ES3051659T3 - Expression constructs and methods of genetically engineering methylotrophic yeast - Google Patents

Expression constructs and methods of genetically engineering methylotrophic yeast

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Abstract

Se proporcionan métodos y materiales para la ingeniería genética de levaduras metilotróficas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Constructos de expresión y métodos de modificación por ingeniería genética de levaduras metilotróficas Campo técnico de la invención
[0003] Esta divulgación se refiere en general a constructos de ADN y métodos de usar tales constructos de ADN para modificar por ingeniería genética las levaduras metilotróficas.
[0004] Antecedentes de la invención
[0005] Las levaduras metilotróficas tales comoPichia pastorisse usan comúnmente para la expresión de proteínas recombinantes. En la presente se proporcionan constructos que pueden usarse para expresar eficientemente uno o más polipéptidos en una levadura metilotrófica.
[0006] Kraineret al. (Microbial Cell Factories(2015) 14:4) describe la optimización de la disponibilidad de cofactores para la producción de hemo peroxidasa recombinante enPichia pastoris.
[0007] Liuet al. (Metabolic Engineering21 (2014) p. 9-16) describe la expresión equilibrada de la proteína globina y la biosíntesis del hemo para la producción de hemoglobina humana enSaccharomyces cerevisiae.
[0008] WO2015/153666 A1 describe réplicas en carne picada.
[0009] Fraseret al. (International Journal of Toxicology,2018 Vol. 37(3) 241-262) describe una evaluación de seguridad de una preparación de proteína de leghemoglobina de soja derivada dePichia pastoris,contemplada para su uso como catalizador de sabor en carne de origen vegetal.
[0010] WO2014/008729 A1 describe un método para eliminar la dependencia del promotor inducido por metanol de una única fuente de carbono de metanol.
[0011] Lin-Cereghinoet al. (Molecular and Cellular Biology26:3 (2006) p. 883-897) describe la Mxr1p como un regulador clave de la ruta de uso del metanol y de los genes peroxisomales enPichia pastoris.
[0012] “Notification For Soybean Leghemoglobin Protein Derived fromPichia pastoris’’, IMPOSSIBLE FOODS. GRAS.14 de septiembre de 2014, es una presentación reglamentaria que contiene datos sobre la seguridad alimentaria de la leghemoglobina recombinante de soja.
[0013] EP 2058398 A1 describe la producción de hemoglobina humana recombinante usando levaduraPichia.
[0014] Breve descripción de la invención
[0015] Esta divulgación describe el uso de cepas deP. pastorisque sobreexpresan el activador transcripcional, Mxrl, a partir del promotor AOX1 para aumentar la expresión de transgenes que también se expresan a partir del promotor AOX1, lo que mejora significativamente la producción recombinante de una o más proteínas. Además, la expresión de Mxr1 a partir del promotor de AOX1 crea un bucle de retroalimentación positiva que permite la expresión de otros transgenes a partir del promotor de AOX1 en ausencia de metanol, el inductor normalmente obligado, cuando se agotan las fuentes de carbono represoras. La expresión de Mxr1 resulta en un aumento significativo de la cantidad de proteína producida.
[0016] En un primer aspecto, se proporciona un constructo de ácido nucleico que comprende: un ácido nucleico que codifica un activador transcripcional enlazado operativamente a un elemento promotor inducible, en donde el activador transcripcional induce el elemento promotor inducible, y en donde el activador transcripcional se selecciona del grupo que consiste en regulador de la expresión de metanol 1 (Mxr1) dePichia pastoris,regulador de alcohol deshidrogenasa 1 (Adr1) deHansenula polymorpha,regulador transcripcional de la inducción de metanol 1 (Trm1) deCandida boidinii,y regulador transcripcional de la inducción de metanol 2 (Trm2) deCandida boidinii(por sus siglas en inglés, respectivamente).
[0017] En un segundo aspecto, se proporciona una célula de levadura metilotrófica que incluye el constructo de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto, en donde el constructo de ácido nucleico se integra de forma estable en el genoma de la célula de levadura metilotrófica. Las levaduras metilotróficas representativas pueden ser del géneroCandida, Hansenula, PichiaoTorulopsis.Una levadura metilotrófica representativa esPichia pastoris.En DQ395124 se muestra un ácido nucleico representativo que codifica un activador transcripcional. Un activador transcripcional representativo tiene una secuencia de aminoácidos que se muestra en ABD57365.
[0018] En algunas realizaciones, el al menos un elemento promotor inducible por metanol es un elemento promotor de alcohol oxidasa 1 (AOX1, por sus siglas en inglés) dePichia pastoris,un elemento promotor de AOD1 deCandida boidinii,un elemento promotor de MOX deHansenula polymorpha,un elemento promotor de MOD1 dePichia methanolica,un elemento promotor de DHAS dePichia pastoris,un elemento promotor de FLD1 dePichia pastoris,o un elemento promotor de PEX8 dePichia pastoris.
[0020] En algunas realizaciones, la célula de levadura metilotrófica incluye además una molécula de ácido nucleico que incluye al menos un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido enlazado operativamente a al menos un elemento promotor inducible por metanol. En algunas realizaciones, el al menos un ácido nucleico heterólogo codifica uno o más polipéptidos involucrados en la biosíntesis de un cofactor de hierro tal como el hemo (por ejemplo, ALA sintasa, ALA deshidratasa, porfobilinógeno desaminasa, UPG III sintasa, UPG III descarboxilasa, CPG oxidasa, PPG oxidasa, y/o ferroquelatasa). En algunas realizaciones, uno o más de los polipéptidos involucrados en la biosíntesis del cofactor hierro están enlazados con al menos un elemento promotor inducible por metanol.
[0022] También se describe en la presente un método para expresar un polipéptido heterólogo en una célula se proporciona. Dicho método típicamente incluye proporcionar una célula de levadura metilotrófica como se describe en la presente; introducir una molécula de ácido nucleico recombinante en la célula de levadura metilotrófica, la molécula de ácido nucleico recombinante que comprende al menos un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido enlazado operativamente a al menos un elemento promotor de la alcohol oxidasa 1 (AOX1) dePichia pastoris; y cultivo de la célula en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula de ácido nucleico recombinante, expresando por lo mismo el polipéptido heterólogo.
[0024] En algunas realizaciones, las condiciones en las que se cultivan las células incluyen la adición de hierro o de una sal farmacéutica o metabólicamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, el paso de introducción incluye una técnica tal como la transducción, la electroporación, el suministro de partículas biológicas o la transformación química. En algunas realizaciones, el paso de cultivo incluye el cultivo de la célula en presencia de metanol.
[0025] En la presente se describe un organismo recombinante que incluye un activador transcripcional enlazado operativamente al promotor que activa. En algunas realizaciones, se proporciona un organismo recombinante que expresa un polipéptido enlazado operativamente al promotor. En otro aspecto más, se proporciona un método para expresar un polipéptido a partir de un promotor inducible sin la adición de un inductor, como se describe en la presente.
[0027] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado comúnmente entendido por una persona con conocimientos ordinarios en la materia a la que pertenecen los métodos y composiciones de la materia. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente en la práctica o pruebas de los métodos y composiciones de la materia, a continuación se describen los métodos y materiales adecuados. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
[0029] Descripción de los dibujos
[0031] La Figura 1 es un esquema de los pasos que intervienen en la ruta de la biosíntesis del hemo.
[0033] La Figura 2 muestra los plásmidos usados en el constructo de la cepa de producción MXY0183.
[0035] La Figura 3 es un esquema que muestra la generación de las cepas de producción, MXY0183 y MXY0207, a partir de la cepa madre, Bg11.
[0037] La Figura 4 muestra esquemáticamente los plásmidos pGAB y pMx354.
[0039] La Figura 5 es un esquema que muestra la generación de las cepas de producción libres de selección de antibióticos, MXY0291 y MXY0338, a partir de la cepa madre, Bg11.
[0041] La Figura 6 es un esquema de las piezas lineales de ADN que contienen Mxrl y LegH var 3 que se introdujeron por cotransformación para hacer la cepa de producción MXY0291.
[0043] La Figura 7 es un esquema que muestra el constructo lineal que expresa LegH bajo el control de promotores constitutivos nativos dePichiano pAOXI.
[0045] La Figura 8 es una fotografía que muestra los cambios fenotípicos asociados a la cepa MXY0183. Se muestran los matraces agitados al inicio de la inducción (0 h) y 72 h después de la inducción. 1, MXY0051; 2, MXY0118; 3, MXY0183.
[0047] La Figura 9 muestra la producción de LegH a partir de las cepas modificadas deP. pastoris.El panel A es un gel SDS (por sus siglas en inglés) que muestra lisados de cepas deP. pastoriscultivadas en matraces agitados: 51, MXY0051; 118, MXY0118; 183, MXY0183. El panel B es una tabla comparativa de la producción de LegH de las cepas MXY0118, MXY0183 y MXY0207.
[0049] La Figura 10 muestra datos de experimentos con la cepa MXY0206. El panel A es una fotografía de cultivos en matraz agitado de las cepas MXY0183 (izquierda) y MXY0206 (derecha) después de 48 h de crecimiento en fuente de carbono reprimida. El panel B es una fotografía de sedimentos celulares procedentes de cultivos en matraz agitado de las cepas MXY0183 (izquierda) y MXY0206 (derecha) después de 48 h de crecimiento en medio BMY. El panel C es un gráfico que muestra el rendimiento relativo de LegH cargada con hemo (en ausencia de cualquier agente inductor).
[0051] La Figura 11 es una tabla resumen que muestra los rendimientos relativos de las cepas descritas en la presente cuando se cultivan en presencia de metanol con glicerol o metanol con glucosa en tanques fermentadores de 2 L.
[0052] Descripción detallada de la invención
[0054] En la presente se proporcionan constructos de ácido nucleico que permiten la modificación por ingeniería genética de una célula para aumentar la expresión recombinante de un polipéptido. En algunas realizaciones, se proporcionan en la presente constructos de ácido nucleico que permiten la modificación por ingeniería genética de una célula para aumentar la expresión recombinante de un polipéptido a partir de un promotor inducible en ausencia de la molécula inductora. Sin estar limitados por ningún mecanismo en particular, los métodos descritos en la presente crean un bucle de retroalimentación positiva en el que la expresión nativa de bajo nivel de un activador transcripcional induce un promotor que está enlazado operativamente a un activador transcripcional. Esto lleva a un aumento de la expresión del activador transcripcional, así como de uno o más polipéptidos objetivo que están enlazados operativamente al mismo promotor inducible.
[0056] En la presente se proporcionan constructos de ácido nucleico que permiten la modificación por ingeniería genética de una célula de levadura metilotrófica. Aunque los métodos se ejemplifican en la presente usando una especie dePichia(es decir,P. pastoris),pueden usarse otras especies del géneroPichiao especies de cualquiera de los génerosCandida, Hansenula, PichiayTorulopsis.
[0058] La ingeniería genética de una célula de levadura metilotrófica incluye típicamente la introducción de una molécula de ácido nucleico recombinante en la célula. Como se describe en la presente, una molécula de ácido nucleico recombinante incluye típicamente un ácido nucleico exógeno que codifica un activador transcripcional enlazado operativamente con al menos un elemento promotor inducible.
[0060] Las moléculas de ácido nucleico recombinante usadas en los métodos descritos en la presente son típicamente ADN, pero pueden usarse moléculas de ARN en las circunstancias apropiadas. Como se usa en la presente, “exógeno” se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico que se introduce en el genoma de una célula a partir de una fuente externa, en donde la fuente externa puede ser el mismo organismo u otro diferente o un ácido nucleico generado sintéticamente. Por ejemplo, un ácido nucleico exógeno puede ser un ácido nucleico de un microorganismo (por ejemplo, un género o especie de levadura metilotrófica) que se introduce en un género o especie diferente de levadura metilotrófica, sin embargo, un ácido nucleico exógeno también puede ser un ácido nucleico de una levadura metilotrófica que se introduce recombinantemente en una levadura metilotrófica como una copia adicional a pesar de la presencia de una secuencia de ácido nucleico nativa correspondiente. Por ejemplo,P. pastoriscontiene un ácido nucleico endógeno que codifica un activador transcripcional Mxr1; un ácido nucleico Mxr1 adicional deP. pastoris(por ejemplo, introducido recombinantemente enP. pastoris)o que modifica el ácido nucleico Mxr1 endógeno deP. pastorisse considera exógeno.
[0062] Los activadores transcripcionales y los ácidos nucleicos que codifican activadores transcripcionales (por ejemplo, ácidos nucleicos exógenos que codifican activadores transcripcionales) son conocidos en la técnica. Por ejemplo, un activador transcripcional dePichia pastorises la secuencia Mxr1, pero también pueden encontrarse activadores transcripcionales adecuados enHansenulapolymorpha(la secuencia Adr1; ver, por ejemplo, No. Acceso GenBank AEOI02000005, bases 858873 a 862352, para la secuencia de ácido nucleico y No. Acceso GenBank ESX01253 para la secuencia de aminoácidos) yCandida boidinii(la secuencia Trm1; ver, por ejemplo, No. Acceso GenBank AB365355 para la secuencia de ácido nucleico y No. Acceso GenBank BAF99700 para la secuencia de aminoácidos; la secuencia Trm2; ver, por ejemplo, No. Acceso GenBank AB548760 para la secuencia de ácido nucleico y No. Acceso GenBank BAJ07608 para la secuencia de aminoácidos). Una secuencia representativa de ácido nucleico deP. pastorisMxr1 puede encontrarse, por ejemplo, en el No. Acceso GenBank DQ395124, mientras que una secuencia representativa de polipéptido deP. pastorisMxr1 puede encontrarse, por ejemplo, en el No. Acceso GenBank ABD57365.
[0064] Los activadores transcripcionales tales como Mxr1 pueden expresarse normalmente a niveles bajos. Por lo tanto, es deseable colocar el ácido nucleico exógeno (es decir, el activador transcripcional) bajo el control de un promotor que sea inducible. Como se usa en la presente, “enlazado operativamente” significa que un promotor u otro(s) elemento(s) de expresión está(n) colocado(s) en relación con una secuencia codificante de ácido nucleico de tal manera que dirige(n) o regula(n) la expresión del ácido nucleico (por ejemplo, dentro del marco).
[0065] Existen varios promotores inducibles que se pueden usar al modificar por ingeniería genética las levaduras metilotróficas. Por ejemplo, se puede usar un promotor inducible por metanol o un elemento promotor del mismo. Los promotores inducibles por metanol son conocidos en la técnica. Por ejemplo, un promotor inducible por metanol comúnmente usado enP. pastorises el promotor, o una porción del mismo, del gen de la alcohol oxidasa 1 (AOX1), que se transcribe fuertemente en respuesta al metanol. Sin embargo, pueden usarse otros promotores inducibles por metanol, o elementos de promotores de los mismos, incluyendo, sin limitante, el promotor de alcohol oxidasa (AOD1) deCandida boidinii(ver, por ejemplo, No. Acceso GenBank YSAAOD1A), el promotor de la alcohol oxidasa (MOX) deHansenula polymorpha(ver, por ejemplo, No. Acceso GenBank X02425), el promotor MOD1 o MOD2 dePichia methanolica(ver, por ejemplo, Raymondet al.,1998,Yeast,14:11-23; y Nakagawaet al,1999,Yeast,15:1223-30), el promotor DHAS deP. pastoris(ver, por ejemplo, No. Acceso GenBank FJ752551) o un elemento promotor del mismo, el promotor de la formaldehído deshidrogenasa (FLD1) dePichia pastoris(ver, por ejemplo, No. Acceso GenBank AF066054), o el promotor PEX8 deP. pastoris(ver, por ejemplo, Kranthiet al.,2010,Yeast,27:705-11); (por sus siglas en inglés, respectivamente). En algunas realizaciones, el activador transcripcional es una secuencia Mit1 dePichia pastoris(ver, por ejemplo, No. Acceso GenBank CAY70887). Se sabe que todos estos promotores son inducidos por el metanol.
[0067] Un experto en la técnica entendería que la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en la presente puede integrarse de forma estable en el genoma de la célula de levadura metilotrófica, o puede expresarse extracromosómicamente a partir de un plásmido competente en replicación. Los métodos para conseguir ambas cosas son bien conocidos y se usan habitualmente en la técnica.
[0069] Como se ha demostrado en la presente, los activadores transcripcionales regulados por metanol enPichiapueden unirse al promotor de AOX1 y actuar cooperativamente con Mxr1 para activar la transcripción desde el promotor de AOX1. En algunas realizaciones, dos activadores transcripcionales regulados por metanol (por ejemplo, Mxr1 y Mit1) pueden estar enlazados operativamente a un elemento promotor inducible por metanol.
[0071] Una cepa que incluye una molécula de ácido nucleico recombinante como se describe en la presente puede usarse para regular (por ejemplo, sobreexpresar) una segunda molécula de ácido nucleico recombinante en la célula de levadura metilotrófica. Una segunda molécula de ácido nucleico recombinante puede incluir, por ejemplo, uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican uno o más polipéptidos de interés. De forma similar al ácido nucleico exógeno que codifica el activador transcripcional, un ácido nucleico heterólogo se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico que no es nativa del genoma o en el genoma de un organismo (por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo puede ser un ácido nucleico de un microorganismo (por ejemplo, un género o especie de levadura metilotrófica) que se introduce en un género o especie diferente de levadura metilotrófica).
[0073] Simplemente a modo de ejemplo, los ácidos nucleicos heterólogos que codifican el uno o más polipéptidos de interés pueden ser los ácidos nucleicos involucrados en la biosíntesis de un hemo-cofactor. Se ejemplifican en la presente los ácidos nucleicos que codifican las 8 enzimas diferentes involucradas en la biosíntesis del hemo, como se determinó y anotó a partir de la secuencia del genoma dePichia pastoris.Por ejemplo, los ácidos nucleicos heterólogos que codifican ALA sintasa, ALA deshidratasa, porfobilinógeno desaminasa, UPG III sintasa, UPG III descarboxilasa, CPG oxidasa, PPG oxidasa y ferroquelatasa pueden expresarse en las cepas de levadura metilotróficas descritas en la presente; (por sus siglas en inglés, respectivamente). Para la modificación por ingeniería genética de levaduras metilotróficas que contengan más de un ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, transgenes), puede combinarse una combinación de promotores inducibles por metanol y constitutivos, o elementos de los mismos, para aumentar aún más la expresión de tales ácidos nucleicos.
[0075] Estudios anteriores enSaccharomyces cerevisiaeidentificaron la ALA deshidratasa y la porfobilinógeno desaminasa como enzimas limitantes de la velocidad de la biosíntesis del hemo (ver, por ejemplo, Hoffmanet al.,2003,Biochem. Biophys. Res. Commun.,310(4):1247-53). Sin embargo, la expresión heteróloga de enzimas hemo individuales enP. pastorisa partir del promotor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP, por sus siglas en inglés) no logró superar las limitaciones asociadas a la expresión de una proteína recombinante que contiene un cofactor hemo (ver Kraineret al.,2015,Microb. Cell Fact.,13;14:4). Como se describe en la presente, la expresión altamente eficiente de una proteína recombinante que contiene hemo enP. pastorisse logró por la coexpresión de toda la ruta biosintética del hemo a partir de promotores inducibles por metanol, aunque se apreciaría que uno o más de los genes involucrados en la ruta biosintética del hemo podrían expresarse a partir de uno o más promotores constitutivos.
