ES2948297T3

ES2948297T3 - Método para preparar bibliotecas de polinucleótidos molde

Info

Publication number: ES2948297T3
Application number: ES19166621T
Authority: ES
Inventors: Niall Gormley; Geoffrey Smith; David Bentley; Roberto Rigatti
Original assignee: Illumina Cambridge Ltd
Current assignee: Illumina Cambridge Ltd
Priority date: 2005-11-01
Filing date: 2006-10-31
Publication date: 2023-09-08
Anticipated expiration: 2026-10-31
Also published as: US20160355880A1; EP2423325A1; US10253359B2; WO2007052006A1; ES2450047T3; EP1954818A1; US8563478B2; US11142789B2; US20220064721A1; ES2450047T5; DK3564394T3; US20190292587A1; EP4249602A2; US7741463B2; US9376678B2; EP1954818B2; EP4249602A3; US20140066335A1; EP1954818B1; US20100273662A1

Abstract

La invención proporciona un método para preparar una biblioteca de polinucleótidos molde que tienen secuencias comunes en sus extremos 5' y 3', y también el uso de la biblioteca de moldes en métodos de amplificación de ácidos nucleicos en fase sólida. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para preparar bibliotecas de polinucleótidos molde

Campo de la invención

La invención se refiere a un método para preparar una biblioteca de polinucleótidos molde y también al uso de la biblioteca de moldes en métodos de amplificación de ácidos nucleicos en fase sólida. En particular, la invención se refiere a un método para preparar de una biblioteca de polinucleótidos molde que tienen secuencias comunes en sus extremos 5' y en sus extremos 3'.

Antecedentes de la invención

En la actualidad, la biología molecular y el desarrollo de fármacos hacen un uso intensivo del análisis de ácidos nucleicos. Las áreas más conflictivas son las de secuenciación del genoma completo, detección de polimorfismo de un solo nucleótido, cribado y control de la expresión génica, que normalmente requieren análisis de grandes cantidades de ácido nucleico.

Un área de la tecnología que revolucionó el estudio de los ácidos nucleicos fue el desarrollo de las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las reacciones de amplificación, tales como la PCR, pueden permitir al usuario amplificar específica y selectivamente un ácido nucleico diana particular de interés a partir de una mezcla compleja de ácidos nucleicos. Sin embargo, existe la necesidad constante de técnicas de amplificación de ácidos nucleicos que permitan la amplificación simultánea de mezclas complejas de moldes de diversa secuencia, tales como fragmentos de ADN genómico (por ejemplo, amplificación del “genoma completo” ) o bibliotecas de ADNc, en una única reacción de amplificación.

La amplificación por PCR no puede producirse en ausencia de hibridación de cebadores de amplificación directos e inversos con las secuencias de unión del cebador en el molde que se va a amplificar en las condiciones de las etapas de hibridación de la reacción PCR, es decir, si no hay suficiente complementariedad entre los cebadores y el molde. Por lo tanto, se requiere cierto conocimiento previo de la secuencia del molde antes de poder realizar una reacción PCR para amplificar un molde específico, a menos que se utilicen cebadores al azar con la consiguiente pérdida de especificidad. Normalmente, el usuario debe conocer de antemano la secuencia de al menos los sitios de unión del cebador en el molde para poder diseñar los cebadores apropiados, aunque la secuencia restante del molde puede ser desconocida. La necesidad de conocimiento previo de la secuencia del molde aumenta la complejidad y el coste de la amplificación por PCR de mezclas complejas de moldes, tales como fragmentos de ADN genómico.

Los documentos WO 98/44151 y WO 00/18957 describen métodos para formar matrices de polinucleótidos basadas en amplificación de ácidos nucleicos en “fase sólida” , que es análoga a una reacción en cadena de la polimerasa en donde los productos de amplificación están inmovilizados sobre un soporte sólido para formar matrices comprendidas por agrupaciones o “colonias” de ácido nucleico. Cada agrupación o colonia en tal matriz se forma a partir de una pluralidad de cadenas de polinucleótidos idénticas inmovilizadas y una pluralidad de cadenas de polinucleótidos complementarias inmovilizadas idénticas. Las matrices así formadas se denominan generalmente en el presente documento “matrices agrupadas” y sus características generales se entenderán por referencia a los documentos WO 98/44151 o WO 00/18957.

Como se ha mencionado anteriormente, los métodos de amplificación en fase sólida de los documentos WO 98/44151 y WO 00/18957 son básicamente una forma de la reacción en cadena de la polimerasa realizada sobre un soporte sólido. Como cualquier reacción PCR, estos métodos requieren el uso de cebadores de amplificación directos e inversos (que pueden ser idénticos o diferentes) que pueden hibridarse con un molde a amplificar. En los métodos de los documentos WO 98/44151 y WO 00/18957 ambos cebadores se inmovilizan sobre el soporte sólido en el extremo 5'. Se conocen otras formas de amplificación en fase sólida en las que solo un cebador está inmovilizado y el otro está presente en la solución libre (Mitra, R.D y Church, G.M., Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, N.° 24).

En común con todas las técnicas de PCR, la amplificación por PCR en fase sólida requiere el uso de cebadores de amplificación directos e inversos que incluyen secuencias de nucleótidos “específicas de molde” que pueden hibridarse con secuencias en el molde a amplificar, o el complemento de las mismas, en condiciones de las etapas de hibridación de la reacción PCR. Las secuencias en el molde con el que los cebadores se hibridan en condiciones de la reacción PCR pueden denominarse en el presente documento secuencias “de unión a cebador” .

Determinadas realizaciones de los métodos descritos en los documentos WO 98/44151 y WO 00/18957 utilizan cebadores “universales” para amplificar moldes que comprenden una parte molde variable que se desea amplificar flanqueada en 5' y 3' por secuencias de unión a cebador común o “universal” . Los cebadores directo e inverso “universales” incluyen secuencias que pueden hibridarse con las secuencias de unión a cebador “universal” en la construcción molde. La parte molde variable puede en sí misma ser de secuencia conocida, desconocida o parcialmente conocida. Este enfoque tiene la ventaja de que no es necesario diseñar un par específico de cebadores para cada molde a amplificar; pueden utilizarse los mismos cebadores para la amplificación de diferentes moldes siempre que cada molde se modifique por la adición de las mismas secuencias de unión a cebador universal en sus extremos 5' y 3'. Por lo tanto, la secuencia molde variable puede ser cualquier fragmento de ADN de interés. Se puede utilizar un enfoque análogo para amplificar una mezcla de moldes, tal como una pluralidad o biblioteca de moléculas de ácido nucleico molde (por ejemplo, fragmentos de ADN genómico), utilizando un solo par de cebadores directos e inversos universales, siempre que cada molécula molde en la mezcla se modifique por la adición de las mismas secuencias de unión a cebador universal.

Dichos enfoques de “cebador universal” para amplificación por PCR, y en particular amplificación por PCR en fase sólida, son ventajosos ya que permiten que puedan realizarse múltiples moléculas molde de secuencia igual o diferente, conocida o desconocida, a amplificar en una única reacción de amplificación, que puede realizarse en un soporte sólido que lleva un solo par de cebadores “ universales” . La amplificación simultánea de una mezcla de moldes de diferentes secuencias por PCR requeriría por otro lado una pluralidad de pares de cebadores, siendo cada par complementario a cada molde exclusivo en la mezcla. La generación de una pluralidad de pares cebadores para cada molde individual no es una opción viable para mezclas complejas de moldes.

La adición de secuencias de cebador universal sobre los extremos de los moldes a amplificar por PCR puede conseguirse mediante diversos métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un cebador universal que consiste en una secuencia universal en su extremo 5' y una secuencia degenerada en su extremo 3' se puede utilizar en una PCR (DOP-PCR, por ejemplo, PNAS 1996 vol. 93 páginas 14676-14679) para amplificar fragmentos al azar a partir de un molde complejo o una mezcla compleja de moldes. La parte 3' degenerada del cebador se hibrida en posiciones al azar sobre ADN y puede extenderse para generar una copia del molde que tiene la secuencia universal en su extremo 5'.

Como alternativa, pueden ligarse adaptadores que contengan secuencias de cebador universal en los extremos de los moldes. Los adaptadores pueden monocatenarios o bicatenarios. Sin son bicatenarios, pueden tener extremos sobresalientes que son complementarios a los extremos sobresalientes de las moléculas molde que se han generado con una endonucleasa de restricción. Como alternativa, los adaptadores bicatenarios pueden ser romos, en cuyo caso los moldes también tienen extremos romos. Los extremos romos de los moldes pueden haberse formado durante un proceso para cizallar el ADN en fragmentos, o pueden haberse formado mediante una reacción de reparación de extremos, como conocen los expertos en la técnica.

Puede utilizarse un solo adaptador o dos adaptadores diferentes en una reacción de ligadura con moldes. Si un molde se ha manipulado de tal manera que sus extremos son iguales, es decir, ambos son romos o ambos tienen el mismo saliente, entonces la ligadura de un solo adaptador compatible generará un molde con ese adaptador en ambos extremos. Sin embargo, si se utilizan dos adaptadores compatibles, adaptador A y adaptador B, entonces se forman tres permutaciones de productos ligados: molde con adaptador A en ambos extremos, molde con adaptador B en ambos extremos, y molde con adaptador A en un extremo y adaptador B en el otro extremo. Este último producto es, en algunas circunstancias, el único producto deseado de la reacción de ligadura y, en consecuencia, se requieren etapas de purificación adicionales después de la reacción de ligadura para purificarlo de los productos de ligadura que tengan el mismo adaptador en ambos extremos.

La presente invención que se presenta en el presente documento es un método que utiliza un solo adaptador en una reacción de ligadura para generar una biblioteca de polinucleótidos molde, cada uno de los cuales tiene secuencias de cebador universal comunes, pero diferentes, en sus extremos 5' y 3'. El método puede aplicarse para preparar mezclas simples o complejas de moldes para amplificación, por ejemplo, una superficie sólida, utilizando secuencias de cebador, sin conocimiento previo de secuencias molde. La invención puede aplicarse para la preparación de moldes a partir de muestras complejas tales como genomas completos o mezclas de ADNc, así como aplicaciones monomolde.

Resumen de la invención

La invención proporciona un método como se define en las reivindicaciones para generar una biblioteca de moléculas polinucleotídicas molde que tienen secuencias comunes en sus extremos 5' y secuencias comunes en sus extremos 3', en donde las secuencias comunes en el extremo 5' de cada molde individual de la biblioteca no son idénticas ni totalmente complementarias a las secuencias comunes en el extremo 3' de dicho molde, comprendiendo el método:

ligar polinucleótidos adaptadores con emparejamiento erróneo idénticos en ambos extremos de cada uno de uno o más dúplex de polinucleótido diana para formar una o más construcciones adaptador-diana, en donde cada adaptador con emparejamiento erróneo se forma a partir de dos cadenas de polinucleótidos hibridadas que forman un complejo biomolecular que comprende al menos una región bicatenaria y una región no emparejada, y

realizar una reacción de extensión de cebador inicial en la que un oligonucleótido cebador se hibrida con una parte de adaptador de cada una de las construcciones adaptador-diana y se extiende por adición secuencial de nucleótidos para formar productos de extensión complementarios al menos a una cadena de cada una de las construcciones adaptador-diana, en donde el oligonucleótido es un cebador con cola que comprende una secuencia con cola no hibridante en el extremo 5',

amplificar los productos de extensión formados en la reacción de extensión de cebador inicial mediante la realización de una reacción en cadena de la polimerasa en fase de solución, y

recoger los productos de amplificación de la reacción PCR para proporcionar una biblioteca de moléculas polinucleotídicas molde que tienen secuencias comunes en sus extremos 5' y secuencias comunes en sus extremos 3'; en donde los dúplex de polinucleótido diana a ligar son una mezcla compleja de fragmentos de ADN genómico que representan un genoma completo o sustancialmente completo, y en donde la biblioteca de moléculas polinucleotídicas molde generadas es representativa del genoma completo o sustancialmente completo.

