ES2953395T3 - Compuestos para inmunoterapia dirigida - Google Patents

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Abstract

Se describen compuestos para inmunoterapia dirigida, composiciones que comprenden los compuestos y el uso de los compuestos en el tratamiento de enfermedades tales como el cáncer. Los compuestos que tienen la estructura de fórmula TM-Ln-AM, en la que TM es un resto de dirección, AM es un resto activador que es capaz de activar una célula dendrítica humana, una célula NK o una célula tumoral, o una combinación de las mismas, Ln es un enlazador, y n es un número entero seleccionado entre 0 y 1. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos para inmunoterapia dirigida
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
La presente solicitud reivindica el beneficio y la prioridad de, la solicitud de patente china No. de serie 201210248481.9, presentada el 18 de julio de 2012.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a compuestos para inmunoterapia dirigida, así como a composiciones que comprenden los mismos. Además, la presente invención se refiere a los compuestos para su uso en el tratamiento de enfermedades como el cáncer.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los anticuerpos terapéuticos se han utilizado en aplicaciones clínicas durante más de veinte años. En la actualidad, hay quince fármacos con anticuerpos antitumorales en fase clínica: Rituxan (1997), Herceptin (1998), Mylotarg (2000), Campath (2001), Zevalin (2002), Bexxer (2003), Avastin (2004), Erbitux (2004), Vectibix (2006), Arzerra (2009), Benlysta (2011), Yervoy (2011), Adcetris (2011), Perjeta (2012) y Kadcyla (2013). Estos anticuerpos se dirigen principalmente a cuatro moléculas: EGFR, Her2, CD20 y VEGF.
En general, los anticuerpos terapéuticos destruyen las células tumorales mediante tres mecanismos (Scott AM, Wolchok JD, Old LJ. Anticuerpo therapy of cancer. Nat Rev Cancer. (2012), 12 :278-87): (1) Acción directa de los anticuerpos, es decir, bloqueo o actividad agonista de la señalización ligando/receptor, inducción de la apoptosis y administración de fármacos o agentes citotóxicos. La actividad de activación del receptor del anticuerpo puede producir un efecto directo de destrucción de las células tumorales. Por ejemplo, algunos anticuerpos pueden unirse a receptores en la superficie de las células tumorales, activar el receptor y provocar la apoptosis (por ejemplo, en las mitocondrias). Los anticuerpos también pueden mediar en la destrucción de células tumorales mediante una actividad antagonista de los receptores. Por ejemplo, ciertos anticuerpos pueden unirse a receptores de la superficie celular y bloquear la dimerización, la activación de quinasas y la señalización descendente, inhibiendo así la proliferación y promoviendo la apoptosis. La unión de anticuerpos a una enzima puede provocar su neutralización, la anulación de la señal y la muerte celular. (2) A través de mecanismos de destrucción celular mediada por el sistema inmunitario, como la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC), la regulación de la función de las células T, etc. La destrucción inmunomediada de células tumorales puede lograrse de las siguientes maneras: inducción de la fagocitosis, activación del complemento, citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos, células T modificadas genéticamente dirigidas al tumor mediante un fragmento variable de cadena única (scFv), mediante la presentación antigénica cruzada mediada por anticuerpos a células dendríticas para activar células T, inhibición de receptores inhibidores de células T, como el antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA4). De ellos, la porción Fc de la característica del anticuerpo es especialmente importante para el efecto de destrucción de células tumorales mediado por CDC y ADCC. (3) Efecto específico del anticuerpo en la vasculatura y matriz tumorales, mediante el atrapamiento del antagonista o ligando del receptor vascular para inducir la ablación de las células vasculares y estromales, incluyendo: inhibición de las células estromales, suministro de toxinas a las células estromales y suministro de toxinas a la vasculatura. (Scott AM, Wolchok JD, Old LJ. Anticuerpo therapy of cancer. Nat Rev Cancer. 2012, 12 (4) :278-87).
Los fármacos con anticuerpos monoclonales terapéuticos han hecho avanzar la investigación y el desarrollo de medicamentos contra el cáncer. Sin embargo, todavía hay que seguir estudiando algunas cuestiones para resolverlas, como la inmunogenicidad de los anticuerpos, la tolerancia del uso a largo plazo de la diana tumoral y los efectos a largo plazo del simple bloqueo único de la vía de transducción de señales. En resumen, una simple mayoría de anticuerpos tiene dificultades para lograr una inhibición eficaz a largo plazo y la eliminación de las células tumorales.
En 1964, la revista "Nature" presentó la nueva idea de la tecnología de conjugados anticuerpo-fármaco (ADC), que en los últimos años ha experimentado grandes avances. El ADC une covalentemente el anticuerpo con un fármaco altamente tóxico (toxina) a través de un enlazador químico (enlazador). El anticuerpo reconoce la molécula de antígeno de superficie de la célula cancerosa, la endocitosis ADC lo lleva al citoplasma, y en particular las toxinas del entorno intracelular liberadas después de que la hidrólisis del conector mata las células..
Seattle Genetics ha desarrollado dicho fármaco Brentuximab Vedotin (nombre comercial Adcetris) que ha sido aprobado por la FDA para su comercialización. Se trata de monometil auristatina E (MMAE), un fármaco sintético tóxico contra el cáncer, acoplado a un anticuerpo dirigido contra la molécula CD30 específica de las células de linfoma, con una eficacia mejorada para eliminar las células tumorales.
Actualmente, hay docenas de tales fármacos ADC en ensayos clínicos. Entre ellos, Genentech e Immunogen desarrollaron conjuntamente trastuzumab acoplado a maytansinas como fármaco denominado adotrastuzumab emtansina (Kadcyla), también conocido como T-DM1, para tratar el cáncer de mama. En febrero de 2013, la FDA aprobó T-DM1 para el cáncer de mama metastásico con receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (Her2) positivo. La maytansina es una toxina de molécula pequeña que puede unirse a la tubulina e impedir la formación de microtúbulos mediante la formación de un complejo dual no reductor - maleimida - propanodiol. El trastuzumab actúa sobre el cáncer de mama y el cáncer gástrico dirigiéndose contra el Her2 humano. Se aprobó para el cáncer Her2 positivo. Sin embargo, el trastuzumab no puede promover la apoptosis de todas las células Her2 positivas. T-DM1 combina el receptor selectivo Her2 trastuzumab con el potente agente citotóxico maytansina para destruir las células tumorales. El anticuerpo T-DM1 se une a los receptores Her2, provocando la internalización celular de las maytansinas liberadas de los conjugados, matando así las células tumorales. T-DM1 presenta una eficacia global y unas propiedades farmacocinéticas mejores y una toxicidad baja.
Los fármacos quimioterapéuticos tradicionales de moléculas pequeñas tienen una fuerte toxicidad y ventajas farmacocinéticas, pero en el proceso de tratamiento de los tumores pueden afectar a otras dianas fisiológicas con graves efectos secundarios. Los conjugados anticuerpo-fármaco combinan la función diana y el fármaco de molécula pequeña con una farmacocinética particular. La estructura de los conjugados anticuerpo-fármaco consiste en la unión de un anticuerpo monoclonal con función diana a un compuesto con propiedades farmacológicas específicas. Esta técnica requiere que el anticuerpo terapéutico tenga especificidad de unión a una diana, que se acople a una molécula con efecto terapéutico u otras funciones, como las citotoxinas. Muchos factores afectan al efecto de este tipo de anticuerpos, como la endocitosis del anticuerpo acoplado, la estabilidad del acoplamiento y la liberación y actividad letal de las toxinas.
Las moléculas de toxina que se utilizan actualmente incluyen los inhibidores de la tubulina, Análogos de la auristatina, monometil auristatina E, monometil auristatina F y maytansina. La monometil auristatina E es un inhibidor sintético de los polímeros microtubulares que puede inhibir la agregación de microtúbulos, interferir en la mitosis de las células tumorales e inducir la apoptosis (Naumovski L y Junutula JR. Glembatumumab vedotin, a conjugate of an antiglycoprotein non-metastatic melanoma protein B mAb and monomethyl auristatin E for treatment of melanoma and breast cancer. Curr Opin Mol Ther 2003; 12 (2): 248-57. Francisco JA, Cerveny CG et al. cAC10-vcMMAE, an anti-CD30-monomethyl auristatin E conjugate with potent and selective antitumor activity. Blood102 (4): 1458-65. La monometil auristatina F es un derivado antimitótico de la auristatina con un residuo de fenilalanina cargado en el terminal C. En comparación con el MMAE no cargado, minimiza el daño a la vía de señalización celular y minimiza la citotoxicidad. En un gran número de pruebas con células CD30 se descubrió que el mAb-maleimidocaproil-valinacitrulina-p-aminobenziloxicarbonil-MMAF (mAb-L1-MMAF) tiene una toxicidad 2.200 veces mayor que el MMAF solo (Doronina SO et al., Enhanced activity of monomethylauristatin F through monoclonal anticuerpo delivery: effects of linker technology on efficacy and toxicity. Bioconjug Chem, 2006; 17 (1): p114-24). La maytansina es un agente antimitótico que actúa como inhibidor de la polimerización de la tubulina, interfiriendo así en la formación de microtúbulos en el núcleo celular. La maytansina también inhibe la síntesis de ADN, ARN y proteínas, observándose el mayor efecto sobre la síntesis de ADN.
Los conjugados anticuerpo-fármaco tienen un efecto anticancerígeno directo e indirecto. El anticuerpo bloquea o activa la señalización del ligando/receptor, induce la apoptosis y, al mismo tiempo, puede presentar o administrar el fármaco de carga útil directa o indirectamente (como un fármaco, una toxina, un A r N interferente pequeño o un radioisótopo) a las células tumorales. El conjugado terapéutico anticuerpo-fármaco utiliza características duales del anticuerpo y del fármaco acoplado, la primera es la función de unión que se une específicamente a la fracción de direccionamiento, la segunda es la función de eliminación de células tumorales del propio anticuerpo, y la tercera es el efecto particular del fármaco conjugado. Los actuales conjugados anticuerpo-fármaco tienen limitaciones para eliminar directamente las células tumorales. Sin embargo, debido a los estrictos requisitos de las tecnologías de anticuerpos, moléculas de enlace, moléculas de toxinas y conjugación, así como a la limitación de introducir toxinas en las moléculas del microentorno tumoral, siguen existiendo algunas dificultades en los estudios clínicos reales.
El documento WO 2009/093250 se refiere a micropartículas o nanopartículas para el tratamiento de tumores, que comprenden un agente diana y un inductor que estimula una respuesta inmunitaria deseada en el entorno tumoral, que conduce a la apoptosis tumoral. El documento WO 2009/018500 se refiere a un conjugado de polipéptido y ácido nucleico para inmunoprofilaxis o inmunoterapia de trastornos neoplásicos o infecciosos. El documento WO 2006/091720 se refiere a una composición inmunomoduladora que comprende una fracción modificadora de la respuesta inmunitaria acoplada a una fracción de direccionamiento. Cecilia, et al. (1998; Cancer Research, 58 (18): 4146-4154) se refiere a la orientación de la interleucina 2 al carcinoma ovárico humano mediante fusión con un Fv de cadena simple de anticuerpo anti-receptor de folato. El documento WO 2004/062603 se refiere a un procedimiento de tratamiento o prevención de una enfermedad pulmonar en un sujeto que comprende administrar al sujeto por vía pulmonar, orofaríngea o nasofaríngea un compuesto que comprende un agente terapéutico y un elemento diana dirigido a un ligando, en el que el elemento diana confiere transcitosis apical a basolateral al agente terapéutico en un ensayo transcitótico in vitro. El documento WO 2004/029206 se refiere a un compuesto que comprende uno o más complejos CD1d, que comprenden una molécula de CD 1d y una molécula de p2-microglobulina, unidas a un anticuerpo o fragmento del mismo específico para un marcador de superficie celular. El documento WO 2006/020266 se refiere a un procedimiento de tratamiento del cáncer que comprende la administración a un sujeto afectado de cáncer de una composición terapéutica que interfiere con la interacción entre CD200 y un receptor CD200 inhibiendo así el efecto inmunosupresor de CD200 y mata las células cancerosas utilizando una molécula de fusión polipeptídica que incluye una porción que se une a OX-2/CD200 o a un receptor OX-2/CD200. Bonifaz, et al. (2002; The Journal of Experimental Medicine, 196 (12 ): 1627-1638) sugiere que la orientación de un antígeno proteico al receptor de células dendríticas DEC-205 en estado estacionario conduce a la presentación del antígeno en productos del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I y a la tolerancia de células T CD8 periféricas. Cárter, et al. (2006; The Journal of Immunology, 177 (4): 2276-2284) se relaciona con la inducción de respuestas de células T CD4+ mediante la orientación del antígeno a la lectina-1 de tipo C asociada a células dendríticas. WO 2008/097870 se refiere a composiciones y métodos para fabricar y utilizar anticuerpos anti-células dendríticas-ASGPR que pueden activar células dendríticas.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En un aspecto, la presente invención proporciona un compuesto que tiene la estructura de la Fórmula (I):
TM-Ln-AM (I),
en la que TM es una fracción de direccionamiento que comprende un anticuerpo, o fragmento funcional del mismo, capaz de unirse aun antígeno tumoral específicamente o preferiblemente en comparación con un antígeno no tumoral, en la que el antígeno tumoral es ErbB 1 (EGFR), AM es una fracción activadora que es un ligando TLR7 y TLR8 humano, Ln es un enlazador, en el que L tiene la siguiente fórmula:
-Ta-Ww-Yy-
en la que T es una unidad extensora, a es 0 o 1, cada W es independientemente una unidad de aminoácido, w es independientemente un número entero de 2 a 12, Y es una unidad espaciadora e y es 0, 1 o 2; y n es 1, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para su uso en el tratamiento del cáncer.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo, comprende un Fab, Fab', F(ab')2, anticuerpo de dominio único, dímero deT yAbs, Fv, scFv, dsFv, ds-scFv, Fd, anticuerpo lineal, minicuerpo, diacuerpo, fragmento de anticuerpo biespecífico, bicuerpo, tricuerpo, sc-diacuerpo, cuerpo kappa (lamda), BiTE, DVD-Ig, SIP, SMIP, DART, o un análogo de anticuerpo que comprenda una o más CDR.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo, comprende un Fab, Fab', F(ab')2, anticuerpo de dominio único, dímero deT yAbs, Fv, scFv, dsFv, ds-scFv, Fd, anticuerpo lineal, minicuerpo, diacuerpo, fragmento de anticuerpo biespecífico, bicuerpo, tricuerpo, sc-diacuerpo, cuerpo kappa (lamda), BiTE, DVD-Ig, SIP, SMIP, DART, o un análogo de anticuerpo que comprenda una o más CDR.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: Erbitux (cetuximab) y Vectibix (Panitumumab).
En algunas realizaciones, el enlazador es escindible enzimáticamente.
En algunas realizaciones, la fracción activadora comprende: (a) ARN monocatenario (ssARN), como ORN02, ORN06, ssPoly(U), ssARN40, ssARN-DR, o Poly(dT); o (b) un receptor ligando análogo, como CL075, CL097, o Resiquimod.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto para su uso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables.
En la presente descripción, se divulgan ciertas realizaciones ilustrativas, pero no reivindicadas. La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
En algunas realizaciones de la presente divulgación, la fracción de direccionamiento es capaz de unirse a un antígeno tumoral específicamente o preferentemente en comparación con un antígeno no tumoral. En algunas realizaciones, el antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste en: CD2, CD19, CD20, CD22, CD27, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD47, CD52, CD56, Cd70, Cd79 y CD137. En algunas realizaciones de la presente divulgación, el antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste en: 4-1BB, 5T4, AGS-5, AGS-16, Angiopoyetina 2, B7.1, B7.2, B7DC, B7H1, B7H2, B7H3, BT-062, BTLA, CAIX, antígeno carcinoembrionario, CTLA4, Cripto, ED-B, ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFL7, EpCAM, EphA2, EphA3, EphB2, FAP, Fibronectina, Receptor de folato, Gangliósido GM3, GD2, Receptor del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides (GITR), gp100, gpA33, GPNMB, ICOS, IGF1R, Integrina av, Integrina avp , KIR, LAG-3, Lewis Y, Mesotelina, c-MET, MN Anhidrasa carbónica IX, MUC1, MUC16, Nectina-4, NKGD2, NOTCH, OX40, OX40L, PD-1, PDL1, PSCA, PSMA, RANKL, ROR1, ROR2, SLC44A4, Syndecan-1, TACI, TAG-72, Tenascina, TIM3, TRAILR1, TRAILR2,VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, y sus variantes.
En algunas realizaciones de la presente divulgación, la fracción de direccionamiento comprende una inmunoglobulina, una proteína, un péptido, una molécula pequeña, una nanopartícula o un ácido nucleico.
En algunas realizaciones de la presente divulgación, la fracción de direccionamiento comprende un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: Rituxan (rituximab), Herceptin (trastuzumab), Erbitux (cetuximab), Vectibix (panitumumab), Arzerra (ofatumumab), Benlysta (belimumab), Yervoy (ipilimumab), Perjeta (pertuzumab), Tremelimumab, Nivolumab, Dacetuzumab, Urelumab, MPDL3280A, Lambrolizumab y Blinatumomab.
En algunas realizaciones, la fracción de direccionamiento comprende un Fab, Fab', F(ab')2, anticuerpo de dominio único, dímero de T y Abs, Fv, scFv, dsFv, ds-scFv, Fd, anticuerpo lineal, minicuerpo, diacuerpo, fragmento de anticuerpo biespecífico, bicuerpo, tricuerpo, sc-diacuerpo, cuerpo kappa (lamda), BiTE, DVD-Ig, s Ip, SMIP, DART, o un análogo de anticuerpo que comprenda una o más CDRs.
En algunas realizaciones de la presente divulgación, la fracción de direccionamiento comprende un polipéptido ATWLPPR de VEGFR, un mimético de trombospondina-1, un polipéptido CDCRGDCFCG (cíclico), un fragmento SCH 221153, NCNGRC (cíclico) polipéptido, CTTHWGFTLC polipéptido, CGNKRTRGC polipéptido (LyP-1), Octreotide, Vapreotide, Lanreotide, C-3940 polipéptido, Decapeptyl, Lupron, Zoladex, o Cetrorelix.
En algunas realizaciones de la presente divulgación, la fracción de direccionamiento comprende ácido fólico o un derivado del mismo.
En algunas realizaciones de la presente divulgación, la fracción de direccionamiento comprende dominios extracelulares (ECD) o forma soluble de PD-1, CTLA4, BTLA, KIR, TIM3, 4-1BB, LAG3, longitud completa o parcial de un ligando de superficie anfiregulina, betacelulina, EGF, efrina, epigen, epiregulina, IGF, neuregulina, TGF, TRAIL o VEGF.
En algunas realizaciones de la presente divulgación, la fracción de direccionamiento comprende una nanopartícula.
En algunas realizaciones de la presente divulgación, la fracción de direccionamiento comprende un aptámero.
En algunas realizaciones de la presente divulgación, la fracción activadora comprende: (a) ARN monocatenario (ssARN), preferiblemente ORN02, ORN06, ssPoly(U), ssARN40, ssARN41, ssARN-DR, o Poly(dT); o (b) un análogo del receptor tipo Toll (TLRL), preferiblemente CL075, CL097, CL264, CL307, Gardiquimod, Loxoribina, Imiquimod, o Resiquimod.
En algunas realizaciones de la presente divulgación, el enlazador se selecciona del grupo que consiste en un grupo hidrazina, un polipéptido, un grupo disulfuro y un grupo tioéter.
En algunas realizaciones, el enlazador es escindible enzimáticamente. En algunas realizaciones de la presente divulgación, el enlazador no es escindible enzimáticamente.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto tal como se proporciona en el presente documento, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además un segundo agente quimioterapéutico. En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en tamoxifeno, raloxifeno, anastrozol, exemestano, letrozol, imatanib, paclitaxel, ciclofosfamida, lovastatina, minosina, gemcitabina, citarabina, 5- fluorouracilo, metotrexato, docetaxel, goserelina, vincristina, vinblastina, nocodazol, tenipósido etopósido, gemcitabina, epotelona, vinorelbina, camptotecina, daunorrubicina, actinomicina D, mitoxantrona, acridina, doxorrubicina, epirrubicina o idarrubicina.
En otro aspecto más, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto proporcionado en el presente documento o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento.
En algunas realizaciones, la enfermedad es un tumor. En algunas realizaciones de la presente divulgación, la enfermedad comprende una proliferación celular anormal. En algunas realizaciones de esta divulgación, la proliferación celular anormal comprende una lesión precancerosa. En algunas realizaciones de esta divulgación, la proliferación anormal es de células cancerosas.
En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de mama, cáncer colorrectal, linfoma difuso de células B grandes, cáncer de endometrio, linfoma folicular, cáncer gástrico, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, cáncer de pulmón, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y carcinoma de células renales.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto que tiene la estructura de la Fórmula (I):
TM-Ln-AM (I),
donde TM es una fracción de direccionamiento, AM es una fracción activadora, Ln es un enlazador, y n es un número entero seleccionado entre 0 y 1,
con la salvedad de que cuando TM comprende un anticuerpo, AM no comprende un oligonucleótido CpG ni un agente terapéutico.
En algunas realizaciones de la presente divulgación, la fracción activadora comprende un ligando TLR, un ligando del receptor tipo Nod, un ligando del receptor tipo RIG, un ligando CLR, un ligando CDS o inductores de inflamasoma.
En algunas realizaciones de la presente divulgación, la fracción activadora comprende un ligando de uno o más TLR (ligando de receptor tipo Toll, t Lr L) seleccionado del grupo que consiste en: TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8 , TLR7/TLR8, TLR9 y TLR10.
En algunas realizaciones de la presente divulgación, la fracción activadora comprende:
(i) un ligando de TLR2 seleccionado del grupo que consiste en: (a) un producto de bacterias muertas por calor, preferentemente HKAL, HKEB, HKHP, HKLM, HKLP, HKLR, HKMF, HKPA, HKPG, o HKSA, HKSP, y (b) un producto de componentes de la pared celular, preferentemente LAM, LM, LPS, LTA, LTA, PGN, FSL, Pam2CSK4, Pam3CSK4, o Zymosan;
(ii) un ligando de TLR3 seleccionado del grupo que consiste en: Poly (I:C) y Poly (A:U);
(iii) un ligando de TLR4 seleccionado del grupo que consiste en: LPS y MPLA;
(iv) un ligando de TLR5 seleccionado del grupo que consiste en: FLAy Flagelina;
(v) un ligando de TLR7/8 seleccionado del grupo que consiste en: ORN02, ORN06, ssPoly(U), ssRNA40, ssRNA41, ssRNA-DR, Poly(dT), CL075, CL097, CL264, CL307, Gardiquimod, Loxoribine, Imiquimod y Resiquimod;
(vi) un ligando de TLR9 seleccionado del grupo que consiste en: ODN1585, ODN1668, ODN1826, ODN2006, ODN2007, ODN2216, ODN2336, ODN2395 y ODN M362;
(vii) un ligando de TLR10;
(viii) un ligando de dominio de nucleótido-oligomerización (NOD)-similar seleccionado del grupo que consiste en: Agonista NOD1 (C12-iE-DAP , iE-DAP, Tri-DAP), agonista NOD2 (L18-MDP, MDP, M-TriLYS, M-TriLYS-D-ASN, Murabutida, N-Glicolil-MDP), y agonistas NOD1/NOD2 (M-TriDAP, PGN);
(ix) un ligando de uno o más receptores similares a RIG-I (RLR) seleccionado del grupo que consiste en: 5'pppdsRNA, Poly (dA:dT), Poly (dG:dC) y Poly (I:C);
(x) un ligando de uno o más receptores de lectina de tipo C (CLR) seleccionado del grupo que consiste en: Curdlan AL, HKCA, HKSC, WGP, Zymosan y Trehalosa-6 ,6 -dibehenato;
(xi) un ligando de uno o más Sensores de ADN Citosólico (CDS) seleccionados del grupo que consiste en: c-GMP, c-G-AMP, c-GMP, c-A-AMP, c-di-AMP, c-di-IMP, c-di-GMP, c-di-UMP, HSV-60 , ISD, pCpG, Poly (dA:dT), Poly(dG:dC), Poly (dA), y VACV-70; o
(xii) un inductor del inflamasoma seleccionado del grupo que consiste en: (a) Complejo proteico del inflamasoma NLRP3, preferentemente Cristales de alumbre, ATP, Cristales de CPPD, Hermozαna, Cristales de MSU, Nano-SiO2, Nigericina, y (b) Complejo proteico del inflamasoma AIM2, preferentemente Poly (dA:dT).