[0077] Además de las enzimas involucradas en la biosíntesis del cofactor hierro, se entendería que puede estar presente un ácido nucleico que codifique un miembro de la familia de proteínas globina (PF00042 en la base de datos Pfam), incluidas las hemoglobinas vegetales. En los Ejemplos en la presente, está presente un ácido nucleico que codifica la leghemoglobina de soja (LegH, por sus siglas en inglés). La LegH es una proteína que se une al cofactor hierro, el hemo, lo que resulta en una absorción característica a 415 nm y un color rojo distintivo. La proteína LegH (también conocida como LGB2) se encuentra de forma natural en los nódulos radiculares de la soja (ver, por ejemplo, No. Acceso UniprotKB P02236), y la secuencia de ácido nucleico usada en la presente fue optimizada en codones para su expresión enP. pastoris.Ver, por ejemplo, WO 2014/110539 y WO 2014/110532.
[0078] Alternativamente, un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de interés puede ser, por ejemplo y sin limitación, una deshidrina, una fitasa, una proteasa, una catalasa, una lipasa, una peroxidasa, una amilasa, una transglutaminasa, una oxidorreductasa, una transferasa, una hidrolasa, una liasa, una isomerasa, una ligasa o un anticuerpo contra cualquiera de tales polipéptidos. En otras realizaciones, un ácido nucleico heterólogo puede codificar una o más enzimas involucradas en la ruta de producción de pequeñas moléculas, tales como etanol, ácido láctico, butanol, ácido adípico o ácido succínico.
[0080] De forma similar al ácido nucleico exógeno que codifica el activador transcripcional, el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de interés puede estar enlazado operativamente a un elemento promotor inducible (por ejemplo, un elemento promotor inducible por metanol), o el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de interés puede estar enlazado operativamente a un promotor constitutivo o a un elemento promotor constitutivo. Los promotores inducibles y sus elementos se han tratado anteriormente. Los promotores constitutivos y los elementos promotores constitutivos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, un promotor constitutivo comúnmente usado deP. pastorises el promotor, o una porción del mismo, del gen del factor de elongación transcripcional EF-1a (TEF1, por sus siglas en inglés), que se transcribe fuertemente de manera constitutiva. Sin embargo, pueden usarse otros promotores constitutivos, o elementos de los mismos, incluyendo, sin limitación, el promotor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) deP. pastoris(ver, por ejemplo, No. Acceso GenBank U62648.1), el promotor de la proteína potencial anclada a glicosilfosfatidilinositol (GPI), GCW 14p (PAS_chr1-4_0586), deP. pastoris(ver, por ejemplo, el No. Acceso GenBank XM_002490678), o el promotor del gen de la cinasa de 3-fosfoglicerato (PGK1) deP. pastoris(ver, por ejemplo, el No. Acceso GenBank AY288296); (por sus siglas en inglés, respectivamente).
[0082] De forma similar a la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en la presente, la segunda molécula de ácido nucleico recombinante puede integrarse de forma estable en el genoma de la célula de levadura metilotrófica, o puede expresarse extracromosómicamente a partir de un plásmido competente en replicación.
[0084] El experto entenderá que puede combinarse una combinación de promotores inducibles (por ejemplo, inducibles por metanol) y constitutivos (o elementos promotores de los mismos) para aumentar aún más la expresión de cualquiera de los ácidos nucleicos enlazados operativamente dentro del mismo.
[0086] Se apreciaría por un experto en la técnica que un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de interés enlazado operativamente a un elemento promotor puede estar separado de la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en la presente, o puede ser contiguo con el ácido nucleico exógeno que codifica un activador transcripcional enlazado operativamente a un elemento promotor contenido dentro de la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en la presente. Un experto en la técnica también apreciaría que, si la segunda molécula de ácido nucleico es contigua a la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en la presente, puede usarse un único promotor, o elemento promotor del mismo, para dirigir la transcripción de ambos o de todos los genes (por ejemplo, el ácido nucleico exógeno que codifica el activador transcripcional, así como uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican el polipéptido o polipéptidos de interés).
[0088] Los métodos de introducción de ácidos nucleicos en células de levadura metilotrófica son conocidos en la técnica, e incluyen, sin limitación, la transducción, la electroporación, el suministro de partículas biolíticas y la transformación química.
[0090] Adicionalmente, se conocen en la técnica métodos de cultivo de células de levadura metilotróficas. Ver, por ejemplo,PichiaProtocols, Methods In Molecular Biology, 389, Cregg, Ed., 2007, 2a Ed.,Humana Press, Inc.En algunas circunstancias, puede ser deseable introducir o añadir metanol a los medios de cultivo, aunque, como se ha demostrado en la presente, el metanol no es necesario para obtener una expresión eficiente a altos niveles de uno o más polipéptidos de interés. En algunas circunstancias (por ejemplo, cuando se expresan uno o más ácidos nucleicos que codifican enzima(s) involucrada(s) en la biosíntesis de un cofactor de hierro), puede ser deseable complementar los medios de cultivo con hierro o una sal farmacéutica o metabólicamente aceptable (o GRAS, por sus siglas en inglés) del mismo.
[0092] Las cepas dePichiacepa son capaces de crecer con metanol como única fuente de carbono. El uso del metanol se inicia con la conversión del metanol en formaldehído por la acción de la alcohol oxidasa. La levadura metilotróficaPichia pastoriscontiene dos genes de alcohol oxidasas, AOX1 y AOX2. Las cepas con actividad alcohol oxidasa reducida (cepas de “uso lento del metanol” o MutS, por sus siglas en inglés) suelen producir más cantidad de una proteína recombinante expresada a partir del promotor AOX1 que las cepas que no tienen actividad alcohol oxidasa reducida. Las cepas mutadas en ambos genes AOX y que carecen por completo de la actividad alcohol oxidasa no pueden metabolizar el metanol, pero aún pueden ser inducidas para la expresión del promotor AOX1 por el metanol. Estas cepas conservan la capacidad de usar otras fuentes de carbono para crecer, pero siguen expresando proteínas heterólogas a partir del promotor AOX1 al añadir metanol. Dado que estas cepas no metabolizan el metanol (cepas de “uso de metanol negativo” o Mut-), se requiere mucho menos metanol para inducir la expresión de proteínas, y las cepas portadoras de estas mutaciones evitan los problemas relacionados con la alimentación con metanol en fermentaciones a gran escala. Ver, por ejemplo, Chiruvoluet al.,1997,Enzyme Microb. Technol.,21:277-83. Se determinó en la presente que la expresión de LegH a partir del promotor AOX1 en cepas Mut- mejoraba enormemente el rendimiento de LegH. Así, una levadura metilotrófica que tenga una mutación tanto en el gen AOX1 como en el gen AOX2 puede usarse en los métodos descritos en la presente.
[0093] La proteína de interés, o un complejo que incluya una o más proteínas de interés (por ejemplo, LegH ligada a un hemo, una deshidrina, una fitasa, una proteasa, una catalasa, una lipasa, una peroxidasa, una amilasa, una transglutaminasa, una oxidorreductasa, una transferasa, una hidrolasa, una liasa, una isomerasa, una ligasa o un anticuerpo) puede purificarse a partir de las células de levadura. Los métodos de purificación de polipéptidos son conocidos en la técnica. Como se usa en la presente, un polipéptido “purificado” es un polipéptido que ha sido separado o purificado de los componentes celulares que lo acompañan de forma natural. Típicamente, el polipéptido se considera “purificado” cuando está al menos en 70 % (por ejemplo, al menos en 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 %) en peso seco, libre de los polipéptidos y moléculas naturales con los que está naturalmente asociado. Puesto que un polipéptido sintetizado químicamente está, por naturaleza, separado de los componentes que lo acompañan de forma natural, un polipéptido sintético está “purificado”.
[0095] Como se usa en la presente, los ácidos nucleicos pueden incluir ADN y ARN, e incluyen ácidos nucleicos que contienen uno o más análogos de nucleótidos o modificaciones de la cadena principal. Un ácido nucleico puede ser de hebra única o de hebra doble, lo que usualmente depende del uso contemplado. También se proporcionan ácidos nucleicos y polipéptidos que difieren de una secuencia dada. Los ácidos nucleicos y los polipéptidos pueden tener al menos un 50 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con una secuencia dada de ácido nucleico o polipéptido.
[0096] Para calcular el porcentaje de identidad de secuencia, se alinean dos secuencias y se determina el número de coincidencias idénticas de nucleótidos o residuos de aminoácidos entre las dos secuencias. El número de coincidencias idénticas se divide por la longitud de la región alineada (es decir, el número de nucleótidos o residuos de aminoácidos alineados) y se multiplica por 100 para obtener un valor porcentual de identidad de secuencia. Se apreciará que la longitud de la región alineada puede ser una porción de una o ambas secuencias hasta la longitud completa de la secuencia más corta. También se apreciará que una misma secuencia puede alinearse con más de una secuencia y, por lo tanto, puede tener diferentes valores porcentuales de identidad de secuencia en cada región alineada.
[0098] El alineamiento de dos o más secuencias para determinar el porcentaje de identidad de secuencia puede realizarse usando el programa informático ClustalW y parámetros por defecto, que permite realizar alineamientos de secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos en toda su longitud (alineamiento global). Chennaet al.,2003,Nucleic Acids Res.,31(13):3497-500. ClustalW calcula la mejor correspondencia entre una consulta y una o más secuencias objeto de estudio, y las alinea para poder determinar identidades, similitudes y diferencias. Se pueden insertar huecos de uno o más residuos en una secuencia de consulta, en una secuencia objeto, o en ambas, para maximizar los alineamientos de secuencias. Para el alineamiento rápido por pares de secuencias de ácidos nucleicos, se pueden usar los parámetros por defecto (es decir, tamaño de palabra: 2; tamaño de la ventana: 4; método de puntuación: porcentaje; número de diagonales superiores: 4; y penalización de hueco: 5); para un alineamiento de múltiples secuencias de ácidos nucleicos, se pueden usar los siguientes parámetros: penalización por apertura de huecos: 10,0; penalización por extensión del hueco: 5,0; y transiciones de peso: sí. Para un alineamiento rápido por pares de secuencias polipeptídicas, se pueden usar los siguientes parámetros: tamaño de palabra: 1; tamaño de la ventana: 5; método de puntuación: porcentaje; número de diagonales superiores: 5; y penalización de hueco: 3. Para el alineamiento múltiple de secuencias polipeptídicas, se pueden usar los siguientes parámetros: matriz de pesos: blosum; penalización por apertura de huecos: 10,0; penalización por extensión del hueco: 0,05; huecos hidrófilos: encendido; residuos hidrófilos: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg y Lys; y penalizaciones de hueco específicas de residuo: activadas. ClustalW puede ejecutarse, por ejemplo, en el sitio web del lanzador de búsquedas del Baylor College of Medicine o en el sitio web del Instituto Europeo de Bioinformática en la World Wide Web (Red Mundial).
[0100] Se pueden introducir cambios en una molécula de ácido nucleico, por lo mismo dando lugar a cambios en la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado. Por ejemplo, se pueden introducir cambios en las secuencias codificantes de ácidos nucleicos por mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis mediada por PCR) o sintetizando químicamente una molécula de ácido nucleico que tenga tales cambios. Tales cambios en el ácido nucleico pueden dar lugar a sustituciones conservadoras y/o no conservadoras de aminoácidos en uno o más residuos de aminoácidos. Una “sustitución conservadora de aminoácidos” es aquella en la que un residuo de aminoácido se sustituye por otro residuo de aminoácido con una cadena lateral similar (ver, por ejemplo, Dayhoffet al.(1978, enAtlas of Protein Sequence and Structure,5 (Suppl. 3):345-352), que proporciona tablas de frecuencias para las sustituciones de aminoácidos), y una sustitución no conservadora es aquella en la que un residuo de aminoácido se sustituye por un residuo de aminoácido que no tiene una cadena lateral similar. Las secuencias de ácido nucleico y/o polipeptídicas pueden modificarse como se describe en la presente para mejorar una o más propiedades, incluyendo, sin limitación, el aumento de la expresión (por ejemplo, transcripción y/o traducción), regulación más estricta, desregulación, pérdida de represión de catabolitos, especificidad modificada, secreción, termoestabilidad, estabilidad frente a disolventes, estabilidad oxidativa, resistencia a proteasas, actividad catalítica y/o color.
[0101] Como se usa en la presente, una molécula de ácido nucleico “aislada” es una molécula de ácido nucleico libre de secuencias que flanquean naturalmente uno o ambos extremos del ácido nucleico en el genoma del organismo del que se deriva la molécula de ácido nucleico aislada (por ejemplo, un fragmento de ADNc o ADN genómico producido por PCR o digestión con endonucleasas de restricción). Tal molécula de ácido nucleico aislada se introduce generalmente en un vector (por ejemplo, un vector de clonación, o un vector de expresión) para facilitar su manipulación o para generar una molécula de ácido nucleico de fusión, que se discute con más detalle a continuación. Además, una molécula de ácido nucleico aislada puede incluir una molécula de ácido nucleico manipulada, tal como una molécula de ácido nucleico recombinante o sintética.
[0103] Los ácidos nucleicos pueden aislarse usando técnicas habituales en la técnica. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden aislarse usando cualquier método, incluyendo, sin limitante, la tecnología de ácidos nucleicos recombinantes, y/o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las técnicas generales de PCR se describen, por ejemplo, en PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995. Las técnicas de recombinación de ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, la digestión con enzimas de restricción y la ligación, que pueden usarse para aislar un ácido nucleico. Los ácidos nucleicos aislados también pueden sintetizarse químicamente, ya sea como una única molécula de ácido nucleico o como una serie de oligonucleótidos.
[0105] Los polipéptidos pueden purificarse a partir de fuentes naturales (por ejemplo, una muestra biológica) mediante métodos conocidos tales como el intercambio iónico DEAE (por sus siglas en inglés), la filtración en gel y la cromatografía de hidroxiapatita. Un polipéptido también puede purificarse, por ejemplo, expresando un ácido nucleico en un vector de expresión. Adicionalmente, puede obtenerse un polipéptido purificado por síntesis química. El grado de pureza de un polipéptido puede medirse usando cualquier método apropiado, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis por HPLC (por sus siglas en inglés).
[0106] También se proporciona un constructo o vector que contiene un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido). Los constructos o vectores, incluidos los constructos o vectores de expresión, están disponibles comercialmente o pueden producirse por técnicas de ADN recombinante habituales en la técnica. Un constructo o vector que contenga un ácido nucleico puede tener elementos de expresión enlazados operativamente a dicho ácido nucleico, y además puede incluir secuencias tales como las que codifican un marcador seleccionable (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos). Un constructo o vector que contenga un ácido nucleico puede codificar un polipéptido quimérico o de fusión (es decir, un polipéptido unido operativamente a un polipéptido heterólogo, que puede estar en el N-terminal o en el C-terminal del polipéptido). Los polipéptidos heterólogos representativos son aquellos que pueden usarse en la purificación del polipéptido codificado (por ejemplo, etiqueta 6x His, glutatión S-transferasa (GST, por sus siglas en inglés)).
[0108] Los elementos de expresión incluyen secuencias de ácido nucleico que dirigen y regulan la expresión de secuencias codificantes de ácido nucleico. Un ejemplo de elemento de expresión es una secuencia promotora. Los elementos de expresión también pueden incluir intrones, secuencias potenciadoras, elementos de respuesta o elementos inducibles que modulan la expresión de un ácido nucleico. Los elementos de expresión pueden ser de origen bacteriano, de levadura, de insecto, de mamífero o viral, y los vectores pueden contener una combinación de elementos de distintos orígenes.
[0110] Los vectores descritos en la presente pueden introducirse en una célula hospedera. Como se usa en la presente, “célula hospedera” se refiere a la célula particular en la que se introduce el ácido nucleico y también incluye la progenie de tal célula que porta el vector. Una célula hospedera puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden expresarse en células bacterianas tales comoE. coli,o en células de insectos, levaduras o células de mamíferos (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS, por sus siglas en inglés, respectivamente)). Los expertos en la técnica conocen otras células hospedadoras adecuadas. Muchos métodos para introducir ácidos nucleicos en células hospederas, tantoin vivocomoin vitro,son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, sin limitación, la electroporación, la precipitación con fosfato de calcio, la transformación con polietilenglicol (PEG, por sus siglas en inglés), el choque térmico, la lipofección, la microinyección y la transferencia de ácidos nucleicos mediada por virus.
[0112] Los ácidos nucleicos pueden detectarse usando cualquier número de técnicas de amplificación (ver, por ejemplo, PCR Primer: A Laboratory Manual, 1995, Dieffenbach & Dveksler, Eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY; y las patentes de EE.UU. Nos. 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; y 4,965,188) con un par apropiado de oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores). Se han desarrollado varias modificaciones de la PCR original que pueden usarse para detectar un ácido nucleico.
[0114] Los ácidos nucleicos también pueden detectarse usando hibridación. La hibridación entre ácidos nucleicos se trata en detalle en Sambrooket al.(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY; Secciones 7.37-7.57, 9.47-9.57, 11.7-11.8, y 11.45-11.57). Sambrooket al.divulga condiciones adecuadas de transferencia tipo Southern para sondas oligonucleotídicas de menos de aproximadamente 100 nucleótidos (Secciones 11.45-11.46). La Tm (por sus siglas en inglés) entre una secuencia que tiene menos de 100 nucleótidos de longitud y una segunda secuencia puede calcularse usando la fórmula proporcionada en la Sección 11.46. Sambrooket al.divulgan adicionalmente condiciones de transferencia tipo Southern para sondas de oligonucleótidos mayores a aproximadamente 100 nucleótidos (ver las Secciones 9.47­ 9.54). La Tm entre una secuencia de más de 100 nucleótidos de longitud y una segunda secuencia puede calcularse usando la fórmula proporcionada en las Secciones 9.50-9.51 de Sambrooket al.
[0116] Las condiciones en las que se prehibridan e hibriden las membranas que contienen ácidos nucleicos, así como las condiciones en las que se laven las membranas que contienen ácidos nucleicos para eliminar el exceso de sonda y la sonda unida de forma no específica, pueden desempeñar un papel importante en la rigurosidad de la hibridación. Tales hibridaciones y lavados pueden realizarse, en su caso, en condiciones de moderada o alta rigurosidad. Por ejemplo, las condiciones de lavado pueden hacerse más estrictas disminuyendo la concentración de sal en las soluciones de lavado y/o aumentando la temperatura a la que se realizan los lavados. Simplemente a modo de ejemplo, las condiciones de alta rigurosidad típicamente son un lavado de las membranas en 0,2X SSC (por sus siglas en inglés) a 65 °C.
[0118] Además, la interpretación de la cantidad de hibridación puede verse afectada, por ejemplo, por la actividad específica de la sonda de oligonucleótidos marcada, por el número de sitios de unión de la sonda en el ácido nucleico molde al que se ha hibridado la sonda y por la cantidad de exposición de un autorradiógrafo u otro medio de detección. Los expertos en la técnica comprenderán fácilmente que, aunque puede usarse cualquier número de condiciones de hibridación y lavado para examinar la hibridación de una molécula de ácido nucleico de sonda con ácidos nucleicos diana inmovilizados, es más importante examinar la hibridación de una sonda con ácidos nucleicos diana en condiciones idénticas de hibridación, lavado y exposición. Preferiblemente, los ácidos nucleicos objetivo se encuentran en la misma membrana.
