ES2968538T3 - Compuestos útiles en la terapia del VIH - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a compuestos de Fórmula (I), (Ia), (Ib), (II) o (III), sus sales, sus composiciones farmacéuticas, así como a métodos terapéuticos de tratamiento y prevención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Compuestos útiles en la terapia del VIH

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un compuesto, composiciones farmacéuticas y uso de estos en relación con individuos infectados con VIH.

Listado de secuencias

Esta solicitud contiene secuencias, enumeradas en un Listado de Secuencias electrónico titulado PR66692_Seq_List, de 2 KB de tamaño, creado utilizando Patent-ln 3.5 el 12 de noviembre de 2010.

Antecedentes de la invención

La infección por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) conduce a la contracción de la enfermedad de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). El número de casos de VIH sigue aumentando, y actualmente se estima que más de treinta y cinco millones de personas en todo el mundo sufren de infección por VIH, por ejemplo, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S235230181630087X? a través de %3Dihub.

Actualmente, la supresión a largo plazo de la replicación viral con fármacos antirretrovirales es la única opción para tratar la infección por VIH-1. De hecho, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos ha aprobado veinticinco fármacos en seis clases de inhibidores diferentes, que han demostrado aumentar en gran medida la supervivencia y la calidad de vida de los pacientes. Sin embargo, todavía se cree que se requieren terapias adicionales debido a una serie de problemas que incluyen, pero no se limitan a interacciones farmacológicas indeseables; interacciones fármaco-alimento; no adherencia a la terapia; resistencia a los medicamentos debido a la mutación de la diana enzimática; e inflamación relacionada con el daño inmunológico causado por la infección por VIH.

Actualmente, casi todos los pacientes VIH positivos son tratados con regímenes terapéuticos de combinaciones de fármacos antirretrovirales denominados terapia antirretroviral altamente activa (“HAART”, por sus siglas en inglés). Sin embargo, las terapias HAART a menudo son complejas porque se debe administrar una combinación de diferentes fármacos a menudo diariamente al paciente para evitar la rápida aparición de variantes del VIH-1 resistentes a los medicamentos. A pesar del impacto positivo de HAART en la supervivencia del paciente, la resistencia a los fármacos aún puede ocurrir y la supervivencia y la calidad de vida no se normalizan en comparación con las personas no infectadas [Lohse Ann Intern Med 2007 146;87-95]. De hecho, la incidencia de varias morbilidades y mortalidades no relacionadas con el SIDA, tal como enfermedades cardiovasculares, fragilidad y deterioro neurocognitivo, aumenta en sujetos infectados por el VIH suprimidos por HAART [Deeks Annu Rev Med 2011;62:141-155]. Esta mayor incidencia de morbilidad/mortalidad no relacionada con el SIDA ocurre en el contexto de, y es potencialmente causada por, inflamación sistémica elevada relacionada con el daño inmunológico causado por la infección por VIH y la infección residual por VIH [Hunt J Infect Dis 2014][Byakagwa J Infect Dis 2014][Tenorio J Infect Dis 2014].

La terapia antirretroviral (ART) moderna tiene la capacidad de suprimir efectivamente la replicación de VIH y mejorar los resultados de salud para las personas infectadas por VIH, pero se cree que no es capaz de eliminar completamente los reservorios virales de VIH dentro del individuo. Los genomas del VIH pueden permanecer latentes dentro de la mayoría de las células inmunitarias en el individuo infectado y se pueden reactivar en cualquier momento, de modo que después de la interrupción de la ART, la replicación del virus generalmente se reanuda en cuestión de semanas. En un puñado de individuos, el tamaño de este reservorio viral se ha reducido significativamente y al cesar la ART, el rebote de la replicación viral se ha retrasado [Henrich TJ J Infect Dis 2013][Henrich TJ Ann Intern Med 2014]. En un caso, el reservorio viral se eliminó durante el tratamiento de la leucemia y no se observó rebote viral durante varios años de seguimiento [Hutter G N Engl J Med 2009]. Estos ejemplos sugieren el concepto de que la reducción o eliminación del reservorio viral puede ser posible y puede conducir a la remisión o cura viral. Como tal, se han buscado formas de eliminar el reservorio viral, por medios moleculares directos, incluida la escisión de genomas virales con sistemas CRISPR/Cas9, o para inducir la reactivación del reservorio latente durante la ART de modo que se eliminen las células latentes. Se cree que se requiere la reversión de la latencia para hacer que las células infectadas latentemente sean vulnerables a la eliminación.

Los miméticos de SMACm (segundo activador de caspasas derivado de mitocondrias) son una clase de compuestos que recientemente han entrado en ensayos clínicos como posibles tratamientos contra el cáncer. Los fármacos agotan y/o inhiben el inhibidor celular de las proteínas de apoptosis (clAP) que actúan como proteínas antiapoptóticas, promoviendo así la muerte celular de las células cancerosas. El antagonismo y/o agotamiento de clAP también conduce a la activación de la vía de señalización de NF-kB no canónica, que puede inducir la expresión de VIH y puede permitir la eliminación de células infectadas por VIH. Además, los miméticos de SMAC pueden promover selectivamente la muerte celular de las células infectadas por VIH [Campbell Cell Host Microbe 2018] o VHB [Ebert Proc Nat Acad Sci 2013] al antagonizar las proteínas antiapoptóticas.

Recientemente, se informó el direccionamiento de la vía no canónica NF-kB (ncNF-KB) para revertir la latencia en modelos de líneas celulares. La vía ncNF-KB se activa típicamente mediante la ligación de un subconjunto de miembros de la familia de receptores de TNF. En el estado estacionario, un complejo multimolecular con actividad de ubiquitina ligasa que consiste en factor 2 asociado al receptor de TNF (TRAF2), TRAF3 e inhibidor celular de la proteína-1 de apoptosis (clAP1) se asocia con la porción citoplasmática del receptor no ligado y ubiquitinila y degrada constitutivamente la quinasa inductora de NF-KB (NIK). Tras la ligación del receptor, clAP1 ubiquitinila TRAF3 y autoubiquitinila, lo que conduce a la degradación proteasómica de TRAF3 y clAP1, desinhibiendo así la acumulación de NIK. NIK es constitutivamente activo y, una vez acumulado, fosforila el inhibidor del homodímero kB quinasa-a (IKKa). El homodímero IKKa/IKKa activado fosforila luego la forma p100 inactiva de NFkB2, lo que conduce a la ubiquitinilación por la ubiquitina ligasa Skp1-Cul1-F-box (SCF(3TrCP) y la escisión proteasómica de p100, liberando la subunidad p52 activa. p52 se asocia con RelB, y este heterodímero se transloca en el núcleo para impulsar la transcripción de los elementos promotores de kB. Además de la ligación del receptor, ncNF-KB se puede activar mediante la señalización de compuestos intermedios de la cascada de apoptosis. La escisión del segundo activador mitocondrial de caspasas (SMAC) de la membrana mitocondrial expone el motivo N-terminal Ala-Val-Pro-lle, que se une específicamente a los dominios de repetición intermedia (BIR) de baculovirus de las proteínas IAP. Esta unión a BIR en clAPI/2 activa la actividad ubiquitina ligasa del complejo TRAF2:TRAF3:clAP, induciendo la autoubiquitinilación y degradación de clAPI/2, la acumulación de NIK y la activación de la vía ncNF-KB. La unión de SMAC a los dominios BIR de XIAP y ML- IAP antagoniza las actividades de inhibición de caspasa de estas moléculas, a menudo sobreexpresadas en células tumorales, que conducen a la potenciación de la apoptosis. Como tal, el motivo Ala-Val-Pro-lle de SMAC ha sido objeto de una atención significativa en oncología, lo que ha llevado al descubrimiento de una clase de miméticos de péptidos que tienen actividad similar a SMAC, denominados miméticos de SMAC (SMACm). Los SMACm activan potentemente la vía ncNF-KB y no inducen apoptosis en células no tumorales, y como tal son de interés para revertir la latencia del VIH. Ver, por ejemplo, Richard Dunham et.al., The SMAC Mimetic AZD5582 is a Potent HIV Latency Reversing Agent, bioRxiv, mayo. 2, 2018; doi: http://dx.doi.org/10.1101/312447.

La patente de los Estados Unidos Núm. 7.960.372 se refiere a miméticos de SMAC bicíclicos diazo bivalentes que inhiben la actividad de IAP.

Breve descripción de la invención

En un aspecto, la invención proporciona un compuesto que tiene la estructura:

o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto como se definió anteriormente o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto como se definió anteriormente o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de una infección por VIH.

En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto como se definió anteriormente o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el agotamiento de células infectadas por VIH.

En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto como se definió anteriormente o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y uno o más agentes adicionales activos contra el VIH para su uso en el agotamiento de las células infectadas por VIH. En ciertos aspectos, estos agentes activos contra el VIH se seleccionan del grupo que consiste en agentes antirretrovirales, agentes de reversión de latencia y agentes para terapia de eliminación.

Estos y otros aspectos están abarcados por la invención como se establece en la presente.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una gráfica que compara los datos farmacocinéticos (PK) de roedores de varios compuestos con los datos PK de SMACm AZD5582.

Descripción detallada de la invención

La materia actualmente divulgada ahora se describirá más completamente más adelante. Sin embargo, muchas modificaciones y otras realizaciones de la presente materia divulgada actualmente expuestas en la presente se le ocurrirá a un experto en la técnica a la cual pertenece la presente materia divulgada actualmente que tiene el beneficio de las enseñanzas presentadas en las descripciones anteriores. Por consiguiente, se va a entender que la presente materia divulgada actualmente no se va a limitar a las realizaciones específicas divulgadas y que las modificaciones y otras realizaciones se propone que se incluyan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. En otras palabras, la presente materia descrita en la presente cubre todas las alternativas, modificaciones y equivalentes que se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica en este campo.

La apoptosis, un tipo de muerte celular programada, juega un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis y la regulación del número de células en organismos superiores. La apoptosis anormal está involucrada en una serie de enfermedades, que incluyen trastornos autoinmunitarios, enfermedades degenerativas del Sistema Nervioso Central, cáncer e infecciones virales, tal como VIH. La familia de proteínas inhibidoras de la apoptosis (lAP) desempeña un papel clave en la supresión de la señalización proapoptótica en células de mamíferos. Se ha demostrado que SMACm, que imita una secuencia tetrapeptídica crítica del segundo activador de caspasa derivado de mitocondrias, interrumpe la unión de lAP con su compañero funcional y restaura la respuesta apoptótica a los estímulos proapoptóticos en las células. Desde principios de la década de 2000, un gran esfuerzo se ha centrado en el diseño y la preparación de miméticos de SMAC como antagonistas de IAP, particularmente en la promoción de la muerte celular en las células tumorales y, más recientemente, en la reversión de la latencia de VIH. Estas investigaciones han explorado la activación de la vía no canónica NF-kB (ncNF-kB) como un método potencial por el cual SMAC imita selectivamente el agotamiento de las células latentes de VIH. Un ejemplo de un mimético temprano de SMAC es SBI-0637142 monomérico, preparado por investigadores del Instituto de Investigación Médica Sanford-Burnham. En las pruebas de agotamiento de VIH, se encontró que SBI-0637142 era potente en los ensayos de líneas celulares, pero no mostró actividad en la conversión de p100-p52 o la inducción de ARNca de VIH en células primarias. También se ha dirigido mucho trabajo al desarrollo de miméticos bivalentes, que son miméticos de SMAC monoméricos unidos covalentemente. AZD5582 de AstraZeneca y Birinapant TL32711 de Medivir son ejemplos de miméticos de SMAC diméricos. En los estudios de reversión de la latencia de VIH, Birinapant TL32711 no fue potente en Jurkat, la conversión p100-p52 o la inducción de ARNca de VIH. Por el contrario, AZD5582 exhibió un aumento en la expresión de ARN de VIH asociado a células en células T CD4+ en reposo a través de experimentos de ensayo de Jurkat, estudios de conversión de p100-p52 e inducción de VIH y ARNca (Sampey et al. bioRxiv 312447). Sin embargo, AZD5582 también puede demostrar problemas de tolerabilidad.

En la presente se divulgan SMACm diméricos que se cree que son lo suficientemente potentes y efectivos como para activar ncNF-kB, revertir la latencia del VIH en células humanas primarias no modificadas como agentes individuales, y pueden tener menos toxicidad fuera del objetivo en relación con otros SMACm diméricos tal como AZD5582, lo que los hace adecuados para su consideración para un desarrollo posterior. En particular, los SMACm diméricos de la invención son capaces de inducir la expresión de ARN de VIH en células T CD4+ primarias en reposo no estimuladas de donantes infectados por VIH cuya viremia se suprime completamente mediante terapia estándar. No se cree que otras SMACm, específicamente moléculas monoméricas o moléculas diméricas con enlazadores no optimizados, tengan este efecto en estas células, el reservorio latente primario de la infección persistente. Además, los SMACm diméricos de la invención son capaces de una inversión clínicamente medible de la latencia en dos modelos animales (macacos rhesus infectados por SIV, con supresión antirretroviral y ratón humanizado suprimido por ART infectado por VIH) como se evidencia por la viremia plasmática intermitente que emerge transitoriamente a pesar de la terapia antiviral en curso exitosa.

Se debe entender que la terminología usada en la presente es para fines de describir solo realizaciones particulares y no se propone limitar el alcance de la presente invención. En esta especificación y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a una serie de términos que se definirán para tener los siguientes significados.

Como se usa en la presente, a menos que se especifique lo contrario, “alquilo” se refiere a un grupo hidrocarbilo alifático saturado monovalente que tiene de 1 a 14 átomos de carbono y, en algunas realizaciones, de 1 a 8 átomos de carbono o de 1 a 6 átomos de carbono. "Alquilo (Cx-Cy)" se refiere a grupos alquilo que tienen de x a y átomos de carbono. El término "alquilo" incluye, a modo de ejemplo, grupos hidrocarbilo lineales y ramificados tal como metilo (CH<3>), etilo (CH<3>CH<2>), n-propilo (CH<3>CH<2>CH<2>), isopropilo ((CH<3>)<2>CH), n-butilo (CH<3>CH<2>CH<2>CH<2>), isobutilo ((CH<3>)2CHCH CH<2>), secbutilo ((CH<3>)(CH<3>CH<2>)CH), f-butilo ((CH<3>)<3>C), n-pentilo (CH<3>CH<2>CH<2>CH<2>CH<2>) y neopentilo ((CH<3>)<3>CCH<2>). Cabe señalar que la mención de, por ejemplo, alquilo (C<1>-C<12>) también abarca intervalos dentro de este grupo, por ejemplo, alquilo (C<1>-C<6>).

“AUC” se refiere al área bajo la gráfica de la concentración plasmática del fármaco (no el logaritmo de la concentr ación) frente al tiempo después de la administración del fármaco.

“EC<50>” se refiere a la concentración de un fármaco que proporciona la mitad de la respuesta máxima. . A veces, también se convierte a la escala pEC<50>(-log IC<50>), en la que los valores más altos indican una potencia exponencialmente mayor.

“ IC<50>” se refiere a la concentración inhibidora semimáxima de un fármaco. A veces, también se convierte a la escala pIC<50>(-log IC<50>), en la que los valores más altos indican una potencia exponencialmente mayor.

“Compuesto” y “entidad química”, como se usa en la presente, se refiere a un compuesto como se definió anteriormente, y cualquier forma del compuesto que incluye los racematos, estereoisómeros y tautómeros del compuesto o compuestos.

"Polimorfismo" se refiere a cuando existen dos o más fenotipos claramente diferentes en la misma población de una especie donde la aparición de más de una forma o morfología. Para ser clasificados como tal, los morfos deben ocupar el mismo hábitat al mismo tiempo y pertenecer a una población panmíctica (una con apareamiento aleatorio).

“Unión a proteínas” se refiere a la unión de un fármaco a proteínas en el plasma sanguíneo, membranas tisulares, glóbulos rojos y otros componentes de la sangre.

“Desplazamiento de proteínas” se refiere a la determinación de un desplazamiento de unión mediante la comparación de los valores de EC<50>determinados en ausencia y presencia de suero humano.

“Racematos” se refiere a una mezcla de enantiómeros. En una realización de la invención, el compuesto como se definió anteriormente, o sales farmacéuticamente aceptables de este, se enriquecen enantioméricamente con un enantiómero en donde todos los carbonos quirales a los que se hace referencia se encuentran en una configuración. En general, la referencia a un compuesto o sal enantioméricamente enriquecida, pretende indicar que el enantiómero especificado comprenderá más del 50% en peso del peso total de todos los enantiómeros del compuesto o sal.

“Solvato” o “solvatos” de un compuesto se refieren a aquellos compuestos, como se definió anteriormente, que están unidos a una cantidad estequiométrica o no estequiométrica de un solvente. Los solvatos de un compuesto incluyen solvatos de todas las formas del compuesto. En determinadas realizaciones, los solventes son volátiles, no tóxicos y/o aceptables para la administración a humanos en cantidades traza. Los solvatos adecuados incluyen agua.

“Estereoisómero” o “estereoisómeros” se refieren a compuestos que difieren en la quiralidad de uno o más estereocentros. Los estereoisómeros incluyen enantiómeros y diastereómeros.

“Tautómero” se refiere a formas alternativas de un compuesto que difieren en la posición de un protón, tal como tautómeros de enol/ceto e imina/enamina, o las formas tautoméricas de grupos heteroarilo que contienen un átomo de anillo unido tanto a un resto NH de anillo como a un resto =N de anillo tal como pirazoles, imidazoles, bencimidazoles, triazoles y tetrazoles.

"Sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales farmacéuticamente aceptables derivadas de una variedad de contraiones orgánicos e inorgánicos conocidos en la técnica e incluyen, solo a modo de ejemplo, sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio y tetraalquilamonio, y cuando la molécula contiene una funcionalidad básica, sales de ácidos orgánicos o inorgánicos, tales como hidrocloruro, hidrobromuro, tartrato, mesilato, acetato, maleato y oxalato. Las sales adecuadas incluyen las descritas en P. Heinrich Stahl, Camille G. Wermuth (Eds.), Handbook of Pharmaceutical Salts Properties, Selection, and Use; 2002.

“Paciente” o “sujeto” se refiere a mamíferos e incluye seres humanos y mamíferos no humanos.

"Tratar" o "tratamiento" de una enfermedad en un paciente se refiere a 1) prevenir que la enfermedad ocurra en un paciente que está predispuesto o que aún no muestra síntomas de la enfermedad; 2) inhibir la enfermedad o detener su desarrollo; o 3) mejorar o causar la regresión de la enfermedad.

Como se indicó anteriormente, "tratamiento" de un trastorno incluye la prevención del trastorno. Un experto en la técnica apreciará que "prevención" no es un término absoluto. En medicina, se entiende que "prevención" se refiere a la administración profiláctica de un fármaco para disminuir sustancialmente la probabilidad o gravedad de un trastorno o manifestación biológica del mismo, o para retrasar la aparición del trastorno o manifestación biológica del mismo.

