ES2951271T3 - Enzimas epimerasas y su uso - Google Patents
Enzimas epimerasas y su uso Download PDFInfo
- Publication number
- ES2951271T3 ES2951271T3 ES19759129T ES19759129T ES2951271T3 ES 2951271 T3 ES2951271 T3 ES 2951271T3 ES 19759129 T ES19759129 T ES 19759129T ES 19759129 T ES19759129 T ES 19759129T ES 2951271 T3 ES2951271 T3 ES 2951271T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- epimerase
- seq
- protein
- fructose
- allulose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 title abstract description 51
- 102000004879 Racemases and epimerases Human genes 0.000 title abstract description 50
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims abstract description 21
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims abstract description 21
- LKDRXBCSQODPBY-JDJSBBGDSA-N D-allulose Chemical compound OCC1(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O LKDRXBCSQODPBY-JDJSBBGDSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 17
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 claims description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims description 2
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 2
- 241000235061 Pichia sp. Species 0.000 claims description 2
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 claims description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 claims description 2
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 8
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 abstract description 2
- 101900214280 Burkholderia multivorans Xylose isomerase Proteins 0.000 abstract 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 12
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 101150033534 lysA gene Proteins 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- BJHIKXHVCXFQLS-PUFIMZNGSA-N D-psicose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)CO BJHIKXHVCXFQLS-PUFIMZNGSA-N 0.000 description 3
- 108030002100 D-tagatose 3-epimerases Proteins 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 2
- 108030002106 D-psicose 3-epimerases Proteins 0.000 description 2
- 101710109941 D-tagatose 3-epimerase Proteins 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- 102220571072 Growth arrest and DNA damage-inducible protein GADD45 gamma_D89K_mutation Human genes 0.000 description 2
- 101710141886 Ketose 3-epimerase Proteins 0.000 description 2
- 208000007976 Ketosis Diseases 0.000 description 2
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 2
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 150000002584 ketoses Chemical class 0.000 description 2
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- AYIRNRDRBQJXIF-NXEZZACHSA-N (-)-Florfenicol Chemical compound CS(=O)(=O)C1=CC=C([C@@H](O)[C@@H](CF)NC(=O)C(Cl)Cl)C=C1 AYIRNRDRBQJXIF-NXEZZACHSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 241000186074 Arthrobacter globiformis Species 0.000 description 1
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 1
- 101100176927 Bacillus subtilis (strain 168) bglS gene Proteins 0.000 description 1
- 101100221537 Bacillus subtilis (strain 168) comK gene Proteins 0.000 description 1
- 101100498158 Bacillus subtilis (strain 168) dacF gene Proteins 0.000 description 1
- 101100449954 Bacillus subtilis (strain 168) eglS gene Proteins 0.000 description 1
- 101100325906 Bacillus subtilis (strain 168) ganA gene Proteins 0.000 description 1
- SPFYMRJSYKOXGV-UHFFFAOYSA-N Baytril Chemical compound C1CN(CC)CCN1C(C(=C1)F)=CC2=C1C(=O)C(C(O)=O)=CN2C1CC1 SPFYMRJSYKOXGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000020731 Burkholderia multivorans Species 0.000 description 1
- HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N Clavulanic acid Natural products OC(=O)C1C(=CCO)OC2CC(=O)N21 HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 241000286316 Desmospora Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101100031701 Escherichia coli (strain K12) bglF gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 208000028017 Psychotic disease Diseases 0.000 description 1
- 241000191043 Rhodobacter sphaeroides Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 101100111413 Thermoanaerobacter pseudethanolicus (strain ATCC 33223 / 39E) lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 101100272383 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) bglT gene Proteins 0.000 description 1
- WKDDRNSBRWANNC-UHFFFAOYSA-N Thienamycin Natural products C1C(SCCN)=C(C(O)=O)N2C(=O)C(C(O)C)C21 WKDDRNSBRWANNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 1
- 241001246487 [Clostridium] bolteae Species 0.000 description 1
- 241000883281 [Clostridium] cellulolyticum H10 Species 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 229960004821 amikacin Drugs 0.000 description 1
- LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N amikacin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](N)C[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)NC(=O)[C@@H](O)CCN)[C@H]1O[C@H](CN)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N 0.000 description 1