[0120] Se considera que una molécula de ácido nucleico hibrida con un ácido nucleico pero no con otro ácido nucleico si la hibridación con un ácido nucleico es al menos 5 veces (por ejemplo, al menos 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces) mayor que la hibridación con otro ácido nucleico. La cantidad de hibridación puede cuantificarse directamente en una membrana o a partir de una autorradiografía usando, por ejemplo, un PhosphorImager o un Densitómetro (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
[0122] Los polipéptidos pueden detectarse usando anticuerpos. Las técnicas para detectar polipéptidos usando anticuerpos incluyen ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés), inmunotransferencias tipo Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Un anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal. Un anticuerpo con afinidad de unión específica para un polipéptido puede generarse usando métodos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo puede fijarse a un soporte sólido tal como una placa de microtitulación usando métodos conocidos en la técnica. En presencia de un polipéptido, se forma un complejo anticuerpo-polipéptido.
[0124] La detección (por ejemplo, de un producto de amplificación, un complejo de hibridación o un polipéptido) se realiza usualmente usando etiquetas detectables. El término “etiqueta” está contemplado para usar tanto etiquetas directas como indirectas. Las etiquetas detectables incluyen enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos.
[0126] En la presente se describen métodos que pueden usarse para generar una cepa que carece de secuencias para la selección (es decir, que carece de un marcador seleccionable). Estos métodos incluyen usar un vector de ADN plasmídico circular y una secuencia de ADN lineal; el vector de ADN plasmídico circular contiene un marcador de selección y un origen de replicación del ADN (también conocido como secuencia de replicación autónoma (ARS, por sus siglas en inglés)), y la secuencia de ADN lineal contiene secuencias para la integración en el genoma dePichiapor recombinación homóloga. La molécula lineal de ADN puede incluir adicionalmente secuencias de ácido nucleico que codifican una o más proteínas de interés, tales como, sin limitación, LegH ligada a hemo, una deshidrina, una fitasa, una proteasa, una catalasa, una lipasa, una peroxidasa, una amilasa, una transglutaminasa, una oxidorreductasa, una transferasa, una hidrolasa, una liasa, una isomerasa, una ligasa, una o más enzimas involucradas en la ruta de producción de pequeñas moléculas, tales como etanol, ácido láctico, butanol, ácido adípico o ácido succínico, o un anticuerpo contra cualquiera de tales proteínas.
[0128] Las células dePichiapueden transformarse con ambas moléculas de ADN y los transformantes seleccionarse por la presencia del marcador seleccionable en el plásmido circular. Posteriormente, se puede comprobar la integración de la molécula lineal de ADN en el genoma usando, por ejemplo, la PCR. Una vez identificadas las transformantes con la integración correcta de la molécula de ADN lineal libre de marcadores, las células pueden cultivarse en ausencia de selección para el plásmido circular. Dado que el plásmido portador del marcador no se mantiene de forma estable en ausencia de selección, el plásmido se pierde, a menudo muy rápidamente, una vez que se relaja la selección. La cepa resultante porta el ADN lineal integrado en ausencia de secuencias heterólogas para su selección. Por lo tanto, este método puede usarse para construir cepas dePichiaque carezcan de un marcador seleccionable (por ejemplo, un marcador de selección heterólogo) con un impacto mínimo o nulo en el rendimiento de la proteína recombinante.
[0130] De acuerdo con la presente invención, pueden emplearse técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, bioquímica y ADN recombinante dentro de la habilidad de la técnica. Estas técnicas se explican en su totalidad en la literatura. La invención se describirá con más detalle en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de los métodos y composiciones de la materia descritos en las reivindicaciones.
[0131] Ejemplos
[0132] PARTE A. Materiales y métodos
[0133] Ejemplo 1 - Reacción en cadena de la polimerasa
[0134] Los genes de interés se amplificaron a partir de moldes de ADN genómico o ADN plasmídico usando la ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (New England Biolabs). Brevemente, se incuban 0,6 |jMde cebador sentido y cebador antisentido con 10-50 ng de ADN molde y 400j Mde mezcla de nucleótidos en presencia de 1-2 U de Phusion ADN polimerasa. Las condiciones de reacción fueron las siguientes:
[0136]
[0138] Ejemplo 2 - Construcción de plásmidos por ligación
[0139] Se incubaron 50-100 ng de plásmido digerido por enzimas de restricción y un exceso molar 3X de insertos amplificados por PCR en presencia de ADN ligasa T4 (New England Biolabs). La ligadura se realizó a 16 °C por más de 2 horas. 2j Lde la reacción de ligación se transformaron en célulasE. co lielectrocompetentes DH10BEjemplo 3 - Transformación en E. coli de células competentes resistentes a fagos ElectroMax DH10B T1Se transformaron 1,5-2j Lde la mezcla de ligación en 20j Lde células competentes resistentes a fagos ElectroMax DH10B T1 (Invitrogen, No. Cat. 12033-015) por electroporación usando MicroPulser (BioRad) ajustado a 1,7 kV usando una cubeta con un hueco de 1 mm (BioRad, No. Cat. 165-2089); después de un pulso se añadió 1 mL de SOC (por sus siglas en inglés) a las células y se incubaron a 37 °C por 1 h con agitación a 200 rpm. Se sembraron 10j Lde la mezcla de recuperación en placas de agar LB (por sus siglas en inglés) con ampicilina a una concentración de 100 jg/mL. Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C.
[0140] Ejemplo 4 - Linealización del ADN plasmídico para la transformación en P. pastoris
[0141] El ADN plasmídico se digirió con la endonucleasa de restricción Pmel (New England BioLabs, No. Cat. R0560L) en amortiguador 1x CutSmart por 1-4 horas a 37 °C o con la endonucleasa de restricción Sfil en amortiguador 1x CutSmart por 1-4 horas a 50 °C (New England BioLabs, No. Cat. R0123L). El plásmido linealizado se purificó en gel a partir de un gel de agarosa al 0,8 % usando el kit de recuperación de ADN Zymoclean Gel (Zymo Research, No. Cat. D4002). El ADN se eluyó en 20j Lde H2O.
[0142] Ejemplo 5 - Preparación de células competentes para la transformación en P. pastoris
[0143] Las cepas seleccionadas deP. pastorisse cultivaron hasta la fase media de crecimiento exponencial (~2 OD, por sus siglas en inglés) en 25 mL de medio YPD (por sus siglas en inglés). Las células se recolectaron por centrifugación a 930 x g por 15 minutos. El sedimento celular se resuspendió en 2 mL de una solución de YPD al 80 % y HEPES 200 mM (por sus siglas en inglés), pH 6,8. Se añadieron 75j Lde DTT 1 M (por sus siglas en inglés). El sedimento celular resuspendido se mezcló a 100 rpm a 30 °C por 25 minutos. Se añadió a la suspensión un volumen de 40 mL de agua estéril helada y se recolectaron las células por centrifugación a 1125 x g por 15 minutos y se colocaron en hielo. El sedimento celular se resuspendió en 40 mL de agua helada y se recolectó como antes para realizar dos pasos de lavado adicionales. Posteriormente, el sedimento celular se resuspendió en 20 mL de sorbitol 1 M helado y se recolectó por centrifugación como antes. El sedimento celular final se suspendió en 0,3 mL de sorbitol estéril helado, se alicuotó y se congeló a -80 °C.
[0144] Ejemplo 6 - Transformación en P. pastoris
[0145] Se transformaron 30-100 ng de ADN plasmídico linealizado en 30j Lde célulasP. pastoriselectrocompetentes usando una cubeta GenePulser (BioRad) con un hueco de 1 mm y un GenePulser (BioRad) ajustado a 1,15 kV. Se añadió 1 mL de YPD/sorbitol 1 M y se mezcló en una relación 1:1 con las células. Las células se dejaron recuperar por 3 h a 30 °C con agitación a 100 rpm. 100j Lde la mezcla de recuperación se sembraron en una placa YPD con el antibiótico apropiado, y el resto de las células se sembraron en una placa YPD con el antibiótico apropiado. Las placas se incubaron a 30 °C por 48 horas. Las placas de transformación primaria se extendieron en placas YPD con el antibiótico adecuado y las placas se incubaron por 48 h a 30 °C. Los clones individuales se colocaron mediante parches en placas YPD con antibióticos y los parches se usaron para realizar la PCR de colonias o la preparación de ADNg para confirmar la integración en el cromosoma y cultivar las cepas en matraces agitados para su posterior análisis.
[0147] Ejemplo 7 - Cultivos en matraces agitados para la producción de LegH
[0149] Se inoculó una cepa de un parche fresco en el medio de cultivo BMGY (BMY suplementado con 0,75 % de glicerol, por sus siglas en inglés) y se cultivó durante la noche a 30 °C con agitación a 200 rpm. Al día siguiente, se indujo la expresión de LegH con metanol diluyendo el cultivo ON con medio BMMY (BMY 1 % metanol) suplementado con 0,1 mM de citrato de amonio de Fe(lII). El cultivo creció hasta una OD600 de 0,5-0,7. Se añadió antiespumante a una concentración final de 0,01 %. Los cultivos se cultivaron por 72 horas en total; los cultivos se suplementaron con metanol cada 24 horas al añadir 1/10 del volumen del matraz de agitación de medio BMMY 10x (BMY 10 % de metanol). Las células se cosecharon por centrifugación después de 72 h de crecimiento inducido.
[0151] Ejemplo 8 - Medio de agitación
[0153] El medio BMY se preparó al disolver 10 g de extracto de levadura y 20 g de piedra de soja en 790 mL de agua. La mezcla se esterilizó en autoclave y se enfrió a temperatura ambiente. Se esterilizaron con filtro (PES de 0,2 |jm de tamaño de poro, por sus siglas en inglés) 100 mL de amortiguador fosfato de potasio 1 M (pH 6,0) y 100 mL de base nitrogenada de levadura 10X sin aminoácidos (13,4 g de polvo de YNB (por sus siglas en inglés) por 100 mL; Sigma-Aldrich) y se añadieron a los medios. No es necesario ajustar el pH.
[0155] Componentes del medio BMY
[0157]
[0160] Los siguientes componentes se disolvieron en agua y se esterilizaron en autoclave.
[0161] Medio de baja osmolaridad para matraz volumétrico
[0163]
[0166] Ejemplo 9 - Medio de fermentación y alimentación
[0168] Se disolvieron los componentes indicados a continuación y se ajustó el volumen con agua. Los componentes eran de grado alimentario FCC (por sus siglas en inglés) o equivalente. El medio se esterilizó en autoclave, al vapor en el lugar o con un equivalente.
[0170] Medio de baja osmolaridad con 95 g/L de glicerol para fermentación
[0172]
[0175] Después de la esterilización, se dejó enfriar el medio a temperatura ambiente y se añadió lo siguiente:
[0177]
[0178] La solución de metales traza PTM1 está disponible como mezcla en polvo en Sunrise Science (No. Cat. 4052-A-B-1L). La bolsa A y la bolsa B se mezclaron en 950 mL de agua y se añadieron 5 mL de ácido sulfúrico. Se espera cierta precipitación al mezclar; la mezcla se esterilizó por filtración (PES de 0,2 |jm de tamaño de poro) y se almacenó a 4 °C en la oscuridad.
[0180] Formulación de solución vitamínica
[0182]
[0185] Alternativamente, los metales traza PTM1 pueden fabricarse de la siguiente manera:
[0187]
[0190] Los componentes se mezclan, se esterilizan por filtración y se almacenan a temperatura ambiente. La mezcla de alimentación de glicerol se preparó mezclando 17,5 g de AmberFerm 4000 en 320 mL de agua y agitando para disolver. La mezcla de agua y AmberFerm se añadió a 850 g de glicerol y se mezcló bien mediante agitación enérgica. La mezcla de alimentación se esterilizó en autoclave.
[0192] Solución de alimentación de glicerol
[0194]
[0197] La alimentación de metanol se hizo usando 99-100 % de metanol suplementado con 12 mL/L de solución de PTM1.
[0199] Ejemplo 10 - Protocolo de fermentación de transferencia de oxígeno a escala de laboratorio
[0200] Protocolo de semillas en matraces agitados
[0202] En una campana de bioseguridad aséptica, se mezclaron el medio de baja osmolaridad y el BMY en una relación bajo osmo:BMY de 9:1. Se añadió al medio glicerol, a una concentración de 12,5 g/L. Se usó glicerol/glicerina de grado alimentario USP (por sus siglas en inglés, 99,7 % de pureza en una solución de glicerol/agua al 50 % v/v (63 % p/p)) y se esterilizó en autoclave. Sigma 204 o un antiespumante equivalente se añadió al medio a una concentración de 0,25 mL/L. Se recuperaron los viales de semillas de glicerol, se rociaron por fuera con IPA al 70 % (por sus siglas en inglés) o etanol y se descongelaron dentro de una campana de bioseguridad a temperatura ambiente por aproximadamente 5 minutos. Se inocularon matraces agitados con viales de semillas de glicerol; se usó 1 mL de vial de inóculo por cada 1 L de medio de matraz agitado. Los cultivos se cultivaron a 30 °C por 24 horas con agitación (200 RPM con un lanzamiento de 1”). Se usó una relación de entre 1:10 y 1:5 de volumen real del medio:volumen nominal del matraz agitador. Los matraces de 2,8 L de volumen nominal con 250 a 500 mL de medio se usaron habitualmente con éxito. La OD a 600 nm se midió después de 24 horas de crecimiento; si la OD era de 15 o mayor, el cultivo se usó para inocular un fermentador. Si la OD era menor a 15, el cultivo se cultivaba por 1-2 horas más antes de volver a determinar la OD. Si no se alcanzaba una OD de 15 al cabo de 15 a 30 horas, se consideraba que el matraz de siembra había fracasado.
[0204] Protocolo de fermentación
[0206] El medio de fermentación y las alimentaciones se prepararon como se describe en la presente. El volumen inicial debe ser aproximadamente 40 % del volumen máximo del fermentador, por ejemplo, 4 L, si el volumen máximo de trabajo del fermentador es de 10 L. Esto se debe a que el proceso se aproximará al volumen máximo de trabajo al final de la fermentación. El fermentador se inocula con semilla de matraz agitador a una relación de 10 % de inóculo-fermentador, por ejemplo, si hay 4 L de medio inicial en el fermentador, éste se inocula con aproximadamente 0,4 L de semilla de matraz agitador. El volumen total del fermentador en este punto se denomina volumen T0, por ejemplo, 4,4 L en este ejemplo representativo. Los controles del proceso incluyen lo siguiente: 30 °C de temperatura; oxígeno disuelto controlado por agitación-aireación en cascada para mantener un punto de ajuste de saturación de 20 %; y pH controlado por la adición de 28 % de NH4OH, el punto de ajuste dependerá de la fase del proceso.
[0208] Fase de lote (desde la inoculación hasta el agotamiento del glicerol, señalado por un pico de OD): Dependiendo de la capacidad de respuesta del control PID (por sus siglas en inglés) para el oxígeno disuelto, cuando las células agotan el glicerol presente en el medio puede observarse un fuerte pico de OD o una rápida caída de las tasas de agitación-aireación o una combinación de ambos. Cuando esto ocurre, se inicia la fase de alimentación por lotes. La duración de la fase por lotes es de aproximadamente 20 horas, pero se considera aceptable hasta 24 horas. El punto de ajuste del pH es 5,0. El peso celular húmedo al final de la fase discontinua será de aproximadamente 220 g/L.
[0210] Fase de alimentación por lotes: la alimentación de glicerol se inicia para alcanzar 12-14 g/L/h de glicerol puro basado en el volumen T0. La tasa de alimentación se mantuvo hasta que se alcanzaron aproximadamente 350 g/L de peso celular húmedo, lo que debería llevar entre 7 y 10 horas. El punto de ajuste del pH es 5,0.
[0212] Fase de transición: Se toma una muestra antes de iniciar la fase de transición. La alimentación de metanol se inició para alcanzar 1 g/L/h de metanol puro, basado en el volumen T0, hasta que se alcanzó una concentración de 1-2 g/L de metanol en el caldo de fermentación. La tasa de alimentación de metanol se ajustó durante el resto de la fermentación para mantener una concentración de metanol de 0,25-1 g/L en el caldo. La tasa de alimentación de glicerol se redujo de 12-14 g/L/h a 8-9 g/L/h de glicerol puro, basado en el volumen T0, linealmente en el transcurso de 2 horas. También sería aceptable una reducción gradual de la tasa de alimentación cada 20 minutos. El punto de ajuste del pH se cambió a 3,5 y se dejó que la fermentación se ajustara de forma natural al nuevo punto de ajuste (es decir, sin añadir ácido).
[0214] Fase de producción (desde el final de la rampa de alimentación de glicerol hasta el final de la fermentación): El punto de ajuste del pH era 3,5. En el caldo de fermentación se mantuvo una concentración de metanol de 0,25-1 g/L. La tasa de alimentación del glicerol se mantuvo en 8-9 g/L/h de glicerol puro, basado en el volumen T0. Se tomaron muestras aproximadamente cada 12 horas. Las muestras se centrifugaron entre 4000 y 7000 RCF a 4 °C, y el sobrenadante se decantó. El sobrenadante se guardó en un tubo aparte. Los sedimentos celulares y 3 muestras de 5 mL de sobrenadantes en cada punto temporal se congelaron a -80 °C. Si no es posible mantener una OD de 15-20 % durante la producción, incluso con las tasas máximas de aireación y agitación del recipiente, la tasa de alimentación de glicerol puede reducirse hasta 5 g/L/h de glicerol puro, basado en el volumen T0. La fermentación finalizó 60 horas después de la inoculación. A escala de 1000 L, el proceso de cosecha consistió en interrumpir la alimentación y la aireación, enfriar el caldo a 8 °C y concentrar la pasta usando una centrifugadora con cuchillas o de discos. La recolección suele durar entre 5 y 10 horas y no conlleva una pérdida detectable de calidad del producto. A escala de laboratorio, basta con recoger, además de las muestras de 3x5 mL, una muestra adicional de 50 mL al final. El peso celular húmedo era > 450 g/L, y los gránulos centrifugados tenían un aspecto rosado, a diferencia de los gránulos centrifugados de las muestras de preinducción, que tenían un aspecto más blanco. El cambio de color del caldo de blanco a un rosa más pronunciado comenzó después de unas 6-12 horas de inducción.
[0216] PARTE B. Construcción de cepas de producción
[0218] Cepa de producción MXY0183
[0220] Ejemplo 11 - Clonación de cada enzima de la ruta de la biosíntesis del hemo en el vector de integración pGAN o pGAZ
[0222] pGAN (con el marcador de selección nat) y pGAZ (con el marcador de selección zeocina) se adquirieron a Biogrammatics, Inc (Carlsbad, CA). Cada gen se colocó bajo el control del promotor AOX1, y el terminador FDH se colocó inmediatamente después del codón de parada de cada gen. Los genes de la ruta de biosíntesis del hemo se amplificaron por PCR a partir de una cepa deP. pastorisde tipo silvestre o se subclonaron a partir de constructos anteriores.