Los términos “ intermitente” o “ intermitentemente” como se usan en la presente significan detener y comenzar a intervalos regulares o irregulares. Como se usa en la presente, el término “infección viral” describe un estado de enfermedad en el que un virus invade células sanas, utiliza la maquinaria reproductiva de la célula para multiplicarse o replicarse y, en última instancia, lisar la célula, lo que da como resultado la muerte celular, la liberación de partículas virales y la infección de otras células por los virus de la progenie recién producidos. La infección latente por ciertos virus también es un posible resultado de la infección viral.

Como se usa en la presente, el término “tratar infecciones virales” se refiere a inhibir la replicación del virus particular, inhibir la transmisión viral y mejorar o aliviar los síntomas de la enfermedad causada por la infección viral. El tratamiento se considera "terapéutico" si hay una reducción en la carga viral, disminución en la mortalidad y/o morbilidad. "Prevenir infecciones virales" significa evitar que el virus se establezca en el huésped. Un tratamiento se considera "profiláctico" si el sujeto está expuesto al virus pero no se infecta con el virus como resultado del tratamiento.

Como se usa en la presente, “latencia” se refiere a un concepto que describe 1) el estado latente de la actividad viral dentro de una población de células, en donde no se produce la producción viral, el empaquetamiento viral y la lisis de la célula hospedadora, o se produce a una frecuencia muy baja, o 2) la regulación negativa o ausencia de expresión génica dentro de una célula infectada.

Como se usa en la presente, “revertir la infección latente por VIH” se refiere a un tratamiento que regula positivamente la expresión de genomas de VIH integrados dentro de células infectadas latentemente, tal como el agente que activa la vía de NF-kB no canónica, lo que conduce a la susceptibilidad de la célula infectada a la muerte celular inducida por virus o la eliminación inmunológica. Como se usa en la presente, “agotar la infección latente por VIH” se refiere a la eliminación de células infectadas latentemente por VIH que pueden seguir a la reversión de la latencia del VIH mediante reactivos tal como aquellos que activan la vía de NF-kB no canónica.

En ciertas realizaciones, las células infectadas por VIH latentes son células T CD4+ en reposo.

Cuando se dibujan compuestos específicos o fórmulas genéricas que tienen anillos aromáticos, tal como anillos arilo o heteroarilo, entonces se entenderá por uno de todavía en la técnica que la ubicación aromática particular de cualquier doble enlace es una mezcla de posiciones equivalentes incluso si se dibujan en diferentes ubicaciones de compuesto a compuesto o de fórmula a fórmula. Por ejemplo, en los dos anillos de piridina (A y B) más adelante, los dobles enlaces se dibujan en diferentes ubicaciones, sin embargo, se sabe que son la misma estructura y compuesto:

La presente invención incluye un compuesto, así como sus sales farmacéuticamente aceptables. Por consiguiente, se entiende que la palabra "o" en el contexto de "un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo" se refiere a: 1) un compuesto solo o un compuesto y una sal farmacéuticamente aceptable del mismo (alternativa), o 2) un compuesto y una sal farmacéuticamente aceptable del mismo (en combinación).

El compuesto comprendido por la presente invención se muestra en la siguiente Tabla 1:

Tabla 1

Las sales farmacéuticamente aceptables también se encuentran dentro del alcance de la invención con respecto al compuesto establecido en la presente. Más preferentemente, el compuesto puede estar presente genéricamente como clorhidrato (es decir, sales de HCl), por ejemplo, más específicamente una sal de diclorhidrato, (2 HCl). También se encuentra dentro del alcance de la invención el compuesto presente como una sola especie, que incluye sales farmacéuticamente aceptables de este, así como el compuesto en forma de base libre.

De acuerdo con una realización de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto como se definió anteriormente o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización adicional, el compuesto está presente en forma amorfa. En una realización adicional, la composición farmacéutica se encuentra en una forma de tableta. En una realización adicional, el compuesto está presente como una dispersión secada por aspersión. En una realización adicional, la composición está presente en forma de nanopartículas, por ejemplo, partículas de entre 1 y 100 nanómetros de tamaño.

De acuerdo con una realización de la presente invención, se proporciona un compuesto como se definió anteriormente o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de una infección por VIH.

De acuerdo con una realización de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica como se describe en la presente para su uso en el tratamiento de una infección por VIH.

Además, el compuesto de la invención puede existir en formas geométricas o estereoisoméricas particulares. La invención contempla todos estos compuestos, incluidos cis- y trans-isómeros, (-)- y (+)-enantiómeros, (R)- y (S)-enantiómeros, diastereómeros, (D) -isómeros, (L)-isómeros, las mezclas racémicas de los mismos y otras mezclas de los mismos, tales como mezclas enriquecidas enantiomérica o diastereoméricamente, como caen dentro del alcance de la invención. Se propone que todos estos isómeros, así como mezclas de los mismos, se incluyan en esta invención.

Los isómeros (R)- y (S) - ópticamente activos y los isómeros d e I se pueden preparar usando sintones quirales o reactivos quirales o resolver usando técnicas convencionales. Si, por ejemplo, se desea un enantiómero particular de un compuesto de la presente invención, se puede preparar por síntesis asimétrica, o por derivatización con un auxiliar quiral, donde la mezcla diastereomérica resultante se separa y el grupo auxiliar se escinde para proporcionar los enantiómeros puros deseados. Alternativamente, cuando la molécula contiene un grupo funcional básico, tal como un grupo amino, o un grupo funcional ácido, tal como un grupo carboxilo, se pueden formar sales diastereoméricas con un ácido o base ópticamente activo apropiado, seguido de resolución de los diastereómeros formados de esta manera por cristalización fraccionada o medio cromatográfico conocido en la técnica, y posterior recuperación de los enantiómeros puros. Además, la separación de enantiómeros y diastereómeros se logra con frecuencia utilizando cromatografía que emplea fases estacionarias quirales, opcionalmente en combinación con derivatización química (por ejemplo, formación de carbamatos a partir de aminas).

En otra realización de la presente invención, se proporciona un compuesto como se definió anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en terapia médica.

En otra realización de la presente invención, se proporciona un compuesto como se definió anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de una infección por VIH.

En una realización, la formulación farmacéutica que contiene un compuesto como se definió anteriormente, o una sal del mismo, es una formulación adaptada para administración parenteral. En otra realización, la formulación es una formulación parenteral de acción prolongada. En una realización adicional, la formulación es una formulación de nanopartículas.

El compuesto de la presente invención y sus sales, solvatos u otros derivados farmacéuticamente aceptables de este, se pueden emplear solos o en combinación con otros agentes terapéuticos. Por lo tanto, en otras realizaciones, el tratamiento y/o prevención de una infección por VIH en un sujeto puede, además de la administración de un compuesto como se definió anteriormente, comprender además la administración de uno o más agentes farmacéuticos adicionales activos contra el VIH.

En estas realizaciones, uno o más agentes adicionales activos contra el VIH se seleccionan del grupo que consiste en agentes antirretrovirales, agentes de reversión de latencia y agentes para terapia de eliminación.

En otras realizaciones, el uno o más agentes adicionales activos contra el VIH se seleccionan del grupo que consiste en inhibidores de transcriptasa inversa de nucleótidos, inhibidores de transcriptasa inversa no nucleotídicos, inhibidores de proteasa, inhibidores de entrada, inhibidores de unión y fusión, inhibidores de integrasa, inhibidores de maduración, inhibidores de CXCR4 y/o CCR5, inhibidores de histona desacetilasa, inhibidores de histona crotonil transferasa, agonistas de proteína quinasa C, inhibidores de proteasoma, agonistas de TLR7, inhibidores de bromodominio y anticuerpos neutralizantes, y combinaciones de los mismos.

En ciertas realizaciones, el uno o más agentes adicionales activos contra el VIH se seleccionan del grupo que consiste en zidovudina, didanosina, lamivudina, zalcitabina, abacavir, estavudina, adefovir, adefovir dipivoxil, fozivudina, todoxil, emtricitabina, alovudina, amdoxovir, elvucitabina, nevirapina, delavirdina, efavirenz, loviride, inmunocal, oltipraz, capravirina, lersivirina, GSK2248761, TMC-278, TMC-125, etravirina, saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, fosamprenavir, brecanavir, darunavir, atazanavir, tipranavir, palinavir, lasinavir, enfuvirtida, T-20, T-1249, PRO-542, PRO-14C), TNX-355, BMS-806, BMS-663068 y BMS-626529, 5-Helix, raltegravir, elvitegravir, dolutegravir,cabotegravir, bictegravir, vicriviroc (Sch-C), Sch-D, TAK779, maraviroc, TAK449, didanosina, tenofovir, lopinavir, darunavir, vorinostat, panobinostat, romidepin, ácido valprónico, mocetinostat, corotonato de sodio, briostatina, ingenol B, disulforam, GS-9620, JQ1, iBET 151, bortezomib, galato de epigalocatequina, salinosporamida A, carfilzomib, anticuerpos ampliamente neutralizantes (bNAb), eCD4-lg, CD4-lg, y proteínas de redireccionamiento de doble afinidad (DART).

Como tal, el compuesto de la presente invención y cualquier otro agente o agentes farmacéuticamente activos se pueden administrar juntos o por separado y, cuando se administran por separado, la administración puede ocurrir simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden. Las cantidades del compuesto de la presente invención y los otros agentes farmacéuticamente activos y los tiempos relativos de administración se seleccionarán para lograr el efecto terapéutico combinado deseado. La administración en combinación de un compuesto de la presente invención y sales, solvatos u otros derivados farmacéuticamente aceptables de este con otros agentes de tratamiento puede ser en combinación por administración concomitante en: (1) una composición farmacéutica unitaria que incluye ambos compuestos; o (2) composiciones farmacéuticas separadas que incluyen cada una uno de los compuestos. De manera alternativa, la combinación se puede administrar por separado de una manera secuencial en donde un agente de tratamiento se administra primero y el otro segundo o viceversa. Esta administración secuencial puede ser cercana en el tiempo o remota en el tiempo. Las cantidades del compuesto de la invención o sales del mismo y los otros agentes farmacéuticamente activos y los tiempos relativos de administración se seleccionarán para lograr el efecto terapéutico combinado deseado.

Además, el compuesto de la presente invención se puede usar en combinación con uno o más agentes adicionales que pueden ser útiles en el tratamiento de VIH. Estos agentes pueden incluir agentes antirretrovirales, agentes de reversión de latencia y agentes para terapia de eliminación. Más adelante se proporcionan varios ejemplos de agentes antirretrovirales:

Inhibidores de transcriptasa inversa de nucleótidos tal como zidovudina, didanosina, lamivudina, zalcitabina, abacavir, estavudina, adefovir, adefovir dipivoxil, fozivudina, todoxil, emtricitabina, alovudina, amdoxovir, elvucitabina y agentes similares;

Inhibidores de transcriptasa inversa no nucleotídicos (que incluyen un agente que tiene actividad antioxidante tal como inmunocal, oltipraz, etc.) tal como nevirapina, delavirdina, efavirenz, lovirida, inmunocal, oltipraz, capravirina, lersivirina, GSK2248761, TMC-278, TMC-125, etravirina y agentes similares;

Inhibidores de proteasa tal como saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, fosamprenavir, brecanavir, darunavir, atazanavir, tipranavir, palinavir, lasinavir y agentes similares;

Inhibidores de entrada, unión y fusión tal como enfuvirtida (T-20), T-1249, PRO-542, PROMO, TNX-355, BMS-806, BMS-663068 y BMS-626529, 5-Hélice y agentes similares;

Inhibidores de integrasa tal como raltegravir, elvitegravir, dolutegravir, cabotegravir, bictegravir y agentes similares;

Inhibidores de maduración tal como PA-344 y PA-457, y agentes similares; y

Inhibidores de CXCR4 y/o CCR5 tal como vicriviroc (Sch-C), Sch-D, TAK779, maraviroc (UK 427.857), TAK449, así como aquellos divulgados en WO 02/74769, PCT/US03/39644, PCT/US03/39975, PCT/US03/39619, PCT/US03/39618, PCT/US03/39740 y PCT/US03/39732, y agentes similares.

En la Tabla 2 se encuentran ejemplos adicionales donde el compuesto de la presente invención se puede usar en combinación con uno o más agentes útiles en la prevención o tratamiento de VIH.

Tabla 2:

La presente invención se puede usar en combinación con otros agentes que inducen la expresión de VIH, tal como agentes de inversión de latencia. Varios agentes de inversión de latencia incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: inhibidores de histona desacetilasa (por ejemplo, vorinostat, panobinostat, romidepin), inhibidores de histona crotonil transferasa (corotonato de sodio), agonistas de proteína quinasa C (por ejemplo, briostatina, ingenol B), disulfiram, agonistas de TLR7 (por ejemplo, GS-9620), inhibidores de bromodominio (por ejemplo, JQ1, iBET 151). Muchos de estos agentes se describen en detalle adicional más adelante.

La presente invención se puede usar en combinación con otros agentes que inducen la expresión de VIH, tal como agentes para terapia de eliminación. Varios ejemplos de agentes para la terapia de eliminación, o de combinaciones inmunológicas para la eliminación, incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: anticuerpos neutralizantes y ampliamente neutralizantes (bNAb), eCD4-lg, CD4-lg y proteínas de redireccionamiento de doble afinidad (DART).

El alcance de las combinaciones del compuesto de esta invención con agentes contra el VIH no se limita a los mencionados anteriormente, sino que incluye en principio cualquier combinación con cualquier composición farmacéutica útil para el tratamiento y/o prevención del VIH. Como se señaló, en estas combinaciones, el compuesto de la presente invención y otros agentes de VIH se pueden administrar por separado o en conjunto. Además, un agente puede ser anterior, simultáneo o posterior a la administración de otros agentes.

La presente invención se puede usar en combinación con uno o más agentes útiles como potenciadores farmacológicos, así como con o sin compuestos adicionales para la prevención o tratamiento de VIH. Ejemplos de estos potenciadores farmacológicos (o potenciadores farmacocinéticos) incluyen, pero no se limitan a, ritonavir, GS-9350 (cobicistat) y SPI-452.

El ritonavir es ácido 10-hidroxi-2-metil-5-(1-metil)-1-1[2-(1-metiletil)-4-tiazolil] -3,6-dioxo-8,11-bis(fenilmetil)-2,4,7,12-tetraazatridecan-13-oico, éster 5-tiazolilmetílico, [5S-(5S*,8R*,10R*,11<r>*)] y está disponible en Abbott Laboratories de Abbott Park, Illinois, como Norvir. El ritonavir es un inhibidor de proteasa de VIH indicado con otros agentes antirretrovirales para el tratamiento de la infección por VIH. El ritonavir también inhibe el metabolismo del fármaco mediado por P450, así como el sistema de transporte celular de la glicoproteína P (Pgp), lo que resulta en un aumento de las concentraciones de compuesto activo dentro del organismo.

GS-9350 (cobicistat) es un compuesto que se está desarrollando por Gilead Sciences de Foster City California como potenciador farmacológico.

SPI-452 es un compuesto que se está desarrollado por Sequoia Pharmaceuticals de Gaithersburg, Maryland, como potenciador farmacológico.

En una realización de la presente invención, un compuesto como se definió anteriormente se usa en combinación con ritonavir. En una realización, la combinación es una combinación de dosis fija oral. En otra realización, el compuesto como se definió anteriormente se formula como una inyección parenteral de acción prolongada y ritonavir se formula como una composición oral. En una realización, un kit que contiene el compuesto como se definió anteriormente se formula como una inyección parenteral de acción prolongada y ritonavir formulado como una composición oral. En otra realización, el compuesto como se definió anteriormente se formula como una inyección parenteral de acción prolongada y ritonavir se formula como una composición inyectable. En una realización, un kit que contiene el compuesto como se definió anteriormente se formula como una inyección parenteral de acción prolongada y ritonavir formulado como una composición inyectable.

En otra realización de la presente invención, un compuesto como se definió anteriormente se usa en combinación con GS-9350. En una realización, la combinación es una combinación de dosis fija oral. En otra realización, el compuesto como se definió anteriormente se formula como una inyección parenteral de acción prolongada y GS-9350 se formula como una composición oral. En una realización, se proporciona un kit que contiene el compuesto como se definió anteriormente formulado como una inyección parenteral de acción prolongada y GS-9350 formulado como una composición oral. En otra realización, el compuesto como se definió anteriormente se formula como una inyección parenteral de acción prolongada y GS-9350 se formula como una composición inyectable. En una realización, un kit que contiene el compuesto como se definió anteriormente se formula como una inyección parenteral de acción prolongada y GS-9350 formulado como una composición inyectable.

En una realización de la presente invención, un compuesto como se definió anteriormente se usa en combinación con SPI-452. En una realización, la combinación es una combinación de dosis fija oral. En otra realización, el compuesto como se definió anteriormente se formula como una inyección parenteral de acción prolongada y SPI-452 se formula como una composición oral. En una realización, se proporciona un kit que contiene el compuesto como se definió anteriormente formulado como una inyección parenteral de acción prolongada y SPI-452 formulado como una composición oral. En otra realización, el compuesto como se definió anteriormente se formula como una inyección parenteral de acción prolongada y SPI-452 se formula como una composición inyectable. En una realización, se proporciona un kit que contiene el compuesto como se definió anteriormente formulado como una inyección parenteral de acción prolongada y SPI-452 formulado como una composición inyectable.

En una realización de la presente invención, un compuesto como se definió anteriormente se usa en combinación con compuestos que se encuentran en el documento PCT/CN2011/0013021 presentado previamente.

Los otros agentes terapéuticos anteriores, cuando se emplean en combinación con las entidades químicas descritas en la presente, se pueden usar, por ejemplo, en las cantidades indicadas en Physicians 'Desk Reference (PDR) o como se determina de otro modo por un experto en la técnica.

En otra realización de la invención, se proporciona un compuesto como se definió anteriormente para su uso en el tratamiento de una infección viral en un mamífero mediada al menos en parte por un virus en la familia deretrovirusde virus en donde el mamífero se ha diagnosticado con la infección viral o está en riesgo de desarrollar la infección viral.

En otra realización de la invención, se proporciona un compuesto como se definió anteriormente para su uso en el tratamiento de una infección viral en un mamífero mediada al menos en parte por un virus en la familia deretrovirusde virus en donde el mamífero se ha diagnosticado con la infección viral o está en riesgo de desarrollar la infección viral, en donde el virus es un virus VIH. En algunas realizaciones, el virus VIH es el virus VIH-1.

En otra realización de la invención, se proporciona un compuesto como se definió anteriormente y una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes activos contra un virus VIH para su uso en el tratamiento de una infección viral en un mamífero mediada al menos en parte por un virus en la familia deretrovirusde virus en donde el mamífero se ha diagnosticado con la infección viral o está en riesgo de desarrollar la infección viral.