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 1
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 101150009206 aprE gene Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940098164 augmentin Drugs 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 229960000603 cefalotin Drugs 0.000 description 1
- XIURVHNZVLADCM-IUODEOHRSA-N cefalotin Chemical compound N([C@H]1[C@@H]2N(C1=O)C(=C(CS2)COC(=O)C)C(O)=O)C(=O)CC1=CC=CS1 XIURVHNZVLADCM-IUODEOHRSA-N 0.000 description 1
- 229960001139 cefazolin Drugs 0.000 description 1
- MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N cefazolin Chemical compound S1C(C)=NN=C1SCC1=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CN3N=NN=C3)[C@H]2SC1 MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N 0.000 description 1
- 229960002682 cefoxitin Drugs 0.000 description 1
- WZOZEZRFJCJXNZ-ZBFHGGJFSA-N cefoxitin Chemical compound N([C@]1(OC)C(N2C(=C(COC(N)=O)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)CC1=CC=CS1 WZOZEZRFJCJXNZ-ZBFHGGJFSA-N 0.000 description 1
- 229960000484 ceftazidime Drugs 0.000 description 1
- NMVPEQXCMGEDNH-TZVUEUGBSA-N ceftazidime pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C([O-])=O)=O)NC(=O)\C(=N/OC(C)(C)C(O)=O)C=2N=C(N)SC=2)CC=1C[N+]1=CC=CC=C1 NMVPEQXCMGEDNH-TZVUEUGBSA-N 0.000 description 1
- 229960005229 ceftiofur Drugs 0.000 description 1
- ZBHXIWJRIFEVQY-IHMPYVIRSA-N ceftiofur Chemical compound S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C(O)=O)=O)NC(=O)\C(=N/OC)C=2N=C(N)SC=2)CC=1CSC(=O)C1=CC=CO1 ZBHXIWJRIFEVQY-IHMPYVIRSA-N 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- HZZVJAQRINQKSD-PBFISZAISA-N clavulanic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1C(=C/CO)/O[C@@H]2CC(=O)N21 HZZVJAQRINQKSD-PBFISZAISA-N 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229960000740 enrofloxacin Drugs 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 229960003760 florfenicol Drugs 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 229960002182 imipenem Drugs 0.000 description 1
- ZSKVGTPCRGIANV-ZXFLCMHBSA-N imipenem Chemical compound C1C(SCC\N=C\N)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@H]([C@H](O)C)[C@H]21 ZSKVGTPCRGIANV-ZXFLCMHBSA-N 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 101150086432 lacA gene Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 101150112117 nprE gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- -1 sarafloxicin Chemical compound 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- OHKOGUYZJXTSFX-KZFFXBSXSA-N ticarcillin Chemical compound C=1([C@@H](C(O)=O)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)C=CSC=1 OHKOGUYZJXTSFX-KZFFXBSXSA-N 0.000 description 1
- 229960004659 ticarcillin Drugs 0.000 description 1
- 229960000223 tilmicosin Drugs 0.000 description 1
- JTSDBFGMPLKDCD-XVFHVFLVSA-N tilmicosin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)[C@H](O)CC(=O)O[C@@H]([C@H](/C=C(\C)/C=C/C(=O)[C@H](C)C[C@@H]1CCN1C[C@H](C)C[C@H](C)C1)CO[C@H]1[C@@H]([C@H](OC)[C@H](O)[C@@H](C)O1)OC)CC)[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](N(C)C)[C@H]1O JTSDBFGMPLKDCD-XVFHVFLVSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
- C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
- C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
- C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
- C12Y503/01005—Xylose isomerase (5.3.1.5)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Esta divulgación proporciona enzimas epimerasa útiles para la producción a escala comercial de alulosa a partir de fructosa. Las enzimas descritas ("variantes de epimerasa") son variantes de la xilosa isomerasa CGD1 de Burkholderia multivorans diseñada para tener una actividad catalítica mejorada de aproximadamente 1,5 a 2 veces en comparación con la enzima original. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Enzimas epimerasas y su uso
CAMPO TÉCNICO
La presente divulgación se refiere en general a la producción de alulosa.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Gráfico que muestra el efecto de la sustitución de aminoácidos en la fracción de fructosa convertida por la epimerasa de tipo silvestre (204020, SEQ ID NÚM.: 6) y por las variantes de epimerasa 230338 (SEQ ID NÚM.: 16), 277285 (SEQ ID NÚM.: 90), 277286 (SEQ ID NÚM.: 92), 277287 (SEQ ID NÚM.: 94), 277288 (SEQ ID NÚM.: 96), 277289 (SEQ ID NÚM.: 98) y 277290 (SEQ ID NÚM.: 100). Barra izquierda de cada par, 200 mM; barra derecha de cada par, 50% (p/p).
Figura 2. Gráfico que muestra la expresión de la epimerasa de tipo silvestre (204020, SEQ ID NÚM.: 6) y de las variantes de epimerasa 230338 (SEQ ID NÚM.: 16), 277285 (SEQ ID NÚM.: 90), 277286 (SEQ ID NÚM.: 92), 277287 (SEQ ID NÚM.: 94), 277288 (SEQ ID NÚM.: 96), 277289 (SEQ ID NÚM.: 98) y 277290 (SEQ ID NÚM.: 100).