En algunas realizaciones de la presente divulgación, la fracción activadora comprende IMO2134, IMO205, MGN-1703, MGN-1704, Agatolimod, SD-101, QAX-935, DIMS0150, Pollinex Quattro, OM-174, Eritoran, TAK-242, NI-0101, interferón de tipo I, interferón de tipo II, interferón de tipo III, IL-12, IL-23, IL-18, IL-7 o IL-15.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La invención se expone con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención se obtendrá por referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invención, y los dibujos adjuntos de los cuales:
La figura 1 muestra las características de los compuestos conjugados. La unión de los conjugados Trastuzumab MC-vc-resiquimod y Trastuzumab -resiquimod a las células L que expresan Her2 se compara con Trastuzumab no conjugado (como referencia), IgG humana de control y anticuerpo IgG1 humano irrelevante, según lo determinado por análisis FACS.
La figura 2 muestra el análisis de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) in vitro de los conjugados Trastuzumab, Trastuzumab MC-vc-TLRL y Trastuzumab MC-TLRL. Se añadieron PBMC (células efectoras) con células SκΒR3 (células diana) en placas de 96 pocillos (relación dianas/efectoras 1/60) durante 17 h con IgG1 humana de control, trastuzumab, o conjugados de Trastuzumab MC-vc-TLRL y Trastuzumab MC-TLRL a diferentes concentraciones. Todos los experimentos se realizaron por duplicado. El análisis se basó en la determinación negativa de la población SκΒR3. Las células muertas se tiñeron con LDH.
La figura 3A muestra los porcentajes de DC antes y después del enriquecimiento. Los números de los dos gráficos superiores representan los porcentajes de DC (HLA-DR+Lin-) del total de células antes y después de la eliminación de linajes. Las cifras de los gráficos inferiores representan los porcentajes de CDM (CD11C CD123-) y CDP (CD123+CD11C-) del total de CD antes y después de la eliminación de linajes. La figura 3(b) muestra el análisis de la producción de citocinas por DC humanas purificadas. Las DC humanas purificadas se sembraron en una placa de 96 pocillos y se cultivaron con TLRL alogénico sin tratar (medio) o tratado con diferentes concentraciones de TLRL, o Trastuzumab MC-vc-TLRL y Trastuzumab MC-TLRL directamente durante 20-22 h en una incubadora a 37 °C. En un experimento separado, se administró Cetuximab MC-vc-TLRL y Cetuximab MC-TLRL en una concentración creciente para tratar con DC humanas. Se recogió el sobrenadante y se analizaron mediante ELISA el IFN-a, la IL-6 , la IL-12(p70) y el TNF-a humanos. Los datos se expresan como media ± DE de cultivos triplicados y son representativos de experimentos independientes de dos de tres donantes sanos.
Las figuras 4A-4C muestran la eficacia terapéutica de Trastuzumab MC-vc-TLRL y Trastuzumab MC-TLRL en el modelo de tumor gástrico PDX. Los ratones BALB/c nu/nu lampiños hembra de 6 - 8 semanas de edad portadores de un tumor gástrico subcutáneo derivado de un paciente fueron tratados por vía intravenosa con 10 mg/kg de Trastuzumab MC-vc-TLRL, Trastuzumab MC-TLRL, o Trastuzumab no conjugado o solución salina (12 ratones por grupo). El tratamiento se realizó semanalmente durante un periodo de 45 días. La terapia se inició cuando los tumores alcanzaron un tamaño medio de 170 mm3. Figura 4A: Los datos representan los volúmenes tumorales medios (media ± DE). Las curvas de crecimiento tumoral se detuvieron cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 2000 mm3. Figura 4B: Variaciones del peso corporal de los ratones durante y después de la terapia. No se observó ninguna pérdida de peso detectable. Figura 4C:
Curvas de supervivencia de los grupos de tratamiento y control; prolongación sustancial para los ratones que recibieron Trastuzumab MC-vc-TLRL, o Trastuzumab no conjugado.
Las figuras 5A-5B muestran la eficacia terapéutica de Cetuximab MC-vc-TLRL en un modelo de cáncer de pulmón humano lampiño/H1650. Ratones lampiños BALB/c nu/nu Ratones hembra de 6 - 8 semanas de edad portadores de células subcutáneas de cáncer de pulmón H1650 fueron tratados por vía intravenosa con 10mg/kg de Cetuximab MC-vc-TLRL, o Cetuximab no conjugado o solución salina (12 ratones por grupo). El tratamiento se realizó semanalmente durante un periodo de 45 días. La terapia se inició cuando los tumores alcanzaron un tamaño medio de 170 mm3. Los datos representan los volúmenes tumorales medios (media ± DE). Las curvas de crecimiento tumoral se detuvieron cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 2000 mm3. Figura 5A: Eficacia terapéutica de Cetuximab MC-vc-TLRL en modelo de cáncer de pulmón humano.
Figura 5B: Variaciones del peso corporal de los ratones durante y después de la terapia. No se observó ninguna pérdida de peso detectable.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
A continuación se describen varios aspectos de la invención con referencia a aplicaciones de ejemplo a título ilustrativo. Debe entenderse que se exponen numerosos detalles, relaciones y métodos específicos para proporcionar una comprensión completa de la invención.
La terminología utilizada en el presente documento tiene por objeto describir únicamente realizaciones particulares y no pretende ser limitativa de la invención. Tal y como se utilizan en este documento, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen también las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, en la medida en que los términos "incluyendo", "incluye", "teniendo", "tiene", "con", o variantes de los mismos se utilizan en la descripción detallada y/o en las reivindicaciones, dichos términos pretenden ser inclusivos de manera similar al término "que comprende".
El término "sobre" o "aproximadamente" significa dentro de un margen de error aceptable para el valor particular determinado por un experto en la materia, que dependerá en parte de cómo se mida o determine el valor, es decir, de las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, "aproximadamente" puede significar dentro de 1 o más de 1 desviación estándar, según la práctica en el arte. Alternativamente, "aproximadamente" puede significar un rango de hasta el 20 %, preferiblemente hasta el 10 %, más preferiblemente hasta el 5 %, y aún más preferiblemente hasta el 1 % de un valor dado. Alternativamente, en particular con respecto a los sistemas o procesos biológicos, el término puede significar dentro de un orden de magnitud, preferiblemente dentro de 5 veces, y más preferiblemente dentro de 2 veces, de un valor. Cuando se describan valores particulares en la solicitud y en las reivindicaciones, a menos que se indique lo contrario, se entenderá que el término "aproximadamente" significa dentro de un margen de error aceptable para el valor particular.
I. Definiciones y abreviaturas
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen generalmente el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece esta invención. En general, la nomenclatura utilizada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio en cultivo celular, genética molecular, química orgánica y química e hibridación de ácidos nucleicos son los conocidos y comúnmente empleados en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para la síntesis de ácidos nucleicos y péptidos. Las técnicas y procedimientos se llevan a cabo generalmente de acuerdo con los métodos convencionales de la técnica y diversas referencias generales, que se proporcionan a lo largo de este documento. La nomenclatura empleada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio de química analítica y de síntesis orgánica que se describen a continuación son los bien conocidos y comúnmente empleados en la técnica. Para las síntesis químicas y los análisis químicos se utilizan técnicas estándar o sus modificaciones.
El término "alquilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique lo contrario, una cadena recta o ramificada, o un radical hidrocarburo cíclico, o una combinación de los mismos, que puede ser totalmente saturado, mono- o poliinsaturado y puede incluir radicales di- y multivalentes, con el número de átomos de carbono designadofes decir, C1 -C10 significa de uno a diez carbonos). Ejemplos de radicales de hidrocarburos saturados incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciclohexilo, (ciclohexilo)metilo, ciclopropilmetilo, homólogos e isómeros de, por ejemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, y similares. Un grupo alquilo insaturado es aquel que tiene uno o más dobles enlaces o triples enlaces. Ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, pero no se limitan a, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2-(butadienilo), 2,4-pentadienilo, 3-(1,4-pentadienilo), erinilo, 1 -y 3-propinilo, 3-butinilo, y los homólogos e isómeros superiores. El término "alquilo", a menos que se indique lo contrario, también incluye los derivados del alquilo definidos con más detalle a continuación, como el "heteroalquilo" Los grupos alquilo, que se limitan a grupos hidrocarburos, se denominan "homoalquilo".
El término "alquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de un alcano, como se ejemplifica, pero no se limita, por -CH2CH2CH2CH2-, e incluye además aquellos grupos descritos a continuación como "heteroalquileno" Típicamente, un grupo alquilo (o alquileno) tendrá de 1 a 24 átomos de carbono, prefiriéndose en la presente invención aquellos grupos que tengan 10 o menos átomos de carbono. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno de cadena más corta, que generalmente tiene ocho o menos átomos de carbono.
Los términos "alcoxi", "alquilamino" y "alquiltio" (o tioalcoxi) se utilizan en su sentido convencional y se refieren a aquellos grupos alquilo unidos al resto de la molécula a través de un átomo de oxígeno, un grupo amino o un átomo de azufre, respectivamente.
El término "heteroalquilo", por sí mismo o en combinación con otro término, significa, a menos que se indique lo contrario, una cadena estable recta o ramificada, o un radical hidrocarburo cíclico, o combinaciones de los mismos, que consiste en el número indicado de átomos de carbono y al menos un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O, N, Si y S, y en el que los átomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados y el heteroátomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado. El (los) heteroátomo(s) O, N y S y Si pueden colocarse en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo o en la posición en la que el grupo alquilo está unido al resto de la molécula. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, CH2-CH2-O-CH3 , -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3 , y-CH=CH-N(CH3)-CH3. Hasta dos heteroátomos pueden ser consecutivos, como, por ejemplo , -CH2-NH.OCH3 y -CH2-O-Si(CH3)3. Del mismo modo, el término "heteroalquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de heteroalquilo, como se ejemplifica, pero no se limita a, -CH2-CH2-S-CH2-CH2-y-CH2-S.CH2-CH2-NH.CH2-. Para los grupos heteroalquileno, los heteroátomos también pueden ocupar uno o ambos extremos de la cadena (por ejemplo, alquilenoxi, alquilendioxi, alquilenamino, alquilendiamino y similares). Además, para los grupos de enlace alquileno y heteroalquileno, la orientación del grupo de enlace no está implícita en la dirección en la que se escribe la fórmula del grupo de enlace. Por ejemplo, la fórmula -C(O)2R'- representa tanto -C(O)2R'- como -R'C(O)2-.
En general, un "sustituyente acilo" también se selecciona del grupo expuesto anteriormente. Como se utiliza aquí, el término "sustituyente acilo" se refiere a grupos unidos a, y que cumplen la valencia de un carbono carbonilo que está directa o indirectamente unido al núcleo policíclico de los compuestos de la presente invención.
Los términos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo", por sí mismos o en combinación con otros términos, representan, a menos que se indique lo contrario, versiones cíclicas de "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente. Además, para el heterocicloalquilo, un heteroátomo puede ocupar la posición en la que el heterociclo se une al resto de la molécula. Ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopentilo, ciclohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, cicloheptilo, y similares. Ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, 1 -(1,2,5,6-tetrahidropiridilo), 1-piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofurano-2-ilo, tetrahidrofurano-3-ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1 -piperazinilo, 2-piperazinilo, y similares.
Los términos "halo" o "halógeno", por sí mismos o como parte de otro sustituyente, significan, a menos que se indique lo contrario, un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo. Además, términos como "haloalquilo" incluyen monohaloalquilo y polihaloalquilo. Por ejemplo, el término "halo(C1 -C4)alquilo" incluye, pero no se limita a, trifluorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 4-clorobutilo, 3-bromopropilo y similares.
El término "arilo" significa, a menos que se indique lo contrario, un sustituyente hidrocarburo poliinsaturado, aromático, que puede ser un anillo único o múltiples anillos (preferentemente de 1 a 3 anillos), que están fusionados o enlazados covalentemente. El término "heteroarilo" se refiere a grupos arilo (o anillos) que contienen de uno a cuatro heteroátomos seleccionados entre N, O y S, en los que los átomos de nitrógeno y azufre están opcionalmente oxidados, y el átomo o átomos de nitrógeno están opcionalmente cuaternizados. Un grupo heteroarilo puede unirse al resto de la molécula a través de un heteroátomo. Ejemplos no limitantes de grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1 -pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-bencimidazolilo, 5-indolilo, 1 -isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo y 6 -quinolilo. Los sustituyentes de cada uno de los sistemas de anillos arilo y heteroarilo mencionados anteriormente se seleccionan del grupo de sustituyentes aceptables descritos a continuación.
En aras de la brevedad, el término "arilo" cuando se utiliza en combinación con otros términos (por ejemplo, ariloxi, ariltioxi, arilalquilo) incluye tanto anillos arilo como heteroarilo, tal como se han definido anteriormente. Así, el término "arilalquilo" se refiere a aquellos radicales en los que un grupo arilo está unido a un grupo alquilo( p. ej., bencilo, fenetilo, piridilmetilo y similares), incluidos aquellos grupos alquilo en los que un átomo de carbono (p. ej., un grupo metileno) ha sido sustituido, por ejemplo, por un átomo de oxígeno (p. ej., fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, 3-(1-naftiloxi)propilo y similares).
Cada uno de los términos anteriores (por ejemplo, "alquilo", "heteroalquilo", "arilo" y "heteroarilo") incluye formas tanto sustituidas como no sustituidas del radical indicado. A continuación se indican los sustituyentes preferidos para cada tipo de radical.
Los sustituyentes de los radicales alquilo y heteroalquilo (incluidos los grupos a menudo denominados alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo y heterocicloalquenilo) se denominan generalmente "sustituyentes alquilo" y "sustituyentes heteroalquilo", respectivamente, y pueden ser uno o más de una variedad de grupos seleccionados entre, pero no limitados a: - OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -halógeno, -SiR'R "R", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', - CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR "C(O)R', -NR'-C(O)NR "R", -NR "C(O)2R', -NR-C(NR'R "R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR", -S(O)R', -S(OPR', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN y -NO2 en un número comprendido entre cero y (2m'+l), donde m' es el número total de átomos de carbono en dicho radical. R', R", R" y R"" se refieren cada uno preferentemente de forma independiente a hidrógeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, por ejemplo, arilo sustituido con 1-3 halógenos, grupos alquilo, alcoxi o tioalcoxi sustituidos o no sustituidos, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como lo son cada uno de los grupos R', R", R'" y R"" cuando está presente más de uno de estos grupos. Cuando R' y R" están unidos al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R" incluye, entre otros, 1 -pirrolidinilo y 4-morfolinilo. A partir de la discusión anterior de los sustituyentes, un experto en la materia entenderá que el término "alquilo" incluye grupos que incluyen átomos de carbono unidos a grupos distintos de los grupos hidrógeno, como haloalquilo (por ejemplo, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (por ejemplo, -C(O)CH3, -C(O)CF3 , -C(O)CH2OCH3 , y similares).
De forma similar a los sustituyentes descritos para el radical alquilo, los sustituyentes arilo y los sustituyentes heteroarilo se denominan generalmente "sustituyentes arilo" y "sustituyentes heteroarilo", respectivamente, y son variados y se seleccionan entre, por ejemplo halógeno, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', - halógeno, -SiR'R "R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'W, - NR "C(O)R', -NR'-C(O)NR "R"', -NR "C(O)zR', -NR-C(NR'R")=NR", -S(O)R', -S(OPR', - S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN y -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, fluoro(C1 -C4)alcoxi, y fluoro(Ci-C4)alquilo, en un número que oscila entre cero y el número total de valencias abiertas en el sistema de anillos aromáticos; y donde R', R", R" y R"" se seleccionan preferentemente de manera independiente entre hidrógeno, (C1 -C8)alquilo y heteroalquilo, arilo y heteroarilo no sustituidos, (arilo no sustituido)-(C1 -C4)alquilo, y (arilo no sustituido)oxi-(C1 -C4)alquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como lo son cada uno de los grupos R', R", R'" y R"" cuando está presente más de uno de estos grupos.
Dos de los sustituyentes arilo en átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden sustituirse opcionalmente con un sustituyente de la fórmula -T-C(O)-(CRR')q.U., donde T y U son independientemente - NR-, -O-, -CRR'- o un enlace simple, y q es un número entero de 0 a 3. Alternativamente, dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden sustituirse opcionalmente por un sustituyente de la fórmula -A-(CH2)r.B., en la que A y B son independientemente -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)z-, -S(O)2NR'- o un enlace simple, y r es un número entero de 1 a 4. Uno de los enlaces simples del nuevo anillo así formado puede sustituirse opcionalmente por un enlace doble. Alternativamente, dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden sustituirse opcionalmente por un sustituyente de la fórmula -(CRR')s-X-(CR "R")d-, donde s y d son números enteros independientes de 0 a 3, y X es -O-, -Nr'-, -S-, -S(O)-, -S(O)z-, o -S(O)2NR'-. Los sustituyentes R, R', R" y R'" se seleccionan preferentemente de forma independiente entre hidrógeno o alquilo (C1 -C6) sustituido o no sustituido.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "heteroátomo" incluye oxígeno (O), nitrógeno (N), azufre (S), fósforo (P) y silicio (Si).
II. Las composiciones
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto que tiene la estructura de la Fórmula (I):
TM-Ln-AM (I),
donde TM es una fracción de direccionamiento, AM es una fracción activadora capaz de activar una célula dendrítica humana, una célula NK o una célula tumoral, o una combinación de las mismas, Ln es un enlazador, y n es un número entero seleccionado entre 0 y 1.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto que tiene la estructura de la Fórmula (I):
TM-Ln-AM (I),
donde TM es una fracción de direccionamiento, AM es una fracción activadora capaz de unirse específicamente a TLR7 y/o TLR8 humanos, Ln es un enlazador, y n es un número entero seleccionado entre 0 y 1.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto que tiene la estructura de la Fórmula (I):
TM-Ln-AM (I),
donde TM es una fracción de direccionamiento, AM es una fracción activadora, Ln es un enlazador, y n es un número entero seleccionado entre 0 y 1, con la condición de que cuando TM comprende un anticuerpo, AM no comprende un oligonucleótido CpG o un agente terapéutico.
A. Fracción de direccionamiento
En general, los compuestos de la presente invención comprenden una fracción diana (TM) como se define en las reivindicaciones. A continuación se describen varios aspectos de la TM según la presente divulgación.
Por "fracción de direccionamiento (TM)" o "agente diana" se entiende aquí una molécula, complejo o agregado que se une específica o selectivamente a una molécula, célula, partícula, tejido o agregado diana, que generalmente se denomina "diana" o "marcador", y que se tratan con más detalle en el presente documento.
En algunas realizaciones, la fracción de direccionamiento comprende una inmunoglobulina, una proteína, un péptido, una molécula pequeña, una nanopartícula o un ácido nucleico.
Agentes diana ejemplares tales como anticuerpos (por ejemplo, quiméricos, humanizados y humanos), ligandos para receptores, lecitinas y sacáridos, y sustrato para ciertas enzimas son reconocidos en el arte y son útiles sin limitación en la práctica de la presente invención. Otros agentes diana incluyen una clase de compuestos que no incluyen motivos específicos de reconocimiento molecular incluyen nanopartículas, macromoléculas como el polietilenglicol), polisacáridos y poliaminoácidos que añaden masa molecular a la fracción activadora. La masa molecular adicional afecta a la farmacocinética de la fracción activadora, por ejemplo, a la semivida sérica.
En algunas realizaciones, una fracción de direccionamiento es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, anticuerpo biespecífico u otra molécula o compuesto basado en anticuerpos. Sin embargo, se conocen en la técnica y pueden utilizarse otros ejemplos de fracciones de direccionamiento, como aptámeros, avímeros, ligandos de unión a receptores, ácidos nucleicos, pares de unión biotina-avidina, péptidos o proteínas de unión, etc. Los términos "fracción de direccionamiento" y "fracción de unión" se utilizan aquí como sinónimos.
Dianas
Por "diana" o "marcador" se entiende cualquier entidad capaz de unirse específicamente a una fracción de direccionamiento concreta. En algunas realizaciones, las dianas se asocian específicamente a uno o más tipos de células o tejidos concretos. En algunas realizaciones, las dianas se asocian específicamente con uno o más estados patológicos concretos. En algunas realizaciones, las dianas se asocian específicamente con una o más etapas concretas del desarrollo. Por ejemplo, un marcador específico de un tipo celular se expresa típicamente a niveles al menos 2 veces mayores en ese tipo celular que en una población de células de referencia. En algunas realizaciones, el marcador específico del tipo celular está presente a niveles al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces o al menos 1.000 veces superiores a su expresión media en una población de referencia. La detección o medición de un marcador específico de un tipo celular puede permitir distinguir el tipo o tipos celulares de interés de células de muchos, la mayoría o todos los demás tipos. En algunas realizaciones, una diana puede comprender una proteína, un carbohidrato, un lípido y/o un ácido nucleico, como se describe en el presente documento.
Una sustancia se considera "dirigida" para los fines aquí descritos si se une específicamente a una fracción de direccionamiento de ácido nucleico. En algunas realizaciones, una fracción de direccionamiento de ácido nucleico se une específicamente a una diana en condiciones estrictas. Se considera que un complejo o compuesto inventivo que comprende una fracción de direccionamiento está "dirigido" si la fracción de direccionamiento se une específicamente a una diana, llevando así la composición completa del complejo o compuesto a un órgano, tejido, célula, componente de la matriz extracelular y/o compartimento intracelular específicos.
En ciertas realizaciones, los compuestos de acuerdo con la presente invención comprenden una fracción de direccionamiento que se une específicamente a una o más dianas (por ejemplo, antígenos) asociadas con un órgano, tejido, célula, componente de la matriz extracelular y/o compartimento intracelular. En algunas realizaciones, los compuestos comprenden una fracción de direccionamiento que se une específicamente a dianas asociadas con un órgano o sistema orgánico concreto. En algunas realizaciones, los compuestos de acuerdo con la presente invención comprenden una fracción dirigida a núcleos que se une específicamente a una o más dianas intracelulares (por ejemplo, orgánulos, proteínas intracelulares). En algunas realizaciones, los compuestos comprenden una fracción de direccionamiento que se une específicamente a dianas asociadas con órganos, tejidos, células, componentes de la matriz extracelular y/o compartimentos intracelulares enfermos. En algunas realizaciones, los compuestos comprenden una fracción de direccionamiento que se une específicamente a dianas asociadas con tipos celulares particulares (por ejemplo, células endoteliales, células cancerosas, células malignas, células de cáncer de próstata, etc.).