En otra realización de la invención, se proporciona un compuesto como se definió anteriormente y una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes activos contra el virus VIH para su uso en el tratamiento de una infección viral en un mamífero mediada al menos en parte por un virus en la familia deretrovirusde virus en donde el mamífero se ha diagnosticado con la infección viral o está en riesgo de desarrollar la infección viral, en donde el agente activo contra el virus VIH se selecciona de inhibidores de transcriptasa inversa de nucleótidos; inhibidores de transcriptasa inversa no de nucleótidos; inhibidores de proteasa; inhibidores de entrada, unión y fusión;

Inhibidores de integrasa; Inhibidores de maduración; inhibidores de CXCR4; e inhibidores de CCR5.

En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto como se definió anteriormente o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el agotamiento de infectados por VIH latente.

En una realización de la invención, la invención se refiere a un compuesto (compuesto 1) de la fórmula:

o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. La invención también incluye una composición farmacéutica que comprende este compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un excipiente farmacéuticamente aceptable que incluye, por ejemplo, los establecidos en la presente. La invención también incluye este compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, así como combinaciones, para su uso en el tratamiento de una infección por VIH. La invención también incluye este compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de una infección por VIH. La invención también incluye este compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, así como combinaciones del mismo, para su uso en el agotamiento de células infectadas por VIH latente.

En diversas realizaciones, el agotamiento de la infección latente por VIH comprende además administrar al sujeto uno o más agentes adicionales activos contra el VIH como se divulgó anteriormente. Como ejemplo, en diversas realizaciones, el uno o más agentes adicionales se seleccionan del grupo que consiste en inhibidores de transcriptasa inversa de nucleótidos, inhibidores de transcriptasa inversa no nucleotídicos, inhibidores de proteasa, inhibidores de entrada, inhibidores de unión y fusión, inhibidores de integrasa, inhibidores de maduración, inhibidores de CXCR4 y/o CCR5, inhibidores de histona desacetilasa, inhibidores de histona crotonil transferasa, agonistas de proteína quinasa C, inhibidores de proteasoma, agonistas de TLR7, inhibidores de bromodominio y anticuerpos para terapia de eliminación, y combinaciones de los mismos. En diversas realizaciones, uno o más agentes adicionales activos contra el VIH se seleccionan del grupo que consiste en zidovudina, didanosina, lamivudina, zalcitabina, abacavir, estavudina, adefovir, adefovir dipivoxil, fozivudina, todoxil, emtricitabina, alovudina, amdoxovir, elvucitabina, nevirapina, delavirdina . efavirenz, loviride, inmunocal, oltipraz, capravirina, lersivirina, GSK2248761, TMC-278, TMC-125, etravirina, saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, fosamprenavir, brecanavir, darunavir, atazanavir, tipranavir, palinavir, lasinavir, enfuvirtida, T-20, T-1249, PRO-542, PRO-14C), TNX-355, BMS-806, BMS-663068 y BMS-626529, 5-Hélice, raltegravir, elvitegravir, dolutegravir,cabotegravir, bictegravir, vicriviroc (Sch-C), Sch-D, TAK779, maraviroc, TAK449, didanosina, tenofovir, lopinavir, darunavir, vorinostat, panobinostat, romidepin, ácido valprónico, mocetinostat, corotonato de sodio, briostatina, ingenol B, disulforam, GS-9620, JQ1, iBET 151, bortezomib, galato de epigalocatequina, salinosporamida A, carfilzomib, y anticuerpos neutralizantes, eCD4-lg, CD4-lg, bNAb, DARTS e IgA.

En otra realización, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un diluyente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto como se definió anteriormente o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

El compuesto de la presente invención se puede suministrar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Los términos "sal farmacéuticamente aceptable" se refieren a sales preparadas a partir de bases y ácidos inorgánicos y orgánicos farmacéuticamente aceptables. Por consiguiente, se entiende que la palabra "o" en el contexto de "un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo" se refiere a un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo (alternativa), o un compuesto y una sal farmacéuticamente aceptable del mismo (en combinación).

Como se usa en la presente, el término “farmacéuticamente aceptable” se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones y formas de dosificación que son, dentro del alcance de un buen juicio médico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación u otro problema o complicación. El experto en la técnica apreciará que se pueden preparar sales farmacéuticamente aceptables del compuesto como se definió anteriormente. Estas sales farmacéuticamente aceptables se pueden prepararin situdurante el aislamiento y purificación final del compuesto, o haciendo reaccionar por separado el compuesto purificado en su forma de ácido libre o base libre con una base o ácido adecuado, respectivamente.

Sales de ácidos farmacéuticamente aceptables ilustrativas del compuesto de la presente invención se pueden preparar a partir de los siguientes ácidos, que incluyen, sin limitación fórmico, acético, propiónico, benzoico, succínico, glicólico, glucónico, láctico, maleico, málico, tartárico, cítrico, nítico, ascórbico, glucurónico, maleico, fumárico, pirúvico, aspártico, glutámico, benzoico, clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, isocítrico, trifluoroacético, pamoico, propiónico, antranílico, mesílico, oxalacético, oleico, esteárico, salicílico, p-hidroxibenzoico, nicotínico, fenilacético, mandélico, embónico (pamoico), metanosulfónico, fosfórico, fosfónico, etanosulfónico, bencenosulfónico, pantoténico, toluenosulfónico, 2-hidroxietanosulfónico, sulfanílico, sulfúrico, salicílico, ciclohexilaminosulfónico, algénico, -hidroxibutírico, ácidos galactárico y galacturónico. Las sales farmacéuticamente aceptables preferidas incluyen las sales de ácido clorhídrico y ácido trifluoroacético.

Las sales de bases inorgánicas farmacéuticamente aceptables ilustrativas del compuesto de la presente invención incluyen iones metálicos. Los iones metálicos más preferidos incluyen, pero no se limitan a, sales de metales alcalinos, sales de metales alcalinotérreos y otros iones metálicos fisiológicamente aceptables apropiados. Sales derivadas de bases inorgánicas incluyen sales de aluminio, amonio, calcio, cobre, férricas, ferrosas, de litio, magnesio, mangánicas, manganosas, de potasio, sodio, zinc y similares y en sus valencias habituales. Las sales básicas de ejemplo incluyen aluminio, calcio, litio, magnesio, potasio, sodio y zinc. Otras sales básicas de ejemplo incluyen las sales de amonio, calcio, magnesio, potasio y sodio. Aún otras sales de base de ejemplo incluyen, por ejemplo, hidróxidos, carbonatos, hidruros y alcóxidos que incluyen NaOH, KOH, Na2CC>3, K2CO3, NaH y t-butóxido de potasio.

Sales derivadas de bases orgánicas no tóxicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, que incluyen en parte trimetilamina, dietilamina, N,N'-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, meglumina (N-metilglucamina) y procaína; aminas sustituidas que incluyen aminas sustituidas de origen natural; aminas cíclicas; cationes de amonio cuaternario; y resinas básicas de intercambio iónico, tal como arginina, betaína, cafeína, colina, N,N-dibenciletilendiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilendiamina, N-etilmorfolina, N-etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina y similares.

Todas las sales anteriores se pueden preparar por aquellos expertos en la técnica por medios convencionales a partir del compuesto correspondiente de la presente invención. Por ejemplo, las sales farmacéuticamente aceptables de la presente invención se pueden sintetizar a partir del compuesto original que contiene un resto básico o ácido mediante métodos químicos convencionales. Generalmente, estas sales se pueden preparar haciendo reaccionar las formas de ácido o base libre de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o ácido apropiado en agua o en un solvente orgánico, o en una mezcla de los dos; generalmente, se prefieren medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. La sal se puede precipitar de la solución y se puede recolectar por filtración o se puede recuperar por evaporación del solvente. El grado de ionización en la sal puede variar desde completamente ionizada hasta casi no ionizada. Las listas de sales adecuadas se encuentran en Remington 's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p.1418, así como en Berge, J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19, o aquellos enumerados en P H Stahl y C G Wermuth, editores,Handbook of Pharmaceutical Salts; Properties, Selection and Use, Segunda EdiciónStahl/Wermuth: Wiley- VCH/VHCA, 2011 (ver http://www.wilev.com/WilevCDM WileyTitle/productCd-3906390519.html.

El compuesto de la invención puede existir tanto en formas no solvatadas como solvatadas. El término “solvato” se usa en la presente para describir un complejo molecular que comprende el compuesto de la invención y una o más moléculas de solvente farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, etanol. El término "hidrato" se emplea cuando el solvente es agua. Los solvatos farmacéuticamente aceptables incluyen hidratos y otros solvatos en donde el solvente de cristalización puede estar sustituido isotópicamente,por ejemplo,D2O, d6-acetona, d6-DMSO.

El compuesto de la invención contiene uno o más átomos de carbono asimétricos y puede existir como dos o más estereoisómeros. Son posibles isómeros geométricoscis/trans(o Z/E). Como el compuesto contiene, por ejemplo, un grupo ceto u oxima o un resto aromático, puede ocurrir isomerismo tautomérico ('tautomerismo'). Se deduce que el compuesto puede exhibir más de un tipo de isomería.

Se incluyen dentro del alcance del compuesto reivindicado de la presente invención todos los estereoisómeros, isómeros geométricos y formas tautoméricas del compuesto, que incluyen compuestos que exhiben más de un tipo de isomería, y mezclas de uno o más de los mismos. También se incluyen sales de adición de ácido o base en donde el contraión es ópticamente activo, por ejemplo, D-lactato o L-lisina, o racémico, por ejemplo, DL-tartrato o DL-arginina.

Losisómeroscis/transse pueden separar mediante técnicas convencionales bien conocidas por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, cromatografía y cristalización fraccionada.

Las técnicas convencionales para la preparación/aislamiento de enantiómeros individuales incluyen síntesis quiral a partir de un precursor ópticamente puro adecuado o la resolución del racemato (o el racemato de una sal o derivado) usando, por ejemplo, cromatografía líquida de alta presión quiral (HPLC).

Alternativamente, el racemato (o un precursor racémico) se puede hacer reaccionar con un compuesto ópticamente activo adecuado, por ejemplo, un alcohol, o, en el caso donde el compuesto contiene un resto ácido o básico, un ácido o base tal como ácido tartárico o 1 -feniletilamina. La mezcla diastereomérica resultante se puede separar por cromatografía y/o cristalización fraccionada y uno o ambos diastereoisómeros se pueden convertir en el o los enantiómeros puros correspondientes por medios bien conocidos por un experto. Los compuestos quirales de la invención (y precursores quirales de estos) se pueden obtener en forma enantioméricamente enriquecida usando cromatografía, típicamente HPLC, en una resina con una fase estacionaria asimétrica y con una fase móvil que consiste en un hidrocarburo, típicamente heptano o hexano, que contiene de 0 a 50% de isopropanol, típicamente de 2 a 20%, y de 0 a 5% de una alquilamina, típicamente 0,1% de dietilamina. La concentración del eluato proporciona la mezcla enriquecida.

Las mezclas de estereoisómeros se pueden separar mediante técnicas convencionales conocidas por aquellos expertos en la técnica. [ver, por ejemplo, “Stereochemistry of Organic Compounds” por E L Eliel (Wiley, Nueva York, 1994).]

La presente invención incluye todos los compuestos isotópicamente marcados farmacéuticamente aceptables en donde uno o más átomos se reemplazan por átomos que tienen el mismo número atómico, pero una masa atómica o número de masa diferente de la masa atómica o número de masa generalmente encontrado en la naturaleza.

Los ejemplos de isótopos adecuados para su inclusión en el compuesto de la invención incluyen isótopos de hidrógeno, tal como 2H y 3H, carbono, tal como 11C, 13 C y 14C, cloro, tal como 36CI, flúor, tal como 18F, yodo, tal como 123l y 125l, nitrógeno, tal como 13N y 15N, oxígeno, tal como 15O,17 O y 18 O, fósforo, tal como 32P y azufre, tal como 35S. Ciertos compuestos marcados isotópicamente, por ejemplo, aquellos que incorporan un isótopo radiactivo, son útiles en estudios de distribución tisular de fármacos y/o sustratos. Los isótopos radiactivos tritio,es decir,3H, y carbono-14,es decir,14C, son particularmente útiles para este propósito en vista de su facilidad de incorporación y medios de detección listos.

La sustitución con isótopos más pesados tales como deuterio,es decir,2H, puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas resultantes de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, mayor semividain vivoo menores requisitos de dosificación y, por lo tanto, puede preferirse en algunas circunstancias.

Los compuestos marcados isotópicamente se pueden preparar generalmente por técnicas convencionales conocidas por aquellos expertos en la técnica o por procesos análogos a aquellos descritos en los ejemplos y preparaciones adjuntos usando un reactivo marcado isotópicamente apropiado en lugar del reactivo no marcado previamente empleado.

El compuesto de la presente invención se puede administrar como un profármaco. Por lo tanto, ciertos derivados del compuesto de la invención, que pueden tener poca o ninguna actividad farmacológica por sí mismos, cuando se administran en o sobre el cuerpo, se pueden convertir en el compuesto de la invención como un "profármaco".

La administración de las entidades químicas descritas en la presente puede sera travésde cualquiera de los modos de administración aceptados para agentes que sirven utilidades similares que incluyen, pero no se limitan a, oral, sublingual, subcutánea, intravenosa, intranasal, tópica, transdérmica, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal o intraocular. En algunas realizaciones, se utiliza administración oral o parenteral.

Las composiciones o formulaciones farmacéuticas incluyen formas de dosificación sólidas, semisólidas, líquidas y en aerosol, tal como, por ejemplo, tabletas, cápsulas, polvos, líquidos, suspensiones, supositorios, aerosoles o similares. Las entidades químicas también se pueden administrar en formas de dosificación de liberación sostenida o controlada, que incluyen inyecciones de depósito o preparación de implantes, bombas osmóticas, píldoras, parches transdérmicos (que incluyen electrotransporte) y similares, para una administración pulsada prolongada y/o programada a una velocidad predeterminada. En ciertas realizaciones, las composiciones se proporcionan en formas de dosificación unitarias adecuadas para la administración única de una dosis precisa. El ingrediente activo se puede comprimir en gránulos o pequeños cilindros e implantarse por vía subcutánea o intramuscular como inyecciones de depósito o implantes. Los implantes pueden emplear materiales inertes tal como polímeros biodegradables o siliconas sintéticas, por ejemplo, Silastic o caucho de silicona.

Las entidades químicas también se pueden administrar en forma de sistemas de administración de liposomas, tal como vesículas unilamelares pequeñas, vesículas unilamelares grandes y vesículas multilamelares. Los liposomas se pueden formar a partir de una variedad de fosfolípidos, tal como colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas. Las preparaciones liposómicas de inhibidores de tirosina cinasa también se pueden usar en los métodos de la invención. Se pueden usar versiones liposómicas de inhibidores de tirosina cinasa para aumentar la tolerancia a los inhibidores.

Las entidades químicas también se pueden administrar mediante el uso de anticuerpos monoclonales como portadores individuales a los que se acoplan las moléculas del compuesto.

Las entidades químicas también se pueden preparar con polímeros solubles como portadores de fármacos dirigibles. Estos polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxi-propil-metacrilamida-fenol, polihidroxietil-aspartamida-fenol o polietilenóxido-polilisina sustituido con residuos de palmitoilo. Además, las entidades químicas se pueden preparar con polímeros biodegradables útiles para lograr la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico y poliglicólico, poliepsilon caprolactona, ácido polihidroxibutírico, poliortoésteres, poliacetales, polidihidropiranos, policianoacrilatos y copolímeros de bloque reticulados o anfipáticos de hidrogeles.

Las entidades químicas descritas en la presente se pueden administrar solas o más típicamente en combinación con un portador farmacéutico convencional, excipiente o similar (por ejemplo, manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, croscarmelosa sódica, glucosa, gelatina, sacarosa, carbonato de magnesio y similares). Si se desea, la composición farmacéutica también puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tal como agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes solubilizantes, agentes amortiguadores de pH y similares (por ejemplo, acetato de sodio, citrato de sodio, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitán, acetato de trietanolamina, oleato de trietanolamina y similares). Generalmente, dependiendo del modo de administración previsto, la composición farmacéutica contendrá aproximadamente 0,005% a 95%; en ciertas realizaciones, aproximadamente 0,5% a 50% en peso de una entidad química. Los métodos reales para preparar estas formas de dosificación son conocidos, o serán evidentes, para los expertos en esta técnica; por ejemplo, verRemington 's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

En determinadas realizaciones, las composiciones tomarán la forma de una píldora o tableta y, por lo tanto, la composición contendrá, junto con el ingrediente activo, un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato dicálcico o similar; un lubricante tal como estearato de magnesio o similar; y un aglutinante tal como almidón, goma arábiga, polivinilpirrolidina, gelatina, celulosa, derivados de celulosa o similar. En otra forma de dosificación sólida, un polvo, marume, solución o suspensión (por ejemplo, en carbonato de propileno, aceites vegetales o triglicéridos) se encapsula en una cápsula de gelatina.

Las composiciones líquidas farmacéuticamente administrables se pueden preparar, por ejemplo, disolviendo, dispersando, etc. al menos una entidad química y adyuvantes farmacéuticos opcionales en un portador (por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol, glicoles, etanol o similares) para formar una solución o suspensión. Los inyectables se pueden preparar en formas convencionales, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, como emulsiones, o en formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en líquido antes de la inyección. El porcentaje de entidades químicas contenidas en estas composiciones parenterales depende en gran medida de la naturaleza específica de las mismas, así como de la actividad de las entidades químicas y de las necesidades del sujeto. Sin embargo, se pueden emplear porcentajes de ingrediente activo de 0,01% a 10% en solución y serán mayores si la composición es un sólido que posteriormente se diluirá a los porcentajes anteriores. En determinadas realizaciones, la composición comprenderá de aproximadamente 0,2 a 2% del agente activo en solución.

Las composiciones farmacéuticas de las entidades químicas descritas en la presente también se pueden administrar al tracto respiratorio como un aerosol o solución para un nebulizador, o como un polvo microfino para insuflación, solo o en combinación con un portador inerte tal como lactosa. En este caso, las partículas de la composición farmacéutica tienen diámetros de menos de 50 micrones, en determinadas realizaciones, menos de 10 micrones.

En general, las entidades químicas proporcionadas se administrarán en una cantidad terapéuticamente efectiva por cualquiera de los modos de administración aceptados para agentes que sirven utilidades similares. El régimen de dosificación que utiliza las entidades químicas descritas en la presente se puede seleccionar de acuerdo con una variedad de factores que incluyen tipo, especie, edad, peso, sexo y el tipo de enfermedad que se está tratando; la gravedad (es decir, etapa) de la enfermedad que se va a tratar; la ruta de administración; la función renal y hepática del paciente; y el compuesto particular o sal de este empleado. Un régimen de dosificación se puede utilizar, por ejemplo, para prevenir, inhibir (total o parcialmente) o detener el progreso de la enfermedad. El fármaco se puede administrar más de una vez al día, tal como una o dos veces al día.