Figura 3. Gráfico que muestra las actividades específicas de la epimerasa de tipo silvestre (204020, SEQ ID NÚM.: 6) y de las variantes de epimerasa 230338 (SEQ ID NÚM.: 16), 277285 (SEQ ID NÚM.: 90), 277286 (SEQ ID NÚM.: 92), 277287 (SEQ ID NÚM.: 94), 277288 (SEQ ID NÚM.: 96), 277289 (SEQ ID NÚM.: 98) y 277290 (SEQ ID NÚM.: 100). Barra izquierda de cada par, 200 mM; barra derecha de cada par, 50% DS.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente divulgación proporciona enzimas epimerasas útiles para la producción a escala comercial de alulosa a partir de fructosa. Las enzimas desveladas ("variantes de epimerasa") son variantes de la xilosa isomerasa CGD1 de Burkholderia multivorans (SEQ ID NÚM.: 6) diseñadas para tener una actividad catalítica mejorada de aproximadamente 1,5 a 2 veces en comparación con la enzima original. La Tabla 1 a continuación identifica la secuencia de aminoácidos de cada variante de epimerasa en el listado de secuencias adjunto y proporciona un ejemplo de secuencia de ácido nucleico que codifica la variante. Las diferencias de aminoácidos entre cada variante de epimerasa y la enzima original (SEQ ID NÚM.: 6) se resumen en la Tabla 2, en la que los números de aminoácidos se refieren a los de la SEQ ID NÚM.: 6.
Tabla 1. Secuencias de aminoácidos y ejemplos de secuencias codificantes de variantes de la epimerasa
Ácidos nucleicos, vectores y microorganismos huéspedes
La presente divulgación proporciona ácidos nucleicos que codifican las variantes de epimerasa desveladas descritas anteriormente. El listado de secuencias proporciona ejemplos de secuencias de nucleótidos que codifican estas variantes, pero puede utilizarse cualquier secuencia de nucleótidos que codifique las variantes de la epimerasa.
Las secuencias de nucleótidos pueden optimizarse para su expresión en diversas especies o cepas de microorganismos, como es bien conocido en la técnica. Los microorganismos adecuados incluyen, pero sin limitación, Bacillus licheniformis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pseudomonas putida, Pichia sp., Aspergillus sp., Trichoderma reesei, Corynebacterium glutamicum, E. coli y B. subtilis. Los vectores que contienen promotores y otras secuencias reguladoras necesarias para expresar cualquier proteína en estos organismos son conocidos y están fácilmente disponibles para los expertos en la técnica.
Los ácidos nucleicos que codifican las variantes de epimerasa descritas anteriormente pueden incluirse en vectores en los que una secuencia codificante está unida de forma operable a una secuencia reguladora adecuada para la expresión en un microorganismo huésped deseado. La secuencia reguladora incluye un sitio adecuado de unión al ribosoma del ARNm y una secuencia para regular la terminación de la transcripción y la traducción, y puede incluir otros elementos, tal como un promotor o un operador. Una vez transformado en un microorganismo huésped, el vector puede replicarse o funcionar independientemente del genoma huésped o integrarse en el propio genoma. El vector que se utiliza no está específicamente limitado y puede ser cualquier vector conocido en la técnica, a condición de que pueda replicarse en el huésped.
Un vector puede incluir al menos un marcador seleccionable, tal como un gen de resistencia a los antibióticos. Los antibióticos adecuados incluyen, por ejemplo, amikacina, ampicilina, augmentina (amoxicilina más ácido clavulónico), cefazolina, cefoxitina, ceftazidima, ceftiofur, cefalotina, cloranfenicol, enrofloxacina, florfenicol, gentamicina, imipenem, kanamicina, penicilina, sarafloxicina, espectinomicina, estreptomicina, tetraciclina, ticarcilina y tilmicosina.
Se pueden utilizar vectores para diseñar un microorganismo para producir una o más de las variantes de epimerasa descritas anteriormente. Los procedimientos de administración de vectores a microorganismos son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, la transfección con fosfato cálcico, la transfección mediada por DEAE-dextrano, la microinyección, la transfección mediada por lípidos, la electroporación, la conjugación, y la infección.
Procedimientos de producción de alulosa
Las variantes de epimerasa desveladas en la presente memoria pueden utilizarse para la producción a escala comercial de alulosa a partir de fructosa utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, los documentos US 2017/0101637, US 2017/0298400, US 2016/0304853y US 2016/0281076.
En algunas realizaciones, una variante de epimerasa o un extracto de un microorganismo que comprende la variante de epimerasa se une a una matriz sólida, y una solución de entrada que comprende fructosa se pasa sobre la matriz para convertir al menos una porción de la fructosa en alulosa, que puede recuperarse de la corriente de salida. Opcionalmente, la alulosa puede separarse de otros componentes en la corriente de salida y puede concentrarse.
