BR112021002184A2 - ácido nucleico, microrganismo, proteína, matriz sólida, coluna, método de produção de uma proteína e método de produção de alulose - Google Patents

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Abstract

ácido nucleico, microrganismo, proteína, matriz sólida, coluna, método de produção de uma proteína e método de produção de alulose. a presente divulgação fornece enzimas epimerase úteis para a produção em escala comercial de alulose a partir de frutose. as enzimas divulgadas (“variantes de epimerase”) são variantes de xilose isomerase de burkholderia multivorans cgd1 modificadas para terem atividade catalítica melhorada em cerca de 1,5 a 2 vezes em comparação com a enzima original.

Description

ÁCIDO NUCLEICO, MICRORGANISMO, PROTEÍNA, MATRIZ SÓLIDA, COLUNA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA E MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ALULOSE
[001] Cada referência, patente e pedido de patente publicado citados na presente divulgação são incorporados no presente documento por referência na sua totalidade.
[002] O presente pedido incorpora por referência um arquivo de texto de 178 kb criado em 31 de julho de 2018 e denominado “CP0178sequencelisting”, que é a listagem de sequências para o presente pedido.
CAMPO TÉCNICO
[003] A presente divulgação se refere em geral à produção de alulose.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[004] Figura 1. Gráfico mostrando o efeito da substituição de aminoácidos na fração de frutose convertida pela epimerase do tipo selvagem (204020, SEQ ID NO:6) e pelas variantes de epimerase 230338 (SEQ ID NO:16), 277285 (SEQ ID NO:90), 277286 (SEQ ID NO:92), 277287 (SEQ ID NO:94), 277288 (SEQ ID NO:96), 277289 (SEQ ID NO:98), e 277290 (SEQ ID NO:100). Barra esquerda de cada par, 200 mM; barra direita de cada par, 50% (p/p).
[005] Figura 2. Gráfico mostrando a expressão da epimerase do tipo selvagem (204020, SEQ ID NO:6) e das variantes de epimerase 230338 (SEQ ID NO:16), 277285 (SEQ ID NO:90), 277286 (SEQ ID NO:92), 277287 (SEQ ID NO:94), 277288 (SEQ ID NO:96), 277289 (SEQ ID NO:98), e 277290 (SEQ ID NO:100).
[006] Figura 3. Gráfico mostrando as atividades específicas da epimerase do tipo selvagem (204020, SEQ ID NO:6) e das variantes de epimerase 230338 (SEQ ID NO:16), 277285 (SEQ ID NO:90), 277286 (SEQ ID NO:92), 277287 (SEQ ID NO:94), 277288 (SEQ ID NO:96), 277289 (SEQ ID NO:98), e 277290 (SEQ ID NO:100). Barra esquerda de cada par, 200 mM; barra direita de cada par, 50% de SD.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[007] A presente divulgação fornece enzimas epimerase úteis para a produção em escala comercial de alulose a partir de frutose. As enzimas divulgadas (“variantes de epimerase”) são variantes de xilose isomerase de Burkholderia multivorans CGD1 (SEQ ID NO:6) modificadas para terem atividade catalítica melhorada em cerca de 1,5 a 2 vezes em comparação com a enzima original. A Tabela 1 abaixo identifica a sequência de aminoácidos de cada variante de epimerase na listagem de sequências em anexo e fornece um exemplo de uma sequência de ácido nucleico que codifica a variante. As diferenças de aminoácidos entre cada variante de epimerase e a enzima original (SEQ ID NO:6) estão resumidas na Tabela 2, na qual os números de aminoácidos se referem aos de SEQ ID NO:6. Tabela 1. Sequências de aminoácidos e exemplos de sequências codificantes de variantes de epimerase SEQ ID NO: ID do gene nucleotídica proteica 230338 15 16 256407 17 18 257999 39 40 261731 41 42 261732 43 44 261733 45 46
SEQ ID NO: ID do gene nucleotídica proteica 261734 47 48 261735 49 50 261736 51 52 261737 53 54 261738 55 56 261739 57 58 261740 59 60 261741 61 62 261742 63 64 261743 65 66 261744 67 68 261745 69 70 261746 71 72 261747 73 74 261748 75 76 261749 77 78 261750 79 80 261751 81 82 261752 83 84 261753 85 86 261754 87 88 277285 89 90 277286 91 92 277287 93 94 277288 95 96 277289 97 98 277290 99 100