Por vía intravenosa o subcutánea, el paciente recibiría las entidades químicas descritas en la presente en cantidades terapéuticamente efectivas suficientes para administrar entre aproximadamente 0,001 a 200 mg por kilogramo de peso corporal del receptor por día; tal como aproximadamente 0,005-100 mg/kg/día, por ejemplo, de aproximadamente 0,005 a 1 mg/kg/día. Por lo tanto, para la administración a una persona de 70 kg, el intervalo de dosificación puede ser de aproximadamente 0,35-70 mg por día. Estas cantidades se pueden administrar de varias maneras adecuadas, por ejemplo, grandes volúmenes de bajas concentraciones de las entidades químicas durante un período de tiempo prolongado o varias veces al día. Las cantidades se pueden administrar durante uno o más días consecutivos, días intermitentes o una combinación de los mismos por semana (período de 7 días). Alternativamente, bajos volúmenes de altas concentraciones de las entidades químicas durante un corto período de tiempo, por ejemplo, una vez al día durante uno o más días, ya sea consecutivamente, intermitentemente o una combinación de los mismos por semana (período de 7 días).

De acuerdo con la invención, las entidades químicas descritas en la presente se pueden administrar mediante dosificaciones continuas o intermitentes. Por ejemplo, la administración intermitente de la entidad química puede ser la administración de uno a seis días por semana o puede significar la administración en ciclos (por ejemplo, administración diaria durante dos a ocho semanas consecutivas, luego un período de descanso sin administración durante hasta una semana) o puede significar la administración en días alternos. Las composiciones se pueden administrar en ciclos, con períodos de descanso entre los ciclos (por ejemplo, tratamiento durante dos a ocho semanas con un período de descanso de hasta una semana entre tratamientos).

Las formulaciones subcutáneas se pueden preparar de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica a un pH en el intervalo entre aproximadamente 5 y aproximadamente 12, que incluyen amortiguadores y agentes de isotonicidad adecuados.

En general, las entidades químicas se administrarán como composiciones farmacéuticas por cualquiera de las siguientes rutas: administración oral, sistémica(por ejemplo,transdérmica, intranasal o por supositorio) o parenteral (por ejemplo, intramuscular, intravenosa o subcutánea). En ciertas realizaciones, se puede usar la administración oral con un régimen de dosificación diario conveniente que se puede ajustar de acuerdo con el grado de aflicción. Las composiciones pueden tomar la forma de tabletas, píldoras, cápsulas, semisólidos, polvos, formulaciones de liberación sostenida, soluciones, suspensiones, elixires, aerosoles o cualquier otra composición apropiada. Otra forma de administrar las entidades químicas proporcionadas es la inhalación.

La elección de la formulación depende de varios factores tales como el modo de administración del fármaco y la biodisponibilidad de la sustancia farmacológica. Para la administraciónporinhalación, la entidad química se puede formular como solución líquida, suspensiones, propulsores de aerosol o polvo seco y cargarse en un dispensador adecuado para su administración. Hay varios tipos de dispositivos farmacéuticos de inhalación: inhaladores nebulizadores, inhaladores de dosis medida (MDI) e inhaladores de polvo seco (DPI). Los dispositivos nebulizadores producen una corriente de aire de alta velocidad que hace que los agentes terapéuticos (que se formulan en forma líquida) se rocíen como una niebla que se transporta al tracto respiratorio del paciente. Los MDI generalmente son formulaciones envasadas con un gas comprimido. Tras el accionamiento, el dispositivo descarga una cantidad medida de agente terapéutico mediante gas comprimido, lo que proporciona un método confiable para administrar una cantidad establecida de agente. El DPI dispensa agentes terapéuticos en forma de un polvo de flujo libre que se puede dispersar en la corriente de aire inspiratoria del paciente durante la respiración por el dispositivo. Con el fin de lograr un polvo de flujo libre, el agente terapéutico se formula con un excipiente tal como lactosa. Una cantidad medida del agente terapéutico se almacena en forma de cápsula y se dispensa con cada accionamiento.

Recientemente, se han desarrollado composiciones farmacéuticas para fármacos que muestran una biodisponibilidad deficiente con base en el principio de que la biodisponibilidad se puede aumentar aumentando el área superficial, es decir, disminuyendo el tamaño de partícula. Por ejemplo, la patente estadounidense núm. 4.107.288 describe una formulación farmacéutica que tiene partículas en el intervalo de tamaño de 10 a 1.000 nm en la que el material activo está soportado en una matriz reticulada de macromoléculas. La patente estadounidense núm. 5.145.684 describe la producción de una formulación farmacéutica en la que la sustancia de fármaco se pulveriza en nanopartículas (tamaño de partícula promedio de 400 nm) en presencia de un modificador de superficie y luego se dispersa en un medio líquido para dar una formulación farmacéutica que exhibe una biodisponibilidad notablemente alta.

Las composiciones comprenden, en general, al menos una entidad química descrita en la presente en combinación con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los excipientes aceptables no son tóxicos, ayudan a la administración y no afectan negativamente el beneficio terapéutico de la por lo menos una entidad química descrita en la presente. Este excipiente puede ser cualquier excipiente sólido, líquido, semisólido o, en el caso de una composición de aerosol, gaseoso que esté generalmente disponible para un experto en la técnica.

Excipientes farmacéuticos sólidos incluyen almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de magnesio, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, cloruro de sodio, leche descremada seca y similares. Los excipientes líquidos y semisólidos se pueden seleccionar de glicerol, propilenglicol, agua, etanol y diversos aceites, que incluyen aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, etc. Los portadores líquidos, para soluciones inyectables, incluyen agua, solución salina, dextrosa acuosa y glicoles.

Los gases comprimidos se pueden usar para dispersar una entidad química descrita en la presente en forma de aerosol. Gases inertes adecuados para este fin son nitrógeno, dióxido de carbono, etc. Otros excipientes farmacéuticos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington 's Pharmaceutical Sciences, editado por E. W. Martin (Mack Publishing Company, 18a ed., 1990).

La cantidad de la entidad química en una composición puede variar dentro del intervalo completo empleado por aquellos expertos en la técnica. Típicamente, la composición contendrá, sobre una base de porcentaje en peso (% en peso), de aproximadamente 0,01-99,99% en peso de al menos una entidad química descrita en la presente con base en la composición total, el resto que es uno o más excipientes farmacéuticos adecuados. En determinadas realizaciones, la por lo menos una entidad química descrita en la presente está presente a un nivel de aproximadamente 1-80% en peso.

En diversas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención abarcan el compuesto de la invención, sales de este y combinaciones de los anteriores.

Los diversos modos de administración, dosificaciones y programas de dosificación descritos en la presente simplemente establecen realizaciones específicas y no se deben interpretar como que limitan el amplio alcance de la invención. Cualquier permutación, variación y combinación de las dosificaciones y los programas de dosificación se incluyen dentro del alcance de la presente invención.

Métodos sintéticos

Los métodos de síntesis para las entidades químicas proporcionadas emplean materiales de partida fácilmente disponibles usando los siguientes métodos y procedimientos generales. Se apreciará que donde se proporcionan condiciones de proceso típicas o preferidas (es decir, temperaturas de reacción, tiempos, relaciones molares de reactivos; disolventes, presiones, etc.), también se pueden usar otras condiciones de proceso a menos que se indique lo contrario. Las condiciones de reacción óptimas pueden variar con los reactivos o solventes particulares utilizados, pero un experto en la técnica puede determinar estas condiciones mediante procedimientos de optimización de rutina.

Además, los métodos de esta invención pueden emplear grupos protectores que evitan que ciertos grupos funcionales experimenten reacciones no deseadas. Los grupos protectores adecuados para varios grupos funcionales, así como las condiciones adecuadas para proteger y desproteger grupos funcionales particulares son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, numerosos grupos protectores se describen en T. W. Greene y G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, tercera edición, Wiley, Nueva York, 1999, y referencias citadas allí.

Además, las entidades químicas proporcionadas pueden contener uno o más centros quirales y estos compuestos se pueden preparar o aislar como estereoisómeros puros,es decir,como enantiómeros o diastereómeros individuales, o como mezclas enriquecidas con estereoisómeros. Todos estos estereoisómeros (y mezclas enriquecidas) se incluyen dentro del alcance de esta especificación, a menos que se indique lo contrario. Los estereoisómeros puros (o mezclas enriquecidas) se pueden preparar usando, por ejemplo, materiales de partida ópticamente activos o reactivos estereoselectivos bien conocidos en la técnica. Alternativamente, las mezclas racémicas de estos compuestos se pueden separar usando, por ejemplo, cromatografía en columna quiral, agentes de resolución quiral y similares.

Los materiales de partida para las siguientes reacciones son compuestos generalmente conocidos o se pueden preparar mediante procedimientos conocidos o modificaciones obvias de los mismos. Por ejemplo, muchos de los materiales de partida están disponibles de proveedores comerciales tales como Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wisconsin, EE. UU.), Bachem (Torrance, California, EE. UU.), Ernka-Chemce o Sigma (St. Louis, Missouri, EE. UU.). Otros se pueden preparar mediante procedimientos, o modificaciones obvias de los mismos, descritos en textos de referencia estándar tal como Fieser y Fieser 's Reagents for Organic Synthesis, Volúmenes 1 -15 (John Wiley and Sons, 1991), Rodd' s Chemistry of Carbon Compounds, Volúmenes 1 -5 y Supplemental (Elsevier Science Publishers, 1989), Organic Reactions, Volúmenes 1-40 (John Wiley and Sons, 1991), March 's Advanced Organic Chemistry, (John Wiley and Sons, 4a Edición) y Larock' s Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers Inc., 1989).

A menos que se especifique lo contrario, las reacciones descritas en la presente tienen lugar a presión atmosférica, generalmente dentro de un intervalo de temperatura de -78 °C a 200 °C. Además, excepto como se emplea en los Ejemplos o como se especifica de otra manera, se pretende que los tiempos y condiciones de reacción sean aproximados,por ejemplo,que tengan lugar a aproximadamente presión atmosférica dentro de un intervalo de temperatura de aproximadamente -78 °C a aproximadamente 110 °C durante un período de aproximadamente 1 a aproximadamente 24 horas; se deja que las reacciones se ejecuten durante la noche durante un período promedio de aproximadamente 16 horas.

Los términos "solvente", "solvente orgánico" y "solvente inerte" significan cada uno un solvente inerte en las condiciones de la reacción que se describe junto con este, que incluyen, por ejemplo, benceno, tolueno, acetonitrilo, tetrahidrofuranilo ("THF"), dimetilformamida ("DMF"), cloroformo, cloruro de metileno (o diclorometano), éter dietílico, metanol, N-metilpirrolidona ("NMP"), piridina y similares.

El aislamiento y la purificación de las entidades químicas y compuestos intermedios descritos en la presente se pueden ver afectados, si se desea, por cualquier procedimiento de separación o purificación adecuado tal como, por ejemplo, filtración, extracción, cristalización, cromatografía en columna, cromatografía de capa fina o cromatografía de capa gruesa, o una combinación de estos procedimientos. Se pueden tener ilustraciones específicas de procedimientos de separación y aislamiento adecuados con referencia a los ejemplos a continuación en la presente. Sin embargo, también se pueden usar otros procedimientos de separación o aislamiento equivalentes.

Cuando se desee, los isómeros (R) y (S) se pueden resolver mediante métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, mediante la formación de sales o complejos diastereoisoméricos que se pueden separar, por ejemplo, mediante cristalización;mediantela formación de derivados diastereoisoméricos que se pueden separar, por ejemplo, mediante cristalización, cromatografía de gas-líquido o líquida; reacción selectiva de un enantiómero con un reactivo específico de enantiómero, por ejemplo, oxidación o reducción enzimática, seguido de la separación de los enantiómeros modificados y no modificados; o cromatografía de gas-líquido o líquida en un entorno quiral, por ejemplo, en un soporte quiral, tal como sílice con un ligando quiral unido o en presencia de un solvente quiral. De manera alternativa, un enantiómero específico se puede sintetizar por síntesis asimétrica usando reactivos, sustratos, catalizadores o solventes ópticamente activos, o convirtiendo un enantiómero en el otro por transformación asimétrica.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos sirven para describir más completamente la manera de hacer y usar la invención descrita anteriormente. En los ejemplos más adelante, las siguientes abreviaturas tienen los siguientes significados. Si una abreviatura no está definida, tiene su significado generalmente aceptado.

ac. = Acuoso

pL = Microlitros

pM = Micromolar

RMN = resonancia magnética nuclear

Boc = terc-butoxicarbonilo

Br = Amplio

Cbz = Benciloxicarbonilo

d = Doblete

A = desplazamiento químico

°C = grados celcius

DCM = Diclorometano

dd = doblete de dobletes

DMAP = 4-(dimetilamino)piridina

DMEM = Medio de Eagle modificado por Dulbeco

DMF = N,N-dimetilformamida

DMP = 2,2-dimetoxipropano

DMSO = Dimetilsulfóxido

EtOAc = acetato de etilo

ESI = ionización por electroaspersión

G o g = Gramos

h o hr = Horas

HCV = virus de la hepatitis C

HPLC = cromatografía líquida de alta resolución

Hz = Hertz

III = Unidades internacionales

IC<50>= concentración inhibidora al 50% de inhibición

J = constante de acoplamiento (dada en Hz a menos que se indique lo contrario

)

LHMDS = Litio bis(trimetilsilil)amida

H = Multiplete

M = Molar

M+H<+>= pico de espectro de masas principal más H<+>

Mg o mg = Miligramo

Min = Minutos

ml = mililitro

mM = Milimolar

Mmol = Milimol

MS = espectro de masas

Nm = Nanomolar

ppm = partes por millón

p-TsOH = ácido p-toluenosulfónico

q.s. = cantidad suficiente

S = Singlete

RT = temperatura ambiente

sat. = Saturada

T = Triplete

TBS-CI = cloruro de terc-butildimetilsililo

TFA = ácido trifluoroacético

Descripción del equipo

Los espectros de<1>H NMR se registraron en un espectrómetro Varian. Los desplazamientos químicos se expresan en partes por millón (ppm, unidades). Las constantes de acoplamiento están en unidades de hertz (Hz). Los patrones de división describen multiplicidades aparentes y se designan como s (singlete), d (doblete), t (triplete), q (cuarteto), quinteto (quinteto), m (multiplete), br (amplio).

Los espectros de masas analíticos de baja resolución (MS) se registraron en Waters (Acquity). Se emplearon las siguientes condiciones descritas más adelante.

Instrumento: Agilent 1200-6100

Modo de escaneo: Electropulverización alterna positiva/negativa

Intervalo de escaneo: 100-1000 amu

Condiciones de LC:

El análisis LCMS se realizó en una columna HALO C-18, 4,6*50 mm, 2,7 pm, C18 a 45 °C.

Se inyectó 1,0 uL de muestra.

El gradiente empleado fue:

Fase móvil A: Agua ácido fórmico al 0,1 % v/v Fase Móvil B: Acetonitrilo ácido fórmico al 0,1 % v/v

Tiempo %A %B Velocidad de flujo

0,00 min 95 5 1,8 ml/min

1,0 min 5 95 1,8 ml/min

2,0 min 5 95 1,8 ml/min

2,5 min 95 5 1,8 ml/min

Detección UV proporcionada por la señal de absorbancia sumada a 214 nm y 254 nm de barrido.

Instrumento: Shimadzu LCMS-2020

Modo de escaneo: Electropulverización alterna positiva/negativa

Intervalo de escaneo: 100-2000 amu

Condiciones de LC:

El análisis LCMS se realizó en una columna HALO C-18, 4,6*50 mm, 2,7 |jm, C18 a 45 °C.

Se inyectó 1,0 uL de muestra.

El gradiente empleado fue:

Fase móvil A: Agua ácido fórmico al 0,1 % v/v Fase Móvil B: Acetonitrilo ácido fórmico al 0,1 % v/v

Tiempo %A %B Velocidad de flujo

0,00 min 95 5 1,5 ml/min

1,0 min 5 95 1,5 ml/min

2,0 min 5 95 1,5 ml/min

2,5 min 95 5 1,5 ml/min

3,0 min 95 5 1,5 ml/min

Detección UV proporcionada por la señal de absorbancia sumada a 214 nm y 254 nm de barrido.

Compuesto Intermedio I:

ácido (4S,7S,9aS)-4-((S)-2-((terc-butoxicarbonil)(metil)amino)propanamido)-8,8-dimetil-5-oxooctahidropirrolo [2,1-b1[1,31 tiazepina-7-carboxílico

Paso 1: (E)-1-(2-nitroest¡r¡l)p¡rrol¡d¡na

A una solución de 1-metil-2-nitrobenceno (50 g, 365mmol) en N,N-dimetilformamida (200 ml) se añadió pirrolidina (31,1 g, 438 mmol) y 1,1-dimetoxi-N,N-dimetilmetanamina (52,2 g, 438 mmol). La mezcla resultante se agitó a 60 °C. Después de 5 h, la temperatura se aumentó a 80 °C y se agitó durante 17 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se dividió entre metil terc-butil éter (500 ml) y agua (1 L). Se separó la fase acuosa y se extrajo con metil terc-butil éter (500 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron para proporcionar (E)-1-(2-nitroestiril)pirrolidina (80 g, crudo) como un aceite rojo oscuro. Esto se usó para el siguiente paso sin purificación adicional.

Paso 2: 1-(2,2-d¡metox¡et¡l)-2-n¡trobenceno

A una solución de (E)-1-(2-nitroestiril)pirrolidina (80 g, crudo) en metanol (600 ml) se añadió trimetilclorosilano (59,5 g, 550 mmol) lentamente. La mezcla se calentó a reflujo durante 24 h. En ese momento, la solución se dejó enfriar a temperatura ambiente y se concentró al vacío para obtener el residuo. Se dividió entre acetato de etilo (500 ml) y ácido cítrico acuoso al 5% (800 ml). La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 300 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con bicarbonato de sodio acuoso al 5 % (300 mL) seguido de salmuera. El producto crudo se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró para dar 1-(2,2-dimetoxietil)-2-nitrobenceno (79 g, crudo) como aceite rojo oscuro que se usó para el siguiente paso sin purificación adicional.

