ID NO: 5; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 33; una región variable de cadena ligera CDR2 de SEQ ID NO: 14 y una región variable de cadena ligera CDR3 de SEQ ID NO: 15.

[0331] En ciertos casos, la divulgación incluye anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a FXI y/o FXla como se describe en la Tabla 1. En un caso preferido, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une a FXI y/o FXla es NOV1090 y NOV1401.

[0332] Tal como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena pesada o ligera, o cadenas pesadas o ligeras completas, que son "producto de" o "derivadas de" una secuencia germinal particular, si las regiones variables o las cadenas completas del anticuerpo se obtienen de un sistema que utiliza genes de inmunoglobulina germinal humana. Dichos sistemas incluyen la inmunización de un ratón transgénico portador de genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés o el cribado de una biblioteca de genes de inmunoglobulina humana presentada en fagos con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que es "producto de" o "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina germinal humana puede identificarse como tal comparando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas germinales humanas y seleccionando la secuencia de inmunoglobulina germinal humana que sea más cercana en secuencia (es decir,con el mayor porcentaje de identidad) a la secuencia del anticuerpo humano.

[0333] [0196] Un anticuerpo humano que es "producto de" o "derivado de" una secuencia particular de inmunoglobulina de la línea germinal humana puede contener diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de la línea germinal, debido, por ejemplo, a mutaciones somáticas naturales o a la introducción intencional de mutaciones dirigidas al sitio. Sin embargo, en las regiones armazón VH o VL, un anticuerpo humano seleccionado suele ser al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana y contiene residuos de aminoácidos que identifican al anticuerpo humano como humano cuando se compara con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de la línea germinal de otras especies (por ejemplo, secuencias de la línea germinal murina). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser al menos 60%, 70%, 80%, 90%, o al menos 95%, o incluso al menos 96%, 97%, 98% o 99% idéntico en la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal.

[0335] Por lo general, un anticuerpo humano recombinante mostrará no más de 10 diferencias de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de la inmunoglobulina de la línea germinal humana en las regiones armazón VH o VL. En ciertos casos, el anticuerpo humano puede mostrar no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2 o 1 diferencia de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de la inmunoglobulina de la línea germinal. Ejemplos de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos de la línea germinal del dominio variable descritos a continuación, así como DP47 y DPK9.

[0337] Anticuerpos homólogos

[0339] También se divulga en el presente documento un anticuerpo, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que comprende secuencias de aminoácidos homólogas a las secuencias descritas en la Tabla 1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 29, 31, 39 o 41), y el anticuerpo se une a una proteína FXI y/o FXla (por ejemplo, FXla humana, de conejo y de mono cynomolgus), y conserva las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos descritos en la Tabla 1, como NOV1090 y NOV1401. En casos específicos, dichos anticuerpos homólogos conservan las secuencias de aminoácidos CDR descritas en la Tabla 1 (por ejemplo, CDR de Kabat, CDR de Chothia, CDR de IMGT o CDR combinados).

[0341] Por ejemplo, se divulga un anticuerpo aislado, o un fragmento funcional de unión a antígeno del mismo, que comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, donde el dominio variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 9 y 29; el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 19 y 39; y el anticuerpo se une específicamente a FXI y/o FXla (por ejemplo, FXla humano, de conejo y de mono cynomolgus). En un caso, un anticuerpo aislado, o un fragmento funcional de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, donde el dominio variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; y el anticuerpo se une específicamente a FXI y/o FXla (por ejemplo, FXla humano, de conejo y de mono cynomolgus). En un caso, un anticuerpo aislado, o un fragmento funcional de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, donde el dominio variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; El dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, al menos un 90% o al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; y el anticuerpo se une específicamente a FXI y/o FXla (por ejemplo, FXla humano, de conejo y de mono cynomolgus). En ciertos casos de la divulgación, las secuencias de cadena pesada y ligera comprenden además las secuencias HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 según lo definido por Kabat, por ejemplo, SEQ ID NO: 3, 4, 5, 13, 14 y 15, respectivamente. En otros casos de la divulgación, las secuencias de cadena pesada y ligera comprenden además las secuencias HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 según lo definido por Chothia, por ejemplo, los números de identificación de secuencia: 6, 7, 8, 16, 17 y 18, respectivamente. En otros aspectos, las secuencias de cadena pesada y ligera comprenden además las secuencias HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 según lo definido por el sistema combinado, por ejemplo, los números de identificación de secuencia: 46, 4, 5, 33, 14 y 15, respectivamente. En otros aspectos, las secuencias de cadena pesada y ligera comprenden además las secuencias HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, según lo define IMGT, por ejemplo, los números de identificación de secuencia: 43, 44, 45, 47, 37 y 15, respectivamente.

[0343] En otros casos, las secuencias de aminoácidos VH y/o VL pueden ser idénticas en un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a las secuencias establecidas en la Tabla 1. En otros casos, las secuencias de aminoácidos VH y/o VL pueden ser idénticas excepto por una sustitución de aminoácidos en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 posiciones de aminoácidos. Se puede obtener un anticuerpo con regiones VH y VL que tengan una identidad alta (es decir, del 80% o superior) con las regiones VH y VL de las descritas en la Tabla 1 mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codifican SEQ ID NO: 10 o 30 y SEQ ID NO: 20 y 40, respectivamente, seguido de la prueba del anticuerpo alterado codificado para la función retenida utilizando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.

[0345] [0201] En otros casos, las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de longitud completa y/o de la cadena ligera de longitud completa pueden ser 50% 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias establecidas en la Tabla 1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 11 y/o 21, o 31 y/o 41). Un anticuerpo que posee una cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de longitud completa con una identidad alta (es decir,del 80 % o superior) con las cadenas pesadas de longitud completa de cualquiera de los SEQ ID NO: 11 o 31, y cadenas ligeras de longitud completa de cualquiera de los SEQ ID NO: 21 o 41, se puede obtener mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codifican dichos polipéptidos, seguida de la prueba del anticuerpo alterado codificado para la función retenida utilizando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.

[0346] También se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado, o un fragmento funcional de unión a antígeno del mismo, que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, donde la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 11 y 31; la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 21 y 41; y el anticuerpo se une específicamente a FXI y/o FXla (por ejemplo, FXla humano, de conejo y de mono cynomolgus). En un caso, un anticuerpo aislado, o un fragmento funcional de unión a antígeno del mismo, comprende una cadena pesada y una cadena ligera, donde la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y el anticuerpo se une específicamente a FXI y/o FXla (por ejemplo,FXla humano, de conejo y de mono cynomolgus). En un caso, un anticuerpo aislado, o un fragmento funcional de unión a antígeno del mismo, comprende una cadena pesada y una cadena ligera, donde la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; La cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; y el anticuerpo se une específicamente a FXI y/o FXla (por ejemplo, FXla humano, de conejo y de mono cynomolgus). En ciertos casos, las secuencias de cadena pesada y ligera comprenden además las secuencias HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 según lo definido por Kabat, por ejemplo, SEQ ID NO: 3, 4, 5, 13, 14 y 15, respectivamente. En otros casos, las secuencias de cadena pesada y ligera comprenden además las secuencias HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 según lo definido por Chothia, por ejemplo, SEQ ID NO: 6, 7, 8, 16, 17 y 18, respectivamente. En otros aspectos, las secuencias de cadena pesada y ligera comprenden además las secuencias HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 según lo define el sistema combinado, por ejemplo, los números de identificación de secuencia: 46, 4, 5, 33, 14 y 15, respectivamente. En otros aspectos, las secuencias de cadena pesada y ligera comprenden además las secuencias HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 según lo define IMGT, por ejemplo, los números de identificación de secuencia: 43, 44, 45, 47, 37 y 15, respectivamente.

[0347] En otros casos, las secuencias de nucleótidos de la cadena pesada de longitud completa y/o de la cadena ligera de longitud completa pueden ser 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias establecidas en la Tabla 1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 12 y/o 22, o 32 y/o 42).

[0348] En otros casos, las regiones variables de las secuencias de nucleótidos de la cadena pesada y/o las regiones variables de las secuencias de la cadena ligera pueden ser idénticas en un 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a las secuencias establecidas en la Tabla 1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 10 y/o 20, o 30 y/o 40).

[0349] En el presente documento, el porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas que comparten (es decir, % de identidad es igual al número de posiciones idénticas dividido entre el número total de posiciones multiplicado por 100), teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que deben introducirse para lograr una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden realizarse mediante un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos que se presentan a continuación.

[0350] Adicional o alternativamente, las secuencias de proteínas de la presente divulgación pueden utilizarse como una "secuencia de consulta" para realizar búsquedas en bases de datos públicas y, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Por ejemplo, dichas búsquedas pueden realizarse utilizando el programa BLAST (versión 2.0) de Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol.215:403-10.

[0351] Anticuerpos con modificaciones conservadoras

[0352] En ciertos casos, un anticuerpo de la divulgación tiene una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, donde una o más de estas secuencias CDR tienen secuencias de aminoácidos específicas basadas en los anticuerpos descritos en el presente documento o modificaciones conservadoras de los mismos, y donde los anticuerpos conservan las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos de unión a FX1a de la invención.

[0353] [0208] En consecuencia, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que consiste en una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, donde: las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada CDR1 se seleccionan del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 3 y 23, y modificaciones conservadoras de los mismos; las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada CDR2 se seleccionan del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 4 y 24, y modificaciones conservadoras de los mismos; las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada CDR3 se seleccionan del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 5 y 25, y modificaciones conservadoras de los mismos; las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera CDR1 se seleccionan del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 13 y 33, y modificaciones conservadoras de los mismos; Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena ligera CDR2 se seleccionan del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 14 y 34, y modificaciones conservadoras de los mismos; las regiones variables de la cadena ligera de las secuencias de aminoácidos CDR3 se seleccionan del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 15 y 35, y modificaciones conservadoras de los mismos; y los fragmentos de unión de anticuerpos o antígenos de las mismas se unen específicamente a FX1a.

[0355] En un caso, se proporciona en el presente documento un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que consiste en una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, donde: las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada CDR1 se seleccionan del grupo que consiste en las descritas en la Tabla 1, y modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada CDR2 se seleccionan del grupo que consiste en las descritas en la Tabla 1, y modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada CDR3 se seleccionan del grupo que consiste en las descritas en la Tabla 1, y modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera CDR1 se seleccionan del grupo que consiste en las descritas en la Tabla 1, y modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera CDR2 se seleccionan del grupo que consiste en las descritas en la Tabla 1, y modificaciones conservadoras de las mismas; Las regiones variables de la cadena ligera de las secuencias de aminoácidos CDR3 se seleccionan del grupo que consiste en las descritas en la Tabla 1, y modificaciones conservativas de las mismas; y los fragmentos de unión de anticuerpos o antígenos de las mismas se unen específicamente a FXla.

[0357] En otros casos, el anticuerpo puede estar optimizado para su expresión en una célula de mamífero y tiene una secuencia de cadena pesada de longitud completa y una secuencia de cadena ligera de longitud completa, donde una o más de estas secuencias tienen secuencias de aminoácidos específicas basadas en los anticuerpos descritos en el presente documento o modificaciones conservadoras de las mismas, y donde los anticuerpos conservan las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos de unión a FXla de la invención. En consecuencia, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado optimizado para su expresión en una célula de mamífero que consiste en una cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de longitud completa donde la cadena pesada de longitud completa tiene secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de SEQ ID NO: 11 o 31, y modificaciones conservadoras de las mismas; y la cadena ligera de longitud completa tiene secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de SEQ ID NO: 21 o 41, y modificaciones conservadoras de las mismas; y el anticuerpo se une específicamente a FXI y/o FXla (por ejemplo, FXla humano, de conejo y de mono cynomolgus).

[0359] Anticuerpos que se unen al mismo epítopo

[0361] La presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen al mismo epítopo que los anticuerpos de unión a FXI y/o FXla descritos en la Tabla 1. Por lo tanto, se pueden identificar anticuerpos adicionales en función de su capacidad para competir (por ejemplo, para inhibir competitivamente la unión de, de manera estadísticamente significativa, mediante la unión al mismo epítopo o a uno superpuesto) con otros anticuerpos de la invención en ensayos de unión a FXI y/o FXla (como los descritos en la Sección de Ejemplos). La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir la unión de los anticuerpos de la presente invención a una proteína FXI y/o FXla demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con ese anticuerpo por la unión a FXI y/o FXla; dicho anticuerpo puede, según la teoría no limitante, unirse al mismo epítopo o a uno relacionado (por ejemplo, un epítopo estructuralmente similar o espacialmente próximo) en la proteína FXI y/o FXla que el anticuerpo con el que compite. En un caso concreto, el anticuerpo que se une al mismo epítopo en FXI y/o FX1a que los anticuerpos de la presente invención es un anticuerpo monoclonal humano. Dichos anticuerpos monoclonales humanos pueden prepararse y aislarse según se describe en el presente documento.

[0363] Tal como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo "compite" por la unión cuando el anticuerpo competidor se une al mismo epítopo FXI y/o FXla que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención (por ejemplo, NOV1401 o NOV1090) e inhibe la unión de FXI y/o FXla de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención en más del 50% (por ejemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%) en presencia de una concentración equimolar del anticuerpo competidor. Esto puede determinarse, por ejemplo, en un ensayo de unión competitiva, mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia.

[0365] [0213] Tal como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo no"competía" con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno FXI y/o FXla de la invención (por ejemplo, NOV1401 o NOV1090) a menos que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno competidor se uniera al mismo epítopo FXI y/o FXla, o a un epítopo FXI y/o FXla superpuesto, que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención. Tal como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno competidor no incluye uno que (i) bloquee estéricamente la unión de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención a su diana (por ejemplo, si dicho anticuerpo competidor se une a un epítopo FXI y/o FXla cercano y no superpuesto e impide físicamente que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención se una a su diana); y/o (ii) se une a un epítopo FXI y/o FXla diferente y no superpuesto e induce un cambio conformacional en la proteína FXI y/o FXla de tal manera que dicha proteína ya no puede ser unida por un anticuerpo FXI y/o FXla o un fragmento de unión de antígeno de la invención de una forma que ocurriría en ausencia de dicho cambio conformacional.

[0366] Anticuerpos diseñados y modificados

[0367] Un anticuerpo de la invención puede prepararse utilizando como material de partida un anticuerpo que contenga una o más de las secuencias VH y/o VL en el presente documento mostradas para diseñar un anticuerpo modificado, el cual puede presentar propiedades diferentes a las del anticuerpo original. Un anticuerpo puede diseñarse modificando uno o más residuos dentro de una o ambas regiones variables (es decir, VH y/o VL), por ejemplo, dentro de una o más regiones CDR y/o dentro de una o más regiones de estructura. Adicional o alternativamente, un anticuerpo puede diseñarse modificando residuos dentro de la(s) región(es) constante(s), por ejemplo, para alterar la(s) función(es) efectora(s) del anticuerpo.

[0368] Un tipo de ingeniería de regiones variables que se puede realizar es el injerto de CDR. Los anticuerpos interactúan con los antígenos diana principalmente a través de residuos de aminoácidos ubicados en las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las cadenas pesada y ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre los anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Debido a que las secuencias CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imiten las propiedades de anticuerpos naturales específicos mediante la construcción de vectores de expresión que incluyan secuencias CDR del anticuerpo natural específico injertadas en secuencias de armazón de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véase, por ejemplo,Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., USA 86:10029-10033; Patente estadounidense n.° 5,225,539 de Winter, y Patentes estadounidenses n.° 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 de Queen et al.)

[0369] En consecuencia, otro ejemplo de la divulgación se refiere a un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDR1 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3 y 23; secuencias CDR2 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 y 24; secuencias CDR3 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 y 25, respectivamente; y una región variable de cadena ligera que tiene secuencias CDR1 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 13 y 33; secuencias CDR2 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14 y 34; y secuencias CDR3 que consisten en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15 y 35, respectivamente. Por lo tanto, dichos anticuerpos contienen las secuencias CDR VH y VL de los anticuerpos monoclonales, pero pueden contener secuencias de estructura diferentes a las de estos anticuerpos.

[0370] Dichas secuencias armazón se pueden obtener de bases de datos de ADN públicas o referencias publicadas que incluyan secuencias de genes de anticuerpos de la línea germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de la línea germinal para los genes de la región variable de la cadena pesada y ligera humana se pueden encontrar en la base de datos de secuencias de la línea germinal humana "VBase" (disponible en la web en mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), así como en Kabat, EA, et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242; Tomlinson, IM, et al., 1992 J. Mol. Biol.227:776-798; y Cox, JPL et al., 1994 Eur. J Immunol.24:827-836.

[0371] Un ejemplo de secuencias armazón para usar en los anticuerpos de la divulgación son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias armazón utilizadas por anticuerpos seleccionados de la divulgación, por ejemplo, secuencias consenso y/o secuencias armazón utilizadas por anticuerpos monoclonales de la divulgación. Las secuencias VH CDR1, 2 y 3, y las secuencias VL CDR1, 2 y 3, pueden injertarse en regiones armazón que tienen la misma secuencia que la que se encuentra en el gen de inmunoglobulina de la línea germinal del que deriva la secuencia marco, o las secuencias CDR pueden injertarse en regiones armazón que contienen una o más mutaciones en comparación con las secuencias de la línea germinal. Por ejemplo, se ha descubierto que en ciertos casos es beneficioso mutar residuos dentro de las regiones del armazón para mantener o mejorar la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo (véanse, por ejemplo,las patentes estadounidenses n.° 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 de Queen et al.). Los marcos que pueden utilizarse como andamios sobre los que construir los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento incluyen, entre otros, VH1A, VH1B, VH3, Vk1, Vl2 y Vk2. Se conocen marcos adicionales en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en la base de datos vBase en la web en vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php?&MMN_position=1:1.

[0372] [0219] En consecuencia, una realización de la invención se refiere a anticuerpos aislados que se unen a FXla, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 9 y 29, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en la región de armazón de dichas secuencias, y que comprende además una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 19 o 39, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en la región de armazón de dichas secuencias.

[0374] Otro tipo de modificación de la región variable es mutar residuos de aminoácidos dentro de las regiones CDR1, CDR2 y/o CDR3 de VH y/o VL para mejorar así una o más propiedades de unión (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interés, lo que se conoce como "maduración de la afinidad". Se puede realizar mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR para introducir la(s) mutación(es) y el efecto sobre la unión del anticuerpo, u otra propiedad funcional de interés, se puede evaluar en ensayosin vitrooin vivocomo se describe en el presente documento y se proporciona en la Sección de Ejemplos. Se pueden introducir modificaciones conservadoras (como se mencionó anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. Además, normalmente no se alteran más de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una región CDR.

[0376] En consecuencia, en otro caso, la divulgación proporciona anticuerpos aislados que se unen a FXla, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que consisten en una región variable de cadena pesada que tiene una región VH CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que tiene los SEQ ID NO: 3 y 23 o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con los SEQ ID NO: 3 y 23; una región VH CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 4 y 24 o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con los SEQ ID NO: 4 y 24; una región VH CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 5 y 25, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con los SEQ ID NO: 5 y 25; una región VL CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 13 y 33, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con los SEQ ID NO: 13 y 33; una región VL CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 14 y 34, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con los SEQ ID NO: 14 y 34; y una región VL CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 15 y 35, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con los SEQ ID NO: 15 y 35.

[0378] En consecuencia, en otro caso, la divulgación proporciona anticuerpos aislados que se unen a FXla, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que consisten en una región variable de cadena pesada que tiene una región VH CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que tiene los SEQ ID NO: 6 y 26 o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con los SEQ ID NO: 6 y 26; una región VH CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 7 y 27 o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con los SEQ ID NO: 7 y 27; una región VH CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 8 y 28, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con los SEQ ID NO: 8 y 28; una región VL CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 16 y 36, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con los SEQ ID NO: 16 y 36; una región VL CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 17 y 37, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con los SEQ ID NO: 17 y 37; y una región VL CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 18 y 38, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con los SEQ ID NO: 18 y 38.

[0380] Injerto de dominios de unión a antígenos en estructuras o andamios alternativos

[0382] Se puede emplear una amplia variedad de estructuras o andamios de anticuerpos/inmunoglobulinas, siempre que el polipéptido resultante incluya al menos una región de unión que se una específicamente a FXla. Dichas estructuras o andamios incluyen los 5 idiotipos principales de las inmunoglobulinas humanas, o fragmentos de las mismas, e incluyen inmunoglobulinas de otras especies animales, preferiblemente con características humanizadas. Los anticuerpos de cadena pesada única, como los identificados en camélidos, son de particular interés en este sentido. Los expertos en la materia continúan descubriendo y desarrollando nuevas estructuras, andamios y fragmentos.