Tabela 2. Variantes de epimerase
ID do gene Variações de aminoácidos de SEQ ID NO:6 230338 D89K S154T C167I
256407 D89K F111L N114Y R120A A121D S154T C167I 257999 R56K D89K N114Y A121R S154T C167I S266G 261731 R56K D89K N114Y R120A A121R S154T C167I G199A D209E S266G Y276F 261732 R56K T71C D89K N114Y R120A A121R S154T C167I D209E S266G Y276F 261733 R56K T71C D89K N114Y R120A A121R S154T C167I G199A D209E S266G 261734 R56K T71C D89K N114Y R120A A121R S154T C167I G199A S266G Y276F 261735 R56K T71C D89K N114Y A121R S154T C167I G199A D209E S266G Y276F 261736 R56K D89K N114Y R120A A121R S154T C167I D209E S266G Y276F 261737 R56K D89K N114Y R120A A121R S154T C167I G199A D209E S266G 261738 R56K T71C D89K N114Y R120A A121R S154T C167I D209E S266G 261739 R56K D89K N114Y A121R S154T C167I G199A D209E S266G Y276F 261740 R56K T71C D89K N114Y A121R S154T C167I D209E S266G Y276F 261741 R56K T71C D89K N114Y A121R S154T C167I G199A S266G Y276F 261742 R56K D89K N114Y R120A A121R S154T C167I G199A S266G Y276F 261743 R56K T71C D89K N114Y R120A A121R S154T C167I S266G Y276F 261744 R56K T71C D89K N114Y A121R S154T C167I G199A D209E S266G 261745 R56K T71C D89K N114Y R120A A121R S154T C167I G199A S266G 261746 E48D R56K H57Y D89K N114Y R120A A121R S154T C167I D209E S266G 261747 A43R R56K D89K N114Y R120A A121R S154T C167I G199A S266G Y276F 261748 R56K H57Y D89K N114Y A121R S154T C167I D209E Y276F 261749 A43R R56K D89K N114Y A121R S154T C167I G199A Y276F 261750 A43R E48D R56K T71C D89K N114Y A121R S154T C167I D209E S266G 261751 E48D R56K T71C D89K N114Y A121R S154T C167I D209E S266G Y276F 261752 A43R E48D R56K T71C D89K N114Y R120A A121R S154T C167I S266G 261753 R56K H57Y T71C D89K N114Y A121R S154T C167I G199A 261754 R56K H57Y D89K N114Y R120A A121R S154T C167I G199A 277285 D89K 277286 S154T 277287 C167I 277288 D89K S154T 277289 S154T C167I 277290 D89K C167I Ácidos nucleicos, vetores e microrganismos hospedeiros
[008] A presente divulgação fornece ácidos nucleicos que codificam as variantes de epimerase divulgadas descritas acima. A listagem de sequências fornece exemplos de sequências nucleotídicas que codificam essas variantes, mas qualquer sequência nucleotídica que codifica as variantes de epimerase pode ser usada.
[009] As sequências nucleotídicas podem ser otimizadas para expressão em várias espécies ou cepas de microrganismos, como é bem conhecido na técnica. Os microrganismos adequados incluem, mas não estão limitados a, Bacillus licheniformis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pseudomonas putida, Pichia sp., Aspergillus sp., Trichoderma reesei, Corynebacterium glutamicum, E. coli e B. subtilis. Os vetores contendo promotores e outras sequências reguladoras necessárias para a expressão de qualquer proteína nesses organismos são conhecidos e estão prontamente disponíveis para aqueles de habilidade comum na técnica.
[010] Os ácidos nucleicos que codificam as variantes da epimerase descritas acima podem ser incluídos em vetores nos quais uma sequência codificante está operacionalmente ligada a uma sequência reguladora adequada para expressão em um microrganismo hospedeiro desejado. A sequência reguladora inclui um sítio de ligação ao ribossomo de RNAm adequado e uma sequência para regulação da terminação da transcrição e tradução e pode incluir outros elementos, tais como um promotor ou operador. Uma vez presente em um microrganismo hospedeiro após transformação, o vetor pode se replicar ou funcionar independentemente do genoma do hospedeiro ou pode se integrar ao próprio genoma. O vetor que é usado não é especificamente limitado e pode ser qualquer vetor conhecido na técnica, desde que possa se replicar no hospedeiro.