Paso 3: 2-(2.2-d¡metox¡et¡l)an¡l¡na

A una solución de 1-(2,2-dimetoxietil)-2-nitrobenceno (79 g, 374,4 mmol) en metanol (1 L) se añadió paladio sobre carbón activado (17,6 g). La mezcla se agitó bajo hidrógeno a 50 psi a temperatura ambiente durante 17 h. La mezcla se filtró a través de diatomita y se enjuagó con metanol. El producto filtrado se concentró para proporcionar el producto crudo. El producto crudo se disolvió en metil terc-butil éter (500 mL) y se filtró. El producto filtrado se concentró para proporcionar 2-(2,2-dimetoxietil)anilina (60 g, 331,5 mmol, 88,5% de rendimiento) como un aceite rojo oscuro. Esto se usó para el siguiente paso sin purificación adicional. RMN<1>H (400 MHz, DMSO-d<6>) 5 ppm 6,98 - 6,89 (m, 2H), 6,63 (dd,J =7,9, 1,1 Hz, 1H), 6,51 (td,J =7,4, 1,2 Hz, 1H), 4,80 (s, 2H), 4,55 (t,J=5,6 Hz, 1H), 3,25 (s, 6H), 2,72 (d,J=5,6 Hz, 2H).

Paso 4: N-(2-(2,2-dimetoxietil)fenil)formamida

A una solución de 2-(2,2-dimetoxietil)anilina (60 g, 331,5 mmol) y formiato de etilo (36,8 g, 497,2 mmol) en tetrahidrofurano seco (400 mL) se añadió una solución de bis(trimetilsilil)amida de litio 1 M (597 mL, 597 mmol) lentamente. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 12 h y luego se calentó a reflujo durante 18 h. En ese momento se añadió cloruro de amonio saturado (200 mL) y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 * 200 mL). Las fases orgánicas se combinaron, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice [éter de petróleo/acetato de etilo (6:1 v/v)] para producirN-(2-(2,2dimetoxietil)fenil)formamida (58 g, 277,5 mmol, 83,7% de rendimiento) como un aceite rojo oscuro.

LCMS (2,5 min de ácido fórmico): Rt= 1,354 min, m/z: 209,1 [M+1]<+>, 231,9 [M+Na]<+>.

Paso 5: 1-(2.2-d¡metox¡et¡l)-2-¡soc¡anobenceno

A una solución de N-(2-(2,2 dimetoxietil)fenil)formamida (58 g, 277,5 mmol) en diclorometano (500 mL) a 0 °C se le añadió trietilamina (143 g, 1415,3 mmol) seguido de oxicloruro de fósforo (63,9 g, 416,3 mmol). La mezcla se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 2 h. En ese momento se vertió en bicarbonato de sodio acuoso saturado (300 ml) y se extrajo con diclorometano (3 * 200 ml). Las capas orgánicas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice [éter de petróleo/acetato de etilo (20:1 v/v)] para producir 1-(2,2-dimetoxietil)-2-isocianobenceno (42 g, 218,5 mmol, 79,2% de rendimiento) como un aceite marrón pálido. RMN<1>H (400 MHz, DMSO-d<6>) 5 ppm 7,57 - 7,27 (m, 4H), 4,61 (t,J =5,6 Hz, 1H), 3,27 (s, 6H), 3,0 (d,J=5,6 Hz, 2H). LCMS (2,5 min de ácido fórmico): Rt= 1,455 min, m/z: 192,0 (M+1)<+>.

Paso 6: 4.4-d¡metox¡-2.2-d¡met¡lbutanon¡tr¡lo

A una solución de diisopropilamina (89,4 ml, 682 mmol) en tetrahidrofurano (1 L) a -10 °C bajo nitrógeno se añadió una solución de n-butil litio 2,4 M en hexano (288 ml, 682 mmol). Después de 30 min, la mezcla se enfrió a -78 °C y se añadió una solución de 4,4-dimetoxibutanonitrilo (40 g, 310 mmol) en tetrahidrofurano (30 ml). Después de 1 h, se añadió yoduro de metilo (42,4 ml, 682 mmol) muy lentamente. La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. En ese momento se inactivó con cloruro de amonio acuoso saturado y se extrajo con acetato de etilo (3 * 400 ml). Las capas orgánicas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice [éter de petróleo/acetato de etilo (30:1 v/v)] para producir 4,4-dimetoxi-2,2-dimetilbutanonitrilo (35 g, 223 mmol, 71,9% de rendimiento) como un aceite amarillo pálido.<r>M<n 1>H (400 MHz, CDC<3>) 5 ppm 4,60 (t,J=5,4 Hz, 1H), 3,36 (s, 6H), 1,83 (d,J=5,4 Hz, 2H), 1,39 (s, 6H).

Paso 7: 4,4-d¡metox¡-2.2-dimet¡lbutanal

A una solución de 4,4-d¡metox¡-2,2-dimet¡lbutanon¡tr¡lo (27 g. 172 mmol) en diclorometano (800 ml) se añadió una solución de hidruro de diisobutilaluminio 1 M en hexano (189 ml. 189 mmol) lentamente a -78 °C durante 3.5 h. En ese momento se calentó a temperatura ambiente y se inactivó con cloruro de amonio acuoso saturado (400 mL) y sal de Rochelle (400 mL). Se extrajo la fase acuosa con diclorometano (2 * 400 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (400 mL), se secaron sobre sulfato de sodio anhidro. se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice [éter de petróleo/acetato de etilo (30:1 v/v)] para producir 4,4-dimetox¡-2,2-dimet¡lbutanal (13 g. 81,1 mmol. 47,1% de rendimiento) como un aceite incoloro. LCMS (2.5 min de ácido fórmico): Rt= 1,453 min, m/z: 182,9 (M+Na)+.

Paso 8: (4S.9aS)-4-am¡no-7-(1H-¡ndol-1-carbonil)-8.8-d¡met¡lhexah¡drop¡rrolo[2.1- b1[1.3]tiazep¡n-5(2H)-ona

a. Una mezcla de W-(terc-butoxicarbon¡l)-S-tr¡t¡l-L-homoc¡steína (11,8 g. 24,7 mmol). 1-(2.2-dimetoxiet¡l) -2-isocianobenceno (del Paso 5) (4.5 g. 23,5 mmol). 4,4-dimetox¡-2,2-dimet¡lbutanal (del Paso 7) (4.5 g. 28,2 mmol) y amoníaco 7 M en metanol (10 ml) en 2,2,2-trifluoroetanol (150 ml) se agitó a 100 °C durante 2 h. En ese momento se inactivó con solución acuosa de hidróxido de sodio 1 M (200 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3 * 150 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro. se filtraron y se concentraron para proporcionar ((2S)-1-((1-((2-(2,2-dimetox¡etil)fen¡l) am¡no)-5.5-d¡metoxi-3.3-d¡met¡l-1-oxopentan-2-¡l)am¡no)-1-oxo-4-(tr¡t¡lt¡o) butan-2-il)carbamato de terc-butilo crudo (26 g. crudo) como un sólido marrón. Se usó para el siguiente paso sin purificación adicional.

b. Además del paso a. a una solución de ((2S)-1-((1-(2-(2,2-dimetox¡etil)fen¡l) amino)-5.5-d¡metox¡-3.3-dimet¡l-1-oxopentan-2-il)amino)-1-oxo-4-(tr¡t¡lt¡o) butan-2-il)carbamato de terc-butilo crudo (26 g. crudo) en diclorometano (200 ml) se agregó ácido trifluoroacético (20 ml) lentamente. La mezcla se agitó a 40 °C durante 2 h. El solvente se concentró y el producto crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice [diclorometano/metanol (25:1 v/v)] para producir (4S.9aS)-4-amino-7-(1H-¡ndol-1-carbon¡l)-8.8-d¡met¡lhexah¡drop¡rrolo [2,1-b][1,3]tiazepin-5(2H)-ona (7.5 g. 21,0 mmol) como un sólido arenoso. LCMS (2.5 min de ácido fórmico): Rt= 1,361 min. m/z: 357,9 (M+1)+.

Paso 9: ((S)-1-(((4S,7S.9aS)-7-(1H-¡ndol-1-carbonil) -8,8-dimet¡l-5- oxooctahidropirrolo [2.1-b][1.3]t¡azep¡n-4-il)am¡no)-1-oxopropan-2-il)(met¡l)carbamato de terc-butilo

A una solución de (4S.9aS)-4-amino-7-(1H-indol-1-carbon¡l) -8,8-dimet¡lhexah¡drop¡rrolo[2,1-b][1,3]tiazep¡n-5(2H)-ona (14 g. 39,2 mmol). W-(terc-butoxicarbon¡l)-W-met¡l-L-alanina (8,76 g. 43,1 mmol). 1-hidroxibenzotriazol (5,82 g. 43,1 mmol) y 4-metilmorfolina (11,88 g. 117,6 mmol) en tetrahidrofurano (400 ml) se le agregó clorhidrato de W-(3-dimetilam¡noprop¡l)-W-etilcarbodiimida (8,27 g. 43,1 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. En ese momento se inactivó con solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (300 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 150 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (200 ml). se secaron sobre sulfato de sodio anhidro. se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice [éter de petróleo/acetato de etilo (2:1 v/v a 1:1 v/v)] para producir ((S)-1-(((4S,7R,9aS)-7-(1H-indol-1-carbon¡l)-8,8-d¡met¡l-5-oxooctah¡dropirrolo[2,1-b][1,3] tiazep¡n-4-¡l)amino)-1-oxopropan-2-¡l)(met¡l)carbamato de terc-butilo (5.2 g. 9.6 mmol. 24,5 % de rendimiento) como un sólido arenoso y el producto deseado ((S)-1-((4S,7S,9aS)-7-(1H-indol-1-carbonil) -8,8-dimetil-5-oxooctah¡drop¡rrolo [2,1-b][1,3]tiazep¡n-4-¡l)amino)-1-oxopropan-2-¡l) (metil)carbamato de terc-butilo (5.0 g. 9.2 mmol. 23,5% de rendimiento) como un sólido amarillo pálido. LCMS (2.5 min de ácido fórmico): Rt= 1,740 min. m/z: 564,8 (M+1)+.

Paso 10: ácido í4S.7S.9aS)-4-ÍÍS)-2-ííterc-butox¡carbon¡l)ímet¡l)am¡no)propanam¡do)-8.8-d¡met¡l-5-oxooctah¡drop¡rrolo [2.1-b][1.3] tiazepina-7-carboxílico

A una solución de ((S)-1 -(((4S,7S.9aS)-7-(1 H-indol-1 -carbonil)-8.8-dimet¡l-5- oxooctahidrop¡rrolo[2.1-b][1.3]t¡azepin-4-¡l)amino)-1-oxopropan-2-¡l)(met¡l)carbamato de terc-butilo (3.9 g. 7,19 mmol) en metanol (60 ml) se le agregó una solución acuosa de hidróxido de sodio 1 M (60 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. El solvente volátil se removió bajo presión reducida. La fase acuosa restante se lavó con acetato de etilo (50 ml) y el pH de la fase acuosa se ajustó con ácido cítrico a pH 3. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 * 60 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (100 ml). se secaron sobre sulfato de sodio anhidro. se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice [éter de petróleo/acetato de etilo (1:2 v/v)] para producir ácido (4S,7S,9aS)-4-((S)-2-((terc-butoxicarbon¡l)(metil) amin)propanamido) -8,8-dimet¡l-5-oxooctahidrop¡rrolo [2.1 -b][1.3] tiazepina-7-carboxílico (2 g. 4,51 mmol. 62,7% de rendimiento) como un sólido blanco. LCMS (2.5 min de ácido fórmico): Rt= 1,493 min. m/z: 443,9 (M+1). RMN 1H (400 MHz, CDCa) ó ppm 12,57 (s. 1H). 7,75 (d. J = 6.6 Hz. 1H). 5,46 (t. J = 7.2 Hz. 1H). 4,64 - 4,60 (m. 1H). 4,43 (s. 1H). 3,98 (s. 1H). 3,17-3,11 (m. 1H). 2,88 (dd. J= 14,6, 3.0 Hz. 1H). 2,74 (s. 3H). 2,27 (dd. J = 12,9, 7.5 Hz. 1H). 2,12 - 2,10 (m. 1H). 1,80 (dd. J = 13,0, 7.1 Hz. 1H). 1,74- 1,68 (m. J =

11,2 Hz, 1H), 1,40 (s, 9H), 1,25 (d, J=7,1 Hz, 3H), 1,09 (d, J = 10,6 Hz, 6H).

Ejemplo 1

(4S,4,S,7S,7,S,9aS,9a,S)-N,N,-((1S,1,S,2R,2,R)-(hexa-2,4-diino-1,6-diilbis(oxi)) bis(2,3-dihidro-1H-indeno-2,1-diil))bis(8,8-dimetil-4-((S)-2-(metilamino)propanamido)-5-oxooctahidropirrolo[2,1- b][1,3]tiazepina-7-carboxamida) diclorhidrato

Paso 1: (1S.2R)-2-(prop-2-¡n-1-¡lox¡)-2.3-d¡h¡dro-1H-¡nden-1-am¡na

A una soluc¡ón de (1S,2R)-1-am¡no-2,3-d¡h¡dro-1H-¡nden-2-ol (2 g. 13.4 mmol) en tetrah¡drofurano (50 ml) a 0 °C se añad¡ó h¡druro de sod¡o en porc¡ones (60%. d¡spers¡ón en líqu¡do de paraf¡na) (0,59 g. 14,7 mmol). La mezcla se dejó calentar a temperatura amb¡ente. Luego se agregó 3-bromoprop-1-¡no (1,75 g. 14,7 mmol) y la mezcla resultante se calentó a 70 °C. Se ag¡tó a 70 °C durante la noche. La mezcla se ¡nact¡vó con agua con h¡elo (50 mL) y se extrajo con acetato de et¡lo (3 * 30 mL). Las capas orgán¡cas comb¡nadas se lavaron con salmuera (50 mL), se secaron sobre sulfato de sod¡o anh¡dro, se f¡ltraron y se concentraron. El producto crudo se pur¡f¡có med¡ante cromatografía en gel de síl¡ce [éter de petróleo/acetato de et¡lo (3:2 v/v)] para produc¡r (1S,2R)-2-(prop-2-¡n-1-¡lox¡)-2.3-d¡h¡dro-1H-¡nden-1-am¡na (1.2 g. 6.4 mmol. 47,8% de rend¡m¡ento) como un ace¡te negro.LCMS (ES, m/z): 187,1, 188,1 [M+H]+, tiempo de retención 0,942 min.RMN<1>H (400 MHz, DMSO-d<6>S) 6 ppm 7,36 - 7,29 (m. 1H). 7,22 - 7,13 (m. 3H). 4,25 (dd.J =4.2. 2.4 Hz. 2H). 4,22 4,15 (m. 2H). 3,43 (t.J=2.4 Hz. 1H). 2,93 (qd.J=16,1, 3.5 Hz. 2H). 1,75 (s. 2H).

Paso 2: ((S)-1-(((4S,7S.9aS)-8.8-d¡met¡l-5-oxo-7-(((1S.2R)-2-(prop-2-¡n-1-¡lox¡)-

2.3-d¡h¡dro-1H-¡nden-1-¡l)carbamovl)octah¡drop¡rrolo[2.1-b][1.31t¡azep¡n-4-¡l)am¡no)-1-

oxopropan-2-¡l)(met¡l)carbamato

A una soluc¡ón de ác¡do (4S.7S.9aS)-4-((S)-2-((terc-butox¡carbon¡l)(met¡l)am¡no)propanam¡do)-8,8-d¡met¡l-5-oxooctah¡drop¡rrolo[2,1- b][1,3] t¡azep¡na-7-carboxíl¡co (260 mg. 0,587 mmol). hexafluorofosfato de 2-(7-azabenzotr¡azol-1-¡l)-N,N.N'.N'-tetramet¡luron¡o (305 mg. 0,801 mmol) y N.N- d¡¡soprop¡let¡lam¡na (138 mg. 1,068 mmol) en 1,2-d¡cloroetano (10 mL) se le agregó (1S,2R)-2-(prop-2-¡n-1-¡lox¡)-2,3-d¡h¡dro-1H-¡nden-1-am¡na (100 mg. 0,534 mmol). La mezcla se ag¡tó a 50 °C durante la noche. El solvente se remov¡ó bajo pres¡ón reduc¡da. El producto crudo se pur¡f¡có med¡ante cromatografía en gel de síl¡ce [éter de petróleo/acetato de et¡lo (1:1 v/v)] y se pur¡f¡có ad¡c¡onalmente med¡ante cromatografía en capa f¡na [acetato de et¡lo/éter de petróleo (3/2 v/v)] para produc¡r ((S)-1- (((4S,7S.9aS)-8.8-d¡met¡l-5-oxo-7-(((1S.2R)-2-(prop-2-¡n-1-¡lox¡)-2.3-d¡h¡dro-1H-¡nden-1-¡l)carbamo¡l)octah¡drop¡rrolo[2,1-b][1.3] t¡azep¡n-4-¡l)am¡no)-1-oxopropan-2-¡l)(met¡l)carbamato de terc-but¡lo (160 mg. 0,261 mmol. 48,9% de rend¡m¡ento). LCMS (2.5 m¡n de ác¡do fórm¡co): Rt= 1,662 m¡n, m/z: 634,8 (M+Na)<+>.

Paso 3: ((2S.2'S)-(((4S.4'S.7S.7'S.9aS.9a' S)-((((1S,1 'S.2R.2'R)-(hexa-2.4-d¡¡no-1.6-d¡¡lb¡s (ox¡))b¡s(2,3-d¡h¡dro-1H-¡ndeno-2.1-d¡¡l))b¡s(azaned¡¡l))b¡s(carbon¡l))b¡s(8.8-d¡met¡l-5-oxooctah¡drop¡rrolo[2.1-_______ b][ 1,3]_______ t¡azep¡na-7,4-d¡¡l)b¡s(azaned¡¡l))b¡s(1-oxopropano-1,2-d¡¡l))b¡s(met¡lcarbamato) de d¡-terc-but¡lo

a. A una soluc¡ón de ((S)-1-(((4S,7S,9aS) -8.8-d¡met¡l-5-oxo-7-(((1S,2R)-2-(prop-2-¡n-1-¡lox¡)-2.3-d¡h¡dro-1H-¡nden-1-¡l)carbamo¡l)octah¡drop¡rrolo[2,1-b][1,3] t¡azep¡n-4-¡l)am¡no)-1-oxopropan-2-¡l)(met¡l)carbamato de terc-but¡lo (160 mg.