La invención también refiere al uso de una biblioteca de moléculas polinucleotídicas molde preparadas según el método de la invención como un molde para la amplificación por PCR en fase sólida. Por lo tanto, en una realización particular, la invención proporciona un método de amplificación de ácidos nucleicos en fase sólida de moléculas polinucleotídicas molde que comprende:

preparar una biblioteca de moléculas polinucleotídicas molde que tienen secuencias comunes en sus extremos 5' y 3' utilizando el método según el primer aspecto de la invención y realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico en fase sólida en donde dichas moléculas polinucleotídicas molde se amplifican.

La invención también refiere al uso de una biblioteca de moléculas polinucleotídicas molde preparadas según el método de la invención como un molde para la amplificación del genoma completo. Por lo tanto, en una realización particular, la invención proporciona un método de amplificación del genoma completo que comprende:

utilizar el método según la invención para preparar una biblioteca de moléculas polinucleotídicas molde que tienen secuencias comunes en sus extremos 5' y 3' a partir de una mezcla compleja de fragmentos de genoma completo y realizar una reacción de amplificación del genoma completo en donde dichas moléculas polinucleotídicas molde se amplifican.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras relacionadas con la materia objeto no incluida en las reivindicaciones son con fines de referencia.

La figura 1 ilustra varios ejemplos de adaptadores con emparejamiento erróneo bifurcados para su uso en el método de la invención, que representan específicamente diferentes estructuras de extremo romo o sobresalientes permisibles en el extremo “ ligable” del adaptador. La figura 1 (e) ilustra esquemáticamente los componentes de secuencia de dos cadenas parcialmente complementarias (denominadas oligo A y oligo B) que forman el adaptador bifurcado cuando están hibridadas. El extremo 5' del oligo B es complementario (COMP) a una parte de la secuencia SEC CEBADOR en el oligo A. El oligo A incluye un solo saliente de nucleótido “T” en el extremo 3'. El extremo 5' del oligo A está fosforilado. P representa un grupo fosfato terminal; X e Y representan funcionalidades de captura de superficie.

La figura 2 ilustra una realización del método de la invención basado en el uso de los adaptadores bifurcados ilustrados en la figura 1. La figura 2(a) representa las etapas de fragmentación de una muestra compleja tal como ADN genómico para generar una pluralidad de fragmentos dúplex diana, ligadura de fragmentos dúplex diana con adaptadores con emparejamiento erróneo (bifurcados) para generar construcciones adaptador-molde y eliminación de adaptadores no unidos. El adaptador bifurcado incluye un grupo de biotina en el extremo 5' que no está ligado al fragmento diana para facilitar la captura en fase sólida de las construcciones adaptador-diana, por ejemplo, sobre perlas magnéticas de estreptavidina. La figura 2(b) representa una reacción de extensión de cebador inicial en la que los cebadores se hibridan con regiones de adaptador con emparejamiento erróneo en cada cadena de una construcción adaptador-diana y se extienden para generar productos de extensión complementarios a cada cadena de la construcción adaptador-diana. Con fines de simplicidad, las etapas de ligadura y de extensión de cebador se ilustran para una sola construcción adaptador-diana.

La figura 3 ilustra una realización alternativa de la invención en la que las construcciones adaptador-diana se someten a rondas múltiples de hibridación con cebador y extensión para generar múltiples copias monocatenarias de cada construcción adaptador-diana. Con fines de simplicidad, las etapas de extensión de cebador se ilustran para una sola construcción adaptador-diana.

La figura 4 ilustra otra realización adicional de la invención en la que las construcciones adaptador-diana se someten a amplificación por PCR para generar múltiples copias bicatenarias de cada construcción adaptador-diana. Con fines de simplicidad, la amplificación por PCR se ilustra para una sola construcción adaptador-diana.

La figura 5 ilustra una realización de la invención, que representa etapas de fragmentación de una muestra compleja tal como ADN genómico para generar una pluralidad de fragmentos diana, ligadura de los fragmentos diana con adaptadores con emparejamiento erróneo (bifurcados) para generar construcciones adaptador-molde y posteriormente la eliminación de los adaptadores no unidos, en donde los adaptadores no incluyen un grupo de biotina en el extremo 5'. Las construcciones adaptador-diana resultantes pueden someterse a amplificación por PCR para generar múltiples copias bicatenarias de cada construcción adaptador-diana. Con fines de simplicidad, las etapas de ligadura se ilustran para una sola construcción adaptador-diana.

La figura 6 ilustra ejemplos adicionales de adaptadores con emparejamiento erróneo bifurcados para su uso en el método de la invención, representando de nuevo los formatos permisibles romo y sobresalientes en el extremo “ ligable” del adaptador” . La figura 6(e) ilustra esquemáticamente las secuencias componentes presentes en las dos cadenas (denominadas oligo C y oligo B) que forman el adaptador cuando están hibridadas. P representa un grupo fosfato terminal; X e Y representan funcionalidades de captura de superficie.

La figura 7 ilustra otra realización adicional de la invención basada en el uso de los adaptadores bifurcados ilustrados en la figura 6. La figura 7(a) representa etapas de fragmentación y ligadura sustancialmente similares a las ilustradas en la figura 5. La figura 7(b) representa la amplificación por PCR posterior utilizando cebadores PCR “con cola” que tienen secuencias del extremo 3' complementarias a una secuencia del extremo 5' del adaptador, e ilustra esquemáticamente la composición de secuencias de los productos de amplificación bicatenarios formados en la reacción PCR. Con fines de simplicidad, las etapas de ligadura y amplificación por PCR se ilustran para una sola construcción adaptador-diana.

La figura 8 ilustra realizaciones alternativas de adaptadores con emparejamiento erróneo para su uso en el método de la invención. P representa un grupo fosfato terminal; X e Y representan funcionalidades de captura de superficie; X y Z representas modificaciones para impedir la ligadura.

La figura 9a ilustra otra realización adicional de la invención basada en el uso de los adaptadores alternativos ilustrados en la figura 8. La figura 9(a) representa la fragmentación, la ligadura y la posterior eliminación de adaptadores no unidos. La figura 9(b) representa la hibridación de cebadores de amplificación idénticos con una región bicatenaria del adaptador en cada cadena de la construcción adaptador-diana. Las construcciones adaptador-diana se pueden amplificar mediante PCR utilizando esta única especie de cebador. Con fines de simplicidad, las etapas de ligadura y la hibridación con cebador se ilustran para una sola construcción adaptador-diana.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona un método como se define en las reivindicaciones para generar una biblioteca de moléculas polinucleotídicas molde que tienen secuencias comunes en sus extremos 5' y 3'. En este contexto, el término “común” se interpreta que significa común a todos los moldes en la biblioteca. Como se explica con más detalle a continuación, todos los moldes dentro de la biblioteca contendrán regiones de secuencia común en (o próximas a) sus extremos 5' y 3', en donde la secuencia común en el extremo 5' de cada molde individual en la biblioteca no es idéntica y no es totalmente complementaria a la secuencia común en el extremo 3' de dicho molde.

El término “ biblioteca” se refiere únicamente a una colección o pluralidad de moléculas molde que comparten secuencias comunes en sus extremos 5' y secuencias comunes en sus extremos 3'. El uso del término “biblioteca” para referirse a una colección o pluralidad de moléculas molde no debería considerarse que implica que los moldes que constituyen la biblioteca procedan de una fuente particular, o que la “ biblioteca” tenga una composición particular. A modo de ejemplo, el uso del término “ biblioteca” no debería considerarse que implica que los moldes individuales dentro de la biblioteca deban ser de diferente secuencia de nucleótidos o que los moldes estén relacionados en cuanto a secuencia y/o fuente. La descripción describe la formación de las denominadas bibliotecas de “ monomoldes” , que comprenden múltiples copias de un único tipo de molécula molde, cada una de las cuales tiene secuencias comunes en sus extremos 5' y 3', así como bibliotecas “complejas” en donde muchas, si no todas, las moléculas molde individuales comprenden diferentes secuencias diana (como se define a continuación), aunque todas comparten secuencias comunes en sus extremos 5' y 3'. Dichas bibliotecas de moldes complejas pueden prepararse utilizando el método de la invención a partir de una mezcla compleja de polinucleótidos diana tales como (pero sin limitación) fragmentos de ADN genómico al azar, bibliotecas de ADNc, etc. La descripción también describe bibliotecas “complejas” formadas mezclando varias bibliotecas de “ monomoldes” individuales, cada una de las cuales se ha preparado por separado utilizando el método de la invención a partir de un único tipo de molécula diana (es decir, un monomolde). En aspectos de la descripción, más del 50 %, o más del 60 %, o más del 70 %, o más del 80 %, o más del 90 %, o más del 95 % de los moldes polinucleotídicos individuales en una biblioteca compleja pueden comprender diferentes secuencias diana, aunque todos los moldes en una biblioteca determinada compartirán una secuencia común en sus extremos 5' y una secuencia común en sus extremos 3'.

El uso del término “ molde” para referirse a moléculas polinucleotídicas individuales en la biblioteca indica meramente que una o dos cadenas de los polinucleótidos en la biblioteca pueden actuar como moldes para la polimerización de ácidos nucleicos dependiente de molde catalizada por una polimerasa. El uso de este término no debe considerarse como limitante del alcance de la invención con respecto a bibliotecas de polinucleótidos que se utilizan en realidad como moldes en una reacción de polimerización catalizada por enzimas posterior.

La biblioteca se forma ligando moléculas polinucleotídicas adaptadoras idénticas (“ adaptadores con emparejamiento erróneo” , cuyas características generales se definen a continuación) en los extremos 5' y 3' de uno o más dúplex de polinucleótido diana (que pueden ser de secuencia conocida, parcialmente conocida o desconocida) para formar construcciones adaptador-diana y a continuación realizando una reacción de extensión de cebador inicial en la que se forman productos de extensión complementarios a ambas cadenas de cada construcción adaptador-diana individual. Los productos de extensión de cebador resultantes y opcionalmente copias amplificadas de los mismos, proporcionan en su conjunto una biblioteca de polinucleótidos molde.

Por lo tanto, cada cadena de cada molécula molde en la biblioteca formada en la reacción de extensión de cebador tendrá la siguiente estructura, cuando se observa como una sola cadena:

5'-[secuencia común I]-[secuencia diana]-[secuencia común II]-3'

en donde “ secuencia común I” representa una secuencia procedente de copiar una primera cadena del adaptador con emparejamiento erróneo y es común a todas las moléculas molde en la biblioteca generada en la reacción de extensión de cebador inicial;

“diana” representa una secuencia procedente de una cadena del dúplex de polinucleótido diana y puede ser diferente en moléculas molde individuales diferentes dentro de la biblioteca; y

“ secuencia común II” representa una secuencia procedente de la copia de una segunda cadena del adaptador con emparejamiento erróneo y también es común a todas las moléculas molde en la biblioteca generada en la reacción de extensión de cebador inicial.

Puesto que “secuencia común I” y “ secuencia común II” son comunes a todas las cadenas molde en la biblioteca, pueden incluir secuencias de unión a cebador “universal” , que permiten que todos los moldes en la biblioteca se amplifiquen finalmente en un procedimiento de PCR en fase sólida utilizando cebadores universales.

Sin embargo, es una característica clave de la invención que las secuencias comunes en el extremo 5' y 3' denominadas “ secuencia común I” y “ secuencia común II” no sean completamente complementarias entre sí, lo que significa que cada cadena molde individual puede contener diferentes secuencias de cebador universal (y no complementarias) en sus extremos 5' y 3'.