[0223] La ruta biosintética del hemo, incluidas las enzimas involucradas en la biosíntesis del hemo, se muestra en la Figura 1. Los intermediarios producidos durante la biosíntesis del hemo se muestran en los recuadros, y la enzima que cataliza cada paso se muestra a la derecha. Los pasos enzimáticos limitantes de la velocidad, como en S.cerevisiae,se muestran subrayados.
[0225] Los genes de la ALA sintasa, la ALA deshidratasa, la UPGIII sintasa, la UPGIII descarboxilasa, la CPG oxidasa y la PPG oxidasa se amplificaron por PCR con cebadores que contenían sitios para el reconocimiento por la endonucleasa de restricción, Bsal. Los oligonucleótidos fueron sintetizados por ElimBiopharm.
[0227]
[0230] Se usó la ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (New England BioLabs, No. Cat. M0530L) para amplificar genes a partir de ADN genómico. Los productos PCR se obtuvieron y purificaron usando el kit DNA Clean&Concentrator-5 (No. Cat. D4004) y el ADN se eluyó en 25|jLde H<2>O. ElAd Ndel vector, pGAZ y pGAN, y los productos de la PCR se digirieron con Bsal (New England BioLabs, No. Cat. R0535S) en 50j Lde volumen de reacción a 37 °C.
[0232] Los vectores linealizados y los productos de PCR digeridos se purificaron a partir de un gel de agarosa al 0,8 % usando el kit Zymoclean Geld NaRecovery Kit (Zymo Research No. Cat.d 4002).El ADN se eluyó en 20j Lde H<2>O. Las reacciones de ligación se prepararon en 1oj La 16 °C durante la noche usando ligasa de ADN T4 (New England BioLabs, No. Cat. M0202S).
[0234] Los genes PBD y ferroquelatasa se subclonaron a partir de plásmidos previamente construidos: pJAZ_PBD se digirió con BstBI(Bsp119I) (ThermoScientific, FD0124)y Notl (ThermoScientific, FD0596) en amortiguador 1x Fast Digest por 5 min a 37 °C. pJAZ_Ferroch se digirió con Mfel (Munl, ThermoScientific, FD0753) y Notl (ThermoScientific, FD0596) en amortiguador 1x Fast Digest por 5 min a 37 °C.
[0236] Los productos digeridos se purificaron a partir de un gel de agarosa al 0,8 % usando el kit Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research No. Cat.d 4002).El ADN se eluyó en 20j Lde H<2>O.
[0238] Las reacciones de ligación se prepararon en reacciones de 10j La 16 °C durante la noche usando ligasa de ADN T4 (New England BioLabs, No. Cat. M0202S).
[0240] Se transformaron 1,5j Lde la mezcla de ligación en 20j Lde células competentes resistentes a fagos ElectroMax DH10B T1 (Invitrogen, No. Cat. 12033-015) mediante electroporación usando MicroPulser (BioRad) ajustado a 1,7 kV; las células se incubaron a 37 °C en 1 mL de SOC por 1 h con agitación a 200 rpm. Se sembraron 10j Lde la mezcla de recuperación en placas de agar LB con ampicilina a una concentración de 100 jg/mL. Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C. Las colonias se analizaron mediante PCR de colonias para detectar la presencia del inserto. Se confirmaron las secuencias de los genes.
[0242]
[0245] Ejemplo 12 - Ensamblaje de genes de la biosíntesis del hemo en plásmidos para su integración en el genoma mutS de P. pastoris
[0247] El casete completo “promotor-gen-terminador” se amplificó por PCR con cebadores que contenían sitios para endonucleasas de restricción con el fin de ensamblar plásmidos para su integración en el genoma dePichia.Ensamblaje de Paox1_UPS_FDHterm- Paox1_UPD_FDHterm-Paox1_CPO_FDHterm en el plásmido pGAN (pMx327)
[0249] Se usó pGAN-CPGoxidase (pMx312) como vector para clonar los casetes UPS y UPD. El casete UPG III sintasa se amplificó por PCR a partir de pMx310 con cebadores para el promotor AOX1/terminador FDH1 que contenían los correspondientes sitios de reconocimiento NheI y SphI para las endonucleasas de restricción:
[0251]
[0254] El casete UPG III descarboxilasa se amplificó por PCR a partir de pMx311 con cebadores para el promotor AOX1/terminador FDH1 que contenían los sitios de reconocimiento SphI y AgeI para las endonucleasas de restricción correspondientes:
[0256]
[0259] Se usó la ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (New England BioLabs, No. Cat. M0530L) para amplificar el ADN de los plásmidos.
[0261] Los productos PCR obtenidos se purificaron usando el kit DNA Clean&Concentrator-5 (Zymo Research, No. Cat. D4o04) y el ADN se eluyó en 25 |jL de H<2>O.
[0263] El pGAN-CPGoxidase (pMx312) denominado como vector se digirió en 1x amortiguador CutSmart con NheI-HF (New England BioLabs, No. Cat. R3131S) y AgeI-HF (New England BioLabs, No. Cat. R3552S) durante la noche a 37 °C.
[0265] El producto PCR del casete UPG III sintasa se digirió en 1x amortiguador CutSmart con NheI-HF (New England BioLabs, No. Cat. R3131S) y SphI-HF (New England BioLabs, No. Cat. R3182S) durante la noche a 37 °C.
[0266] El producto PCR del casete UPG III descarboxilasa se digirió en 1x amortiguador CutSmart con Sphl-HF (New England BioLabs, No. Cat. R3182S) y AgeI-HF (New England BioLabs, No. Cat. R3552S) durante la noche a 37 °C.
[0268] El vector digerido y los productos de la PCR se purificaron en gel a partir de agarosa al 0,8 % usando el kit Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research, No. Cat. D4002). El ADN se eluyó en 20 |jL de H2O.
[0270] La ligadura de tres vías entre el casete de UPG III sintasa digerido con NheI-SphI, el casete de UPG III descarboxilasa digerido con SphI-AgeI y un vector digerido con NheI-AgeI se estableció en 10 j L a 16 °C durante la noche usando ligasa de ADN T4 (New England BioLabs, No. Cat. M0202S).
[0272] Se transformaron 1,5 j L de la mezcla de ligación en 20 j L de células competentes resistentes a fagos ElectroMax DH10B T1 (Invitrogen, No. Cat. 12033-015) mediante electroporación usando MicroPulser (BioRad) ajustado a 1,7 kV; las células se incubaron a 37 °C en 1 mL de SOC por 1 h con agitación a 200 rpm. Se sembraron 10<j>L de la mezcla de recuperación en placas de agar LB (por sus siglas en inglés) con ampicilina a una concentración de 100 jg/mL. Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C. Las colonias se analizaron mediante PCR de colonias para detectar la presencia del inserto. Se confirmaron las secuencias de las uniones entre el vector y los insertos.
[0273] Ensamblaje del casete Paox1_ALAsintasa_FDH1term - Paox1_PPGoxidasa_FDH1term- Paox1_Fc_ FDH1term. -Paox1_PBD_FDH1term (pMx330)
[0275] a. Amplificación por PCR de casetes de genes:
[0277] El casete de ALA sintasa se amplificó por PCR a partir de pMx310 con cebadores para el promotor de AOX1/terminador de FDH1 que contenían los sitios de reconocimiento de NheI y XhoI para las endonucleasas de restricción correspondientes:
[0280]
[0283] El casete de PPG oxidasa se amplificó por PCR a partir de pMx313 con cebadores para el promotor de AOX1/terminador de FDH1 que contenían los sitios de reconocimiento de XhoI y AflII para las endonucleasas de restricción correspondientes:
[0286]
[0289] El casete de ferroquelatasa se amplificó por PCR a partir de pMx323 con cebadores para el promotor AOX1/terminador<f>DH1 que contenían los sitios de reconocimiento AflII y AgeI para las endonucleasas de restricción correspondientes:
[0292]
[0295] El marcador G418 se amplificó por PCR a partir del plásmido pJAG adquirido a Biogrammatics usando los siguientes cebadores:
[0296]
[0299] Se usó la ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (New England BioLabs, No. Cat. M0530L) para amplificar el ADN de los plásmidos. Los productos de la PCR se obtuvieron y purificaron usando el kit DNA Clean&Concentrator-5 (Zymo Research, No. Cat. D4004) y el ADN se eluyó en 25|jLde H<2>O.
[0301] b. Preparación de vectores
[0303] El pGAZ-PBD (pMx321) denominado como vector se digirió en 1x amortiguador CutSmart con Nhel-HF (New England BioLabs, No. Cat. R3131S) y Xhol (New England BioLabs, No. Cat. R0146S) durante la noche a 37 °C. pGAZ-ALAsyn.-PBD (pMx328) se digirió en 1x NEBuffer 3.1 con MluI (New England BioLabs, No. Cat. R0198S) y BbvCI (New England BioLabs, No. Cat. R0601S) durante la noche a 37 °C.
[0305] pGAG-ALAsyn-PBD (pMx332) se digirió en 1x amortiguador CutSmart con Xhol (New England BioLabs, No. Cat. R0146S) y Agel-HF (New England BioLabs, No. Cat. R3552S) durante la noche a 37 °C.
[0307] c. Fabricación de constructos intermedios y ensamblaje de un casete final
[0309] El vector digerido y los productos de la PCR se purificaron en gel a partir de agarosa al 0,8 % usando el kit Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research, No. Cat. D4002). El ADN se eluyó en 20j Lde H<2>O.
[0311] El vector pGAZ-PBD (pMx321), digerido con endonucleasas de restricción Nhel-Xhol, se ligó con el producto de PCR del casete de ALA sintasa digerido con las mismas enzimas en una reacción de 10j La 16 °C durante la noche usando ligasa de ADN T4 (New England BioLabs, No. Cat. M0202S) para obtener un plásmido pGAZ-ALAsyn.-PBD (pMx328).
[0313] El pGAG-ALAsyn-PBD (pMx332) digerido con las endonucleasas de restricción Xhol y Agel-HF se ligó con los productos PCR del casete PPG oxidasa y del casete Ferroquelatasa digeridos con Xhol, Aflll y Afl11, Agel-HF endonucleasas de restricción correspondientes en una reacción de ligación de tres vías usando T4 ADN Ligasa (New England BioLabs, No. Cat. M0202S) para producir un pGAG-ALA sintasa_PPG oxidasa_Fc_PBD (pMx330).
[0314] Se transformaron 1,5j Lde la mezcla de ligación en 20j Lde células competentes resistentes a fagos ElectroMax DH10B T1 (lnvitrogen, No. Cat. 12033-015) mediante electroporación usando MicroPulser (BioRad) ajustado a 1,7 kV; las células se incubaron a 37 °C en 1 mL de SOC por 1 h con agitación a 200 rpm. Se sembraron 10j Lde la mezcla de recuperación en placas de agar LB (por sus siglas en inglés) con ampicilina a una concentración de 100 jg/mL. Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C. Las colonias se analizaron mediante PCR de colonias para detectar la presencia del inserto. Se confirmaron las secuencias de las uniones entre el vector y los insertos.
[0316]
[0319] Ejemplo 13 - Integración de plásmidos linealizados con casetes génicos en el genoma de P. pastoris Bg11
[0320] Los plásmidos que se usaron para generar la cepa de producción, MXY0183, se muestran en la Figura 2. En la Figura 3 se muestran los pasos seguidos para realizar las modificaciones que condujeron a la cepa de producción, MXY0183.
[0322] La primera enzima que se introdujo en el genoma deP. pastorisBg11 fue la ALAD. Se linealizó un plásmido que contenía pAOX1-driven ALAD (pMX229, Figura 2i y Figura 3) usando la enzima de restricción Pmel (New England BioLab). El plásmido linealizado se purificó a partir de un gel de agarosa al 0,8 % como se ha descrito y se transformó enP. pastorisusando recombinación homóloga en ellocusnativo AOX1, generando la cepa MXY099 (Figura 3).
[0324] Un plásmido que contiene dos copias del gen LegH de la soja (secuencia optimizada paraP. pastoris;SEQ lD NO: 3) bajo el control del promotor pA0X1 denominado pMX282 (Figura 2ii y Figura 3) se linealizó usando la enzima de restricción Sfil. El plásmido linealizado se purificó a partir de un gel de agarosa al 0,8 % como se ha descrito y se transformó en la cepa deP. pastorisque contenía ALAD, generando la cepa MXY0118 (Figura 3). Se usó qPCR y se determinó que la cepa MXY0118 contenía varias copias del gen LegH, probablemente debido a la concatamerización del plásmido, pMX282, en el momento de la recombinación.
[0326] El plásmido pMX327 (Figura 2iii y Figura 3) que contiene genes que codifican la Uroporfirinógeno III sintasa (UPS), la Uroporfirinógeno III descarboxilasa (UPD) y la Coproporfirinógeno III oxidasa (CPO) (las enzimas que catalizan los pasos 4, 5 y 6, respectivamente) bajo el control del promotor AOX1 se linealizó con la endonucleasa de restricción SfiI y se introdujo en MXY0118, dando lugar a la cepa MXY0170 (Figura 3).
[0328] Los genes que codifican la ALA sintasa (ALAS), la protoporfirina III oxidasa (PPO), la ferroquelatasa (FC) y la porfobilinógeno deaminasa (PBD) (las enzimas que catalizan los pasos 1, 7, 8 y 3, respectivamente) del genoma deP. pastorisse ensamblaron en el plásmido pMX330 (Figura 2iv y Figura 3). pastoris se ensamblaron en el plásmido pMX330 (Figura 2iv y Figura 3). pMX330 se linealizó con la endonucleasa de restricción SfiI y se transformó en MXY0170, dando lugar a la cepa MXY0183 (Figura 3). El genotipo de MXY0183 se confirmó usando PCR y qPCR.
[0330] Cepa de producción MXY0207
[0332] Ejemplo 14 - Construcción del vector de expresión pGAB
[0334] El vector de expresión pGAB (Figura 4A) se construyó sustituyendo el marco abierto de lectura del gen de resistencia a la Zeocina del vector pGAZ (BioGrammatics, Inc., Carlsbad, CA) por el marco abierto de lectura del gen de la Blasticidina S deaminasa (BSD, por sus siglas en inglés) deAspergillus terreus,que permite la selección de transformantes portadores del plásmido con el antibiótico Blasticidina S.
[0336] El marco abierto de lectura BSD se amplificó a partir de una molécula de ADN sintetizada comercialmente usando cebadores oligonucleotídicos MxO0476 y MxO0477 usando una reacción en cadena de la polimerasa de alta fidelidad como se describe en la presente.
[0338]
[0341] El producto de la PCR BSD se purificó por electroforesis en gel en un gel de agarosa al 1 % en amortiguador 1x TBE (por sus siglas en inglés, Tris 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM, por sus siglas en inglés, pH 8,3) y se visualizó usando la tinción para gel SYBR Safe DNA (Life Technologies, Carlsbad, CA). El fragmento de ADN deseado se extrajo del gel de agarosa y el ADN se recuperó usando el kit Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research, Irvine, CA).
[0343] El producto de PCR BSD purificado y el vector pGAZ se digirieron con 10 unidades de cada una de las endonucleasas de restricción MluI y BbvCI (New England Biolabs, Ipswich, MA) por 1 hora a 37 °C en amortiguador 1x NEBuffer 3.1 (NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM, MgCh 10 mM, 100 |jg/mL de BSA (por sus siglas en inglés), pH 7,9 a 25 °C). Los productos de ADN digeridos se recuperaron mediante electroforesis en gel como se ha descrito anteriormente.
[0345] El producto BSD purificado, digerido por MluI y BbvCI y el vector pGAZ se incubaron con 400 unidades de ADN ligasa T4 (New England Biolabs) en amortiguador de reacción 1xAd Nligasa T4 (Tris-HCl 50 mM, MgCh 10 mM, ATP 1 mM (por sus siglas en inglés), DTT 10 mM, pH 7,5 a 25 °C) en una reacción de 20 jL , a 16 °C por 2 horas en una reacción de 20 jL . Se transformaron células electrocompetentesE. coliDH10B con 2 jL de la reacción de ligación y se seleccionaron transformantes resistentes a los antibióticos en placas de agar LSB (por sus siglas en inglés) suplementadas con 100 jg / jL de ampicilina.
[0347] Ejemplo 15 - Construcción del vector de expresión Mxr1
[0349] El vector de expresión de Mxr1, pMx354, se construyó introduciendo el marco abierto de lectura de Mxr1 en el vector pGAB (Figura 4B). El marco abierto de lectura de Mxr1 se insertó en pGAB con el inicio de la traducción inmediatamente aguas abajo del promotor de la alcohol oxidasa 1 (AOX1) inducible por metanol dePichia pastorisy la señal de parada de la traducción inmediatamente seguida de la secuencia terminadora de la transcripción del gen FDH1 deP. pastoris.
[0351] El marco abierto de lectura que codifica la proteína Mxr1 se amplificó a partir de ADN genómico aislado de la cepa Bg11 MutS dePichia pastorisobtenida de BioGrammatics, Inc. (Carlsbad, CA). El marco abierto de lectura de la Mxr1 se amplificó a partir de ADN genómico deP. pastoriscon los cebadores MxO0495 (TTT TGC GGC CGC ATG AGC AAT CTA CCC CCA ACT TTT G (SEQ ID NO: 45)) y MxO0496 (AAA AGC GGC CGC CTA GAC ACC ACC ATC TAG TCG GTT (SEQ ID NO: 46)), a los que se añadieron sitios flanqueantes de reconocimiento de la endonucleasa de restricción NotI. La amplificación se llevó a cabo usando la reacción en cadena de la polimerasa como se describe en la presente.
[0352] El producto de PCR amplificado Mxr1 y el vector pGAB se digirieron con 10 unidades de endonucleasa de restricción NotI (New England Biolabs) por 1 hora a 37 °C en amortiguador 1x NEBuffer 3.1 (NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM, MgCh 10 mM, 100 |jg/mL de BSA, pH 7,9 a 25 °C). Después de la digestión, el vector pMx352 digerido por NotI se trató con 5 unidades de fosfatasa antártica (New England Biolabs) por 15 minutos a 37 °C en amortiguador de fosfatasa antártica 1x (Bis-Tris-Propano-HCl 50 mM, MgCh 1 mM, ZnCh 0,1 mM, pH 6 a 25 °C).
[0353] El fragmento Mxr1 amplificado y digerido por NotI y el vector pMx352 se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1 % en amortiguador 1x TBE (Tris 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM, pH 8,3) y se visualizaron usando la tinción de gel de ADN SYBR Safe (Life Technologies, Carlsbad, CA). Los fragmentos de ADN deseados se extrajeron del gel de agarosa y el ADN se recuperó usando el kit Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research, Irvine, CA).
[0355] El fragmento digerido mediante NotI que contenía el marco abierto de lectura de Mxr1 se introdujo en pGAB en un sitio NotI inmediatamente cadena abajo del promotor de AOX1 por ligadura. Una mezcla que contenía 137 ng de ADN digerido con NotI que codificaba el marco abierto de lectura de Mxr1 y 60 ng de pMx352 digerido con NotI y tratado con fosfatasa se incubó con 400 unidades de ADN ligasa T4 (New England Biolabs) en un amortiguador de reacción de ADN ligasa T41x (Tris-HCl 50 mM, MgCl<2>10 mM, ATP 1 mM, DTT 10 mM, pH 7,5 a 25 °C) en una reacción de 20 jL , a 16 °C, por 2 horas en una reacción de 20 jL . Se transformaron células electrocompetentesE. coliDH10B con 2 jL de la reacción de ligación y se seleccionaron transformantes resistentes a los antibióticos en placas de agar LSB suplementadas con 100 jg / jL de ampicilina. Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C. Se analizaron las colonias para detectar la presencia del inserto por PCR usando los cebadores MxO0495 y MxO0496. La secuencia del vector final se confirmó por secuenciación del ADN.