En algunas realizaciones, los compuestos de acuerdo con la presente invención comprenden una fracción de direccionamiento que se une a una diana que es específica para uno o más tipos de tejido particulares (por ejemplo, tejido hepático frente a tejido prostático). En algunas realizaciones, los compuestos de acuerdo con la presente invención comprenden una fracción de direccionamiento que se une a una diana que es específica para uno o más tipos celulares particulares (por ejemplo, células T frente a células B). En algunas realizaciones, los compuestos de acuerdo con la presente invención comprenden una fracción de direccionamiento que se une a una diana que es específica para uno o más estados de enfermedad particulares (por ejemplo, células tumorales frente a células sanas). En algunas realizaciones, los compuestos de acuerdo con la presente invención comprenden una fracción de direccionamiento que se une a una diana que es específica para una o más etapas de desarrollo particulares (por ejemplo, células madre frente a células diferenciadas).
En algunas realizaciones, una diana puede ser un marcador que se asocia exclusiva o principalmente con uno o unos pocos tipos de células, con una o unas pocas enfermedades, y/o con una o unas pocas etapas de desarrollo. Un marcador específico de un tipo celular se expresa típicamente a niveles al menos 2 veces mayores en ese tipo celular que en una población de células de referencia que puede consistir, por ejemplo, en una mezcla que contenga células de una pluralidad (por ejemplo, 5-10 o más) de tejidos u órganos diferentes en cantidades aproximadamente iguales. En algunas realizaciones, el marcador específico del tipo celular está presente a niveles al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces o al menos 1000 veces superiores a su expresión media en una población de referencia. La detección o medición de un marcador específico de un tipo celular puede permitir distinguir el tipo o tipos celulares de interés de células de muchos, la mayoría o todos los demás tipos.
En algunas realizaciones, una diana comprende una proteína, un carbohidrato, un lípido y/o un ácido nucleico. En algunas realizaciones, una diana comprende una proteína y/o una porción característica de la misma, como un marcador tumoral, una integrina, un receptor de superficie celular, una proteína transmembrana, una proteína intercelular, un canal iónico, una proteína transportadora de membrana, una enzima, un anticuerpo, una proteína quimérica, una glicoproteína, etc. En algunas realizaciones, una diana comprende un carbohidrato y/o una porción característica del mismo, como una glicoproteína, azúcar (por ejemplo, monosacárido, disacárido, polisacárido), glicocálix (es decir, la zona periférica rica en carbohidratos de la superficie exterior de la mayoría de las células eucariotas), etc. En algunas realizaciones, una diana comprende un lípido y/o una porción característica del mismo, como un aceite, un ácido graso, un glicérido, una hormona, un esteroide (por ejemplo, colesterol, ácido biliar), una vitamina (por ejemplo, vitamina E), un fosfolípido, un esfingolípido, una lipoproteína, etc. En algunas realizaciones, una diana comprende un ácido nucleico y/o una porción característica del mismo, como un ácido nucleico deADN; un ácido nucleico deARN; un ácido nucleico deADN modificado; un ácido nucleico deARN modificado; un ácido nucleico que incluye cualquier combinación de ADN, ARN, ADN modificado y ARN modificado.
Numerosos marcadores son conocidos en la técnica. Los marcadores típicos incluyen proteínas de la superficie celular, por ejemplo, receptores. Los receptores ejemplares incluyen, entre otros, el receptor de transferrina; el receptor de LDL; los receptores de factores de crecimiento, como los miembros de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, EGFR, Her2, Her3, Her4) o los receptores del factor de crecimiento endotelial vascular, los receptores de citoquinas, las moléculas de adhesión celular, las integrinas, las selectinas y las moléculas CD. El marcador puede ser una molécula presente exclusivamente o en mayor cantidad en una célula maligna, por ejemplo, un antígeno tumoral.
Antígenos tumorales
En la invención, la fracción de direccionamiento es capaz de unirse a una célula tumoral específicamente o preferentemente en comparación con una célula no tumoral. El antígeno tumoral según la invención es ErbB1 (EGFR). A continuación se describen diversos aspectos de los antígenos tumorales según la presente divulgación.
La unión de la fracción diana a la célula tumoral puede medirse mediante ensayos conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, la célula tumoral es de un carcinoma, un sarcoma, un linfoma, un mieloma o un cáncer del sistema nervioso central.
En algunas realizaciones, la fracción de direccionamiento es capaz de unirse a un antígeno tumoral específicamente 0 preferentemente en comparación con un antígeno no tumoral.
Por "se une específicamente" o "se une preferentemente" se entiende aquí que la unión entre dos socios de unión (por ejemplo, entre una fracción de direccionamiento y su socio de unión) es selectiva para los dos socios de unión y puede discriminarse de interacciones no deseadas o no específicas. Por ejemplo, la capacidad de una fracción de unión a antígeno para unirse a un determinante antigénico específico puede medirse mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA) u otras técnicas conocidas por los expertos en la materia, por ejemplo, la técnica de resonancia de plasmón superficial (analizada en un instrumento BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Los términos "anticuerpo anti-[antígeno]" y "un anticuerpo que se une a [antígeno]" se refieren a un anticuerpo que es capaz de unirse al antígeno respectivo con suficiente afinidad como para que el anticuerpo sea útil como agente diagnóstico y/o terapéutico dirigido al antígeno. En algunas realizaciones, el grado de unión de un anticuerpo anti-[antígeno] a una proteína no relacionada es inferior a aproximadamente el 10 % de la unión del anticuerpo al antígeno medida, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA). En algunas realizaciones, un anticuerpo que se une a [antígeno] tiene una constante de disociación (KD) de < 1 μM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, o < 0,001 nM (por ejemplo, 10'8 M o menos, por ejemplo, de 10'8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10'9 M a 10' 13 M). Se entiende que la definición anterior también es aplicable a las fracciones de unión a antígeno que se unen a un antígeno.
En ciertas realizaciones específicas, una diana es un marcador tumoral. En algunas realizaciones, un marcador tumoral es un antígeno presente en un tumor que no está presente en órganos, tejidos y/o células normales. En algunas realizaciones, un marcadortumoral es un antígeno que es más prevalente en un tumor que en órganos, tejidos y/o células normales. En algunas realizaciones, un marcador tumoral es un antígeno que es más prevalente en las células cancerosas malignas que en las células normales.
Por "antígeno tumoral" se entiende aquí una sustancia antigénica producida en las células tumorales, es decir, que desencadena una respuesta inmunitaria en el huésped. Las proteínas normales del organismo no son antigénicas debido a la autotolerancia, un proceso en el que los linfocitos T citotóxicos (CTL) autorreactivos y los linfocitos B productores de autoanticuerpos se eliminan "centralmente" en el tejido linfático primario (BM) y "periféricamente" en el tejido linfático secundario (principalmente el timo para los linfocitos T y el bazo/nódulos linfáticos para los linfocitos B). Así, cualquier proteína que no esté expuesta al sistema inmunitario desencadena una respuesta inmunitaria. Puede tratarse de proteínas normales que están bien secuestradas del sistema inmunitario, proteínas que normalmente se producen en cantidades extremadamente pequeñas, proteínas que normalmente sólo se producen en determinadas fases del desarrollo o proteínas cuya estructura está modificada debido a una mutación.
En algunas realizaciones, una diana se expresa preferentemente en tejidos y/o células tumorales frente a tejidos y/o células normales.
En algunas realizaciones de la invención, un marcador es un marcador tumoral. El marcador puede ser un polipéptido que se expresa a niveles más altos en las células en división que en las que no lo están. Por ejemplo, Her-2/neu (también conocido como ErbB-2) es un miembro de la familia de receptores EGF y se expresa en la superficie celular de los tumores asociados al cáncer de mama. Otro ejemplo es un péptido conocido como F3 que es un agente de orientación adecuado para dirigir una nanopartícula a la nucleolina (Porkka et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 99:7444y Christian et al., 2003, J. Cell Biol., 163:871). Se ha demostrado que las partículas dirigidas compuestas por una nanopartícula y el aptámero A10 (que se une específicamente al PSMA) eran capaces de administrar docetaxel de forma específica y eficaz a los tumores de cáncer de próstata.
Los anticuerpos u otros fármacos que se dirigen específicamente a estos objetivos tumorales interfieren específicamente con y regulan las vías de señalización del comportamiento biológico de las células tumorales regulan directamente, o bloquean la vía de señalización para inhibir el crecimiento de células tumorales o inducir la apoptosis. Hasta la fecha, se han aprobado decenas de fármacos diana para la investigación clínica y el tratamiento de tumores sólidos o neoplasias hematológicas malignas, y hay varios fármacos diana para neoplasias hematológicas malignas.
En algunas realizaciones, el antígeno tumoral (o diana tumoral) se selecciona del grupo que consiste en: CD2, CD19, CD20, CD22, CD27, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD47, CD52, CD56, CD70, CD79 y CD137.
En algunas realizaciones, el antígeno tumoral (o diana tumoral) se selecciona del grupo que consiste en: 4-1BB, 5T4, AGS-5, AGS-16, Angiopoyetina 2, B7.1, B7.2, B7DC, B7H1, B7H2, B7H3, BT-062, BTLA, CAIX, antígeno carcinoembrionario, CTLA4, Cripto, ED-B, ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFL7, EpCAM, EphA2, EphA3, EphB2, FAP, Fibronectina, Receptor de folato, Gangliósido GM3, GD2, Receptor del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides (GITR), gp100, gpA33, GPNMB, ICOS, IGF1R, Integrina av, Integrina avp, KIR, LAG-3, Antígeno Y de Lewis, Mesotelina, c-MET, MNAnhidrasa carbónica IX, MUC1, MUC16, Nectina-4, NKGD2, NOTCH, OX40, OX40L, PD-1, PDL1, PSCA, PSMA, RANKL, ROR1, ROR2, SLC44A4, Syndecan-1, TACI, TAG-72, Tenascina, TIM3, TRAILR1, TRAILR2, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, y sus variantes. Las variantes del antígeno tumoral abarcan diversos mutantes o polimormismos conocidos en la técnica y/o producidos de forma natural.
Anticuerpos
En la invención, la fracción de direccionamiento comprende un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo.
Por "inmunoglobulina" o "anticuerpo" se entiende aquí una molécula de inmunoglobulina de longitud completa (es decir, de origen natural o formada por procesos recombinatorios de fragmentos de genes de inmunoglobulina normales) (por ejemplo, un anticuerpo IgG) o una porción inmunológicamente activa (es decir, de unión específica) de una molécula de inmunoglobulina, como un fragmento de anticuerpo. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser conjugado o derivatizado de otro modo. Dichos anticuerpos incluyen IgGl , IgG2a, IgG3, IgG4 (y subformas de IgG4), así como los isotipos IgA.
El término "anticuerpo" se utiliza aquí en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo pero no limitándose a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos, siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada y comprendan una región Fc o una región Fc equivalente a una inmunoglobulina. los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo entero" se utilizan aquí indistintamente para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a la estructura de un anticuerpo nativo o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define aquí.
Por "anticuerpos nativos" se entienden moléculas de inmunoglobulina naturales con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG nativos son glicoproteínas heterotetraméricas de unos 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas unidas por disulfuro. Del N- al C-terminal, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CHI, CH2 y CH3), también llamados región constante de cadena pesada. Del mismo modo, desde el N- al C-terminal, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio de luz variable o dominio variable de cadena ligera, seguida de un dominio de luz constante (CL), también llamado región constante de cadena ligera. La cadena ligera de un anticuerpo puede asignarse a uno de dos tipos, denominados kappa (k) y lambda (A), en función de la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.
Por "fragmento de anticuerpo" se entiende aquí una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, entre otros, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena simple (por ejemplo, scFv), anticuerpos de dominio simple y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpos, véase Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase por ejemplo Pliickthun, en The Pharmacology of Monoclonal Anticuerpos, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer- Verlag, Nueva York, pp.
269-315 (1994); véase también WO 93/16185 y Patentes estadounidenses n° 5.571.894 y 5,587,458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos de epítopos de unión a receptores de rescate y que tienen una semivida in vivo aumentada, véase Patente estadounidense n° 5.869.046. Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígenos que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véase, por ejemplo, EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129- 134 (2003); y Hollinger et al., Proc NatlAcad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpos que comprenden todo o parte del dominio variable de cadena pesada o todo o parte del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En ciertas realizaciones, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo humano de dominio único (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, p. ej. Patente estadounidense n° 6.248.516 B1). Los fragmentos de anticuerpo pueden fabricarse mediante diversas técnicas, incluyendo pero sin limitarse a la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción mediante células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fagos), como se describe en el presente documento.
Por "dominio de unión a antígeno" se entiende aquí la parte de un anticuerpo que comprende el área que se une específicamente y es complementaria a una parte o a la totalidad de un antígeno. Un dominio de unión a antígeno puede estar constituido, por ejemplo, por uno o más dominios variables de anticuerpo (también denominados regiones variables de anticuerpo). En particular, un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y una región variable de cadena pesada de anticuerpo (VH).
Por "región variable" o "dominio variable" se entiende aquí el dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que interviene en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo suelen tener estructuras similares, y cada dominio comprende cuatro regiones marco conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR). Véase, por ejemplo Kindt et al., Kuby Immunology, 6 a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un solo dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión al antígeno.
Por "región hipervariable" o "HVR" se entiende aquí cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos ""bucles hipervariables").
Generalmente, los anticuerpos nativos de cuatro cadenas comprenden seis HVR; tres en la VH (HI, H2, H3), y tres en la VL (LI, L2, L3). Los HVR generalmente comprenden residuos de aminoácidos de los bucles hipervariables y/o de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), siendo estas últimas las de mayor variabilidad de secuencia y/o implicadas en el reconocimiento de antígenos. Con la excepción de la CDRl en VH, las CDR generalmente comprenden los residuos de aminoácidos que forman los bucles hipervariables. Las regiones hipervariables (HVR) también se denominan "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), y estos términos se utilizan aquí indistintamente en referencia a porciones de la región variable que forman las regiones de unión al antígeno. Esta región en particular ha sido descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) y por Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987), donde las definiciones incluyen solapamientos o subconjuntos de residuos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. No obstante, la aplicación de cualquiera de las dos definiciones para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes del mismo se entiende dentro del ámbito del término tal y como se define y utiliza en el presente documento. El número exacto de residuos que engloba una determinada CDR variará en función de la secuencia y el tamaño de la CDR. Los expertos en la materia pueden determinar rutinariamente qué residuos comprenden una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.
El anticuerpo de la presente invención puede ser anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos o proteínas de fusión de anticuerpos.
Por "anticuerpo quimérico" se entiende aquí una proteína recombinante que contiene los dominios variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, incluidas las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo derivado de una especie, preferentemente un anticuerpo de roedor, más preferentemente un anticuerpo murino, mientras que los dominios constantes de la molécula de anticuerpo se derivan de los de un anticuerpo humano. Para aplicaciones veterinarias, los dominios constantes del anticuerpo quimérico pueden derivarse del de otras especies, como un primate subhumano, un gato o un perro.
Por "anticuerpo humanizado" se entiende aquí una proteína recombinante en la que las CDR de un anticuerpo de una especie; por ejemplo, un anticuerpo de roedor, se transfieren de las cadenas variables pesadas y ligeras del anticuerpo de roedor a dominios variables pesados y ligeros humanos. Los dominios constantes de la molécula de anticuerpo se derivan de los de un anticuerpo humano. En algunas realizaciones, pueden modificarse residuos específicos de la región marco del anticuerpo humanizado, en particular los que están en contacto o cerca de las secuencias CDR, por ejemplo sustituyéndolos por los residuos correspondientes del anticuerpo original de roedor, primate subhumano u otro.
Por "anticuerpo humano" se entiende aquí un anticuerpo obtenido, por ejemplo, de ratones transgénicos que han sido "diseñados" para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a un desafío antigénico. En esta técnica, se introducen elementos de los locus humanos de cadenas pesadas y ligeras en cepas de ratones derivadas de líneas de células madre embrionarias que contienen interrupciones dirigidas de los loci endógenos de cadenas pesadas y ligeras. Los ratones transgénicos pueden sintetizar anticuerpos humanos específicos para antígenos humanos, y los ratones pueden utilizarse para producir hibridomas humanos secretores de anticuerpos. Los métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de ratones transgénicos se describen en Green et al, Nature Genet. 7: 13 (1994), Lonberg et al, Nature 368:856 (1994), y Taylor et al, Int. Immun. 6:579 (1994). Un anticuerpo totalmente humano también puede construirse por métodos de transfección genética o cromosómica, así como por tecnología de visualización de fagos, todos ellos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, McCafferty et al, Nature 348:552-553 (1990) para la producción de anticuerpos humanos y fragmentos de los mismos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. En esta técnica, los genes de dominio variable de los anticuerpos se clonan dentro del marco de un gen de proteína de cubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, y se muestran como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la partícula del fago. Dado que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan lugar a la selección del gen que codifica el anticuerpo que presenta esas propiedades. De este modo, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La visualización de fagos puede realizarse en una variedad de formatos, para su revisión, véase por ejemplo Johnson y Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571 (1993). Los anticuerpos humanos también pueden ser generados por células B activadas in vitro. Véase Patentes de EE.UU. n° 5.567.610 y 5,229,275.
Por "proteína de fusión de anticuerpos" se entiende aquí una molécula de unión a antígeno producida recombinantemente en la que se unen dos o más segmentos del mismo o de diferentes anticuerpos naturales, anticuerpos de cadena simple o fragmentos de anticuerpos con las mismas o diferentes especificidades. Una proteína de fusión comprende al menos un sitio de unión específico. La valencia de la proteína de fusión indica el número total de brazos o sitios de unión que tiene la proteína de fusión al antígeno o antígenos o al epítopo o epítopos; es decir, monovalente, bivalente, trivalente o multivalente. La multivalencia de la proteína de fusión de anticuerpos significa que puede aprovechar múltiples interacciones en la unión a un antígeno, aumentando así la avidez de unión al antígeno, o a diferentes antígenos. La especificidad indica cuántos tipos diferentes de antígeno o epítopo es capaz de unir una proteína de fusión de anticuerpos; es decir, monoespecífico, biespecífico, triespecífico, multiespecífico. Según estas definiciones, un anticuerpo natural, por ejemplo una IgG, es bivalente porque tiene dos brazos de unión, pero es monoespecífico porque se une a un tipo de antígeno o epítopo. Una proteína de fusión monoespecífica y multivalente tiene más de un sitio de unión para el mismo antígeno o epítopo. Por ejemplo, un diábolo monoespecífico es una proteína de fusión con dos sitios de unión reactivos con el mismo antígeno. La proteína de fusión puede comprender una combinación multivalente o multiespecífica de diferentes componentes de anticuerpos o múltiples copias del mismo componente de anticuerpos. La proteína de fusión puede contener además un agente terapéutico.
En algunas realizaciones, la fracción de direccionamiento es un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, que se selecciona en función de su especificidad para un antígeno expresado en una célula diana, o en un sitio diana, de interés. Se ha identificado una amplia variedad de antígenos específicos de tumores u otras enfermedades y se han utilizado o propuesto anticuerpos contra esos antígenos para su uso en el tratamiento de dichos tumores u otras enfermedades. Los anticuerpos conocidos en la técnica pueden utilizarse en los compuestos de la invención, en particular para el tratamiento de la enfermedad a la que se asocia el antígeno diana. Ejemplos de antígenos diana (y sus enfermedades asociadas) a los que puede dirigirse un conjugado anticuerpo-enlazador-fármaco de la invención incluyen: CD2, CD19, CD20, CD22, CD27, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD47, CD52, CD56, CD70, CD79, CD137, 4-1BB, 5T4, AGS-5, AGS-16, Angiopoyetina 2, B7.1, B7.2, B7DC, B7H1, B7H2, B7H3, BT-062, BTLA, CAIX, antígeno carcinoembrionario, CTLA4, Cripto, ED-B, ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFL7, EpCAM, EphA2, EphA3, EphB2, FAP, Fibronectina, Receptor de folato, Gangliósido GM3, GD2, receptor del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides (GITR), gp100, gpA33, GPNMB, ICOS, IGF1R, Integrina av, Integrina avp , KIR, LAG-3, Lewis Y, Mesotelina, c-MET, MN Anhidrasa carbónica IX, MUC1, MUC16, Nectina-4, NKGD2, NOTCH, OX40, OX40L, PD-1, PDL1, PSCA, PSMA, RANKL, ROR1, ROR2, SLC44A4, Syndecan-1, TACI, TAG-72, Tenascina, TIM3, TRAILR1, TRAILR2,VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3,.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: Rituxan (rituximab), Herceptin (trastuzumab), Erbitux (cetuximab), Vectibix (panitumumab), Arzerra (ofatumumab), Benlysta (belimumab), Yervoy (ipilimumab), Perjeta (pertuzumab), Tremelimumab, Nivolumab, Dacetuzumab, Urelumab, MPDL3280A, Lambrolizumab y Blinatumomab.
Rituxan (Rituximab) es un anticuerpo quimérico utilizado para el tratamiento del linfoma no Hodgkin de células B. Actúa sobre la superficie de los linfocitos B que expresan el antígeno CD20 que se expresa en el 90 % de los linfomas no Hodgkin de células B. Rituxan se une a CD20 para inducir la lisis de los linfocitos B mediante CDC y ADCC, así como sensibilizar a los linfocitos humanos resistentes a algunos quimioterápicos citotóxicos.
Herceptin (Trastuzumab) es un anticuerpo monoclonal humanizado que actúa sobre el dominio extracelular del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano Her2, que se expresa en el 25 % -30 % de los cánceres de mama. Se cree que el Trastuzumab tiene un efecto antitumoral a través de (1) la regulación a la baja del receptor Her2, la inhibición de las vías de transducción de señalización intracelular de Her2 y la inducción de la apoptosis; (2) mecanismos inmunitarios relacionados con el ADCC dependiente de anticuerpos y el CDC para eliminar las células tumorales; (3) potenciar los efectos de la quimioterapia.
Erbitux (Cetuximab) es un anticuerpo quimérico que actúa sobre el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Erbitux se une al EGFR para inhibir su vía de transducción de señales, afectando a la proliferación celular, la invasión y la metástasis, y la angiogénesis. La inhibición de la vía de transducción de señales del EGFR puede mejorar la eficacia de los fármacos quimioterapéuticos y la radioterapia.
Avastin (Bevacizumab) es un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Su unión al VEGFR inhibe el VEGF y la transducción de señales, lo que provoca la inhibición de la angiogénesis tumoral.
Otros anticuerpos que se están desarrollando en la actualidad también pueden utilizarse como fracciones de direccionamiento. Por ejemplo, se están desarrollando anticuerpos monoclonales terapéuticos contra las siguientes dianas para el tratamiento de tumores: CD2, CD19, CD20, CD22, CD27, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD47, CD52, Cd 56, CD70, CD79 y CD137 y las siguientes dianas para el tratamiento de tumores: 4-1BB, 5T4, AGS-5, AGS-16, Angiopoyetina 2, B7.1, B7.2, b 7d C, B7H1, B7H2, B7H3, BT-062, BTLA, CAIX, antígeno carcinoembrionario, CTLA4, Cripto, ED-B, ErbBI, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFL7, EpCAM, EphA2, EphA3, EphB2, FAP, Fibronectina, Receptor de folato, Gangliósido GM3, GD2, Receptor del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides (GITR), gp100, gpA33, GPNMB, ICOS, IGF1R, Integrina av, Integrina avp , KIR, LAG-3, Lewis, Mesotelina, c-MET, MN Anhidrasa carbónica IX, MUC1, MUC16, Nectina-4, NKGD2, NOTCH, OX40, OX40L, PD-1, PDL1, PSCA, PSMA, RANKL, ROR1, ROR2, SLC44A4, Syndecan-1, TACI, TAG-72, Tenascina, TIM3, TRAILR1, TRAILR2, VEGFR-1, VEGFR-2 y VEGFR-3 y sus variantes. (Scott AM, Wolchok JD, Old LJ. Antibody Therapy of Cancer. Nat Rev Cancer.