[0384] [0224] En un aspecto, la presente divulgación se refiere a la generación de anticuerpos no basados en inmunoglobulinas utilizando andamios no inmunoglobulinas sobre los cuales se pueden injertar las CDR de la invención. Se pueden emplear estructuras y andamios no inmunoglobulinas conocidos o futuros, siempre que comprendan una región de unión específica para la proteína FXI y/o FX1a diana. Entre los armazones o estructuras no inmunoglobulinas conocidos se incluyen, entre otros, la fibronectina (Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA), la anquirina (Molecular Partners AG, Zúrich, Suiza), los anticuerpos de dominio (Domantis, Ltd., Cambridge, MA, y Ablynx nv, Zwijnaarde, Bélgica), la lipocalina (Pieris Proteolab AG, Freising, Alemania), los inmunofármacos modulares pequeños (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), los maxybodies (Avidia, Inc., Mountain View, CA), la proteína A (Affibody AG, Suecia) y la afilina (gamma-cristalina o ubiquitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemania).

[0386] Los andamios de fibronectina se basan en el dominio de fibronectina tipo III (por ejemplo, el décimo módulo de la fibronectina tipo III (dominio 10 Fn3)). El dominio de fibronectina tipo III tiene 7 u 8 hebras beta que se distribuyen entre dos láminas beta, las cuales se empaquetan entre sí para formar el núcleo de la proteína, y además contienen bucles (análogos a las CDR) que conectan las hebras beta entre sí y están expuestos al solvente. Hay al menos tres de estos bucles en cada borde del sándwich de lámina beta, donde el borde es el límite de la proteína perpendicular a la dirección de las hebras beta (ver US 6,818,418). Estos andamios basados en fibronectina no son una inmunoglobulina, aunque el plegamiento general está estrechamente relacionado con el del fragmento de anticuerpo funcional más pequeño, la región variable de la cadena pesada, que comprende toda la unidad de reconocimiento de antígeno en la IgG de camello y llama. Debido a esta estructura, el anticuerpo no inmunoglobulina imita propiedades de unión a antígeno similares en naturaleza y afinidad a las de los anticuerpos. Estos andamios pueden utilizarse en una estrategia de aleatorización y reordenamiento de buclesin vitro, similar al proceso de maduración de la afinidad de los anticuerposin vivo.Estas moléculas basadas en fibronectina pueden utilizarse como andamios, donde las regiones de bucle de la molécula pueden reemplazarse con CDR de la invención mediante técnicas de clonación estándar.

[0388] La tecnología de anquirina se basa en el uso de proteínas con módulos repetitivos derivados de anquirina como andamios para portar regiones variables que pueden usarse para unirse a diferentes dianas. El módulo repetitivo de anquirina es un polipéptido de 33 aminoácidos que consiste en dos hélices α antiparalelas y un giro β. La unión de las regiones variables se optimiza principalmente mediante la visualización en ribosomas.

[0390] Los avímeros se derivan de proteínas naturales que contienen el dominio A, como LRP-1. Estos dominios son utilizados por la naturaleza para las interacciones proteína-proteína y, en humanos, más de 250 proteínas se basan estructuralmente en dominios A. Los avímeros constan de varios monómeros de "dominio A" diferentes (2-10) unidos mediante enlaces de aminoácidos. Se pueden crear avímeros que se unan al antígeno diana utilizando la metodología descrita en, por ejemplo, las solicitudes de patente estadounidenses n.° 20040175756; 20050053973; 20050048512; y 20060008844.

[0392] Los ligandos de afinidad de afibody son proteínas pequeñas y simples compuestas por un haz de tres hélices basado en el andamiaje de uno de los dominios de unión a IgG de la proteína A. La proteína A es una proteína de superficie de la bacteria Staphylococcus aureus. Este dominio de andamiaje consiste en 58 aminoácidos, 13 de los cuales se aleatorizan para generar bibliotecas de afibody con un gran número de variantes de ligando (véase, por ejemplo,US 5,831,012). Las moléculas de afibody imitan a los anticuerpos, tienen un peso molecular de 6 kDa, en comparación con el peso molecular de los anticuerpos, que es de 150 kDa. A pesar de su pequeño tamaño, el sitio de unión de las moléculas de afibody es similar al de un anticuerpo.

[0394] Las anticalinas son productos desarrollados por la empresa Pieris ProteoLab AG. Se derivan de las lipocalinas, un grupo extendido de proteínas pequeñas y robustas que suelen participar en el transporte o almacenamiento fisiológico de compuestos químicamente sensibles o insolubles. Varias lipocalinas naturales se encuentran en los tejidos humanos o fluidos corporales. La arquitectura proteica recuerda a las inmunoglobulinas, con bucles hipervariables sobre una estructura rígida. Sin embargo, a diferencia de los anticuerpos o sus fragmentos recombinantes, las lipocalinas están compuestas por una única cadena polipeptídica de 160 a 180 residuos de aminoácidos, siendo solo ligeramente mayor que un dominio de inmunoglobulina. El conjunto de cuatro bucles que conforma el sitio de unión muestra una marcada plasticidad estructural y tolera una variedad de cadenas laterales. Por lo tanto, el sitio de unión puede modificarse mediante un proceso patentado para reconocer moléculas diana específicas de diferente forma con alta afinidad y especificidad. Una proteína de la familia de las lipocalinas, la proteína de unión a bilina (BBP) de Pieris Brassicae, se ha utilizado para desarrollar anticalinas mediante la mutagénesis de un conjunto de cuatro bucles. Un ejemplo de solicitud de patente que describe anticalinas se encuentra en la publicación PCT n.° WO 199916873.

[0396] Las moléculas de afilina son pequeñas proteínas no inmunoglobulinas diseñadas para tener afinidades específicas hacia proteínas y moléculas pequeñas. Se pueden seleccionar rápidamente nuevas moléculas de afilina a partir de dos bibliotecas, cada una basada en una proteína andamiaje derivada de humanos diferente. Las moléculas de afilina no muestran homología estructural con las proteínas inmunoglobulinas. Actualmente, se emplean dos andamiajes de afilina: uno es la proteína gamma cristalina, una proteína estructural del cristalino humano, y el otro son proteínas de la superfamilia de la ubiquitina. Ambos andamiajes humanos son muy pequeños, presentan alta estabilidad térmica y son prácticamente resistentes a los cambios de pH y a los agentes desnaturalizantes. Esta alta estabilidad se debe principalmente a la estructura de lámina beta expandida de las proteínas. En WO200104144 se describen ejemplos de proteínas derivadas de la proteína gamma cristalina, y en WO2004106368 se describen ejemplos de proteínas similares a la ubiquitina.

[0397] Los miméticos de epítopos proteicos (PEM) son moléculas cíclicas de tamaño mediano, similares a péptidos (MW 1-2kDa) que imitan las estructuras secundarias de horquilla beta de las proteínas, la principal estructura secundaria involucrada en las interacciones proteína-proteína.

[0398] La presente invención proporciona anticuerpos totalmente humanos que se unen específicamente a una proteína FX1a. En comparación con los anticuerpos quiméricos o humanizados, los anticuerpos humanos que se unen a FX1a de la presente invención tienen una antigenicidad aún menor cuando se administran a sujetos humanos.Anticuerpos de camélidos

[0399] Las proteínas de anticuerpos obtenidas de miembros de la familia del camello y el dromedario (Camelus bactrianus y Calelus dromaderius), incluyendo miembros del Nuevo Mundo como las especies de llama (Lama paccos, Lama glama y Lama vicugna), se han caracterizado en cuanto a tamaño, complejidad estructural y antigenicidad para sujetos humanos. Ciertos anticuerpos IgG de esta familia de mamíferos, tal como se encuentran en la naturaleza, carecen de cadenas ligeras y, por lo tanto, son estructuralmente distintos de la estructura cuaternaria típica de cuatro cadenas, con dos cadenas pesadas y dos ligeras, para los anticuerpos de otros animales. Véase PCT/EP93/02214 (WO 94/04678, publicado el 3 de marzo de 1994).

[0400] Una región del anticuerpo de camélido que es el pequeño dominio variable único identificado como VHH se puede obtener mediante ingeniería genética para producir una proteína pequeña que tiene alta afinidad por una diana, lo que resulta en una proteína derivada de anticuerpos de bajo peso molecular conocida como un "nanocuerpo de camélido". Véase la patente estadounidense número 5,759,808 emitida el 2 de junio de 1998; véase también Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al.2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al.2002 Int J Cancer 89: 456-62; y Lauwereys, M. et al.1998 EMBO J 17: 3512-3520. Existen bibliotecas de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de camélidos diseñados mediante ingeniería genética, disponibles comercialmente, por ejemplo, en Ablynx, Gante, Bélgica. Al igual que con otros anticuerpos de origen no humano, la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de camélido puede modificarse mediante recombinación para obtener una secuencia más similar a la humana; es decir, el nanocuerpo puede "humanizarse". De este modo, se puede reducir aún más la baja antigenicidad natural de los anticuerpos de camélidos para los humanos.

[0401] El nanocuerpo de camélido tiene un peso molecular aproximadamente una décima parte del de una molécula de IgG humana, y la proteína tiene un diámetro físico de solo unos pocos nanómetros. Una consecuencia de su pequeño tamaño es la capacidad de los nanocuerpos de camélido para unirse a sitios antigénicos que son funcionalmente invisibles para las proteínas de anticuerpos más grandes; es decir, los nanocuerpos de camélido son útiles como reactivos para detectar antígenos que de otro modo serían crípticos utilizando técnicas inmunológicas clásicas, y como posibles agentes terapéuticos. Por lo tanto, otra consecuencia de su pequeño tamaño es que un nanocuerpo de camélido puede inhibir como resultado de la unión a un sitio específico en un surco o hendidura estrecha de una proteína diana, y por lo tanto puede servir en una capacidad que se asemeja más a la función de un fármaco clásico de bajo peso molecular que a la de un anticuerpo clásico.

[0402] El bajo peso molecular y el tamaño compacto hacen que los nanocuerpos de camélidos sean extremadamente termoestables, estables a pH extremos y a la digestión proteolítica, y poco antigénicos. Otra consecuencia es que los nanocuerpos de camélidos se mueven fácilmente del sistema circulatorio a los tejidos, e incluso atraviesan la barrera hematoencefálica y pueden tratar trastornos que afectan el tejido nervioso. Los nanocuerpos pueden facilitar aún más el transporte de fármacos a través de la barrera hematoencefálica. Véase la solicitud de patente estadounidense 20040161738 publicada el 19 de agosto de 2004. Estas características, combinadas con la baja antigenicidad para los humanos, indican un gran potencial terapéutico. Además, estas moléculas pueden expresarse completamente en células procariotas como E. coli y se expresan como proteínas de fusión con bacteriófagos y son funcionales.

[0403] En consecuencia, una característica de la presente divulgación es un anticuerpo o nanocuerpo de camélido con alta afinidad por FXI y/o FXIa. En ciertos casos, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se produce de forma natural en el animal camélido, es decir, se produce por el camélido tras la inmunización con FXI y/o FXIa o un fragmento peptídico de los mismos, utilizando las técnicas descritas en el presente documento para otros anticuerpos. Alternativamente, el nanocuerpo de camélido que se une a FXI y/o FXIa se diseña mediante ingeniería genética, es decir, se produce mediante selección, por ejemplo, a partir de una biblioteca de fagos que muestran proteínas de nanocuerpos de camélido mutagenizadas adecuadamente, utilizando procedimientos de selección con FXI y/o FXIa, y/o dominios y/o fragmentos peptídicos de los mismos, como diana, tal como se describe en los ejemplos en el presente documento presentados. Los nanocuerpos diseñados mediante ingeniería genética pueden personalizarse aún más para tener una semivida en un sujeto receptor de entre 45 minutos y dos semanas. En un caso específico, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se obtiene mediante el injerto de las secuencias CDR de la cadena pesada o ligera de los anticuerpos humanos de la invención en secuencias de la estructura del nanocuerpo o del anticuerpo de dominio único, como se describe, por ejemplo, en PCT/EP93/02214.

[0404] Moléculas biespecíficas y anticuerpos multivalentes

[0405] En otro aspecto, la presente divulgación presenta moléculas biespecíficas o multiespecíficas que comprenden un anticuerpo de unión a FXI y/o FXla, o un fragmento del mismo, de la divulgación. Un anticuerpo de la invención, o regiones de unión a antígeno del mismo, puede derivatizarse o unirse a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se une a al menos dos sitios de unión o moléculas diana diferentes. El anticuerpo de la invención puede, de hecho, derivatizarse o unirse a más de una molécula funcional para generar moléculas multiespecíficas que se unen a más de dos sitios de unión y/o moléculas diana diferentes; dichas moléculas multiespecíficas también se pretenden incluir en el término "molécula biespecífica" tal como se utiliza en el presente documento. Para crear una molécula biespecífica de la invención, un anticuerpo de la invención puede unirse funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente u otro procedimiento) a una o más moléculas de unión, como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión, de manera que se obtenga una molécula biespecífica.

[0406] En consecuencia, la presente divulgación incluye moléculas biespecíficas que comprenden al menos una primera especificidad de unión para FXI y/o FXla y una segunda especificidad de unión para un segundo epítopo diana. Por ejemplo, el segundo epítopo diana es otro epítopo de FXI y/o FXla distinto del primer epítopo diana.

[0407] Además, en los casos en que la molécula biespecífica sea multiespecífica, la molécula puede incluir una tercera especificidad de unión, además del primer y segundo epítopo diana.

[0408] En un caso, las moléculas biespecíficas de la presente invención comprenden como especificidad de unión al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, incluyendo, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, o un Fv de cadena simple. El anticuerpo también puede ser un dímero de cadena ligera o pesada, o cualquier fragmento mínimo del mismo, como un Fv o una construcción de cadena simple como se describe en la patente estadounidense n.° 4,946,778 de Ladner et al.

[0409] Los diabodies son moléculas bivalentes y biespecíficas en las que los dominios VH y VL se expresan en una única cadena polipeptídica, conectadas por un enlazador demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Los dominios VH y VL se aparean con dominios complementarios de otra cadena, creando así dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo,Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123). Los diabodies pueden producirse expresando dos cadenas polipeptídicas con la estructura VHA-VLB y VHB-VLA (configuración VH-VL), o VLA-VHB y VLB-VHA (configuración VL-VH) dentro de la misma célula. La mayoría de ellos pueden expresarse en forma soluble en bacterias. Los diabodies de cadena simple (scDb) se producen conectando las dos cadenas polipeptídicas formadoras de diabody con un enlazador de aproximadamente 15 residuos de aminoácidos (véase Holliger y Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36). El scDb puede expresarse en bacterias en forma monomérica soluble y activa (véase Holliger y Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun y Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21). Un diabody puede fusionarse a Fc para generar un "di-diabody" (ver Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65).

[0410] Otros anticuerpos que pueden emplearse en las moléculas biespecíficas de la divulgación son los anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos y humanizados.

[0411] Las moléculas biespecíficas pueden prepararse mediante la conjugación de sus especificidades de unión constituyentes, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica puede generarse por separado y luego conjugarse con las demás. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, se pueden utilizar diversos agentes de acoplamiento o reticulación para la conjugación covalente. Ejemplos de agentes de reticulación incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) y sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (véase, por ejemplo, Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med.160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Otros procedimientos incluyen los descritos en Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No.78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83), y Glennie et al., 1987 J. Immunol.139: 2367-2375). Los agentes conjugadores son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles en Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

[0412] Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, pueden conjugarse mediante enlaces sulfhidrilo en las regiones bisagra del extremo C de las dos cadenas pesadas. En una realización particular, la región bisagra se modifica para contener un número impar de residuos sulfhidrilo, por ejemplo, uno, antes de la conjugación.

[0413] Alternativamente, ambas especificidades de unión pueden codificarse en el mismo vector y expresarse y ensamblarse en la misma célula huésped. Este procedimiento es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es una proteína de fusión mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x Fab. Una molécula biespecífica de la divulgación puede ser una molécula de cadena simple que comprende un anticuerpo de cadena simple y un determinante de unión, o una molécula biespecífica de cadena simple que comprende dos determinantes de unión.

[0414] Las moléculas biespecíficas pueden comprender al menos dos moléculas de cadena simple. Los procedimientos para preparar moléculas biespecíficas se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense número 5,260,203; patente estadounidense número 5,455,030; patente estadounidense número 4,881,175; patente estadounidense número 5,132,405; patente estadounidense número 5,091,513;

[0415] Patente número 5,476,786; Patente estadounidense número 5,013,653; Patente estadounidense número 5,258,498; y Patente estadounidense número 5,482,858.

[0416] La unión de las moléculas biespecíficas a sus dianas específicas puede confirmarse mediante, por ejemplo, ensayo inmunoenzimático (ELISA), radioinmunoensayo (REA), análisis FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibición del crecimiento) o Western Blot. Cada uno de estos ensayos generalmente detecta la presencia de complejos proteínaanticuerpo de particular interés mediante el uso de un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés.

[0417] En otro aspecto, la presente divulgación proporciona compuestos multivalentes que comprenden al menos dos porciones de unión a antígeno idénticas o diferentes de los anticuerpos de la invención que se unen a FX1a. Las porciones de unión a antígeno pueden unirse mediante fusión de proteínas o mediante enlaces covalentes o no covalentes. Alternativamente, se han descrito procedimientos de enlace para las moléculas biespecíficas. Los compuestos tetravalentes pueden obtenerse, por ejemplo, mediante la reticulación de anticuerpos de la invención con un anticuerpo que se une a las regiones constantes de los anticuerpos de la invención, por ejemplo, la región Fc o la región bisagra.

[0418] Los dominios trimerizantes se describen, por ejemplo, en la patente boreana EP 1012280B1. Los módulos pentamerizantes se describen, por ejemplo, en PCT/EP97/05897.

[0419] Anticuerpos con semivida prolongada

[0420] La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a la proteína FXla y que tienen una semivida prolongadain vivo.

[0421] Muchos factores pueden afectar la semivida de una proteínain vivo.Por ejemplo, la filtración renal, el metabolismo en el hígado, la degradación por enzimas proteolíticas (proteasas) y las respuestas inmunogénicas (por ejemplo, la neutralización de proteínas por anticuerpos y la captación por macrófagos y células dendríticas). Se pueden utilizar diversas estrategias para prolongar la semivida de los anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo, mediante la unión química a polietilenglicol (PEG), reCODE PEG, andamiaje de anticuerpos, ácido polisialico (PSA), hidroxietil almidón (HES), ligandos de unión a albúmina y escudos de carbohidratos; mediante la fusión genética a proteínas que se unen a proteínas séricas, como albúmina, IgG, FcRn y transferencia; mediante el acoplamiento (genética o químicamente) a otras fracciones de unión que se unen a proteínas séricas, como nanobodies, Fabs, DARPins, avimers, affibodies y anticalinas; mediante fusión genética con rPEG, albúmina, dominio de albúmina, proteínas de unión a la albúmina y Fc; o mediante incorporación en nanotransportadores, formulaciones de liberación lenta o dispositivos médicos.

[0422] Para prolongar la circulación sérica de anticuerposin vivo,se pueden unir moléculas de polímero inerte, como el PEG de alto peso molecular, a los anticuerpos o a un fragmento de los mismos, con o sin un enlazador multifuncional, ya sea mediante la conjugación sitio-específica del PEG al extremo N o C de los anticuerpos o a través de grupos épsilon-amino presentes en los residuos de lisina. Para pegilar un anticuerpo, este, o un fragmento del mismo, se hace reaccionar típicamente con polietilenglicol (PEG), como un éster reactivo o un derivado aldehídico del PEG, en condiciones en las que uno o más grupos PEG se unen al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La pegilación puede llevarse a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero reactivo soluble en agua análogo). En el presente documento, el término "polietilenglicol" abarca cualquiera de las formas de PEG utilizadas para derivatizar otras proteínas, como el mono(C1-C10)alcoxi- o ariloxipolietilenglicol o el polietilenglicol-maleimida. En ciertas realizaciones, el anticuerpo que se va a pegilar es un anticuerpo aglicosilado. Se utilizará la derivatización con polímeros lineales o ramificados que minimice la pérdida de actividad biológica. El grado de conjugación se puede controlar mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas para asegurar la correcta conjugación de las moléculas de PEG con los anticuerpos. El PEG no reaccionado se puede separar de los conjugados anticuerpo-PEG mediante cromatografía de exclusión por tamaño o de intercambio iónico. Los anticuerpos derivatizados con PEG se pueden evaluar para determinar su actividad de unión y su eficaciain vivomediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, mediante los inmunoensayos descritos en el presente documento. En la técnica se conocen procedimientos para la pegilación de proteínas que pueden aplicarse a los anticuerpos de la invención. Véanse, por ejemplo, las patentes EP 0154316 de Nishimura et al. y EP 0401384 de Ishikawa et al.