[0357] Durante la clonación, se introdujeron adicionalmente 6 aminoácidos en el N-terminal de la Mxr1. El marco abierto de lectura de Mxr1 se muestra en la sección “Secuencias de ácidos nucleicos”, con los aminoácidos residuales de la clonación subrayados. Las cepas de producción dePichiaque contenían la secuencia Mxr1 con los 6 aminoácidos adicionales en el N-terminal y las cepas dePichiaque contenían la Mxr1 de tipo silvestre (es decir, sin los 6 aminoácidos adicionales en el N-terminal) eran indistinguibles en los tanques de fermentación.
[0359] Ejemplo 16 - Construcción del vector de expresión nativo de Mxr1
[0361] Se usó como molde para la amplificación por PCR un plásmido que contenía el gen regulador de la transcripción Mxr1 bajo el control del promotor pAOX1, denominado pMX354. El extremo 3' del promotor de AOX1, el marco abierto de lectura de LegH y el terminador de AOX1 se amplificaron a partir de pMX354 usando los cebadores MxO0617 y MxO0647 que se muestran a continuación. El terminador de AOX1, el enlazador y el extremo 5' del promotor de AOX1 se amplificaron a partir de pMX382 usando los cebadores MxO0618 y Mxo0646.
[0363]
[0366] Los productos de PCR se obtuvieron y purificaron usando el kit DNA Clean&Concentrator-5 y el ADN se eluyó en 12 jL de H2O. Posteriormente se combinaron los productos de PCR purificados y se usaron como molde para una ronda subsecuente de amplificación por PCR usando los cebadores MxO0617 y MxO0618. El producto de PCR resultante estaba compuesto por el extremo 3' del promotor de AOX1, seguido del marco abierto de lectura de Mxr1, el terminador de AOX1, una secuencia enlazadora corta y el extremo 5' del promotor de AOX1. El producto de la PCR se obtuvo y purificó como se describe en la presente. El producto PCR purificado se clonó en el vector pCR™-Blunt II-TOPO® usando el kit de clonación PCR Zero Blunt® TOPO® (Invitrogen, No. Cat. K2800-20) para crear el vector pMX402.
[0368] Ejemplo 17 - Construcción de las cepas P. pastoris MXY0206 y MXY0207
[0370] El vector de expresión pMx354 Mxr1 (Figura 4B) se introdujo en la cepa MXY0183 mediante transformación del ADN (Figura 3).
[0372] El vector pMx354 (1,5 jg ) se linealizó en un sitio PmeI único en las secuencias promotoras de AOX1 por digestión con 20 unidades de la endonucleasa de restricción PmeI (New England Biolabs) por 1 hora a 37 °C en amortiguador 1x NEBuffer 4 (acetato de potasio 50 mM, Tris-acetato 20 mM, acetato de magnesio 10 mM, DTT 1 mM, pH 7,9 a 25 °C).
[0374] El vector pMX354 digerido por PmeI se purificó por electroforesis en gel recuperado usando el kit Zymoclean Gel DNA Recovery Kit, como se describe anteriormente. El vector pMX354 linealizado se introdujo en la cepa MXY0183 mediante transformación y selección en medio que contenía blasticidina. De la transformación se obtuvieron dos clones independientes, que se denominaron MXY0206 y MXY0207. La presencia de una copia adicional de Mxr1 bajo el control del promotor AOX1 en estas cepas se confirmó por PCR.
[0376] Cepa de producción MXY0291
[0378] Ejemplo 18 - Construcción de las cepas MXY0213 y MXY0260
[0380] La Figura 5 muestra los pasos seguidos para construir la cepa MXY0213 libre de marcadores antibióticos que contiene 7 enzimas de la ruta biosintética del hemo. Un trozo lineal de ADN que contenía la variante Mxr1 (6 aminoácidos extra en el N-terminal) bajo pAOX1, con homología al promotor de pAOX1 en cada extremo, se introdujo usando cotransformación (Figura 5 y Figura 6i). Este casete de expresión lineal de Mxr1 se introdujo simultáneamente en la cepa MXY213 dePichiacon el plásmido pIL75 por transformación. El vector pIL75 lleva una secuencia de replicación autónoma panARS (Liachko & Dunham, 2014,FEMS Yeast Res.,14:364-7), que permite el mantenimiento del vector plasmídico sin integración en el genoma de las células transformadas, y un marcador kanMX para la selección de transformantes con el antibiótico G418. Las células transformadas se seleccionaron en medios suplementados con G418 para detectar la presencia del marcador kanMX en el plásmido pIL75. Las transformantes dePichiase examinaron por PCR de colonias para detectar las transformantes que tomaban tanto el plásmido pIL75 como las que habían integrado correctamente el casete de expresión Mxr1.
[0381] Ejemplo 19 - Cotransformación para introducir el casete de expresión LegH en Pichia
[0383] Se usó como fuente de molde para la amplificación del gen por PCR un plásmido que contenía una variante optimizada dePichia pastorisdel gen LegH de la soja (variante 3; SEQ ID NO: 5) bajo el control del promotor pAOX1, denominado pMX399. La cadena principal del plásmido de clonación TOPO pMX401 se amplificó por PCR. El inserto y el vector se ensamblaron usando el ensamblaje Gibson (kit de ensamblaje Gibson de NEB) para generar el plásmido pMX422. Este plásmido se usó como molde para una subsecuente ronda de amplificación por PCR usando los cebadores MxO0617 y MxO0618 que se muestran a continuación.
[0385]
[0388] El producto PCR resultante estaba compuesto, en dirección 5' a 3', por el extremo 3' del promotor AOX1, seguido del marco abierto de lectura LegH var 3, el terminador AOX1, una secuencia enlazadora corta y el extremo 5' del promotor AOX1 (Figura 6ii). El producto de la PCR se obtuvo y purificó por electroforesis en gel de agarosa como se describe en la presente.
[0390] Las transformantes con el casete de expresión de LegH integrado en el genoma se analizaron por PCR y se caracterizaron por el número de copias del gen LegH usando qPCR.
[0392] Ejemplo 20 - Curado de transformantes de vectores plasmídicos con marcadores de selección
[0394] En los clones en los que se demostró que el casete de expresión LegH de soja estaba correctamente integrado por PCR de colonia y en un número elevado de copias mediante qPCR, el plásmido pIL75 necesario para la selección en G418 se eliminó relajando la selección para el antibiótico. Las transformantes se filtraron por estrías para obtener colonias individuales en medios que carecían del antibiótico G418. Dado que el plásmido panARS no se mantiene de forma estable en ausencia de selección, el pIL75 se perdió rápidamente de las células transformadas en esta condición. La cepaPichiaresultante, MXY0291, contiene secuencias para la expresión de LegH en número de copias similar a MXY0207, pero carece de secuencias heterólogas para la selección.
[0396] Cepas de producción MXY0330, MXY0333 y MXY0338
[0398] Ejemplo 21 - Construcción de la cepa MXY0306
[0399] La PCR del genotipo de la cepa MXY0291 reveló que una parte de la secuencia codificante de la CPG oxidasa se había delecionado durante el constructo de esta cepa. La región codificante de la CPG oxidasa de longitud completa se restauró por la sustitución de la copia truncada. Brevemente, se generó un fragmento lineal de ADN que contenía el promotor pAOX1 y la región codificante de la CPG oxidasa de longitud completa mediante amplificación por PCR a partir del plásmido pMX312 usando los cebadores MxO0866 y MxO0867 que se muestran a continuación.
[0400]
[0403] El fragmento lineal de ADN pAOXI-CPGoxidasa se introdujo en la cepa MXY0291 por cotransformación con el plásmido pIL75. Las transformantes se seleccionaron en medios que contenían G418 y posteriormente se analizaron por PCR para detectar la presencia de la región codificante de la CPG oxidasa de longitud completa. Se identificó un aislado que contenía la CPG oxidasa de longitud completa y subsecuentemente se curó del vector plásmido requerido para la selección en G418 como se describió anteriormente. Esta cepa se denominó MXY0306 (ver la Figura 5).
[0405] Ejemplo 22 - Constructos lineales para cepas promotoras híbridas
[0407] La variante 3 de LegH se expresó bajo la dirección de cada uno de los tres promotores constitutivos nativos dePichia pastorisindicados en la presente. Los constructos lineales se muestran en la Figura 7, y contenían la mitad 3' del promotor, seguido de LegH var3, seguido del terminador de transcripción FDH1. Inmediatamente después se colocó el casete de resistencia a los antibióticos que contenía el promotor pTEF deAshbya gossypii,el gen de la acetamidasa (amdS) deAspergillus nidulansy el terminador TEF deAshbya gossypii.Por último, el constructo contenía la mitad 5' del promotor. Este casete lineal se amplificó usando los cebadores oligonucleotídicos enlistados en la Tabla siguiente para generar constructos que contienen varios cientos de pares de bases en los extremos 5' y 3' que son homólogos al promotor respectivo en el genoma nativo dePichia.
[0409] Cebadores usados para amplificar los constructos lineales
[0411]
[0414] Se transformaron células MXY0306 competentes con cada uno de los casetes lineales y se seleccionaron las transformantes que contenían el casete de selección amdS basándose en su capacidad para crecer en placas de agar que contenían acetamida como única fuente de nitrógeno. Estas cepas se purificaron, aislaron y la presencia de LegH bajo el control del promotor constitutivo se verificó por PCR (Figura 5).
[0415] Ejemplo 23 - Secuencias de ácidos nucleicos
[0417] Secuencia de ácido nucleico de Mxr1 (los nucleótidos subrayados codifican 6 aminoácidos en el extremo N introducidos durante la clonación) (SEQ ID NO: 1) ATGCGAGACCGCGGCCGCATGAGCAATCTACCCCCAACTTTTGGTTCCACTAGACAATCTCCA GAAGACCAATCACCTCCCGTGCCCAAGGAGCTGTCATTCAATGGGACCACACCCTCAGGAAAG CTACGCTTATTTGTCTGTCAGACATGTACICGAGCATTTGCTCGTCAGGAACACTTGAAACGA CACGAAAGGTCTCACACCAAGGAGAAACCTTTCAGCTGCGGCATTTGTTCTCGTñAATTCAGC CGTCGAGATCTGTTATTGAGACATGCCCAAAAACTGCACAGCAACTGCTCTGATGCGGCCATA ACAAGñCTAAGGCGCAAGGCAACTCGTCGGTCTTCTAATGCCGCGGGTTCCATATCTGGTTCT ACTCCGGTGACAACGCCAAATACTATGGGTACGCCCGAAGA"GGCGAGAAACGAAAAGTTCAG
[0418] AAAC TGGCCGGCCGCCGG GAC T CAAAT GAACAG AAAC T G CAAC T G CAACAACAACAT C TACAG CAACAACCACAGT T GCAATACCAACAAT C T C T TAAGCAGCACGAAAAT CAAGT C CAGCAGCCT GAT CAAGATCCAT T GATAT CCC C GAGAATGCAAT TAT TCAACGAT TCCAACCAT CACGTAAAC AATTTGTTTGATCTTGGACTAAGAAGAGCTTCCTTCTCCGCCGTTAGTGGAAATAATTATGCC CAT T AT G TGAATAAT TT T CAACAAGAT GCCTCTTCTACCAAC1 CC AAAT CAAGAT TCAAATAAT GCCGAATTTGAGAATATTGAATTTTCTACCCCACAAATGATGCCCGTTGAAGATGCTGAAACT TGGATGAACAACATGGGTCCAATTCCGAACTTCTCTCTCGA"GTGAACAGGAACATTGGTGAT
[0419] AGC T TTACAGATATACAACACAAGAAT T CAGAGCCTATTATATCC GAAC C GCC CAAGGACACC GCTCCAAACGACAAGAAGTTGAATGGCTACTCTTTTTACGAAGCCCCCATCAAGCCATTAGAA TCCCTATTTTCTGT CAGC- AAT AC AAAGAGAAAC AAG T AT AAAAC AAAT GAC GAC T CT C CAGAC ACCGTGGATAATAACTCCGCACCGGCTGCTAATACCATTCAAGAñCTTGñGTCTTCTTTGAAT GCATCCAAGAATTTTTGCTTGCCAACTGGITATICCTTCTACGGTAATTTGGACCAACAGACT TTCTCTAACACGTTATCATGCACTTCTTCTAATGCCACAATCTCGCCCATTCTACTCGATAAC T C CAT TAATAATAAC TCCAC TAG TGAC G T GAGACCAGAAT T TAGAACACAAAGT G TCAC C TC T GAAATGAGTCAAGCCCCTCCCCCTCCTCAAAAAAACAACTCGAAATATTCCACCGAAGTTCTT TTTACCAGCAACATGCGGTCGTTTATTCACTACGCTCTTTCCAAGTATCCTTTTATTGGTGTG CCCACTCCAACTCTTCCC-GAGAACGAAAGACTAAATGAATATGCTGATTCATTCACCAACCGT TTCTTAAATCATTATCCTTTCATACATGTCACGATTCTCAAAGAATACTCCCTTTTCAAGGCA AT T T TAGATGAGAATGAG T CGAC TAAGAACT GGGAAAATAATCAGTTT TAC T TAGAGAACCAA CGAATATCAATTGTTTGTCTTCCTCTTTTGGTGGCTACGATAGGTGCAGTACTATCAAACAAC AAAAAGGATGCTTCGAATTTATACGAAGCITCAAGGCGTTGCATTCATGTTTACTTAGATTCC AGGAAAAAGATACCCACTTCCTTGTCCGCAAATAACAATGACTCTCCACTTTGGCTAATTCAA TCCCTGACGTTATCTGTTATGTATGGGTTATTTGCGGACAACGACATTAGTTTGAATGTCGTG ATCAGACAAGTTAACGCACTTAATTCTCTGGTCAAGACTTCGGGCCTGAATAGGACCTCAATT ATAGAT C T T T T CAACAT CAACAAAC C T T T GGATAAT GAAC T C TGGAATCAAT T C G TGAAAATA GAGTCCACCGTAAGGACAATCCACACGATTTTTCAAATCAGTTCCAACTTAAGCGCCTTGTAC AATATTATTC CAT C G T T C-AAAAT T G AT GAC C T AAT G AT T AC T C T ACCAGT T C C C ACAACAC T T TGGCAAGCTGATTCTTTTGTGAAATTCAAAAGTCTAAGTTACGGAAATCAGATCCCTTTTCAA T ATAC AAGAG TAC T AC AC-AAT T T GAT T GAT TAC AAT CAGC CAT T GAGCGATGGAAAAT T T T T G TATGAAAACCATGTAAGTGAGTTTGGACTCATATGCCTACAGAATGGTCTACACCAATACAGC TAT T T C CAAAAAT T GAC T G C T G T CAATAACAGAGAAGAT G C GC TAT T CACAAAGG T T G T TAAT TCACTTCACAGTTGGGATAGGATGATTTCGAATTCTGATTTGTTTCCAAAGAAGATATATCAG CAGAGTTGCTTGATTTTC-GACTCAAAGTTGCTTAATAATTTCCTGATTGTCAAGAGCTCATTG AAAGTTTCGACCGGAGACGTTAGTTCTTTGAATAAGTTAAAAGAAAACGTGTGGCTTAAAAAC TGGAATCAAGTGTGTGCTATCTATTATAACAGCTTCATGAACATTCCTGCTCCCAGTATTCAA AAGAAG TACAATGACATAGAGT T TGT GGAT GACAT GAT TAAT T T GAGT C TAAT CATCATCAAG AT TAT GAAAC T CAT T T T C TATAACAAT G T CAAAGACAAT TAT GAGGAT GAAAAT GAC T T CAAA T T GCAAGAGT TAAAT TTAACATT TGACAATT T TGAT GAGAAAATATCCT T GAAT T TGACAATA T T AT T C GAT AT AT T T T T C-AT GAT C T ACAAGAT AAT TAC CAAT TAC GAAAAG T T T AT GAAGAT C AAACACAAG T T TAAT TAC TACAATTCTAAT T C GAATATAAGC T T C T TGCATCAT T TCGAAC T C TCCTCGGTTATCAATAACACCCAAATGAACCAGAATGATTATATGAAAACAGATATTGATGAA AAGCTTGATCAGCTTTTCCACATCTATCAAACATTTTTCCGGCTGTATCTGGATTTAGAAAAG T T TAT GAAG T T CAAAT T CAAC TAT CAT GACT T TGAGACAGAG T T T TCAAGTCT C TCAATATC C AATATACTGAACACTCATGCTGCTTCTAACAATGACACAAACGCTGCTGATGCTATGAATGCC AAGGATGAAAAAATATC T CCCACAACTT T GAATAGCGTATTAC T TGCT GATGAAGGAAATGAA AATTCCGGTCGTAATAACGATTCAGACCGCCTGTTCATGCTGAACGAGCTAATTAATTTTGAA GTAGGTTTGAAATTTCTCAAGATAGGTGAGTCATTTTTTGATTTCTTGTATGAGAATAACTAC AAG T T CAT C CAC T T CAAAAACT TAAAT GACGGAAT GT TCCACAT CAGGATATACC TAGAAAAC CGACTAGATGGTGGTGTCTAG