2012 Mar 22;12(4):278-87).
En algunas realizaciones, la fracción de direccionamiento comprende un Fab, Fab', F(ab')2, anticuerpo de dominio único, dímero de T y Abs, Fv, scFv, dsFv, ds-scFv, Fd, anticuerpo lineal, minicuerpo, diacuerpo, fragmento de anticuerpo biespecífico, bicuerpo, tricuerpo, sc-diacuerpo, cuerpo kappa (lamda), BiTE, DVD-Ig, s Ip, SMIP, DART, o un análogo de anticuerpo que comprenda una o más CDRs.
La siguiente tabla muestra las diversas estructuras de anticuerpos y las dianas estudiadas.
Tabla 1
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En algunas realizaciones, la fracción de direccionamiento comprende un polipéptido ATWLPPR de VEGFR, un mimético de trombospondina-1, un polipéptido CDCRGDCFCG (cíclico), un polipéptido SCH 221153fragment, NCNGRC (cíclico) polipéptido, CTThWg FTLC polipéptido, CGNKRTRGC polipéptido (LyP-1), Octreotide, Vapreotide, Lanreotide, C-3940 polipéptido, Decapeptyl, Lupron, Zoladex, o Cetrorelix.
Ácido fólico
En aspectos de la presente divulgación, la fracción de direccionamiento comprende ácido fólico o un derivado del mismo.
En los últimos años, la investigación sobre el ácido fólico ha avanzado mucho. El ácido fólico es una pequeña molécula de vitamina necesaria para la división celular. Las células tumorales se dividen de forma anormal y existe una elevada expresión del receptor de folato (FR) en la superficie de la célula tumoral para captar suficiente ácido fólico que favorezca la división celular.
Los datos indican que la expresión de FR en las células tumorales es 20-200 veces superior a la de las células normales. La tasa de expresión de FR en diversos tumores malignos son: 82 % en cáncer de ovario, 66 % en cáncer de pulmón no microcítico, 64 % en cáncer de riñón, 34 % en cáncer de colon y 29 % en cáncer de mama (Xia W, Low PS. Terapias dirigidas tardías contra el cáncer. J Med Chem. 2010; 14; 53 (19):6811-24). La tasa de expresión de FA y el grado de malignidad de la invasión y metástasis de tumores epiteliales están positivamente correlacionados. El FA entra en la célula a través de endocitosis mediada por FR, y el FA a través de su grupo carboxilo forma complejos de FAcon fármacos que entran en las células. En condiciones ácidas (pH de 5), el FR se separa del FAy éste libera fármacos al citoplasma.
Clínicamente, el sistema puede utilizarse para administrar fármacos que ataquen selectivamente a las células tumorales. El ácido fólico tiene un peso molecular pequeño, no es inmunógeno y presenta una gran estabilidad, además de ser barato de sintetizar. Y lo que es más importante, el acoplamiento químico entre el fármaco y el portador es sencillo, por lo que el uso de FAcomo molécula de direccionamiento para construir sistemas de administración de fármacos se ha convertido en un punto de interés en la investigación para el tratamiento del cáncer. En la actualidad, el EC145 (compuesto quimioterápico conjugado con FA) que se encuentra en ensayos clínicos puede atacar eficazmente a las células cancerosas (Pribble P y Edelman MJ. EC145: a novel targeted agent for adenocarcinoma of the lung. ExpertOpin. Investig. Drugs (2012) 21:755-761).
Otras fracciones de direccionamiento
En algunos aspectos de la presente divulgación, la fracción de direccionamiento comprende dominios extracelulares (ECD) o forma soluble de PD-1, CTLA4, CD47, BTLA, KIR, TIM3, 4-1BB, y LAG3, longitud completa o parcial de un ligando de superficie Amphiregulin, Betacellulin, EGF, Ephrin, Epigen, Epiregulin, IGF, Neuregulin, t Gf, TRAIL, o VEGF.
Nanopartículas
En algunos aspectos de la presente divulgación, la fracción de direccionamiento comprende una partícula (partícula diana), preferiblemente una nanopartícula, opcionalmente una nanopartícula dirigida que se une a una molécula de direccionamiento que puede unirse específica o preferiblemente a una diana. En algunas realizaciones, la partícula diana por sí misma guía el compuesto de la presente invención (como por enriquecimiento en células tumorales o tejido) y no hay moléculas de direccionamiento adicionales unidas a ella.
Por "nanopartícula" se entiende cualquier partícula con un diámetro inferior a 1000 nm. En algunas realizaciones, un agente terapéutico y/o una fmolécula de direccionamiento pueden asociarse a la matriz polimérica. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento puede asociarse covalentemente a la superficie de una matriz polimérica. En algunas realizaciones, la asociación covalente está mediada por un enlazador. En algunas realizaciones, el agente terapéutico puede estar asociado a la superficie de la matriz polimérica, encapsulado en ella, rodeado por ella y/o disperso por toda ella. Pat. N° 8.246.968.
En general, las nanopartículas de la presente invención comprenden cualquier tipo de partícula. Puede utilizarse cualquier partícula de acuerdo con la presente invención. En algunas realizaciones, las partículas son biodegradables y biocompatibles. En general, una sustancia biocompatible no es tóxica para las células. En algunas realizaciones, se considera que una sustancia es biocompatible si su adición a las células produce menos de un determinado umbral de muerte celular. En algunas realizaciones, se considera que una sustancia es biocompatible si su adición a las células no induce efectos adversos. En general, una sustancia biodegradable es aquella que se descompone en condiciones fisiológicas en el transcurso de un periodo de tiempo terapéuticamente relevante (por ejemplo, semanas, meses o años). En algunas realizaciones, una sustancia biodegradable es una sustancia que puede ser descompuesta por la maquinaria celular. En algunas realizaciones, una sustancia biodegradable es una sustancia que puede descomponerse mediante procesos químicos. En algunas realizaciones, una partícula es una sustancia biocompatible y biodegradable. En algunas realizaciones, una partícula es una sustancia biocompatible, pero no biodegradable. En algunas realizaciones, una partícula es una sustancia biodegradable, pero no biocompatible.
En algunas realizaciones, las partículas tienen un tamaño superior al límite de excreción renal (por ejemplo, partículas con diámetros superiores a 6 nm). En algunas realizaciones, las partículas son lo suficientemente pequeñas como para evitar su eliminación del torrente sanguíneo por el hígado (por ejemplo, partículas con diámetros inferiores a 1000 nm). En general, las características fisicoquímicas de las partículas deben permitir que una partícula diana circule más tiempo en el plasma al disminuir la excreción renal y el aclaramiento hepático.
A menudo es deseable utilizar una población de partículas que sea relativamente uniforme en términos de tamaño, forma y/o composición, de modo que cada partícula tenga propiedades similares. Por ejemplo, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % de las partículas pueden tener un diámetro o dimensión mayor que se sitúe dentro del 5 %, 10 % o 20 % del diámetro medio o dimensión mayor. En algunas realizaciones, una población de partículas puede ser heterogénea en cuanto a tamaño, forma y/o composición.
El potencial zeta es una medida del potencial de superficie de una partícula. En algunas realizaciones, las partículas tienen un potencial zeta que oscila entre -50 mV y 50 mV. En algunas realizaciones, las partículas tienen un potencial zeta que oscila entre -25 mV y 25 mV. En algunas realizaciones, las partículas tienen un potencial zeta que oscila entre -10 mV y 10 mV. En algunas realizaciones, las partículas tienen un potencial zeta que oscila entre -5 mV y 5 mV. En algunas realizaciones, las partículas tienen un potencial zeta que oscila entre 0 mV y 50 mV. En algunas realizaciones, las partículas tienen un potencial zeta que oscila entre 0 mV y 25 mV. En algunas realizaciones, las partículas tienen un potencial zeta que oscila entre 0 mV y 10 mV. En algunas realizaciones, las partículas tienen un potencial zeta que oscila entre 0 mV y 5 mV. En algunas realizaciones, las partículas tienen un potencial zeta que oscila entre -50 mV y 0 mV. En algunas realizaciones, las partículas tienen un potencial zeta que oscila entre -25 mV y 0 mV. En algunas realizaciones, las partículas tienen un potencial zeta que oscila entre -10 mV y 0 mV. En algunas realizaciones, las partículas tienen un potencial zeta que oscila entre -5 mV y 0 mV. En algunas realizaciones, las partículas tienen un potencial zeta sustancialmente neutro (es decir, aproximadamente 0 mV).
Se puede utilizar una variedad de partículas diferentes de acuerdo con la presente invención. En algunas realizaciones, las partículas son esferas o esferoides. En algunas realizaciones, las partículas son esferas o esferoides. En algunas realizaciones, las partículas son planas o tienen forma de placa. En algunas realizaciones, las partículas son cubos o cuboides. En algunas realizaciones, las partículas son óvalos o elipses. En algunas realizaciones, las partículas son cilindros, conos o pirámides.
En algunas realizaciones, las partículas son micropartículas (por ejemplo, microesferas). En general, una "micropartícula" se refiere a cualquier partícula que tenga un diámetro inferior a 1000 μm. En algunas realizaciones, las partículas son picopartículas (por ejemplo, picosferas). En general, una "picopartícula" se refiere a cualquier partícula que tenga un diámetro inferior a 1 nm. En algunas realizaciones, las partículas son liposomas. En algunas realizaciones, las partículas son micelas.
Las partículas pueden ser sólidas o huecas y pueden comprender una o más capas (por ejemplo, nanocáscaras, nanoanillos). En algunas realizaciones, cada capa tiene una composición única y propiedades únicas en relación con la(s) otra(s) capa(s). Por ejemplo, las partículas pueden tener una estructura núcleo/cáscara, en la que el núcleo es una capa y la cáscara es una segunda capa. Las partículas pueden comprender una pluralidad de capas diferentes. En algunas realizaciones, una capa puede estar sustancialmente reticulada, una segunda capa no está sustancialmente reticulada, y así sucesivamente. En algunas realizaciones, una, varias o todas las capas pueden contener uno o más agentes terapéuticos o de diagnóstico. En algunas realizaciones, una capa comprende un agente que debe administrarse, una segunda capa no comprende un agente que debe administrarse, y así sucesivamente. En algunas realizaciones, cada capa individual comprende un agente diferente o un conjunto de agentes a suministrar.
En algunas realizaciones, una partícula es porosa, entendiéndose por ello que la partícula contiene agujeros o canales, que son típicamente pequeños en comparación con el tamaño de la partícula. Por ejemplo, una partícula puede ser una partícula de sílice porosa, por ejemplo, una nanopartícula de sílice mesoporosa o puede tener un recubrimiento de sílice mesoporosa (Lin et al., 2005, J. Am. Chem. Soc., 17:4570). Las partículas pueden tener poros de entre 1 nm y 50 nm de diámetro, por ejemplo, de entre 1 y 20 nm de diámetro. Entre el 10 % y el 95 % del volumen de una partícula puede consistir en huecos dentro de los poros o canales.
Las partículas pueden tener una capa de recubrimiento. El uso de una capa de recubrimiento biocompatible puede ser ventajoso, por ejemplo, si las partículas contienen materiales tóxicos para las células. Los materiales de recubrimiento adecuados incluyen, entre otros, proteínas naturales como la albúmina de suero bovino (BSA), polímeros hidrófilos biocompatibles como el polietilenglicol (PEG) o un derivado del PEG, fosfolípidos (PEG), sílice, lípidos, polímeros, carbohidratos como el dextrano, otras nanopartículas que pueden asociarse con nanopartículas inventivas, etc. Los recubrimientos pueden aplicarse o ensamblarse de diversas maneras, como por inmersión, mediante una técnica de capa por capa, por autoensamblaje, conjugación, etc. El autoensamblaje se refiere a un proceso de ensamblaje espontáneo de una estructura de orden superior que se basa en la atracción natural de los componentes de la estructura de orden superior (por ejemplo, moléculas) entre sí. Suele producirse mediante movimientos aleatorios de las moléculas y la formación de enlaces basados en el tamaño, la forma, la composición o las propiedades químicas.
Ejemplos de polímeros son los polialquilenos (por ejemplo, polietilenos), policarbonatos (por ejemplo, poli(1,3-dioxan-2 ona)), polianhídridos (por ejemplo, poli(anhídrido sebácico)), polihidroxiácidos (por ejemplo, poli(p-hidroxialcanoato)), polifumaratos, policaprolactonas, poliamidas (por ejemplo, policaprolactama), poliacetales, poliésteres (por ejemplo, polilactida, poliglicolida, poli(ortoésteres)), alcoholes polivinílicos, poliuretanos, polifosfazenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, policianoacrilatos, poliureas, poliestirenos y poliaminas. En algunas realizaciones, los polímeros de acuerdo con la presente invención incluyen polímeros que han sido aprobados para su uso en seres humanos por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU. (FDA) en virtud de 21 C.F.R. §177.2600, incluidos, entre otros, poliésteres (por ejemplo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, poli(ácido láctico-co-glicólico), policaprolactona, polivalerolactona, poli(1,3-dioxan-2ona)); polianhídridos (por ejemplo, poli(anhídrido sebácico)); poliéteres (por ejemplo, polietilenglicol); poliuretanos; polimetacrilatos; poliacrilatos; y policianoacrilatos.
En algunas realizaciones, las partículas pueden ser partículas no poliméricas (por ejemplo, partículas metálicas, puntos cuánticos, partículas cerámicas, polímeros que comprenden materiales inorgánicos, materiales derivados del hueso, sustitutos del hueso, partículas virales, etc.). En algunas realizaciones, un agente terapéutico o de diagnóstico a administrar puede asociarse a la superficie de dicha partícula no polimérica. En algunas realizaciones, una partícula no polimérica es un agregado de componentes no poliméricos, como un agregado de átomos metálicos (por ejemplo, átomos de oro). En algunas realizaciones, un agente terapéutico o de diagnóstico a administrar puede estar asociado a la superficie de y/o encapsulado dentro de, rodeado por, y/o disperso a través de un agregado de componentes no poliméricos.
Las partículas (por ejemplo, nanopartículas, micropartículas) pueden prepararse utilizando cualquier procedimiento conocido en la técnica. Por ejemplo, las formulaciones particuladas pueden formarse por métodos como la nanoprecipitación, canales fluídicos de enfoque de flujo, secado por pulverización, evaporación de disolventes de emulsión simple y doble, extracción de disolventes, separación de fases, molienda, procedimientos de microemulsión, microfabricación, nanofabricación, capas de sacrificio, coacervación simple y compleja, y otros métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Como alternativa o complemento, se han descrito síntesis acuosas y con disolventes orgánicos de nanopartículas monodispersas semiconductoras, conductoras, magnéticas, orgánicas y de otros tipos (Pellegrino et al., 2005, Small, 1:48; Murray et al., 2000, Ann. Rev. Mat. Sci., 30:545y Trindade et al., 2001, Chem. Mat., 13:3843).
Los métodos para fabricar micropartículas para la administración de agentes encapsulados se describen en la bibliografía (véase, p. ej, Doubrow, Ed., "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy," CRC Press, Boca Ratón, 1992; Mathiowitz et al., 1987, J. Control. Release, 5:13; Mathiowitz et al., 1987, Reactive Polymers, 8 : 275; y Mathiowitz et al., 1988, J. Appl. Polymer Sci., 35:755).
Fracciones de direccionamiento de ácidos nucleicos
En algunos aspectos de la presente divulgación, la fracción de direccionamiento comprende una fracción de direccionamiento de ácido nucleico.
En general, una fracción de direccionamiento de ácido nucleico es cualquier polinucleótido que se une a un componente asociado con un órgano, tejido, célula, componente de la matriz extracelular y/o compartimento intracelular (la diana).
En algunas realizaciones, las fracciones de direccionamiento de ácido nucleico son aptámeros.
Un aptámero es típicamente un polinucleótido que se une a una estructura diana específica asociada a un órgano, tejido, célula, componente de la matriz extracelular y/o compartimento intracelular en particular. En general, la función de orientación del aptámero se basa en su estructura tridimensional. En algunas realizaciones, la unión de un aptámero a una diana suele estar mediada por la interacción entre las estructuras bidimensionales y/o tridimensionales tanto del aptámero como de la diana. En algunas realizaciones, la unión de un aptámero a una diana no se basa únicamente en la secuencia primaria del aptámero, sino que depende de la(s) estructura(s) tridimensional(es) del aptámero y/o de la diana. En algunas realizaciones, los aptámeros se unen a sus dianas mediante el emparejamiento de bases complementarias Watson-Crick que se interrumpe por estructuras (por ejemplo, bucles de horquilla) que interrumpen el emparejamiento de bases.
En algunas realizaciones, las fracciones de direccionamiento de ácido nucleico son Spiegelmers (Publicaciones PCT WO 98/08856, WO 02/100442y WO 06/117217). En general, los Spiegelmers son ácidos nucleicos sintéticos de imagen especular que pueden unirse específicamente a una diana (es decir, aptámeros de imagen especular). Los Spiegelmers se caracterizan por unas características estructurales que los hacen insensibles a las exo- y endonucleasas.
Un experto en la materia reconocerá que cualquier fracción de ácido nucleico (por ejemplo, aptámero o Spiegelmer) capaz de unirse específicamente a una diana puede utilizarse de acuerdo con la presente invención. En algunas realizaciones, las fracciones de direccionamiento de ácido nucleico que se utilizarán de acuerdo con la presente invención pueden dirigirse a un marcador asociado con una enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas realizaciones, las fracciones de direccionamiento de ácido nucleico que se utilizarán de acuerdo con la presente invención pueden dirigirse a dianas asociadas al cáncer. En algunas realizaciones, las fracciones de direccionamiento de ácido nucleico que se utilizarán de acuerdo con la presente invención pueden dirigirse a marcadores tumorales. Cualquier tipo de cáncer y/o cualquier marcador tumoral puede ser diana utilizando fracciones de direccionamiento de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Por citar sólo algunos ejemplos, las fracciones de direccionamiento de ácido nucleico pueden dirigirse a marcadores asociados con el cáncer de próstata, el cáncer de pulmón, el cáncer de mama, el cáncer colorrectal, el cáncer de vejiga, el cáncer de páncreas, el cáncer de endometrio, el cáncer de ovario, el cáncer de huesos, el cáncer de esófago, el cáncer de hígado, el cáncer de estómago, los tumores cerebrales, el melanoma cutáneo y/o la leucemia.
Los ácidos nucleicos de la presente invención (incluidas las fracciones de direccionamiento de ácido nucleico y/o los ARN funcionales a administrar, p. ej., entidades inductoras de ARNi, ribozimas, ARNt, etc., descritos con más detalle a continuación) pueden prepararse de acuerdo con cualquier técnica disponible, incluyendo, entre otras, síntesis química, síntesis enzimática, escisión enzimática o química de un precursor más largo, etc. Los métodos de síntesis de ARN son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Gait, M. J. (ed.) Oligonucleotide synthesis: a practical approach, Oxford [Oxfordshire], Washington, D.C.: IRL Press, 1984; y Herdewijn, P (ed.) Oligonucleotide synthesis: methods and applications, Methods in molecular biology, v. 288 (Clifton, N.J.) Totowa, Nueva Jersey: Humana Press, 2005).
El ácido nucleico que forma la fracción de direccionamiento de ácido nucleico puede comprender nucleósidos naturales, nucleósidos modificados, nucleósidos naturales con enlazadores hidrocarburos (por ejemplo, un alquileno) o un enlazador poliéter (por ejemplo, un enlazador PEG) insertados entre uno o más nucleósidos, nucleósidos modificados con enlazadores hidrocarburos o PEG insertados entre uno o más nucleósidos, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los nucleótidos o nucleótidos modificados de la fracción de direccionamiento de ácido nucleico pueden sustituirse por un enlazador hidrocarburo o un enlazador poliéter, siempre que la afinidad de unión y la selectividad de la fracción de direccionamiento de ácido nucleico no se reduzcan sustancialmente por la sustitución (p. ej., la constante de disociación de la fracción de direccionamiento de ácido nucleico para la diana no debe ser superior a aproximadamente1x10'3 M).
Se apreciará por aquellos de habilidad normal en el arte que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden comprender nucleótidos enteramente de los tipos encontrados en ácidos nucleicos ed origen natural, o pueden en su lugar incluir uno o más análogos de nucleótidos o tener una estructura que de otra manera difiere de la de un ácido nucleico que ocurre naturalmente. Pat. de EE.UU. Nos. 6.403.779; 6,399,754; 6,225,460; 6,127,533; 6,031,086; 6,005,087; 5,977,089; y las referencias en los mismos divulgan una amplia variedad de análogos de nucleótidos específicos y modificaciones que pueden utilizarse. Véase Crooke, S. (ed.) Antisense Drug Technology: Principios, estrategias y aplicaciones (1a ed), Marcel Dekker; ISBN: 08247056611a edición (2001) y sus referencias. Por ejemplo, las 2'-modificaciones incluyen grupos halo, alcoxi y aliloxi. En algunas realizaciones, el grupo 2'-OH se sustituye por un grupo seleccionado entre H, OR, R, halo, SH, Sr , NH2, NHR, NR2 o CN, donde R es C 1 -C6 alquilo, alquenilo o alquinilo, y halo es F, Cl, Br o I. Ejemplos de enlaces modificados incluyen enlaces fosforotioato y 5'-N-fosforamidito.
Los ácidos nucleicos que comprenden una variedad de diferentes análogos de nucleótidos, esqueletos modificados o enlaces internucleósidos no naturales pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención. Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden incluir nucleósidos naturales (es decir, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina) o nucleósidos modificados. Entre los ejemplos de nucleótidos modificados se incluyen nucleósidos de base modificada (p. ej, aracitidina, inosina, isoguanosina, nebularina, pseudouridina, 2,6-diaminopurina, 2-aminopurina, 2-tiotimidina, 3-deaza-5-azacitidina, 2'-desoxiuridina, 3-nitorpirrol, 4-metilindol, 4-tiouridina, 4-tiotimidina, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, 2-tiouridina, 5-bromotidina, 5-iodouridina, inosina, 6 -azauridina, 6 -cloropurina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8 -azaadenosina, 8 -azidoadenosina, bencimidazol, M1-metiladenosina, pirrolopirimidina, 2-amino-6-cloropurina, 3-metiladenosina, 5-propinilcitidina, 5-propiniluridina, 5-bromouridina, 5-fluorouridina, 5-metilcitidina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8 -oxoadenosina, 8 -oxoguanosina, O(6 )-metilguanina y 2-tiocitidina), bases modificadas química o biológicamente (p. ej.g., bases metiladas), azúcares modificados (por ejemplo, 2 '-fluoribosa, 2 '-aminoribosa, 2 '-azidoribosa, 2'-O-metilribosa, nucleósidos L-enantioméricos arabinosa y hexosa), grupos fosfato modificados (por ejemplo, fosforotioatos y enlaces 5'-N-fosforamidito), y combinaciones de los mismos. Los monómeros de nucleótidos naturales y modificados para la síntesis química de ácidos nucleicos están fácilmente disponibles. En algunos casos, los ácidos nucleicos que comprenden dichas modificaciones muestran propiedades mejoradas en relación con los ácidos nucleicos que constan únicamente de nucleótidos naturales. En algunas realizaciones, las modificaciones de ácidos nucleicos descritas en el presente documento se utilizan para reducir y/o prevenir la digestión por nucleasas (por ejemplo, exonucleasas, endonucleasas, etc.). Por ejemplo, la estructura de un ácido nucleico puede estabilizarse incluyendo análogos de nucleótidos en el extremo 3' de una o ambas cadenas para reducir la digestión.