[0423] [0254] Otras tecnologías de pegilación modificadas incluyen la tecnología de ingeniería dirigida químicamente ortogonal (ReCODE PEG), que incorpora cadenas laterales químicamente especificadas en proteínas biosintéticas a través de un sistema reconstituido que incluye la ARNt sintetasa y el ARNt. Esta tecnología permite la incorporación de más de 30 nuevos aminoácidos en proteínas biosintéticas en E. coli, levadura y células de mamíferos. El ARNt incorpora un aminoácido no nativo en cualquier lugar donde se encuentre un codón ámbar, convirtiendo el ámbar de un codón de parada en uno que señala la incorporación del aminoácido químicamente especificado.

[0424] La tecnología de pegilación recombinante (rPEG) también puede utilizarse para prolongar la semivida sérica. Esta tecnología consiste en fusionar genéticamente una cola de proteína no estructurada de 300 a 600 aminoácidos a una proteína farmacéutica ya existente. Dado que el peso molecular aparente de dicha cadena de proteína no estructurada es aproximadamente 15 veces mayor que su peso molecular real, la semivida sérica de la proteína aumenta considerablemente. A diferencia de la PEGilación tradicional, que requiere conjugación química y purificación posterior, el proceso de fabricación se simplifica enormemente y el producto es homogéneo.

[0425] La polisialilación es otra tecnología que utiliza el polímero natural ácido polisialico (PSA) para prolongar la vida activa y mejorar la estabilidad de péptidos y proteínas terapéuticas. El PSA es un polímero de ácido siálico (un azúcar). Cuando se utiliza para la administración de fármacos proteicos y peptídicos terapéuticos, el ácido polisialico proporciona un microambiente protector durante la conjugación. Esto aumenta la vida activa de la proteína terapéutica en la circulación y evita que sea reconocida por el sistema inmunitario. El polímero PSA se encuentra de forma natural en el cuerpo humano. Ciertas bacterias lo adoptaron tras evolucionar durante millones de años para recubrir sus paredes con él. Estas bacterias polisialiladas de forma natural pudieron, gracias al mimetismo molecular, burlar el sistema de defensa del cuerpo. El PSA, la tecnología de sigilo definitiva de la naturaleza, puede producirse fácilmente a partir de dichas bacterias en grandes cantidades y con características físicas predeterminadas. El PSA bacteriano es completamente no inmunogénico, incluso cuando se acopla a proteínas, ya que es químicamente idéntico al PSA del cuerpo humano.

[0426] Otra tecnología incluye el uso de derivados de hidroxietil almidón ("HES") unidos a anticuerpos. El HES es un polímero natural modificado derivado del almidón de maíz ceroso y puede ser metabolizado por las enzimas del cuerpo. Las soluciones de HES se administran habitualmente para sustituir el volumen sanguíneo deficiente y mejorar las propiedades reológicas de la sangre. La hesilación de un anticuerpo permite prolongar la semivida de circulación al aumentar la estabilidad de la molécula, así como al reducir la eliminación renal, lo que resulta en una mayor actividad biológica. Al variar diferentes parámetros, como el peso molecular del HES, se puede personalizar una amplia gama de conjugados de anticuerpos con HES.

[0427] También se pueden generar anticuerpos con una semivida aumentadain vivomediante la introducción de una o más modificaciones de aminoácidos (es decir, sustituciones, inserciones o deleciones) en un dominio constante de IgG o en un fragmento de unión a FcRn del mismo (preferiblemente un fragmento del dominio Fc o de la región bisagra del Fc). Véase, por ejemplo, la publicación internacional n.º WO 98/23289; la publicación internacional n.º WO 97/34631; y la patente estadounidense n.º 6.277.375.

[0428] Además, los anticuerpos pueden conjugarse con albúmina (por ejemplo, albúmina sérica humana; HSA) para hacer que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo sea más establein vivoo tenga una semivida más largain vivo.Las técnicas son bien conocidas en la técnica, véanse, por ejemplo, las publicaciones internacionales n.° WO 93/15199, WO 93/15200 y WO 01/77137; y la patente europea n.° EP 413,622. Además, en el contexto de un anticuerpo biespecífico como el descrito anteriormente, las especificidades del anticuerpo pueden diseñarse de manera que un dominio de unión del anticuerpo se una a FX1a mientras que un segundo dominio de unión del anticuerpo se una a la albúmina sérica, preferiblemente HSA.

[0429] Las estrategias para aumentar la semivida son especialmente útiles en nanobodies, ligandos basados en fibronectina y otros anticuerpos o proteínas para los que se desea una mayor semividain vivo .

[0430] Conjugados de anticuerpos

[0431] La presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a una proteína FXIa fusionada recombinantemente o conjugada químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) a una proteína o polipéptido heterólogo (o fragmento del mismo, preferiblemente a un polipéptido de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos) para generar proteínas de fusión. En particular, la divulgación proporciona proteínas de fusión que comprenden un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo descrito en el presente documento (por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento F(ab)2, un dominio VH, una CDR VH, un dominio VL o una CDR VL) y una proteína, polipéptido o péptido heterólogo. En la técnica se conocen procedimientos para fusionar o conjugar proteínas, polipéptidos o péptidos a un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. Véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.° 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851 y 5,112,946; las patentes europeas n.° EP 307,434 y EP 367,166; las publicaciones internacionales n.° WO 96/04388 y WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol.154:5590-5600; y Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337- 11341.

[0432] [0262] Se pueden generar proteínas de fusión adicionales mediante las técnicas de intercambio de genes, intercambio de motivos, intercambio de exones y/o intercambio de codones (denominadas colectivamente "intercambio de ADN"). El intercambio de ADN puede emplearse para alterar las actividades de los anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos con mayores afinidades y menores tasas de disociación). Véase, en general, las patentes estadounidenses n.° 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252 y 5,837,458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol.8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol.16(2):76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol.287:265-76; y Lorenzo y Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313.

[0433] Los anticuerpos o fragmentos de los mismos, o los anticuerpos o fragmentos codificados de los mismos, pueden alterarse al ser sometidos a mutagénesis aleatoria por PCR propensa a errores, inserción aleatoria de nucleótidos u otros procedimientos antes de la recombinación. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a una proteína FX1a puede recombinarse con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc., de una o más moléculas heterólogas.

[0434] Además, los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden fusionarse a secuencias marcadoras, como un péptido, para facilitar la purificación. En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexa-histidina (SEQ ID NO: 48), como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Como se describe en Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, por ejemplo, la hexa-histidina (SEQ ID NO: 48) permite una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas peptídicas útiles para la purificación incluyen, entre otras, la etiqueta de hemaglutinina ("HA"), que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza (Wilson et al., 1984, Cell 37:767), y la etiqueta "flag".

[0435] En otras realizaciones, anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos conjugados a un agente de diagnóstico o detectable. Dichos anticuerpos pueden ser útiles para monitorear o pronosticar el inicio, desarrollo, progresión y/o gravedad de una enfermedad o trastorno como parte de un procedimiento de prueba clínica, como determinar la eficacia de una terapia particular. Dicho diagnóstico y detección se puede lograr acoplando el anticuerpo a sustancias detectables que incluyen, pero no limitadas a, varias enzimas, tales como, pero no limitadas a, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos, tales como, pero no limitados a, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como, pero no limitados a, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, como por ejemplo, el luminol; materiales bioluminiscentes, como por ejemplo, la luciferasa, la luciferina y la aequorina; materiales radiactivos, tales como, pero no limitados a, yodo (1311, 125I, 123I y 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In y 111In), tecnecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn y 117Tin; y metales emisores de positrones utilizando diversas tomografías de emisión de positrones, e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos.

[0436] La presente invención abarca además el uso de anticuerpos o fragmentos de los mismos conjugados a una molécula terapéutica. Un anticuerpo o fragmento del mismo puede conjugarse a una molécula terapéutica como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un ion metálico radiactivo, por ejemplo, emisores alfa. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células.

[0437] Además, un anticuerpo o un fragmento del mismo puede conjugarse a una fracción terapéutica o fracción farmacológica que modifica una respuesta biológica determinada. Las fracciones terapéuticas o fracciones farmacológicas no deben interpretarse como limitadas a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la fracción farmacológica puede ser una proteína, péptido o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina como la abrina, la ricina A, la exotoxina de Pseudomonas, la toxina del cólera o la toxina de la difteria; una proteína como el factor de necrosis tumoral, el interferón α, el interferón β, el factor de crecimiento nervioso, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, el activador tisular del plasminógeno, un agente apoptótico, un agente antiangiogénico; o un modificador de la respuesta biológica como, por ejemplo, una linfocina.

[0438] Además, un anticuerpo puede conjugarse con fracciones terapéuticas como un ion metálico radiactivo, como emisores alfa como 213Bi o quelantes macrocíclicos útiles para conjugar iones radiometálicos, incluidos, entre otros, 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm, a polipéptidos. En ciertas realizaciones, el quelante macrocíclico es el ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N‴-tetraacético (DOTA), que puede unirse al anticuerpo mediante una molécula enlazadora. Dichas moléculas enlazadoras son comúnmente conocidas en la técnica y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; y Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol.26(8):943-50.

[0439] Las técnicas para conjugar fragmentos terapéuticos a anticuerpos son bien conocidas, véase, por ejemplo,Arnon et al., "Anticuerpos monoclonales para la inmunodireccionalización de fármacos en la terapia del cáncer", en Anticuerpos monoclonales y terapia del cáncer, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc.

[0440] 1985); Hellstrom et al., "Anticuerpos para la administración de fármacos", en Administración controlada de fármacos (2.ª ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Portadores de anticuerpos de agentes citotóxicos en la terapia del cáncer: una revisión", en Anticuerpos monoclonales 84: Aplicaciones biológicas y clínicas, Pinchera et al. (eds.), págs.475-506 (1985); "Análisis, resultados y perspectivas futuras del uso terapéutico de anticuerpos radiomarcados en la terapia del cáncer", en Anticuerpos monoclonales para la detección y terapia del cáncer, Baldwin et al. (eds.), págs.303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev.62:119-58.

[0441] Los anticuerpos también pueden unirse a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos o purificación del antígeno diana. Dichos soportes sólidos incluyen, entre otros, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno.

[0442] Procedimientos de producción de anticuerpos

[0443] Ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos

[0444] La presente divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico sustancialmente purificadas que codifican polipéptidos que comprenden segmentos o dominios de las cadenas de anticuerpos de unión a FXla descritas anteriormente. Algunos de los ácidos nucleicos de la invención comprenden la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 10 o 30, y/o la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 20 o 40. En un caso específico, las moléculas de ácido nucleico son las identificadas en la Tabla 1. Algunas otras moléculas de ácido nucleico pueden comprender secuencias de nucleótidos que son sustancialmente idénticas (por ejemplo, al menos 65, 80%, 95% o 99%) a las secuencias de nucleótidos identificadas en la Tabla 1. Cuando se expresan a partir de vectores de expresión apropiados, los polipéptidos codificados por estos polinucleótidos son capaces de exhibir capacidad de unión a antígeno FXI y/o FXla.

[0445] En la divulgación también se proporcionan polinucleótidos que codifican al menos una región CDR y, por lo general, las tres regiones CDR de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de unión a FXla descrito anteriormente. Algunos otros polinucleótidos codifican la totalidad o prácticamente la totalidad de la secuencia de la región variable de la cadena pesada y/o la cadena ligera del anticuerpo de unión a FXla descrito anteriormente. Debido a la degeneración del código, diversas secuencias de ácidos nucleicos codificarán cada una de las secuencias de aminoácidos de la inmunoglobulina.

[0446] Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden codificar tanto una región variable como una región constante del anticuerpo. Algunas de las secuencias de ácido nucleico de la invención comprenden nucleótidos que codifican una secuencia de cadena pesada que es sustancialmente idéntica (por ejemplo, al menos 80%, 90% o 99%) a la secuencia de cadena pesada establecida en SEQ ID NO: 11 o 31. Otras secuencias de ácido nucleico comprenden nucleótidos que codifican una secuencia de cadena ligera que es sustancialmente idéntica (por ejemplo, al menos 80%, 90% o 99%) a la secuencia de cadena ligera establecida en SEQ ID NO: 21 o 41.

[0447] Las secuencias de polinucleótidos pueden producirse mediante síntesis de ADN en fase sólida de novo o mediante mutagénesis por PCR de una secuencia existente (por ejemplo, secuencias como las descritas en los Ejemplos a continuación) que codifica un anticuerpo de unión a FXla o su fragmento de unión. La síntesis química directa de ácidos nucleicos puede lograrse mediante procedimientos conocidos en la técnica, como el procedimiento del fosfotriéster de Narang et al., 1979, Meth. Enzymol.68:90; el procedimiento del fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol.68:109, 1979; el procedimiento de la dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981; y el procedimiento de soporte sólido de la patente estadounidense n.° 4,458,066. La introducción de mutaciones en una secuencia de polinucleótidos mediante PCR se puede realizar como se describe en, por ejemplo, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, HA Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res.19:967, 1991; y Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991.

[0448] En la presente divulgación también se proporcionan vectores de expresión y células huésped para la producción de los anticuerpos que se unen a FXI y/o FXla descritos anteriormente. Se pueden emplear diversos vectores de expresión para expresar los polinucleótidos que codifican las cadenas de anticuerpos que se unen a FXla o los fragmentos de unión. Se pueden utilizar vectores de expresión tanto virales como no virales para producir los anticuerpos en una célula huésped de mamífero. Los vectores y sistemas no virales incluyen plásmidos, vectores episomales, generalmente con un casete de expresión para expresar una proteína o ARN, y cromosomas artificiales humanos (véase, por ejemplo,Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997). Por ejemplo, los vectores no virales útiles para la expresión de los polinucleótidos y polipéptidos que se unen a FXla en células de mamíferos (por ejemplo, humanas) incluyen pThioHis A, B y C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B y C (Invitrogen, San Diego, CA), vectores MPSV y muchos otros vectores conocidos en la técnica para la expresión de otras proteínas. Los vectores virales útiles incluyen vectores basados en retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, vectores basados en SV40, virus del papiloma, virus de Epstein-Barr HBP, vectores del virus vaccinia y virus del bosque de Semliki (SFV). Véase Brentet al.,supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol.49:807, 1995; y Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992.

[0449] [0276] La elección del vector de expresión depende de las células huésped previstas en las que se expresará el vector. Normalmente, los vectores de expresión contienen un promotor y otras secuencias reguladoras (por ejemplo, potenciadores) que están unidas funcionalmente a los polinucleótidos que codifican una cadena o fragmento de anticuerpo que se une a FX1a. En algunas realizaciones, se emplea un promotor inducible para evitar la expresión de las secuencias insertadas, excepto en condiciones de inducción. Los promotores inducibles incluyen, por ejemplo, arabinosa, lacZ, promotor de metalotioneína o un promotor de choque térmico. Los cultivos de organismos transformados pueden expandirse en condiciones no inductoras sin sesgar la población hacia secuencias codificantes cuyos productos de expresión son mejor tolerados por las células huésped. Además de los promotores, también pueden ser necesarios o deseables otros elementos reguladores para la expresión eficiente de una cadena o fragmento de anticuerpo que se une a FX1a. Estos elementos suelen incluir un codón de iniciación ATG y un sitio de unión al ribosoma adyacente u otras secuencias. Además, la eficiencia de la expresión puede mejorarse mediante la inclusión de potenciadores adecuados para el sistema celular en uso (véase, por ejemplo,Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; y Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987). Por ejemplo, el potenciador SV40 o el potenciador CMV pueden utilizarse para aumentar la expresión en células huésped de mamíferos.

[0451] Los vectores de expresión también pueden proporcionar una posición de secuencia señal de secreción para formar una proteína de fusión con polipéptidos codificados por secuencias de anticuerpos insertados que se unen a FXla. Con mayor frecuencia, las secuencias insertadas de anticuerpos que se unen a FXI y/o FXla se unen a una secuencia señal antes de su inclusión en el vector. Los vectores que se utilizan para recibir secuencias que codifican dominios variables de cadena ligera y pesada de anticuerpos que se unen a FXI y/o FXla a veces también codifican regiones constantes o partes de ellas. Dichos vectores permiten la expresión de las regiones variables como proteínas de fusión con las regiones constantes, lo que lleva a la producción de anticuerpos intactos o fragmentos de los mismos. Típicamente, dichas regiones constantes son humanas.

[0453] Las células huésped para albergar y expresar las cadenas de anticuerpos que se unen a FXI y/o FXla pueden ser procariotas o eucariotas. E. coli es un huésped procariota útil para clonar y expresar los polinucleótidos de la presente invención. Otros huéspedes microbianos adecuados para su uso incluyen bacilos, como Bacillus subtilis, y otras enterobacterias, como Salmonella, Serratia y varias especies de Pseudomonas. En estos huéspedes procariotas, también se pueden crear vectores de expresión, que normalmente contienen secuencias de control de expresión compatibles con la célula huésped (por ejemplo, un origen de replicación). Además, estarán presentes diversos promotores bien conocidos, como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp), un sistema promotor de betalactamasa o un sistema promotor del fago lambda. Los promotores suelen controlar la expresión, opcionalmente con una secuencia operadora, y poseen secuencias de unión al ribosoma y similares, para iniciar y completar la transcripción y la traducción. También se pueden emplear otros microorganismos, como la levadura, para expresar los polipéptidos de la invención que se unen a FXla. Asimismo, se pueden utilizar células de insectos en combinación con vectores de baculovirus.

[0455] En algunos casos preferidos, se utilizan células huésped de mamíferos para expresar y producir los polipéptidos que se unen a FXI y/o FXla descritos en la presente invención. Estas incluyen cualquier célula animal o humana, ya sea mortal, normal o anormal, inmortal. Por ejemplo, se han desarrollado varias líneas celulares huésped adecuadas capaces de secretar inmunoglobulinas intactas, incluidas las líneas celulares CHO, diversas líneas celulares Cos, células HeLa, líneas celulares de mieloma y células B transformadas. El uso de cultivos de células de tejido de mamíferos para expresar polipéptidos se analiza generalmente en, por ejemplo, Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, NY, NY, 1987. Los vectores de expresión para células huésped de mamíferos pueden incluir secuencias de control de la expresión, como un origen de replicación, un promotor y un potenciador (véase, por ejemplo,Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986), y sitios de información de procesamiento necesarios, como sitios de unión de ribosomas, sitios de empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias de terminación transcripcional.

[0457] Estos vectores de expresión suelen contener promotores derivados de genes de mamíferos o de virus de mamíferos. Los promotores adecuados pueden ser constitutivos, específicos de tipo celular, específicos de etapa y/o modulables o regulables. Los promotores útiles incluyen, pero no se limitan a, el promotor de metalotioneína, el promotor tardío principal constitutivo del adenovirus, el promotor MMTV inducible por dexametasona, el promotor SV40, el promotor MRP polll, el promotor MPSV constitutivo, el promotor CMV inducible por tetraciclina (como el promotor CMV inmediato temprano humano), el promotor CMV constitutivo y combinaciones promotor-potenciador conocidas en el arte.

[0459] [0281] Los procedimientos para introducir vectores de expresión que contienen las secuencias de polinucleótidos de interés varían según el tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio se utiliza comúnmente para células procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio o la electroporación pueden utilizarse para otros huéspedes celulares. (Véase en general Sambrook,et al.,supra). Otros procedimientos incluyen, por ejemplo,electroporación, tratamiento con fosfato de calcio, transformación mediada por liposomas, inyección y microinyección, procedimientos balísticos, virosomas, inmunoliposomas, conjugados de policatión:ácido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales, fusión a la proteína estructural VP22 del virus del herpes (Elliot y O'Hare, Cell 88:223, 1997), captación de ADN mejorada por agentes y transducción ex vivo. Para la producción a largo plazo y de alto rendimiento de proteínas recombinantes, a menudo se deseará una expresión estable. Por ejemplo, se pueden preparar líneas celulares que expresen de forma estable cadenas de anticuerpos o fragmentos de unión a FX1a utilizando vectores de expresión de la invención que contienen orígenes de replicación virales o elementos de expresión endógena y un gen marcador seleccionable. Tras la introducción del vector, las células pueden cultivarse durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de transferirlas a un medio selectivo. El objetivo del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento de células que expresan con éxito las secuencias introducidas en el medio selectivo. Las células resistentes y transfectadas de forma estable pueden proliferarse utilizando técnicas de cultivo celular adecuadas para el tipo celular.