Generalmente, esto es ventajoso para bibliotecas complejas de moldes a amplificar por PCR (por ejemplo, amplificación del genoma completo) ya se realice en solución o en un soporte sólido, para incluir regiones de secuencia “diferente” en sus extremos 5' y 3', que sin embargo son comunes a todas las moléculas molde en la biblioteca, especialmente si los productos de amplificación se secuencian finalmente. Por ejemplo, la presencia de una secuencia única común en un extremo solamente de cada molde en la biblioteca puede proporcionar un sitio de unión para un cebador de secuenciación, lo que permite que una cadena de cada molde en la forma amplificada de la biblioteca se secuencie en una sola reacción de secuenciación utilizando un solo tipo de cebador de secuenciación.

Normalmente, la “secuencia común I” y la “secuencia común II” consistirán en no más de 100, o no más de 50 o no más de 40 nucleótidos consecutivos en los extremos 5' y 3', respectivamente, de cada cadena de cada polinucleótido molde. La longitud exacta de las dos secuencias puede o no ser idéntica. Las secuencias de nucleótidos de la “secuencia común I” y la “ secuencia común II” en los polinucleótidos molde se determinará en parte por las secuencias de las cadenas adaptadoras ligadas a los polinucleótidos diana y en parte por la secuencia del cebador utilizado en la reacción de extensión de cebador inicial y cualquier ronda posterior de amplificación de ácidos nucleicos.

En realizaciones en donde el producto de extensión de cebador inicial se somete a amplificación adicional mediante PCR convencional, los productos de la reacción de amplificación serán polinucleótidos bicatenarios, una cadena de los cuales tiene la estructura:

5'-[secuencia común I]-[secuencia diana]-[secuencia común II]-3'

Se apreciará que la “secuencia común II” en los productos de amplificación pueden diferir algo con respecto a la “secuencia común II” presente en los productos de la región de extensión de cebador inicial, ya que esta última se determinará en parte por la secuencia del cebador de PCR utilizado para cebar la síntesis de una cadena de polinucleótidos complementaria al producto de extensión de cebador inicial, mientras que la última se determinará exclusivamente copiando las secuencias adaptadoras en los extremos 3' de las construcciones adaptador-molde en la extensión de cebador inicial. Sin embargo, dado que el cebador de PCR se diseña para hibridarse con una secuencia en los productos de extensión iniciales que es complementaria al adaptador 3', las dos formas de “secuencia común II” contendrán una secuencia idéntica, al menos en el extremo 3'. Puede incluirse una secuencia adicional en el extremo 5' de la “secuencia común II” en los productos amplificados, por ejemplo, mediante el uso de cebadores de PCR “con cola” como se describe en detalle a continuación. En otras realizaciones, las secuencias comunes presentes en los productos de amplificación pueden realmente ser más cortas que las secuencias comunes que se incluyen en los adaptadores originalmente ligados a la diana.

Las secuencias de nucleótidos exactas de las regiones comunes de las moléculas molde en la biblioteca no son generalmente esenciales para la invención y el usuario puede seleccionarlas. Las secuencias comunes deben comprender al menos secuencias “de unión a cebador” que permitan la hibridación específica de cebadores de amplificación cuando se utilizan los moldes en una reacción de amplificación en fase sólida. Por lo tanto, las secuencias de unión a cebador se determinan mediante la secuencia de los cebadores a utilizar finalmente para la amplificación en fase sólida. La secuencia de estos cebadores a su vez se selecciona ventajosamente para impedir o minimizar la unión de los cebadores a las partes diana de los moldes dentro de la biblioteca en las condiciones de la reacción de amplificación, pero no se limita particularmente de otro modo. A modo de ejemplo, si las partes diana de los moldes proceden de ADN genómico humano, entonces las secuencias de los cebadores a utilizar en la amplificación en fase sólida idealmente deben seleccionarse para minimizar la unión no específica a cualquier secuencia genómica humana.

Los polinucleótidos adaptadores utilizados en el método de la invención se denominan en el presente documento adaptadores “con emparejamiento erróneo” porque, como se explicará con detalle en el presente documento, es esencial que los adaptadores incluyan una región de emparejamiento erróneo de secuencia, es decir, no deben formarse por hibridación de cadenas de polinucleótidos completamente complementarias.

Los adaptadores con emparejamiento erróneo para su uso en la invención se forman hibridando dos cadenas de polinucleótidos parcialmente complementarias para proporcionar, cuando las dos cadenas están hibridadas, al menos una región bicatenaria y al menos una región no emparejada.

La “ región bicatenaria” del adaptador es una región bicatenaria corta, comprendiendo normalmente 5 o más pares de bases consecutivos, formados por hibridación de las dos cadenas de polinucleótidos parcialmente complementarias. Este término simplemente se refiere a una región bicatenaria de ácido nucleico en la que las dos cadenas están hibridadas y no implica ninguna conformación estructural particular.

Generalmente es ventajoso que la región bicatenaria sea lo más corta posible sin pérdida de función. En este contexto “función” significa que la región bicatenaria forma un dúplex estable en condiciones de reacción convencionales para una reacción del ligadura de ácidos nucleicos catalizada por enzimas, que se conocerá bien por lector experto (por ejemplo, incubación a una temperatura en el intervalo de 4 °C a 25 0C en un tampón de ligadura apropiado para la enzima), de tal manera que las dos cadenas que forman el adaptador continúen parcialmente hibridadas durante la ligadura del adaptador a una molécula diana. No es absolutamente necesario que la región bicatenaria sea estable en las condiciones normalmente utilizadas en las etapas de hibridación de la extensión de cebador o en las reacciones PCR.

Dado que en ambos extremos de cada molécula molde se ligan adaptadores idénticos, la secuencia diana en cada construcción adaptador-diana estará flanqueada por secuencias complementarias procedentes de la región bicatenaria de los adaptadores. Cuanto más larga sea la región bicatenaria y, por lo tanto, las secuencias complementarias procedentes de la misma, en las construcciones adaptador-diana, mayor será la posibilidad de que la construcción adaptador-diana sea capaz de volverse a plegar y formar pares de bases consigo misma en estas regiones de autocomplementariedad interna en las condiciones de hibridación utilizadas en la extensión de cebador y/o PCR. Generalmente, se prefiere que la región bicatenaria tenga 20 o menos, 15 o menos, o 10 o menos pares de bases de longitud para reducir este efecto. La estabilidad de la región bicatenaria puede aumentarse y, por lo tanto, su longitud verse potencialmente reducida, por la inclusión de nucleótidos no naturales que muestran emparejamiento de bases más fuerte que los pares de bases estándar de Watson-Crick.

Se prefiere, pero no es absolutamente esencial, que las dos cadenas del adaptador tengan una complementariedad del 100 % en la región bicatenaria. Se apreciará que pueden tolerarse uno o más emparejamientos erróneos de nucleótidos dentro de la región bicatenaria, siempre que las dos cadenas sean capaces de formar un dúplex estable en condiciones de ligadura convencionales.

Los adaptadores para su uso en la invención generalmente incluirán una región bicatenaria adyacente al extremo “ ligable” del adaptador, es decir, el extremo que está unido a un polinucleótido diana en la reacción de ligadura. El extremo ligable del adaptador puede ser romo o, en otras realizaciones, puede haber presentes salientes en 5' o 3' cortos de uno o más nucleótidos para facilitar/promover la ligadura. El nucleótido terminal 5' en el extremo ligable del adaptador debe estar fosforilado para permitir la unión fosfodiéster a un grupo hidroxilo 3' en el polinucleótido diana.

La expresión “ región no emparejada” se refiere una región del adaptador en donde las secuencias de las dos cadenas de polinucleótidos que forman el adaptador presentan un grado de no complementariedad de tal manera que las dos cadenas no pueden hibridarse entre sí en condiciones de hibridación convencionales para una extensión de cebador o reacción PCR. Las dos cadenas en la región no emparejada pueden presentar cierto grado de hibridación en condiciones de reacción convencionales para una reacción de ligadura catalizada por enzimas, siempre que las dos cadenas vuelvan a una forma monocatenaria en condiciones de hibridación.

Las condiciones encontradas durante las etapas de hibridación de una reacción PCR son generalmente conocidas por un experto en la técnica, aunque las condiciones de hibridación exactas variarán de reacción a reacción (véase Sambrook y col., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Current Protocols, eds Ausubel y col.). Normalmente dichas condiciones pueden comprender, pero sin limitación, (después de una etapa de desnaturalización a una temperatura de aproximadamente 94 °C durante aproximadamente 1 minuto) exposición a una temperatura en el intervalo de 40 °C a 72 °C (preferiblemente 50-68 °C) durante un periodo de aproximadamente 1 minuto en un tampón de reacción PCR convencional.

Pueden utilizarse diferentes condiciones de hibridación para una sola reacción de extensión de cebador que no forma parte de una reacción PCR (véase de nuevo Sambrook y col., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Current Protocols, eds Ausubel y col.). Las condiciones para la hibridación con cebador en una sola extensión de cebador incluyen, por ejemplo, exposición a una temperatura en el intervalo de 30 a 37 °C en un tampón de extensión de cebador convencional. Se apreciará que diferentes enzimas, y por lo tanto diferentes tampones de reacción, pueden utilizarse para una sola reacción de extensión de cebador contrariamente a lo que ocurre con una reacción PCR. No es un requisito el uso de una polimerasa termoestable para una sola reacción de extensión de cebador.

Debe entenderse que la “ región no emparejada” se proporciona por diferentes partes de las mismas dos cadenas de polinucleótidos que forman la región o regiones bicatenarias. Sin embargo, las partes de las dos cadenas que forman la región no emparejada no están hibridadas en condiciones en las que otras partes de las mismas dos cadenas se hibridan para formar una o más regiones bicatenarias. Para evitar la duda debe entenderse que un saliente de base única o monocatenario en el extremo 5' o 3' de un dúplex de polinucleótido no constituye una “ región no emparejada” en el contexto de la presente invención.

Las partes de las dos cadenas que forman la región bicatenaria normalmente comprenden al menos 10, o al menos 15 o al menos 20 nucleótidos consecutivos en cada cadena. El límite inferior sobre la longitud de la región no emparejada normalmente se determinará por la función, por ejemplo, la necesidad de proporcionar una secuencia adecuada para la unión de un cebador para la extensión de cebador, PCR y/o secuenciación. Teóricamente, no existe límite superior sobre la longitud de la región no emparejada, excepto que generalmente sea ventajoso minimizar la longitud total del adaptador, por ejemplo, para facilitar la separación de adaptadores no unidos de construcciones adaptador-diana después de la etapa de ligadura. Por lo tanto, se prefiere que la región no emparejada tenga menos de 50, o menos de 40, o menos de 30 o menos de 25 nucleótidos consecutivos de longitud en cada cadena.

La longitud total de las dos cadenas que forman el adaptador normalmente estará en el intervalo de 25 a 100 nucleótidos, más normalmente de 30 a 55 nucleótidos.

Las partes de las dos cadenas que forman la región no emparejada deben tener preferiblemente una longitud similar, aunque no es absolutamente esencial, siempre que la longitud de cada parte sea suficiente para cumplir la función deseada (por ejemplo, la unión a cebador). Los inventores han demostrado mediante experimentos que las partes de las dos cadenas que forman la región no emparejada pueden diferir en hasta 25 nucleótidos sin afectar negativamente a la función del adaptador.

Mucho más preferiblemente, las partes de las dos cadenas de polinucleótidos que forman la región no emparejada tendrán completamente emparejamiento erróneo, o tendrán un 100 % de no complementariedad. Sin embargo, los lectores expertos apreciarán que algunas “coincidencias” de secuencia, es decir, un menor grado de no complementariedad pueden tolerarse en esta región sin afectar a la función en gran medida. Como se ha indicado anteriormente, el grado de emparejamiento erróneo de secuencia o no complementariedad de secuencia debe ser tal que las dos cadenas en la región no emparejada permanezcan en forma monocatenaria en condiciones de hibridación como se ha definido anteriormente.