Muchas matrices sólidas adecuadas para unir enzimas son bien conocidas en la técnica e incluyen alginato (por ejemplo, alginato de sodio), resinas AMBERLITE™ (por ejemplo, XAD®2, XAD®4, XAD®8, XAD®16 (Sigma Aldrich), resinas SEPHADEX® o resinas DUOLITE™ (por ejemplo, A568; Dow Chemical); y Purolite CR8415 y ECR 8314 (Purolite). Véanse también los documentos w O 2016/160573 y WO 2016/191267. Los procedimientos para inmovilizar epimerasas en un soporte son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 8.375.106.
En otras realizaciones, un microorganismo que expresa una variante de epimerasa puede permeabilizarse e inmovilizarse en cuentas de alginato, como se describe en la Patente de los Estados Unidos 8.735.106o en arcillas, carbón, tierra de diatomeas o un hidrogel tal como poliacrilamida.
Los expertos en la técnica apreciarán que existen numerosas variaciones y permutaciones de las realizaciones descritas anteriormente que entran dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo 1 Generación de una cepa de Bacillus subtilis libre de marcadores para la producción comercial de alulosa epimerasa
Este ejemplo describe la generación de una cepa de B. subtilis libre de marcadores que expresa alulosa epimerasa. Brevemente, en una primera etapa, se transformó una cepa de B. subtilis con un casete que codifica la BMCGD1 epimerasa e incluye un marcador de resistencia a los antibióticos. Este casete se recombinó en el cromosoma de Bacillus y eliminó 8 kb de ADN, incluyendo un gran grupo de genes de esporulación y el gen de biosíntesis de lisina lysA. En una segunda etapa, se recombinó un segundo casete en el cromosoma de B. subtilis , restaurando el gen lysA y eliminando el ADN que codifica la resistencia a los antibióticos. Se utilizó la cepa 39 A10 de E. coli de la colección Keio para pasar el a Dn plasmídico antes de la transformación de B. subtilis. El fenotipo relevante es una deficiencia de la metilasa del ADN HsdM en una cepa K-12 de E. coli que, por lo demás, es de tipo silvestre.
En detalle, se sintetizó un casete de 5120 pb (SEQ ID NÚM.: 1; ADN sintético de IDT, Coralville, IA) y se clonó en un vector pIDT estándar resistente a la ampicilina. La pieza sintética codificaba 700 pb corriente arriba de lysA en el cromosoma de B. subtilis, el marcador antibiótico cat (651 pb), la proteína de unión al ADN lacI (1083 pb) y la alulosa epimerasa (894 pb), e incluía 700 pb de homología en dacF. Este vector se transformó en la cepa 39 A10 de E. coli (Baba et al., 2006), y se preparó ADN plasmídico que se transformó en las cepas 1A751 y 1A976 de B. subtilis.
Las transformantes se seleccionaron en LB suplementada con cloranfenicol. El replicón para pIDT es funcional en E. coli pero no funciona en bacterias Gram positivas tal como B. subtilis. Las colonias que surgieron representaban, por tanto, un acontecimiento de integración en el cromosoma. En la cepa 1A751, la morfología de la colonia en las placas se utilizó para distinguir entre eventos de recombinación simple y doble. La recombinación doble eliminaría los genes necesarios para la esporulación, mientras que la recombinación simple no lo haría. Después de tres días en placas LB, las colonias capaces de esporular eran marrones y opacas; las colonias deficientes en esporulación eran más translúcidas.
La cepa 1A976 de B. subtilis con el casete de alulosa epimerasa es auxotrófica para la histidina y la lisina y puede alcanzar una eficiencia de transformación muy alta tras la inducción de xilosa Se amplificó un ADN sintético de 1925 pb (SEQ ID NÚM.: 2) mediante cebadores (Se Q ID NÚM.: 3, SEQ ID NÚM.: 4) y Taq polimerasa (Promega). Este producto de la PCR codificaba el gen lysA que se suprimió por la caída en el casete de la epimerasa y 500 pb de homología con lacI. Un evento exitoso de recombinación doble de este ADN debería dar lugar a colonias prototróficas para la lisina y sensibles al cloranfenicol; es decir, debería perderse todo el gen cat.
Las transformantes se seleccionaron en medio Davis mínimo suplementado con histidina. Las colonias que surgieron se caracterizaron por PCR y por estriación en LB con y sin cloranfenicol. Las cepas que amplificaron el ADN introducido y que eran sensibles al cloranfenicol se caracterizaron más detalladamente, y se extrajo su ADN cromosómico.
La cepa 1A751 que contiene la alulosa resistente al cloranfenicol se transformó con este ADN cromosómico y se seleccionó en medio Davis mínimo suplementado con histidina. Las transformantes se estriaron en LB con y sin cloranfenicol y se caracterizaron enzimáticamente como se describe a continuación.