[0460] Ingeniería de marcos (“framework”) o Fc

[0461] Los anticuerpos modificados de la invención incluyen aquellos en los que se han realizado modificaciones en los residuos de la estructura dentro de VH y/o VL, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Normalmente, dichas modificaciones de la estructura se realizan para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque consiste en "revertir la mutación" de uno o más residuos de la estructura a la secuencia de la línea germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que ha sufrido una mutación somática puede contener residuos de la estructura que difieren de la secuencia de la línea germinal de la que se deriva el anticuerpo. Dichos residuos pueden identificarse comparando las secuencias de la estructura del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal de la que se deriva el anticuerpo. Para devolver las secuencias de la región de la estructura a su configuración de línea germinal, las mutaciones somáticas pueden "revertirse la mutación" a la secuencia de la línea germinal mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida. Dichos anticuerpos "revertirse la mutación" también están incluidos en la invención.

[0462] Otro tipo de modificación del armazón implica la mutación de uno o más residuos dentro de la región del marco, o incluso dentro de una o más regiones CDR, para eliminar epítopos de células T y así reducir la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este enfoque también se conoce como "desinmunización" y se describe con mayor detalle en la publicación de patente estadounidense n.° 20030153043 de Carr et al.

[0463] Además o como alternativa a las modificaciones realizadas dentro de las regiones de armazón o CDR, los anticuerpos de la invención pueden diseñarse para incluir modificaciones dentro de la región Fc, generalmente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, como la semivida sérica, la fijación del complemento, la unión al receptor Fc y/o la citotoxicidad celular dependiente del antígeno. Además, un anticuerpo de la invención puede modificarse químicamente (por ejemplo, se pueden unir uno o más grupos químicos al anticuerpo) o modificarse para alterar su glicosilación, también para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe con más detalle a continuación. La numeración de los residuos en la región Fc es la del índice de Kabat de la UE.

[0464] En una realización, la región de bisagra de CH1 se modifica de tal manera que se altera el número de residuos de cisteína en dicha región, por ejemplo, aumentando o disminuyendo. Este enfoque se describe con más detalle en la patente estadounidense n.° 5,677,425 de Bodmer et al.El número de residuos de cisteína en la región de bisagra de CH1 se altera, por ejemplo, para facilitar el ensamblaje de las cadenas ligeras y pesadas o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.

[0465] En otra realización, la región bisagra Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la semivida biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento bisagra Fc, de manera que el anticuerpo presenta una unión reducida a la proteína A de Staphylococcus (SpA) en comparación con la unión a SpA del dominio bisagra Fc nativo. Este enfoque se describe con mayor detalle en la patente estadounidense n.° 6,165,745 de Ward et al.

[0466] En otra realización, el anticuerpo se modifica para aumentar su semivida biológica. Son posibles varios enfoques. Por ejemplo, se puede utilizar una o más de las mutaciones descritas en la patente estadounidense n.° 6,277,375 de Ward. Alternativamente, para aumentar la semivida biológica, el anticuerpo puede alterarse dentro de la región CH1 o CL para contener un epítopo de unión al receptor de rescate tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las patentes estadounidenses n.° 5,869,046 y 6,121,022 de Presta et al.

[0467] En otras realizaciones, la región Fc se altera reemplazando al menos un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos pueden ser reemplazados con un residuo de aminoácido diferente de manera que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector pero conserve la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo original. El ligando efector al que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor Fc o el componente C1 del complemento. Este enfoque se describe con más detalle en las patentes estadounidenses n.° 5,624,821 y 5,648,260, ambas de Winter et al.

[0468] En otra realización, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácidos pueden ser reemplazados por un residuo de aminoácido diferente, de manera que el anticuerpo tenga una unión a C1q alterada y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida o eliminada. Este enfoque se describe con mayor detalle en la patente estadounidense n.° 6,194,551 de Idusogie et al.

[0469] En otra realización, se modifican uno o más residuos de aminoácidos para alterar la capacidad del anticuerpo de fijar el complemento. Este enfoque se describe con más detalle en la publicación PCT WO 94/29351 de Bodmer et al.

[0470] En una realización específica, un anticuerpo anti-FXI/FX1a de la invención (un anticuerpo que comprende CDR VL y CDR VH de NOV1401) comprende una región Fc de IgG humana (por ejemplo,IgG1) que comprende dos sustituciones de aminoácidos, D265A y P329A, para reducir la probabilidad de ADCC o CDC causada por cualquier FXI asociado a la superficie. Se ha demostrado que estas sustituciones de alanina reducen la ADCC y la CDC (véase, por ejemplo,Idosugie et al., J. Immunol. 164:4178-4184, 2000; Shields et al., J. Biol. Chem.276:6591-6604, 2001).

[0471] En otra realización, la región Fc se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcy mediante la modificación de uno o más aminoácidos. Este enfoque se describe con más detalle en la publicación PCT WO 00/42072 de Presta. Además, se han mapeado los sitios de unión en la IgG1 humana para FcγRI, FcγRII, FcyRIll y FcRn y se han descrito variantes con unión mejorada (véase Shields, RL et al., 2001 J. Biol. Chen.276:6591-6604).

[0472] En otra realización, se modifica la glicosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede crear un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación se puede alterar para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el "antígeno". Estas modificaciones de carbohidratos se pueden lograr, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos que resulten en la eliminación de uno o más sitios de glicosilación del armazón de la región variable para eliminar así la glicosilación en ese sitio. Dicha aglicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Este enfoque se describe con más detalle en las patentes estadounidenses n.° 5,714,350 y 6,350,861 de Co et al.

[0473] Adicional o alternativamente, se puede producir un anticuerpo con un tipo de glicosilación alterada, como un anticuerpo hipofucosilado con cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo con estructuras GlcNAc bisecantes aumentadas. Se ha demostrado que estos patrones de glicosilación alterados aumentan la capacidad ADCC de los anticuerpos. Estas modificaciones de carbohidratos se pueden lograr, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula huésped con maquinaria de glicosilación alterada. En la técnica se han descrito células con maquinaria de glicosilación alterada, las cuales pueden utilizarse como células huésped para expresar anticuerpos recombinantes de la invención y, de este modo, producir un anticuerpo con glicosilación alterada. Por ejemplo, la patente EP 1,176,195 de Hang et al. describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosil transferasa, de modo que los anticuerpos expresados en dicha línea celular presentan hipofucosilación. La publicación PCT WO 03/035835 de Presta describe una variante de la línea celular CHO, células Lecl3, con capacidad reducida para unir fucosa a carbohidratos unidos a Asn(297), lo que también resulta en hipofucosilación de los anticuerpos expresados en esa célula huésped (véase también Shields, RL et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). La publicación PCT WO 99/54342 de Umana et al. describe líneas celulares modificadas para expresar glicosiltransferasas modificadoras de glicoproteínas (por ejemplo, beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares modificadas exhiben estructuras GlcNAc bisecantes aumentadas, lo que resulta en una mayor actividad ADCC de los anticuerpos (véase también Umana et al., 1999 Nat. Biotech.17:176-180).

[0474] Procedimientos de diseño de anticuerpos alterados

[0475] Como se mencionó anteriormente, los anticuerpos que se unen a FXla que tienen secuencias VH y VL o secuencias de cadena pesada y ligera de longitud completa que se muestran en el presente documento pueden usarse para crear nuevos anticuerpos que se unen a FXla modificando secuencias de cadena pesada y/o ligera de longitud completa, secuencias VH y/o VL, o la(s) región(es) constante(s) unida(s) a ellas. Por lo tanto, en otro aspecto de la divulgación, las características estructurales de un anticuerpo que se une a FXla de la invención se usan para crear anticuerpos que se unen a FXla estructuralmente relacionados que conservan al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, como la unión a FXla humana y también la inhibición de una o más propiedades funcionales de FXla (por ejemplo, inhibir la unión de FXla al receptor FXIa, inhibir la proliferación celular dependiente de FXla).

[0476] Por ejemplo, una o más regiones CDR de los anticuerpos de la presente invención, o mutaciones de las mismas, pueden combinarse recombinantemente con regiones armazón conocidas y/u otras CDR para crear anticuerpos adicionales, diseñados recombinantemente, que se unan a FXla, como se ha descrito anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen las descritas en la sección anterior. El material de partida para el procedimiento de ingeniería es una o más de las secuencias VH y/o VL proporcionadas en el presente documento, o una o más regiones CDR de las mismas. Para crear el anticuerpo diseñado, no es necesario preparar (es decir, expresar como proteína) un anticuerpo que contenga una o más de las secuencias VH y/o VL proporcionadas en el presente documento, o una o más regiones CDR de las mismas. En cambio, la información contenida en la(s) secuencia(s) se utiliza como material de partida para crear una o más secuencias de "segunda generación" derivadas de la(s) secuencia(s) original(es), y luego la(s) secuencia(s) de "segunda generación" se prepara(n) y se expresa(n) como proteína.

[0477] [0297] En consecuencia, la divulgación proporciona un procedimiento para preparar un anticuerpo de unión a FXla que consiste en una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada que tiene una secuencia CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3 y 23, una secuencia CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 y 24, y/o una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 y 25; y una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera que tiene una secuencia CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 13 y 33, una secuencia CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14 y 34, y/o una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15 y 35; alterando al menos un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada y/o la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y expresando la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína.

[0478] La divulgación también proporciona un procedimiento para preparar un anticuerpo de unión a FXla que consiste en una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada que tiene una secuencia CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6 y 26, una secuencia CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 y 27, y/o una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8 y 28; y una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera que tiene una secuencia CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16 y 36, una secuencia CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17 y 37, y/o una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18 y 38; alterando al menos un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada y/o la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y expresando la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína.

[0479] La divulgación proporciona además un procedimiento para preparar un anticuerpo de unión a FXla optimizado para su expresión en una célula de mamífero que consiste en: una secuencia de anticuerpo de cadena pesada de longitud completa con una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 11 o 31; y una secuencia de anticuerpo de cadena ligera de longitud completa con una secuencia seleccionada del grupo de 21 o 41; alterar al menos un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de cadena pesada de longitud completa y/o la secuencia de anticuerpo de cadena ligera de longitud completa para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína. En un caso, la alteración de la cadena pesada o ligera se encuentra en la región del armazón de la cadena pesada o ligera.

[0480] La secuencia de anticuerpos modificada también puede prepararse mediante el cribado de bibliotecas de anticuerpos con secuencias CDR3 fijas o determinantes de unión esenciales mínimos, como se describe en US2005/0255552, y con diversidad en las secuencias CDR1 y CDR2. El cribado puede realizarse según cualquier tecnología de cribado adecuada para el cribado de anticuerpos a partir de bibliotecas de anticuerpos, como la tecnología de visualización de fagos.

[0481] Se pueden utilizar técnicas estándar de biología molecular para preparar y expresar la secuencia de anticuerpo alterada. El anticuerpo codificado por la(s) secuencia(s) de anticuerpo alterada(s) es uno que conserva una, algunas o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos que se unen a FXla descritos en el presente documento, las cuales incluyen, pero no se limitan a, la unión específica a FXla humano, de mono cynomolgus, de rata y/o de ratón; y el anticuerpo inhibe la proliferación celular dependiente de FXla en un ensayo de proliferación celular F36E y/o Ba/F3-FXIaR.

[0482] En ciertos casos de los procedimientos de ingeniería de anticuerpos, se pueden introducir mutaciones de forma aleatoria o selectiva a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante de un anticuerpo que se une a FXla, y los anticuerpos modificados resultantes que se unen a FXla pueden ser examinados para determinar su actividad de unión y/u otras propiedades funcionales como se describe en el presente documento. Se han descrito procedimientos mutacionales en la técnica. Por ejemplo, la publicación PCT WO 02/092780 de Short describe procedimientos para crear y examinar mutaciones de anticuerpos utilizando mutagénesis de saturación, ensamblaje de ligación sintética o una combinación de ambos. Alternativamente, la publicación PCT WO 03/074679 de Lazar et al. describe procedimientos para utilizar procedimientos de cribado computacional para optimizar las propiedades fisicoquímicas de los anticuerpos.

[0483] En ciertas realizaciones de la invención, se han diseñado anticuerpos para eliminar los sitios de desamidación. Se sabe que la desamidación provoca cambios estructurales y funcionales en un péptido o proteína. La desamidación puede resultar en una disminución de la bioactividad, así como en alteraciones de la farmacocinética y la antigenicidad del fármaco proteico.(Anal Chem.1 de marzo de 2005;77(5):1432-9).

[0484] [0304] En ciertas realizaciones de la invención, los anticuerpos se han diseñado para aumentar el pl y mejorar sus propiedades farmacológicas. El pl de una proteína es un determinante clave de las propiedades biofísicas generales de una molécula. Se sabe que los anticuerpos con pl bajos son menos solubles, menos estables y propensos a la agregación. Además, la purificación de anticuerpos con pl bajos es compleja y puede resultar problemática, especialmente durante la ampliación de la producción para uso clínico. El aumento del pl de los anticuerpos anti-FXI/FX1a, o Fabs, de la invención mejoró su solubilidad, lo que permitió formular los anticuerpos a concentraciones más altas (>100 mg/ml). La formulación de los anticuerpos a altas concentraciones (por ejemplo, >100 mg/ml) ofrece la ventaja de poder administrar dosis más altas de los anticuerpos, lo que a su vez puede permitir una menor frecuencia de dosificación, una ventaja significativa para el tratamiento de enfermedades crónicas, incluidos los trastornos trombóticos y/o tromboembólicos. Un mayor pl también puede aumentar el reciclaje mediado por FcRn de la versión IgG del anticuerpo, lo que permite que el fármaco permanezca en el organismo durante más tiempo, requiriendo menos inyecciones. Finalmente, la estabilidad general de los anticuerpos mejora significativamente debido al mayor pl, lo que resulta en una mayor vida útil y bioactividadin vivo.Preferiblemente, el pl es mayor o igual a 8,2.

[0485] Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados pueden evaluarse utilizando ensayos estándar disponibles en la técnica y/o descritos en el presente documento, como los establecidos en los Ejemplos (por ejemplo, ELISA).

[0486] Usos profilácticos y terapéuticos

[0487] Los anticuerpos que se unen a FXI y/o FXla como se describe en el presente documento (por ejemplo, los anticuerpos descritos en la Tabla 1, como los anticuerpos anti-FXI/FXla que comprenden VL CDR y VHCDR de NOV1401), pueden utilizarse en una concentración terapéuticamente útil para el tratamiento de una enfermedad o trastorno tromboembólico (por ejemplo, accidente cerebrovascular trombótico, fibrilación auricular, prevención de accidentes cerebrovasculares en la fibrilación auricular (SPAF), trombosis venosa profunda, tromboembolismo venoso, embolia pulmonar, síndromes coronarios agudos (SCA), accidente cerebrovascular isquémico, isquemia aguda de las extremidades, hipertensión pulmonar tromboembólica crónica o embolia sistémica) mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la invención. La presente invención proporciona productos para su uso en el tratamiento de trastornos tromboembólicos (por ejemplo, trastornos trombóticos) mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de los anticuerpos de la invención. La presente invención proporciona productos para el tratamiento de trastornos tromboembólicos (por ejemplo, accidente cerebrovascular trombótico, fibrilación auricular, prevención de accidentes cerebrovasculares en la fibrilación auricular (SPAF), trombosis venosa profunda, tromboembolismo venoso, embolia pulmonar, síndromes coronarios agudos (SCA), accidente cerebrovascular isquémico, isquemia aguda de las extremidades, hipertensión pulmonar tromboembólica crónica o embolia sistémica) mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de los anticuerpos de la invención.

[0488] Los anticuerpos descritos en el presente documento (por ejemplo, los anticuerpos descritos en la Tabla 1, como NOV1401 o los anticuerpos anti-FXI/FX1a que comprenden VL CDR y VHCDR de NOV1401) pueden utilizarse, entre otras cosas,para prevenir, tratar, prevenir y mejorar afecciones o trastornos tromboembólicos, incluidos, pero no limitados a, los trastornos trombóticos, como se describe con mayor detalle en el presente documento.

[0489] Los anticuerpos en el presente documento descritos (por ejemplo, los descritos en la Tabla 1, como los anticuerpos anti-FXI/FX1a que comprenden VL CDR y VHCDR de NOV1401) también pueden utilizarse en combinación con otros agentes para la prevención, el tratamiento o la mejora de los trastornos tromboembólicos. Por ejemplo, las terapias con estatinas pueden utilizarse en combinación con los anticuerpos FXIa y los fragmentos de unión a antígeno de la invención para el tratamiento de pacientes con trastornos trombóticos y/o tromboembólicos.

[0490] En un caso específico, se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar o prevenir un accidente cerebrovascular en un paciente con fibrilación auricular, que comprende administrar al paciente que lo necesita una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o anticuerpos anti-FXI/FXla que comprenden VL CDR y VHCDR de NOV1401.

[0491] En un caso específico, se divulga en el presente documento un procedimiento para gestionar o prevenir riesgos o afecciones asociadas con la fibrilación auricular (FA), como el accidente cerebrovascular embólico y la embolia sistémica, en un paciente con fibrilación auricular, que comprende administrar al paciente que lo necesita una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o anticuerpos anti-FXI/FXla que comprenden VL CDR y VHCDR de NOV1401.

[0492] En un caso específico, se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar, controlar o prevenir afecciones asociadas con la fibrilación auricular (FA), como el accidente cerebrovascular embólico y la embolia sistémica, en un paciente con fibrilación auricular, que comprende administrar al paciente que lo necesita una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o anticuerpos anti-FXI/FXla que comprenden VL CDR y VHCDR de NOV1401. En casos particulares, un paciente con FA tiene un alto riesgo de hemorragia.

[0493] En un caso específico, se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar, controlar o prevenir la trombosis venosa profunda o afecciones asociadas con ella, en un sujeto (por ejemplo, un sujeto con, o en riesgo de desarrollar, trombosis venosa profunda), que comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o anticuerpos anti-FXI/FXla que comprenden VL CDR y VHCDR de NOV1401.

[0494] [0313] En un caso específico, se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar, controlar o prevenir el tromboembolismo venoso (TEV) o afecciones asociadas con él, en un sujeto(por ejemplo,un sujeto con, o en riesgo de desarrollar, tromboembolismo venoso), que comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o anticuerpos anti-FXI/FXla que comprenden VL CDR y VHCDR de NOV1401. En casos particulares, los sujetos que están siendo tratados con un anticuerpo anti-FXI/FXla proporcionado en el presente documento han experimentado 1) un primer TEV no provocado con bajo riesgo de sangrado, 2) recurrencia de TEV no provocado, o 3) TEV asociado con trombofilia, incluidos pacientes con cáncer.

[0495] En un caso específico, se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar, controlar o prevenir la embolia pulmonar o afecciones asociadas con ella, en un sujeto (por ejemplo, un sujeto con, o en riesgo de desarrollar, embolia pulmonar), que comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o anticuerpos anti-FXI/FXla que comprenden VL CDR y VHCDR de NOV1401.

[0496] En un caso específico, se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar, controlar o prevenir síndromes coronarios agudos (SCA) o afecciones asociadas con ellos, en un sujeto, que comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o anticuerpos anti-FXI/FXla que comprenden VL CDR y VHCDR de NOV1401.

[0497] En un caso específico, se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar, controlar o prevenir el accidente cerebrovascular isquémico en un sujeto (por ejemplo, un sujeto con, o en riesgo de desarrollar, un accidente cerebrovascular isquémico), que comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o anticuerpos anti-FXI/FXla que comprenden VL CDR y VHCDR de NOV1401.

[0498] En un caso específico, se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar, controlar o prevenir la isquemia aguda de las extremidades en un sujeto, que comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o anticuerpos anti-FXI/FXla que comprenden VL CDR y VHCDR de NOV1401.

[0499] En un caso específico, se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar, controlar o prevenir la hipertensión pulmonar tromboembólica crónica en un sujeto, que comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o anticuerpos anti-FXI/FXla que comprenden VL CDR y VHCDR de NOV1401.

[0500] En un caso específico, se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar, controlar o prevenir la embolia sistémica en un sujeto (por ejemplo, un sujeto con embolia sistémica o en riesgo de desarrollarla), que comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o anticuerpos anti-FXI/FXla que comprenden VL CDR y VHCDR de NOV1401.