[011] Um vetor pode incluir pelo menos um marcador de seleção, tal como um gene de resistência a antibiótico. Os antibióticos adequados incluem, por exemplo, amicacina, ampicilina, augmentin (amoxicilina mais ácido clavulônico), cefazolina, cefoxitina, ceftazidima, ceftiofur, cefalotina, cloranfenicol, enrofloxacina, florfenicol, gentamicina, imipenem, canamicina, penicilina, sarafloxicina, espectinomicina, estreptomicina, tetraciclina, ticarcilina e tilmicosina.
[012] Vetores podem ser usados para fazer com que um microrganismo produza uma ou mais das variantes de epimerase descritas acima. Os métodos de entrega de vetores a microrganismos são bem conhecidos e incluem, por exemplo, transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, microinjeção, transfecção mediada por lipídeos, eletroporação, conjugação e infecção. Métodos de produção de alulose
[013] As variantes de epimerase divulgadas no presente documento podem ser usadas para a produção em escala comercial de alulose a partir de frutose usando métodos bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, US 2017/0101637, US 2017/0298400, US 2016/0304853 e US 2016/0281076.
[014] Em algumas modalidades, uma variante de epimerase ou um extrato de um microrganismo compreendendo a variante de epimerase é ligado a uma matriz sólida e uma solução de entrada compreendendo frutose é passada sobre a matriz para converter pelo menos uma porção da frutose em alulose, que pode ser recuperada da corrente de saída. Opcionalmente, a alulose pode ser separada de outros componentes na corrente de saída e pode ser concentrada.
[015] Muitas matrizes sólidas adequadas para enzimas de ligação são bem conhecidas na técnica e incluem alginato (por exemplo, alginato de sódio), resinas AMBERLITETM (por exemplo, XAD®2, XAD®4, XAD®8, XAD®16 (Sigma Aldrich)), resinas SEPHADEX® ou resinas DUOLITETM (por exemplo, A568; Dow Chemical), e Purolite CR8415 e ECR 8314 (Purolite). Veja também WO 2016/160573 e WO 2016/191267. Os métodos para a imobilização de epimerases em um suporte são bem conhecidos pelo especialista na técnica. Veja, por exemplo, a patente dos E.U.A. 8.375.106.
[016] Em outras modalidades, um microrganismo que expressa uma variante de epimerase pode ser permeabilizado e imobilizado em grânulos de alginato, conforme descrito na patente dos E.U.A. 8.735.106, ou em argilas, carbono, terra diatomácea ou um hidrogel, tal como poliacrilamida.
[017] Os especialistas na técnica reconhecerão que existem inúmeras variações e permutações das modalidades descritas acima que se enquadram no escopo das reivindicações anexas. Exemplo 1. Geração de uma cepa de Bacillus subtilis sem marcador para a produção comercial de alulose epimerase
[018] Este exemplo descreve a geração de uma cepa de B. subtilis sem marcador que expressa alulose epimerase. Resumidamente, em uma primeira etapa, uma cepa de B. subtilis foi transformada com um cassete que codifica a epimerase de BMCGD1 e inclui um marcador de resistência a antibiótico. Este cassete se recombinou no cromossomo de Bacillus e nocauteou 8 kb de DNA, incluindo um grande agrupamento de genes de esporulação e o gene de biossíntese de lisina lysA. Em uma segunda etapa, um segundo cassete foi recombinado no cromossomo de B. subtilis, restaurando o gene lysA e removendo o DNA que codifica a resistência a antibiótico. A cepa 39 A10 de E. coli da coleção Keio foi usada para a passagem de DNA plasmidial antes da transformação de B. subtilis. O fenótipo relevante é uma deficiência na HsdM de DNA metilase que, caso contrário, seria encontrada em uma cepa K-12 do tipo selvagem de E. coli.
[019] Em detalhe, um cassete de 5120 pb (SEQ ID NO:1; DNA sintético da IDT, Coralville, IA) foi sintetizado e clonado em um vetor pIDT resistente à ampicilina padrão. O pedaço sintético codificou 700 pb a montante de lysA no cromossomo de B. subtilis, o marcador de antibiótico cat (651 pb), a proteína de ligação ao DNA lacI (1083 pb) e a alulose epimerase (894 pb), e incluiu 700 pb de homologia em dacF. Este vetor foi usado na transformação da cepa 39 A10 de E. coli (Baba et al., 2006), e DNA plasmidial foi preparado e usado na transformação das cepas 1A751 e 1A976 de B. subtilis.