[0420] Secuencia de la proteína Mxr1 (los 6 aminoácidos subrayados en el extremo N introducidos durante la clonación) (SEQ ID NO: 2)
[0421] MRDRGRM SNLPPTFGSTRQSPEDQSPPVPKELS FNGTTPSGKLRLFVCQTCTRAFARQEHLKR H ERSH TKEKPFSCGICSRKFSRRDLLLRH AQ KLH SNCSDAAIIRLRRKATRRSSN AAGSISGS TPVTTPNTMGTPEDGEKRKVQKLAGRRDSNEQKLQLQQQHLQQQPQLQYQQSLKQHENQVQQP DQDPLISPRMQLFNDSNHHVNNLFDLGLRRASFSAVSGNMYAHYVNNFQQDASSTNPNQDSNN AEFENIEFSTPQMMPVEE'AETW MNNMGPIPNFSLDVNRNIGDSFTDIQHKNSEPIISEPPKDT APNDKKLNGY S FYEA PIKP LE S L FSVRNT KRNKYKTNDDSPD TVDNNSAPAANTIQE LE S S LN ASKN FCLPTGYSFYG N LD Q Q TFSM TLSCTSSN A TISPILLD N SIN N N STSD V RPEFRTQ SV TS EM SQAPPPPQKNNSKYSTEVLFTSNM RSFIHYALSKYFFIGVPTPTLPENERLNEYADSFTNR FLNH YPFIHVTILKEYSLFKAILDENESTKNW ENNQFYLENQRISIVCLPLLVATIGAVLSNN KKDASNLYEASRRCIHVYLDSRKKIPTSLSANNNDSPLW LIQSLTLSVM YGLFADNDISLNW IRQ V NALN SLV KTSGLN RTSIID LFN LN KPLD N ELW N Q FV KIESTV RTIH TIFQ ISSN LSA LY NIIPSLKIDDLM ITLPVPTTLW Q ADS FVKFKSLSYGNQIPFQYTRVLQNLIDYNQPLSDGKFL YENHVSEFGLICLQNGLHQYSYFQKLTAVNNREDALFTKW NSLHSW DRMISNSDLFFKKIYQ QSCLILESKLLNNFLIVKSSLKVSTGDVSSLNKLKENVW LKNW NQVCAIYYNSFM NIFAPSIQ KK YN D IEFV DD M INLSLIIIKIM KLIFYNN VKDNYED ENDFKLQ ELN LTFDNFDEKISLNLTI LFDIFLM IYKIITNYEKEM KIKHKFNYYNSNSNISFLHHFELSSVLNNTQM NQNDYM KTDIDE KLDQLFHIYQTFFRLYLDLEKFMKFKFNYHDFETEFSSLSISNILNTHAASNNDTNAADAMNA KDEKISPTTLNSVLLADEGNENSGRNNDSDRLFM LNELINFEVGLKFLKIGESFFDFLYENNY KFIHFKNLNDGMFHIRIYLENRLDGGV^
[0423] Secuencia de ácido nucleico de LegH optimizada para codones dePichia pastoris(SEQ ID NO: 3) ATGGGTGCTTTCACCGÁGAAGCAGGAAGCACTTGTTTCCTCTTCGTTCGAAGCTTTTAAGGCT AACATCCCTCAATACGCTGTTGTGTTTTACACGTCCATTCTAGAAAAAGCTCCTGCTGCCAAG GACCTCTTCTCTTTTCTGTCCAACGGTGTAGATCCATCCAATCCCAAATTAACAGGTCACGCT GAGAAATTGTTCGGTETAGTCAGAGATAGCGCTGGACAATTGAAAGCAAATGGTACTGTGGTT GCTGATGCTGCCTTGGGCAGCATCCATGCACAGAAGGCAATTACAGACCCACAATTTGTTGTT GTGAAGGAAGCTCTGCTTAAAACTATAAAGGAAGCCGTCGGAGACAAATGGAGTGACGAGTTG TCATCAGCTTGGGAGGTAGCTTATGATGAGTTGGCCGCAGCAATCAAAAAGGCATTCTAA
[0425] Secuencia de aminoácidos de LegH optimizada para codones dePichia pastoris(SEQ ID NO: 4)
[0426] M G AFTEKQEALVSSSFEAFKANIPQYSW FYTSILEKAPAAKDLFSFLSNGVDPSNPKLTGH A EKLFGLVRDSAGQLKANGTW ADAALGSIHAQKAITDFQFVW KEALLKTIKEAVGDKW SDEL SSAWEVAYDELAAA IKKAF
[0428] Secuencia de ácido nucleico de la variante 3 de LegH optimizada para codones dePichia pastoris(SEQ ID NO: 5) ATGGGTGCATTTACAGAAAAACAAGAGGCTTTAGTATCCTCATCTTTTGAAGCTTTCAAAGCC AATATTCCTCAATACECCGTTGTTTTCTATACGTCCATTTTGGAAAAGGCTCCAGCAGCTAAG GACCTTTTCTCTTTCGTGTCGAACGGCGTGGATCCCTCAAATCCTAAGCTGACTGGTCACGCC GAGAAGCTTTTTGGTGTGGTCAGAGACAGCGCCGGACAGCTGAAAGCTAACGGTACAGTTGTG GCAGATGCTGCCTTGGGATCTATACATGCACAAAAGGCTATCACCGACCCACAGTTTGTGGTT GTAAAAGAGGCTCTACTCAAAACTATCAAGGAAGCAGTTGGTGACAAATGGAGCGATGAATTG TCCAGTGCATGGGAGGTCGCTTACGATGAGTTAGCTGCTGCAATCAAAAAGGCTTTCTAA
[0430] Secuencia de aminoácidos de la variante 3 de LegH optimizada para codones dePichia pastoris(SEQ ID NO: 6) M G AFTEKQEALVSSSFEAFKANIPQYSW FYTSILEKAPAAKDLFSFLSNGVDPSNPKLTGH A EKLFGLVRDSAGQLKANC-TWADAALGSIHAQKAITDFQFVW KEALLKTIKEAVGDKWSDEL
[0431] S SAWEVAYDE LAAAIKKAF
[0432] Promotor pAOX1 dePichia pastorís(SEQ ID NO: 7)
[0433] GAT C TAACAT C CAAAGACGAAAGGTT GAATGAAACCTTTTTGCCATCCGACATCCACAGGTCC ATTCTCñCACATAAGTGCCAAACGCAACAGGñGGGGATACñCTAGCAGCñGACCGTTGCAAAC GCAGGACCTCCACTCCTCTTCTCCTCAACACCCACTTTTGCCATCGAAAAACCAGCCCAGTTA TTGGGCTTGATTGGAGCTCGCTCATTCCAATTCCTTCTATTAGGCTACTAACACCATGACTTT ATTAGCCTGTCTATCCTGGCCCCCCTGGCGAGGTTCATGTTTGTTTATTTCCGAATGCAACAA GCTCCGCATTACACCCGAACATCACTCCAGATGAGGGCTTTCTGAGTGTGGGGTCAAATAGTT TCATGTTCCCCAAAIGGCCCAAAACTGACAGTTTAAACGCIGTCTTGGAACCTAATATGACAA AAGCGTGATCTCATCCAAGATGAACTAAGTTTGGTTCGTTGAAATGCTAACGGCCAGTTGGTC AAAAAGAAACTTCCAAAAGTCGGCATACCGTTTGTCTTGTTTGGTATTGATTGACGAATGCTC AAAAATAATCTCATTAATGCTTAGCGCAGTCTCTCTATCGCTTCTGAACCCCGGTGCACCTGT GCCGAAACGCAAATGGGC-AAACACCCGCTTTTTGGATGATTAIGCATTGTCTCCACATTGTAT GCTTCCAAGATTCTGGTC-GGAATACTGCTGATAGCCTAACGTTCATGATCAAAATTTAACTGT TCTAACCCCTACTTGACAGCAATATATAAACAGAAGGAAGCTGCCCTGTCTTAAACCTTTTTT TTTATCATCATTATTAGCTTACTTTCATAATTGCGACTGGTTCCAATTGACAAGCTTTTGATT T TAAC GAC T T T TAAC GACAAC T T GAGAAGATCAAAAAACAAC TAAT TAT T CGAAACG
[0435] Promotor pGAP dePichia pastoris(SEQ ID NO: 8) CGACTATTATCGATCAATGAAATCCATCAAGATTGAAATCTTAAAATTGCCCCTTTCACTTGA CAGGATCCTTTTTTGTAC-AAATGTCTTGGTGTCCTCGTCCAATCAGGTAGCCATCTCTGAAAT ATCTGGCTCCGTTGCAACTCCGAACGACCTGCTGGCAACGTAAAATTCTCCGGGGTAAAACTT AAATGTGGAGTAATGGAACCAGAAACGTCTCTTCCCTTCTCTCTCCTTCCACCGCCCGTTACC GTCCCTAGGAAATTTTACTCTGCTGGAGAGCTTCTTCTACGGCCCCCTTGCAGCAATGCTCTT CCCAGCATTACGTTGCGGGTAAAACGGAGGTCGTGTACCCGACCTAGCAGCCCAGGGATGGAA AAGTCCCGGCCGTCGCTC-GCAATAATAGCGGGCGGACGCATGTCATGAGATTATTGGAAACCA CCAGAATCGAATATAAAAGGCGAACACCTTTCCCAATTTTGGTTTCTCCTGACCCAAAGACTT TAAATT TAATT TAT TTGTCCCTATTTCAAT CAAT T GAACAACTAT CAAAACAC G
[0437] Promotor pGCW14 dePichia pastoris(SEQ ID NO: 9) CAGGTGAACCCACCTAACTATTTTTAACTGGGATCCAGTGAGCTCGCTGGGTGAAAGCCAACC ATCTTTTGTTTCGGGGAACCGTGCTCGCCCCGTAAAGTTAATTTTTTTTTCCCGCGCAGCTTT AATCTTTCGGCAGAGAAGGCGTTTTCATCGTAGCGTGGGAACAGAATAATCAGTTCATGTGCT ATACAGGCACAT GGCAGCAGT CAC TAT TTTGCTTTTTAAC C TTAAAGT CGTTCATCAATCAT T AACTGACCAATCAGATTTTTTGCATTTGCCACTTATCTAAAAATACTTTTGTATCTCGCAGAT ACGTTCAGTGGTTTCCAC-GACAACACCCAAAAAAAGGTATCAATGCCACTAGGCAGTCGGTTT TATTTTTGGTCACCCACC-CAAAGAAGCACCCACCTCTTTTAGGTTTTAAGTTGTGGGAACAGT AACACCGCCTAGAGCTTCAGGAAAAACCAGTACCTGTGACCGCAATTCACCATGATGCAGAAT GT TAAT T TAAAC GAGTGCCAAATCAAGAT T T CAACAGACAAAT CAATCGATCCATAGT TACCC ATTCCAGCCTTTTCGTCGTCGAGCCTGCTTCATTCCTGCCTCAGGTGCATAACTTTGCATGAA AAG T C CAGAT TAGGGCAGAT T T T GAGTTTAAAATAGGAAATATAAACAAATATACCGC GAAAA AGGTTTGTTTATAGCTTTTCGCCTGGTGCCGTACGGTATAAATACATACTCTCCTCCCCCCCC TGGTTCTCTTTTTCTTTTGTTACTTACATTTTACCGTTCCGT'CACTCGCTTCACTCAACAACA AAA
[0439] Promotor pTEF1 dePichia pastoris(SEQ ID NO: 10) ATAACTGTCGCCTCTTTTATCTGCCGCACTGCATGAGGTGTCCCCTTAGTGGGAAAGAGTACT GAGCCAACCCTGGAGGACAGCAAGGGAAAAATACCTACAACTTGCTTCAT/ATGGTCGTAAAA ACAATCCTTGTCGGATATAAGTGTTGTAGACTGTCCCTTATCCTCTGCGATGTTCTTCCTCTC AAAGTTTGCGATTTCTCTCTATCAGAATTGCCATCAAGAGACTCAGGACTAATTTCGCAGTCC CACACGCACTCGTACATGATTGGCTGAAATTTCCCTAAAGAATTTcTTTTTCACGAAAATTTT TTTTTTACACAAGATTTTCAGCAGATATAAAATGGñGAGCAGGACCTCCGCTGTGACTCTTCT TTTTTTTCTTTTATTCTCACTACATACATTTTAGTTATTCGCCAAC
[0440] Enzima de biosíntesis del hemo 1- ALA sintasa (SEQ ID NO: 11) ATGGAGTTTGTCGCCCGTCAGTCCATGAATGCCTGTCCCTTCGTCAGGTCAACTTCTACCCAC CATTTGAAGAAGTTGGCAGCAAACAGTTCTCTAGCTGCTACCGCTAGTCATTGTCCCGTGGTT GGCCCTGCTCTCCAACAC-CAGAGATACTACTCTCAACCTTCCAAGCCAGCCCAAGCCCAAACC TCCGACATTGCTACTGGGATCAAGAAGGATGTTTCTCCGATCCGTATGGACTCTAATGAAACC GCCTTTGATTACAATGGAATGTATGAGTCTGATCTTGCGAAGAAACGTAAAGATAACTCGTAT C G T TAT T T CAATAACATCAACCGTCTAGCCAAGGAGT T T C CCAAGGCACATCGC CAGAC CGAA GATGACAAGGTGACCGTCTGGTGCTCTAACGACTACTTAGGAATGGGTAGGCATCCTGAGATT ATCAAAACCATGAAGGCTACCATGGACAAGTACGGTTCCGGAGCAGGAGGAACTAGGAACATT GCAGGTCATAACCACGCCGCTATCAATTTGGAAAGCGAGTTGGCTTGCTTGAACAAGAAGGAA GCGGCTCTGGTGTTTTCATCATGTTTCATAGCTAACGATGCAATCATCTCGTTGTTGGGACAA AAAATCAAAAATTTGGTCATTTTCTCTGACCAGTCGAATCATGCTTCCATGATATTGGGTGTG C G TAAC TCCAAAGC GAAGAAGCACAT CT TCAAGCACAACAAT T T GAAGGATC T GGAGT C GCAG TTAGCTCAGTACCCCAAGTCGACTCCTAAACTGATCGCCTTCGAGTCAGTTTACTCTATGTGT GGATCTGTGGCTCCCATTGAGAAGATTTGCGATTTGGCTAAAAGGTACGGTGCCCTCACCTTC TTGGATGAAGTTCATGCTGTTGGAATGTATGGTCCTCATGGACAGGGTGTAGCTGAGCATTTG GACTTTGATCTGCATTTACAGTCTGGAATCGCCAGTCCTAGCGTGGTGGACAAACGCACCATA TTGGATCGTGTCGACATGATTACTGGTACTTGCGGAAAGTCATTTGGTACTGTTGGAGGTTAC GTTGCTGGTAGTGCCAACCTAATTGATTGGTTAAGATCCTATGCGCCAGGTTTCATTTTCACT ACCACACTTCCTCCTGCTATCATGGCTGGTACAGCCACTTC^GTTCGTATTGTTAGGGCCGAC ATTGAGGCCCGTATCAAGCAACAGCTTAATACTCGCTACGTCAAAGACTCATTTGAAAACCTT GGTATTCCAGTCATTCCAAACCCAAGTCAX1ATTGTTCCTGTTCTAGTTGGAAATGCTGCAGAT GC CAAGAñG G CAT C C G AT AT GT TAAT GAACAAAC AC C G T AT T1 T AT G T T CAAGC T AT TAAC TAC CCTACTGTGCCTGTCGGTGAAGAACGACTAAGGATTACTCCCACTCCAGGTCATGGAAAGGAG ATTTGTGACCAGCTGATCAGCGCTGTCGACGATGTTTTTACTGAGCTTAATTTACCAAGAATC AACAAATGGCAGTCCCAAGGTGGTCATTGCGGTGTTGGTGATGCTAATTACGTACCAGAACCC AATCTGTGGACTCAGGACCAGCTCAGCTTGACAAACCAAGACTTGCACTCCAATGTGCACAAC C CAG T GAT T GAG CAGAT CGAAACCT CAT CAGGAGTCAGATT GTAG
[0442] Enzima de biosíntesis del hemo 2- ALA deshidratasa (SEQ ID NO: 12) ATGGTGCATAAGGCTGAATACTTGGACGACCACCCAACTCAGATTTCCAGCATTCTTTCAGGA GG T TACAAC CAC CCATTACTTCGTGAAT GGCAACATGAACG CCAAC TCAACAAAAACATGT T C ATCTTTCCCCTGTTTGTCACAGATCGACCAGACGAAGAAGflACTTATTCCTAGTCTACCTAAT ATCAAGAGGTTTGGCGTTAACAAGTTGATTCCTTATGTAGGAGGTTTGGTTTCCAAAGGATTG AGGGCGGTGATCCTATTTGGTGTTCCTCTGAAGCCCGGTGTGAAAGATGAAGAAGGAACGGCC GC T GAT GAT C CAGAGGGAC C T G T TAT C CAAGC CAT CAAACAC T T GAGAAAGAAC T T T C C T GAC C T G TATAT CATCAC CGAT GTCTGTCTATGTGAG TACACCAGCCAT GGACAT TGTGGAATACTA TATGAGGATGGCACTATCAACAGAGAGCTCTCAGTCCGTCGTATTGCTGCTGTAGCTGTCAAA TAIGCTCAAGCTGGAGCCAACTCTGTGGCTCCTICTGATATGACTGACGGCAGAATAAGAGAT ATIAAAGAAGGCTTACTAAGTGCAGGACTGGCACATAAAACGTTTGTTATGICCTACGCTGCA AAATTCTCTGGTAATTTGTATGGCCCTTTCAGAGATGCTGCAGGTTCCTGTCCATCTCAAGGG GACAGAAAATGTTACCAGCTTCCTTCTGGAGGAAAAGGGTTGGCCCATCGTGCTCTGATTCGT GATAT GAAT G AAGGC AC T GAT GGAAT T AT T G T C AAAC CAT C TAC AT T C T AT T T GG ACAT T G T C GCTGATGCTTATCAGCTTTGTAAAGACTATCCTATCTGCTGCTACCAGGTTTCTGGAGAGTAC GCCATGCTACATGCAGCGGCAGAGAAGAATATTGTTGATCTGAAATCAATCGCTTTTGAAGCT CATCAAGGATTCTTGCCCCCTGGAGCTCCTTTAAT CAT TAC T1 TAC TTTAJCCCCT GAAT TCCTC GAGTGGTTATCTGAATGA
[0443] Enzima de biosíntesis del hemo 3- Porfobilinógeno deaminasa (SEQ ID NO: 13) ATGAACCAAATCGAACAC-AGCGGACCCATTGATTGCAGTTCCTTGAAATTGGGGTCCCGAAAG TCCGCTCTGGCTATAATCCAGGCAGAAATCGTCCGCCAATTGATATTGAAAGAATACCCTGAA TTGGAGñCGAAGTTGGTCAGTGTGTCCACCCTGGGGGACCñAGTCCAGAATAAAGCACTTTTC ACGTTTGGAGGAAAATCTTTGTGGACCAAAGAACTTGAGATGTTGTTGTTGGAGAGTGTGGGA G GAT T T GAC CAAATAGACAT GAT T GTACAC T C G T T GAAAGACATGCCAACTCAT T TAC CAGAC GAATTTGAGCTGGGTTGCATTATTGAAAGAGAAGACCCTAGAGACGCTTTGGTCGTGCAAGAT GGTTTATCTTACAAGTCATTGGCCGACCTTCCAGAGGGAGCCGTGGTCGGTACGTCTTCGGTT AGAAGATCGGCTCAACTACTGAAGAATTTCCCTCATCTGAAATTCAAATCTGTTAGAGGAAAC CTTCAGACCAGACTAAGAAAATTAGATGATCCAGATTCCGAGTACTGCTGTCTCCTCCTTGCA GCAGCCGGTTTAATCAGC-ACAGGCTTACAACACAGAATTTCAAIGTATTTGAACGACGATGTG ATGTACCACTCCGTCGGACAAGGAGCATTAGGAGTAGAGATCAGAAAAGGTGACCAATTCATG AAAAATATCTGTGAAAA.CATTGGGCATAGAACCACCACCCTCCGTTGTCTTGCAGAGAGAGCA CTGCTGAGATATCTAGAC-GGAGGCTGCTCGGTGCCAATTGGGGTCTCCACTATTTATAGCGAG GATACGAAGGAACTTACCATGAACTCCCTAGTCGTCAGTTGTAACGGTCGTGACTCGGTAACA GAATCAATGACTGAAGTCGTGACTACTGAAGAGCAAGCTGAAGATTTCGGTGAAAGGCTGGCC CAGAAC C T CATAGAT CAAC G T G C GAAACGCAT TC T T GACGAGATCAACT T CAACAACATCAAA GAGAT T AAG G AAGAGGG T T TACAT TAA
[0445] Enzima de biosíntesis del hemo 4- Uroporfirinógeno III sintasa (SEQ ID NO: 14) ATGCCAAAAGCCATTCTTCTGAAGAATAAAACTACACCGAAGGATCCTTATCTGGAGAACTTC GTAAGTAGTGGCTACTCGACCGATTTCGTACCACTTTTAGACCATATTCACATGGAGAAATCT GAGATCATC.GCATTTCTCAAGACTGACTACTTTTTGCATAAAACTTTGGCGTTTATTATTACG
[0446] T C C CAAAGAGCT GTAGAAAT GC T GAAT GAGT GTAT GCAAATAC T GAGAC GTAC T GAT C C TGAA AT TACAGAAAT CAT C TATAGTAAAC C T G T C TATACAG T T G GC C C T GC CAC C TACAGAATAC T T GCGGATGCTGGCTTCGTC-GATCTACGAGGCGGAGATAAGGCAGGAAACGGATCCATTCTAGCC CAGATAAT T T T GAATGAT GACAT T TACACT GGAATT GAAGAT T C T GACAAGCATATAAC GT T T T T CAC GGGAG AAAC AAGC-AGAGAC AT AAT T C C CAAAT GTTTACTCTC T AAC AAC T T T CAAC T T
[0447] TAC GAAAAGAT T G T C TACAAGAC TCTTCCTAGGGATGATATCG T GACTAGAT T CAAGT C TGCC GTTGACAGCATCGACCAATCGCAAAGAAGTTCCAGTTGGGTGGICTTCTTTTCGCCTCAAGGA ACAGAGGACATTGTAACC-TAT C T TCAACACACCAAAGACCAAT T TAATAT TGCATCTAT CGGG
[0448] C CAAC CACAGAAAAATAC C T T C TAAG CAAAAAC C TGAAAC CAAAAG TT GT GGCACCTAAGCCA GAGCCTATCTCTTTACTATTGTC TATACAAAAAGT GCACTAA