[0501] En un caso determinado, se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar, controlar o prevenir afecciones tromboembólicas que son afecciones relacionadas con catéteres (por ejemplo, catéter de Hickman en pacientes con cáncer) en las que los catéteres se trombosan, u oxigenación por membrana extracorpórea (ECMO), en la que los tubos desarrollan coágulos, que comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o anticuerpos anti-FXI/FXla que comprenden VL CDR y VHCDR de NOV1401.

[0502] En casos particulares, los sujetos que necesitan tratamiento con un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o anticuerpos anti-FXI/FXla que comprenden VL CDR y VHCDR de NOV1401, pueden incluir:

[0503] - sujetos con indicaciones para terapia anticoagulante crónica (por ejemplo, fibrilación auricular, trombo ventricular izquierdo, accidente cerebrovascular cardioembólico previo).

[0504] - sujetos con riesgo intermedio a alto de hemorragia grave;

[0505] - sujetos sometidos a intervención coronaria percutánea (ICP) electiva o primaria con colocación de stent que pueden requerir terapia antiplaquetaria dual (aspirina y antagonistas del receptor P2Y12) para prevenir la trombosis del stent.

[0506] En casos particulares, una de las siguientes afecciones puede ser tratada o controlada con un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o anticuerpos anti-FXI/FXla que comprenden VL CDR y VHCDR de NOV1401:

[0507] - tromboembolismo en sujetos con sospecha o confirmación de arritmia cardíaca, como fibrilación auricular paroxística, persistente o permanente o aleteo auricular;

[0508] - prevención de accidentes cerebrovasculares en la fibrilación auricular (SPAF), una subpoblación de la cual son los pacientes con FA sometidos a intervenciones coronarias percutáneas (ICP);

[0509] - tratamiento de eventos tromboembólicos venosos agudos (ETV) y prevención secundaria extendida de ETV en pacientes con alto riesgo de hemorragia;

[0510] - eventos cerebrales y cardiovasculares en la prevención secundaria después de un ataque isquémico transitorio (AIT) o un accidente cerebrovascular no incapacitante y prevención de eventos tromboembólicos en la insuficiencia cardíaca con ritmo sinusal;

[0511] - formación de coágulos en la aurícula izquierda y tromboembolismo en pacientes sometidos a cardioversión por arritmia cardíaca;

[0512] - trombosis antes, durante y después del procedimiento de ablación para la arritmia cardíaca;

[0513] - trombosis venosa, que incluye, pero no exclusivamente, el tratamiento y la prevención secundaria de la trombosis venosa profunda o superficial en las extremidades inferiores o superiores, la trombosis en las venas abdominales y torácicas, la trombosis del seno venoso y la trombosis de las venas yugulares;

[0514] - trombosis en cualquier superficie artificial de las venas, como los cables de catéteres o marcapasos;

[0515] - embolia pulmonar en pacientes con o sin trombosis venosa;

[0516] - hipertensión pulmonar tromboembólica crónica (HPTEC);

[0517] - trombosis arterial en placa aterosclerótica rota, trombosis en prótesis o catéter intraarterial y trombosis en arterias aparentemente normales, esto incluye, pero no exclusivamente, síndromes coronarios agudos, infarto de miocardio con elevación del segmento ST, infarto de miocardio sin elevación del segmento ST, angina inestable, trombosis de stent, trombosis de cualquier superficie artificial en el sistema arterial y trombosis de arterias pulmonares en sujetos con o sin hipertensión pulmonar;

[0518] - trombosis y tromboembolismo en pacientes sometidos a intervenciones coronarias percutáneas (ICP);

[0519] - accidentes cerebrovasculares cardioembólicos y criptogénicos;

[0520] - trombosis en pacientes con neoplasias malignas cancerosas invasivas y no invasivas;

[0521] - trombosis sobre un catéter permanente;

[0522] - trombosis y tromboembolismo en pacientes gravemente enfermos;

[0523] - trombosis cardíaca y tromboembolismo, que incluye, pero no exclusivamente, la trombosis cardíaca después de un infarto de miocardio, la trombosis cardíaca relacionada con afecciones como aneurisma cardíaco, fibrosis miocárdica, agrandamiento e insuficiencia cardíaca, miocarditis y superficie artificial en el corazón;

[0524] - tromboembolismo en pacientes con valvulopatía cardíaca con o sin fibrilación auricular;

[0525] - tromboembolismo sobre prótesis mecánicas o biológicas valvulares;

[0526] - lesiones o traumatismos en pacientes que tenían parches cardíacos nativos o artificiales, tubos de conducción arterial o venosa después de la reparación cardíaca de malformaciones cardíacas simples o complejas;

[0527] - trombosis venosa y tromboembolismo después de cirugía de reemplazo de rodilla, cirugía de reemplazo de cadera y cirugía ortopédica, cirugía torácica o abdominal;

[0528] - trombosis arterial o venosa después de neurocirugía, incluidas las intervenciones intracraneales y de la médula espinal;

[0529] - trombofilia congénita o adquirida, incluyendo, pero no exclusivamente, factor V Leiden, mutación de protrombina, antitrombina III, deficiencias de proteína C y proteína S, mutación del factor XIII, disfibrinogenemia familiar, deficiencia congénita de plasminógeno, niveles elevados del factor XI, enfermedad de células falciformes, síndrome antifosfolípido, enfermedad autoinmune, enfermedad intestinal crónica, síndrome nefrótico, uremia hemolítica, enfermedad mieloproliferativa, coagulación intravascular diseminada, hemoglobinuria paroxística nocturna y trombocitopenia inducida por heparina;

[0530] - trombosis y tromboembolismo en la enfermedad renal crónica; y

[0531] - trombosis y tromboembolia en pacientes sometidos a hemodiálisis y oxigenación por membrana extracorpórea.

[0533] En un caso específico, se describen en el presente documento procedimientos para controlar el sangrado en un paciente que está siendo tratado o al que se le administra un anticuerpo anti-FXI/FXla proporcionado en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo descrito en la Tabla 1, como un anticuerpo anti-FXI/FXla que comprende VL CDRs y VHCDRs de NOV1401), por ejemplo, sangrado asociado con traumatismos, cirugía, menstruación o posparto, dicho procedimiento comprende la reversión del efecto anticoagulante. La deficiencia de FXI rara vez se asocia con manifestaciones de sangrado espontáneo; en aspectos específicos, el sangrado se asocia más típicamente con traumatismos, cirugía, menstruación o posparto. El sangrado prolongado puede ocurrir después de un traumatismo mayor o después de una cirugía que involucre órganos con un área fibrinolítica alta como la mucosa bucal, nasal, genital o urinaria. La extracción dental, la amigdalectomía y la ablación del útero o la próstata son ejemplos de cirugías que conllevan un alto riesgo de sangrado. Las personas con este trastorno también tienen una marcada tendencia a desarrollar epistaxis y equimosis, y, más raramente, sangrado en la orina o los intestinos. La frecuencia de hemorragias musculares o articulares espontáneas e intracraneales no aumenta en pacientes con deficiencia de FXI. La punción venosa no suele asociarse con una hemorragia prolongada. Otras mutaciones genéticas asociadas con la deficiencia de FXI pueden contribuir a la tendencia hemorrágica heterogénea e impredecible en pacientes con deficiencia grave de FXI. El uso concomitante de antiagregantes plaquetarios, otros anticoagulantes y agentes fibrinolíticos puede aumentar el riesgo de hemorragia.

[0535] [0324] En casos particulares, se divulga en el presente documento un procedimiento para controlar el sangrado en un paciente que está siendo tratado con un anticuerpo anti-FXI/FXla proporcionado en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo descrito en la Tabla 1, como un anticuerpo anti-FXI/FXla que comprende VL CDRs y VHCDRs de NOV1401), dicho procedimiento comprende la reversión temporal del efecto anticoagulante durante un tiempo suficiente para controlar el sangrado. En casos específicos, el paso de reversión del efecto anticoagulante comprende (i) reemplazo de líquidos usando coloides, cristaloides, plasma humano o proteínas plasmáticas como albúmina; o (ii) transfusión con sangre roja concentrada o sangre entera. En un caso particular, los agentes terapéuticos para revertir el efecto de los anticoagulantes, por ejemplo, en casos de emergencia grave, incluyen, pero no se limitan a, componentes sanguíneos prohemostáticos como plasma fresco congelado (PFC), concentrados de complejo de protrombina (CCP) y CCP activado [(CPAP); por ejemplo, actividad de derivación del inhibidor del factor VIII (FEIBA)] y factor VII activado recombinante (rFVlla). En un caso, un régimen que comprende la administración de rFVlla a una dosis de 30 µg/kg seguida de la administración de rFVlla a una dosis de 15-30 µg/kg cada 2-4 horas durante 24-48 horas además de ácido tranexámico 1 g cada 6 horas durante 5 a 7 días puede tener el potencial de recuperar la hemostasia y detener el sangrado en sujetos tratados con un anticuerpo anti-FXI/FXla proporcionado en el presente documento (por ejemplo, NOV1401 o un anticuerpo que comprende CDR VL y CDR VH de NOV1401) que se someten a cirugía mayor y en pacientes con un sitio de sangrado activo no accesible. Por ejemplo, Riddell et al. informaron experiencia en 4 pacientes con deficiencia grave de FXI sin inhibidor sometidos a cirugía (Riddell et al., 2011, Thromb. Haemost.; 106: 521-527); a los pacientes se les administró rFVlla 30 µg/kg y ácido tranexámico 1 g iv al inicio de la anestesia. Se administraron dosis subsiguientes en bolo de rFVlla 15-30 µg/kg a intervalos de 2 a 4 horas según los resultados de la tromboelastometría rotacional (ROTEM). Los pacientes fueron tratados con rFVlla en las dosis mencionadas anteriormente durante 24-48 horas. Se continuó con ácido tranexámico 1 g cada seis horas durante cinco días. En esta pequeña serie, el rFVlla en dosis tan bajas como 15-30 µg/kg en combinación con ácido tranexámico fue seguro y eficaz para corregir el defecto hemostático en la deficiencia grave de FXI en este estudio. En otro estudio que comprendió 4 pacientes con deficiencia grave de FXI con inhibidor (anticuerpos neutralizantes autólogos de FXI generalmente adquiridos después de una transfusión o administración de productos sanguíneos a pacientes con deficiencia grave de FXI) que se sometieron a 5 cirugías, los autores (Livnat et al., 2009, Thromb. Haemost.; 102: 487-492) aplicaron el siguiente protocolo: 1 g de ácido tranexámico por vía oral dos horas antes de la cirugía, luego los pacientes recibieron inmediatamente antes de las intervenciones otro 1 g de ácido tranexámico por vía intravenosa. Se infundió FV1a recombinante en dosis que oscilaban entre 15 y 30 µg/kg al finalizar la cirugía. Posteriormente,Se administró ácido tranexámico oral de 1 g cada 6 horas durante al menos 7 días. En un paciente, se aplicó pegamento de fibrina en el lecho de la vesícula biliar extirpada. Este protocolo garantizó una hemostasia normal en pacientes con deficiencia grave de FXI con inhibidor.

[0537] En un caso, el pegamento de fibrina puede usarse para restaurar la hemostasia local durante la cirugía dental en pacientes con deficiencia de FXI (Bolton-Maggs (2000) Haemophilia; 6 (S1):100-9). En un caso determinado, con respecto a los procedimientos para controlar el sangrado en pacientes que están siendo tratados con un anticuerpo anti-FXI/FXla proporcionado en el presente documento (por ejemplo, NOV1401), un régimen que consiste en ácido tranexámico 1 g cada 6 horas durante 5 a 7 días asociado con el uso de pegamento de fibrina podría usarse para establecer la hemostasia local en sujetos sometidos a cirugía menor y en sujetos con sitio de sangrado accesible, incluidos eventos de sangrado oral y nasal.

[0539] Composiciones farmacéuticas

[0541] La invención da a conocer composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos que se unen a FX1a (intactos o fragmentos de unión) formulados junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden contener además uno o más agentes terapéuticos adecuados para tratar o prevenir, por ejemplo, trastornos tromboembólicos (por ejemplo, trastornos trombóticos). Los excipientes farmacéuticamente aceptables mejoran o estabilizan la composición, o pueden utilizarse para facilitar su preparación. Entre los excipientes farmacéuticamente aceptables se incluyen disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles.

[0543] Una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica. La vía y/o el modo de administración varían según los resultados deseados. Se prefiere la administración intravenosa (iv), intramuscular (im), intraperitoneal (ip) o subcutánea (sc), o administrada proximalmente al sitio de acción. El vehículo farmacéuticamente aceptable debe ser adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, el anticuerpo, la molécula biespecífica y la multiespecífica, puede recubrirse con un material para protegerlo de la acción de los ácidos y otras condiciones naturales que podrían inactivarlo.

[0545] En aspectos particulares, los anticuerpos anti-FXI/FXla descritos en el presente documento (por ejemplo, los anticuerpos descritos en la Tabla 1, como NOV1401 o los anticuerpos que comprenden LCDR y HCDR de NOV1401) se formulan a una concentración aproximada de 75 mg/1 mL a aproximadamente 200 mg/1 mL, en viales líquidos para inyecciones subcutáneas. En realizaciones particulares, la composición farmacéutica comprende un vehículo farmacéutico o excipiente, por ejemplo, sacarosa y polisorbato 20. En realizaciones particulares, la composición farmacéutica comprende L-histidina y/o monohidrato de clorhidrato de histidina. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica tiene un pH aproximado de 4 a 7, o de 5 a 6.

[0547] [0329] En aspectos particulares, los anticuerpos anti-FXI/FXla descritos en el presente documento (por ejemplo, los anticuerpos descritos en la Tabla 1, como NOV1401 o anticuerpos que comprenden LCDR y HCDR de NOV1401) se formulan a una concentración de 150 mg/1 mL, en viales líquidos para inyecciones subcutáneas. En una realización, la formulación líquida de 150 mg/mL contiene 150 mg de anticuerpo anti-FXI/FXla, L-histidina, monohidrato de clorhidrato de histidina, sacarosa y polisorbato 20, con un pH = 5,5 ± 0,5. La composición debe ser estéril y fluida. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, como azúcares, polialcoholes como el manitol o el sorbitol, y cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, como el monoestearato de aluminio o la gelatina.

[0548] Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden prepararse de acuerdo con procedimientos bien conocidos y practicados habitualmente en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20.ª ed., 2000; y Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, JR Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978. Las composiciones farmacéuticas se fabrican preferiblemente bajo condiciones GMP. Normalmente, en las composiciones farmacéuticas de la invención se emplea una dosis terapéuticamente efectiva o una dosis eficaz del anticuerpo de unión a FXIa. Los anticuerpos de unión a FXIa se formulan en formas farmacéuticas aceptables mediante procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un bolo único, varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Resulta especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en unidades de dosificación para facilitar la administración y garantizar la uniformidad de la dosis. El término “unidad de dosificación”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a unidades físicas discretas adecuadas como dosis unitarias para los pacientes a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado en combinación con el excipiente farmacéutico necesario.

[0549] Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particulares, sin ser tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado depende de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, la vía de administración, el momento de la administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la condición, el estado de salud general y los antecedentes médicos del paciente que está siendo tratado, y factores similares.

[0550] Un médico puede comenzar con dosis de los anticuerpos de la invención empleados en la composición farmacéutica a niveles inferiores a los necesarios para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta alcanzar dicho efecto. En general, las dosis efectivas de las composiciones de la presente invención, para el tratamiento de los trastornos trombóticos y/o tromboembólicos descritos en el presente documento, varían según diversos factores, como la vía de administración, el sitio de acción, el estado fisiológico del paciente, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Las dosis de tratamiento deben ajustarse para optimizar la seguridad y la eficacia. Para la administración sistémica con un anticuerpo, la dosis oscila entre aproximadamente 0,01 y 15 mg/kg de peso corporal del huésped. Para la administración (por ejemplo, subcutánea) con un anticuerpo, la dosis puede oscilar entre 0,1 mg y 5 mg o entre 1 mg y 600 mg. Por ejemplo, un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento puede administrarse a una dosis de 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,1 mg/kg, 2,2 mg/kg, 2,3 mg/kg, 2,4 mg/kg, 2,5 mg/kg, 2,6 mg/kg, 2,7 mg/kg, 2,8 mg/kg, 2,9 mg/kg, 3,0 mg/kg, 3,1 mg/kg, 3,2 mg/kg, 3,3 mg/kg, 3,4 mg/kg, 3,5 mg/kg, 3,6 mg/kg, 3,7 mg/kg, 3,8 mg/kg, 3,9 mg/kg, 4,0 mg/kg, 4,1 mg/kg, 4,2 mg/kg, 4,3 mg/kg, 4,4 mg/kg, 4,5 mg/kg, 4,6 mg/kg, 4,7 mg/kg, 4,8 mg/kg, 4,9 mg/kg o 5,0 mg/kg. Un régimen de tratamiento ejemplar implica la administración sistémica una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Un régimen de tratamiento ejemplar implica la administración sistémica una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez al mes, o una vez cada 3 a 6 meses, o según sea necesario (PRN).

[0551] En un caso determinado, se administra un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o un anticuerpo que comprende CDR VL y CDR VH de NOV1401), por ejemplo, por vía intravenosa o subcutánea, a una dosis de 3 mg/kg.

[0552] En un caso determinado, se administra un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o un anticuerpo que comprende CDR VL y CDR VH de NOV1401), por ejemplo, por vía intravenosa o subcutánea, a una dosis de 10 mg/kg.

[0553] En un caso determinado, se administra un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o un anticuerpo que comprende CDR VL y CDR VH de NOV1401), por ejemplo, por vía intravenosa o subcutánea, a una dosis de 30 mg/kg.

[0554] [0336] En un caso determinado, se administra un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o un anticuerpo que comprende CDR VL y CDR VH de NOV1401), por ejemplo, por vía intravenosa o subcutánea, a una dosis de 50 mg/kg.

[0555] En un caso determinado, se administra un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o un anticuerpo que comprende CDR VL y CDR VH de NOV1401), por ejemplo, por vía intravenosa o subcutánea, a una dosis de 100 mg/kg.

[0556] En un caso determinado, se administra un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o un anticuerpo que comprende CDR VL y CDR VH de NOV1401), por ejemplo, por vía intravenosa o subcutánea, a una dosis en el intervalo de 5 mg a 600 mg.

[0557] En un caso determinado, se administra un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o un anticuerpo que comprende CDR VL y CDR VH de NOV1401), por ejemplo, por vía intravenosa o subcutánea, a una dosis aproximada de 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 90 mg, 100 mg, 120 mg, 150 mg, 180 mg, 200 mg, 210 mg, 240 mg, 250 mg, 270 mg, 300 mg, 330 mg, 350 mg, 360 mg, 390 mg, 400 mg, 420 mg, 450 mg, 480 mg, 500 mg, 510 mg, 540 mg, 550 mg, 570 mg o 600 mg.

[0558] En un caso determinado, se administra un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o un anticuerpo que comprende CDR VL y CDR VH de NOV1401), por ejemplo, por vía subcutánea, a una dosis de 5 mg.

[0559] En un caso determinado, se administra un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o un anticuerpo que comprende CDR VL y CDR VH de NOV1401), por ejemplo, por vía subcutánea, a una dosis de 15 mg.

[0560] En un caso determinado, se administra un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o un anticuerpo que comprende CDR VL y CDR VH de NOV1401), por ejemplo, por vía subcutánea, a una dosis de 50 mg.

[0561] En un caso determinado, se administra un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o un anticuerpo que comprende CDR VL y CDR VH de NOV1401), por ejemplo, por vía subcutánea, a una dosis de 150 mg.

[0562] En un caso determinado, se administra un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o un anticuerpo que comprende CDR VL y CDR VH de NOV1401), por ejemplo, por vía subcutánea, a una dosis de 300 mg.

[0563] En un caso determinado, se administra un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o un anticuerpo que comprende CDR VL y CDR VH de NOV1401), por ejemplo, por vía subcutánea, a una dosis de 600 mg.

[0564] En un caso determinado, se administra un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o un anticuerpo que comprende CDR VL y CDR VH de NOV1401), por ejemplo, por vía intravenosa o subcutánea, en una dosis suficiente para lograr una duración media de prolongación del TPPa de 2 veces o más durante un período no superior a 30 días, 35 días, 36 días, 37 días, 38 días, 39 días, 40 días, 41 días, 42 días, 43 días, 44 días, 45 días o 50 días.

[0565] En un caso determinado, se administra un anticuerpo anti-FXI/FXla descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo descrito en la Tabla 1, como NOV1401 o un anticuerpo que comprende CDR VL y CDR VH de NOV1401), por ejemplo, por vía intravenosa o subcutánea, en una dosis suficiente para lograr una duración media de prolongación del TPPa de 2 veces o más durante un período no superior a 42 días.