[020] Os transformantes foram selecionados em LB suplementado com cloranfenicol. O replicon de pIDT é funcional em E. coli, mas não funciona em bactérias Gram positivas como B. subtilis. As colônias que surgiram, portanto, representaram um evento de integração no cromossomo. Na cepa 1A751, a morfologia das colônias nas placas foi usada para distinguir entre eventos de recombinação simples e dupla. O evento de recombinação dupla nocautearia os genes necessários para a esporulação, enquanto a recombinação simples não. Após três dias em placas de LB, as colônias capazes de esporulação eram marrons e opacas; as colônias com deficiência de esporulação eram mais translúcidas.
[021] A cepa 1A976 de B. subtilis com o cassete de alulose epimerase é auxotrófica para histidina e lisina e pode atingir eficiência de transformação muito alta após indução de xilose. Um DNA sintético de 1925 pb (SEQ ID NO:2) foi amplificado com iniciadores (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4) e Taq polimerase (Promega). Este produto de PCR codificou o gene lysA que foi deletado pela inserção no cassete de epimerase e 500 pb de homologia com lacI. Um evento de recombinação dupla bem-sucedido desse DNA deve resultar em colônias que são prototróficas para a lisina e sensíveis ao cloranfenicol; ou seja, todo o gene cat deve ser perdido.
[022] Os transformantes foram selecionados em meio mínimo de Davis suplementado com histidina. As colônias que surgiram foram caracterizadas por PCR e semeadura por esgotamento em LB com e sem cloranfenicol. As cepas que amplificaram o DNA introduzido e que eram sensíveis ao cloranfenicol foram posteriormente caracterizadas e seu DNA cromossômico foi extraído.
[023] A cepa 1A751 contendo a alulose resistente ao cloranfenicol foi transformada com este DNA cromossômico e selecionada em meio mínimo de Davis suplementado com histidina. Os transformantes foram semeados por semeadura por esgotamento em LB com e sem cloranfenicol e caracterizados enzimaticamente como descrito abaixo. Exemplo 2. Análise dos níveis de proteína de epimerase
[024] Os níveis de proteína de epimerase em lisados brutos e solúveis foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida em géis de 4 a 12% de Bis-Tris NuPAGE (NUPAGE®) (Invitrogen). Os níveis de proteína foram determinados por densitometria de géis corados com SimplyBlue
(SIMPLYBLUETM) Safe Stain (Invitrogen) usando padrões de quantificação de proteínas. Exemplo 3. Expressão da epimerase de BMCGD1 em B. subtilis
[025] Uma construção de pHT254 que abriga o gene da epimerase de BMCGD1 foi otimizado com relação aos códons para expressão em B. subtilis (SEQ ID NO:5) e usada para transformação da cepa DP1077 de B. subtilis. A cepa DP1077 é um derivado com deficiência de esporulação (∆spoIIG::ZeoR) da cepa 1A976 do Bacillus Genetic Stock Center (Em his nprE18 aprE3 eglS(DELTA)102 bglT/bglS(DELTA)EV lacA::PxylA-comK). Além de ter deficiência de esporulação, a cepa tem deficiência na sua capacidade de secreção de protease neutra e a subtilisina como resultado de mutações nos genes nprE e aprE, respectivamente. A cepa adicionalmente carrega um cassete de expressão que coloca o fator de competência, comK, sob o controle de um promotor induzível por xilose para a produção simples de células competentes.
[026] Os transformantes foram selecionados e cultivados em meio de Azure personalizado sem Mn2+ e Co2+ (Teknova) suplementado com 1% de glicose e 5 µg/mL de cloranfenicol ou em meio mínimo de Davis (HiMedia) suplementado com 2 g/L de mistura de aminoácidos completa sintética (MP Biomedicals), 1% de glicose e 5 µg/mL de cloranfenicol. As culturas foram cultivadas a 37 °C durante 16 h. Quarenta µL desta cultura foram usados para inocular 2 mL de meio fresco, e a cultura resultante foi incubada a 37 °C até o crescimento logarítmico médio (DO a 600 nm de ~0,7). A cultura foi então induzida com IPTG 1 mM e a incubação foi continuada a 37 °C durante 4 horas ou 24 °C durante 20 h.