La secuencia de nucleótidos exacta de los adaptadores no es generalmente esencial para la invención y puede seleccionarse por el usuario de tal manera que los elementos de secuencia deseados se incluyan finalmente en las secuencias comunes de la biblioteca de moldes procedentes de los adaptadores, por ejemplo, para proporcionar sitios de unión para conjuntos particulares de cebadores de amplificación universales y/o cebadores de secuenciación. Pueden incluirse elementos de secuencia adicionales, por ejemplo, para proporcionar sitios de unión para cebadores de secuenciación que finalmente se utilizarán en la secuenciación de moléculas molde en la biblioteca, o productos procedentes de la amplificación de la biblioteca molde, por ejemplo, en un soporte sólido. Los adaptadores pueden incluir además secuencias “etiqueta” que se pueden utilizar para etiquetar o marcar moléculas molde procedentes de una fuente particular. Las características generales y el uso de dichas secuencias etiqueta se describen en la solicitud en trámite del solicitante publicada como WO 05/068656.

Aunque la secuencia de nucleótidos exacta del adaptador es generalmente no limitante para la invención, las secuencias de las cadenas individuales en la región no emparejada debe ser de tal manera que ninguna cadena individual presente ninguna autocomplementariedad interna que pudiera conducir a una autohibridación, formación de estructuras de horquilla, etc., en condiciones de hibridación convencionales. La autohibridación de una cadena en la región no emparejada debe impedirse ya que esto puede evitar o reducir la unión específica de un cebador de amplificación a esta cadena.

Los adaptadores con emparejamiento erróneo se forman preferiblemente a partir de dos cadenas de ADN, pero pueden incluir mezclas de nucleótidos naturales y no naturales (por ejemplo, uno o más ribonucleótidos) unidos mediante una mezcla de enlaces de cadena principal fosfodiéster y no fosfodiéster. Pueden incluirse otras modificaciones no nucleotídicas tales como, por ejemplo, restos de biotina, grupos bloqueantes y restos de captura para la unión a una superficie sólida, como se analiza en más detalle a continuación.

El uno o más “dúplex de polinucleótido diana” al los que se ligan los adaptadores puede ser cualquiera de las moléculas polinucleotídicas que se desea amplificar mediante PCR en fase sólida, generalmente con vista a la secuenciación. Los dúplex de polinucleótido diana pueden originarse en forma de ADN bicatenario (por ejemplo, fragmentos de ADN genómico) o pueden haberse originado en forma monocatenaria, como ADN, y haberse convertido a ADNbc antes de la ligadura. La secuencia exacta de las moléculas diana no es generalmente esencial para la invención, y puede ser conocida o desconocida. Las moléculas de ADN modificadas que incluyen enlaces de cadena principal no natural y/o nucleótidos no naturales pueden servir como diana, siempre que las modificaciones no excluyan la ligadura con adaptador y/o la copia en una reacción de extensión de cebador.

Aunque en teoría el método puede aplicarse a un único dúplex diana (es decir, una molécula bicatenaria individual), se utiliza una mezcla o una pluralidad de dúplex de polinucleótido diana. El método de la invención se aplica a una mezcla de diferentes moléculas diana que difieren entre sí con respecto a la secuencia de nucleótidos sobre toda o una parte de su longitud, por ejemplo, una mezcla compleja de moldes. El método puede aplicarse a una pluralidad de moléculas diana procedentes de una fuente común, por ejemplo, una biblioteca de fragmentos de ADN genómico procedente de un individuo particular. En una realización preferida, los polinucleótidos diana comprenderán fragmentos al azar de ADN genómico humano. Los fragmentos proceden de un genoma completo y de un individuo o varios individuos. Las moléculas diana de ADN pueden tratarse química o enzimáticamente antes o después de la ligadura de las secuencias adaptadoras. Las técnicas para la fragmentación de ADN genómico incluyen, por ejemplo, digestión enzimática o cizalladura mecánica.

La “ ligadura” de adaptadores en los extremos 5' y 3' de cada polinucleótido diana implica la unión de dos cadenas de polinucleótidos del adaptador a un polinucleótido diana bicatenario de tal manera que se formen enlaces covalentes entre ambas cadenas de las dos moléculas bicatenarias. En este contexto “unión” significa unión covalente de dos cadenas de polinucleótidos que previamente no estaban unidas covalentemente. Preferiblemente dicha “unión” se realizará por la formación de un enlace fosfodiéster entre las dos cadenas de polinucleótidos pero pueden utilizarse otros medios de unión covalente (por ejemplo, enlaces de cadena principal no fosfodiéster). Sin embargo, es un requisito esencial que los enlaces covalentes formados en las reacciones de ligadura permitan una lectura de una polimerasa, de tal manera que la construcción resultante pueda copiarse en una reacción de extensión de cebador utilizando cebadores que se unen a secuencias en las regiones de la construcción adaptador-diana que proceden de las moléculas adaptadoras.

Las reacciones de ligadura preferiblemente se catalizarán por enzimas. La naturaleza de la enzima ligasa utilizada para la ligadura enzimática no está particularmente limitada. También pueden utilizarse técnicas de ligadura no enzimática (por ejemplo, ligadura química), siempre que la ligadura no enzimática conduzca a la formación de un enlace covalente que permita la lectura de una polimerasa, de tal manera que la construcción resultante pueda copiarse en una reacción de extensión de cebador.

Los productos deseados de la reacción de ligadura son construcciones adaptador-diana en las que adaptadores idénticos están ligados en ambos extremos de cada polinucleótido diana, dada la estructura adaptador-dianaadaptador. Por lo tanto, las condiciones de la reacción de ligadura deben optimizarse para maximizar la formación de este producto, en preferencia para dianas que tienen un adaptador solo en un extremo.

Los productos de la reacción de ligadura pueden someterse a etapas de purificación para eliminar las moléculas adaptadoras no unidas antes de procesarse adicionalmente las construcciones adaptador-diana. Puede utilizarse cualquier técnica adecuada para eliminar el exceso de adaptadores no unidos, cuyos ejemplos preferidos se describen más en detalle a continuación.

A continuación, las construcciones adaptador-diana formadas en la reacción de ligadura se someten a una reacción de extensión de cebador inicial en la que un oligonucleótido cebador se hibrida con una parte adaptadora de cada una de las construcciones adaptador-diana y se extiende por adición secuencial de nucleótidos en el extremo hidroxilo 3' libre del cebador para formar productos de extensión complementarios al menos a una cadena en cada una de las construcciones adaptador-diana.

La expresión reacción de extensión de cebador “ inicial” se refiere a una reacción de extensión de cebador en la que los cebadores se hibridan directamente con las construcciones adaptador-diana, en oposición a cualquier cadena complementaria formada por extensión de cebador utilizando la construcción adaptador-diana como un molde o copias amplificadas de la construcción adaptador-diana. Es una característica clave del método de la invención que la reacción de extensión de cebador inicial se realice utilizando un cebador “ universal” que se una específicamente a una secuencia análoga dentro de una parte adaptadora de la construcción adaptador-diana, y no se realice utilizando un cebador específico de diana o una mezcla de cebadores al azar. El uso de un cebador específico de adaptador para la reacción de extensión de cebador inicial es clave para la formación de una biblioteca de moldes que tienen una secuencia común en el extremo 5' y una secuencia común el extremo 3'.

Los cebadores utilizados para la reacción de extensión de cebador inicial podrán hibridarse con cada cadena individual de construcciones adaptador-diana que tengan adaptadores ligados en ambos extremos, y se puede extender para obtener dos productos de extensión de cebador individuales, uno complementario a cada cadena de la construcción. Por lo tanto, en la realización mucho más preferida, la reacción de extensión de cebador inicial dará como resultado la formación de productos de extensión de cebador complementarios a cada cadena de cada adaptador-diana

En una realización preferida, el cebador utilizado en la reacción de extensión de cebador inicial se hibridará con una secuencia de unión a cebador (en una cadena) en la región no emparejada del adaptador.

Como se utiliza en este contexto, el término “hibridación” se refiere a una unión/hibridación específica de secuencia del cebador con una secuencia de unión a cebador en una región adaptadora de la construcción adaptador-diana en las condiciones que van a utilizarse para la etapa de hibridación con cebador de la reacción de extensión de cebador inicial.

Los productos de la reacción de extensión de cebador pueden someterse a condiciones desnaturalizantes convencionales para separar los productos de extensión de las cadenas de las construcciones adaptador-diana. Opcionalmente, las cadenas de las construcciones adaptador-diana pueden eliminarse en esta fase. Los productos de extensión (con o sin las cadenas originales de las construcciones adaptador-diana) forman en su conjunto una biblioteca de polinucleótidos molde que pueden utilizarse como moldes para la PCR en fase sólida.

Si se desea, la reacción de extensión de cebador inicial puede repetirse una o más veces, a través de rondas de hibridación con cebador, extensión y desnaturalización, para formar múltiples copias de los mismos productos de extensión complementarios a las construcciones adaptador-diana.

En otras realizaciones, los productos de extensión iniciales pueden amplificarse mediante PCR en fase de solución convencional, como se describe con más detalle a continuación. Los productos de dicha amplificación por PCR adicional pueden recogerse para formar una biblioteca de moldes que comprenden “ productos de amplificación procedentes de” los productos de extensión de cebador iniciales. En una realización preferida, ambos cebadores utilizados para la amplificación por PCR adicional se hibridarán con diferentes secuencias de unión a cebador sobre cadenas opuestas en la región no emparejada del adaptador. Sin embargo, otras realizaciones pueden basarse en el uso de un solo tipo de cebador de amplificación que hibrida con una secuencia de unión a cebador en la región bicatenaria del adaptador. En realizaciones del método basado en amplificación por PCR, la reacción de extensión de cebador “ inicial” se produce en el primer ciclo de PCR.

La inclusión de la etapa de extensión de cebador inicial (y opcionalmente rondas adicionales de amplificación por PCR) para formar copias complementarias de las construcciones adaptador-diana (antes de la PCR del genoma completo o en fase sólida) es ventajosa por diversas razones. En primer lugar, la inclusión de la etapa de extensión de cebador y la posterior amplificación por PCR, actúa como una etapa de enriquecimiento para seleccionar construcciones adaptador-diana, con adaptadores ligados en ambos extremos. Solo construcciones diana con adaptadores ligados en ambos extremos proporcionan moldes eficaces para la PCR del genoma completo o en fase sólida utilizando cebadores comunes o universales específicos para secuencias de unión a cebador en los adaptadores, por lo tanto, es ventajoso producir una biblioteca de moldes que comprenda solo dianas ligadas doblemente antes de la amplificación en fase sólida o del genoma completo.

En segundo lugar, la inclusión de la etapa de extensión de cebador inicial y posterior amplificación por PCR, permite que la longitud de las secuencias comunes en los extremos 5' y 3' de la diana aumente antes de la PCR en fase sólida o del genoma completo. Como se ha descrito anteriormente, es generalmente ventajoso que la longitud de las moléculas adaptadoras sea lo más corta posible, para maximizar la eficacia de la ligadura y la posterior eliminación de los adaptadores no unidos. Sin embargo, para los fines de la PCR del genoma completo o en fase sólida puede ser ventajoso tener secuencias más largas comunes o secuencias “universales” en los extremos 5' y 3' de los moldes a amplificar. La inclusión de las etapas de extensión de cebador (y posterior amplificación) significa que la longitud de las secuencias comunes en un extremo (o en ambos extremos) de los polinucleótidos en la biblioteca de moldes se puede aumentar después de la ligadura por inclusión de una secuencia adicional en los extremos 5' de los cebadores utilizados para la extensión de cebador (y posterior amplificación). El uso de dichos cebadores “con cola” se describe en más detalle a continuación.