0,261 mmol) y p¡r¡d¡na (124 mg. 1,566 mmol) en aceton¡tr¡lo (7 ml) se le agregó acetato cúpr¡co (57 mg. 0,313 mmol). La mezcla se ag¡tó a 85 °C durante 1h. La mezcla se enfr¡ó, se concentró y se d¡luyó con acetato de et¡lo (15 ml). Se añad¡ó amoníaco acuoso (d¡luc¡ón 20 veces. 15 ml). La fase acuosa se extrajo con acetato de et¡lo (2 * 10 ml). Las capas orgán¡cas comb¡nadas se lavaron con salmuera (15 ml). se secaron sobre sulfato de sod¡o anh¡dro, se f¡ltraron y se concentraron. Se pur¡f¡có el producto crudo med¡ante cromatografía en capa f¡na [acetato de et¡lo/éter de petróleo (2/1 v.v)] segu¡do de HPLC preparat¡va para dar ((2S.2'S)-(((4S.4'S.7S.7'S.9aS.9a'S)-((((1S.1'S.2R.2'R)-(hexa-2.4-d¡¡no-1.6-d¡¡lb¡s (ox¡))b¡s(2,3-d¡h¡dro-1H-¡ndeno-2,1- d¡¡l))b¡s(azaned¡¡l))b¡s(carbon¡l))b¡s(8,8-d¡met¡l-5-oxooctah¡drop¡rrolo [2.1 -b][1.3] t¡azep¡na-7,4-d¡¡l))b¡s(azaned¡¡l))b¡s(1-oxopropano-1,2-d¡¡l))b¡s(met¡lcarbamato) de d¡-but¡lo (80 mg. 0,065 mmol. 50,2% de rend¡m¡ento)<como un sól¡do blanco.>L<c>M<s (2.5 m¡n de ác¡do fórm¡co): Rt= 1,853 m¡n, m/z: 511,8 {[(M-2Boc)+2]/2}+.>

b. A una solución de ((S)-1-(((4S,7S,9aS) -8,8-dimetil-5-oxo-7-(((1S,2R)-2-(prop-2-in-1-iloxi)-2,3-dihidro-1H-inden-1-il)carbamoil)octahidropirrolo[2,1-b][1,3] tiazepin-4-il)amino)-1-oxopropan-2-il)(metil)carbamato de terc-butilo (1,0 g, 1,63 mmol) y piridina (775 mg, 9,79 mmol) en acetonitrilo (20 mL) se le agregó acetato cúprico (366 mg, 1,96 mmol). La mezcla se agitó a 85 °C durante 1 h. La mezcla de reacción se enfrió, se concentró y se diluyó con acetato de etilo (100 mL). Se añadió una solución de amoníaco 20 veces (50 mL). La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 * 50 mL). La capa orgánica se combinó y se lavó con salmuera. Se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró para obtener el crudo. El residuo se purificó mediante cromatografía en una columna de gel de sílice eluyendo con acetato de etilo/éter de petróleo = 1/1 para proporcionar el producto crudo. Luego, el producto crudo se purificó mediante HPLC preparativa para obtener di-terc-butilo((2S,2'S)-(((4S,4,S,7S,7,S,9aS,9a'S)-((((1S,1,S,2R,2,R)-(hexa-2,4-diino-1,6-diilbis (oxi))bis(2,3-dihidro-1H-indeno-2,1-diil))bis(azanodiil))bis(carbonil))bis(8,8-dimetil-5-oxooctahidropirrolo[2,1-b][1,3]tiazepina-7,4-diil))bis(azanodiil))bis(1-oxopropano-1,2- diil))bis(metilcarbamato) (800 mg, 0,65 mmol, 80,2% de rendimiento) como un sólido blanco.LCMS (ES, m/z): 1222,6, 512,2 [M/2-Boc H]+, tiempo de retención 1,735 min. RMN 1H (400 MHz, DMSO-de) 5 ppm 7,96 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,77 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 7,24 (ddd, J = 14,9, 8,9, 2,8 Hz, 8H), 5,48 (t, J= 7,9 Hz, 2H), 5,38 (dd, J = 8,7, 5,3 Hz, 2H), 4,67- 4,62 (m, 2H), 4,30 (m, 6H), 4,23 (s, 2H), 3,15 (t, J = 11,9 Hz, 2H), 3,03 (d, J = 4,4 Hz, 2H), 2,88 (d, J = 16,4 Hz, 2H), 2,73 (s, 6H), 2,26-2,17 (m, 2H), 2,16-2,05 (m, 6H), 1,76 (dt, J = 23,3, 10,1 Hz, 4H), 1,40 (s, 18H), 1,24 (d,J=7,1Hz, 6H), 1,07 (d, 14,9 Hz, 12H).

Paso 4: (4S,4'S,7S,7'S,9aS,9a'S)-N.N’-((1S,1'S,2R,2'R)-(hexa-2,4-diino-1,6-diilbis(oxi)) bis(2,3-dihidro-1H-indeno-2,1-d¡¡l))b¡s(8.8-d¡met¡l-4-((S)-2-(met¡lam¡no)propanam¡do)-5-oxooctah¡drop¡rrolo[2.1-b][1.31t¡azep¡na-7-carboxam¡da) diclorhidrato

A una solución de ((2S,2'S)-(((4S,4'S,7S,7'S,9aS,9a'S)-((((1S,1'S,2R,2'R)- (hexa-2,4-diino-1,6 -diilbis(oxi))bis(2,3-dihidro-1H-indeno-2,1-diil))bis(azanediil))bis(carbonil))bis(8,8-dimetil-5-oxooctahidropirrolo[2,1] -b][1,3]tiazepina-7,4-diil))bis(azanediil))bis(1-oxopropano-1,2-diil))bis(metilcarbamato) de di-terc-butilo (80 mg, 0,065 mmol) en diclorometano (5 ml) se añadió cloruro de hidrógeno 4 N en 1,4-dioxano (1,5 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El solvente se removió bajo presión reducida y el sólido se secó a alto vacío para proporcionar (4S,4'S,7S,7'S,9aS,9a 'S)-N,N'-((1S,1 S,2R,2'R)-(hexa-2,4-diino-1,6-diilbis (oxi))bis(2,3-dihidro-1H-indeno-2,1-diil))bis(8,8-dimetil-4- ((S)-2-(metilamino)propanamido)-5-oxooctahidropirrolo[2,1- b][1,3] tiazepina-7-carboxamida)diclorhidrato (55 mg, 0,050 mmol, 76,9 % de rendimiento) como un sólido blanco. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) ó ppm 9,53-9,50 (m, 2H), 8,95-8,91 (m, 2H), 8,88 (d, J= 7,2 Hz, 2H), 8,00 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 7,28-7,20 (m, 8H), 5,51 (t, J= 7,8 Hz, 2H), 5,38 (dd, J= 8,6, 5,4 Hz, 2H), 4,76-4,71 (m, 2H), 4,24-4,28 (m, 6H), 4,23 (s, 2H), 3,93-3,85 (m, 2H), 3,22-3,16 (m, 2H), 3,10-3,00 (m, 4H), 2,94-2,90 (m, 2H), 2,47 (t, J= 5,2 Hz, 6H), 2,29-2,14 (m, 4H), 1,87-1,79 (m, 4H), 1,42 (d, J= 6,8 Hz, 6H), 1,10 (s, 6H), 1,06 (s , 6H). LCMS (2,5 min de ácido fórmico): Rt= 1,328 min, m/z: 512,0 [(M+2)/2]+.

Ejemplo de referencia 1

(4S,4'S,7S,7'S,9aS,9a'S)-N,N-((1S,1' S,2R,2,R)-(hexano-1,6-diilbis(oxi))bis(2,3-dihidro-1H-indeno-2,1-diil))bis(8,8-dimetil-4- ((S)-2-(metilamino)propanamido)-5-oxooctahidropirrolo [2,1- b][1,3]tiazepina-7-carboxamida)diclorhidrato

Paso 1: (1S.1'S.2R.2'R)-2.2'-(hexano-1.6-d¡¡lb¡s(ox¡))b¡s(2,3-d¡h¡dro-1H-¡nden-1-amina)

A una solución de (1S,2R)-1-amino-2,3-dihidro-1H-inden-2-ol (1,35 g, 9,10 mmol) en tetrahidrofurano (80 mL) a 0 °C se añadió hidruro de sodio en porciones (60%, dispersión en líquido de parafina) (428 mg, 10,70 mmol). La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente. Luego se añadió 1,6-dibromohexano (1 g, 4,12 mmol). La mezcla resultante se agitó a 70 °C durante la noche. La mezcla se inactivó con agua con hielo (50 mL) y se extrajo con acetato de etilo (3 * 30 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (50 mL), se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice [acetato de etilo/metanol (10:1 v/v)] para producir (170 mg, 0,45 mmol, 10,9% de rendimiento) como un sólido marrón. LCMS (2,5 min de ácido fórmico): Rt= 1,284 min, m/z: 381,0 (M+1)<+>.

Paso 2: ((2S.2'S)-(((4S.4'S.7S,7 'S ,9aS.9a' S)-(((1S, 1 'S ,2R.2' R)-(hexano-1,6- diilbisí oxi))bis(2,3-dihidro-1H-indeno-2,1-d¡¡l))b¡s(azaned¡¡l))b¡s(carbon¡l))b¡s(8.8-d¡met¡l-5-oxooctah¡drolo[2.1-b][1.31________tiazepina-7,4-diil))bis(azanediil))bis(1-oxopropano-1.2-d¡¡l))b¡símet¡lcarbamato) de di-ferc-butilo

A la mezcla de (1S,1'S,2R,2'R)-2,2'-(hexano-1,6-diilbis(oxi)bis(2,3-dihidro-1H- inden-1-amina) (120 mg, 0,315 mmol) y ácido (4S,7S,9aS)-4-((S)-2-((terc-butoxicarbonil)(metil)amino)propanamido)-8,8-dimetil-5-oxooctahidropirrolo[2,1-b][1,3]tiazepina-7-carboxílico (Compuesto Intermedio I) (307 mg, 0,694 mmol) en 1,2-dicloroetano (8 ml) se le agregó N-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina (233 mg, 0,945 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (162 mg, 1,26 mmol). La mezcla resultante se agitó a 50 °C durante la noche. El solvente se removió bajo presión reducida. Se purificó el producto crudo mediante cromatografía en capa fina [acetato de etilo/éter de petróleo (3/2 v/v)] seguido de HpLC preparativa para dar ((2S,2'S)-(((4S,4'S,7S,7'S,9aS,9a'S)-((((1S,1'S,2R,2'R)-(hexano-1,6- diilbis(oxi))bis(2,3-dihidro-1H-indeno-2,1-diil))bis(azanediil))bis(carbonil))bis(8,8-dimetil-5-oxooctahidropirrolo[2,1-b][1,3]tiazepina-7,4-diil))bis(azanediil))bis(1-oxopropano-1,2-diil))bis(metilcarbamato) de di-ferc-butilo (60 mg, 0,049 mmol, 15,6% de rendimiento) como un aceite incoloro. LCMS (2,5 min de ácido fórmico): Rt= 2,218 min, m/z: 515,9 {[(M-2Boc)+2]/2}<+>.

Paso 3: (4S.4'S.7S.7'S.9aS.9a'S)-N.N’-((1S.1'S.2R.2'R)-(hexano-1.6-d¡¡lb¡s(ox¡))b¡s(2,3-d¡h¡dro-1H-¡ndeno-2.1-d¡¡l))b¡s(8,8-d¡met¡l-4-______ ((S)-2-(met¡lam¡no)propanam¡do)-5-oxooctahidrop¡rrolo______ [2,1-______ b][1,3]tiazepina-7-carboxamida)d¡clorh¡drato

A una solución de ((2S,2'S)-(((4S,4'S,7S,7'S,9aS,9a'S)-((((1S,1'S,2R,2'R)-(hexano-1,6- diilbis(oxi))bis(2,3-dihidro-1H-indeno-2,1-diil))bis(azanediil))bis(carbonil))bis(8,8-dimetil-5-oxooctahidropirrolo[2,1-b][1,3]tiazepina-7,4-diil))bis(azanediil))bis(1-oxopropano-1,2-diil))bis(metilcarbamato) de di-ferc-butilo (60 mg, 0,049 mmol) en metanol (5 ml) se añadió cloruro de hidrógeno 4 N en 1,4-dioxano (4 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. El solvente se removió bajo presión reducida y el sólido se secó a alto vacío para proporcionar (4S,4'S,7S,7'S,9aS,9a 'S)-N,N'-((1S,1S,2R,2'R)-(hexano-1,6-diilbis(oxi))bis(2,3-dihidro-1H-indeno-2,1-diil))bis(8,8- dimetil-4-((S)-2-(metilamino)propanamido)-5-oxooctahidropirrolo[2,1-b][1,3] tiazepina-7-carboxamida)diclorhidrato (30 mg, 0,027 mmol, 55,1% de rendimiento) como un sólido blanco. RMN<1>H (400 MHz, DMSO-d<6>) 5 ppm 9,33 (s, 2H), 8,87-8,85 (m, 4H), 7,91 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 7,24- 7,21 (m, 8H), 5,50 (t, J= 7,8 Hz, 2H), 5,35-5,31 (m, 2H), 4,76-4,72 (m, 2H), 4,24 (s, 2H), 4,11 4,10 (m, 2H), 3,91-3,87 (m, 2H), 3,72-3,65 (m, 2H), 3,51-3,47 (m, 2H), 3,39-3,37 (m, 4H), 3,19 (t, J= 12,4 Hz, 2H), 2,98 2,97 (m, 4H), 2,93-2,89 (m, 2H), 2,48 (s, 6H), 2,24-2,13 (m, 4H), 1,84-1,79 (m, 4H), 1,41-1,39 (m, 10h), 1,08 (m, 6H), 1,05 (m, 6H). LCMS (2,5 min de ácido fórmico): Rt= 1,365 min, m/z: 1030,8 (M+1)<+>.

Ejemplo de referencia 2

(4S,4'S,7S,7'S,9aS,9a ,S)-N,N,-((1S,1'S)-(hexa-2,4-diino-1,6-diilbis(oxi))bis(1-feniletano-2,1-diil))bis(8,8-dimetil-4-((S)-2-(metilamino)propanamido)-5-oxooctahidropirrolo[2,1- b][1,3]tiazepina-7-carboxamida) diclorhidrato

Paso 1: (S)-1 -fenil-2-(prop-2-¡n-1 -iloxi)etan-1 -amina

A una solución de (S)-2-amino-2-feniletan-1-ol (6 g, 43,7 mmol) en tetrahidrofurano seco (200 mL) a 0 °C se le añadió hidruro de sodio (60 %, dispersión en líquido de parafina) (1,9 g, 48,1 mmol). La mezcla se agitó a 0 °C durante 20 min. Luego se añadió 3-bromoprop-1-ino (5,72 g, 48,1 mmol). La mezcla se calentó a 70 °C durante la noche. Tras el enfriamiento, se agregó agua con hielo (200 mL) a la mezcla y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 * 100 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice [éter de petróleo/acetato de etilo (1:1 v/v)] para producir (S)-1-fenil-2-(prop-2-in-1-iloxi)etan-1-amina (2,5 g, 14,3 mmol, 32,65 % de rendimiento) como un aceite naranja. RMN<1>H 1 (400 MHz, DMSO-d<6>) 5 ppm 7,44-7,14 (m, 5H), 4,18-4,12 (m, 2H), 4,08-4,00 (m, 1H), 3,55-3,47 (m, 1H), 3,44 - 3,37 (m, 2H), 1,84 (s, 2H).

Paso 2: ((S)-1-((((4S.7S.9aS)-8.8-d¡met¡l-5-oxo-7-(((S)-1-fen¡l-2-(prop-2-¡n-1-¡lox¡)et¡l)carbamovl)octah¡drop¡rrolo[2.1-b1[1.31t¡azep¡n-4-¡l)am¡no) -1-oxopropan-2-¡l)(met¡l)carbamato de tere-butilo

A una soluc¡ón de (S)-1-fen¡l-2-(prop-2-¡n-1-¡lox¡)etan-1-am¡na (308 mg. 1,76 mmol) en d¡clorometano (10 mL) se le agregó ác¡do (4S.7S.9aS)-4-((S)-2-((terc-butox¡carbon¡l)(met¡l)am¡no)propanam¡do)-8.8-d¡met¡l-5-oxooctah¡drop¡rrolo [2.1-b1[1.31t¡azep¡na-7-carboxíl¡co (650 mg. 1.47 mmol). hexafluorofosfato de 2-(7-azabenzotr¡azol-1-¡l)-N.N.N '.N'-tetramet¡luron¡o (948 mg. 2.49 mmol) y N.N-d¡¡soprop¡l-et¡lam¡na (454 mg. 3.52 mmol) a temperatura amb¡ente. La mezcla se ag¡tó durante la noche. La reacc¡ón se ext¡ngu¡ó con agua (300 mL) y se extrajo con d¡clorometano (3 x 20 mL). Las capas orgán¡cas comb¡nadas se lavaron con salmuera. se secaron. se f¡ltraron y se concentraron. El res¡duo se pur¡f¡có med¡ante cromatografía en gel de síl¡ce [acetato de et¡lo/éter de petróleo (1/5 v/v)] para produc¡r ((S)-1-(((4S.7S.9aS) -8.8-d¡met¡l-5-oxo-7- (((S)-1 -fen¡l-2-(prop-2-¡n-1-¡lox¡)et¡l)carbamo¡l)octah¡drop¡rrolo[2.1 -b][1.3] t¡azep¡n-4-¡l)am¡no)-1-oxopropan-2-¡l)(met¡l)carbamato de fere-but¡lo (194 mg. 0.32 mmol. 22.63 % de rend¡m¡ento) como un ace¡te amar¡llo.

LCMS (3.0 m¡n de ác¡do fórm¡co): Rt= 1.70 m¡n. m/z: 601 (M+1)<+>.

Paso 3: ((2S.2'S)-(((4S.4'S.7S.7'S .9aS.9a'S)-((3S.14S)-3.14 -d¡fen¡l-5.12-d¡oxa-2.15-d¡azahexadeca-7.9-d¡yned¡ovl)b¡s(8.8-d¡mef// -5-oxooctah¡drop¡rrolo[2.1-b¡n .3lt¡azep¡na-7.4-d¡¡l))b¡s(azaned¡¡l))b¡s(1-oxopropano-1.2-d¡¡l))b¡s(met¡lcarbamato) de d¡-tere-but¡lo

Una mezcla de ((S)-1-(((4S.7S.9aS)-8.8-d¡met¡l-5-oxo-7-(((S)-1-fen¡l-2-(prop-2-¡n-1-¡lox¡)et¡l)carbamo¡l)octah¡drop¡rrolo[2.1-b1[1.3]t¡azep¡n-4-¡l)am¡no) -1-oxopropan-2¡l)(met¡l)carbamato de terc-but¡lo (194 mg. 0.32 mmol). acetato de cobre(ll) (70.4 mg. 0.39 mmol) y p¡r¡d¡na (50.6 mg. 0.64 mmol) en aceton¡tr¡lo (10 ml) se ag¡tó a 85 °C durante 1 h. Se agregó amoníaco acuoso (d¡luc¡ón de 20 veces) a la mezcla hasta que se volv¡ó azul y la mezcla se extrajo con d¡clorometano (3 x 30 ml). Las capas orgán¡cas comb¡nadas se lavaron con salmuera. se secaron. se f¡ltraron y se concentraron. El res¡duo se pur¡f¡có med¡ante cromatografía en capa f¡na [acetato de et¡lo/éter de petróleo (2/1 v/v)] para produc¡r el producto crudo (130 mg). Este mater¡al se pur¡f¡có ad¡c¡onalmente med¡ante HPLC preparat¡va para proporc¡onar ((2S.2'S)-(((4S.4'S.7S.7'S.9aS.9a'S)-((3S.14S) -3.14-d¡fen¡l-5.12-d¡oxa-2.15-d¡azahexadeca-7.9-d¡yned¡o¡l)b¡s(8.8-d¡met¡i-5-oxooctah¡drop¡rrolo[2.1-b][1.31 t¡azep¡na-7.4-d¡¡l)) b¡s(azaned¡¡l))b¡s(1-oxopropano-1.2-d¡¡l)) b¡s(met¡lcarbamato) de d¡-íere-but¡lo (70 mg. 0.058 mmol) como un polvo blanco. LCMS (3.0 m¡n de ác¡do fórm¡co): Rt= 2.10 m¡n. m/z: 1199.7 (M+1)<+>.