[0566] [0348] El anticuerpo se administra generalmente en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis únicas pueden ser semanales, quincenales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares, según lo indique la medición de los niveles sanguíneos del anticuerpo que se une a FXI y/o FXla en el paciente. Además, un médico puede determinar intervalos de dosificación alternativos y administrarlos mensualmente o según sea necesario para lograr la eficacia. En algunos procedimientos de administración sistémica, la dosis se ajusta para alcanzar una concentración plasmática de anticuerpos de 1-1000 µg/mL o 1-1200 µg/mL, y en otros procedimientos de 25-500 µg/mL. Alternativamente, el anticuerpo puede administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosis y la frecuencia varían según la semivida del anticuerpo y su diana en el paciente. En general, los anticuerpos humanos y humanizados muestran una semivida más larga en humanos que la de los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos no humanos. La dosis y la frecuencia de administración pueden variar según se trate de un tratamiento profiláctico o terapéutico. En la profilaxis, se administra una dosis relativamente baja a intervalos poco frecuentes durante un periodo prolongado. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento de por vida. En el tratamiento terapéutico, a veces se requiere una dosis relativamente alta a intervalos cortos hasta que la progresión de la enfermedad se reduzca o se detenga, y preferiblemente hasta que el paciente muestre una mejoría parcial o completa de los síntomas. Posteriormente, se puede administrar un régimen profiláctico.

[0567] EJEMPLOS

[0568] Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar mejor la invención, pero no para limitar su alcance. Otras variantes de la invención serán fácilmente evidentes para un experto en la materia y están comprendidas en las reivindicaciones adjuntas.

[0569] Ejemplo 1

[0570] Selección por afinidad (panning) de bibliotecas de fagos Fab humanos

[0571] Para la selección de anticuerpos que reconocen el Factor XI humano, se utilizaron múltiples estrategias de selección por afinidad. Se generaron anticuerpos terapéuticos contra diferentes variantes del Factor XI humano y la proteína del dominio catalítico del Factor Xla de conejo mediante la selección de clones que se unieron al Factor XI utilizando como fuente de anticuerpos una biblioteca de visualización de fagos disponible comercialmente, la biblioteca Morphosys HuCAL PLATINUM<®>. La biblioteca de fagemidos se basa en el concepto HuCAL<®>(Knappik et al., 2000, J Mol Biol 296: 57-86) y emplea la tecnología CysDisplay<™>para mostrar el Fab en la superficie del fago (WO01/05950). Para el aislamiento de anticuerpos anti-Factor XI se emplearon estrategias de selección por afinidaden fase líquida. Análisis de reactividad cruzada

[0572] Los Fab purificados se analizaron mediante ELISA para determinar su unión a las diferentes variantes del Factor XI humano (Factor XI, Factor Xla y dominio catalítico del Factor Xla) y a las proteínas biotiniladas del dominio catalítico del Factor Xla de conejo. Para ello, se recubrieron placas de 384 pocillos Maxisorp<™>(Nunc) con 10 µg/ml de NeutrAvidina en PBS durante la noche a 4 °C. Los antígenos se capturaron en la NeutrAvidina mediante biotina a temperatura ambiente (TA) durante 30 minutos. La unión de los Fab a diferentes concentraciones se detectó mediante F(ab)<2>IgG de cabra antihumana conjugada con fosfatasa alcalina (diluida 1:5000) utilizando el sustrato de fluorescencia Attophos (Roche, catálogo n.º 11681982001). Se registró la emisión de fluorescencia a 535 nm con excitación a 430 nm.

[0573] Conversión a IgG y expresión de IgG

[0574] Para expresar IgG de longitud completa en células CAP-T, los fragmentos del dominio variable de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) se subclonaron desde vectores de expresión Fab en vectores pMorph<®>_hlg apropiados para IgG1 humana. Se introdujeron dos sustituciones de aminoácidos (D265A y P329A) en la porción Fc para reducir la probabilidad de ADCC o CDC causada por cualquier FXI asociado a la superficie. Se ha demostrado que estas sustituciones de alanina reducen ADCC y CDC (véase, por ejemplo,Idosugie et al., J. Immunol.164:4178-4184, 2000; Shields et al., J. Biol. Chem.276:6591-6604, 2001). El sobrenadante del cultivo celular se recolectó 7 días después de la transfección. Después de la filtración estéril, la solución se sometió a cromatografía de afinidad de proteína A utilizando una estación de manipulación de líquidos. Las muestras se eluyeron en una solución de citrato 50 nM, NaOH 140 nM y se neutralizó el pH con tampón Tris 1 M. Posteriormente, se filtraron de forma estéril (tamaño de poro de 0,2 µm). Las concentraciones de proteínas se determinaron mediante espectrofotometría UV a 280 nm y la pureza de las IgG se analizó en condiciones desnaturalizantes y reductoras mediante SDS-PAGE.

[0575] Ejemplo 2

[0576] Datos de unión

[0577] Análisis de resonancia de plasmones superficiales (SPR) para el dominio catalítico de FXI.

[0578] Las mediciones de SPR se realizaron en un biosensor óptico basado en resonancia de plasmones superficiales BIACORE<™>T200 (BIACORE<™>, GE Healthcare, Uppsala). Los chips sensores de la serie S (CM5), los kits de inmovilización y el tampón de regeneración se compraron a GE Healthcare (Uppsala). Se realizaron dos configuraciones de ensayo diferentes dependiendo del formato del ligando, IgG o Fab. Primero, la superficie se activó conN-hidroxisuccinimida (NHS) y clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida (EDC). El NOV1401-Fab se unió covalentemente a la matriz de dextrano activada en un chip CM5 mediante el procedimiento estándar de acoplamiento de aminas (GE Healthcare, Uppsala). Para el NOV1401-IgG se realizó un ensayo de captura y se inmovilizó un anticuerpo de cabra anti-IgG-Fc humana (JIR) en el chip a 14000 RUs. Los grupos superficiales activos restantes se inactivaron con etanolamina (EA). Se preparó una celda de referencia sin ligando inmovilizado y el sistema se equilibró con tampón HBS-EP+ 1x (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05 % P20, pH 7,4, Teknova H8022).

[0579] Todos los experimentos de unión se realizaron a 25 °C a un caudal de 50 µL/min utilizando tampón HBS-EP+.

[0580] Para el ensayo de captura, NOV1401-IgG se capturó hasta alcanzar un nivel RU de 80. Para los estudios cinéticos se utilizó una serie de diluciones del dominio catalítico FXI con concentraciones que oscilaban entre 0 y 200 nM en tampón HBS-EP+. El tiempo de asociación fue de 120 s y el tiempo de disociación de 180 s. La superficie se regeneró con una única inyección de 10 mM de glicina pH 1,5 (tiempo de contacto 60 s, tiempo de estabilización 120 s). El procesamiento de datos, así como la determinaciónde kon,koff

yKD

se llevaron a cabo con el software T200 BiaEvaluation versión 1.0. Se aplicó una doble referencia (resta de la inyección de referencia y en blanco) para corregir los efectos de volumen y otros artefactos sistemáticos. Los sensogramas se ajustaron aplicando un modelo de unión 1:1 (R<max>establecido en global).

[0581] Titulación de equilibrio en solución (SET) para FXI y FXla

[0582] Se prepararon 22 diluciones seriadas 1.6n de los antígenos en tampón de muestra (PBS pH 7.4 que contenía 0,5 % BSA y 0,02 % Tween 20) y se agregó una concentración constante de NOV1401-Fab (200 pM para huFXI y 500 pM para huFXla) o NOV1401-Antibody (10 pM para huFXI y huFXla) a cada concentración de antígeno. Las concentraciones iniciales para la serie de diluciones de antígeno fueron 100 nM para huFXla y 20 nM huFXI (ensayo Fab) o 1 nM (ensayo IgG). Se distribuyeron 60 µl/pocillo de cada mezcla de dilución por duplicado en una placa MTP de polipropileno de 384 pocillos. El tampón de muestra sirvió como control negativo y una muestra sin antígeno como control positivo (Bmax). La placa se selló y se incubó durante la noche a temperatura ambiente en un agitador. Una placa MTP estándar de matriz MSD de 384 pocillos se recubrió con 30 µl/pocillo de huFXla a 0,1 µg/ml (para huFXla y huFXI) diluida en PBS, se selló y se incubó durante la noche a 4 °C.

[0583] Después de la incubación y tres lavados con TBST (TBS que contiene 0,05 % de Tween 20), la placa MSD recubierta con antígeno se bloqueó con 50 µl/pocillo de tampón de bloqueo (PBS que contiene 5 % de BSA) y se incubó durante 1 h a TA en un agitador. El paso de lavado se repitió y 30 µl/pocillo de la preparación de antígeno Fab-/IgG- se transfirió desde el MTP de polipropileno a la placa MSD recubierta con antígeno y se incubó durante 20 min a TA en un agitador. Después de un paso de lavado adicional, se añadieron 30 µl de anticuerpo de detección de cabra anti-IgG/Fab humano marcado con ECL de 0,5 µg/ml (MSD) diluido en tampón de muestra a cada pocillo y se incubó durante 30 min a TA con agitación. Después de lavar la placa de nuevo tres veces, se añadieron 35 µl de tampón de lectura (MSD) a cada pocillo. Las señales de electroquimioluminiscencia (ECL) se generaron y detectaron con el sistema de imágenes sectoriales MSD 6000.

[0584] Las señales ECL promedio se calcularon a partir de mediciones duplicadas dentro de cada ensayo. Los datos se ajustaron a la línea base restando el valor más bajo de todos los puntos de datos y se graficaron frente a la concentración de antígeno correspondiente. Los valores de K<D>se determinaron ajustando la gráfica con el siguiente modelo de ajuste 1:1 (para Fab) o 1:2 (para IgG) (según Piehleret al.,1997).

[0585] Resultados

[0586] Los resultados se resumen enlas Tablas 3 y 4.Para ambos formatos de NOV1401, Fab e IgG, se obtuvieron valoresde KD

de aproximadamente 20 nM para el dominio catalítico de FXI según lo determinado por BIACORE<™>. Las afinidades del Fab tanto al FXI activado como al zimógeno estaban en el intervalo de pM y fueron 66 y 300 veces más altas que la afinidad al dominio catalítico, respectivamente. Con base en sus altas afinidades, estas interacciones se midieron mediante ensayos SET. El NOV1401-Fab exhibió una afinidad cinco veces mayor al FXI zimógeno (62 pM) que al FXI activado (305 pM). Las afinidades del NOV1401-IgG tanto al zimógeno dimérico como al FXI activado están marcadas como valoresde KD

aparentes ya que la interacción podría estar influenciada por efectos de avidez. Para confirmar que NOV2401 también se une al FXI del mono cynomolgus, se realizaron experimentos SET con FXI activado del mono cynomolgus y zimógeno de FXI del mono cynomolgus, obteniéndose valoresde KDaparentes de 12,5 ± 6,6 pM (N=2) y 5,0 ± 0,7 pM (N=2), respectivamente. Por lo tanto, las afinidades de NOV1401 por las proteínas FXI del mono cynomolgus (forma activa y zimógeno) son comparables a las de la unión al FXI humano (Tabla 3).

[0587] Tabla 2.Los valores de K<D>y los parámetros de unión cinética de NOV1401-Fab/IgG con el dominio catalítico del FXI humano tal como se determinan mediante BIACORE™.

[0589]

[0591] Tabla 3.Los valores K<D>de NOV1401-Fab/IgG para el FXI humano activado y zimógeno determinados mediante la titulación de equilibrio en solución (SET). * Solamente se presentaron valores aparentes de K<D>, debido a que la interacción puede verse afectada por efectos de avidez

[0592] .

[0594]

[0595]

[0597] Referencia: Piehler et al. Assessmentofaffinityconstantsbyrapidsolidphasedetectionofequilibriumbindingin a flow system, J.Immunol. Meth.1997.189-206.

[0598] Ejemplo 3

[0599] Ensayo bioquímico: Inhibición de FXIa en un ensayo de actividad utilizando un péptido fluorescente como sustrato.

[0600] La actividad de FXla humana (Kordia Life Science NL, número de catálogo HFXla 1111a) se determina monitorizando la escisión de un péptido marcado fluorescentemente con la secuencia D-Leu-Pro-Arg*Rh110-D-Pro (número de producto BS-2494; Biosyntan GmbH, Berlín, Alemania). En la secuencia del sustrato escrita arriba, * indica el enlace escindible, D-Leu: D-leucina, Pro: prolina, Arg: arginina, Rh110: rodamina 110, D-Pro: D-prolina). La escisión mediada por FXIa del enlace escindible del sustrato peptídico conduce a un aumento de la intensidad de fluorescencia de la rodamina 110 cuando se utilizan longitudes de onda de excitación y emisión de 485 nm y 535 nm, respectivamente. La intensidad de fluorescencia se mide continuamente utilizando el lector de placas de microtitulación Safire2 (TECAN, Maennedorf, Suiza) a temperatura ambiente (TA). El tampón de ensayo contiene 50 mM de HEPES a pH 7,4, 125 mM de NaCl, 5 mM de CaCl<2>y 0,05 % (p/v) de CHAPS. En el ensayo de actividad final, la FXla humana y el sustrato BS-2494 tienen concentraciones de ensayo de 0,1 nM y 0,5 µM, respectivamente. En estas condiciones, el aumento de la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo es lineal durante al menos 60 minutos.

[0601] Para probar la actividad inhibitoria de los anticuerpos, se preparan diluciones seriadas de anticuerpos en tampón PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na<2>HPO<4>, 1,8 mM de KH<2>PO<4>) que contiene 0,05% (p/v) de CHAPS. Dos µL de solución de anticuerpos se preincuban con 10 µL.

[0602] .

[0603] Solución de FXla (en tampón de ensayo) durante 60 minutos a temperatura ambiente. Tras la preincubación, se añaden 10 µL de sustrato BS-2494 (diluido en tampón de ensayo) y se deja que la reacción enzimática continúe durante 60 minutos, tras lo cual se mide la intensidad de fluorescencia. Los valores de intensidad de fluorescencia se convierten en porcentaje de inhibición utilizando reacciones de control (la señal de las reacciones no inhibidas equivale a un 0 % de inhibición, y una reacción sin enzima equivale a un 100 % de inhibición) y la siguiente fórmula para la conversión de valores:

[0604] donde y es el porcentaje de inhibición a la concentración de anticuerpo x, FI(x) es la intensidad de fluorescencia medida a la concentración de anticuerpo x, FI(min) es la intensidad de fluorescencia medida en la reacción de control en ausencia de anticuerpo y Fl(max) es la intensidad de fluorescencia medida en la reacción de control sin inhibición. Los datos se analizan utilizando el programa Origin 7.5SR6 (OriginLab Corporation, EE. UU.). Los valores de IC50 a partir de los datos promediados se calculan utilizando la función logística:

[0605] donde y es el porcentaje de inhibición a la concentración de anticuerpos x, A1 es el valor de inhibición más bajo y A2 el valor de inhibición máximo. El exponente, p, es el coeficiente de Hill.

[0606] La Figura 6Amuestra una curva representativa de respuesta del compuesto del anticuerpo NOV1401 que inhibe la actividad enzimática de la FXla humana de longitud completa. Los resultados muestran que NOV1401 inhibe la actividad enzimática de la FXla humana de longitud completa de manera dependiente de la concentración (Figura 6A). El ajuste con el modelo logístico conduce a un valor de IC50<de>aproximadamente 160 pM.

[0607] Ejemplo 4

[0608] Actividad anticoagulante de los anticuerpos anti-FXIa

[0609] La actividad antitrombótica de los anticuerpos NOV1401 y NOV1090 se probó utilizando el ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada (TPPa) y el ensayo de generación de trombina (TGA).

[0610] Ensayo de TPPa:

[0611] [0365] Se adquirió plasma humano normal liofilizado “Coagulation Control N” (número de referencia 5020050) de Technoclone GmbH (Viena, Austria). Este plasma se obtuvo a partir de plasma citratado de donantes sanos seleccionados. El tiempo de coagulación obtenido con este plasma normal refleja concentraciones normales de los factores de coagulación implicados. El plasma liofilizado se almacenó a 4 °C. Antes de su uso, el plasma se resuspendió en 1 ml de agua destilada girando cuidadosamente el vial y dejándolo reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

[0612] El reactivo activador de la vía intrínseca 'TPPa-s' (número de referencia TE0350) se adquirió de SYCOmed (Lemgo, Alemania) y contiene fosfolípidos y silicatos (coloidales) en una solución tamponada (cloruro de sodio, polietilenglicol 20000; sacarosa, azida de sodio). La solución se almacenó a 4 °C.

[0613] El cloruro de calcio (número de referencia C1016-500G; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Alemania) se preparó en agua bidestilada a una concentración madre de 25 mM.

[0614] El tampón UltraPure Tris/HCl a pH 7,5 (número de referencia 15567-027; Life Technologies Corporation, NY, EE. UU.) y la solución salina tamponada con fosfato (PBS, número de referencia P4417-100TAB; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Alemania) se utilizaron para la dilución del compuesto.

[0615] El hidrato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS, número de referencia C3023-25G) y el dimetilsulfóxido anhidro (DMSO, número de referencia 276855-100ML) se adquirieron de Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Alemania).

[0616] Las mediciones del tiempo de coagulación se realizaron en un coagulómetro de bola Amelung modelo KC4A (adquirido a través de SYCOmed, Lemgo, Alemania), que es un sistema semiautomático de detección mecánica de coágulos. El sistema utiliza una cubeta especial (número de referencia Al4000; SYCOmed) en la que se colocó una bola de acero inoxidable (número de referencia Al5000; SYCOmed).

[0617] La muestra se añade a la cubeta. Tras un periodo de incubación adecuado, la cubeta se coloca en el pozo de medición del coagulómetro de bola. El pozo de medición gira lentamente, lo que provoca que la cubeta gire sobre su eje longitudinal. Debido a que la cubeta se coloca en un ligero ángulo, la gravedad y la inercia siempre sitúan la bola en el punto más bajo de la cubeta. Exactamente en el extremo opuesto a la posición de la bola se encuentra un sensor magnético. Al añadir el reactivo de activación, se inicia un cronómetro. A medida que se produce la coagulación, se forman filamentos de fibrina en la mezcla de reacción. Los filamentos de fibrina tiran de la bola, alejándola de su posición de inercia, lo que activa un impulso en el sensor magnético. Este impulso detiene electrónicamente el cronómetro. El esquema de pipeteo fue el siguiente(Tabla 4a):

[0618] Tabla 4a

[0619] Etapa de Solución volumen de ensayo TPPa [µL]

[0620] ensayo

[0621] 1 Dilución del compuesto o 50

[0622] diluyente

[0623] 2 Plasma sanguíneo humano 50

[0624] 3 Reactivo de TPPa-s 50

[0625] 4 Incubar durante 3 minutos a 37 °C bajo

[0626] rotación

[0627] 5 25 mM de cloruro de calcio 50

[0628] 6 Iniciar inmediatamente el temporizador 7 El temporizador se detiene cuando se

[0629] forma el coágulo

[0630] Las muestras se midieron por duplicado a una temperatura de 37 °C en el coagulómetro de bola Amelung.

[0631] La figura 6Bmuestra una curva de respuesta representativa del anticuerpo NOV1401, que produce una prolongación de los tiempos de coagulación TPPa dependiente de la concentración. Los resultados sugieren que NOV1401 prolonga los tiempos de coagulación TPPa del plasma humano de forma dependiente de la concentración. El tiempo de coagulación TPPa se duplica con respecto al valor basal a una concentración de NOV1401 de aproximadamente 14 nM. El valor de IC<50>se calculó en aproximadamente 13 nM.

[0632] Ensayo de Generación de Trombina (TGA):

[0633] Para el TGA se adquirió plasma humano normal liofilizado (control de coagulación N) de Technoclone GmbH, (número de referencia 5020040, lote n.° 1 P37B00) y se reconstituyó en agua destilada en el volumen sugerido por el fabricante.

[0634] [0375] La solución de sustrato se preparó utilizando el sustrato fluorogénico Z-Gly-Gly-Arg-AMC de Technoclone GmbH (número de referencia 5006230, lote n.° 8F41B00). Se mantuvieron alícuotas del sustrato liofilizado a 4 °C. El sustrato se disolvió en el volumen de agua destilada indicado en el vial 20 minutos antes de su uso en el ensayo. La solución de sustrato reconstituida contiene el péptido fluorogénico a una concentración de 1 mM y CaCl<2>a una concentración de 15 mM.