Ahora se describirán en más detalle diversas realizaciones específicas no limitantes del método de la invención con referencia a los dibujos adjuntos. Salvo que se especifique de otro modo, las características descritas como preferidas en relación con una realización específica de la invención se aplican con los cambios que correspondan a otras realizaciones específicas de la invención.

Las figuras relacionadas con las características no incluidas en las reivindicaciones son con fines de referencia.

La figura 1 ilustra varias realizaciones de un tipo particular de adaptador con emparejamiento erróneo para su uso en el método de la invención. El adaptador se forma hibridando dos oligonucleótidos monocatenarios, denominados en el presente documento “oligo A” y “oligo B” . El oligo A y el oligo B pueden prepararse mediante técnicas de síntesis de oligonucleótidos automatizadas convencionales en el uso rutinario en la técnica. Los oligonucleótidos son parcialmente complementarios de tal manera que el extremo 3' del oligo A es complementario al extremo 5' del oligo B. El extremo 5' del oligo A y el extremo 3' del oligo B no son complementarios entre sí. Cuando las dos cadenas se hibridan, la estructura resultante es bicatenaria en un extremo (la región bicatenaria) y monocatenaria en el otro extremo (la región no emparejada) y se denomina en el presente documento un “adaptador bifurcado” (figura 1a). La región bicatenaria del adaptador bifurcado puede ser de extremos romos (figura 1 b) o puede tener un saliente. En el último caso, el saliente puede ser un saliente 3' (figura 1c) o un saliente 5' (figura 1d), y puede comprender un solo nucleótido o más de un nucleótido.

El extremo 5' de la parte bicatenaria del adaptador bifurcado está fosforilada, es decir, el extremo 5' del oligo B (figura 1a-d). La presencia del grupo fosfato 5' identifica a este como el extremo “ ligable” del adaptador. El extremo 5' del oligo A puede estar biotinilado o llevar otra funcionalidad (representada por X) que permita capturarlo en una superficie, tal como una perla. Dichas funcionalidades alternativas distintas de las de la biotina se conocen por los expertos en la técnica. El extremo 3' del oligo B también puede estar biotinilado o llevar otra funcionalidad (representada por Y) que permite que se capture en una superficie (figura 1d).

Los enlaces fosfodiéster que comprenden la cadena principal de los oligonucleótidos puede reemplazarse por enlaces no enzimáticamente escindibles tales como enlaces fosforotioato. Preferiblemente, solo el último, o el último y penúltimo enlaces fosfodiéster en ambos extremos 3' y 5' de los oligonucleótido se sustituirán por enlaces fosforotioato. En la realización mucho más preferida de la invención, el oligo A contiene un grupo de biotina en su extremo 5', y el oligo B está fosforilado en su extremo 5' y la parte bicatenaria del dúplex contiene un saliente en 3' de una sola base que comprende un nucleótido “T” . El oligo A consiste en dos secuencias: una secuencia en el extremo 5' que es idéntica a la del cebador universal que se utilizará para la amplificación por PCR, denominada en el presente documento secuencia “ CEBADOR 1” , y en su extremo 3', una secuencia idéntica a la de un cebador de secuenciación universal, denominada en el presente documento secuencia “ SEC CEBADOR” , más un nucleótido “T” adicional en el extremo 3'. El oligo B también consiste en dos secuencias: una secuencia en su extremo 5' que es complementaria a solo parte del extremo 3' de la secuencia SEC CEBADOR en el oligo A, excluyendo el saliente “T” del oligo A, y una secuencia complementaria a la de un cebador de amplificación por PCR universal, denominada en el presente documento “ CEBADOR 2-comp” en su extremo 3' (figura 1e).

La figura 2 ilustra una realización del método de la invención basado en el uso de los adaptadores bifurcados ilustrados en la figura 1. Puede prepararse una mezcla de moléculas de ADN diana de secuencia diferente mezclando un número, mayor de uno, de moléculas de ADN individuales. En el procedimiento preferido, el ADN genómico está fragmentado en moléculas pequeñas, preferiblemente menores de 1000 pares de bases de longitud. La fragmentación del ADN puede conseguirse mediante diversos métodos incluyendo: digestión enzimática, escisión química, sonicación, nebulización o hidrocizallamiento, preferiblemente nebulización.

El ADN fragmentado puede fabricarse con extremos romos mediante diversos métodos conocidos por los expertos en la técnica. En el método preferido, los extremos del ADN fragmentado se reparan en los extremos con ADN polimerasa T4 y Klenow polimerasa, un procedimiento bien conocido por los expertos en la técnica, y a continuación se fosforilan con una enzima polinucleótido cinasa. A continuación se añade un solo desoxinucleótido “A” en ambos extremos 3' de las moléculas de ADN utilizando la enzima Taq polimerasa, produciendo un saliente en 3' de una base que es complementaria al otro saliente “T” de una base en 3' en el extremo bicatenario del adaptador bifurcado.

A continuación se realiza una reacción de ligadura entre el adaptador bifurcado y los fragmentos de ADN utilizando una enzima ligasa adecuada (por ejemplo, ADN ligasa T4) que une dos copias del adaptador a cada fragmento de ADN, en cualquier extremo, para formar construcciones adaptador-diana. Los productos de esta reacción pueden purificarse a partir de adaptador no ligado mediante diversos medios, incluyendo cromatografía de inclusión por tamaño, preferiblemente por electroforesis a través de un gel de agarosa seguido por escisión de una parte de la agarosa que contiene el ADN de mayor tamaño que el tamaño del adaptador (figura 2a).

Después de haber eliminado el exceso de adaptador, el ADN diana no ligado permanece además de las construcciones adaptador-diana ligadas y este puede eliminarse por captura selectiva de solo aquellas moléculas de ADN diana que tienen adaptador unido. La presencia de un grupo de biotina en el extremo 5' del Oligo A del adaptador permite que cualquier ADN diana ligado al adaptador se capture sobre una superficie recubierta con estreptavidina, una proteína que se une selectiva y estrechamente a la biotina. La estreptavidina puede aplicarse sobre una superficie por medios conocidos por los expertos en la técnica. En el método preferido, pueden utilizarse perlas magnéticas disponibles comercialmente que están revestidas de estreptavidina para capturar construcciones adaptador-diana ligadas. La aplicación de un imán al lado de un tubo que contiene estas perlas las inmoviliza de tal manera que pueden lavarse de las moléculas de ADN diana no ligadas (figura 2a).

Un oligonucleótido denominado en el presente documento CEBADOR 2, que se hibrida con la secuencia “CEBADOR 2-comp” en la cadena oligo B de las construcciones adaptador-diana puede utilizarse en una reacción de extensión de cebador inicial para generar una copia complementaria de la cadena adaptador-diana unida a la perla. El producto de extensión de cebador resultante forma un dúplex bicatenario con su cadena adaptador-diana complementaria unida a la perla y a continuación puede aislarse y purificarse de la cadena adaptador-diana de la perla por desnaturalización (figura 2b).

Existen varios métodos convencionales para separar la cadena de un dúplex de ADN por desnaturalización, incluyendo desnaturalización térmica, preferiblemente desnaturalización química en solución de hidróxido de sodio 100 mM. El pH de una solución de a Dn monocatenario en hidróxido de sodio recogido del sobrenadante de una suspensión de perlas magnéticas puede neutralizarse mediante ajuste con una solución de ácido apropiada, o preferiblemente mediante un intercambio de tampón a través de una columna de cromatografía por exclusión de tamaño equilibrada previamente en una solución tamponada. La solución resultante contiene una biblioteca de moléculas molde de ADN monocatenario, todas las cuales comprenden en este orden: la secuencia 5' CEBADOR 2, ADN diana, el complemento de la secuencia SEC CEBADOR, a continuación el complemento de la secuencia CEBADOR 1. A continuación, esta biblioteca de moldes se puede utilizar para la amplificación por PCR en fase sólida utilizando los oligonucleótidos CEBADOR 1 y CEBADOR 2 inmovilizados. Sin embargo, se apreciará que la utilidad de la biblioteca no está limitada a la PCR en fase sólida sino que se extiende a cualquier tipo de amplificación por PCR, incluyendo la amplificación del genoma completo realizada totalmente en solución.

La figura 3 ilustra una realización alternativa de la invención en la que las construcciones adaptador-diana preparadas como se ha descrito anteriormente con referencia a la figura 2 se someten a rondas múltiples de hibridación con cebador y extensión para generar múltiples copias monocatenarias de cada construcción adaptador diana. En la presente realización de la invención, la reacción de extensión de cebador inicial sobre las moléculas adaptador-molde inmovilizadas en perlas con CEBADOR 2 se reemplaza en efecto por una amplificación por PCR asimétrica con el oligonucleótido CEBADOR 2 (figura 3), siendo esto equivalente a múltiples rondas de la misma reacción de extensión de cebador. En la presente realización, se generan múltiples copias monocatenarias de las cadenas inmovilizadas en perlas en el sobrenadante de la suspensión con perlas debido al termociclado de PCR, dado que no es necesaria una etapa de desnaturalización independiente para recuperar las copias complementarias recién sintetizadas de las cadenas adaptador-diana inmovilizadas en perlas; las copias pueden purificarse del sobrenadante mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica.

En otra realización de la invención, ilustrada en la figura 4, la reacción de extensión de cebador inicial de las construcciones adaptador-diana inmovilizadas en perlas con CEBADOR 2 forma parte de una amplificación por PCR (simétrica) convencional con los oligonucleótidos CEBADOR 2 y CEBADOR 1. En la presente realización, se generan múltiples copias bicatenarias de las cadenas inmovilizadas en perlas en el sobrenadante de la suspensión con perlas debido al termociclado de PCR, dado que no es necesaria una etapa de desnaturalización independiente para recuperar las copias complementarias recién sintetizadas de las cadenas adaptador-diana inmovilizadas en perlas; las copias pueden purificarse del sobrenadante mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica.

En otra realización de la invención, ilustrada en la figura 5, el adaptador bifurcado no contiene un grupo de biotina en el extremo 5' de la cadena Oligo A. En la presente realización, el ADN fragmentado puede elaborarse con los extremos romos mediante diversos métodos conocidos por los expertos en la técnica. En el método preferido, los extremos del fragmentado se reparan en los extremos con ADN polimerasa T4 y Klenow polimerasa y a continuación se fosforilan con una enzima polinucleótido cinasa. A continuación se añade un solo desoxinucleótido “A” en ambos extremos 3' de las moléculas de ADN con la enzima Taq polimerasa, produciendo un saliente en 3' de una base que es complementaria al otro saliente “T” de una base en 3' en el extremo “ ligable” bicatenario del adaptador bifurcado. A continuación, se realiza una reacción de ligadura entre el adaptador bifurcado y los fragmentos de ADN, por ejemplo, utilizando la enzima ADN ligasa T4 que une dos copias del adaptador con cada molécula molde de ADN, una en cada extremo.

Los productos de la reacción de ligadura pueden purificarse a partir de adaptador no ligado mediante diversos medios, incluyendo cromatografía de inclusión por tamaño, preferiblemente por electroforesis a través de un gel de agarosa seguido por escisión de una parte de la agarosa que contiene el ADN de mayor tamaño que el tamaño del adaptador. A continuación, se utiliza una alícuota del ADN purificado en una amplificación por PCR con los oligonucleótidos CEBADOR 2 y CEBADOR 1 (figura 5). El primer ciclo de PCR implicará una reacción de extensión de cebador inicial con el cebador 2 (no ilustrado). Los cebadores amplifican selectivamente aquellas moléculas de ADN molde que tengan adaptadores ligados en ambos extremos. El producto de la reacción es una biblioteca de moléculas molde bicatenarias, cada una de las cuales comprende en orden una de las cadenas dúplex: la secuencia 5' CEBADOR 2, ADN diana, el complemento de la secuencia SEC CEBADOR, a continuación el complemento de la secuencia CEBADOR 1. A continuación, esta biblioteca puede utilizarse en una plataforma de PCR en fase sólida que contenga los oligonucleótidos CEBADOR 1 y CEBADOR 2 inmovilizados.