[027] As células foram colhidas por centrifugação, congeladas e descongeladas duas vezes, e lisadas usando o protocolo de lise completo PeriPreps (PERIPREPSTM) (Epicentre). As proteínas solúveis nos lisados foram preparadas por coleta das frações de sobrenadante após a centrifugação dos lisados brutos.
[028] Os níveis de proteína de epimerase em lisados brutos e solúveis foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida, conforme descrito acima no Exemplo 2. Exemplo 4. Geração de variantes de epimerase
[029] Com base em métodos descritos em US
8.635.029, alterações nucleotídicas que codificam variações de aminoácidos foram introduzidas na sequência codificante otimizada de BMCGD1 e usadas para gerar sequências codificantes para variantes de epimerase. Estas sequências codificantes foram inseridas em pHT254 (MoBiTech, Inc.). Este vetor expressa um gene de interesse a partir de um promotor Pgrac100 forte que é derivado do promotor que precede o operon groESL de Bacillus subtilis. Ele contém elementos reguladores aprimorados fundidos ao operador lac permitindo a indução por IPTG e um forte sítio de ligação ribossômica. Os nucleotídeos foram otimizados nas regiões conservadas do promotor groESL, incluindo o elemento UP, a região -35 e a região -15 (Phan et al., 2012). Cada sequência codificante foi clonada no vetor de expressão pHT254 nos sítios de restrição BamHI e XmaI.
[030] Os vetores foram então usados na transformação da cepa DB1077 de Bacillus subtilis, conforme descrito acima. Os transformantes foram selecionados em meio LB com ágar contendo 5 µg/mL de cloranfenicol.
[031] Noventa e seis transformantes de B. subtilis foram colhidos e transferidos para meio mínimo de Davis. O meio mínimo de Davis foi preparado usando água de grau reagente e em um volume final de 1 L, 10,6 g de caldo mínimo de Davis sem dextrose (HIMEDIA n.º de catálogo M390- 500G) com 2 g de mistura de aminoácidos completa sintética (MP Biomedicals n.º de catálogo 4400-022) e autoclavado por 15 min a 121 ºC. Antes da utilização, foi adicionada glicose a 1% e cloranfenicol a 5 µg/mL. Exemplo 5. Triagem de transformantes quanto à atividade de epimerase
[032] Para a triagem de epimerase de D-frutose para D-alulose, os transformantes foram colhidos e transferidos para 600 µL de meio mínimo de Davis (HiMedia) suplementado com 2 g/L de aminoácido completo sintético (MP Biomedicals), 1% de glicose e 5 µg/mL de cloranfenicol. As células foram cultivadas até log médio a 37 °C, depois induzidas com IPTG por 20 h a 24 °C. As células foram colhidas por centrifugação e lisadas usando o protocolo de lise PeriPreps (Epicentre) em um volume final de 75 µL. A expressão de proteína solúvel foi analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida em géis de 4 a 12% de Bis-Tris NuPAGE (Invitrogen) e os níveis de proteína foram determinados por densitometria contra padrões de quantificação. A epimerase solúvel recuperada variou de 1 a 10 µg/mL de cultura.
[033] Para a atividade de epimerase dos lisados derivados de B. subtilis, as reações foram avaliadas em um volume de 100 µL: 10% v/v de lisado clarificado, quantidade baixa (200 mM) ou alta (50% p/p) de frutose, e MgCl2 5 mM. As reações foram incubadas a 70 °C durante 2 h e interrompidas pela adição de 10% em volume de HCl a 2% e resfriamento a 4 °C. As reações foram filtradas através de uma membrana de PES com um peso molecular de corte de 10 kDa (Pall) antes da análise de HPLC.