Ejemplo 2 Análisis de los niveles de proteína epimerasa
Los niveles de proteína epimerasa en lisados brutos y solubles se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en geles (Invitrogen) 4-12% Bis-Tris NuPAGE (NUPAGE®). Los niveles de proteínas se determinaron por densitometría de geles teñidos con SimplyBlue (SIMPLYBLUE™) Safe Stain (Invitrogen) utilizando estándares de cuantificación de proteínas.
Ejemplo 3 Expresión de la BMCGD1 Epimerasa en B. subtilis
Se optimizó un constructo pHT254 que alberga el gen de la epimerasa BMCGD1 para su expresión en B. subtilis (SEQ ID NÚM.: 5) y se utilizó para transformar la cepa DP1077 de B. subtilis. La cepa DP1077 es un derivado con esporulación defectuosa (AspoIIG::ZeoR) de la cepa 1A976 de Bacillus del Genetic Stock Center (Em his nprE18 aprE3 eglS(DELTA)102 bglT/bglS(DELTA)EV lacA::PxylA-comK). Además de ser defectuosa en la esporulación, la cepa es defectuosa en la capacidad de secretar proteasa neutra y subtilisina como resultado de mutaciones en los genes nprE y aprE, respectivamente. La cepa lleva además un casete de expresión que coloca el factor de competencia, comK, bajo el control de un promotor inducible por xilosa para la producción sencilla de células competentes.
Las transformantes se seleccionaron y cultivaron en medios Azure personalizados carentes de Mn2+ yCo2+ (Teknova) suplementados con 1% de glucosa y 5 μg/ml de cloranfenicol o en medios Davis mínimos (HiMedia) suplementados con 2g/L de mezcla sintética completa de aminoácidos (MP Biomedicals), 1% de glucosa y 5 μg/ml de cloranfenicol. Los cultivos se cultivaron a 37 °C durante 16 h. Cuarenta μl de este cultivo se utilizaron para inocular 2 ml de medio recién preparado, y el cultivo resultante se incubó a 37 °C hasta crecimiento log medio (DO a 600 nm de ~0,7). A continuación, se indujo el cultivo con 1mM de IPTG y se continuó la incubación a 37°C durante 4 horas o a 24°C durante 20 h.
Las células se cosecharon por centrifugación, se congelaron y descongelaron dos veces y se lisaron utilizando el protocolo de lisis completa PeriPreps (PERIPREPS™) (Epicentre). Las proteínas solubles de los lisados se prepararon recogiendo las fracciones sobrenadantes tras la centrifugación de los lisados brutos.
Los niveles de proteína epimerasa en lisados brutos y solubles se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2.
Ejemplo 4 Generación de variantes de epimerasa
Con base en los procedimientos descritos en el documento US 8.635.029se introdujeron cambios de nucleótidos que codifican variaciones de aminoácidos en la secuencia de codificación optimizada de BMCGD1 y se utilizaron para generar secuencias de codificación para variantes de epimerasa. Estas secuencias de codificación se introdujeron en pHT254 (MoBiTech, Inc.). Este vector expresa un gen de interés a partir de un promotor Pgrac100 potente derivado
del promotor que precede al operón groESL de Bacillus subtilis. Este contiene elementos reguladores mejorados fusionados al operador lac que permiten la inducción por IPTG y un fuerte sitio de unión ribosomal. Los nucleótidos se optimizaron en las regiones conservadas del promotor groESL, incluyendo el elemento UP, la región -35 y la -15 (Phan et al., 2012). Cada secuencia de codificación se clonó en el vector de expresión pHT254 en los sitios de restricción BamHI y XmaI.
A continuación, los vectores se transformaron en la cepa Bacillus subtilis DB 1077 como se ha descrito anteriormente. Las transformantes se seleccionaron en medio de agar LB con 5 μg/ml de cloranfenicol.
Se recogieron noventa y seis transformantes de B. subtilis en medio Davis mínimo. El medio Davis mínimo se preparó utilizando agua de calidad reactiva y en un volumen final de 1 L, 10,6 g de Caldo Davis Mínimo sin Dextrosa (HIMEDIA No. de Cat. M390-500G) con 2 g de mezcla completa de aminoácidos sintéticos (MP Biomedicals No. de Cat. 4400 022) y se esterilizó en autoclave durante 15 min a 121°C. Antes de su uso, se añadió glucosa al 1% y cloranfenicol a 5 μg/ml.
Ejemplo 5 Cribado de en transformantes para actividad de epimerasa
Para el cribado de D-fructosa a D-alulosa epimerasa, las transformantes se recogieron en 600 μL de medio Davis mínimo (HiMedia) suplementado con 2g/L de aminoácido sintético completo (MP Biomedicals), 1% de glucosa y 5μg/ml de cloranfenicol. Las células se cultivaron a 37 °C hasta la mitad de su crecimiento log, luego se indujeron con IPTG durante 20 h a 24 °C. Las células se cosecharon por centrifugación y se lisaron utilizando el protocolo de lisis PeriPreps (Epicentre) en un volumen final de 75 μL. La expresión de proteínas solubles se analizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en geles Bis-Tris NuPAGE al 4-12% (Invitrogen) y los niveles de proteínas se determinaron por densitometría contra estándares de cuantificación. La epimerasa soluble recuperada osciló entre 1-10 μg/ml de cultivo.