La figura 6 ilustra ejemplos adicionales de adaptadores con emparejamiento erróneo bifurcados para su uso en el método de la invención. En la presente realización, el adaptador bifurcado se forma hibridando dos oligonucleótidos monocatenarios, denominados en el presente documento “oligo C” y “oligo B” . Los oligonucleótidos son parcialmente complementarios de tal manera que el extremo 3' del oligo C es complementario al extremo 5' del oligo B. El extremo 5' del oligo C y el extremo 3' del oligo B no son complementarios entre sí. Cuando los dos oligos se hibridan, la estructura resultante es bicatenaria en un extremo (región bicatenaria) y monocatenaria en el otro extremo (región no emparejada) (figura 6a). La región bicatenaria del adaptador bifurcado puede ser de extremos romos (figura 6d) o puede tener un saliente. En el último caso, el saliente puede ser un saliente 3' (figura 6c) o un saliente 5' (figura 6b), y puede comprender una sola base o más de una base.

El extremo 5' de la región bicatenaria del adaptador bifurcado está fosforilada, es decir, el extremo 5' del “oligo B” (figura 6a-d), para proporcionar un extremo “ ligable” . El extremo 5' del oligo C puede estar biotinilado o llevar otra funcionalidad (X) que permita capturarlo en una superficie, tal como una perla. El extremo 3' del oligo B también puede estar biotinilado o llevar otra funcionalidad (Y) que permite que se capture en una superficie (figura 6d).

Los enlaces fosfodiéster que comprenden la cadena principal de los oligonucleótidos puede reemplazarse por enlaces no enzimáticamente escindibles tales como enlaces fosforotioato. Preferiblemente, solo el último, o el último y penúltimo enlaces fosfodiéster en ambos extremos 3' y 5' de los oligonucleótido se sustituirán por enlaces fosforotioato. El oligo C consiste en solo una secuencia: una secuencia idéntica a la del cebador de secuenciación universal denominado “ SEC CEBADOR” (o idéntica a parte del extremo 3' de la secuencia “SEC CEBADOR” ), más un nucleótido “T” adicional en el extremo 3'. El oligo B consiste en dos secuencias: una secuencia en su extremo 5' que es complementaria a solo una parte del extremo 3' de la secuencia SEC CEBADOR en el oligo C, excluyendo el saliente “T” del “Oligo C” , y una secuencia en su extremo 3' que es complementaria a la de un cebador de amplificación por PCR universal, denominada en el presente documento secuencia “CEBADOR 2-comp” , (figura 6e).

La figura 7 ilustra una realización adicional de la invención basada en el uso de los adaptadores bifurcados ilustrados en la figura 6. En la presente realización, las construcciones adaptador-diana se preparan sustancialmente como se ha descrito anteriormente con referencia a la figura 5, excepto que se utilizan los adaptadores ilustrados en la figura 6 (figura 7a).

Se utiliza una alícuota de las construcciones adaptador-diana purificadas en una amplificación por PCR en fase de solución convencional con oligonucleótidos cebadores “con cola” . Los cebadores con cola son cebadores que solo se hibridan a través de su extremo 3' con una secuencia diana, dejando una cola 5' no hibridada. La longitud y secuencia exacta de la cola no hibridada no es limitante, pero normalmente puede comprender de 10 a 50 nucleótidos, más normalmente de 15 a 30 nucleótidos. Cuando se utilizan amplificaciones por PCR, la ronda de amplificación por PCR inicial (es decir, la primera y segunda reacciones de extensión de cebador) se basa en la unión de los extremos 3' de los cebadores con cola con las secuencias de unión a cebador análogas en las regiones adaptadoras de las construcciones adaptador-diana. Las colas no hibridadas 5' procedentes de los cebadores con cola actúan como moldes en posteriores ciclos de PCR y, por lo tanto, se copian dando los productos de PCR bicatenarios resultantes.

En la presente realización, uno cualquiera o ambos de los cebadores utilizados en la reacción de amplificación pueden ser cebadores “con cola” . En una realización, los cebadores utilizados se denominan CEBADOR 3 y CEBADOR 4, donde el CEBADOR 3 consiste en una secuencia con cola 5', y una secuencia 3' que es complementaria a la secuencia “ CEBADOR 2-comp” en el adaptador bifurcado; y el CEBADOR 4 consiste en una secuencia con cola 5' y una secuencia 3' que es idéntica al extremo 5' de la secuencia SEC CEBADOR presente en la región no emparejada del adaptador bifurcado. Después de la amplificación por PCR, las secuencias con cola se incorporan en las copias de la construcción de ADN adaptador-diana.

En una realización de la invención, las secuencias con cola en el CEBADOR 3 y el CEBADOR 4 no son secuencias idénticas. A continuación, la secuencia con cola del CEBADOR 3 y la secuencia con cola del CEBADOR 4 pueden utilizarse para formar la secuencia de cebadores inmovilizados sobre la superficie a utilizar para utilizar en una plataforma de amplificación de ADN en fase sólida (figura 7b).

En otra realización de la invención, las secuencias con cola en el CEBADOR 3 y el CEBADOR 4 son secuencias idénticas. Por lo tanto, los productos de la PCR en fase solución tendrán la misma secuencia en sus extremos: la secuencia con cola común del CEBADOR 3 y el CEBADOR 4. A continuación, esta secuencia con cola común puede utilizarse para formar la secuencia de un solo cebador inmovilizado sobre la superficie en una plataforma de amplificación de ADN en fase sólida. Por lo tanto, la amplificación sobre la superficie de la biblioteca de moldes puede realizarse utilizando un solo cebador de PCR inmovilizado sobre la superficie.

La figura 8 ilustra realizaciones alternativas de adaptadores con emparejamiento erróneo para su uso en el método de la invención. Estos adaptadores bifurcados “ modificados” pueden diseñarse para permitir la amplificación en fase sólida de moldes utilizando un solo cebador unido a la superficie. El adaptador se forma hibridando dos oligonucleótidos monocatenarios, denominados en el presente documento “oligo D” y “oligo E” . Los oligonucleótidos son parcialmente complementarios de tal manera que el extremo 3' del oligo D es complementario al extremo 5' del oligo E, y el extremo 5' del oligo D es complementario al extremo 3' del oligo E, sin embargo, las partes centrales del oligo D y el oligo E no son complementarias. Cuando el oligo D y el oligo E se hibridan, la estructura resultante es bicatenaria en ambos extremos (regiones bicatenarias) y monocatenaria en la región central (región no emparejada) y se denomina en el presente documento “ adaptador bifurcado modificado” (figura 8a).

Un extremo del adaptador bifurcado modificado se modifica para impedir la ligadura de una molécula de ADN en su extremo. Dichas modificaciones se conocen por los expertos en la técnica y pueden incluir, por ejemplo, la presencia de un saliente en 5' o 3'. El otro extremo “ ligable” puede ser un extremo romo (figura 8d) o puede tener un saliente. En el último caso, el saliente puede ser un saliente 3' (figura 8c) o un saliente 5' (figura 8b), y puede comprender una sola base o más de una base. La cadena 5' del extremo ligable está fosforilada, es decir, el extremo 5' del oligo E (figura 8a-d). El extremo 5' del oligo D puede estar biotinilado o llevar otra funcionalidad que permita capturarlo en una superficie, tal como una perla. El extremo 3' del oligo E puede estar biotinilado o llevar otra funcionalidad que permite capturarlo en una superficie (figura 8d). Las modificaciones para impedir la ligadura (Z,W) pueden ser las mismas que o diferentes de las funcionalidades de captura de superficie (X,Y).

Los enlaces fosfodiéster que comprenden la cadena principal de los oligonucleótidos puede reemplazarse por enlaces no enzimáticamente escindibles tales como enlaces fosforotioato. Preferiblemente, solo el último, o el último y penúltimo enlaces fosfodiéster en ambos extremos 3' y 5' de los oligonucleótido se sustituirán por enlaces fosforotioato.

En la realización preferida de la invención, el oligo E está fosforilado en su extremo 5' y el extremo 3' del oligo D contiene un saliente 3' de una sola base, que comprende un nucleótido “T” . El oligo D consiste en dos secuencias: una secuencia en su extremo 5' que es idéntica a la de un cebador de amplificación por PCR universal, denominada en el presente documento secuencia “CEBADOR 5” , próxima a una secuencia idéntica a la de un cebador de secuenciación universal denominada secuencia “SEC CEBADOR” , más el nucleótido “T” adicional en el extremo 3'. El oligo E consiste en tres secuencias: una secuencia en su extremo 5' que es complementaria a solamente parte del extremo 3' de la secuencia SEC CEBADOR en el oligo D, excluyendo el saliente “T” del oligo D, una secuencia central no complementaria a ninguna parte del oligo D y un extremo 3' que es complementario a la secuencia “CEBADOR 5” del oligo D (figura 8e).

La figura 9 ilustra otra realización adicional de la invención basada en el uso de los adaptadores alternativos ilustrados en la figura 8. En la presente realización, pueden prepararse construcciones adaptador-diana sustancialmente como se ha descrito anteriormente en relación con la figura 5, excepto que se utilizan los adaptadores bifurcados modificados ilustrados en la figura 8. Se utiliza una alícuota de las construcciones adaptador-diana purificadas en una amplificación por PCR en fase solución utilizando el oligonucleótido CEBADOR 5 para amplificar selectivamente los productos de ligadura que tengan el adaptador modificado en ambos extremos (figura 9b). A continuación, el producto de la PCR en fase solución puede purificarse y amplificarse en una plataforma de PCR en fase sólida con un solo cebador inmovilizado, por ejemplo, el CEBADOR 5. La inclusión de la secuencia con emparejamiento erróneo en el oligo E garantiza que todos los productos de esta amplificación en fase sólida contendrán secuencias de unión a cebadores de secuenciación comunes solo en una cadena, lo que permite la secuenciación utilizando un cebador de secuenciación universal que se hibrida con esta secuencia común.

Uso de la biblioteca de moldes

Las bibliotecas de moldes preparadas según el método de la invención pueden utilizarse esencialmente en cualquier método de análisis de ácidos nucleicos que requiera amplificación adicional de los moldes y/o secuenciación de los moldes o productos de amplificación de los mismos. Los usos de ejemplo de las bibliotecas de moldes incluyen, pero sin limitación, proporcionar moldes para amplificación del genoma completo y también amplificación por PCR en fase sólida (de bibliotecas de moldes complejas o de monomoldes). Un uso particularmente preferido es la amplificación del genoma completo realizada en un soporte sólido.

Amplificación del genoma completo

Las bibliotecas de moldes preparadas según el método de la invención a partir de una mezcla compleja de fragmentos de ADN genómico que representan un genoma completo o sustancialmente completo proporcionan moldes adecuados para amplificación denominada de “genoma completo” . La expresión “ amplificación del genoma completo” se refiere a una reacción de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR) en la que el molde a amplificar comprende una mezcla compleja de fragmentos de ácidos nucleicos representativa de un genoma completo (o un genoma sustancialmente completo).

Amplificación en fase sólida

Una vez formada, la biblioteca de moldes preparada según los métodos descritos anteriormente se puede utilizar para la amplificación de ácidos nucleicos en fase sólida.

Por lo tanto, en aspectos adicionales, la invención proporciona un método de amplificación de ácidos nucleicos en fase sólida de moléculas polinucleotídicas molde que comprende:

preparar una biblioteca de moléculas polinucleotídicas molde que tienen secuencias comunes en sus extremos 5' y 3' utilizando un método según el primer aspecto de la invención descrito en el presente documento y realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico en fase sólida en donde dichas moléculas polinucleotídicas molde se amplifican.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “amplificación en fase sólida” se refiere a cualquier reacción de amplificación de ácidos nucleicos realizada en o junto con un soporte sólido de tal manera que todos o una parte de los productos amplificados se inmovilicen sobre el soporte sólido según se forman. En particular, la expresión abarca la reacción en cadena de la polimerasa en fase sólida (PCR en fase sólida) que es una reacción análoga a la PCR en fase en solución convencional, excepto que uno o ambos cebadores de amplificación directos o inversos están inmovilizados sobre el soporte sólido.