Paso 4: (4S.4'S.7S.7'S.9aS.9a'S)-N.N’-((1S.1'S)-(hexa-2.4-d¡¡no-1.6-d¡¡lb¡s (ox¡))b¡s(1-fen¡letano-2.1-d¡¡l))b¡s(8.8-d¡met¡lo-4-((S)-2-(met¡lam¡no)propanam¡do) -5-oxooctah¡drop¡rrolo [2.1- b1[1.31t¡azep¡na-7-carboxam¡da) díclorhídrato

A una soluc¡ón de ((2S.2'S)-(((4S.4'S.7S.7'S.9aS.9a'S)-((3S.14S)-3.14- d¡fen¡l-5.12-d¡oxa-2.15-d¡azahexadeca-7.9-d¡¡nd¡o¡l)b¡s(8.8-d¡met¡l-5-oxooctah¡drop¡rrolo [2.1 -b][1.3] t¡azep¡na-7.4-d¡¡l))b¡s(azanod¡¡l))b¡s(1-oxopropano-1.2-d¡¡l))b¡s(met¡lcarbamato) de d¡-fere-but¡lo (70 mg. 0.058 mmol) en d¡clorometano (15 ml) se le añad¡ó cloruro de h¡drógeno (4 N en 1.4-d¡oxano. 1 ml). La reacc¡ón se ag¡tó a temperatura amb¡ente durante la noche. El solvente se concentró bajo pres¡ón reduc¡da y se secó a alto vacío para dar (4S.4'S.7S.7'S.9aS.9a'S)-N.N'-((1S.1'S)-(hexa-2.4-d¡¡no-1.6-d¡¡lb¡s (ox¡))b¡s(1-fen¡letano-2.1-d¡¡l))b¡s(8.8-d¡met¡l-4-((S)-2-(met¡lam¡no)propanam¡do) -5-oxooctah¡drop¡rrolo[2.1-b1[1.3]t¡azep¡na-7-carboxam¡da)d¡clorh¡drato (50 mg. 0.047 mmol. 79.36% de rend¡m¡ento) como un sól¡do blanco. RMN<1>H (400 MHz. DMSO-d<6>) ó ppm 9.24 (s. 2H). 8.86 (d. J = 6.4 Hz. 2H). 8.81 (d. J = 7.2 Hz. 2H). 8.38 (d. J = 8.0 Hz. 2H).

7.39-7.32 (m. 8H). 7.29-7.25 (m. 2H).5.47 (t. J = 8.0 Hz. 2H). 5.04 (q. J = 6.8 Hz. 2H). 4.73-4.69 (m. 2H). 4.30 (s.4H).

4.17 (s. 2H). 3.86 (q. J = 6.9 Hz. 2H).3.62 (d. J= 6.0 Hz. 4H). 3.19-3.13 (m. 2H). 2.92-2.87 (m. 2H). 2.47 (s. 6H ). 2.22 2.17 (m. 2H). 2.13- 2.09 (m. 2H). 1.87 (dd. J= 12.4. 8.8 Hz. 2H). 1.80-1.72 (m. 2H). 1.38 (d. J= 6.8 Hz. 6H). 1.06 (s.6H).

1.01 (s .6H). LCMS (2.5 m¡n de ác¡do fórm¡co): Rt= 1.28 m¡n. m/z: 999.7 (M+1)<+>.

Ejemplo de referencia 3

(4S,4'S,7S,7,S,9aS,9a,S)-N,N' -((1S,1'S)-(hexano-1,6-diilbis(oxi))bis(1-feniletano-2,1-diil))bis(8,8-dimetil-4-((S)-2-(metilamino)propanamido)-5-oxooctahidropirrolo[2,1- b][1,3]tiazepina-7-carboxamida)diclorhidrato

Paso 1: (1S.TS)-2.2'-(hexano-1.6-d¡¡lb¡s(ox¡))b¡s(1-fen¡letan-1-am¡na)

A una mezcla de (S)-2-am¡no-2-fen¡letan-1-ol (1.0 g. 7.20 mmol) en tetrah¡drofurano seco (20 mL) a 0 °C se le añad¡ó lentamente h¡druro de sod¡o en porc¡ones (60 %. d¡spers¡ón en líqu¡do de paraf¡na) (330 mg. 13.8 mmol) bajo n¡trógeno. La mezcla se ag¡tó a temperatura amb¡ente durante 30 m¡n y se añad¡ó una soluc¡ón de 1.6-d¡bromohexano (810 mg. 3.31 mmol) en tetrah¡drofurano seco (10 mL). La mezcla se calentó a reflujo y se ag¡tó durante otras 5 h. Tras el enfr¡am¡ento. se agregó cu¡dadosamente agua (300 mL) a la mezcla. segu¡do de la extracc¡ón con d¡clorometano (3 x 100 mL). Las capas orgán¡cas comb¡nadas se lavaron con salmuera. se secaron. se f¡ltraron y se concentraron. El res¡duo se pur¡f¡có med¡ante cromatografía en capa f¡na (d¡clorometano/metanol (7:1 v/v)] para produc¡r (1S.1'S)-2.2'-(hexano-1.6-d¡¡lb¡s(ox¡))b¡s(1-fen¡letan-1-am¡na) (410 mg. 1.15 mmol. 25.6% de rend¡m¡ento) como un ace¡te amar¡llo. LCMS (2.5 m¡n de ác¡do fórm¡co): Rt= 1.24 m¡n. m/z: 357.0 (M+1)+.

Paso 2: ((2S.2'S)-(((4S.4'S.7S.7'S.9aS.9a'S)-((3S.14S)-3.14-d¡fen// -5.12-d¡oxa-2.15-d¡azahexadecanod¡ovl)b¡s(8.8-d¡met¡l -5-oxooctah¡drop¡rrolo [2.1-b¡r¡ .3lt¡azep¡na-7.4-d¡¡l))b¡s(azaned¡¡l))b¡s(1-oxopropano-1.2-d¡¡l))b¡s(met¡lcarbamato) de d¡-terc-but¡lo

Una soluc¡ón de (1S.1'S)-2.2'-(hexano-1.6-d¡¡lb¡s(ox¡))b¡s(1-fen¡letan-1-am¡na) (90 mg. 0.25 mmol). ác¡do (4S.7S.9aS)-4-((S)-2-((terc-butox¡carbon¡l)(met¡l)am¡no)propanam¡do)-8.8-d¡met¡l-5-oxooctah¡drop¡rrolo[2.1-b][1.3] t¡azep¡na-7-carboxíl¡co (235.2 mg. 0.53 mmol). N-etox¡carbon¡l-2-etox¡-1.2-d¡h¡droqu¡nol¡na (187.3 mg. 0.76 mmol) y N,N-d¡¡soprop¡let¡lam¡na (130.5 mg. 1.01 mmol) en 1.2-d¡cloroetano (5 ml) se ag¡tó a 50 °C durante la noche. El solvente se remov¡ó bajo pres¡ón reduc¡da. El res¡duo se pur¡f¡có med¡ante cromatografía en capa f¡na [acetato de et¡lo/éter de petróleo (1:1 v/v)] para produc¡r el producto crudo (120 mg) como un ace¡te amar¡llo. Este mater¡al se pur¡f¡có ad¡c¡onalmente med¡ante HPLC preparat¡va para proporc¡onar ((2S.2'S)-(((4S.4'S.7S.7'S.9aS.9a' S)-((3S.14S) -3.14-d¡fen¡l-5.12-d¡oxa-2.15-d¡azahexadecanod¡o¡l)b¡s(8.8-d¡met¡l-5-oxooctah¡drop¡rrolo [2.1 -b][1.3] t¡azep¡na-7.4-d¡¡l)) b¡s(azaned¡¡l))b¡s(1-oxopropano-1.2-d¡¡l))b¡s(met¡lcarbamato) de d¡-ferc-but¡lo (50 mg. 0.041 mmol. 16.4 % de rend¡m¡ento) como un sól¡do blanco. LCMS (2.5 m¡n de ác¡do fórm¡co): Rt= 1.89 m¡n. m/z: 503.9 {[(M-2Boc)+2]/2}<+>.

Paso 3: (4S.4'S.7S.7'S.9aS.9a'S)-N.N’-((1S.1'S)-(hexano-1.6-d¡¡lb¡s(ox¡))b¡s(1-fen¡letano-2.1-d¡¡l))b¡s(8.8-d¡met¡l-4-((S)-2-(met¡lam¡no)propanam¡do)-5-oxooctah¡drop¡rrolo[2.1- b1[1.31t¡azep¡na-7-carboxam¡da)d¡clorh¡drato

A una soluc¡ón de ((2S.2'S)-(((4S.4'S.7S.7'S.9aS.9a'S)-((3S.14S)-3.14-d¡fen¡l-5.12-d¡oxa-2.15-d¡azahexadecanod¡o¡l)b¡s(8.8-d¡met¡l-5-oxooctah¡drop¡rrolo [2.1 -b][1.3] t¡azep¡na-7.4-d¡¡l))b¡s(azanod¡¡l))b¡s(1-oxopropano-1.2-d¡¡l))b¡s(met¡lcarbamato) de d¡- ferc-but¡lo (100 mg. 0.083 mmol) en d¡clorometano (5 ml) se le añad¡ó cloruro de h¡drógeno (4 N en 1.4- d¡oxano. 1 ml). La mezcla se ag¡tó a temperatura amb¡ente durante la noche. La mezcla se concentró bajo pres¡ón reduc¡da y se secó a alto vacío para dar (4S.4'S.7S.7'S.9aS.9a 'S)-N.N'-((1S.1 'S)-(hexano-1.6-d¡¡lb¡s(ox¡))b¡s(1-fen¡letano-2.1-d¡¡l))b¡s(8.8-d¡met¡l-4-((S)-2-(met¡lam¡no)propanam¡do)-5-oxooctah¡drop¡rrolo[2.1-b][1.3]t¡azep¡na-7-carboxam¡da) d¡clorh¡drato (41.9 mg. 0.038 mmol. 45.8% de rend¡m¡ento) como un sól¡do blanco. RMN 1H (400 MHz. DMSO-d6) 6 ppm 9.34 (s. 2H). 8.88-8.86 (m. 2H). 8.82 (d. J= 7.8 Hz. 2H). 8.36 (d. J= 8.4 Hz. 2H). 7.38-7.31 (m. 8H). 7.27-7.23 (m. 2H). 5.47 (t. J= 7.8 Hz. 2H). 5.48-5.02 (m. 2H). 4.73-4.68 (m. 2H). 4.17 (s. 2H). 3.88-3.83 (m. 2H).

3.72-3.65 (m. 2H). 3.51-3.47 (m. 6H). 3.32-3.28 (m. 4H). 3.19-3.13 (m. 2H). 2.90-2.87 (m. 2H). 2.46 (t. J= 4.4H. 6H). 2.22 2.17 (m. 2H). 2.13-2.09 (m. 2H). 1.89-1.84 (m. 2H). 1.79-1.34 (m. 2H). 1.39- 1.38 (m. 10h). 1.06 (s. 6H). 1.01 (m. 6H). LCMS (2.5 m¡n de ác¡do fórm¡co): Rt= 1.258 m¡n. m/z: 1006.8 (M+1)<+>.

Ejemplo de referencia 4

(4S,4'S,7S,7'S,9aS,9a ,S)-N,N,-((1S,1 ,S)-((1,4-fenilenbis(metileno))bis(oxi))bis(1-feniletano-2,1-diil))bis(8,8-dimetil-4- ((S)-2-(metilamino)propanamido) -5-oxooctahidropirrolo [2,1- b][1,3]tiazepina-7-carboxamida) diclorhidrato

Paso 1: (1S.1'S)-2.2'-((1.4-fen¡lenb¡s(met¡leno))b¡s(ox¡))b¡s(1-fen¡letan-1 -amina)

A una soluc¡ón de (S)-2-am¡no-2-fen¡letan-1-ol (2.2 g. 16.0 mmol) en tetrah¡drofurano seco (30 mL) se le añad¡ó h¡druro de sod¡o (60%. d¡spers¡ón en líqu¡do de paraf¡na) (760 mg. 31.6 mmol). Después de 30 m¡nutos. se añad¡ó 1.4-b¡sbromomet¡l-benceno (2.0 g. 7.6 mmol). La mezcla se ag¡tó a temperatura amb¡ente durante la noche. La mezcla se ¡nact¡vó con agua con h¡elo (50 mL) y se extrajo con acetato de et¡lo (3 x 60 mL). Las capas orgán¡cas comb¡nadas se lavaron con salmuera. se secaron (NaaScU). se f¡ltraron y se concentraron. El producto crudo se pur¡f¡có med¡ante cromatografía en gel de síl¡ce (d¡clorometano/metanol (20:1 v/v)] para produc¡r (1S.1'S)-2.2'-((1.4-fen¡lenb¡s(met¡leno))b¡s(ox¡))b¡s(1-fen¡letan-1-am¡na) (1.2 g. 3.2 mmol. 31% de rend¡m¡ento) como un ace¡te amar¡llo. LCMS (2.5 m¡n de ác¡do fórm¡co): Rt= 1.14 m¡n. m/z: 377.0 (M+1)<+>.

Paso 2: ((2S.2'S)-(((4S.4'S.7S.7'S.9aS.9a'S)-((((1S.1'S)-((1.4-fen¡lenb¡s(met¡leno))b¡s(ox¡))b¡s(1-fen¡letano-2.1-d¡¡l))b¡s(azaned¡¡l))b¡s(carbon¡l))b¡s(8.8-d¡met¡l-5-oxooctah¡droclo[2.1-b][1.3]t¡azep¡na-7.4-d¡¡l))b¡s(azaned¡¡l))b¡s(1-oxopropano-1.2-d¡¡l))b¡s(met¡lcarbamato) de d¡-terc-but¡lo de terc-but¡lo

Una soluc¡ón de (1S.1'S)-2.2'-((1.4-fen¡lenb¡s(met¡len))b¡s(ox¡))b¡s(1-fen¡letan- 1-am¡na) (100 mg. 0.266 mmol). ác¡do (4S.7S.9aS)-4-((S)-2-((terc-butox¡carbon¡l)(met¡l)am¡no)propanam¡do) -8.8-d¡met¡l-5-oxooctah¡drop¡rrolo[2.1-b][1.3] t¡azep¡na-7-carboxíl¡co (247.5 mg. 0.56 mmol). N-etox¡carbon¡l-2-etox¡-1.2-d¡h¡droqu¡nol¡na (197.1 mg. 0.80 mmol) yN,N-d¡¡soprop¡l-et¡lam¡na (137.3 mg. 0.29 mmol) en 1.2-d¡cloroetano (6 mL) se ag¡tó a 50 °C durante la noche. La mezcla se concentró bajo pres¡ón reduc¡da y se pur¡f¡có med¡ante cromatografía en capa f¡na [acetato de et¡lo/éter de petróleo (2:1 v/v)] para produc¡r el producto crudo (200 mg) como un ace¡te amar¡llo. Este mater¡al se pur¡f¡có ad¡c¡onalmente med¡ante HPLC preparat¡va para proporc¡onar ((2S.2'S)-(((4S.4'S.7S.7'S.9aS.9a'S)-((((1S.1'S)-((1.4-fen¡lenb¡s(met¡len))b¡s(ox¡))b¡s(1-fen¡letano-2.1-d¡¡l))b¡s(azanod¡¡l))b¡s(carbon¡l))b¡s(8.8-d¡met¡l-5-oxooctah¡drop¡rrolo[2.1-b][1.3] t¡azep¡na-7.4-d¡¡l))b¡s(azanod¡¡l))b¡s(1-oxopropano-1.2-d¡¡l))b¡s(met¡lcarbamato) de d¡-ferc-but¡lo de ferc-but¡lo (160 mg. 0.130 mmol. 49.1% de rend¡m¡ento) como un sól¡do blanco. LCMS (2.5 m¡n de ác¡do fórm¡co): Rt= 1.86 m¡n. m/z: 514.1 {[(M-2Boc)+2]/2}<+>.

Paso 3: (4S.4'S.7S.7'S.9aS.9a'S)-N.N’-((1S.1'S)-((1.4-fen¡lenb¡s(met¡leno))b¡s(ox¡))b¡s(1-fen¡letano-2.1-d¡¡l))b¡s(8.8-d¡met¡l-4-((S)-2-(met¡lam¡no)propanam¡do)-5-oxooctah¡drop¡rrolo[2.1-bl[1.3]t¡azep¡na-7-carboxam¡da) díclorhídrato

A una soluc¡ón de ((2S.2'S)-(((4S.4'S.7S.7'S.9aS.9a'S)-(((1S.1'S)-((1.4- fen¡lenb¡s(met¡leno))b¡s(ox¡))b¡s(1-fen¡letano-2.1-d¡¡l))b¡s(azaned¡¡l))b¡s(carbon¡l))b¡s(8.8-d¡met¡l-5-oxooctah¡droclo [2.1- b][1.3]t¡azep¡na-7.4-d¡¡l))b¡s(azaned¡¡l))b¡s(1-oxopropano-1.2-d¡¡l))b¡s(met¡lcarbamato) (160 mg. 0.13 mmol) en d¡clorometano (15 ml) se le añad¡ó cloruro de h¡drógeno (4 N en 1.4-d¡oxano. 1 ml). La reacc¡ón se ag¡tó a temperatura amb¡ente durante la noche. La mezcla se concentró bajo pres¡ón reduc¡da y se secó a alto vacío para dar (4S.4'S.7S.7'S.9aS.9a'S)-N.N'-((1S.1'S)-((1.4-fen¡lenb¡s(met¡leno))b¡s(ox¡))b¡s(1- fen¡letano-2.1-d¡¡l))b¡s(8.8-d¡met¡l-4-((S)-2-(met¡lam¡no)propanam¡do)-5-oxooctah¡drop¡rrolo [2.1-b][1.3]t¡azep¡na-7-carboxam¡da) d¡clorh¡drato (110 mg. 0.11 mmol. 78% de rend¡m¡ento) como un sól¡do blanco. RMN<1>H (400 MHz. DMSO-d<6>) 6 ppm 9.39 (s. 2H). 8.88- 8.86 (m. 2H). 8.81 (d. J= 6.8 Hz. 2H). 8.42 (d. J= 8.0 Hz. 2H). 7.39-7.32 (m.8H). 7.28-7.25 (m. 2H). 7.20 (s. 4H). 5.47 (t. J= 7.6 Hz. 2H). 5.08 (q. J= 6.0 Hz. 2H). 4.70 (t. J= 9.0 Hz. 2H). 4.49-4.43 (m. 4H). 4.18 (s. 2H). 3.86 (s. 2H). 3.72-3.63 (m. 2H). 3.55-3.47 (m. 2H). 3.13 (t. J= 12.2 Hz. 2H).