Para la actividad de epimerasa de los lisados derivados de B. subtilis, las reacciones se ensayaron en un volumen de 100 μL: 10% v/v de lisado clarificado, fructosa baja (200 mM) o alta (50% p/p) y 5 mM de MgCh. Las reacciones se incubaron a 70°C durante 2 h y se detuvieron por adición de un volumen del 10% de HCl al 2% y enfriamiento a 4°C. Las reacciones se filtraron a través de una membrana PES con un corte de peso molecular de 10 kDa (Pall) antes del análisis por HPLC.
Los resultados se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. Expresión y perfil de conversión de fructosa a alulosa en 2 h de variantes de epimerasa
Ejemplo 6 Análisis comparativo de la epimerasa de tipo silvestre y las variantes de epimerasa con una, dos o tres sustituciones de aminoácidos
La fracción de fructosa convertida en alulosa por las variantes de epimerasa con una, dos o tres de las sustituciones de aminoácidos en la variante 230338 (D89K, S154T y C167I) se analizó en dos condiciones (lisado clarificado al 10% v/v, fructosa baja (200 mM) o alta (50% peso/peso), 50 mM MES, pH 5,0 y 5 mM MgCh) y se comparó con la epimerasa de tipo silvestre. Los resultados se muestran en la Figura 1, en la que la barra izquierda de cada par de barras representa la fracción de conversión de fructosa en alulosa al cabo de 1 hora, partiendo de 200 mM de fructosa, y la barra derecha de cada par de barras representa la fracción de conversión de fructosa en alulosa al cabo de 2 horas, partiendo de un 50% de fructosa p/p. Las sustituciones de aminoácidos presentes en cada variante se muestran en la cuadrícula sobre el gráfico de barras, y las secuencias de aminoácidos de las variantes se proporcionan en SEQ ID NÚM.: 16 (variante 230338), SEQ ID NÚM.: 90 (variante 277285), SEQ ID NÚM.: 92 (variante 277286), SEQ ID NÚM.: 94 (variante 277287), SEQ ID NÚM.: 96 (variante 277288), SEQ ID NÚM.: 98 (variante 27289), y SEQ ID NÚM.: 100 (variante 27290). "204020" es la epimerasa de tipo silvestre (SEQ ID NÚM.: 6). La expresión de la epimerasa (μg/ml) se muestra en la Figura 2. La actividad específica (fructosa convertida por μg/ml de epimerasa) se muestra en la Figura 3.
Este ejemplo demuestra que la variante triple era catalíticamente más activa en las condiciones en que se evaluó la enzima. La variante que presentaba las tres sustituciones (D89K, S154T y C167I) tenía la expresión más alta y era la enzima más activa tanto en 200 mM de fructosa como al 50%( p/p) de fructosa.
REFERENCIAS
Baba et al., "Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection", Molecular Systems Biology (2006) doi: 10/1038/msb4100050, 11 pages
Chu et al., "Expression, purification and activity of D-tagatose 3-epimerase from Clostridium bolteae," Shipin Gongye Keji 33, 198-201,2012
Izumori et al., "Ketose 3-epimerase produced by Arthrobacter globiformis, method for converting ketose using the epimerase, and method for manufacture of ketose using the epimerase", documento WO 2014109254. Kim et al., "Characterization of an Agrobacterium tumefaciens D-psicose 3-epimerase that converts D-fructose to D-psicose," Applied and Environmental Microbiology 72, 981-85, 2006
Li et al., "Overexpression of -psicose 3-epimerase from Clostridium cellulolyticum H10 in Bacillus subtilis and its prospect for -psicose production", Advance Journal of Food Science and Technology 5, 264-69, 2013 Mu et al., "A strategy for bioproduction of rare sugars: Izumoring", Zhongguo Shengwu Gongcheng Zazhi 27, 129-36, 2007
Mu et al., "Recent advances on applications and biotechnological production of D-psicose", Applied Microbiology and Biotechnology 94, 1461-67, 2012
Phan et al., "Development of a strong intracellular expression system for Bacillus subtilis by optimizing promoter elements," J Biotechnol. 157, 167-72, 2012
Wagner et al., "Practical Aspects of Integrated Operation of Biotransformation and SMB Separation for Fine Chemical Synthesis", Organic Process Research & Development 16, 323-30, 2012
Woodyer & Armentrout, "Recombinant ketose 3-epimerases for conversion of fructose to psicose," documento WO 2014049373
Zhang et al., "Characterization of a Metal-Dependent D-Psicose 3-Epimerase from a Novel Strain, Desmospora sp. 8437", J. Agricultural and Food Chemistry 61, 11468-76, 2013
Zhang et al., "Characterization of D-tagatose-3-epimerase from Rhodobacter sphaeroides that converts dfructose into D-psicose," Biotechnology Letters 31, 857-62, 2009
Zhou et al., "Immobilization of D-tagatose 3-epimerase," Shipin Gongye Keji 33, 197-200, 2012
Claims (8)
1. Un ácido nucleico que codifica una proteína, en el que la secuencia de aminoácidos de la proteína se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NÚM.: 16, 18, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 y 100.