Aunque la invención abarca métodos de amplificación en “fase sólida” en los que solo un cebador de amplificación se inmoviliza (el otro cebador normalmente está presente en solución libre), se prefiere que el soporte sólido se proporcione con los cebadores tanto directos e inversos inmovilizados. En la práctica, habrá una “ pluralidad” de cebadores directos idénticos y/o una “pluralidad” de cebadores inversos idénticos inmovilizados sobre el soporte sólido, ya que el proceso de la PCR requiere un exceso de cebadores para realizar la amplificación. Las referencias en el presente documento a cebadores directos e inversos deben interpretarse en consecuencia abarcando una “pluralidad” de dichos cebadores salvo que el contexto indique lo contrario.

Como apreciará un lector experto, cualquier reacción PCR determinada requiere al menos un tipo de cebador directo y al menos un tipo de cebador inverso específico para el molde a amplificar. Sin embargo, en determinadas realizaciones, los cebadores directo e inverso pueden comprender partes específicas de patrón de secuencia idéntica y pueden tener una secuencia y estructura nucleotídica completamente idéntica (incluida cualquier modificación no nucleotídica). En otras palabras, es posible llevar a cabo la amplificación en fase sólida utilizando un solo tipo de cebador, y dichos métodos de cebador único están comprendidos dentro del ámbito de la invención. Otras realizaciones pueden utilizar cebadores directos e inversos que contienen secuencias específicas de patrón idénticas pero que difieren en algunas otras características estructurales. Por ejemplo, un tipo de cebador puede contener una modificación no nucleotídica que no esté presente en el otro.

En otras realizaciones de la invención, los cebadores inversos y directos pueden contener partes específicas de molde de diferente secuencia.

En todas las realizaciones de la invención, los cebadores de amplificación para PCR en fase sólida se inmovilizan preferiblemente por unión covalente al soporte sólido en o cerca del extremo 5' del cebador, dejando la parte específica de molde del cebador libre para hibridación con su molde análogo y el grupo hidroxilo 3' libre para la extensión de cebador. Para ello puede utilizarse cualquier medio de unión covalente adecuado conocido en la técnica. La química de unión seleccionada dependerá de la naturaleza del soporte sólido y cualquier derivatización o funcionalización aplicada al mismo. El propio cebador puede incluir un resto, que puede ser una modificación química no nucleotídica, para facilitar la unión. En una realización particularmente preferida, el cebador puede incluir un nucleófilo que contiene azufre, tal como fosforotioato o tiosfosfato, en el extremo 5'. En el caso de hidrogeles de poliacrilamida de soporte sólido (como se describe a continuación), este nucleófilo se unirá a un grupo “ C” presente en el hidrogel. Los medios más preferidos de unión de cebadores y moldes a un soporte sólido se realiza mediante unión fosforotioato 5' a un hidrogel compuesto por acrilamida polimerizada y N-(5-bromoacetamidilpentil)acrilamida (BRAPA).

Se prefiere el uso de la biblioteca de moldes preparada según la invención para preparar matrices agrupadas de colonias de ácidos nucleicos, análogas en las descritas en los documentos WO 00/18957 y WO 98/44151, por amplificación por PCR en fase sólida. Los términos “agrupación” y “colonia” se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un sitio diferenciado sobre un soporte sólido compuesto por una pluralidad de cadenas de ácido nucleico inmovilizadas idénticas y una pluralidad de cadenas de ácido nucleico complementarias inmovilizadas idénticas. La expresión “ matriz agrupada” se refiere a una matriz formada a partir de tales agrupaciones o colonias. En este contexto, no debe entenderse que el término “ matriz” exija una disposición ordenada de agrupaciones.

Uso en secuenciación/métodos de secuenciación

La descripción también describe métodos para secuenciar ácidos nucleicos amplificados generados por amplificación del genoma completo o en fase sólida. Por lo tanto, la invención proporciona un método de secuenciación de ácidos nucleicos que comprende amplificar una biblioteca de moldes de ácidos nucleicos utilizando amplificación del genoma completo o en fase sólida como se ha descrito anteriormente y realizar una reacción de secuenciación de ácidos nucleicos para determinar la secuencia de toda o parte de al menos una cadena de ácido nucleico amplificada producida en la reacción de amplificación del genoma completo o en fase sólida.

La secuenciación se puede realizar utilizando cualquier técnica de “secuenciación por síntesis” adecuada, en donde los nucleótidos se añaden sucesivamente al grupo hidroxilo 3' libre, dando como resultado la síntesis de una cadena de polinucleótidos en la dirección 5' a 3'. La naturaleza del nucleótido añadido se determina preferiblemente después de cada adición de nucleótidos.

El punto de inicio para la reacción de secuenciación puede proporcionarse hibridando un cebador de secuenciación con un producto de la reacción de genoma completo o en fase sólida. En este sentido, uno o ambos adaptadores añadidos durante la formación de la biblioteca de moldes puede incluir una secuencia de nucleótidos que permita la hibridación de un cebador de secuenciación con productos amplificados derivados mediante amplificación del genoma completo o en fase sólida de la biblioteca de moldes.

Los productos de reacciones de amplificación en fase sólida en donde tanto los cebadores de amplificación directos como inversos se inmovilizan covalentemente sobre la superficie sólida también se denominan estructuras “puenteadas” formadas por hibridación de pares de cadenas de polinucleótidos inmovilizadas y cadenas complementarias inmovilizadas, estando ambas cadenas unidas al soporte sólido en el extremo 5'. Las matrices compuestas por dichas estructuras puenteadas proporcionan moldes ineficaces para la secuenciación de ácidos nucleicos, ya que la hibridación de un cebador de secuenciación convencional con una de las cadenas inmovilizadas no está favorecida en comparación con la hibridación de esta cadena con su cadena complementaria inmovilizada en condiciones de hibridación convencionales.

Para proporcionar moldes más adecuados para la secuenciación de ácidos nucleicos se prefiere eliminar sustancialmente toda o al menos una parte de una de las cadenas inmovilizadas en la estructura “puenteada” para generar un molde que sea al menos parcialmente monocatenario. Por lo tanto, la parte del molde que es monocatenaria estará disponible para la hibridación con un cebador de secuenciación. El proceso de eliminación de toda o una parte de la cadena inmovilizada en una estructura de ácido nucleico bicatenaria “puenteada” puede denominarse en el presente documento “ linealización” .

Las estructuras de molde “puenteadas” pueden linealizarse escindiendo una o ambas cadenas con una endonucleasa de restricción o por escisión de una cadena con una endonucleasa de corte enzimático. Se pueden utilizar otros métodos de escisión como una alternativa a las enzimas de restricción o enzimas de corte enzimático, incluyendo, entre otros, escisión química (por ejemplo, escisión de un enlace diol con peryodato), escisión de sitios abásicos por escisión con endonucleasa, o por exposición al calor o a sustancias alcalinas, escisión de ribonucleótidos incorporados en productos de amplificación de otra manera compuestos por desoxirribonucleótidos, escisión fotoquímica o escisión de un enlazador peptídico.

Se apreciará que una etapa de linealización puede no ser esencial si la reacción de amplificación en fase sólida se realiza solo con un cebador inmovilizado covalentemente y el otro en solución libre.

Para generar un molde linealizado adecuado para la secuenciación es necesario retirar cantidades “distintas” de las cadenas complementarias en la estructura puenteada formada por amplificación para dejar después un molde linealizado para la secuenciación que es completa o parcialmente monocatenaria. Mucho más preferiblemente, una cadena de la estructura puenteada se elimina sustancial o completamente.

Después de la etapa de escisión, independientemente del método utilizado para la escisión, el producto de la reacción de escisión puede someterse a condiciones de desnaturalización para eliminar la o las partes de la o las cadenas escindidas que no están unidas al soporte sólido. Las condiciones de desnaturalización adecuadas resultarán evidentes para el lector experto con referencia a protocolos de biología molecular convencionales (Sambrook y col., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Current Protocols, eds Ausubel y col.).

La desnaturalización (y posterior rehibridación de las cadenas escindidas) da como resultado la producción de un molde de secuenciación que es parcial o sustancialmente monocatenario. A continuación, puede iniciarse una reacción de secuenciación por hibridación de un cebador de secuenciación con la parte monocatenaria del molde.

Por lo tanto, la reacción de secuenciación de ácidos nucleicos puede comprender hibridar un cebador de secuenciación con una región monocatenaria de un producto de amplificación linealizado, incorporar secuencialmente uno o más nucleótidos en una cadena de polinucleótidos complementaria a la región de la cadena molde amplificada a secuenciar, identificar la base presente en uno más de los nucleótidos incorporados y determinar así la secuencia de una región de la cadena molde.

Un método de secuenciación preferido que puede utilizarse según la invención se basa en el uso de nucleótidos modificados que pueden actuar como finalizadores de cadena. Una vez que el nucleótido modificado se ha incorporado en la cadena de polinucleótidos en crecimiento complementaria a la región de un molde que se está secuenciando, no hay ningún grupo 3'-OH libre disponible para dirigir la extensión de secuencia adicional y, por lo tanto, la polimerasa no puede añadir nucleótidos adicionales. Una vez que se ha determinado la naturaleza de la base incorporada en la cadena en crecimiento, puede retirarse el bloqueo del extremo 3’ para permitir la adición del siguiente nucleótido sucesivo. Ordenando los productos derivados utilizando estos nucleótidos modificados es posible deducir la secuencia de ADN del molde de ADN. Dichas reacciones pueden realizarse en un solo experimento si cada uno de los nucleótidos modificados tiene una etiqueta diferente unida, que se sabe que corresponde a la base particular, para facilitar la discriminación entre las bases añadidas en cada etapa de incorporación. Como alternativa, se puede llevar a cabo una reacción separada que contenga cada uno de los nucleótidos modificados por separado.

Los nucleótidos modificados pueden llevar una etiqueta para facilitar su detección. Preferiblemente, es una etiqueta fluorescente. Cada tipo de nucleótido puede llevar una etiqueta fluorescente diferente. Sin embargo la etiqueta detectable no tiene que ser una etiqueta fluorescente. Puede utilizarse cualquier etiqueta que permita la detección de un nucleótido incorporado.

Un método para detectar nucleótidos marcados por fluorescencia comprende el uso de luz láser de una longitud de onda específica para los nucleótidos marcados, o el uso de otras fuentes adecuadas de iluminación. La fluorescencia de la etiqueta en el nucleótido puede ser detectada por una cámara CCD u otro medio de detección adecuado.

La descripción no pretende limitar el uso del método de secuenciación descrito anteriormente, ya que básicamente puede utilizarse cualquier metodología de secuenciación que se base en la incorporación sucesiva de nucleótidos en una cadena de polinucleótidos. Las técnicas alternativas incluyen, por ejemplo, Pyrosequencing™, FISSEQ (secuenciación de fluorescencia in situ), MPSS (secuenciación de marca masivamente paralela) y secuenciación por métodos basados en ligadura.

El polinucleótido diana a secuenciar utilizando el método de la invención puede ser cualquier polinucleótido que se desee secuenciar. Utilizando el método de preparación de bibliotecas de moldes descrito con detalle en el presente documento es posible preparar bibliotecas de moldes a partir de un polinucleótido diana monocatenario o bicatenario de secuencia conocida, desconocida o parcialmente conocida. Con el uso de matrices agrupadas preparadas por amplificación en fase sólida es posible secuenciar dianas múltiples de la misma o diferente secuencia en paralelo.