No es necesario que los ácidos nucleicos modificados estén uniformemente modificados a lo largo de toda la molécula. En varias posiciones del ácido nucleico pueden existir diferentes modificaciones nucleotídicas y/o estructuras vertebrales. Un experto en la materia apreciará que los análogos de nucleótidos u otras modificaciones pueden situarse en cualquier posición de un ácido nucleico de forma que la función del ácido nucleico no se vea sustancialmente afectada. Por citar sólo un ejemplo, las modificaciones pueden situarse en cualquier posición de una fracción de direccionamiento de ácido nucleico de forma que la capacidad de la fracción de direccionamiento de ácido nucleico para unirse específicamente a la diana no se vea sustancialmente afectada. La región modificada puede estar en el extremo 5' y/o en el extremo 3' de una o ambas cadenas. Por ejemplo, se han empleado fracciones de direccionamiento de ácido nucleico modificadas en las que aproximadamente 1-5 residuos en el extremo 5' y/o 3' de cualquiera de ambas cadenas son análogos de nucleótidos y/o tienen una modificación de la columna vertebral. La modificación puede ser una modificación terminal 5' o 3'. Una o ambas cadenas de ácido nucleico pueden comprender al menos un 50 % de nucleótidos no modificados, al menos un 80 % de nucleótidos no modificados, al menos un 90 % de nucleótidos no modificados o un 100 % de nucleótidos no modificados.
Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden, por ejemplo, comprender una modificación a un azúcar, nucleósido o enlace internucleósido como los descritos en Publicaciones de solicitud de patente de EE.UU.
2003/0175950, 2004/0192626, 2004/0092470, 2005/0020525 y 2005/0032733. La presente invención abarca el uso de cualquier ácido nucleico que tenga una o más de las modificaciones descritas en la misma. Por ejemplo, se ha informado de que una serie de conjugados terminales, por ejemplo, lípidos como el colesterol, el ácido litocólico, el ácido alúrico, o largas cadenas ramificadas de alquilos, mejoran la captación celular. Los análogos y las modificaciones pueden ensayarse, por ejemplo, mediante cualquier ensayo apropiado conocido en la técnica, por ejemplo, para seleccionar los que dan lugar a una entrega mejorada de un agente terapéutico o de diagnóstico, una unión específica mejorada de una fracción de direccionamiento de ácido nucleico a una diana, etc. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden comprender uno o más enlaces nucleósidos no naturales. En algunas realizaciones, uno o más nucleótidos internos en el extremo 3'-, extremo 5'-, o ambos extremos 3'- y 5'- de la fracción de direccionamiento de ácido nucleico se invierten para producir un enlace tal como un enlace 3'-3' o un enlace 5'-5'.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención no son sintéticos, sino que son entidades naturales que han sido aisladas de sus entornos naturales.
Puede utilizarse cualquier procedimiento para diseñar novedosas fracciones de direccionamiento de ácido nucleico (véase, p. ej., U.S. Pat. Nos. 6.716.583; 6,465,189; 6,482,594; 6,458,543; 6,458,539; 6,376,190; 6,344,318; 6,242,246; 6,184,364; 6,001,577; 5,958,691; 5,874,218; 5,853,984; 5,843,732; 5,843,653; 5,817,785; 5,789,163; 5,763,177; 5,696,249; 5,660,985; 5,595,877; 5,567,588 y 5,270,163 y Publicaciones de solicitud de patente de EE.UU.
2005/0069910, 2004/0072234, 2004/0043923, 2003/0087301,2003/0054360 y 2002/0064780). La presente invención proporciona métodos para diseñar nuevas fracciones de direccionamiento de ácidos nucleicos. La presente invención proporciona además métodos para aislar o identificar nuevas fracciones de direccionamiento de ácido nucleico a partir de una mezcla de fracciones de direccionamiento de ácido nucleico candidatas.
Pueden diseñarse y/o identificarse fracciones de direccionamiento de ácido nucleico que se unen a una proteína, un carbohidrato, un lípido y/o un ácido nucleico. En algunas realizaciones, las fracciones de direccionamiento de ácido nucleico pueden diseñarse y/o identificarse para su uso en los complejos de la invención que se unen a proteínas y/o porciones características de las mismas, como marcadores tumorales, integrinas, receptores de superficie celular, proteínas transmembrana, proteínas intercelulares, canales iónicos, proteínas transportadoras de membrana, enzimas, anticuerpos, proteínas quiméricas, etc. En algunas realizaciones, pueden diseñarse y/o identificarse fracciones de direccionamiento de ácido nucleico para su uso en los complejos de la invención que se unen a carbohidratos y/o porciones características de los mismos, como glicoproteínas, azúcares (p. ej., monosacáridos, disacáridos y polisacáridos), glicocálix (es decir, la zona periférica rica en carbohidratos en la superficie exterior de la mayoría de las células eucariotas), etc. En algunas realizaciones, pueden diseñarse y/o identificarse fracciones de direccionamiento de ácido nucleico para su uso en los complejos de la invención que se unen a lípidos y/o porciones características de los mismos, como aceites, ácidos grasos saturados, ácidos grasos insaturados, glicéridos, hormonas, esteroides (p. ej., colesterol, ácidos biliares), vitaminas (p. ej., vitamina E), fosfolípidos, esfingolípidos, lipoproteínas, etc. En algunas realizaciones, pueden diseñarse y/o identificarse fracciones de direccionamiento de ácidos nucleicos para su uso en los complejos de la invención que se unen a ácidos nucleicos y/o porciones características de los mismos, como ácidos nucleicos de ADN; ácidos nucleicos de ARN; ácidos nucleicos de ADN modificados; ácidos nucleicos de ARN modificados; y ácidos nucleicos que incluyen cualquier combinación de ADN, ARN, ADN modificado y ARN modificado; etc.
Las fracciones de direccionamiento de ácido nucleico (por ejemplo, aptámeros o eSpiegelmeros) pueden diseñarse y/o identificarse utilizando cualquier procedimiento disponible. En algunas realizaciones, las fracciones de direccionamiento de ácido nucleico se diseñan y/o identifican identificando fracciones de direccionamiento de ácido nucleico a partir de una mezcla candidata de ácidos nucleicos. La Evolución Sistémica de Ligandos por Enriquecimiento Exponencial (SELEX), o una variación de la misma, es un procedimiento comúnmente utilizado para identificar fracciones de direccionamiento de ácidos nucleicos que se unen a una diana a partir de una mezcla candidata de ácidos nucleicos.
Las fracciones de direccionamiento de ácido nucleico que se unen selectivamente a cualquier diana pueden aislarse mediante el proceso SELEX, o una variación del mismo, siempre que la diana pueda utilizarse como diana en el proceso SELEX.
B. Fracción activadora
En general, el compuesto de la presente invención comprende una fracción activadora (AM) como se define en las reivindicaciones. A continuación se describen diversos aspectos de la AM según la presente divulgación.
Por "fracción activadora" se entiende una molécula o agente capaz de estimular o potenciar el sistema inmunitario del organismo o las células tumorales. En general, la fracción activadora actúa, directa o indirectamente, sobre receptores tipo Toll, receptores tipo dominio de oligomerización de nucleótidos, receptores tipo RIG-I, receptores tipo lectina c, o sensores citosólicos de ADN, o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la fracción activadora es capaz de activar células inmunitarias humanas, incluidas, entre otras, células dendríticas, macrófagos, monocitos, células supresoras derivadas de mieloides, células NK, células B, células T o células tumorales, o una combinación de las mismas.
Células dendríticas
Las células dendríticas son las células presentadoras de antígenos más potentes. Las células dendríticas desempeñan un papel esencial en la iniciación de respuestas inmunitarias tanto innatas como adaptativas. Las células dendríticas también desempeñan un papel clave en la inducción y el mantenimiento de la tolerancia inmunitaria.
Por "células dendríticas" (CD) se entiende una población celular heterogénea que incluye dos subtipos principales: las CD mieloides (CDm) y las Cd plasmocitoides (CDp) (Steinman et al., 1979, J. Exp. Med., 149, 1-16). Estos dos subconjuntos de DC sanguíneas se diferenciaron originalmente por su expresión de CD11c (receptor de complemento de integrina) y CD 123 (IL-3Ra). Cada una de las poblaciones de pDC y mDC constituye entre el 0,2 y el 0,6 % de la población de PBMC en humanos.
Por "pDC" se entienden aquí las células dendríticas plasmocitoides y representan un subtipo de células dendríticas que se encuentran en la sangre y en los órganos linfoides periféricos. Estas células expresan los marcadores de superficie CD123, BDCA-2(CD303) y BDCA-4(CD304) y HLA-DR, pero no expresan CD11c, CD 14, CD3, CD20 o cD56, lo que las distingue de las células dendríticas convencionales, los monocitos, las células T, las células B y las células n K. Como componentes del sistema inmunitario innato, estas células expresan los receptores intracelulares tipo Toll 7 y 9, que permiten la detección de ácidos nucleicos víricos y bacterianos, como el ssRNA o los motivos de ADN CpG. Tras la estimulación y posterior activación, estas células producen grandes cantidades de interferón de tipo I (principalmente IFN-a e IFN-p) e interferón de tipo III (por ejemplo, IFN-A), que son compuestos antivirales pleiotrópicos críticos que median una amplia gama de efectos. Al generar un gran número de interferones de tipo I, citocinas y quimiocinas, las células dendríticas plasmocitoides intervienen ampliamente en las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas del organismo. Pueden regular las células NK, las células T, las células B y otras células implicadas en la intensidad, la duración y el modo de respuesta inmunitaria, por lo que desempeñan una función muy importante en los tumores, las infecciones y las enfermedades autoinmunitarias. (Liu YJ. CIP: células profesionales productoras de interferón de tipo 1 y precursoras de células dendríticas plasmacitoides. Annu Rev Immunol. 2005; 23:275-306. Gilliet M, Cao W, Liu YJ. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases.. Nat Rev Immunol. 2008 Ago; 8 (8 ) :594-606).
Por "mDC" se entienden aquí las células dendríticas mieloides y representan un subtipo de células dendríticas circulantes que se encuentran en la sangre y en los órganos linfoides periféricos. Estas células expresan los marcadores de superficie CD11c, CD1a, HLA-DR y BDCA-1 (CD1c) o BDCA-3 (CD141). No expresan BDCA-2 ni CD123, lo que las distingue de las pDC. Las mDC tampoco expresan CD3, CD20 ni CD56. Como componentes del sistema inmunitario innato, los mDC expresan receptores de tipo Toll (TLR), incluidos TLR2, 3, 4, 5, 6 y 8 , que permiten la detección de componentes bacterianos y víricos. Tras la estimulación y posterior activación, estas células son las células presentadoras de antígenos más potentes para activar las células T CD4 y CD8 específicas de antígeno. Además, las mDC tienen la capacidad de producir grandes cantidades de IL-12 e iL23, que es fundamental para la inducción de la inmunidad mediada por células Th1 o Th17.
Un estudio encontró que muchos tumores sólidos como el cáncer de mama y el cáncer de cabeza y cuello, el cáncer de ovario tienen invasión de pDC (Treilleux I, Blay JY, Bendriss-Vermare N et al. Dendritic cell infiltration and prognosis of early stage breast cancer. Clin Cancer Res 2004; 10:7466-7474. Hartmann E, Wollenberg B, Rothenfusser S et al. Identification and functional analysis of tumor-infiltrating plasmacytoid dendritic cells in head and neck cancer.. Cancer Res 2003; 63:6478-6487. Zou WP, Machelon V, Coulomb-L'Hermin A, et al. Stromal-derived factor-1 in human tumors recruits and alters the function of plasmacytoid precursor dendritic cells. Nat Med 2001; 7:1339-1346) and factors secreted by tumor cells inhibit DC maturation. (Gabrilovich DI, Corak J, Ciernik IF et al. Decreased antigen presentation by dendritic cells in patients with breast cancer. Clin Cancer Res 1997; 3:483-490. Bell D, Chomarat P, Broyles D et al. In breast carcinoma tissue, immature dendritic cells reside within the tumor, whereas mature dendritic cells are located in peritumoral areas. J Exp Med 1999; 190: 1417-1425. Menetrier-Caux C, Montmain G, Dieu MC et al. Inhibition of the differentiation of dendritic cells from CD34 (+) progenitors by tumor cells: role of interleukin-6 and macrophage colony-stimulating factor. Blood 1998; 92:4778-4791). Estas células DC inmaduras no desempeñaron ningún papel en la promoción de la inmunidad antitumoral. Por el contrario, las DC del microentorno tumoral favorecen el crecimiento del tumor al inhibir la inmunidad antitumoral y promover la angiogénesis. Existen pruebas de que los fármacos Imiquimod, agonista del receptor tipo Toll 7, y CpG, agonista del receptor tipo Toll 9, pueden estimular los pDC dentro del microambiente tumoral para inhibir el desarrollo tumoral. (Dummer R, Urosevic M, Kempf W et al. Imiquimod in basal cell carcinoma: how does it work? Br J Dermatol 2003; 149:57-58. Miller RL, Gerster JF, Owens ML et al Imiquimod applied topically: a novel immune response modifier and new class of drug. Int J Immunopharmacol 1999; 21: 1-14. Hofmann MA, Kors C, Audring H et al Phase 1 evaluation of intralesionally injected TLR9-agonist PF-3512676 in patients with basal cell carcinoma or metastatic melanoma. J Immunother 2008; 31:520-527).
En algunas realizaciones, la célula dendrítica humana es una célula dendrítica plasmacitoide.
En algunas realizaciones, la célula dendrítica humana es una célula dendrítica mieloide.
En algunas realizaciones, la fracción activadora es capaz de unirse específicamente a TLR7 o TLR8 humanos y, por lo tanto, es capaz de activar pDC o mDC.
En algunas realizaciones, la fracción activadora es capaz de unirse específicamente tanto a TLR7 como a TLR8 humanos, por lo que es capaz de activar tanto pDC como mDC. Los pDC expresan selectivamente el receptor endosomal tipo Toll (TLR) 7 y TLR9, mientras que los mDC expresan selectivamente TLR8. Bao M, Liu YJ. Regulation of TLR7/9 signaling in plasmacytoid dendritic cells, Protein Cel. 2013 Ene;4(1):40-52. Hémont C, Neel A, Heslan M, Braudeau C, Josien R. Human blood mDC subsets exhibit distinctTLR repertoire and responsiveness. J Leukoc Biol.
2013 Abr;93(4):599-609.
Células asesinas naturales (células NK)
En algunas realizaciones, la fracción activadora es capaz de activar células asesinas naturales (células NK), preferiblemente células NK humanas.
Las células asesinas naturales (NK) son un tipo de linfocito citotóxico que constituye un componente principal del sistema inmunitario. Las células NK son un subconjunto de linfocitos de sangre periférica definidos por la expresión de CD56 o CD 16 y la ausencia del receptor de células T (CD3). Reconocen y eliminan líneas celulares transformadas sin cebado de forma no restringida por el CMH. Las células NK desempeñan un papel fundamental en el rechazo de tumores y células infectadas por virus. El proceso por el que una célula NK reconoce una célula diana y emite una señal suficiente para desencadenar la lisis de la diana viene determinado por una serie de receptores inhibidores y activadores en la superficie celular. La discriminación de NKde la misma de la autoalterada implica el reconocimiento de receptores inhibidores de moléculas MHC-I y ligandos no MHC como CD48 y Clr-1b. El reconocimiento por parte de las NK de células infectadas o dañadas (autoalteradas) se coordina a través de ligandos inducidos por el estrés (por ejemplo, MICA, MICB, Rae1, H60, Mult1) o ligandos codificados viralmente (por ejemplo, m157, hemaglutinina) reconocidos por varios receptores activadores, incluidos NKG2D, Ly49H y NKp46/Ncr1.
Las células NK representan la célula linfoide predominante en la sangre periférica durante muchos meses después del trasplante alogénico o autólogo de células madre y tienen un papel primordial en la inmunidad frente a patógenos durante este periodo (Reittie et al (1989) Blood 73: 1351-1358; Lowdell et al (1998) Bone MarrowTransplant 21:: 679­ 686 ). El papel de las células NK en el injerto, la enfermedad injerto contra huésped, la actividad antileucémica y la infección postrasplante se revisa en Lowdell (2003) Transfusion Medicine 13:399-404.
Las células NK humanas median la lisis de células tumorales y células infectadas por virus a través de la citotoxicidad natural y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
Las células NK humanas están controladas por señales citolíticas positivas y negativas. Las señales negativas (inhibitorias) son transmitidas por los receptores CD94/NKG2A que contienen el dominio C-lectina y por algunos receptores similares a las inmunoglobulinas asesinas (KIR). La regulación de la lisis NK mediante señales inhibitorias se conoce como la hipótesis del "autodesaparecido", en la que alelos específicos HLA de clase I expresados en la superficie de la célula diana ligan receptores inhibidores en las células n K. La regulación a la baja de las moléculas HLA en las células tumorales y algunas células infectadas por virus (por ejemplo, CMV) reduce esta inhibición por debajo de un umbral objetivo y las células diana pueden volverse susceptibles a la lisis mediada por células NK si las células diana también portan moléculas activadoras y cebadoras de NK. Los agonistas de TLR7, TLR8 o TLR9 pueden activar tanto las mDC como las pDC para que produzcan IFN de tipo I y expresen moléculas coestimuladoras como el ligando GITR, que posteriormente activan las células NK para que produzcan IFN-g y promuevan de forma potente la función letal de las células NK.
Los receptores inhibidores se dividen en dos grupos, los de la superfamilia Ig llamados Receptores asesinos similares a las inmunoglobulinas (KIRs) y los de la familia de las lectinas, los NKG2, que forman dímeros con CD94 en la superficie celular. Los KIR tienen una estructura extracelular de 2 o 3 dominios y se unen a HLA-A, -B o -C. Los complejos NKG2/CD94 ligan HLA-E.
Los KIRs inhibitorios tienen hasta 4 dominios intracelulares que contienen ITIMs y los mejor caracterizados son KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3 que se sabe que se unen a moléculas HLA-C. KIr 2d L2 y KIR2DL3 se unen a los alelos HLA-C del grupo 1, mientras que KIR2DL1 se une a los alelos del grupo 2. Ciertas células de leucemia/linfoma expresan alelos HLA-C de los grupos 1 y 2 y se sabe que son resistentes a la lisis celular mediada por NK
Con respecto a las señales activadoras positivas, se cree que el ADCC está mediado por CD 16, y se han identificado varios receptores desencadenantes responsables de la citotoxicidad natural, como CD2, CD38, CD69, NKRP-I, CD40, B7-2, NK-TR, NKp46, NKp30 y NKp44. Además, varias moléculas KIR con colas intracitoplasmáticas cortas también son estimulantes. Se sabe que estos KIRs (KIR2DS 1, KIR2DS2 y KIR2DS4) se unen a HLA-C; sus dominios extracelulares son idénticos a los KIRs inhibidores relacionados. Los KIR activadores carecen de ITIM y en su lugar se asocian con DAP 12, lo que provoca la activación de las células NK. El mecanismo de control de la expresión de los KIR inhibidores frente a los activadores sigue siendo desconocido.
Células tumorales
En algunas realizaciones, la fracción activadora es capaz de activar células tumorales. Varios informes han descrito la expresión de TLR en líneas celulares de cáncer humano o de ratón. Por ejemplo, TLR1 a TLR6 se expresan en líneas celulares tumorales de ratón de colon, pulmón, próstata y melanoma (Huang B, et al. Los receptores Toll-like de las células tumorales facilitan la evasión de la vigilancia inmunitaria. Cancer Res. 2005;65(12):5009-5014), TLR3 se expresa en células de cáncer de mama humano (Salaun B, Coste I, Rissoan MC, Lebecque SJ, Renno T TLR3 can directly trigger apoptosis in human cancer cells. J Immunol. 2006;176(8):4894-4901), las células de hepatocarcinoma y carcinoma gástrico expresan TLR2 y TLR4 (Huang B, et al. Listeria monocytogenes promueve el crecimiento tumoral a través de la señalización del receptor toll-like 2 de las células tumorales. Cancer Res. 2007;67(9):4346-4352), y TLR9 (Droemann D, et al. Las células de cáncer de pulmón humano expresan el receptor tipo Toll 9 funcionalmente activo. Respir Res. 2005;6: 1.) y TLR4 (Hc W, Liu Q, Wang L, Chen W, Li N, Cao X. Tl R4 signaling promotes immune escape of human lung cancer cells by inducing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance. Mol Immunol.
2007;44(11):2850-2859.) se expresan en las células de cáncer de pulmón humano. TLR7 y TLR8 se encuentran en las células tumorales del cáncer de pulmón humano (Cherfils-Vicini J, Platonova S, Gillard M, Laurans L, Validire P, Caliandro R, Magdeleinat P, Mami-Chouaib F, Dieu-Nosjean MC, Fridman WH, Damotte D, Sautés-Fridman C, Cremer I. J. Clin Invest. 2010;120(4):1285-1297).
Los efectos sobre las células tumorales pueden ser diversos, por ejemplo, la estimulación de TLR3 por poli I:C en células humanas de cáncer de mama y melanoma desencadena directamente la apoptosis de las células tumorales (Salaun B, Coste I, Rissoan MC, Lebecque SJ, Renno T. TLR3 can directly trigger apoptosis in human cancer cells. J Immunol. 2006;176(8):4894-4901., Salaun B, Lebecque S, Matikainen S, Rimoldi D, Romero P Toll-like receptor 3 expressed by melanoma cells as a target fortherapy? Clin Cancer Res. 2007;13(15 Pt 1):4565-4574.). Por otra parte, las células de cáncer de pulmón humano expresan el receptor tipo Toll 9 funcionalmente activo y la estimulación de las líneas celulares A549 y HeLa que expresan TLR-9 con CpG-ODN mostró un efecto antiapoptótico. No obstante, los datos acumulados demuestran que los TLR están bien asociados a las células cancerosas y pueden tener un efecto directo o indirecto sobre ellas.
Composición química de la fracción activadora
En general, la fracción activadora de la presente divulgación comprende una proteína, un anticuerpo, un ácido nucleico, una molécula pequeña o un ligando. La AM de la invención se define en las reivindicaciones.
En algunas realizaciones, la AM es capaz de unirse específicamente a TLR7 y/o TLR8 humanos.
En algunas realizaciones, la fracción activadora comprende: (a) ARN monocatenario (ssARN), preferiblemente ORN02, ORN06, ssPoly(U), ssARN40, ssARN41, ssARN-DR, o Poly(dT); o (b) un ligando análogo, preferiblemente CL075, CL097, CL264, CL307, Gardiquimod, Loxoribina, Imiquimod, o Resiquimod.
En algunas realizaciones, la fracción activadora comprende un ligando TLR (TLRL), un ligando tipo Nod Receptor, un ligando de recepptortipo RIG-, un ligando CLR, un ligando CDS, o un inductor del inflamasoma.
En algunas realizaciones, la fracción activadora comprende un ligando de uno o más TLR seleccionados del grupo que consiste en: TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8 , TLR7/TLR8, TLR9 y TLR10.
Los TLR son una familia de proteínas que detectan un producto microbiano y/o inician una respuesta inmunitaria adaptativa. Los TLR activan una célula dendrítica (DC). Los TLR son moléculas conservadas de membrana que contienen un ectodominio de repeticiones ricas en leucina, un dominio transmembrana y un dominio intracelular TIR (receptor Toll/interleucina). Los TLR reconocen distintas estructuras en los microbios, a menudo denominadas "PAMP" (patrones moleculares asociados a patógenos). La unión del ligando a los TLR invoca una cascada de vías de señalización intracelular que inducen la producción de factores implicados en la inflamación y la inmunidad.