2.82-2.78 (m. 2H). 2.46 (s. 6H). 2.21-2.16 (m. 2H). 2.09-2.06 (m. 2H). 1.88-1.83 (m. 2H). 1.77-1.68 (m. 2H). 1.39 (d. J= 6.8 Hz. 6H). 1.05 (m. 6H). 0.97 (m. 6H). LCMS (2.5 m¡n de ác¡do fórm¡co): Rt= 1.334 m¡n. m/z: 1027.8 (M+1)<+>.

Ensayo de revers¡ón de latenc¡a de Jurkat.

Los clones de Jurkat VIH-luc¡ferasa se mantuv¡eron en med¡o RPMI 1640 (G¡bco de L¡fe Technolog¡es) que contenía suero bov¡no fetal al 10% (v/v) (SAFC/S¡gma-Aldr¡ch) y 25 un¡dades/mL de pen¡c¡l¡na. 25 un¡dades/mL de estreptom¡c¡na (G¡bco de L¡fe Technolog¡es) y se d¡v¡d¡eron 1:4 cada 3 a 4 días para mantener una dens¡dad celular de -0.3 a 1 m¡llón de células/mL. Los clones de Jurkat se mantuv¡eron con la ad¡c¡ón de EFV 500 nM en el med¡o. Se agregaron tres clones de células Jurkat (C16. 115 y N6). cada uno con uno o dos prov¡rus de VIH ¡ntegrados que expresan el gen ¡nd¡cador de luc¡ferasa. en cant¡dades ¡guales para un total de 5.000 células por poc¡llo a placas de 384 poc¡llos que cont¡enen t¡tulac¡ones de compuestos. Las pruebas de dos¡s-respuesta se real¡zaron en compuestos d¡sueltos en d¡met¡lsulfóx¡do (DMSO; Fisher Scientific, Merelbeke, Bélgica) dispensados en titulaciones duplicadas en serie de 3 veces, de 14 puntos usando un Dispensador de Gotitas Digital D300e (Hewlett-Packard) para dar concentraciones de ensayo finales de 10 pM a 2,1 pM en 50 pL de medio a una concentración final de DMSO al 0,5% (v/v). Las células y el compuesto se incubaron a 37 °C durante 48 horas, a menos que se indique lo contrario, seguido de la adición de 20 pL de luciferasa Steady-Glo® (Promega). La luminiscencia resultante de la inducción de la luciferasa expresada viralmente se midió usando un lector de placas de múltiples etiquetas EnVision 2102 (Perkin Elmer). Las relaciones dosis-respuesta se analizaron con GraphPad PRISM 6 utilizando un modelo de regresión logística de cuatro parámetros para calcular la concentración de compuesto que proporciona la mitad de la respuesta máxima (EC50) y el porcentaje máximo de activación en comparación con el control del vehículo.

Los resultados del ensayo anterior se establecen en la Tabla 3.

Tabla 3

Datos farmacocinéticos

Los datos farmacocinéticos (PK) de roedores de varios compuestos miméticos de SMAC se compararon con los datos PK de SMACm AZD5582 (Figura 1). Como se puede ver en la figura 1, las curvas de concentración de fármaco en plasma versus el tiempo para los compuestos demuestran una relación PK comparable a la de AZD5582.

Inducción del gen NFkB2

Se trataron 5X105 células T CD4 de donantes normales durante 24 h con diluciones en serie de compuestos a partir de 1,0 pM a 6 veces, 7 lugares. El ARN total se aisló utilizando el kit RNEasy Mini (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Los siguientes conjuntos de sondas cebadoras TaqMan se obtuvieron de Applied Biosystems: Hs00174517_m1 (NFKB2) y Hs02800695 (HPRT1). Se utilizó PCR en tiempo real basada en TaqMan (Fast Virus 1-Step Master Mix, Applied Biosystems) para amplificar los genes del huésped de interés. La expresión génica se normalizó a HPRT1 y se utilizó el método de ciclo de umbral comparativo (CT) (AACT) para el cambio de veces relativo de la expresión génica en comparación con las células no tratadas. Los datos se analizaron mediante el sistema de PCR en tiempo real QuantStudio3. Los resultados se proporcionan en la tabla 4.

p100/p52 línea WB

Cultivo y tratamiento celular

Los cultivos celulares se establecieron para evaluar varios compuestos SMACm. Las células PBMC congeladas de donantes sanos se descongelaron y se colocaron en placas de 2 ml de pocillos profundos a 2x106 células/ml. Las diluciones en serie de cada compuesto se llevaron a cabo como una dilución 1:6 de 7 veces con la dosis final inicial de 1000nM. Luego, las células se combinaron con el compuesto y se colocaron a 37° durante 24 horas. Al día siguiente, las células se sedimentaron y se colocaron a -80° hasta la lisis.

Recolección de lisis de células enteras

En preparación para la lisis celular, los sedimentos celulares congelados y una alícuota de amortiguador de lisis celular NP40 (Invitrogen, Parte# FNN0021), así como una alícuota de 10x cóctel inhibidor de proteasa (Sigma, Parte# P-2714) se descongelan en hielo. Una vez descongelado, el amortiguador de lisis completo se prepara agregando un cóctel de PI de volumen final al 10% al amortiguador NP40 y luego agregando un volumen suficiente de PMSF 0,1 M (Sigma, Parte# 93482) y DTT 1 M (Sigma, Parte# 43816) para crear una concentración final de 1 mM cada uno en el amortiguador de lisis completo. La lisis celular se lleva a cabo resuspendiendo cada sedimento celular en 30 pL por 10“6 células y luego incubando en hielo durante 30 minutos con agitación vigorosa cada 10 minutos. Las células lisadas se centrifugan a 13K RPM durante 10 minutos a 4 °C en una microcentrífuga refrigerada. Los sobrenadantes (lisados) luego se transfieren a nuevos tubos de microcentrífuga y se almacenan a -80° o se utilizan inmediatamente para la concentración de proteínas y el análisis de Western Blot.

Procedimiento de microplaca de Bradford

La concentración de proteína para cada lisado se determina usando un ensayo Bradford compatible con detergente (Pierce, Parte# 23246) siguiendo las instrucciones de la microplaca del fabricante.

Separación de proteínas e inmunodetección

El análisis Western capilar se realizó usando el sistema ProteinSimple Jess. Se preparó un total de 1ug de lisado celular de acuerdo con el protocolo proporcionado suministrado por ProteinSimple. El anticuerpo primario para p100/p52 (Cell, Señalización #3017) se diluye 1:10 para su uso en el sistema Jess. El módulo de separación Jess de cartuchos capilares de 12-230 kDa (SM-W004) se usa junto con el conjugado NIR secundario anti-conejo ( 043-819). El módulo de separación incluye placas precargadas en las que se cargan las muestras, anticuerpos primarios y secundarios, así como reactivo de normalización de proteínas y diluyentes para realizar la separación y detección. Una vez que se ha ejecutado el ensayo, los datos se analizan utilizando el software Compass proporcionado por ProteinSimple.

Análisis de inmunotransferencia

Como alternativa a la electroforesis capilar, se llevaron a cabo ensayos de inmunotransferencia tradicionales, se cargaron 10 ug de lisado celular por pocillo en geles de SDS-PAGE de Tris-Glicina al 4-20%. La proteína de los geles SDS-PAGE se transfirió a los envases de transferencia Turbo Midi PVDF (BioRad) utilizando el protocolo "MW mixto" para un gel de formato MIDI (constante 2,5A hasta 25V, durante 7 minutos) del sistema de transferencia Trans-Blot Turbo (Bio-Rad) con Trans-Blot prefabricado según las instrucciones del fabricante. Después de la transferencia, las membranas de PVDF se bloquearon en albúmina de suero bovino (BSA) al 5% en TBS 1x (BioRad) con Tween-20 al 0,1% durante 1 hora a temperatura ambiente con balanceo suave. Se agregaron anticuerpos primarios y se incubaron durante la noche a 4 °C (anti-p100/p52, Cell Signaling Technology #3017, 1:1000; conjugado anti-Actina-HRP, Abeam #49900, 1:30.000). Después de la tinción primaria, la membrana se lavó tres veces con 1x solución salina amortiguada con Tris (TBS)+ TWE<e>N® 20 al 0,1% durante 10 minutos cada lavado. Después del lavado, la membrana se incubó en BSA al 5% en 1x TBS TWEEN® 20 al 0,1% con el anticuerpo secundario apropiado durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la tinción secundaria, la membrana se lavó dos veces durante 10 minutos con 1x TBS TWEEN® 20 al 0,1% seguido de un lavado de 10 minutos con 1x TBS. La membrana luego se secó con papel de filtro y se capturó una imagen de la membrana no revelada en el Sistema de Imágenes ChemiDoc MP utilizando el software Image Lab (BioRad). Se utilizó suficiente reactivo ECL (GE Healthcare) para cubrir la membrana y se tomaron una serie de imágenes comenzando con 0,001 segundos y duplicando hasta triplicar el tiempo de exposición hasta que la luminiscencia de la membrana revelada saturó la imagen. La membrana desarrollada luego se lavó tres veces con 1x TBS durante 5 minutos para eliminar el reactivo ECL residual y luego se almacenó a 4 °C en suficiente 1x TBS para sumergir toda la membrana. La densitometría de las imágenes de la membrana revelada se llevó a cabo utilizando el software Image Lab. Algunas membranas se desprendieron durante un minuto con amortiguador de desprendimiento de transferencia Western Blot One Minute Plus (GM Biosciences) y luego se lavaron tres veces durante 10 minutos con 1x TBS. Las membranas desprendidas se bloquearon luego en BSA al 5% en TBS 1x TWEEN® 20 al 0,1% durante una hora y se volvieron a sondear durante la noche con un nuevo anticuerpo primario. Los resultados del ensayo de línea WB p100/p52 se proporcionan en la tabla 4.

ARN de VIH asociado a células (ARNca)

Durante la fase productiva del ciclo de vida viral, el VIH produce un gran número de transcritos empalmados diferencialmente denominados colectivamente ARN de VIH asociado a células (ARN ca-VIH) dentro de algunas células que están infectadas. En individuos infectados por el VIH que reciben terapia antirretroviral supresora (ART), los cambios en los niveles de ARN caVIH son una medida sustituta aceptada de la eficacia de la reversión de la latencia del VIH.

Para medir ARN caVIH, se aíslan células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de leucocitos obtenidos por leucaféresis de flujo continuo. Las células T CD4+ totales se aislaron de PBMC mediante selección negativa utilizando el kit de enriquecimiento de células T CD4+ humanas EasySep (StemCell, Vancouver, Canadá) según las recomendaciones del fabricante. Las células T CD4+ en reposo se aíslan mediante selección negativa con una columna inmunomagnética como se describió anteriormente (25) y se criopreservan inmediatamente o se mantienen durante dos días en medio IMDM (Gibco), FBS al 10%, 2ug/ml de IL-2 (Peprotech) y antirretrovirales para prevenir la expansión viral.

Para el tratamiento con SMACm, se trataron de tres a cinco réplicas de 2-5x106 células T CD4+ durante 48 horas a 37 °C en 1 ml de medio RPMI 1640, FBS al 10%, 10ug/ml de enfuvirtida (Sigma) y rilpivirina 200 nM. Se utilizó forbol 12-miristato 13-acetato 10nM (PMA; Sigma) con ionomicina 1pM (Sigma) como control positivo para la activación de LRA y se utilizó un vehículo de DMSO al 0,2% como control negativo. Después del tratamiento, las células se lisaron y el ARN y el ADN se coextrajeron usando un kit de ADN/ARN AllPrep 96 (Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante, ajustando el volumen de amortiguador de lisis a 0,6 ml, agregando un tratamiento de ADNasa I en columna (Qiagen) y eluyendo el ARN en 50pL de agua.

La RT-qPCR se realizó por triplicado para cada uno de los tres pocilios replicados utilizando la mezcla maestra RT-qPCR de 1 paso del virus TaqMan Fast (Applied Biosciences) con 5uL de ARN aislado y 900nM de cebadores de la cápside de VIH HlV-gag (5'-AT CAAGCAGCTAT GCAAAT GTT-3' (SEQ ID NO: 1)) y gag inverso (5'-CTGAAGGGTACTAGTAGTTCCTGCTATGTC-3' (SEQ ID NO: 2)) y 250nM de sonda gag de VIH FAM/ZEN/IABFQ (5'-ACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGA-3' (S<e>Q ID NO: 3)). Las muestras se amplificaron y los datos se recogieron utilizando un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio™ 3 (Applied Biosystems) con las siguientes condiciones de ciclo: un ciclo a 50 °C durante 5 minutos (transcripción inversa), un ciclo a 95 °C durante 20 segundos (inactivación de la transcriptasa inversa) y 50 ciclos a 95 °C durante 3 segundos y 60 °C durante 20 segundos (desnaturalización y reasociación/extensión).

Las copias de ARN de gag de VIH absoluto por reacción se determinaron utilizando un estándar de qPCR de gag de VIH correspondiente a la secuencia de ADN del producto de qPCR (5'-ATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGATTGCATCCAGTGCAT GCAGGGCCTATTGCACCAGGCCAGATGAGAGAACCAAGGGGAAGTGACATAGCAGGAACTACTAGTACCCTTCAG-3' (SEQ ID NO: 4); Integrated DNA Technologies), y las copias se normalizaron a los recuentos celulares como se determina mediante microscopía de campo brillante. Se requirió que la eficiencia de RT-qPCR estuviera entre 90% y 110%. Los valores de ensayo con una señal positiva que fueron menores que el límite inferior de detección (LLOD) de siete copias de gag de VIH por reacción se ajustaron al LLOD. El análisis se realizó utilizando el software de diseño y análisis QuantStudio™ (Applied Biosystems) y el paquete de software R (descrito en detalle más adelante).

En la tabla 4 se muestran los datos que comparan los datos del ensayo EC50, p100/p52 WB de Jurkat, el ensayo de inducción del gen NFkB2 y el ensayo de ARNca de varios miméticos de SMAC divulgados en la presente con miméticos competidores.

Los compuestos de la presente invención (es decir, los Ejemplos de referencia 1 a 4 y el Ejemplo 1), son SMACm diméricos potentes que son capaces de activar la vía de ncNF-kB e inducir la expresión del VIH. Estas moléculas agotan eficazmente clAP1 y clAP2, conducen a la escisión de p100 para liberar p52, activan la vía ncNF-kB e inducen la expresión de VIH. Además, estos tienen propiedades que se acoplan a la vía ncNF-kBin vivo.En particular, se cree que el Ejemplo 1 y el Ejemplo de referencia 1 poseen la mejor combinación de propiedades inesperadas y sorprendentes.

Tabla 4: Resumen de miméticos de SMAC divulgados en la presente con otros miméticos

Ej.” significa Ejemplo

en donde:

Citotoxicidad

La viabilidad celular de las células Jurkat se determinó usando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega), un método homogéneo para determinar los niveles de ATP en un pocillo de cultivo, que corresponde a la presencia de células metabólicamente activas en el cultivo. Las células se cultivaron como se indica en otra parte para los ensayos de Jurkat. Para la evaluación de la toxicidad mediada por SMACm en el contexto de TNFa se añadieron 10 ng/mL de TNFa (R&D Systems) al cultivo. Se retiró una proporción de células y se añadieron 30 pL de reactivo Promega CellTiter-Glo® a cada pocillo que contenía células y se midió la luminiscencia utilizando un lector de placas Perkin Elmer EnVision. Las relaciones dosis-respuesta se analizaron con GraphPad PRISM 6 utilizando un modelo de regresión logística de modelo de cuatro parámetros para calcular la concentración de compuesto que reduce la viabilidad celular en un 50% en comparación con los controles no tratados (CC50).

Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales.

Un experto en la técnica reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente, que se podrían usar en la práctica de la presente materia descrita en la presente. La presente divulgación no se limita de ninguna manera a los métodos y materiales descritos.

A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta materia, y son consistentes con: Singleton et al (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2a Ed., J. Wiley & Sons, Nueva York, NY; y Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, 5a Ed., Garland Publishing, Nueva York.

A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones, las palabras "comprende", "comprende" y "que comprende" se usan en un sentido no exclusivo, excepto donde el contexto requiera lo contrario. Se entiende que las realizaciones descritas en la presente incluyen “que consiste en” y/o “que consiste esencialmente en” realizaciones.

Como se usa en la presente, el término "aproximadamente", cuando se refiere a un valor, pretende abarcar variaciones de, en algunas realizaciones ± 50%, en algunas realizaciones ± 20%, en algunas realizaciones ± 10%, en algunas realizaciones ± 5%, en algunas realizaciones ± 1%, en algunas realizaciones ± 0,5% y en algunas realizaciones ± 0,1% de la cantidad especificada, como tales variaciones son apropiadas para realizar los métodos divulgados o emplear las composiciones divulgadas.

Donde se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior del intervalo y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido, está comprendido. También se abarcan los límites superior e inferior de estos intervalos pequeños que se pueden incluir independientemente en intervalos más pequeños, sometidos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. Donde el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, también se incluyen los intervalos que excluyen uno o ambos de esos límites incluidos.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
2. 2. Una sal de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la sal está presente como una sal de clorhidrato.
3. 3. La sal de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la sal de clorhidrato es una sal de diclorhidrato.
4. 4. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
5. 5. Un compuesto de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el agotamiento de células infectadas por VIH latente.
6. 6. Un compuesto de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de una infección por VIH.
7. 7. Un compuesto de la reivindicación 1 que tiene la estructura:
8. 8. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con la reivindicación 7, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
9. 9. Un compuesto de la reivindicación 7 para su uso en el agotamiento de células infectadas por VIH latente.
10. 10. Un compuesto de la reivindicación 7 para su uso en el tratamiento de una infección por VIH.
11. 11. Un compuesto de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en terapia médica.
12. 12. Un compuesto de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y uno o más agentes adicionales activos contra el VIH para su uso en el agotamiento de células infectadas por VIH.