La invención se entenderá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos experimentales no limitantes:

Ejemplo

Descripción experimental

Los siguientes detalles experimentales describen la exposición completa de una realización de la invención como se ha descrito anteriormente. La fuente de ADN utilizada es ADN de la línea celular humana purificada proporcionada por Coriell Cell Repositories, Camden, NJ 08103 EE.UU., catálogo n.° NA07055. El ADN se prepara primero para la ligadura a adaptadores bifurcados por: fragmentación del ADN por nebulización, reparación de los extremos de ADN para hacer los extremos romos y fosforilación, a continuación la adición de un solo nucleótido “A” en los extremos 3' de los fragmentos de ADN humano. La reacción de ligadura se realiza con el ADN fragmentado preparado y los adaptadores preformados por hibridación “Oligo A” y “Oligo B” (secuencias proporcionadas más adelante). El producto de la reacción se aísla/purifica del adaptador no ligado por electroforesis en gel. Finalmente, el producto de la reacción de ligadura se somete a ciclos de PCR para amplificar selectivamente el producto ligado que contiene el adaptador en ambos extremos de los fragmentos.

Materiales y métodos

Nebulización

Materiales:

• ADN genómico humano (1 mg/ml) Coriell NA07055

• Tampón (glicerol 53,1 ml, agua 42,1 ml, TrisHCl 1 M a pH 7,5, 3,7 ml, EDTA 0,5 M, 1,1 ml)

• Nebulizador Invitrogen (N.° K7025-05)

• Kit de purificación por PCR de columnas Qiagen (N.° 28104)

Procedimiento:

La solución de ADN enfriada se fragmentó en el nebulizador sobre hielo durante 5 a 6 minutos bajo al menos 32 psi de presión. El volumen recuperado (normalmente en algún punto entre 400 y 600 μl) se dividió en 3 alícuotas y se purificó con un kit de purificación de PCR de Qiagen, pero utilizando solo una columna, y finalmente se eluyó en 30 μl de EB (Qiagen). Reparación de extremos

Materiales:

La mezcla de reparación de extremos se ensambló de la siguiente manera:

La reacción se incubó durante 15 min a temperatura ambiente, a continuación se añadió 1 μl de fragmento grande de Pol I de ADN de E. coli (Klenow) y la reacción se incubó durante 15 min más a temperatura ambiente. El ADN se purificó de las enzimas, tampón, etc. cargando la mezcla de reacción en una columna Qiagen, eluyendo finalmente en 30 μl de EB. A continuación, los extremos 5' del ADN se fosforilaron utilizando polinucleótido cinasa de la siguiente manera:

La reacción se incubó durante 30 min a 37 0C, a continuación se inactivó con calor a 65 0C durante 20 min. A continuación, el ADN se purificó de las enzimas, tampón, etc. cargando la mezcla de reacción en una columna Qiagen, eluyendo finalmente en 30 μl de EB. Se agruparon tres grupos distintos para dar 90 μl en total.

Reacción de cola A

Materiales:

La siguiente mezcla de reacción se ensambló:

La reacción se incubó durante 30 min a 70 0C, a continuación el ADN se purificó de las enzimas, tampón, etc. cargando la mezcla de reacción en una columna MinElute de Qiagen, eluyendo finalmente en 10 μl de EB.

Hibridación del adaptador bifurcado

Materiales:

• “Oligo A” y “ Oligo B”

• Tris 50 mM/NaCl 50 mM a pH 7

• Máquina de PCR

Oligo A: 5'ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCxT (x = enlace fosforotioato) (SEQ ID NO:1)

Oligo B: 5'Fosfato-GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG (SEQ ID NO:2)

Las cadenas adaptadoras se hibridaron en una máquina de PCR programada de la siguiente manera:

Rampa a 0,5 0C/s a 97,5 0C

Retención a 97,5 0C durante 150 s

A continuación, una etapa de 97,5 0C durante 2 s con una caída de temperatura de 0,1 0C/ciclo durante 775 ciclos Reacción de ligadura

Materiales:

La mezcla de reacción se ensambló de la siguiente manera:

La reacción se incubó durante 20 min a temperatura ambiente y a continuación el ADN se purificó de las enzimas, tampón, etc. cargando la mezcla de reacción en una columna Qiagen, eluyendo finalmente en 30 μl de EB.

Purificación en gel

Materiales:

Toda la muestra de la reacción de ligadura purificada se cargó en un carril de un gel de agarosa al 2 % que contenía bromuro de etidio y se desarrolló a 120 V durante 50 min. A continuación, el gel se observó en una caja de “ luz blanca” y los fragmentos desde por encima de 300 pb hasta al menos 750 pb se escindieron y se purificaron con un kit de purificación de en gel de Qiagen, eluyendo en 30 μl de EB. Para tortas de gel grandes se utilizaron dos columnas minElute, eluyendo cada una en 15 μl de EB y se agruparon.

Amplificación por PCR

Materiales:

• ADN ligado

• CEBADOR 1: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGA (SEQ ID NO:3)

• CEBADOR 2: CAAGCAGAAGACGGCATACGA (SEQ ID NO:4)

• Mezcla de PCR 2x Jump Start RedTaq Sigma N.° P0982

• Máquina de PCR

• Columnas MinElute de Qiagen Qiagen (N.° 28004)

El ADN ligado purificado se eluyó 25 veces y a continuación se preparó una mezcla de reacción PCR de la siguiente manera:

El termociclado se realizó en una máquina de PCR en las siguientes condiciones:

• 2 min a 94 0C

• [45 s a 94 0C, 45 s a 65 0C, 2 min a 70 0C] 16 ciclos

• 5 min a 70 0C

• Retención a 4 0C

Los productos de PCR se purificaron de las enzimas, tampón, etc. en una columna MinElute de Qiagen eluyendo en 10 μl de EB. La biblioteca de ADN resultante está lista para amplificación sobre una plataforma de PCR de superficie. Validación de la biblioteca

Se clonó 1 μl de la biblioteca de ADN en un vector plasmídico y se sembró en placas de agar. Se seleccionaron 19 colonias, se sometieron a miniprep y los insertos clonados se secuenciaron mediante secuenciación Sanger convencional. Los datos de secuencia obtenidos fueron los siguientes:

Clon 1 (SEQ ID NO:5)

Clon 2 (SEQ ID NO:6)

Clon 3 (SEQ ID NO:7)

Clon 4 (SEQ ID NO:8)

Clon 5 (SEQ ID NO:9)

Clon 6 (SEQ ID NO:10)

Clon 7 (SEQ ID NO:11)

Clon 8 (SEQ ID NO:12)

Clon 9 (SEQ ID NO:13)

Clon 10 (SEQ ID NO:14)

Clon 11 (SEQ ID NO:15)

Clon 12 (SEQ ID NO:16)

Clon 13 (SEQ ID NO:17)

Clon 14 (SEQ ID NO:18)

Clon 15 (SEQ ID NO:19)

Clon 16 (SEQ ID NO:20)

Clon 17 (SEQ ID NO:21)

Clon 18 (SEQ ID NO:22)

Clon 19 (SEQ ID NO:23)

Estos resultados confirman que el método de preparación de bibliotecas produce una biblioteca de moldes de ADN “secuenciables” que contienen una mezcla de fragmentos de diferente secuencia. Se encontró que el ADN inserto de cada uno de los 19 clones secuenciados se alineaba con una secuencia de referencia del genoma humano (alineamiento no mostrado), lo que ilustra que el método produce una biblioteca de moldes que refleja realmente la composición de secuencia de los fragmentos diana de partida (es decir, los clones contienen fragmentos genómicos humanos en lugar de una secuencia “ redundante” ).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para generar una biblioteca de moléculas polinucleotídicas molde que tienen secuencias comunes en sus extremos 5' y secuencias comunes en sus extremos 3', en donde las secuencias comunes en el extremo 5' de cada molde individual de la biblioteca no son idénticas ni totalmente complementarias a las secuencias comunes en el extremo 3' de dicho molde, comprendiendo el método:

recoger los productos de amplificación de la reacción PCR para proporcionar una biblioteca de moléculas polinucleotídicas molde que tienen secuencias comunes en sus extremos 5' y secuencias comunes en sus extremos 3';

en donde los dúplex de polinucleótido diana a ligar son una mezcla compleja de fragmentos de ADN genómico que representan un genoma completo o sustancialmente completo, y en donde la biblioteca de moléculas polinucleotídicas molde generadas es representativa del genoma completo o sustancialmente completo.

2. El método según la reivindicación 1, en donde la reacción de extensión de cebador inicial comprende:

a) hibridar un primer oligonucleótido cebador con una parte de adaptador de cada una de las construcciones adaptador-diana, en donde el primer oligonucleótido cebador es un cebador con cola que comprende una cola 5' no hibridante,

b) extender el primer oligonucleótido cebador por adición secuencial de nucleótidos para formar productos de extensión complementarios al menos a una cadena de cada una de las construcciones adaptadordiana, y

c) someter los productos obtenidos en la etapa b) a condiciones desnaturalizantes, separando de este modo los productos de extensión de cadenas de las construcciones adaptador-diana.

3. El método de la reivindicación 2, que comprende la etapa de hibridar segundos oligonucleótidos cebadores con los productos de extensión y extender los segundos oligonucleótidos cebadores para formar cadenas complementarias a los productos de extensión.

4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el primer oligonucleótido cebador utilizado en la reacción de extensión de cebador inicial se hibrida con una región no emparejada de los adaptadores.

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la reacción en cadena de la polimerasa se realiza utilizando primeros cebadores oligonucleotídicos que pueden hibridarse con una región no emparejada de la parte de adaptador de una primera cadena de las construcciones adaptador-diana y segundos cebadores oligonucleotídicos que pueden hibridarse con una región de las cadenas extendidas producidas por extensión de los primeros cebadores oligonucleotídicos, siendo esta región complementaria a la región no emparejada de la parte de adaptador en una segunda cadena de las construcciones adaptador-diana.

6. El método según la reivindicación 5, en donde los segundos cebadores también son cebadores con cola que comprenden una parte de cola en 5' que no se hibrida con los adaptadores con emparejamiento erróneo.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde los polinucleótidos adaptadores con emparejamiento erróneo son adaptadores bifurcados formados por hibridación de la primera y segunda cadenas de polinucleótidos parcialmente complementarias, en donde una secuencia de 5 o más nucleótidos consecutivos en el extremo 3' de la primera cadena es complementaria a una secuencia de 5 o más nucleótidos consecutivos en el extremo 5' de la segunda cadena de tal manera que una región bicatenaria de 5 o más pares de bases consecutivos se forma hibridando las dos cadenas y en donde una secuencia de al menos 10 nucleótidos consecutivos en el extremo 5' de la primera cadena y una secuencia de al menos 10 nucleótidos consecutivos en el extremo 3' de la segunda cadena no son complementarias de tal manera que la región no emparejada de al menos 10 nucleótidos consecutivos en cada cadena permanece como una forma monocatenaria cuando la región bicatenaria se hibrida.

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde los dúplex de polinucleótido diana son fragmentos de un genoma completo.

9. Un método de amplificación de ácidos nucleicos en fase sólida de moléculas polinucleotídicas molde que comprende:

preparar una biblioteca de moléculas polinucleotídicas molde que tienen secuencias comunes en sus extremos 5' y secuencias comunes en sus extremos 3' utilizando el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico en fase sólida en donde dichas moléculas polinucleotídicas molde se amplifican.

10. Uso de una biblioteca de moléculas polinucleotídicas molde preparadas según el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, como un molde para la amplificación en fase sólida.

11. Uso según la reivindicación 10, en donde los dúplex de polinucleótidos diana son fragmentos de un genoma completo y en donde la amplificación en fase sólida es una amplificación del genoma completo.

12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, en donde al menos una de dichas secuencias comunes comprende la secuencia de SEQ ID NO 1, o la secuencia de SEQ ID NO 2.