Los agonistas ejemplares que pueden utilizarse para estos receptores incluyen, sin limitación, lipoproteínas, lipopolipéptidos, peptidoglicanos, zimosán, lipopolisacárido, porinas neiséricas, flageilina, profiilina, galactoceramida, dipéptido muramilo, lípido A giucopiranosil (GLA) y resiquimod (R848). Los peptidoglicanos, las lipoproteínas y los ácidos lipoteicoicos son componentes de la pared celular de los grampositivos. La mayoría de las bacterias expresan lipopolisacáridos. La flageilina es un componente estructural de los flagelos bacterianos secretado por bacterias patógenas y comensales. A La galactosilceramida (a-GalCer) es un activador de las células T asesinas naturales (NKT). El muramil dipéptido es un motivo bioactivo del peptidoglicano común a todas las bacterias. Estos agonistas median en la activación inmunitaria innata a través de los receptores tipo Toll. La unión específica de un agonista a su receptor se expresa a menudo en términos de afinidad. Los ligandos de la presente invención pueden unirse con afinidades de entre aproximadamente 104 M' 1 y aproximadamente 108 M-1. La afinidad se calcula como Kd = kf/kon, ( k f es la constante de velocidad de disociación, Kon es la constante de velocidad de asociación y Kd es la constante de equilibrio). Pueden utilizarse agonistas únicos o múltiples.
En humanos, se han identificado al menos ocho TLR. Los TLR que se expresan en la superficie de las células incluyen TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8 o TLR7/TLR8, TLR9 y TLR10 se expresan con el compartimento ER. Los subconjuntos de células dendríticas humanas pueden identificarse sobre la base de distintos patrones de expresión de TLR. A modo de ejemplo, el subconjunto mieloide o "convencional" de DC (mDC) expresa los TLR 2-8 cuando se estimula, y se produce una cascada de marcadores de activación (por ejemplo, CD80, CD86 , MHC de clase I y II, CCR7), citocinas proinflamatorias y quimiocinas. Una de las consecuencias de esta estimulación y de la expresión resultante es el cebado de las células T CD4+ y CD8 específicas de antígeno. Estas DC adquieren una mayor capacidad para captar antígenos y presentarlos de forma adecuada a las células T. Por el contrario, el subconjunto plasmocitoide de DC (pDC) sólo expresa TLR7 y TLR9 en el momento de la activación, con la consiguiente activación de las células NK, así como de las células T. Sin ceñirnos a ninguna teoría en particular, dado que la muerte de las células tumorales puede afectar negativamente a la función de las CD, se plantea la hipótesis de que la activación de las CD con agonistas TLR es beneficiosa para cebar la inmunidad antitumoral en un enfoque de inmunoterapia para el tratamiento del cáncer. También se ha sugerido que el éxito del tratamiento del cáncer de mama mediante radiación y quimioterapia requiere la activación de TLR4.
Los agonistas TLR conocidos en el arte y útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: Pam3Cys, un agonista de TLR-1/2; productos de los componentes de la pared celular (LAM, LM, LPS, LTA, LTA), un agonista de TLR-2; MALP2, un agonista de TLR-2; Pam2Cys, un agonista de TLR-2; FSL, un agonista de TLR-2; Zymosan, un agonista de TLR-2; PGN, un agonista de TLR-2; ácido polirribosínico ;polirribocítido (Poly I:C), un agonista del TLR-3; ácido poliadenosínico-poliuridílico (poli AU), un agonista del TLR-3; ácido poliinosínico-policidílico estabilizado con poly--L-lisina y carboximetilcelitilosa (Hiltonol©), un agonista del TLR-3; monofosfolípido A (MPL), un agonista del TLR-4; LPS, un agonista TLR-4; flagelina bacteriana, un agonista TLR-5; FLA, un agonista TLR-5; ORN02, un agonista TLR-7/8; ORN06, un agonista TLR-7/8; ssPoly(U), un agonista TLR-7/8; ssRNA40, un agonista TLR-7/8; ssRNA41, un agonista TLR-7/8; ssRNA-DR, un agonista 7/8; Poly(dT), un agonista del TLR-7/8; CL075, un agonista del TLR-7/8; CL097, un agonista del TLR-7/8; CL264, un agonista del TLR-7/8; CL307, un agonista del TLR-7/8; Gardiquimod, un agonista del TLR-7/8; Loxoribina, un agonista del TLR-7/8; Imiquimod, un agonista del TLR-7/8; Resiquimod un agonista del TLR-7/8; yODN1585, un agonista del TLR-9; ODN1668, un agonista del TLR-9; ODN1826, un agonista del TLR-9; ODN2006, un agonista del TLR-9; ODN2007, un agonista del TLR-9; ODN2216, un agonista del TLR-9; ODN2336, un agonista del TLR-9; ODN2395, un agonista del TLR-9; ODN M362 un agonista del TLR-9.
En algunas realizaciones, la fracción activadora comprende:
(i) un ligando de TLR2 seleccionado del grupo que consiste en: (a) un producto de bacterias muertas por calor, preferentemente HKAL, HKEB, HKHP, HKLM, HKLP, HKLR, HKMF, HKPA, HKPG, o HKSA, HKSP, y (b) un producto de componentes de la pared celular, preferentemente LAM, LM, LPS, LTA, LTA, PGN, FSL, Pam2CSK4, Pam3CSK4, o Zymosan;
(ii) un ligando de TLR3 seleccionado del grupo que consiste en: Poly (I:C) y Poly (A:U);
(iii) un ligando de TLR4 seleccionado del grupo que consiste en: LPS y MPLA;
(iv) un ligando de TLR5 seleccionado del grupo que consiste en: FLAy Flagelina;
(v) un ligando de TLR7, TLR 8 , o TLR 7 y TLR, seleccionado del grupo que consiste en: ORN02 (TLR8 ), ORN06 (TLR8 ), ssPoly(U) (TLR8 ), ssRNA40 (TLR8 ), ssRNA41 (TLR8 ), ssRNA-DR (TLR8 ) Poly(dT) (TLR7/8), CL075 (TLR7/8), CL097 (TLR7/8), CL264 (TLR7), CL307 (TLR7), Gardiquimod (TLR7), Loxoribina (TLR7), Imiquimod (TLR7/8) y Resiquimod (TLR7/8);
(vi) un ligando de TLR9 seleccionado del grupo que consiste en: ODN1585, ODN1668, ODN1826, ODN2006, ODN2007, ODN2216, ODN2336, ODN2395 y ODN M362;
(vii) un ligando de TLR10;
(viii) un ligando de dominio de nucleótido-oligomerización (NOD)-similar seleccionado del grupo que consiste en: Agonista NOD1 (C12-iE-DAP , iE-DAP, Tri-DAP), agonista NOD2 (L18-MDP, MDP, M-TriLYS, M-TriLYS-D-ASN, Murabutida, N-Glicolil-MDP), y agonistas NOD1/NOD2 (M-TriDAP, PGN);
(ix) un ligando de uno o más receptores similares a RIG-I (RLR) seleccionado del grupo que consiste en: 5'pppdsRNA, Poly (dA:dT), Poly(dG:dC) y Poly (I:C);
(x) un ligando de uno o más receptores de lectina de tipo C (CLR) seleccionados del grupo que consiste en: Curdlan AL, HKCA, HKSC, WGP, Zymosan y Trehalosa-6 ,6 -dibehenato;
(xi) un ligando de uno o más sensores citosólicos de ADN (CDS) seleccionados del grupo que consiste en: c-GMP, c-G-AMP, c-G-GMP, c-A-AMP, c-di-AMP, c-di-IMP, c-di-GMP, c-di-UMP, HSV-60 , ISD, pCpG , Poly (dA:dT) , Poly(dG:dC), Poly (dA), y VACV-70; y
(xii) un inductor del inflamasoma seleccionado del grupo que consiste en: (a) Complejo proteico del inflamasoma NLRP3, preferentemente Cristales de alumbre, ATP, Cristales de CPPD, Hermozαna, Cristales de MSU, Nano-SiO2, Nigericina, y (b) Complejo proteico del inflamasoma AIM2, preferentemente Poly (dA:dT).
En algunas realizaciones, la fracción activadora comprende IMO2134, IMO205, MGN-1703, MGN-1704, Agatolimod, SD-101, QAX-935, DIMS0150, Pollinex Quattro, OM-174, Eritoran, TAK-242, NI-0101, interferón de tipo I, interferón de tipo II, interferón de tipo III, IL-12, IL-23, IL-18, IL-7 o IL-15. .
En algunas realizaciones, la fracción activadora es capaz de unirse específicamente a TLR7 y/o TLR8 humanos, preferiblemente se une específicamente tanto a TLR7 como a TLR8 , como Resiquimod (R848), por lo que es capaz de activar tanto pDC como mDC. TLR7 y TLR8 están filogenética y estructuralmente relacionados. TLR7 se expresa de forma selectiva en los pDC y los linfocitos B humanos. TLR8 se expresa predominantemente en CDM, monocitos, macrófagos y células mieloides supresoras. Los agonistas específicos de t LR7 activan las DC plasmocitoides (pDC) para que produzcan grandes cantidades de IFN de tipo 1 y expresen altos niveles de moléculas coestimuladoras que promueven la activación de células T, células NK, células B y mDC. Los agonistas específicos de TLR8 activan las CD mieloides, los monocitos, los macrófagos o las células supresoras derivadas de mieloides para que produzcan grandes cantidades de IFN de tipo 1, IL-12 e IL-23, y expresen altos niveles de MHC de clase I, MHC de clase II y moléculas coestimuladoras que promueven la activación de células T CD4 y CD8 específicas de antígenos.
Otras fracciones o moléculas que activan las células inmunitarias humanas a través de TLR pueden identificarse mediante líneas celulares informadoras de TLR, por ejemplo: 293/TLR de InvivoGen.
Pueden identificarse fracciones o moléculas adicionales que pueden activar TLR7 y/o TLR 8 utilizando las células 293/TLR reporteras de InvivoGen, y la capacidad de estos elementos adicionales para estimular los pDC a producir IFN de tipo 1, y para estimular los mDC a producir IFN de tipo 1 e IL-12, así como para regular al alza la expresión de CD80, CD86.
La fracción activadora capaz de activar células NK a través de IFN tipo 1 y moléculas coestimuladoras como el ligando GITR expresado por pDC y/o mDC activadas puede identificarse mediante la proliferación de células NK y la expresión del activador CD69 en un ensayo de células mononucleares de sangre periférica total.
La fracción activadora capaz de activar las células tumorales para que sufran muerte celular y produzcan citoquinas como IFN tipo 1, IL-1a/b, TNF o IL- 6 puede identificarse mediante métodos conocidos en la técnica.
Las moléculas o moléculas activadoras adicionales que son capaces de activar células DC, monocitos, macrófagos, células supresoras mieloides, células B, células n K o células tumorales pueden identificarse utilizando métodos conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, cuando la fracción de direccionamiento comprende un anticuerpo (o un fragmento del mismo), o un aptámero, la fracción activadora no comprende un oligonucleótido CpG.
En algunas realizaciones, especialmente cuando la fracción de direccionamiento comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo, o un aptámero, la fracción activadora no comprende un agente terapéutico, como agentes quimioterapéuticos o toxinas, como toxinas generalmente utilizadas en conjugados anticuerpo-fármaco). Así pues, en general, los compuestos de la presente invención no abarcan los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC), ni los conjugados anticuerpo-CpG.
C. Enlazadores
En general, el compuesto de la invención comprende un enlazador que une la fracción de direccionamiento y la fracción activadora. Sin embargo, en algunos compuestos de la presente divulgación no hay enlazador y la fracción activadora y la fracción de direccionamiento están unidas directamente. El enlazador de la invención se define en las reivindicaciones. A continuación se describen diversos aspectos del enlazador según la presente divulgación
Por "enlazador" se entiende una fracción que conecta una primera molécula a una segunda molécula mediante enlaces químicos. En los enlazadores de la invención, la conexión puede romperse para liberar una forma biológicamente activa de la primera y/o segunda molécula. Un ejemplo preferido de enlazador es una fracción que comprende un enlace que es estable a pH neutro pero que se escinde fácilmente en condiciones de pH bajo. Ejemplos particularmente preferidos de enlazadores son las moléculas que comprenden un enlace que es estable a valores de pH entre 7 y 8 pero que se escinde fácilmente a valores de pH entre 4 y 6. Otro ejemplo de enlazador es una fracción que comprende un enlace que se escinde fácilmente en presencia de una enzima. Ejemplos preferidos de tales enlazadores sensibles a enzimas son péptidos que comprenden una secuencia de reconocimiento para una peptidasa endosomal. Otro ejemplo de enlazador es un enlazador sensible al potencial rédox que es estable en condiciones de bajo potencial de reducción (por ejemplo, baja concentración de tiol o glutatión), pero que se escinde en condiciones de alto potencial de reducción (por ejemplo, alta concentración de tiol o glutatión). Ejemplos preferidos de tales enlazadores sensibles al potencial rédox incluyen disulfuros y sulfenamidas. Entre los ejemplos particularmente preferidos se incluyen los disulfuros de aril-alquilo sustituidos en los que el grupo arilo está sustituido con sustituyentes estéricamente exigentes y que retiran o donan electrones, con el fin de controlar la sensibilidad del enlace disulfuro frente a la reacción con el tiol. Otro ejemplo de enlazador es una fracción que comprende un enlace que se rompe fácilmente al exponerse a la radiación. Ejemplos preferidos de tales enlazadores sensibles a la radiación son los éteres de 2-nitrobencil que se escinden al exponerse a la luz. Ejemplos particularmente preferidos de enlazadores son las moléculas que enmascaran la actividad biológica de una de las dos moléculas enlazadas hasta que se rompe el enlace.
En algunas realizaciones, el compuesto de la invención comprende un enlazador que se selecciona del grupo que consiste en un grupo hidrazina, un polipéptido, un grupo disulfuro y un grupo tioéter.
Por "grupo hidracina" o "enlazador hidracina" o "enlazador hidracina autociclizante" se entiende una fracción de enlazador que, al cambiar las condiciones, como un cambio de pH, experimenta una reacción de ciclización y forma uno o más anillos. La fracción de hidracina se convierte en hidrazona cuando se une. Esta unión puede producirse, por ejemplo, mediante una reacción con un grupo cetona en la fracción L4. Por lo tanto, el término enlazador hidrazina también se puede utilizar para describir el enlazador de la presente invención debido a esta conversión a una hidrazona tras la unión.
Por "enlazador de hidracina de cinco miembros" o "enlazador de hidracina de 5 miembros" se entienden aquí las moléculas que contienen hidracina y que, al cambiar las condiciones, como un cambio de pH, sufren una reacción de ciclización y forman uno o más anillos de 5 miembros. Alternativamente, este enlazador de cinco miembros puede describirse de manera similar como un enlazador de hidrazina de cinco miembros o un enlazador de hidrazina de 5 miembros.
Por "enlazador de hidracina de seis miembros" o "enlazador de hidracina de 6 miembros" se entienden aquí las moléculas que contienen hidracina y que, tras un cambio en las condiciones, como un cambio en el pH, experimentarán una reacción de ciclización y formarán uno o más anillos de 6 miembros. Este enlazador de seis miembros puede describirse de forma similar como un enlazador de hidracina de seis miembros o un enlazador de hidracina de 6 miembros.
Por "reacción de ciclización" se entiende aquí la ciclización de un enlazador péptido, hidrazina o disulfuro, indica la ciclización de ese enlazador en un anillo e inicia la separación del complejo fármaco-ligando. Esta tasa puede medirse ex situ, y se completa cuando se forma al menos el 90 %, 95 % o 100 % del producto.
En algunas realizaciones, el compuesto de la presente invención comprende una región enlazadora entre la fracción de direccionamiento y la fracción activadora, y el enlazador es escindible por un agente escindente que está presente en el entorno intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma o endosoma o caveola). El enlazador puede ser, por ejemplo, un enlazador peptidílico que es escindido por una enzima peptidasa o proteasa intracelular, incluyendo, pero sin limitarse a, una proteasa lisosomal o endosomal. Típicamente, el peptidil enlazadortiene al menos dos aminoácidos de longitud o al menos tres aminoácidos de longitud. Los agentes de corte pueden incluir las catepsinas B y D y la plasmina, todos los cuales se sabe que hidrolizan los derivados dipéptidos del fármaco, lo que da lugar a la liberación del fármaco activo en el interior de las células diana (véase, por ejemplo, Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Los más típicos son los enlaces peptídicos que pueden ser escindidos por enzimas presentes en las células o tejidos diana. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazador peptidílico que sea escindible por la proteasa dependiente de tiol catepsina-B, que se expresa altamente en el tejido canceroso (por ejemplo, un enlazador Phe-Leu o un enlazador Gly--Phe-Leu-Gly). Otros enlazadores de este tipo se describen, por ejemplo, en U.S. Pat. N° 6.214.345. En algunas realizaciones, el enlazador peptidilo escindible por una proteasa intracelular es un enlazador Val-Cit o un enlazador Phe-Lys (véase, por ejemplo, Pat. N° 6.214.345 que describe la síntesis de doxorrubicina con el enlazador val-cit). Una ventaja de utilizar la liberación proteolítica intracelular del agente terapéutico es que el agente se atenúa típicamente cuando se conjuga y las estabilidades séricas de los conjugados son típicamente altas.
En algunas realizaciones, el enlazador escindible es sensible al pH, es decir, sensible a la hidrólisis a ciertos valores de pH. Típicamente, el enlazador sensible al pH es hidrolizable en condiciones ácidas. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazador lábil en ácido que sea hidrolizable en el lisosoma (p. ej., una hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal o similar). (Véase, por ejemplo U.S. Pat. Nos. 5.122.368; 5,824,805; 5,622,929; Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem.
264: 14653-14661.) Dichos enlazadores son relativamente estables en condiciones de pH neutro, como las de la sangre, pero son inestables por debajo de pH 5,5 o 5,0, el pH aproximado del lisosoma. En ciertas realizaciones, el enlazador hidrolizable es un enlazador tioéter (tal como, por ejemplo, un tioéter unido al agente terapéutico mediante un enlace de acilhidrazona (véase, por ejemplo, Pat. N° 5.622.929)).
En otras realizaciones, el enlazadores escindible en condiciones reductoras (por ejemplo, un enlazador disulfuro). Se conocen en la técnica diversos enlazadores disulfuro, incluidos, por ejemplo, los que pueden formarse utilizando SATA (N-succinimidil-5-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato) y SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)tolueno), SPDB y SMPT (Véase, p. ej.g., Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Véase también Pat. estadounidense N° 4.880.935.)
En otras realizaciones específicas, el enlazador es un enlazador malonato (Johnson et al., 1995, Anticancer Res.
15:1387-93), un enlazador maleimidobenzoilo (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10): 1299-1304), o un análogo 3'-N-amida (Lau et al., 1995,Bioorg-Med-Chem. 3(10): 1305-12).
Típicamente, el enlazador no es sustancialmente sensible al ambiente extracelular. Tal como se utiliza en el presente documento, "no sustancialmente sensible al entorno extracelular", en el contexto de un enlazador, significa que no más de aproximadamente el 20 %, típicamente no más de aproximadamente el 15 %, más típicamente no más de aproximadamente el 10 %, e incluso más típicamente no más de aproximadamente el 5 %, no más de aproximadamente el 3 %, o no más de aproximadamente el 1 % de los enlazadores, en una muestra de compuestos de la presente invención, se escinden cuando los compuestos de la invención presentes en un entorno extracelular (por ejemplo, en plasma). Si un enlazador no es sustancialmente sensible al entorno extracelular puede determinarse, por ejemplo, incubando independientemente con plasma (a) el compuesto de la invención (la "muestra de compuesto") y (b) una cantidad molar igual de anticuerpo o agente terapéutico no conjugado (la "muestra de control") durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, 2, 4, 8 , 16, o 24 horas) y luego comparar la cantidad de anticuerpo no conjugado o agente terapéutico presente en la muestra de compuesto con la presente en la muestra de control, medida, por ejemplo, por cromatografía líquida de alta resolución.
En otras realizaciones no mutuamente excluyentes, el enlazador promueve la internalización celular. En ciertas realizaciones, el enlazador promueve la internalización celular cuando se conjuga con la fracción activadora. En otras realizaciones, el enlazador promueve la internalización celular cuando se conjuga tanto con la fracción de direccionamiento como con la fracción activadora.
Una variedad de enlazadores que pueden utilizarse con las presentes composiciones y métodos se describen en WO 2004010957 titulado "Conjugados de fármacos y su uso para tratar el cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa", US20141509A1y US20120288512A1.
En ciertas realizaciones, la unidad de enlace tiene la siguiente fórmula general:
-Ta-Ww-Yy-
donde -T- es una unidad extensora; a es 0 o 1; cada -W- es independientemente una unidad de aminoácido; w es independientemente un número entero comprendido entre 2 y 12; -Y- es una unidad espaciadora; e y es 0, 1 o 2.
La Unidad extensora
La unidad extensora (-T-), cuando está presente, une la fracción de direccionamiento a una unidad de aminoácido (-W-). Los grupos funcionales útiles que pueden estar presentes en una fracción de direccionamiento, como un anticuerpo, de forma natural o mediante manipulación química incluyen, entre otros, sulfhidrilo, amino, hidroxilo, el grupo hidroxilo anomérico de un carbohidrato y carboxilo. Los grupos funcionales adecuados son el sulfhidrilo y el amino. Los grupos sulfhidrilo pueden generarse por reducción de los enlaces disulfuro intramoleculares de un anticuerpo. Alternativamente, los grupos sulfhidrilo pueden generarse por reacción de un grupo amino de una fracción de lisina de un anticuerpo con 2-imotiolano (reactivo de Traut) u otros reactivos generadores de sulfhidrilo. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante y está diseñado para llevar una o más lisinas. En otras realizaciones, el anticuerpo recombinante está diseñado para llevar grupos sulfhidrilos adicionales, por ejemplo, cisteínas adicionales.
En algunas realizaciones, la unidad extensora forma un enlace con un átomo de azufre del anticuerpo. El átomo de azufre puede derivarse de un grupo sulfhidrilo (-SH) de un anticuerpo reducido (A). Las unidades extensoras representativas de estas realizaciones se representan dentro de los corchetes de las fórmulas (IIa) y (IIb), en las que A-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se han definido anteriormente y R1 se selecciona entre -C i-C i0 alquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -O-(C1-C8 alquilo)-, -arileno-, -C1-C10 alquileno-arileno-, -arileno-C 1-C10 alquileno-, -C 1-C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-C1-C10alquileno-, -C3-C8 heterociclo-, -C1 -C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo)-, -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno-, -(CH2CH2O)r-, y -(CH2CH2O)r-CH2-; y r es un número entero comprendido entre 1 - 10.
Figure imgf000028_0001
Una unidad extensora ilustrativa es la de fórmula (IIa) donde R1 es -(CH2)5-:
Figure imgf000028_0002
Otra unidad extensora ilustrativa es la de fórmula (IIa) donde R1 es -(CH2CH2O)r-CH2-y r es 2:
Figure imgf000028_0003
Otra unidad extensora ilustrativa es la de fórmula (IIb) en la que R1 es -(CH2)5-:
Figure imgf000028_0004
En algunas otras realizaciones específicas, la unidad extensora está unida a la unidad de anticuerpo (A) a través de un enlace disulfuro entre un átomo de azufre de la unidad de anticuerpo y un átomo de azufre de la unidad extensora. Una unidad extensora representativa de esta realización se representa entre los corchetes de la Fórmula (III), en la que R1, A-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se han definido anteriormente.