[0450] Enzima de biosíntesis del hemo 5- Uroporfirinógeno III descarboxilasa (SEQ ID NO: 15) ATGAGTAGATTTCCAGAACTGAAGAATGACCTTATTTTAAGGGCAGCTCGTGGTGAAAAAGTT GAACGTCCCCCAATATGGATTATGAGACAGGCCGGAAGATACCTTCCGGAGTACCATGAGGTC AAAGGAGGTAGGGACTTCTTTGAAACTTGCAGGGATGCTGAGATTGCTTCTGAAATTACTATC CAGCCGATTACGCATTTTGACGGTCTGATCGATGCAGCTATCATCTTCAGTGATATCTTGGTG ATTCCTCñAGCTATGGGCñTGGAAGTTñAGATGGTGGñCAAAGTTGGCCCACAGTTCCCCAAT CCGCTAAGAAAACCGTCTGACTTGGATCATTTGAAAAAAGACGTTGACGTTTTGAAGGAACTC GATTGGGCCTTCAAAGCTATCTCATTGACCAGAAAAAAACTCAATGGACGAGTGCCTTTGCTT GGATTTTGTGGTGCTCCTTGGACTCTACTGGTTTATATGACTGAAGGAGGCGGTACCAAGATG TTTCGATTTG CAAAAGAG TGGATCTACAAGTT TACCAAGGAAT C T CAT CAAT TAC TCCAACAG ATCACTGACGTTGCAGTTGAATTCTTAGCTCAGCAAGTTGTTGCAGGTGCCCAAATGTTACAA GTTTTTGAATCTTGGGGCGGTGAATTGGGGCCTGATGAATTCGATGAGTTTTCTTTGCCTTAT TTGAGACAGATTTCCTCTAAACTTCCCCTGAGGTTGAAGGAACTTGGAATCACAGAGAATGTT CCCATAACTGTCTTTGCTAAAGGCTCTTGGTACGCCTTGGAGCAATTGTGCGACAGTGGTTAT GATGTTGTCTCGTTGGATTGGTTATTCCGTCCAAGTGATGCTGTCCAGATTGCTAACGGAAGA ATCGCATTGCAAGGTAAT C T T GACCOT GGAAC CAT GTACGGC T C CAAAGAAAC CATT T C GAAG AAAC T G GACAAAAT GAT CAAC CCTTTTGGTGGAGCAAACCAAAAC TACAA AAT TAAT T T TGCA CACGGCACTCATCCATTCATGGATCCAGAACAGATCAGATGGTTCTTACAAGAATGTCATCGC ATTGGATCTCAATAG
[0451] Enzima de biosíntesis del hemo 6- Coproporfirinógeno III oxidasa (SEQ ID NO: 16) ATGGCCATCGACTCTGATATCAATCTAAGCTCTCCCAATGACTCCATCCGTCAAAGGATGTTC GAGCTTATCCAGCGGAAC-CAACTCGAAATTGTCGCTGCATTGGAGGCAATTGAAGGAAACGAT ACCAAATTTCGTTCTGATTCTTGGGAAAGAGGAGCCGAAGGTGGAGGAGGAAGATCTATGCTT ATICAAGATGGAAGAGTGTTTGAAAAGGCTGGTGTAAATATCTCCAAGGTTCATGGCGTATTG CCTCCTCAAGCTGTGAGCCAGATGAGAAATGACCACTCCAAGCTAGATCTGCCTGCGGGAACC TCTCTGAAGTTCTTTGCCTGTGGGCTTTCGTTGGTCATTCATCCCCATAATCCCCATGCTCCA ACTACCCATCTGAATTATCGCTACTTCGAAACTTGGGATGAAACTGGAAAGCCTCACACCTGG TGGTTTGGGGGCGGTGCTGATTTAACGCCTTCGTACCTGTATCCCGAGGATGCCAAGCAATTC CATCAAGCCCATAAGGATGCCCTGGACAAACACGATGTTAGCTTGTACCCGAGATTCAAAAAG TGGTGTGATGAATACTTTCTGATCAAACATCGAAATGAAACCAGAGGTA.TTGGGGGTATTTTC TTTGATGATTTTGACGAGTTTGATGCTGAGAGGTCCCTGAAGTTGGTTGAAGATTGTTTCAAT GCTTTCTTGGAATCTTATCCCGCTATCACTCGAAAAAGGATGGACACCCCTTCAACTGATGCT GAGAAGAAC T GG CAACAAAT TAGAAGAGGAAGATAT GTCGAATT CAACTTAGTATTGGATAGA GGTACTCAATTTGGTTTGAGAACGCCTGGATCTCGTGTTGAAAGTATTTTGATGTCGTTGCCA AGAACAGCTGGTTGGGTCTATGATCATCATCCAGAGCCTGGCTCCAGAGAAGAGGAGTTATTG CAGGTACTACAAAATCCTATTGAATGGGTATGA
[0453] Enzima de biosíntesis del hemo 7- Protoporfirinógeno oxidasa (SEQ ID NO: 17) ATGCTGAAAAGTCTTGCACCAAATTCCTCAATTGCCGTTTTAGGTTCAGGGATATCTGGATTG ACTTTCAGCTTTTTTTTGAATCGGTTGCGTCCCGATGTTAAGATCCATATCTTTGAAAAATCC AAGCAGGTTGGAGGATGGATCAGATCAGAAGAGCATGAAACCITTCATTTTGAAAAGGGACCC AGAACTTTGAGAGGCACAAATACGGGTACCTTGATGTTGTTGGATCTTCTTACCAAGATAGGA GCAAATGACAAGGTCCTGGGACTGCACAAAGATTCTCTTGOTAATAAAAAGTATCTGTTGTCC CCGTTCTCAGATGTTCACGGAAACAACGCAAAGCTTCTTCAAGTGCCACAGGATTTCAGCTCT TTTGTAAAGTTCATGTTTGACCCGTTGTCTAAGGATCTCATTCTCGGTCTTTTGAAAGAACCA TGGCAACCAAAATTAAAGTATTCAGATGAGTCGGTTGACCACTTTTTCAACAGAAGATTTGCT ACCAAACTATCAGAGAATATCGTCAGCGCAATTGTGCATGGAATCTATGCGGGCGACGTGAAG AAGTTAAGTGTGAAAGCCATCTTCCCTAGGCTCCCTGAGATGGAACAGGAAAGTGGCTCTATT ATAAGG TATAT GAT C GCC CAATACAGGACAAAAAAGAAC G T CAAACAAAAAG T T GAC C C T T T T TTGGCAGATTATGAAAAATTGATCGGTACATCTTTGAGTTTCAAAAATATTTCTTTGTTTCTG AAAAAC T T T C C CAT GC T C- AGT T T T C AG G G T GGAC T ACAGAAAC T T CC CAT C T C AT T GAAGAAC CAT T TATCACAGAT TGAAAACAT CAAGTTT CAT T T T GACAGCAAAATCAAAAACATT GC T T T G GAGAGCGGTAAGGTGGCATTGACTGACCATGATCAGGTTTATCTTGTTGACCATGTGAGATCT ACCATTAATACCAACGAATTGGCCAAAATC7TTTTCACCCGTCGTTCCAAGTTCTACTAAGAAA AAATCCGTTTTCAAATCCAAAGCGAATGGCCCAGGGCTGGTCAAATGTTTGAGCTGGCTACAC T AT AC AAAT AT AC T AAT C- T GCAAC AT TTATATACC T AAGC AC G T C T CAAAAT C T AT CAC CGGA TTTGGATACTTGGTTCCTCGATCAATGTCTTCTCAGGCATCCAAACTTCTCGGTGTCATATTT GAC T C AGACAT CGAGACT G CAAT GACTC C T AAT T T T ACAGAGGC CAACAT T AC GGCGATAAAC AGTAACTCTGCATCTCCCAAGCAACTCCAAAAGTTTTCTGACCAATTCGTCAATAATGATCTC CCTAAATACACCAAGTTGACGCTAATGCTTGGAGGTCATTACCTCAAGTCGGAGGCAGACATG CCCGGTTCCGCAGAGAGTAAACATGCTGTCAñGGCGATTCTGTCAAATCACCTGAATATTGAT C TAGATGAGTTTGCATCTTT GC CAGACT T CAAGAT GGAAATCAC CAAGATCCC CAACT GCAT T CCCCAATATGAAGTTGGGTATCTTGATCTCAAGAGAAAGGTCCAGAATGCAGCCTCCAAAGAG TTCAACGACCAAATAAGTTTTGGAGGCATGGCATTTGGTGA'TGGTGTGGGGATCCCTGACTGT GTCCAGAATGCATTCAAAGATTCGGCTACCCTCAGTGGCATTTAA
[0454] Enzima de biosíntesis del hemo 8- Ferroquelatasa (SEQ ID NO: 18) ATGCTTAACCGTCGTTTCCAATCTACCGTGTCCTCGAGTCTGAACAAGGGCACTGGAATAGTG TTCATGAATATGGGTGGTCCCTCCACTGTCAAGGAAACCTACGACTTTTTATTTCGTCTTTTC TCGGACGGAGATTTAATCCCGTTTGGCAGATTTCAGAACATCCTGGCCCGCTTCATTGCAAGT AGAAGAACACCCAAAATTGAATCCTACTACAAAGCTATCGGAGGTGGGTCTCCTATCCGAAAG T GG T C T GAATACCAGAGT T CTAAACTAT G T GAAAAAT TAGACATTATCAGTCCACAAT CGGCT CCTCATAACCCTTATGTTCCCTTCACATACCCTAATCCTCTCACTCAACATACTTTACAAAAC ATGAAAAATGATGGAATTACTAAGGCCATTGCCTTTTCTCAATATCCGCAATTTAGTTATTCA AC CAC CGGATCATC GAT TAACGAACT T TACAGGCAAT CGAAAATT T TGGACCC T GAT CAATCT ATTAAATGGACAGTTATAGATCGCTGGCCTGACCACCCAGCCTTAGTTAAAACTTTCGCAGCT CATAT CAAAGATAC T C TAAACAGAT T CAAAACTGAAAAT GGAC T GACT GACACAAAAGACGT C GTCCTCCAATTCAGTGCTCATTCTTTACCAATGGATATTGTCAATAAAGGAGATTCGTATCCT GCAGAAGTCGCAGCGAGTGTCTTTGCCATTAT GAAAGAAC T"AAC T TCT CAAAT CCT TATAAA TTAACCTGGCAATCACAGGTTGGCCCAAAGCCTTGGCTGGGTGCTCAAACTGAAAAAATTACC AAGCAGCTAGCA'i'CCAGT GATGT 'rCCTGGAGT'CGTTT'i'GG'i'CCCTATTGCC'i'T TACCTC'i'GAT
[0455] CATAT T GAAACTCT CCAT GAAC TGGATATT GAAC T GAT T CAAGAACTAC C TAAT CCT T CAAAA GTAAAGCGAGTTGAATCC-TTGAACGGAGACCAAACTTTCATTGACTCCTTGGCAGAACTAGTG AAGAGTCACATTGATTCGAAGGTTGTATTTTCCAACCAGTTGCCATTGGATTCCATGCTGGGA GTAGTGTCAGATAATTCCCTCACAGATCCAAAAGAGTTTTTCAGAGCCCATTGA
[0456] PARTE C. Resultados y discusión
[0458] Ejemplo 24 - Caracterización de la cepa MXY0183
[0460] Las condiciones óptimas de crecimiento para la cepa MXY0183 incluyen un pH objetivo de 3,0 a 6,0 y temperaturas de 28-35 °C. Para producir la proteína LegH, la cepa MXY0183 debe estar viva y en crecimiento aeróbico por un periodo de 6 días.
[0462] La expresión de los genes asociados a la cepa MXY0183 resultó en cambios fenotípicos de la cepa. La Figura 8 muestra fotografías de los matraces agitados al inicio de la inducción (0 h) y 72 h después de la inducción. Los matraces denominados con el No. 1 contienen la cepa hospedera, MXY0051. Los matraces denominados como No. 2 y No. 3 contienen una de las cepas intermedias (es decir, MXY0118, que contiene > 10 copias del gen LegH y la ALA deshidratasa de la ruta biosintética del hemo) y la cepa de producción (es decir, MXY0183, que contiene > 10 copias del gen LegH y las 8 enzimas de la ruta biosintética del hemo), respectivamente. El color rojo característico del matraz No. 3 después de 72 horas demuestra la producción de LegH ligado al hemo.
[0464] Después de crecer en matraces agitados, las cepas deP. pastorisindicadas anteriormente, MXY0051, MXY0118 y MXY0183, se lisaron y las proteínas se analizaron en un gel SDS (Figura 9A). La flecha muestra la posición de la proteína LegH. En la Figura 9B se muestra una comparación de la producción de LegH en la cepa MXY0183 y en la cepa MXY0118, lo que demuestra la eficiencia de la carga de hemo de la proteína LegH por la cepa MXY0183.
[0466] Ejemplo 25 - Caracterización de la cepa MXY0207
[0468] Posteriormente se realizaron experimentos para determinar los beneficios de sobreexpresar el activador transcripcional, Mxr1, en presencia de los genes que codifican las 8 enzimas involucradas en la biosíntesis del hemo. La cepa MXY0183, que contiene > 10 copias de la secuencia LegH y los genes que codifican las 8 enzimas involucradas en la biosíntesis del hemo, y las cepas hermanas MXY0206 y MXY0207, que contienen > 10 copias de la secuencia LegH, los genes que codifican las 8 enzimas involucradas en la biosíntesis del hemo y el activador transcripcional Mxr1, se cultivaron en matraces agitados en presencia de glicerol, que es una fuente de carbono represora para estas cepas. En la Figura 10A se muestran fotografías de los cultivos en matraz agitado después de 48 h, y en la Figura 10B se muestran fotografías de los pellets de células cultivadas en medio BMY por 48 h sin fuente adicional de carbono; estos experimentos demostraron que se produce una expresión significativa de transgenes (por ejemplo, enzimas hemo) bajo el control del promotor de AOX1 en ausencia de una fuente de carbono inductora cuando se consume una fuente de carbono represora en el medio de crecimiento de una cepa en la que también se expresa Mxr1 a partir del promotor de AOX1. En la Figura 10C se muestra el rendimiento relativo de LegH cargada con hemo, cuando los cultivos en matraz agitado crecieron en ausencia de agente inductor. Estos experimentos demostraron que se logra una producción significativa de una proteína recombinante cargada de hemo a partir de transgenes dirigidos por el promotor AOX1 en ausencia de inducción de metanol en cepas dePichiaen las que la expresión de Mxr1 también está dirigida por el promotor AOX1.
[0470] Las cepas seleccionadas se cultivaron en tanques fermentadores de 2 L y se determinó el rendimiento relativo de LegH y LegH cargada de hemo (Figura 11). En comparación con la cepa MXY0183, la cepa MXY0207 produjo aún más LegH y fue capaz de producir suficiente hemo para hemo-cargar la proteína LegH muy efectivamente.
[0471] Ejemplo 26 - Caracterización de la cepa MXY0291
[0472] Como se describe en los Ejemplos 18-20, se construyó la cepa MXY0291 para recapitular la capacidad de producción de LegH de MXY0207, pero libre de genes de resistencia a los antibióticos. Se determinó que la cepa MXY0291 contenía ~ 16 copias de LegH var3, Mxr1 y 7 de las 8 enzimas biosintéticas del hemo. Cuando se cultivó en tanques fermentadores de 2 L, esta cepa mostró un mejor rendimiento de LegH en comparación con MXY0207. Esta mejora se observó tanto en medios de inducción que contenían metanol/glicerol como metanol/dextrosa (D-glucosa) (Figura 11).
[0473] Ejemplo 27 - Caracterización de cepas promotoras híbridas
[0474] Se expresaron copias adicionales de leghemoglobina de soja (LegH) bajo tres promotores constitutivos diferentes, pGAP, pGCW14 y pTEF1, en una cepa que ya contiene varias copias de LegH, todas las enzimas biosintéticas del hemo y el factor transcripcional Mxr1 bajo el control del promotor, pAOX1 (denominado anteriormente MXY0291). Cuando se induce con metanol en presencia de dextrosa (es decir, D-glucosa), los promotores constitutivos y pAOX1 impulsan la expresión de LegH, mientras que solamente el promotor pAOX1 impulsa la expresión de las enzimas hemo. Esto conduce a una mejora adicional en el rendimiento de LegH en comparación con la cepa anterior MXY0291 (Figura 11).
[0475] Debe entenderse que, si bien los métodos y composiciones de materia se han descrito en la presente en relación con varios aspectos diferentes, la descripción anterior de los diversos aspectos pretende ilustrar y no limitar el alcance de los métodos y composiciones de materia. Otros aspectos, ventajas, y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
[0476] Se divulgan métodos y composiciones que pueden usarse para, pueden usarse junto con, pueden usarse en la preparación de o son productos de los métodos y composiciones divulgados. Estos y otros materiales se divulgan en la presente, y se entiende que se divulgan combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos métodos y composiciones. Es decir, aunque no se divulgue explícitamente una referencia específica a cada una de las diversas combinaciones y permutaciones individuales y colectivas de estas composiciones y métodos, cada una de ellas se contempla y describe específicamente en la presente. Por ejemplo, si se divulga y discute una composición particular de materia o un método particular y se discuten varias composiciones o métodos, se contemplan específicamente todas y cada una de las combinaciones y permutaciones de las composiciones y los métodos, a menos que se indique específicamente lo contrario. Asimismo, también se contempla y divulga específicamente cualquier subconjunto o combinación de los mismos.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES
1. Un constructo de ácido nucleico, que comprende:
un ácido nucleico que codifica un activador transcripcional enlazado operativamente a un elemento promotor inducible, en donde el activador transcripcional induce el elemento promotor inducible, y
en donde el activador transcripcional se selecciona del grupo que consiste en el regulador de expresión de metanol 1 (Mxr1) dePichia pastoris,el regulador de alcohol deshidrogenasa 1 (Adr1) deHansenula polymorpha,la regulación transcripcional de la inducción de metanol 1 (Trm1) deCandida boidinii,y la regulación transcripcional de la inducción de metanol 2 (Trm2) deCandida boidinii.