[0635] Se adquirieron dos reactivos diferentes, 'TGA RD' (número de referencia 500622) y 'TGA RC low' (número de referencia 5006213), para activar la vía intrínseca y extrínseca, respectivamente, de Technoclone GmbH (Viena, Austria). El reactivo activador 'plasma pobre en plaquetas (PPP)-reactivo bajo' se adquirió de Thrombinoscope (TS31.00, Lote n.° PPL1409/01) y se reconstituyó en agua destilada como se indica en el vial. 'PPP-reactivo bajo' contiene una mezcla de fosfolípidos y factor tisular en concentración muy baja. El reactivo se diluyó 8 veces en Tris/HCl 80 mM a pH 7,4, CHAPS al 0,05 % (p/v) inmediatamente antes de su uso.

[0636] Las muestras se dividieron en alícuotas y se midieron en placas de 96 pocillos con fondo negro/transparente adquiridas de Costar (producto n.° 3603). Para la transferencia automatizada, las muestras se colocaron en placas de 96 pocillos con fondo en V (Costar, 3894) y se transfirieron utilizando un sistema de automatización CyBio (Analytik Jena US, Woburn, MA, EE. UU.).

[0637] El plasma sanguíneo humano reconstituido, el reactivo activador 'PPP-reagent low' y el sustrato se precalentaron durante 10 minutos en un baño de agua a 37 °C. Se prepararon diluciones seriadas 1:3 de anticuerpos en PBS en una placa de 96 pocillos comenzando con una concentración de NOV1401 de 5 µM (5 veces la concentración final más alta de 1 µM) para un total de 8 diluciones. Se mezclaron 222 µl de reactivo activador con 1108 µl de solución de sustrato para generar la mezcla de sustrato de reactivo activador 10+50. Se agregaron 80 µl por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo en V para su posterior transferencia utilizando un sistema de automatización. La placa se mantuvo a 37 °C. Los reactivos se agregaron de acuerdo con el esquema dado en la Tabla 4b.

[0638] Tabla 4b

[0639] Etapa de ensayo Solución Volumen [ul]

[0640] 1 Soluciones de anticuerpos (8 20

[0641] diluciones)

[0642] 2 Solución madre de plasma 20

[0643] 5 minutos de incubación a 37°C en un

[0644] termomezclador a 300 rpm.

[0645] 3 Mezcla de reactivo 10 50 desencadenante/sustrato

[0646] Las mezclas de desecadenante/sustrato se transfirieron mediante automatización. Tras añadir las mezclas, se registraron inmediatamente la excitación y la emisión a 360 nm y 460 nm, respectivamente, utilizando un instrumento Synergy Neo (BioTek Instrument Inc., Winooski, VT, EE. UU.). Las muestras se midieron por duplicado a una temperatura de 37 °C en el lector de placas durante 90 minutos a intervalos de 55 segundos.

[0647] Para generar valores de concentración máxima de trombina, los datos se procesaron utilizando el archivo de software de evaluación TGA proporcionado por Technoclone. Para generar gráficos de concentración máxima de trombina vs. concentración de anticuerpos, los datos se ajustaron utilizando el software GraphPad. Estos datos se ajustaron a un modelo de regresión no lineal en el software GraphPad Prism5 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE. UU.). El valor de IC<50>se determinó utilizando la ecuación de curva dosis-respuesta de cuatro parámetros incorporada (pendiente variable): y = Bottom (Top - Bottom) / (1 10^((LogIC50-x)*HillSlope)) donde y es la concentración máxima de trombina formada a la concentración del inhibidor, x, y top y bottom representan la concentración de trombina sin inhibidor y a la concentración más alta del inhibidor, respectivamente.

[0648] La figura 6Cmuestra una curva de respuesta representativa del compuesto anticuerpo NOV1401, que muestra la inhibición dependiente de la concentración de la generación de trombina en el TGA. Se calculó un valor de IC50<de>24 nM y una concentración residual de trombina de 159 nM (línea punteada) para esta curva de respuesta del compuesto.

[0649] Ejemplo 5

[0650] Expresión de proteínas, formación de complejos, cristalización y determinación de la estructura de NOV1401 (Fab) - FXI (dominio catalítico).

[0651] La estructura de la porción Fab del anticuerpo NOV1401, obtenida por escisión con papaína en complejo con el dominio catalítico del factor XI, se obtuvo por cocristalización a una resolución de 2,04 Å.

[0652] Expresión de proteínas:

[0653] [0383] La construcción de expresión para el dominio catalítico FXI consistió en los residuos de aminoácidos 388-625 (Swissprot P03951) con la cisteína no apareada, C500, mutada a cisteína, con una extensión N-terminal compuesta por los aminoácidos MGSS (SEQ ID NO:49), una etiqueta de octa-histidina (SEQ ID NO: 50), un sitio de escisión PreScission<™>seguido de un sitio de escisión de enterocinasa. El constructo se ensambló por síntesis génica, se clonó en el vector de expresión pET24a y se expresó como cuerpos de inclusión en la cepa de E. coli BL21 (DE3) cultivada en medio LB. Los cuerpos de inclusión se solubilizaron en 50 mM Tris/HCl pH 8.0, 6.0 M cloruro de guanidinio, 50 mM DTT durante 2 h, desnaturalizando completamente la proteína recombinante. Se añadió rápidamente un gran exceso de tampón de replegamiento (0,5 M Tris pH 8,0, 0,9 M Arginina HCl, 5 mM GSH, 0,5 mM GSSG, 1 mM EDTA) a la solución IB para obtener una concentración final de proteína de 50 µg/ml y se incubó a 4 °C durante 5 días. El replegamiento y la formación de puentes disulfuro se llevaron a cabo mediante diálisis con tampón A (50 mM Tris pH 8,0) durante tres días.

[0654] La proteína replegada se cargó en una columna de cromatografía de intercambio aniónico que contenía Q-Sepharose<®>FF (GE Healthcare) equilibrada y lavada con tampón A. La proteína recombinante no unida se recolectó de las fracciones de flujo y lavado. El pH se ajustó a 7,4 por diálisis con 50 mM Tris pH 7,4 antes de la eliminación de la secuencia de etiqueta N-terminal usando enterocinasa (relación enterocinasa: proteína recombinante 1:100, tiempo de incubación de 2,5 h). La reacción de escisión se detuvo cargando la muestra en una columna de afinidad de Benzamidina que contenía Benzamidina Sepharose 4 FF, alta sub (GE Healthcare) equilibrada y lavada con tampón B (50 mM Tris pH 7,4, 0,5 M NaCl) y eluida con tampón C (tampón B que contenía 50 mM Benzamidina). El dominio catalítico activo de FXI se cargó en una columna de exclusión por tamaño XK 26/600 Superdex 75 (GE Healthcare) equilibrada con acetato de sodio 20 mM, pH 5,3 y NaCl 75 mM. La concentración final de proteína fue de 1,07 mg/ml.

[0655] La porción Fab de NOV1401 se obtuvo mediante la escisión de la IgG con papaína. La concentración final de Fab fue de 11 mg/ml en PBS. La digestión se realizó durante la noche a 37 °C utilizando papaína (Roche Diagnostics 108 014; 10 mg/ml) añadida al anticuerpo en una proporción de 1:100 (p/p) y en presencia de 1 mM de cisteína (añadida a la solución original de IgG). La digestión se detuvo mediante la adición de 50 µM del inhibidor específico de papaína E64, (N-[N-(L-3-trans-carboxirano-2-carbonil)-L-leucil]-agmatina, y el digerido se pasó a través de una pequeña columna de proteína A (5 mL) para eliminar la porción Fc. El Fab se recuperó en el flujo, se dializó contra PBS, se concentró a su concentración final por ultrafiltración y se filtró estérilmente (0,22 µm).

[0656] Formación de complejos, cristalización y determinación de la estructura:

[0657] El dominio catalítico de FXI y el Fab se mezclaron en proporción equimolar y se concentraron hasta una concentración final de aproximadamente 9 mg/ml.

[0658] El cristal utilizado para la recopilación de datos se obtuvo a 277 Kempleando difusión de vapor de gota sentada mezclando 0,3 µL de solución de reservorio (0,2 M de cloruro de amonio, 20 % de PEG 3350), 0,2 µL de complejo Fab-FXI y 0,1 µL de semillas de cristal de cristales obtenidos en una primera ronda de cribado de cristales.

[0659] Para la recopilación de datos, los cristales se congelaron directamente en nitrógeno líquido. Los datos se recolectaron en la línea de luz X10SA de la Fuente de Luz Suiza a una longitud de onda de 1,00002 Å utilizando un detector de píxeles Pilatus (Dectris) a 100 K. El procesamiento y escalado de datos se realizó con XDS y XSCALE (Kabsch, W. (2010) Acta Cryst. D66, 125-132). El cristal difractó a una resolución de 2,04 Å con dimensiones de celda unitaria de a=191,27, b= 53,22, c=65,164 alfa=90,0, beta= 94,56, gamma= 90,0 (grupo espacial C2) con una copia del complejo por unidad asimétrica.

[0660] La estructura del complejo se resolvió mediante reemplazo molecular utilizando estructuras del dominio catalítico FXI y un Fab truncado previamente resuelto internamente como modelos de búsqueda utilizando PHASER (McCoy, AJ et al. (2007) J. Appl. Cryst.40, 658-674). Se realizaron ciclos alternos de refinamiento y reconstrucción utilizando buster y coot rsp. (Bricogne, G. et al. (2010) BUSTER versión 2.9. Cambridge, Reino Unido: Global Phasing Ltd.; Emsley, P. y Cowtan, K. (2004). Acta Crystallogr. D60, 2126-2132). Las estadísticas de recopilación de datos y refinamiento se resumen en la Tabla 5.

[0661] Tabla 5. Reco ilación de datos estadística de refinamiento

[0664]

[0665]

[0667] Descripción de la estructura:

[0668] La estructura revela que el epítopo de unión del anticuerpo NOV1401 se une a la superficie del sitio activo con el bucle CDR3 de la cadena pesada cubriendo porciones de los subsitios S3, S2, S1-beta y S1'. Los bucles CDR1 y CDR2 adyacentes de la cadena pesada inducen cambios conformacionales en los bucles FXI 145 y 220 (numeración de quimotripsina). Además, cuatro residuos N-terminales de FXI, así como los residuos que rodean a Asp189, se desordenan; ambas son porciones con funciones clave para la actividad catalítica de FXI. El cambio conformacional del bucle 145 conduce a la oclusión del bolsillo S1 por Arg144 y del subsitio S2' por Tyr143. Por lo tanto, la unión del anticuerpo conduce a una conformación inhibida de FXI a través de múltiples mecanismos.

[0669] La forma inhibida observada comparte características descritas para la forma zimógena completa de FXI (PDB 2F83). Las porciones del dominio catalítico de FXI que han cambiado de conformación o se han desordenado como resultado de la unión del anticuerpo también se encuentran desordenadas en el zimógeno. Esto explica la fuerte unión de NOV1401 también a la forma zimógena de FXI.

[0670] Nuestro hallazgo de que NOV1401 no inhibe la activación del zimógeno FXI está de acuerdo con la distancia del epítopo de unión al sitio de escisión de activación del zimógeno FXla. NOV1401 se une tanto a FXI como a FXla. La estructura de rayos X del complejo Fab-CD de FXI revela un modo de unión único y un mecanismo de inhibición de FXla. NOV1401 se une al sitio activo de FXla (Figura 4) e induce cambios conformacionales de los cuatro residuos N-terminales y bucles del dominio catalítico que conducen a una conformación inactiva. Esta conformación inactiva comparte características con la estructura del dominio catalítico inactivo en el zimógeno (Figura 5) lo que proporciona una explicación de cómo tanto FXI como FXla pueden ser unidos con alta afinidad por NOV1401. Por ejemplo, tres bucles del sitio catalítico (por ejemplo, bucle 220, bucle 188 y bucle 145) que se encuentran desordenados en la estructura del zimógeno también se encuentran desordenados o desplazados en la estructura del complejo NOV1401 Fab-CD de FXI y un puente salino N-terminal observado en la conformación activa está ausente tanto en la estructura del zimógeno como en la del complejo NOV1401 Fab-CD de FXI (Tabla 6). Por lo tanto, NOV1401 parece inducir cambios conformacionales dentro del CD que conducen a una conformación inactiva, similar a la del zimógeno.Tabla 6: Características estructurales de CD de FXIa, CD de FXla en complejo con NOV1401 y FXI-zimógeno

[0672] D :

[0674]

[0676] Ejemplo 6

[0677] Mapeo de epítopos basado en la estructura de rayos X

[0678] Los residuos de FXI en contacto con el Fab se analizaron utilizando AREAIMOL (Briggs, PJ (2000) CCP4 Newsletter n.° 38), determinando la diferencia del área superficial del residuo cuando se calcula sin Fab unido y en complejo con el Fab, descrito de la siguiente manera en la Tabla 7 y la Tabla 8a (numeración Swissprot):

[0679] T l 7: E í FXI

[0682]

[0684] El epítopo FXI está formado por los siguientes residuos:

[0685] Pro410, Arg413, Leu415, Cys416, His431, Cys432, Tyr434, Gly435, Glu437, Tyr472-Glu476, Tyr521-Lys527, Arg548, His552, Ser575, Ser594-Glu597, Arg602-Arg604.

[0686] T l : R i FXI n n n N V14 1 E í

[0689]

[0690]

[0692] Epítopo de rayos X mapeado en la secuencia del dominio catalítico (residuos que forman el epítopo en negrita y subrayados):

[0693]

[0695] La tabla 8b muestra los residuos del anticuerpo en contacto con FXI (parátopo).

[0696] Ta l : R i N V141 n n n FXI P r . L n li r H n da

[0698]

[0699]

[0701] Ejemplo 7

[0702] Efecto del anticuerpo FXI sobre la trombosis inducida por FeCl3 en ratones

[0703] Ratones deficientes en FXI (ratones FXI<-/->) con fondo genético C57BI fueron criados en Novartis (E. Hanover, NJ) y utilizados para evaluar la eficacia antitrombótica de NOV1401. Cuando se reconstituyen intravenosamente con FXI humano (hFXI), estos ratones adquieren un fenotipo trombofílico de tipo salvaje cuando se exponen a un estímulo trombogénico. En los estudios en el presente documento descritos, la trombosis se indujo en la arteria carótida mediante la aplicación de cloruro férrico (FeCl3) en la superficie de la arteria.

[0704] NOV1401 se inyectó en bolo a través de la vena yugular de ratones anestesiados 15 minutos antes de la inducción de trombosis. Las dosis de anticuerpo variaron de 0,24 mg/kg a 0,47 mg/kg. Los ratones FXI<-/->se reconstituyeron con FXI humano mediante la inyección de 0,47 mg/kg de FXI humano a través de la vena yugular 10 minutos antes del desafío con FeCl<3>. Luego se aplicaron dos trozos de papel de filtro de 1 mm x 1,5 mm saturados con FeCl<3>al 3,5% en lados opuestos de la arteria carótida, en contacto con su superficie adventicia, y se retiraron 3 minutos después, seguido de un lavado exhaustivo con solución salina. El flujo sanguíneo a través de la arteria carótida se midió con una sonda de flujo Transonic. El flujo sanguíneo basal se obtuvo durante 5 minutos antes de la aplicación de FeCl<3>y luego durante 30 minutos después de la aplicación de FeCl<3>(es decir, durante el período trombogénico). Al finalizar el experimento, se extrajo una muestra de sangre de la vena cava en jeringas que contenían citrato de sodio al 3,8%, se preparó el plasma y se sometió a un ensayo de TTPa.

[0705] [0399]La Figura 1Amuestra el efecto de NOV1401 sobre la trombosis inducida por FeCl<3>en ratones FXI -</->reconstituidos con FXI humano (modelo de ratón FXI humanizado).La Figura 1Bmuestra el efecto de NOV1401 sobre el TPPa en el mismo modelo de ratón.La Figura 1Cmuestra la prolongación del TPPa en ratones FXI<-/->en comparación con ratones de tipo silvestre.

[0706] NOV1401 inhibió completamente la formación de trombos inducida por FeCl3<en ratones FXI>-/-

reconstituidos con hFXI (Figura 1A) a partir de 0,24 mg/kg. Se observó una respuesta dosis-dependiente pronunciada, que probablemente refleja una respuesta antitrombótica estequiométrica de todo o nada. El TPPa se prolongó 1,6 veces por encima de los controles con vehículo en el grupo de dosis alta (Figura 1B), lo que corresponde al mismo nivel de prolongación por agotamiento genético de FXI (Figura 1C), es decir, efecto máximo. Estos resultados muestran que NOV1401 tiene actividad antitrombótica en el modelo de trombosis por FeCl3 en<ratones>.

[0707] Ejemplo 8

[0708] Efectos del anticuerpo FXI sobre el FXI libre y el TPPa en monos cynomolgus

[0709] Para evaluar el perfil farmacocinético (PK) y los efectos farmacológicos de un anticuerpo anti-FXI/FXla, como NOV1401, el anticuerpo se administró mediante inyecciones subcutáneas (s.c.) o intravenosas (i.v.) a monos cynomolgus en un estudio de dosis creciente.

[0710] El efecto anticoagulante de NOV1401 se caracterizó en monos cynomolgus probando la capacidad del anticuerpo para prolongar el TPPa y reducir los niveles de FXI libre (FXI<f>) después de una dosis única intravenosa (N=2) o subcutánea (N=2) de 3 mg/kg. Se administró una segunda dosis de 10 mg/kg a todos los animales seguida de una tercera dosis de 30 mg/kg para determinar si los efectos observados a 3 mg/kg pueden potenciarse con dosis más altas. Estos resultados muestran que NOV1401 tiene una actividad anticoagulante sostenida en monos cynomolgus. La farmacodinámica (PD) de NOV1401, caracterizada por su efecto anticoagulante determinado por los niveles de TPPa y FXI<f>, se comparó luego con el perfil PK. La comparación indica que hay una buena correlación PK/PD.

[0711] Los animales recibieron una dosis de NOV1401 por vía intravenosa (N=2) o subcutánea (N=2) el día 1 del estudio a 3 mg/kg, el día 85 a 10 mg/kg y el día 114 a 30 mg/kg. Se recolectaron muestras de sangre en tubos de coagulación con citrato de sodio a los 15 minutos y 2 horas después de la dosis para los animales que recibieron la dosis intravenosa, y para todos los animales en la prueba previa, 6, 24, 48, 72 y 96 horas después de la dosis (días 1, 85 y 114) y a los 8, 11, 15, 18, 22, 25, 29, 32, 36, 39, 43, 46, 50, 53, 57, 60, 64, 66, 71, 75 y 78 días después de la dosis (solo el día 1). También se recolectó sangre los días 92, 95, 99, 102, 107, 110, 121, 124, 128 y antes de la administración de la dosis el día 114. Todas las muestras de sangre se centrifugaron; se obtuvieron muestras de plasma y se congelaron. a aproximadamente -70 ºC o menos.

[0712] Las concentraciones plasmáticas totales de NOV1401 se midieron mediante procedimientos estándar para la detección de IgG humana por ELISA utilizando un inmunoensayo tipo sándwich con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-IgG humana como anticuerpo de captura y un anticuerpo de cabra anti-IgG humana con una etiqueta HRP como anticuerpo de detección.

[0713] Para las mediciones de FXI libre en muestras de plasma que contienen tanto FXI como NOV1401, el FXI no unido se capturó con NOV1401 inmovilizado y el FXI ya complejizado con NOV1401 se eliminó mediante lavado. El FXI unido a la placa se detectó con un anticuerpo 14E11 que contiene Fc de ratón, un anticuerpo monoclonal que se une al dominio A2 del FXI y que ha sido descrito en la literatura (Cheng, et al. Blood, 116:3981-3989, 2010). La muy alta afinidad de NOV1401 tanto por FXI como por FX1a y los diferentes sitios de unión para NOV1401 y el anticuerpo de detección 14E11 permitieron una determinación precisa del FXI libre.