2. Un microorganismo que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1.
3. El microorganismo de la reivindicación 2, en el que el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en Bacillus licheniformis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pseudomonas putida, Pichia sp., Aspergillus sp., Trichoderma reesei, Corynebacterium glutamicum, E. coli y B. subtilis.
4. Una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NÚM.: 16, 18, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 y 100.
5. Una matriz sólida que comprende la proteína de la reivindicación 4.
6. Una columna que comprende la matriz sólida de la reivindicación 5 y está configurada para recibir una solución de entrada que comprende fructosa sobre la matriz sólida y para permitir la salida de una solución de salida que comprende alulosa.
7. Un procedimiento de producción de una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NÚM.: 16, 18, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, y 100, que comprende:
(a) cultivar el microorganismo de la reivindicación 2 ; y
(b) recuperar la proteína.
8. Un procedimiento de producción de alulosa, que comprende poner en contacto una solución que comprende fructosa con una proteína de la reivindicación 4 durante un tiempo y en condiciones adecuadas para convertir al menos una porción de la fructosa en alulosa.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862716204P | 2018-08-08 | 2018-08-08 | |
| PCT/US2019/045400 WO2020033472A1 (en) | 2018-08-08 | 2019-08-07 | Epimerase enzymes and their use |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2951271T3 true ES2951271T3 (es) | 2023-10-19 |
Family
ID=67766296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES19759129T Active ES2951271T3 (es) | 2018-08-08 | 2019-08-07 | Enzimas epimerasas y su uso |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11859228B2 (es) |
| EP (1) | EP3833756B9 (es) |
| JP (1) | JP2021532809A (es) |
| KR (1) | KR20210044241A (es) |
| CN (1) | CN112639092A (es) |
| AU (1) | AU2019319816A1 (es) |
| BR (1) | BR112021002184A2 (es) |
| ES (1) | ES2951271T3 (es) |
| PL (1) | PL3833756T3 (es) |
| WO (1) | WO2020033472A1 (es) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113249287B (zh) * | 2021-07-07 | 2021-09-24 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一株表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌工程菌株及其应用 |
| CN114277049A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-04-05 | 李宪臻 | 一种异源表达蔗糖异构酶的基因工程菌及应用 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8005620B2 (en) | 2003-08-01 | 2011-08-23 | Dna Twopointo Inc. | Systems and methods for biopolymer engineering |
| KR20110035805A (ko) | 2009-09-30 | 2011-04-06 | 씨제이제일제당 (주) | 사이코스-에피머화 효소의 고정화 및 이를 이용한 사이코스의 제조방법 |
| US9128961B2 (en) | 2010-10-28 | 2015-09-08 | Google Inc. | Loading a mobile computing device with media files |
| GB2508586B (en) | 2012-09-27 | 2020-09-02 | Tate & Lyle Ingredients Americas Llc | A protein |
| CN108315316B (zh) | 2013-01-08 | 2021-07-20 | 松谷化学工业株式会社 | 球形节杆菌生产的酮糖3-差向异构酶 |
| CN105637089B (zh) | 2013-09-03 | 2021-06-15 | 罗盖特兄弟公司 | D-阿洛酮糖3-差向异构酶的改进的变体及其用途 |
| KR101539097B1 (ko) | 2013-12-26 | 2015-07-23 | 주식회사 삼양제넥스 | 사이코스 에피머화 효소를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드, 및 이를 이용하는 사이코스 생산방법 |
| CN103710330B (zh) * | 2014-01-03 | 2015-04-22 | 江南大学 | 一种高催化活性的d-阿洛酮糖 3-差向异构酶的突变体酶及其应用 |
| KR101473918B1 (ko) | 2014-05-28 | 2014-12-17 | 대상 주식회사 | 사이코스 에피머화 효소, 이의 제조방법 및 이를 이용한 사이코스의 제조방법 |