A-[S-RI-C(O)}W „-Yy-D (III)
En otras realizaciones específicas, el grupo reactivo del extensor contiene un sitio reactivo que puede ser reactivo a un grupo amino de un anticuerpo. El grupo amino puede ser el de una arginina o una lisina. Los sitios reactivos de amina adecuados incluyen, entre otros, ésteres activados como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo, anhídridos, cloruros ácidos, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos. Las unidades extensoras representativas de estas realizaciones se representan dentro de los corchetes de las fórmulas (IVa) y (IVb), en las que R1, A-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se han definido anteriormente;
Figure imgf000029_0001
En otro aspecto más, la función reactiva del extensor contiene un sitio reactivo que es reactivo a un grupo carbohidrato modificado que puede estar presente en un anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo se glicosila enzimáticamente para proporcionar una fracción de carbohidrato. El carbohidrato puede oxidarse ligeramente con un reactivo como periodato sódico y la unidad carbonilo resultante del carbohidrato oxidado puede condensarse con un estirador que contenga una funcionalidad como una hidrazida, una oxima, una amina reactiva, una hidrazina, una tiosemicarbazida, un carboxilato de hidrazina y una arilhidrazida como las descritas por Kaneko et al., 1991, Bioconjugate Chem 2:133-41. Las unidades extensoras representativas de esta realización se representan dentro de los corchetes de las fórmulas (Va)-(IVc), en las que R1, A-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se han definido anteriormente.
Figure imgf000029_0002
La unidad de aminoácidos
La unidad de aminoácidos (-W-) une la unidad extensora (-T-) a la unidad espaciadora (-Y-) si la unidad espaciadora está presente, y une la unidad extensora al agente citotóxico o citostático (Moiety Activating; D) si la unidad espaciadora está ausente. -Ww- es una unidad de dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido o dodecapéptido. Cada unidad -W tiene independientemente la fórmula indicada a continuación entre corchetes, y w es un número entero comprendido entre 2 y 12:
Figure imgf000029_0003
donde R2 es hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, bencilo, p-hidroxibencilo, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3 , -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2 , - CH2CH2COOH, -(CH2)3 NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3 NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-, fenilo, ciclohexilo,
Figure imgf000029_0004
Figure imgf000030_0002
La unidad de aminoácidos de la unidad de enlace puede ser escindida enzimáticamente por una enzima incluyendo, pero no limitada a, una proteasa asociada a tumor para liberar la fracción activadora (-D) que es protonada in vivo al ser liberada para proporcionar una molécula activadora (D).
Las unidades Ww ilustrativas están representadas por las fórmulas (VI)-(VIII):
Figure imgf000030_0001
donde R3 y R4 son como sigue:
Figure imgf000030_0003
Figure imgf000031_0001
donde R3, R4 y R5 son como sigue:
Figure imgf000031_0004
Figure imgf000031_0002
en el que R3,R4,R5 y R6 son como sigue:
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Las unidades de aminoácidos adecuadas incluyen, pero no se limitan a, unidades de fórmula (VI) donde: R3 es bencilo y R4 es -(CH2)4NH2 ;R3 es isopropilo y R4 es -(CH2)4NH2; oR3 es isopropilo y R4 es-(CH2)3NHCONH2. Otra unidad de aminoácido adecuada es una unidad de fórmula (Vii), donde: R3 es bencilo, R4 es bencilo y R5 es -(CH2)4NH2. Las unidades -Ww pueden diseñarse y optimizarse en su selectividad para la escisión enzimática por una proteasa particular asociada a un tumor. Las unidades -Ww- adecuadas son aquellas cuya escisión es catalizada por las proteasas, catepsina B, C y D, y plasmina.
En algunas realizaciones, -Ww- es una unidad dipéptida, tripéptida o tetrapéptida.
Cuando R2, R3, R4, R5 o R6 es distinto de hidrógeno, el átomo de carbono al que está unido R2, R3, R4, R5 o R6 es quiral. Cada átomo de carbono al que está unido R2, R3, R4, R5 o R6 está independientemente en la configuración (S) o (R).
En algunas realizaciones, la unidad de aminoácido es un dipéptido de fenilalanina-lisina (enlace Phe-Lys o FK). En algunas realizaciones, la unidad de aminoácidos es un dipéptido de valina-citrulina (Val-Cit o VC linker). En algunas realizaciones, la unidad de aminoácido es ácido 5-aminovalérico, homo fenilalanina lisina, tetraisoquinolinecarboxilato lisina, ciclohexilalanina lisina, ácido isonepecótico lisina, beta-alanina lisina, glicina serina valina glutamina, o ácido isonepecótico.
La unidad de aminoácidos puede comprender aminoácidos naturales. En otras realizaciones, la unidad de aminoácidos puede comprender aminoácidos no naturales.
La unidad espaciadora
La unidad espaciadora (-Y-), cuando está presente, une una unidad de aminoácido a la unidad de fármaco. Las unidades espaciadoras son de dos tipos generales: autoinmolables y no autoinmolables. Una unidad espaciadora no autoinmolante es aquella en la que parte o la totalidad de la unidad espaciadora permanece unida a la unidad de fracción activadora tras la escisión enzimática de una unidad de aminoácido del conjugado TM-enlazador-AM o del compuesto enlazadorde fármacos. Ejemplos de una unidad espaciadora no autoinmolante incluyen, pero no se limitan a una unidad espaciadora (glicina-glicina) y una unidad espaciadora de glicina. Cuando un conjugado TM-enlazador-AM que contiene una unidad espaciadora de glicina-glicina o una unidad espaciadora de glicina se somete a escisión enzimática a través de una proteasa asociada a células tumorales, una proteasa asociada a células cancerosas o una proteasa asociada a linfocitos, una fracción de glicina-glicina-fármaco o una fracción de glicina-fármaco se escinde de A-T-Ww-. Para liberar la AM, debe producirse una reacción de hidrólisis independiente dentro de la célula diana para escindir el enlace de la unidad glicina-fármaco.
En una realización típica, -Yy- es un éter p-aminobencílico que puede sustituirse con Qm donde Q es _Ci_C8 alquilo, -C1-C8alcoxi, -halógeno, -nitro o -ciano; y m es un número entero comprendido entre 0-4.
En algunas realizaciones, una unidad espadadora no autoimolativa (-Y-) es -Gly-Gly-.
En algunas realizaciones, una unidad espadadora no autoinmolante (-Y-) es -Gly-.
En una realización, el compuesto enlazadorAM o un conjugado enlazador-AM TM carece de una unidad espaciadora (y=0 ).
Alternativamente, un conjugado TM-enlazador-AM que contenga una unidad espaciadora autoimolativa puede liberar la AM (D) sin necesidad de un paso de hidrólisis separado. En estas realizaciones, -Y- es una unidad de alcohol paminobencílico (PAB) que está unida a -Ww- a través del átomo de nitrógeno del grupo PAB, y conectada directamente a -D a través de un grupo carbonato, carbamato o éter.
Otros ejemplos de espaciadores autoinmolativos incluyen, pero no se limitan a, compuestos aromáticos que son electrónicamente equivalentes al grupo PAB tales como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (véase Hay et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett.9:2237 por ejemplo) y orto o paraaminobencilacetales. Pueden utilizarse espaciadores que sufran una ciclización fácil tras la hidrólisis del enlace amida, como las amidas sustituidas y no sustituidas del ácido 4-aminobutírico (Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2:223), sistemas de anillos biciclo[2.2.1] y biciclo[2.2.2] adecuadamente sustituidos (Storm et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) y amidas del ácido 2-aminofenilpropiónico (Amsberry et al., 1990, J. Org. Química. 55:5867) Eliminación de fármacos que contienen aminas sustituidas en la posición a de la glicina (Kingsbury, et al., 1984, J. Med. Chem. 27: 1447) son también ejemplos de estrategias espaciadoras autoinmolantes que pueden aplicarse a los conjugados TM-enlazador-AM.
En una realización alternativa, la unidad espaciadora es una unidad de bis(hidroximetil)estireno (BHMS) ramificada, que puede utilizarse para incorporar elementos.
Las unidades espaciadoras típicas (-Yy-) están representadas por las fórmulas (IX)-(XI):
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donde Q es alquilo Ci-Cs, alcoxiC1-C8 , halógeno, nitro o ciano; y m es un número entero comprendido entre 0-4;
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En algunas realizaciones, el enlazador es escindible enzimáticamente. En algunas realizaciones, el enlazador no es escindible enzimáticamente.
III. Formulaciones farmacéuticas y administración
La presente invención se refiere además a una formulación farmacéutica que comprende un compuesto de la invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables.
Los compuestos aquí descritos, incluidos los portadores farmacéuticamente aceptables como sales de adición o hidratos de los mismos, pueden administrarse a un paciente utilizando una amplia variedad de rutas o modos de administración. Las vías de administración adecuadas incluyen, entre otras, la inhalación, la administración transdérmica, oral, rectal, transmucosa, intestinal y parenteral, incluidas las inyecciones intramusculares, subcutáneas e intravenosas. Preferiblemente, los compuestos de la invención que comprenden un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como la fracción de direccionamiento se administran por vía parenteral, más preferiblemente por vía intravenosa.
Tal como se utilizan aquí, los términos "administrar" o "administración" pretenden abarcar todos los medios para entregar directa e indirectamente un compuesto a su sitio de acción previsto.
Los compuestos aquí descritos, o sales farmacéuticamente aceptables y/o hidratos de los mismos, pueden administrarse solos, en combinación con otros compuestos de la invención, y/o en cócteles combinados con otros agentes terapéuticos. Por supuesto, la elección de los agentes terapéuticos que pueden coadministrarse con los compuestos de la invención dependerá, en parte, de la afección que se esté tratando.
Por ejemplo, cuando se administran a pacientes que padecen un estado de enfermedad causado por un organismo que depende de un autoinductor, los compuestos de la invención pueden administrarse en cócteles que contienen agentes utilizados para tratar el dolor, la infección y otros síntomas y efectos secundarios comúnmente asociados con la enfermedad. Dichos agentes incluyen, por ejemplo, analgésicos, antibióticos, etc.
Cuando se administran a un paciente sometido a tratamiento contra el cáncer, los compuestos pueden administrarse en cócteles que contengan agentes anticancerígenos y/o agentes potenciadores suplementarios. Los compuestos también pueden administrarse en cócteles que contengan agentes que traten los efectos secundarios de la radioterapia, como antieméticos, protectores de la radiación, etc.
Los agentes potenciadores suplementarios que pueden coadministrarse con los compuestos de la invención incluyen, por ejemplo, fármacos antidepresivos tricíclicos (por ejemplo, imipramina, desipramina, amitriptilina, clomipramina, trimipramina, doxepina, nortriptilina, protriptilina, amoxapina y maprotilina); fármacos no tricíclicos y antidepresivos (por ejemplo, sertralina, trazodona y citalopram); antagonistas del Ca+2 (por ejemplo, verapamilo, nifedipino, nitrendipino y caroverina); anfotericina; análogos del triparanol (por ejemplo, tamoxifeno); antiarrítmicos (por ejemplo, quinidina); antihipertensivos (por ejemplo, reserpina); depletores de tioles (por ejemplo, butionina y sulfoximina); y leucovorina cálcica.
El (los) compuesto(s) activo(s) de la invención se administra(n) per se o en forma de una composición farmacéutica en la que el (los) compuesto(s) activo(s) está(n) en mezcla con uno o más portadores, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la presente invención se formulan típicamente de manera convencional utilizando uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que, pueden utilizarse farmacéuticamente. La formulación adecuada depende de la vía de administración elegida.
Para la administración transmucosa, se utilizan en la formulación penetrantes adecuados a la barrera que se desea permeabilizar. Tales penetrantes son generalmente conocidos en el arte.
Para la administración oral, los compuestos pueden formularse fácilmente combinando el (los) compuesto(s) activo(s) con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en el arte. Dichos portadores permiten formular los compuestos de la invención en forma de comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas y suspensiones para su ingestión oral por el paciente a tratar. Preparaciones farmacéuticas para su uso oral se pueden obtener excipiente sólido, opcionalmente moler una mezcla resultante, y el procesamiento de la mezcla de gránulos, después de añadir auxiliares adecuados, si se desea para obtener comprimidos o núcleos dragee. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparados de celulosa como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboxinietilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes desintegradores, como la polivinilpirrolidona reticulada, el agar o el ácido algínico o una sal del mismo, como el alginato sódico.
Los núcleos de grageas están provistos de revestimientos adecuados. Para ello, pueden utilizarse soluciones concentradas de azúcar, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes adecuados. Pueden añadirse colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de grageas para su identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos.
Las preparaciones farmacéuticas, que pueden utilizarse por vía oral, incluyen cápsulas a presión hechas de gelatina, así como cápsulas blandas y selladas hechas de gelatina y un plastificante, como glicerol o sorbitol. Las cápsulas autoadhesivas pueden contener los principios activos mezclados con cargas como lactosa, aglutinantes como almidón y/o lubricantes como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden añadirse estabilizantes. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosis adecuadas para dicha administración.
Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o pastillas formuladas de manera convencional.
Para la administración por inhalación, los compuestos para su uso según la presente invención se suministran convenientemente en forma de una presentación en aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad dosificada. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador pueden formularse conteniendo una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada, como lactosa o almidón.
Los compuestos pueden formularse para administración parenteral por inyección, por ejemplo, por inyección en bolo o infusión continua. La inyección es un procedimiento preferido de administración para las composiciones de la presente invención. Las formulaciones inyectables pueden presentarse en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes formuladores tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión, como la polivinilpirrolidona reticulada, el agar o el ácido algínico o una sal del mismo como el alginato sódico.
Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma hidrosoluble. Además, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones oleosas de inyección apropiadas. Entre los disolventes o vehículos lipofílicos adecuados se encuentran los aceites grasos, como el aceite de sésamo, o los ésteres sintéticos de ácidos grasos, como el oleato de etilo o los triglicéridos, o los liposomas. Las suspensiones acuosas inyectables pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, como la carboximetilcelulosa sódica, el sorbitol o el dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores o agentes adecuados, que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Para la inyección, los agentes de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles, como la solución de Hanks, la solución de Ringer o el tampón salino fisiológico.
Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.
Los compuestos también pueden formularse en composiciones rectales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contengan bases convencionales para supositorios como manteca de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones descritas anteriormente, los compuestos también pueden formularse como una preparación de depósito. Estas formulaciones de acción prolongada pueden administrarse mediante implantación o administración transcutánea (por ejemplo, subcutánea o intramuscular), inyección intramuscular o parche transdérmico. Así, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble.
Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender portadores o excipientes adecuados en fase sólida o gel. Ejemplos de tales portadores o excipientes incluyen carbonato cálcico, fosfato cálcico, diversos azúcares, almidones, derivados de la celulosa, gelatina y polímeros como polietilenglicoles.
Una composición farmacéutica preferida es una composición formulada para inyección tal como inyección intravenosa e incluye aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 100 % en peso del compuesto de la presente invención, basado en 100 % en peso de la composición farmacéutica total. El conjugado fármaco-ligando puede ser un conjugado anticuerpo-citotoxina en el que el anticuerpo se ha seleccionado para apintar a un cáncer concreto.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica de la presente invención comprende además un segundo agente quimioterapéutico.
Por "agente quimioterapéutico" se entiende un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Algunos ejemplos son Gemcitabina, irinotecán, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, arabinósido de citosina ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, busulfán, citoxina, TAXOL, metotrexato, cisplatino, melfalán, vinblastina y carboplatino.
En algunas realizaciones, el segundo agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en tamoxifeno, raloxifeno, anastrozol, exemestano, letrozol, imatanib, paclitaxel, ciclofosfamida, lovastatina, minosina, gemcitabina, citarabina, 5- fluorouracilo, metotrexato, docetaxel, goserelina, vincristina, vinblastina, nocodazol, tenipósido etopósido, gemcitabina, epothilona, vinorelbina, camptotecina, daunorrubicina, actinomicina D, mitoxantrona, acridina, doxorrubicina, epirrubicina o idarrubicina.
IV. Kits
En otro aspecto, la presente invención proporciona kits que contienen uno o más de los compuestos o composiciones de la invención e instrucciones para usar el compuesto o composición. En una realización ejemplar, la invención proporciona un kit para conjugar un brazo enlazador de la invención con otra molécula. El kit incluye el enlazador y las instrucciones para unir el enlazador a un grupo funcional concreto. El kit también puede incluir uno o más de un fármaco citotóxico, un agente diana, una etiqueta detectable, sales farmacéuticas o tampones. El kit también puede incluir un recipiente y, opcionalmente, uno o más viales, tubos de ensayo, matraces, botellas o jeringuillas. Otros formatos de kits serán evidentes para los expertos en la materia.
V. Uso médico
La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento del cáncer.
Además de las composiciones y constructos descritos anteriormente, la presente invención también proporciona una serie de usos médicos de los compuestos de la invención. Los compuestos de la invención actual son para su uso en matar o inhibir el crecimiento o replicación de una célula tumoral o célula cancerosa, tratar el cáncer, tratar una condición precancerosa, prevenir la multiplicación de una célula tumoral o célula cancerosa, prevenir el cáncer, prevenir la multiplicación de una célula que expresa un anticuerpo autoinmune.
El compuesto de la invención actual es útil para tratar enfermedades como el cáncer en un animal, como un ser humano. Se proporcionan composiciones y usos para tratar tumores proporcionando a un sujeto la composición de una manera farmacéuticamente aceptable, con una cantidad farmacéuticamente eficaz de una composición de la presente invención.
Por "cáncer" se entiende la condición patológica en humanos que se caracteriza por una proliferación celular no regulada. Algunos ejemplos son: carcinoma, linfoma, blastoma y leucemia. Ejemplos más particulares de cánceres incluyen pero no se limitan a: pulmón (células pequeñas y células no pequeñas), mama, próstata, carcinoide, vejiga, gástrico, pancreático, hígado (hepatocelular), hepatoblastoma, colorrectal, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, esofágico, ovárico, cervical, endometrial, mesotelioma, melanoma, sarcoma, osteosarcoma, liposarcoma, tiroides, desmoides, leucemia mielocítica crónica (LMA) y leucemia mielocítica crónica (LMC).
Por "inhibir", "tratar" o "tratamiento" se entienden aquí la reducción, el tratamiento terapéutico y el tratamiento profiláctico o preventivo, en los que el objetivo es reducir o prevenir el trastorno o la afección patológica pretendida. En un ejemplo, tras la administración de un compuesto de la presente invención, un paciente con cáncer puede experimentar una reducción del tamaño del tumor. "Tratamiento" o "tratar" incluye (1) inhibir una enfermedad en un sujeto que experimenta o muestra la patología o los síntomas de la enfermedad, (2) mejorar una enfermedad en un sujeto que experimenta o muestra la patología o los síntomas de la enfermedad, y/o (3) afectar a cualquier disminución medible de una enfermedad en un sujeto o paciente que experimenta o muestra la patología o los síntomas de la enfermedad. En la medida en que un compuesto de la presente invención puede impedir el crecimiento y/o matar células cancerosas, puede ser citostático y/o citotóxico.
Por "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende aquí una cantidad de un compuesto proporcionado aquí eficaz para "tratar" un trastorno en un sujeto o mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas, reducir el tamaño del tumor, inhibir la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos, inhibir la metástasis tumoral, inhibir en cierta medida el crecimiento tumoral y/o aliviar en cierta medida uno o varios de los síntomas asociados al cáncer.
La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "combinación farmacéutica" se refiere a un producto obtenido a partir de la mezcla o combinación de principios activos, e incluye tanto combinaciones fijas como no fijas de los principios activos. El término "combinación fija" significa que los principios activos, por ejemplo, un compuesto de Fórmula (1) y un coagente, se administran simultáneamente a un paciente en forma de una única entidad o dosis. El término "combinación no fija" significa que los ingredientes activos, por ejemplo, un compuesto de Fórmula (1) y un coagente, se administran a un paciente como entidades separadas, ya sea simultánea, concurrente o secuencialmente sin límites de tiempo específicos, en los que dicha administración proporciona niveles terapéuticamente eficaces de los ingredientes activos en el cuerpo del paciente. Esto último también se aplica a la terapia de cóctel, por ejemplo, la administración de tres o más principios activos.
En algunas realizaciones, la condición de enfermedad es un tumor.
En algunas realizaciones, la condición de enfermedad comprende proliferación celular anormal, tal como una lesión precancerosa.
La presente invención es particularmente útil para el tratamiento del cáncer y para la inhibición de la multiplicación de una célula tumoral o cancerosa en un animal. El cáncer, o una afección precancerosa, incluye un tumor, metástasis, o cualquier enfermedad o trastorno caracterizado por un crecimiento celular incontrolado, puede tratarse o prevenirse mediante la administración del complejo fármaco-ligando de la presente invención. El compuesto administra la fracción activadora a una célula tumoral o cancerosa. En algunas realizaciones, la fracción de direccionamiento se une o asocia específicamente a una célula cancerosa o a un antígeno asociado a una célula tumoral. Debido a su proximidad con el ligando, tras ser internalizada, la fracción activadora puede ser absorbida por el interior de una célula tumoral o cancerosa mediante, por ejemplo, endocitosis mediada por receptor. El antígeno puede estar unido a una célula tumoral o cancerosa o puede ser una proteína de la matriz extracelular asociada a la célula tumoral o cancerosa. Una vez dentro de la célula, el enlazador es escindido hidrolítica o enzimáticamente por una proteasa asociada a la célula tumoral o a la célula cancerosa, liberando así la fracción activadora. La fracción activadora liberada queda entonces libre para difundirse e inducir o potenciar la actividad inmunitaria de las células inmunitarias o tumorales. En una realización alternativa, la fracción activadora se escinde del compuesto del microambiente tumoral, y el fármaco penetra posteriormente en la célula.
Ejemplos representativos de condiciones precancerosas que pueden ser atacadas por los compuestos de la presente invención, incluyen: metaplasia, hiperplasia, displasia, pólipos colorrectales, cetatosis actínica, queilitis actínica, virus del papiloma humano, leucoplasia, liquen plano y enfermedad de Bowen.
Ejemplos representativos de cánceres o tumores a los que pueden dirigirse los compuestos de la presente invención incluyen: cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de próstata, linfoma, melanoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer testicular, cáncer del SNC, cáncer renal, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer de estómago, cáncer oral, cáncer nasal, cáncer cervical y leucemia. Es evidente para el experto en la materia que la fracción de direccionamiento utilizada en el compuesto puede elegirse de forma que dirija la fracción activadora al tejido tumoral que se va a tratar con el fármaco (es decir, se elige un agente de direccionamiento específico para un antígeno específico del tumor). Los ejemplos de estas fracciones de direccionamiento son bien conocidos en la técnica, y entre ellos se incluyen los anti-Her2 para el tratamiento del cáncer de mama, los anti-CD20 para el tratamiento del linfoma, los anti-PSMA para el tratamiento del cáncer de próstata y los anti-CD30 para el tratamiento de los linfomas, incluido el linfoma no Hodgkin.
En algunas realizaciones, la proliferación anormal es de células cancerosas.
En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer colorrectal, linfoma difuso de células B grandes, cáncer de endometrio, linfoma folicular, cáncer gástrico, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, cáncer de pulmón, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y carcinoma de células renales.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un compuesto para su uso en matar una célula. El compuesto se administra a la célula en una cantidad suficiente para matar dicha célula. En una realización ejemplar, el compuesto se administra a un sujeto portador de la célula. En otra realización ejemplar, la administración sirve para retrasar o detener el crecimiento de un tumor que incluye la célula (por ejemplo, la célula puede ser una célula tumoral). Para que la administración retrase el crecimiento, la tasa de crecimiento de la célula debe ser al menos un 10 % inferior a la tasa de crecimiento antes de la administración. Preferiblemente, la tasa de crecimiento se retrasará al menos un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o se detendrá por completo.
Dosificaciones eficaces
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso con la presente invención incluyen composiciones en las que el ingrediente activo está contenido en una cantidad terapéuticamente eficaz, es decir, en una cantidad eficaz para lograr su propósito previsto. La cantidad real eficaz para una aplicación concreta dependerá, entre otras cosas, de la afección tratada. La determinación de una cantidad eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la materia, especialmente a la luz de la divulgación detallada en el presente documento.