[0714] Las placas ELISA (LUMITRAC<™>600 HB de 384 pocillos) se recubrieron con NOV1401 (5 µg/mL en PBS) para la unión de FXI libre. Después del bloqueo (bloqueador de leche: KPL #50-82-01, dilución 1:20) y el lavado de las placas con tampón de lavado (PBS; 0,05 % Tween 20), las muestras de plasma diluidas 1:40 en tampón de ensayo (50 mM HEPES a pH 7,4, 125 mM NaCl, 5 mM CaCl<2>, 5 mM EDTA y 0,05 % (p/v) CHAPS) se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min y se lavaron 3 veces con tampón de lavado. El anticuerpo de detección 14E11 se añadió a 1 µg/mL en tampón de dilución (1,7 mM de fosfato monosódico, 8,1 mM de fosfato disódico heptahidratado, 0,15 M de cloruro de sodio, 0,7 % de Triton X-100 y 0,1 % de azida sódica, pH 7) que contenía 0,7 % de caseína. Tras lavar las placas con tampón de lavado, se añadió un anticuerpo de detección secundario, IgG anti-ratón marcada con peroxidasa (Sigma #A5278), a 0,5 µg/mL en tampón de dilución que contenía 0,4 % de caseína. Tras lavar las placas con tampón de lavado, se añadieron 50 µL de solución de sustrato quimioluminiscente de peroxidasa (LumiGLO, KPL #54-61-01) y la señal de luminiscencia se leyó inmediatamente en un lector de microplacas multimodo (SPECTRAMAX M5E). La concentración de FXI libre en cada muestra se determinó mediante una curva estándar generada con FXI humano (zimógeno) de Enzyme Research Laboratories (Catálogo n.° HFXI 1111), partiendo de 100 nM de FXI con un factor de dilución de 2 y 22 pasos de dilución. El límite inferior de cuantificación (LIC) fue de 0,24 nM de FXI, teniendo en cuenta la dilución 1:40 previa a la medición.

[0715] Se analizaron muestras de plasma de todos los puntos temporales mediante el procedimiento TPPa, y los resultados se compararon con la concentración plasmática total de NOV1401 y los niveles de FXI libre.Las figuras2A y 2B

muestran los cambios en los tiempos de coagulación del TPPa en relación con los niveles plasmáticos totales de NOV1401 para los animales tratados por vía intravenosa y subcutánea.Las figuras 3A y 3Bmuestran los cambios en los tiempos de coagulación del TPPa en relación con los niveles de FXI libre para los animales tratados por vía intravenosa y subcutánea.

[0716] Para NOV1401 administrado por vía intravenosa, los niveles plasmáticos totales más altos de NOV1401 se observaron a los 15 min. después de la dosis (Figura 2A). En este momento, el TPPa se duplicó aproximadamente con respecto al valor basal en ambos animales y se mantuvo en este nivel durante un promedio de 5 a 6 semanas. Las prolongaciones medias del TPPa desde los 15 min. después de la dosis con respecto a las mediciones previas al descenso hacia el valor basal fueron de 2,0 ± 0,02 veces y 1,9 ± 0,03 veces para cada animal.

[0717] Para el día 85, antes de la administración de una segunda dosis, el TPPa había alcanzado los niveles basales y las concentraciones plasmáticas de NOV1401 habían caído por debajo de 10 nM. Se administró una segunda dosis de 10 mg/kg el día 85, aumentando la concentración plasmática de NOV1401 total en al menos 3 veces y resultando en una prolongación del TPPa similar a la observada después de la primera dosis. Se administró una tercera dosis de 30 mg/kg el día 114 mientras el TPPa aún estaba prolongado, y no resultó en ninguna prolongación adicional significativa del TPPa, a pesar de otro aumento de al menos 3 veces en la concentración plasmática total de NOV1401 (Figura 2A). Por lo tanto, las dosis de NOV1401 superiores a 3 mg/kg lograron una prolongación del TPPa comparable a la de la dosis de 3 mg/kg, y no parecieron aumentar la magnitud de la prolongación del TPPa. Como era de esperar, la administración subcutánea de NOV1401 produjo un aumento más lento del TPPa que la administración intravenosa, pero la magnitud de la prolongación fue comparable a la del grupo intravenoso (Figura 2B). El TPPa se prolongó con respecto al valor basal durante un promedio de 5 a 6 semanas en los dos animales. Las prolongaciones medias del TPPa fueron similares a las de los animales tratados por vía intravenosa: 2,0 ± 0,03 y 1,8 ± 0,02 desde las 6 horas posteriores a la dosis hasta las mediciones previas al descenso hacia el valor basal. Al igual que en la vía intravenosa, la administración de dosis más altas no produjo mayores respuestas de TPPa a pesar de las mayores exposiciones plasmáticas a NOV1401.

[0718] Los resultados de las figuras 2A-2B demuestran que NOV1401 prolonga el TPPa en monos cynomolgus.

[0719] La concentración plasmática basal media de FXI<f>fue de 10,9 ± 0,3 nM en el grupo i.v. y cayó rápidamente (en 15 min.) tras la inyección de NOV1401 (Figura 3A). Los niveles plasmáticos de FXI<f>se mantuvieron bajos hasta que los niveles plasmáticos totales de NOV1401 cayeron a entre 15 nM-25 nM (Figura 2A, Figura 3A). En el grupo sc, la concentración basal media de FXI<f>fue de 14,3 ± 1,0 nM. FXI<f>fue marcadamente más baja que la basal a las 6 h. postratamiento (Figura 3B), y se mantuvo baja hasta que los niveles plasmáticos de NOV1401 disminuyeron a entre 15 nM-25 nM (Figura 2B, Figura 3B). FXI<f>volvió a caer marcadamente después de la segunda dosis de 10 mg/kg en todos los animales y se mantuvo baja hasta el final del estudio. Las dos dosis más altas no redujeron aún más el FXI<f>en relación con el valor inicial.

[0720] En todos los animales tratados, la caída y recuperación de los niveles de FXI<f>estuvieron relacionados temporal e inversamente con la prolongación del TPPa inducida por NOV1401, lo que confirma que NOV1401 inhibe la función de la vía intrínseca de coagulación (prolonga el TPPa) al disminuir el FXI<f>.

[0721] Estos resultados (por ejemplo,Figuras 3A y 3B) demuestran que NOV1401 reduce los niveles plasmáticos de FXI<f>en monos cynomolgus. En los estudios con monos cynomolgus, no se observó evidencia de sangrado excesivo en los sitios de venopunción ni en observaciones macroscópicas durante la necropsia. Además, no se detectó sangre oculta en las heces durante todo el estudio.

[0722] También se observó un efecto anticoagulante sostenido de NOV1401 en un estudio de toxicidad de dosis repetidas de 13 semanas s.c./4 semanas iv en monos cynomolgus. En este estudio, NOV1401 se administró semanalmente a dosis de 10 mg/kg (N=3, machos y hembras combinados) y 100 mg/kg (N=5, machos y hembras combinados) sc durante 13 semanas (14 dosis) o a 50 mg/kg (N=3, machos y hembras combinados) i.v. durante 4 semanas (5 dosis). El grupo de control (N=5, machos y hembras combinados) recibió vehículo durante 13 y 4 semanas s.c. e i.v., respectivamente. FXI:C se evaluó midiendo el tiempo de coagulación de muestras de plasma de monos cynomolgus en presencia de plasma humano deficiente en FXI (TPPa de una etapa). Se midieron el TPPa y el FXI:C en los días 2, 23 y 79 del estudio para los grupos s.c. y en los días 2 y 23 para el grupo i.v. En todos los animales y todos los grupos de tratamiento, se observó una prolongación del TPPa de 2,1 a 3 veces (Figura 7A). El efecto se mantuvo durante toda la fase de dosificación del estudio y no se observó dependencia de la dosis, similar a la observación en el estudio previo de dosis crecientes. El FXI:C se redujo en todos los animales y grupos de tratamiento en un 88-95% y se mantuvo en estos niveles durante toda la fase de dosificación del estudio (Figura 7B). El efecto sobre el FXI:C también fue independiente de la dosis en estas dosis.

[0723] [0415] No se observaron indicios macroscópicos ni microscópicos de sangrado, incluido sangrado excesivo, en los sitios de venopunción (incluidos los sitios de inyección subcutánea e intravenosa y de toma de muestras de sangre) ni en las observaciones macroscópicas durante la necropsia. Además, no se detectó sangre oculta en las heces al final del estudio. Asimismo, no se produjo mortalidad ni se observaron efectos relacionados con la sustancia de prueba en los signos clínicos, el peso corporal, el consumo de alimentos, los parámetros oftalmológicos y electrocardiográficos, la hematología, la química clínica ni el análisis de orina. No se identificaron órganos diana de toxicidad.

[0724] Se observó un aumento del peso de la tiroides en machos a 100 mg/kg s.c. Sin embargo, la importancia toxicológica de este hallazgo no es concluyente, ya que no hubo correlaciones histológicas. Hubo una gran variabilidad en el peso de la tiroides entre los animales, y el hallazgo se presentó solo en un sexo. Microscópicamente, se observó fibrosis dependiente de la dosis en los sitios de inyección sc en ambos sexos a 10 y 100 mg/kg/semana s.c. Estos hallazgos no se consideraron adversos.

[0725] No se observaron hallazgos de toxicidad significativos en estudios de toxicidad general con dosis únicas crecientes o repetidas en monos cynomolgus hasta las 13 semanas. Por lo tanto, el nivel de dosis subcutánea más alto administrado en el estudio de toxicidad GLP de 13 semanas (100 mg/kg/semana) se definió como el NOAEL.Ejemplo 9

[0726] Farmacocinética en monos cynomolgus - dosis única

[0727] A monos Cynomolgus (hembras, N=2) se les administró una dosis única de 3 mg/kg de NOV1401 por vía intravenosa o subcutánea y se les observó hasta que las concentraciones plasmáticas de FXI<f>y el TPPa volvieron a los valores previos a la dosis. A continuación, a los animales se les administró una dosis única de 10 mg/kg de NOV1401 por vía intravenosa o subcutánea, seguida dos semanas después por una dosis de 30 mg/kg por vía intravenosa o subcutánea y otro período de observación de dos semanas. La farmacocinética de NOV1401 se evaluó midiendo el NOV1401 total. La exposición al NOV1401 total, medida por la concentración máxima observada de NOV1401 total (C<max>) o el área bajo la curva de concentración-tiempo de NOV1401 total (AUC<0-14d>), fue comparable entre los animales individuales de cada grupo. La exposición (C<max>o AUC<0-14d>) fue aproximadamente proporcional a la dosis para cada vía de administración (Tabla 9). La C<max>fue aproximadamente 3 veces mayor en el grupo iv que en el grupo sc. Sin embargo, las concentraciones plasmáticas totales de NOV1401 fueron similares en ambos grupos después de la fase de distribución inicial. La semivida de eliminación terminal (t<1/2>) se estimó para cada animal utilizando un modelo de dos compartimentos después de la administración de la dosis de 3 mg/kg. La t<1/2>osciló entre 14 y 15 días (N=2). La biodisponibilidad absoluta después de la inyección s.c. osciló entre 61 y 66 % (3 niveles de dosis). No se detectaron anticuerpos anti-NOV1401 después de la administración i.v. o s.c. en ningún animal.

[0728] Tabla 9: Media de los parámetros farmacocinéticos después de la administración de dosis única (creciente) en monos c nomol us hembras

[0730]

[0732] Ejemplo 10

[0733] Toxicocinética en monos cynomolgus - dosis repetida

[0734] A los monos Cynomolgus se les administraron dosis semanales de 10 o 100 mg/kg de NOV1401 por vía subcutánea durante 13 semanas (14 dosis) o dosis de 50 mg/kg de NOV1401 por vía intravenosa durante 4 semanas (5 dosis). Los animales tratados con NOV1401 estuvieron expuestos a NOV1401 durante la fase de dosificación del estudio; no se observó exposición en los animales de control. No se observaron diferencias relacionadas con el sexo en la exposición al NOV1401 plasmático total. El aumento en la exposición (tanto Cmax<como>AUC<0-7d>) fue proporcional a la dosis tanto en animales machos como hembras (Tabla 10). Se detectaron anticuerpos anti-NOV1401 en 5 de 6 animales a 10 mg/kg/semana s.c., en 1 de 10 animales a 100 mg/kg/semana s.c. y en 1 de 6 animales a 50 mg/kg/semana i.v. La exposición total a NOV1401 no se vio comprometida en ninguno de los grupos de dosis s.c. Solo un animal con anticuerpos antidrogas (ADA) positivos tuvo un AUC<0-7d>en el día 22 del estudio que fue menor que los otros animales en el mismo grupo (50 mg/kg/semana i.v.). No hubo impacto en la prolongación del TPPa en este animal y no se observó toxicidad.

[0735] Tabla 10: Media de los parámetros toxicocinéticos para la penúltima dosis (día de estudio 85 para los grupos s.c., día de estudio 22 para el grupo i.v.) o estudio de toxicidad conforme con GLP de 13 semanas/4 semanas en monos c nomol us machos hembras combinados

[0737]

[0739] Ejemplo 11

[0740] Estudio de escalada de dosis en humanos

[0741] Se realizan estudios en humanos para evaluar la seguridad y tolerabilidad de los anticuerpos anti-FXI/FXIa, como NOV1401, tras la administración de una dosis única en sujetos sanos. En este estudio participan aproximadamente 60 sujetos varones sanos y mujeres posmenopáusicas/cirugía estéril, de entre 18 y 55 años de edad. El buen estado de salud se determina mediante los antecedentes médicos, el examen físico, el examen neurológico, los signos vitales, el electrocardiograma (ECG) y las pruebas de laboratorio realizadas durante la selección. Los sujetos seleccionados pesan al menos 50 kg y tienen un índice de masa corporal (IMC) dentro del intervalo de 18-35 kg/m²<.>IMC = peso corporal (kg) / [altura (m)]<2>.

[0742] Se probarán seis niveles de dosis subcutáneas de 5, 15, 50, 150, 300 y 600 mg en un estudio en humanos, siempre que la duración media prevista de la prolongación del TTPa ≥ 2 veces no persista durante ≥ 42 días en ninguna de las dosis probadas. Se realizan dos análisis intermedios (AI) para confirmar la selección de dosis para los 2 niveles de dosis más altos. Si la duración media prevista del TTPa es ≥ 2 veces durante más de 42 días en la dosis de 300 mg o 600 mg, la dosis se puede reducir basándose, por ejemplo, en simulaciones del modelo, para asegurar que la duración media de la prolongación del TTPa no supere 2 veces durante ≥ 42 días. Los ajustes de dosis ejemplares no limitantes pueden consistir en reducir la dosis en incrementos de 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg o 50 mg.

[0743] Los tres primeros pasos de escalada de dosis ocurren en incrementos de ≈1/2 log. Los dos últimos pasos de escalada de dosis son incrementos de ≤ 2 veces para mitigar el riesgo de saturación objetivo prolongada y prolongación extendida del TPPa.

[0744] La duración máxima de la prolongación de 2 veces el TPPa durante un cierto número de días(por ejemplo,30 días, 35 días, 40 días, 42 días, etc.) con una terapia dirigida al FXI se puede evaluar en función de datos genéticos que muestran un fenotipo de sangrado leve en pacientes con deficiencia grave de FXI, datos de pacientes con deficiencia de FXI con inhibidor adquirido y también datos de estudios en humanos, por ejemplo, FXI-ASO (véase, por ejemplo,Liu et al., (2011) "ISIS-FXIRx, a novel andspecific antisenseinhibitor of factor XI, caused significant reduction in FXI antigen andactivity and increasedaPTTwithoutcausingbleeding inhealthy volunteers." Presentado en la 53.ª reunión anual y exposición de la Sociedad Americana de Hematología, San Diego, California. Blood; 118: Resumen 209), donde la administración de dosis múltiples de FXI-ASO durante 6 semanas resultó en un agotamiento robusto y sostenido del FXI durante > 6 semanas (42 días) sin eventos de sangrado. En ciertas realizaciones, un análisis basado en modelos predice que se puede lograr transitoriamente una prolongación máxima del TTPa de aproximadamente 2,7 veces (en relación con el valor previo a la dosis) con una dosis subcutánea de 50 mg de NOV1401 (en un sujeto de 60 kg). En ciertas realizaciones, se prevé que dosis más altas prolonguen la duración de esta prolongación máxima del TTPa de 2,7 veces.

[0745] Los sujetos son monitorizados durante todo el estudio para parámetros de seguridad y/o puntos finales, tales como examen físico, examen neurológico, signos vitales, electrocardiograma (ECG), laboratorios de seguridad y eventos adversos (EA), incluidos los EA graves (EAG) hasta el día 106, inclusive, posterior a la dosis.

[0746] El efecto del anticuerpo anti-FXI/FXla (por ejemplo, NOV1401) sobre el TPPa se evalúa en función de los cambios relativos respecto al valor basal. Se miden las concentraciones plasmáticas del anticuerpo anti-FXI/FXla total (por ejemplo, NOV1401) para evaluar la farmacocinética de dosis únicas en estos sujetos.

[0747] Para evaluar la inmunogenicidad (IG) de los anticuerpos anti-FXI/FXla (por ejemplo, NOV1401), se realizan pruebas de cribado y confirmación de ADA.

[0748] Se miden el FXI libre y total y la actividad de coagulación del FXI (FXI:C) para evaluar los efectos de los anticuerpos anti-FXI/FXla (por ejemplo, NOV1401) sobre el acoplamiento a la diana y los parámetros PD relacionados con la diana.

[0749] [0428] Se evalúan el dímero D, los fragmentos de protrombina 1.2 (F1.2) y el complejo protrombina-antitrombina (TAT) para determinar los efectos de los anticuerpos anti-FXI/FXla (por ejemplo, NOV1401) en los parámetros de trombogénesis.

[0751] Para estudiar los efectos de los anticuerpos anti-FXI/FXla (por ejemplo, NOV1401) en otros parámetros de coagulación, se pueden evaluar los siguientes: tiempo de protrombina (TP), tiempo de trombina (TT) y parámetros exploratorios de laboratorio de coagulación como el inhibidor de la fibrinólisis activable por trombina, el fibrinógeno, el activador tisular del plasminógeno (tPA) y el TGA en los sujetos.

[0753] Los biomarcadores estudiados pueden incluir, pero sin limitarse a los mismos: dímero D, actividad FXI, PT/INR, TT, F1.2, fibrinógeno, TGA, actividad TAFI, TAT, antígeno PAI-1, actividad TFPi, actividad tPA y actividad vWF.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo anti-Factor XI (FXI) y anti-FXI activado (FXIa) aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une dentro del dominio catalítico de FXI y FXIa, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende i. una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 23; una región variable de cadena pesada CDR2 de SEQ ID NO: 24; una región variable de cadena pesada CDR3 de SEQ ID NO: 25; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 33; una región variable de cadena ligera CDR2 de SEQ ID NO: 34; y una región variable de cadena ligera CDR3 de SEQ ID NO: 35;

ii. una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 26; una región variable de cadena pesada CDR2 de SEQ ID NO: 27; una región variable de cadena pesada CDR3 de SEQ ID NO: 28; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 36; una región variable de cadena ligera CDR2 de SEQ ID NO: 37; y una región variable de cadena ligera CDR3 de SEQ ID NO: 38;

iii. una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 43; una región variable de cadena pesada CDR2 de SEQ ID NO: 44; una región variable de cadena pesada CDR3 de SEQ ID NO: 45; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 47; una región variable de cadena ligera CDR2 de SEQ ID NO: 37; y una región variable de cadena ligera CDR3 de SEQ ID NO: 15 o

iv. una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 46; una región variable de cadena pesada CDR2 de SEQ ID NO: 4; una región variable de cadena pesada CDR3 de SEQ ID NO: 5; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 33; una región variable de cadena ligera CDR2 de SEQ ID NO:14; y una región variable de cadena ligera CDR3 SEQ ID NO: 15.

2. Anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de cadena pesada variable (VH) de SEQ ID NO: 29 o una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 % de identidad de la misma; y una región de cadena ligera variable (VL) de SEQ ID NO: 39 o una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 % de identidad de la misma.

3. Anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 2, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de VH de SEQ ID NO: 29 y una secuencia de aminoácidos de VL de SEQ ID NO: 39.

4. Anticuerpo aislado, según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41.

5. Anticuerpo aislado, según la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41.

6. Anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano.

7. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un portador farmacéuticamente aceptable.

8. Ácido nucleico que codifica uno o más de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

9. Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 8.

10. Célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 9.

11. Composición farmacéutica, según la reivindicación 7, para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno tromboembólico en un sujeto afectado por un trastorno tromboembólico.

12. Composición farmacéutica para su uso, según la reivindicación 11, en la que el sujeto está afectado por un accidente cerebrovascular isquémico asociado a fibrilación auricular.

13. Composición farmacéutica para su uso, según la reivindicación 11, en la que el sujeto está afectado por trombosis venosa profunda.

14. Composición farmacéutica para su uso, según la reivindicación 11, en la que dicha composición farmacéutica se administra en combinación con una o más terapias con estatinas.