| KR101577147B1 (ko) | 2014-10-01 | 2015-12-11 | 경상대학교산학협력단 | 사이코스의 생산 방법 |
| US20180251749A1 (en) | 2015-03-27 | 2018-09-06 | Archer Daniels Midland Company | Fructose to Allulose Conversion |
| EP4086355A3 (en) * | 2015-05-22 | 2023-01-25 | Archer Daniels Midland Company | A genus of epimerase enzymes for conversion of fructose to allulose at high temperature and low ph |
-
2019
- 2019-08-07 PL PL19759129.0T patent/PL3833756T3/pl unknown
- 2019-08-07 EP EP19759129.0A patent/EP3833756B9/en active Active
- 2019-08-07 US US17/266,443 patent/US11859228B2/en active Active
- 2019-08-07 AU AU2019319816A patent/AU2019319816A1/en active Pending
- 2019-08-07 JP JP2021506426A patent/JP2021532809A/ja active Pending
- 2019-08-07 CN CN201980056241.9A patent/CN112639092A/zh active Pending
- 2019-08-07 BR BR112021002184-1A patent/BR112021002184A2/pt unknown
- 2019-08-07 WO PCT/US2019/045400 patent/WO2020033472A1/en unknown
- 2019-08-07 ES ES19759129T patent/ES2951271T3/es active Active
- 2019-08-07 KR KR1020217006658A patent/KR20210044241A/ko active Search and Examination
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR112021002184A2 (pt) | 2021-05-04 |
| WO2020033472A1 (en) | 2020-02-13 |
| PL3833756T3 (pl) | 2023-09-04 |
| EP3833756A1 (en) | 2021-06-16 |
| EP3833756B9 (en) | 2023-10-04 |
| JP2021532809A (ja) | 2021-12-02 |
| KR20210044241A (ko) | 2021-04-22 |
| CN112639092A (zh) | 2021-04-09 |
| EP3833756C0 (en) | 2023-06-07 |
| EP3833756B1 (en) | 2023-06-07 |
| AU2019319816A1 (en) | 2021-03-25 |
| US20220145344A1 (en) | 2022-05-12 |
| US11859228B2 (en) | 2024-01-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8802393B2 (en) | Arabinose isomerase expressed from Corynebacterium genus and tagatose manufacturing method by using it | |
| KR101656063B1 (ko) | 사이코스 에퍼머화 효소의 발현 시스템 및 이를 이용한 사이코스의 생산 | |
| ES2951271T3 (es) | Enzimas epimerasas y su uso | |
| CN112342179B (zh) | 产塔格糖的枯草芽孢杆菌基因工程菌及制备塔格糖的方法 | |
| US8759028B2 (en) | Expression cassette, recombinant host cell and process for producing a target protein | |
| KR101695830B1 (ko) | 사이코스 에퍼머화 효소의 발현 시스템 및 이를 이용한 사이코스의 생산 | |
| JP3408737B2 (ja) | ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質及びそれをコードする遺伝子 | |
| CN103695364B (zh) | 通过弱化5‑氨基乙酰丙酸脱水酶活性获得5‑氨基乙酰丙酸高产菌株及其应用 | |
| JPWO2016076159A1 (ja) | シス−５−ヒドロキシ−ｌ−ピペコリン酸の製造方法 | |
| JPWO2016076159A6 (ja) | シス−５−ヒドロキシ−ｌ−ピペコリン酸の製造方法 | |
| US8137946B2 (en) | Recombinant GRAS strains expressing thermophilic arabinose isomerase as an active form and method of preparing food grade tagatose by using the same | |
| CN105985939B (zh) | 一种聚羟基烷酸颗粒降解酶其用途及(r)-3hb生产方法 | |
| CN107619832B (zh) | 一种氯代硝基苯酚类化合物氧化还原酶基因簇cnpAB及其应用 | |
| RU2719140C1 (ru) | Бактерия рода bacillus, продуцирующая гиалуроновую кислоту, и способ получения гиалуроновой кислоты с использованием указанной бактерии | |
| CN117448249A (zh) | 一种生产依克多因的工程菌及其制备方法和应用 | |
| JP2627755B2 (ja) | アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼの製造法 | |
| KR101479134B1 (ko) | 화농연쇄구균 유래 신규 ｎａｄｈ 산화효소 및 ｌ－아라비니톨 산화효소와의 커플링에 의한 ｌ－자일룰로스의 생산 | |
| KR0164284B1 (ko) | 로도구균으로 부터 분리한 원형 플라즈미드 | |
| JP6048716B2 (ja) | ウレアーゼ遺伝子を欠失又は不活性化させたロドコッカス属細菌 | |
| CN115895918A (zh) | 一种裂解性多糖单加氧酶及其应用 | |
| CN117660496A (zh) | 鼠李糖基转移酶sgt822及其应用 | |
| CN118222468A (zh) | 稳定遗传生物合成肌醇的基因工程菌株的构建方法及其应用 | |
| JP2645702B2 (ja) | アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼの製造法 | |
| KR20180020814A (ko) | 아밀로수크라제 효소의 발현 시스템 및 이를 이용한 투라노스의 생산 |