Para cualquier compuesto descrito en el presente documento, la cantidad terapéuticamente eficaz puede determinarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Las concentraciones plasmáticas diana serán aquellas concentraciones de compuesto(s) activo(s) que sean capaces de inhibir el crecimiento o la división celular. En realizaciones preferidas, la actividad celular se inhibe al menos en un 25 %. Se prefieren concentraciones plasmáticas diana de compuesto(s) activo(s) que sean capaces de inducir una inhibición de la actividad celular de al menos un 30 %, 50 %, 75 % o incluso un 90 % o superior. El porcentaje de inhibición de la actividad celular en el paciente puede controlarse para evaluar la idoneidad de la concentración plasmática de fármaco alcanzada, y la dosis puede ajustarse al alza o a la baja para lograr el porcentaje de inhibición deseado.
Como es bien sabido en la técnica, las cantidades terapéuticamente eficaces para su uso en seres humanos también pueden determinarse a partir de modelos animales. Por ejemplo, una dosis para humanos puede formularse para alcanzar una concentración circulante que se haya demostrado eficaz en animales. La dosis en humanos puede ajustarse monitorizando la inhibición celular y ajustando la dosis al alza o a la baja, como se ha descrito anteriormente.
También se puede determinar una dosis terapéuticamente eficaz a partir de datos humanos para compuestos que se sabe que presentan actividades farmacológicas similares. La dosis aplicada puede ajustarse en función de la biodisponibilidad y potencia relativas del compuesto administrado en comparación con el compuesto conocido.
El ajuste de la dosis para lograr la máxima eficacia en humanos está dentro de las capacidades del artesano normalmente experto.
En el caso de administración local, la concentración circulante sistémica del compuesto administrado no será de particular importancia. En tales casos, el compuesto se administra de forma que se alcance una concentración en el área local eficaz para lograr el resultado previsto.
Para la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades relacionadas con la proliferación celular anormal, se prefiere una concentración circulante del compuesto administrado de aproximadamente 0,001 j M a 20 j M, siendo preferible de aproximadamente 0,01 j M a 5 j M.
Las dosis para pacientes para la administración oral de los compuestos descritos aquí, típicamente varían de aproximadamente 1 mg/día a aproximadamente 10,000 mg/día, más típicamente de aproximadamente 10 mg/día a aproximadamente 1,000 mg/día, y más típicamente de aproximadamente 50 mg/día a aproximadamente 500 mg/día. En términos de peso corporal del paciente, las dosis típicas oscilan entre 0,01 y 150 mg/kg/día, más típicamente entre 0,1 y 15 mg/kg/día, y más típicamente entre 1 y 10 mg/kg/día, por ejemplo 5 mg/kg/día o 3 mg/kg/día.
En al menos algunas realizaciones, las dosis para pacientes que retardan o inhiben el crecimiento tumoral pueden ser de 1 jmol/kg/día o menos. Por ejemplo, las dosis para el paciente pueden ser de 0,9, 0,6, 0,5, 0,45, 0,3, 0,2, 0,15 o 0,1 jmol/kg/día o menos (referidas a moles del fármaco). Preferiblemente, el anticuerpo con conjugados farmacológicos retrasa el crecimiento del tumor cuando se administra en la cantidad de dosis diaria durante un periodo de al menos cinco días.
Para otros modos de administración, la cantidad de dosificación y el intervalo pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles plasmáticos del compuesto administrado eficaces para la indicación clínica particular que se está tratando. Por ejemplo, en una realización, un compuesto según la invención puede administrarse en concentraciones relativamente altas varias veces al día. Alternativamente, puede ser más deseable administrar un compuesto de la invención a concentraciones mínimas eficaces y utilizar un régimen de administración menos frecuente. Esto proporcionará un régimen terapéutico acorde con la gravedad de la enfermedad del individuo.
Utilizando las enseñanzas proporcionadas aquí, se puede planear un régimen de tratamiento terapéutico efectivo que no cause toxicidad substancial y sin embargo sea completamente efectivo para tratar los síntomas clínicos demostrados por el paciente en particular. Esta planificación debe incluir la elección cuidadosa del compuesto activo teniendo en cuenta factores como la potencia del compuesto, la biodisponibilidad relativa, el peso corporal del paciente, la presencia y gravedad de los efectos secundarios adversos, el modo de administración preferido y el perfil de toxicidad del agente seleccionado.
Las realizaciones preferidas de la presente invención se han mostrado y descrito en el presente documento
EJEMPLOS
La presente invención se ejemplifica además mediante lo siguiente y Ejemplos que ilustran la preparación de los compuestos de la invención.
Ejemplo 1
Generación de líneas celulares L transfectadas con her2 o egfr
Reactivos: Las células L procedían de ATCC (Manassas, VA; n° de cat. CRL2648), el ADNc de Her2/pEZ-Lv105 o egfr/pCMV se adquirió a Sino Biological Inc. (n° de cat. H10004) o GeneCopoeia (n° de cat. Z2866), DMEM glucosa, L-glutamina, Lipofectamine 2000 (Invitrogen; Carlsbad, CA).
Para fabricar líneas celulares para el cribado del Trastuzumab conjugado, se generaron células L que expresaban el Her2 o EGFR direccionado. El constructo de ADNc Her2/pEZ-Lv105 o egfr/pCMV se transfectó en células L (que crecieron en células DMEM+10 % FBS+2 mM L-glutamina con alto contenido en glucosa) mediante el protocolo estándar Lipofectamine 2000.
Análisis de unión (análisis FACS)
Para determinar la capacidad de unión del Trastuzumab conjugado, se realizaron análisis FACS de células L que expresaban her2 humano. En resumen, se incubaron aproximadamente 106 células L con her2 transfectado transitoriamente en 100 j l con cantidades variables de anticuerpo conjugado con Trastuzumab, PBS o anticuerpo secundario solo o se utilizó huIgG irrelevante como control negativo. Tras el lavado, las células se volvieron a suspender en tampón FACS y se incubaron 30 minutos a temperatura ambiente con 20 j l de anticuerpo secundario IgG antihumano de ratón conjugado con ficoeritrina (Mu anti-Human-PE) en un volumen de reacción de 100 jl. Tras el lavado, las células se fijaron en 200 j l de paraformaldehído al 2 %/PBS y se realizó la citometría de flujo. Se utilizó el mismo procedimiento para el anticuerpo IgG humano irrelevante como control de isotipo para establecer la PMT de referencia por línea celular. La citometría de flujo se realizó en un BD FACSCalibur® y se registró la intensidad de fluorescencia media geométrica para cada muestra. Los datos registrados se analizaron con el programa informático FlowJo. Los resultados se muestran en la figura 1.
Generación de anticuerpos con conjugados del ligando de receptores tipo Toll
Reactivos: Trastuzumab (Roche/Genentech Corporation, South San Francisco, CA), Cetuximab (Merck, ); MC-val-cit-PAB unido a resiquimod (MC-vc-PAB-TLRL) o m C- unido a resiquimod (MC-TLRL) (sintetizados en Contract Research Organization, China), borato sódico, cloruro sódico, ditiotreitol (DTT), SephadexG25, DTPA, DTNB y maleimidocaproilmonometil (Sigma-Aldrich, Milwaukee, Wisconsin).
Los fármacos utilizados para la generación de conjugados anticuerpo ligando TLR incluyeron Trastuzumab y resiquimod (TLRL), en algunos casos, Cetuximab fue utilizado para conjugados. Los enlazadores utilizados para la generación del TLAC fueron el enlazador escindible MC-vc-PAB o el enlazador no escindible MC.
Preparación de Trastuzumab MC-TLRL o Cetuximab MC-TLRL
El trastuzumab se purificó a partir de HERCEPTIN® mediante intercambio tampón a 20 mg/mL, y el anticuerpo disuelto en 500 mM de borato sódico y 500 mM de cloruro sódico a pH 8,0 se trata con un exceso de 100 mM de ditiotreitol (DTT). Tras incubar a 37°C durante unos 30 minutos, se intercambia el tampón por elución sobre resina Sephadex G25 y se eluye con PBS con 1 mM de DTPA. El valor tiol/Ab se comprueba determinando la concentración reducida de anticuerpos a partir de la absorbancia a 280 nm de la solución y la concentración de tiol por reacción con DTNB (Sigma-Aldrich, Milwaukee, Wisconsin) y determinación de la absorbancia a 412 nm. El anticuerpo reducido disuelto en PBS se enfría en hielo. El reactivo enlazador del fármaco, Mc- enlazado con resiquimod, disuelto en DMSO, se diluye en acetonitrilo y agua a concentración conocida, y se añade al anticuerpo reducido refrigerado en PBS. Después de aproximadamente una hora, se añade un exceso de maleimida para apagar la reacción y tapar cualquier grupo tiol del anticuerpo que no haya reaccionado. En algunos casos, se realizó el acoplamiento a lisinas de inmunoglobulina con el procedimiento estándar. La mezcla de reacción se concentra por ultrafiltración centrífuga y el anticuerpo conjugado se purifica y desala por elución a través de resina G25 en PBS, se filtra a través de filtros de 0,2 μm en condiciones estériles y se congela para su almacenamiento. _LA preparación de Cetuximab MC-TLRL utilizó el mismo procedimiento.
Preparación de Trastuzumab MC-vc-TLRL o Cetuximab MC-vc-TLRL
Los anticuerpos se unieron a TLRL a través de la cisteína mediante Maleimidocaproil-valina-citrulina (vc)-paminobenziloxicarbonil (MC-vc-PAB). El enlazador MC-vc-PAB es escindible por proteasas intercelulares como la catepsina B y, cuando se escinde, libera el fármaco libre (Doronina et al., Nat. Biotechnol. 21: 778-784 (2003)) mientras que el enlazador MC es resistente a la escisión por proteasas intracelulares. El Trastuzumab purificado se disolvió en 500 mM de borato sódico y 500 mM de cloruro sódico a pH 8,0 y se trató además con un exceso de 100 MM de ditiotreitol (DTT). Tras incubar a 37°C durante unos 30 minutos, se intercambia el tampón por elución sobre resina Sephadex G25 y se eluye con PBS con 1 mM de DTPA. El valor tiol/Ab se comprobó determinando la concentración reducida de anticuerpos a partir de la absorbancia a 280 nm de la solución y la concentración de tiol mediante reacción con DTNB (Sigma-Aldrich, Milwaukee, Wisconsin) y determinación de la absorbancia a 412 nm (coeficiente de extinción =13600 cirr1 M'1). El anticuerpo reducido disuelto en PBS se enfrió en hielo. El MC-val-cit-PAB-PNP unido con resiquimod en DMSO, se disolvió en acetonitrilo y agua, y se añadió al anticuerpo reducido refrigerado en PBS. Tras una hora de incubación, se añadió un exceso de maleimida para apagar la reacción y tapar cualquier grupo tiol del anticuerpo que no hubiera reaccionado. En algunos casos, se realizó el acoplamiento a lisinas de inmunoglobulina con el procedimiento estándar. La mezcla de reacción se concentró por ultrafiltración centrífuga y el conjugado anticuerpo-fármaco, se purificó y desaló por elución a través de resina G25 en PBS, se filtró a través de filtros de 0,2 μm en condiciones estériles y se congeló para su almacenamiento. La preparación de Cetuximab MC-vc-TLRL fue el mismo procedimiento.
Típicamente, una reacción de conjugación de anticuerpo con MC-TLRL o MC-vc-TLRL resulta en una mezcla heterogénea que comprende anticuerpos diferentes números de fármacos TLRL unidos y conjugados, es decir, carga de fármaco donde el fármaco es una distribución de 1 a aproximadamente 8. Así, el anticuerpo MC-TLRL, o anticuerpo MC-vc-TLRL, incluye moléculas de especies aisladas y purificadas, así como mezclas de carga media de fármaco de 1 a 8. En el proceso de control, las cargas de fármaco oscilaban entre 3 y 5. El número medio de moléculas de fármaco TLRL por anticuerpo en preparaciones de compuestos procedentes de reacciones de conjugación puede caracterizarse por medios convencionales como la espectroscopia de masas, el ensayo ELISA, la electroforesis y la HPLC. También puede determinarse la distribución cuantitativa del anticuerpo MC-TLRL o del anticuerpo MC-vc-TLRL en función del fármaco. Mediante ELISA, se puede determinar el valor medio del número de carga útil del fármaco en una preparación concreta de anticuerpo con conjugación TLRL (Hamblett et al (2004) Clinical Cancer Res. 10:7063-7070; Sanderson et al (2005) Clinical Cancer Res. 11:843-852). Sin embargo, la distribución de los valores del fármaco no es discernible por la unión anticuerpo-antígeno y la limitación de detección del ELISA. Además, el ensayo ELISA para la detección de conjugados anticuerpo-fármaco no determina dónde están unidas las fracciones de fármaco al anticuerpo, como la cadena pesada o los fragmentos de cadena ligera, o los residuos de aminoácidos concretos. En algunos casos, la separación, purificación y caracterización de Trastuzumab MC-TLRL o Trastuzumab MC-vc-TLRL homogéneos en los que el fármaco es un valor determinado de Trastuzumab MC-TLRL o Trastuzumab MC-vc-TLRL con otras cargas de fármaco puede lograrse por medios como HPLC de fase inversa o electroforesis.
Ensayo de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC)
Reactivos: Células SκΒR3 (ATCC, catálogo#HTB-30), McCoy's 5A(Invitrogen, CatNo.22400, Lot No.747809); RPMI-1640 (Invitrogen, Cat No.11835, Lot No.764956); FCS (Hyclone, Cat No.SH30084.03, Lot No.GRH0054); Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ; Cat No 17-1440-02), placa de 96 pocillos (Costar, Cat No.3599, Cat No.3916); Trypan blue (Invitrogen Cat No 15250-061); LDH kit (Promega, Cat No.G7891), ELISA reader MD5 (Dispositivo molecular), Anticuerpo humanizado Herceptin® (Genentech Corporation, South San Francisco, CA; nombre comercial Trastuzumab) Se reconstituyó con agua para preparar una solución madre de 10 mg/ml antes de su uso.
Para determinar si el Trastuzumab conjugado con una carga útil alta de TLRL seguiría teniendo función efectora, se probaron las actividades de citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) de varias formas diferentes de conjugación y se compararon con la actividad ADCC del material de referencia de Trastuzumab que ha demostrado tener una actividad ADCC significativamente mejorada. Se realizaron ensayos ADCC utilizando células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos como células efectoras, y una línea celular SκΒR3 humana como células diana. El primer día, se sembraron 1 x104/100uL de células SκΒR3 en las placas de 96 pocillos y, a continuación, se incubaron a 37 °C con un 5 % de CO2 durante 48 horas.
Al tercer día, se prepararon PBMC humanas frescas a partir de sangre humana obtenida de donantes voluntarios sanos. Se recogieron muestras de sangre venosa humana en tubos de citrato de amonio (ACD-A). Se invirtieron los tubos varias veces y se transfirió sangre total a un tubo cónico de 50 ml. La sangre se diluyó 1:3 con PBS al 2 % de FBS. Ficoll-Hypaque se dispensó lentamente por debajo de la mezcla de sangre/PBS. Las muestras se centrifugaron a temperatura ambiente a 2400 rpm durante 30 minutos antes de eliminar la capa superior (plasma/PBS) por aspiración. Las capas leucocitarias se recogieron con pipetas estériles y se mezclaron en un tubo cónico de 50 ml. Si quedaban grumos visibles de CMB por debajo de la capa leucocitaria, se recogía todo el material de CMB, con cuidado de no eliminar el exceso de Ficoll-Hypaque. Se añadió PBS-2 % FBS estéril y se mezcló por inversión. Las suspensiones de PBMC diluidas se centrifugaron a 250 x g a temperatura ambiente durante 20 minutos y se recogió el sedimento celular. El sedimento de PBMC se suspendió en medio RPMI-1640 con un 2 % de FBS inactivado por calor, se lavó y se comprobó el número de células viables mediante exclusión por azul tripán. Se prepararon 1,2 * 107 células/mL de densidad, listas para su uso. Mientras tanto, las concentraciones finales de anticuerpos que oscilaban entre 12, 4, 1,2, 0,4, 0,12, 0,04, 0,012, 0,004 y 0|jg/mL se prepararon bien en RPMI-1640.
A continuación, se añadieron diluciones seriadas de anticuerpos de prueba y de control a los pocillos que contenían las células diana, se añadieron células efectoras PBMC en 50 j l de medio RPMI-1640 a cada pocillo con una relación de células efectoras:diana de 60: 1 y se incubó durante 17 horas más. Las placas se centrifugaron al final de la incubación y los sobrenadantes se analizaron para determinar la actividad de la lactato deshidrogenasa (LDH) utilizando un kit de medición de LDH. La lisis celular se cuantificó mediante absorbancia a 490 nm utilizando un lector de microplacas. La absorbancia de los pocillos que contenían sólo las células diana sirvió como control del fondo, mientras que los pocillos que contenían células diana lisadas con Triton-X100 proporcionaron la máxima señal disponible. La citotoxicidad celular independiente del anticuerpo se midió en pocillos que contenían células diana y efectoras sin adición de anticuerpo. La citotoxicidad se calculó según la siguiente ecuación:
% de citotoxicidad = 100% x [A490nm (Muestra) -A 490 (célula diana)-A490 (células efectoras]/[A490nm
(Células diana Usadas) -A 490nm (células diana)]
Los valores medios de ADCC de duplicados de diluciones de muestras se graficaron contra la concentración de anticuerpo, y los valores EC50 y la extensión máxima de ADCC ( %) se generaron ajustando en Prism 5 (GraphPad).
Enriquecimiento de células dendríticas (CD) humanas a partir de PBMC
Las PBMC humanas se prepararon a partir de capas leucocitarias obtenidas de donantes voluntarios sanos mediante centrifugación Ficoll. Las células dendríticas se enriquecieron mediante depleción negativa con microesferas magnéticas (Miltenyi Biotec) con una mezcla de anticuerpos anti-CD3, CD19, CD20, CD14 y CD16 a partir de PBMC humanas. El enriquecimiento de DCs se tiñó con FITC antiratón de cabra (linajes), HLA-DR-APCCy7, CD123-BV421 y CD11C-APC. Las células teñidas se analizaron en el BD LSR Fortessa. Los anticuerpos monoclonales anti CD3, CD4, CD11C, CD19, CD14, CD16 y CD123 se adquirieron a BD Biosciences o Biolgend.
La Figura 3(a) muestra los porcentajes de DCs antes y después del enriquecimiento. Los números de los dos gráficos superiores representan los porcentajes de DC (HLA-DR+Lin-) del total de células antes y después de la eliminación de linajes. Las cifras de los gráficos inferiores representan los porcentajes de CDM (CD11C CD123-) y CDP (CD123+CD11C-) del total de CD antes y después de la eliminación de linajes.
Estimulación de DC humanas enriquecidas y expresión de citocinas
Se sembraron 1-2 * 105 DC enriquecidas en una placa de 96 pocillos en 100 j l de medio, se añadieron 100 j l de estimuladores diluidos a la placa y se cultivaron durante 20-22h en la incubadora a 37°C. Se recogió el sobrenadante y se analizaron mediante ELISA (Mabtech AB) el IFN-a, la IL-6, la IL-12(p70) y el TNF-a humanos.
Análisis estadístico
La significación de todas las comparaciones se calculó mediante una prueba t de Student de dos colas, asumiendo una varianza desigual entre los grupos de simulacros y muestras, y los resultados se consideraron significativos cuando p<0,05. Las correlaciones entre parámetros se evaluaron mediante la prueba de correlación de rangos de Spearman; los valores de P <0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Ensayo de mortandad de células tumorales in vivo utilizando conjugados TLRL de Trastuzumab o conjugados TLRL de Cetuximab
Para el desarrollo de modelos de ratón de xenoinjerto de carcinoma gástrico (PDX) derivados de pacientes, se utilizaron ratones lampiños Balb/c hembra (de SLAC, Shanghai, China) de 6-8 semanas de edad para la implantación de fragmentos tumorales. Los animales se alimentaron con dieta normal para ratones lampiños y se alojaron en el estabulario SPF de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y las normas del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales. Se implantaron (s.c.) fragmentos de tumor gástrico STO#69 patentados de un tamaño aproximado de 15-30 mm3 en los flancos derechos de ratones lampiños Balb/c.
Para el desarrollo de modelos de xenoinjerto de cáncer de pulmón, se utilizaron ratones lampiños hembra Balb/c de 6-8 semanas de edad para la implantación de fragmentos tumorales. Línea celular de cáncer de pulmón humano H1650 (ATCC, Cat. # CRL5883) se cultivaron en medio RPMI-1640 con un 10 % de suero y se implantaron (s.c.) en los flancos derechos de ratones lampiños Balb/c. Cada ratón recibió 2*10® células por inoculación en 100 ul de matrigel.
Los fármacos se administraron por vía i.v. con 5~20 mg/kg de anticuerpo o 20mg/kg de Tarceva o fármaco de referencia, QWKx3. Los tumores se midieron una vez a la semana con un calibrador para determinar su crecimiento subcutáneo. Los tumores se midieron dos veces por semana en dos dimensiones con calibradores. El volumen tumoral se calculó mediante la siguiente fórmula: volumen tumoral = (longitud * anchura2) * 0,5. Los volúmenes medios de los tumores o los pesos corporales se representaron gráficamente con el programa Prism 5 (GraphPad). El criterio de valoración del estudio de eficacia se fijó en los 30-45 días posteriores al primer tratamiento o cuando el tamaño del tumor superara los 2000 mm3, lo que ocurriera primero. Si un ratón pierde más del 20 % de su peso corporal o está muy enfermo y no puede conseguir comida o agua adecuadas, se le retirará del estudio y se le aplicará la eutanasia. Se recogieron los tumores de los ratones en el punto final, la mitad se congelaron en LN2 y la otra mitad se fijaron en formol para preparar tejidos FFPE.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto que tiene la estructura de la Fórmula (I):
TM-Ln-AM (I),
donde TM es una fracción de diana que comprende un anticuerpo, o fragmento funcional del mismo, capaz de unirse a un antígeno tumoral específicamente o preferiblemente en comparación con un antígeno no tumoral, donde el antígeno tumoral es ErbB1 (EGFR), AM es una fracción activadora que es un ligando TLR7 y TLR8 humano, Ln es un enlazador donde L tiene la siguiente fórmula:
-Ta-Ww-Yyen la que T es una unidad extensora, a es 0 o 1, cada W es independientemente una unidad de aminoácido, w es independientemente un número entero de 2 a 12, Y es una unidad espaciadora e y es 0, 1 o 2; y n es 1, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para su uso en el tratamiento del cáncer.
2. El compuesto para su uso según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo, comprende un Fab, Fab', F(ab')2, anticuerpo de dominio único, dímero de T y Abs, Fv, scFv, dsFv, ds-scFv, Fd, anticuerpo lineal, minicuerpo, diacuerpo, fragmento de anticuerpo biespecífico, bicuerpo, tricuerpo, sc-diacuerpo, cuerpo kappa (lamda), BiTE, DVD-Ig, SIP, SMIP, DART, o un análogo de anticuerpo que comprenda una o más c Dr .
3. El compuesto para su uso según la reivindicación 2, en el que el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: Erbitux (cetuximab) y Vectibix (Panitumumab).
4. El compuesto para su uso según la reivindicación 1, en el que dicho enlazador es escindible enzimáticamente.
5. El compuesto para su uso según la reivindicación 1, en el que dicha fracción activadora comprende: (a) ARN monocatenario (ssARN), como ORN02, ORN06, ssPoly(U), ssARN40, ssARN-DR, o Poly(dT); o (b) análogos del ligando del receptor, como CL075, CL097, o Resiquimod.
6. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto para su uso como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables.
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