[034] Os resultados são mostrados na Tabela 3. Tabela 3. Expressão e perfil de conversão de frutose em alulose de 2 horas de variantes de epimerase ID da Expressão Frutose_50% p/p, Alulose_50% p/p, ponto variante [ng/mL] ponto de tempo 2,0 h, de tempo 2,0 h, pH 5,0 pH 5,0 230338 16,1 44,07 0,96 256407 23,8 44,37 1,12 257999 11,8 44,57 1,25 261731 10,8 43,33 1 261732 17,6 43,33 1,59 261733 16,1 43,15 1,4 261734 15,2 43,22 1,42 261735 11,4 43,57 0,96 261736 17,4 43,08 1,33 261737 11,6 43,21 1,06 261738 21 43,95 1,51 261739 7,5 43,31 0,73 261740 15,3 43,48 1,32 261741 11,5 43,37 1,22 261742 13 43,52 1,21 261743 21 41,76 1,92 261744 13,5 43,19 1,11 261745 19 41,67 1,55 261746 24,6 42,05 1,85 261747 9,52 44,12 0,96 261748 18,3 43,06 1,37 261749 8,28 43,54 0,92 261750 16,7 43,88 1,4 261751 17,6 43,88 1,46
261752 21,4 42,66 1,82 261753 20,4 39,04 1,6 261754 19,6 42,83 1,68 Exemplo 6. Análise comparativa da epimerase do tipo selvagem e variantes de epimerase com uma, duas ou três substituições de aminoácidos
[035] A fração de frutose convertida em alulose por variantes de epimerase com uma, duas ou três das substituições de aminoácidos na variante 230338 (D89K, S154T e C167I) foi testada sob duas condições (10% v/v de lisado clarificado, quantidade baixa (200 mM) ou alta (50% p/p) de frutose, MES 50 mM, pH 5,0, e MgCl2 5 mM) e comparada com a epimerase do tipo selvagem. Os resultados são mostrados na Figura 1, em que a barra esquerda de cada par de barras representa a fração de conversão de frutose em alulose após 1 hora, começando com frutose 200 mM, e a barra direita de cada par de barras representa a fração de conversão de frutose em alulose após 2 horas, começando com 50% p/p de frutose. As substituições de aminoácidos presentes em cada variante são mostradas na grade acima do gráfico de barras e as sequências de aminoácidos das variantes são fornecidas em SEQ ID NO:16 (variante 230338), SEQ ID NO:90 (variante 277285), SEQ ID NO: 92 (variante 277286), SEQ ID NO: 94 (variante 277287), SEQ ID NO: 96 (variante 277288), SEQ ID NO: 98 (variante 27289) e SEQ ID NO:100 (variante 27290). “204020” é a epimerase do tipo selvagem (SEQ ID NO:6). A expressão de epimerase (µg/mL) é mostrada na Figura 2. A atividade específica (frutose convertida por µg/mL de epimerase) é mostrada na Figura 3.
[036] Este exemplo demonstra que a variante tripla foi cataliticamente mais ativa nas condições em que a enzima foi avaliada. A variante com todas as três substituições (D89K, S154T e C167I) teve a expressão mais alta e foi a enzima mais ativa tanto em frutose 200 mM quanto em frutose a 50% (p/p).
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Claims (8)

REIVINDICAÇÕES
1. ÁCIDO NUCLEICO, caracterizado por codificar uma proteína, em que a sequência de aminoácidos da proteína é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS:16, 18, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, e 100.
2. MICRORGANISMO, caracterizado por compreender o ácido nucleico conforme definido na reivindicação 1.
3. MICRORGANISMO, de acordo com a reivindicação 2, sendo o microrganismo caracterizado por ser selecionado do grupo que consiste em Bacillus licheniformis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pseudomonas putida, Pichia sp., Aspergillus sp., Trichoderma reesei, Corynebacterium glutamicum, E. coli, e B. subtilis.
4. PROTEÍNA, caracterizada por compreender uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS:16, 18, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, e 100.
5. MATRIZ SÓLIDA, caracterizada por compreender a proteína conforme definida na reivindicação 4.
6. COLUNA, caracterizada por compreender a matriz sólida, conforme definida na reivindicação 5, e ser configurada para receber uma solução de entrada compreendendo frutose sobre a matriz sólida e para permitir a saída de uma solução de saída compreendendo alulose.
7. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA, compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS:16, 18, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58,
60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, e 100, caracterizado por compreender: (a) cultivar o microrganismo conforme definido na reivindicação 2; e (b) recuperar a proteína.
8. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ALULOSE, caracterizado por compreender colocar uma solução compreendendo frutose em contato com uma proteína conforme definida na reivindicação 4 por um tempo e sob condições adequados para converter pelo menos uma porção da frutose em alulose.
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