2. El constructo de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde el elemento promotor inducible es un elemento promotor inducible por metanol.
3. El constructo de ácido nucleico de la reivindicación 2, en donde el elemento promotor inducible se selecciona del grupo que consiste en alcohol oxidasa 1 (AOX1), metanol oxidasa (MOX), alcohol oxidasa (AOD1), metanol alcohol oxidasa 1 (MOD1), metanol alcohol oxidasa 2 (MOD2), dihidroxiacetona sintasa (DHAS), formaldehído deshidrogenasa (FLD1), y peroxina 8 (PEX8).
4. El constructo de ácido nucleico de la reivindicación 3, en donde el elemento promotor inducible es AOX1.
5. El constructo de ácido nucleico de la reivindicación 4, en donde el activador transcripcional es Mxr1.
6. El constructo de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en donde dos activadores transcripcionales regulados por metanol están enlazados operativamente a un elemento promotor inducible por metanol.
7. El constructo de ácido nucleico de la reivindicación 6, en donde los dos activadores transcripcionales regulados por metanol son Mxr1 y Mit1.
8. Una célula de levadura metilotrófica, que comprende el constructo de ácido nucleico, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7,en donde el constructo de ácido nucleico está integrado de forma estable en el genoma de la célula de levadura metilotrófica.
9. La célula de levadura metilotrófica de la reivindicación 8, en donde la célula de levadura metilotrófica es de una especiePichia,una especieCandida,una especieHansenulao una especieTorulopsis.
10. La célula de levadura metilotrófica de la reivindicación 8 o 9, que comprende además un segundo constructo de ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de interés enlazado operativamente a un segundo elemento promotor inducible, en donde el activador transcripcional induce el segundo elemento promotor.
11. La célula de levadura metilotrófica de la reivindicación 10, en donde el segundo constructo de ácido nucleico codifica una deshidrina, una fitasa, una proteasa, una catalasa, una lipasa, una peroxidasa, una amilasa, una transglutaminasa, una oxidorreductasa, una transferasa, una hidrolasa, una liasa, una isomerasa, una ligasa o un anticuerpo.
12. La célula de levadura metilotrófica de la reivindicación 10, en donde el segundo constructo de ácido nucleico codifica una enzima involucrada en una ruta de producción de etanol, ácido láctico, butanol, ácido adípico o ácido succínico.
13. La célula de levadura metilotrófica de la reivindicación 10, en donde el segundo constructo de ácido nucleico codifica una proteína que contiene hemo o al menos una proteína involucrada en la biosíntesis del hemo.
14. La célula de levadura metilotrófica de acuerdo con la reivindicación 8, que es una célulaPichiay comprende: un constructo de ácido nucleico que codifica un activador transcripcional del regulador de la expresión del metanol 1 (Mxr1) vinculado operativamente a un elemento promotor de la alcohol oxidasa 1 (AOX1), en donde el activador transcripcional Mxr1 induce el elemento promotor AOX1; y
un constructo de ácido nucleico que codifica una proteína exógena enlazada operativamente a un segundo elemento promotor de AOX1, en donde el activador transcripcional Mxr1 induce el elemento promotor de AOX1.
15. La célula de levadura metilotrófica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-14, en donde la célula de levadura metilotrófica es una célula dePichia pastoris.
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Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HRP20220299T1 (hr) * 2015-05-11 2022-05-13 Impossible Foods Inc. Ekspresijski konstrukti i postupci za genetsku modifikaciju metilotrofnog kvasca
US10988515B2 (en) 2017-01-13 2021-04-27 Bolt Threads, Inc. Elastomeric proteins
US20190359977A1 (en) * 2017-01-25 2019-11-28 Altius Institute For Biomedical Sciences Methods and Platform of Designing Genetic Editing Tools
CA3076249A1 (en) 2017-09-21 2019-03-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Isolation, preservation, compositions and uses of extracts from justicia plants
US11051532B2 (en) 2017-09-22 2021-07-06 Impossible Foods Inc. Methods for purifying protein
US10221403B1 (en) * 2018-04-25 2019-03-05 Life Rainbow Biotech Co., Ltd. Method of preparing zearalenone hydrolase
CN108913732B (zh) * 2018-07-31 2022-02-08 华东理工大学 一种莫纳可林j异源生产的方法及应用
CN111286520B (zh) * 2018-12-10 2021-05-07 上海凯赛生物技术股份有限公司 用于发酵生产l-赖氨酸的重组dna、菌株及其应用
CN109929769B (zh) * 2019-03-05 2021-07-23 天津科技大学 一种利用fld1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株及构建方法
CN109749948A (zh) * 2019-03-05 2019-05-14 天津科技大学 一种利用tef1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株及构建方法
MX2021012671A (es) 2019-04-17 2022-01-24 Impossible Foods Inc Métodos y materiales para la producción de proteínas.
EP3959311A1 (en) 2019-04-25 2022-03-02 Impossible Foods Inc. Strains and methods for production of heme-containing proteins
WO2021108502A1 (en) 2019-11-27 2021-06-03 Evelo Biosciences, Inc. Methods and compositions for culturing hemoglobin-dependent bacteria
JP2023509911A (ja) 2019-12-31 2023-03-10 エア プロテイン，インコーポレイテッド 高タンパク質食品組成物
WO2021140487A1 (en) * 2020-01-10 2021-07-15 Intron Biotechnology, Inc. A method for preparing soy leghemoglobin using escherichia coli
EP4114198A4 (en) 2020-03-02 2024-03-13 Air Protein, Inc. COMPOSITIONS OF MEAT PRODUCT ANALOGS WITH HIGH STRUCTURED PROTEIN CONTENT
US12011016B2 (en) 2020-09-14 2024-06-18 Impossible Foods Inc. Protein methods and compositions
US10894812B1 (en) 2020-09-30 2021-01-19 Alpine Roads, Inc. Recombinant milk proteins
US10947552B1 (en) 2020-09-30 2021-03-16 Alpine Roads, Inc. Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants
EP4222167A1 (en) 2020-09-30 2023-08-09 Nobell Foods, Inc. Recombinant milk proteins and food compositions comprising the same
WO2022072833A2 (en) 2020-10-02 2022-04-07 Impossible Foods Inc. Expression constructs and methods of genetically engineering cells
WO2022072846A2 (en) 2020-10-02 2022-04-07 Impossible Foods Inc. Transgenic plants with altered fatty acid profiles and upregulated heme biosynthesis
AU2021391607A1 (en) * 2020-12-02 2023-06-29 Planeat Foods Pte. Ltd. Method of producing globin polypeptide recombinantly and meat substitute food product
US20240110168A1 (en) * 2020-12-02 2024-04-04 Genzyme Corporation Polypeptide Having Beta-Hexosaminidase Activity, and Polynucleotides Coding for the Same
WO2022251166A2 (en) 2021-05-25 2022-12-01 Evelo Biosciences, Inc. Bacterial compositions comprising soy hemoglobin
CA3231125A1 (en) 2021-10-19 2023-04-27 Joshua MARCH Plant base/animal cell hybrid meat substitute
KR20240118861A (ko) * 2021-12-16 2024-08-05 임파서블 푸즈 인크. 재조합 단백질의 발현을 증가시키는 유전 인자
US11931687B2 (en) 2022-02-15 2024-03-19 Streamline Innovations, Inc. Gas purification apparatus and method
KR102804540B1 (ko) 2022-05-25 2025-05-07 한화솔루션 주식회사 야생형 효모 균주를 이용한 헴 고생산 방법
WO2024022474A1 (zh) 2022-07-29 2024-02-01 南京百斯杰生物工程有限公司 一种嵌合型转录激活因子及其应用
KR20240098834A (ko) 2022-12-21 2024-06-28 한화솔루션 주식회사 고농도의 헴을 생산하는 효모 돌연변이 균주 및 이를 이용한 헴 고생산 방법
CN116042621A (zh) * 2023-01-06 2023-05-02 江南大学 一种酵母杂交启动子及其应用
CN120769861A (zh) 2023-02-08 2025-10-10 丹尼斯科美国公司 用于在丝状真菌细胞中生产异源球蛋白的组合物和方法
KR20240162935A (ko) 2023-05-09 2024-11-18 한화솔루션 주식회사 고농도의 헴을 생산하는 효모 돌연변이 균주 hs-y010 및 이를 이용한 헴 고생산 방법
KR20240162936A (ko) 2023-05-09 2024-11-18 한화솔루션 주식회사 고농도의 헴을 생산하는 효모 돌연변이 균주 hs-y007 및 이를 이용한 헴 고생산 방법
CN121263531A (zh) * 2023-06-06 2026-01-02 富士胶片株式会社 基因重组酵母、目标蛋白质的制造方法、试剂盒及基因重组酵母的制造方法
WO2025247966A1 (en) * 2024-05-29 2025-12-04 Mybios Gmbh Process for protein production in methylotrophic yeast host cell.
WO2025259480A2 (en) 2024-06-12 2025-12-18 Streamline Innovations Inc Gas purification apparatus with eductor reduction unit and method

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4158065A (en) 1977-12-16 1979-06-12 Sugiyo Co., Ltd. Crab meat substitute and method of preparing same
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
DK162399C (da) 1986-01-28 1992-03-23 Danisco Fremgangsmaade til ekspression af gener i baelgplanteceller, dna-fragment, rekombineret dna-fragment samt plasmid til brug ved udoevelsen af fremgangsmaaden
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5663143A (en) 1988-09-02 1997-09-02 Dyax Corp. Engineered human-derived kunitz domains that inhibit human neutrophil elastase
US6946587B1 (en) 1990-01-22 2005-09-20 Dekalb Genetics Corporation Method for preparing fertile transgenic corn plants
US5204253A (en) 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
US5753465A (en) 1994-08-30 1998-05-19 Carnegie Mellon University Unmodified recombinant human adult hemoglobin production
US5538800A (en) 1994-09-29 1996-07-23 At&T Corp. Magnetoresistive oxide material and articles comprising the material
FR2736930B1 (fr) 1995-07-17 1997-09-19 Biocem Procede de production, par des cellules vegetales, de proteines heminiques, proteines ainsi obtenues et produits contenant ces proteines
US5824511A (en) 1995-08-01 1998-10-20 University Technology Corporation Method for enhancing the production of hemoproteins
WO1997028273A1 (en) 1996-02-01 1997-08-07 North American Vaccine, Inc. Expression of group b neisseria meningitidis outer membrane (mb3) protein from yeast and vaccines
EP0910642B1 (en) 1996-06-10 2004-04-28 Novozymes Biotech, Inc. A method for increasing hemoprotein production in filamentous fungi
JP3794760B2 (ja) 1996-07-30 2006-07-12 三井化学株式会社 フィターゼ生産酵母
US5959187A (en) 1996-09-26 1999-09-28 Bailey; James E. Expression of oxygen-binding proteins in plants
JPH10117776A (ja) 1996-10-22 1998-05-12 Japan Tobacco Inc インディカイネの形質転換方法
WO2000000597A2 (en) 1998-06-26 2000-01-06 The University Of Manitoba Non-symbiotic plant hemoglobins to maintain cell energy status
US7803765B2 (en) 1999-05-05 2010-09-28 Phylogica Limited Methods of constructing biodiverse gene fragment libraries and biological modulators isolated therefrom
US7498304B2 (en) 2000-06-16 2009-03-03 Curis, Inc. Angiogenesis-modulating compositions and uses
EP1294914A2 (en) 2000-06-23 2003-03-26 Syngenta Participations AG Promoters for regulation of plant gene expression
AU2001292749A1 (en) 2000-09-18 2002-03-26 Genencor International, Inc. Twin-arginine translocation in bacillus
US8021695B2 (en) 2002-02-15 2011-09-20 Arch Personal Care Products, L.P. Personal care composition containing leghemoglobin
EP1578977B1 (de) 2002-12-23 2011-08-17 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zur veränderung des gehalts von speicherstoffen in pflanzen
JP2006522585A (ja) 2003-04-11 2006-10-05 ベントリア バイオサイエンス 単子葉植物種子の中で発現させたヒト血中蛋白質
KR100660539B1 (ko) 2004-07-29 2006-12-22 삼성전자주식회사 자기 기억 소자 및 그 형성 방법
CN1308452C (zh) 2004-09-14 2007-04-04 上海永业农科生物工程有限公司 一种含有改组乙醇氧化酶启动子的毕赤酵母植酸酶表达系统
EP1841872A2 (en) 2005-01-12 2007-10-10 Dsm Ip Assets B.V. Hemoglobin overexpression in fungal fermentations
AT501955B1 (de) 2005-02-23 2007-08-15 Univ Graz Tech Mutierte aox1-promotoren
JP5225087B2 (ja) 2005-08-24 2013-07-03 ザ スクリプス リサーチ インスティチュート 翻訳エンハンサーエレメント依存性のベクター系
JP2007228956A (ja) 2006-02-28 2007-09-13 Suntory Ltd 醸造用酵母由来の有用タンパク質同定方法
JP2008017733A (ja) 2006-07-11 2008-01-31 Tokyo Univ Of Agriculture 異種タンパク質の発現方法及び異種タンパク質の発現方法により得られたタンパク質
JP2008017774A (ja) 2006-07-13 2008-01-31 Nipro Corp ピキア酵母を用いた組換えヒトヘモグロビンの製造
UA98127C2 (ru) 2006-11-01 2012-04-25 СИГМА АЛИМЕНТОС, С.А. де К.В. Способ получения пищевого продукта - заменителя мяса
JP5290997B2 (ja) * 2007-01-26 2013-09-18 ノボザイムス アクティーゼルスカブ ピキアにおけるメタノール誘導性プロモーターからのメタノール非依存的誘導の方法
EP2380988A3 (en) 2007-07-10 2012-04-11 Mosanto Technology LLC Transgenic plants with enhanced agronomic traits
EP2058398A1 (en) * 2007-11-09 2009-05-13 Nipro Corporation Production of recombinant human hemoglobin using pichia yeast
US20110129874A1 (en) 2008-07-11 2011-06-02 Novozymes A/S Pichia Pastoris Das Promoter Variants
BRPI1011936A2 (pt) 2009-07-02 2016-05-03 Verdezyne Inc métodos biológicos para a preparação de ácido adípico
CA2767259A1 (en) 2009-07-09 2011-01-13 Verdezyne, Inc. Engineered microorganisms with enhanced fermentation activity
CN102947440B (zh) 2009-12-30 2015-04-08 埃欧金能源公司 呈现增强的木质纤维素水解产物发酵的改良酵母菌株
CN102190731B (zh) 2010-03-09 2016-01-27 中国科学院上海生命科学研究院 用人工转录因子诱导产生多能干细胞
US9085766B2 (en) 2010-05-21 2015-07-21 Cornell University Methods of producing recombinant heme-binding proteins and uses thereof
SG187680A1 (en) 2010-08-02 2013-03-28 Cellectis Method for targeted genomic events in algae
WO2012083424A1 (en) 2010-12-21 2012-06-28 The University Of Western Ontario Novel amino acid linker sequences for ligand immobilization
EP2669375B1 (en) 2011-01-27 2018-10-17 Kaneka Corporation Yeast of the genus pichia modified to express high levels of a mpp1 homolog and process for producing protein
WO2012177499A1 (en) 2011-06-23 2012-12-27 The Trustees Of Princeton University Systems for induction of gene expression and protein depletion in yeast
EP4606221A2 (en) 2011-07-12 2025-08-27 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for consumables
US20140220217A1 (en) 2011-07-12 2014-08-07 Maraxi, Inc. Method and compositions for consumables
US10039306B2 (en) 2012-03-16 2018-08-07 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for consumables
EP2565262A1 (en) 2011-08-31 2013-03-06 VTU Holding GmbH Protein expression
JP6295512B2 (ja) 2012-03-15 2018-03-20 株式会社豊田中央研究所 酵母における外来遺伝子の発現産物の生産方法、酵母における発現調節剤及びその利用
WO2013158749A2 (en) 2012-04-17 2013-10-24 Gevo, Inc. Engineered microorganisms with improved growth properties
CN102757976B (zh) * 2012-07-12 2014-10-08 华东理工大学 消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性的方法
US9938326B2 (en) 2012-09-19 2018-04-10 Osaka University Pneumococcal vaccine containing pneumococcal surface protein A
AU2014205114B2 (en) 2013-01-11 2017-11-16 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for affecting the flavor and aroma profile of consumables
WO2015020537A1 (en) 2013-08-05 2015-02-12 Agresearch Limited A method and control system for optimising the quality of meat
EP3044320B1 (en) 2013-09-11 2020-02-19 Impossible Foods Inc. Secretion of heme-containing polypeptides
CN119605908A (zh) 2014-03-31 2025-03-14 非凡食品有限公司 碎肉仿品
WO2016089516A2 (en) 2014-10-31 2016-06-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Short exogenous promoter for high level expression in fungi
HRP20220299T1 (hr) 2015-05-11 2022-05-13 Impossible Foods Inc. Ekspresijski konstrukti i postupci za genetsku modifikaciju metilotrofnog kvasca
EP3128006A1 (en) 2015-08-06 2017-02-08 Consejo Superior de Investigaciones Cientificas (CSIC) Tools for multiprotein complex expression in pichia pastoris
US20190292217A1 (en) 2016-12-02 2019-09-26 Impossible Foods Inc. Transgenic plants with upregulated heme biosynthesis
WO2018102656A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 City Of Hope Producing recombinant products in contained systems
US11655444B2 (en) 2017-09-28 2023-05-23 Precision Fermentation, Inc. Methods, devices, and computer program products for standardizing a fermentation process
RU2658758C1 (ru) 2017-10-02 2018-06-22 ООО "Лаборатория Ангиофарм" Рекомбинантная плазмида для экспрессии в дрожжах Pichia pastoris гена химерного белка ангиогенина человека и штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека
US20200325484A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 Delin Liang Enhancing gene expression by linking self-amplifying transcription factor with viral 2A-like peptide
MX2021012671A (es) 2019-04-17 2022-01-24 Impossible Foods Inc Métodos y materiales para la producción de proteínas.
EP3959311A1 (en) 2019-04-25 2022-03-02 Impossible Foods Inc. Strains and methods for production of heme-containing proteins
US20210062206A1 (en) 2019-07-08 2021-03-04 The Regents Of The University Of California Synthetic transcription factors
KR20240118861A (ko) 2021-12-16 2024-08-05 임파서블 푸즈 인크. 재조합 단백질의 발현을 증가시키는 유전 인자

Also Published As

Publication number Publication date
AU2016262494A1 (en) 2017-11-30
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