ES2893153T3 - Clonación de ácidos nucleicos monocatenarios - Google Patents

Clonación de ácidos nucleicos monocatenarios

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Abstract

Un oligonucleótido que comprende (a) una porción bicatenaria, cuya porción bicatenaria es ADN y tiene de 9 a 30 pares de bases de longitud; (b) un bucle que conecta el extremo 3' de la primera cadena de dicha porción bicatenaria con el extremo 5' de la segunda cadena de dicha porción bicatenaria, comprendiendo dicho bucle, en dirección de 5' a 3': (ba) una primera porción de ADN que tiene de 4 a 20 nucleótidos de longitud; (bb) un espaciador no-ácido nucleico seleccionado entre un espaciador de oligoetilenglicol y un espaciador de oligometileno; y (bc) una segunda porción de ADN que tiene de 4 a 20 nucleótidos de longitud; en donde dicha primera porción de ADN y dicha segunda porción de ADN no son complementarias entre sí; (c) un saliente monocatenario en su extremo 5', teniendo dicho saliente de 5 a 40 nucleótidos de longitud, en el que (ca) el enlace que conecta dicha porción bicatenaria con el nucleótido de dicho saliente que está directamente adyacente a dicha porción bicatenaria es escindible en condiciones alcalinas; y (cb) dicho saliente comprende opcionalmente una secuencia de código de barras, teniendo preferentemente dicha secuencia de código de barras de 5 a 10 nucleótidos de longitud; y opcionalmente (d) dentro de uno, más o todos de (a), (b) y (c), uno, más o todos los siguientes: (da) uno o más nucleótidos modificados; (db) una o más secuencias que confieren compatibilidad con los kits de secuenciación de ácidos nucleicos, siendo dicha compatibilidad preferentemente la presencia de regiones dentro de dicho oligonucleótido que son complementarias a los cebadores comprendidos en dichos kits de secuenciación; y (dc) una o más bases aleatorias.

Description

DESCRIPCIÓN
Clonación de ácidos nucleicos monocatenarios
La presente invención se refiere a un oligonucleótido que comprende (a) una porción bicatenaria, cuya porción bicatenaria es ADN y tiene de 9 a 30 pares de bases de longitud; (b) un bucle que conecta el extremo 3' de la primera cadena de dicha porción bicatenaria con el extremo 5' de la segunda cadena de dicha porción bicatenaria, comprendiendo dicho bucle, en dirección de 5' a 3': (ba) una primera porción de ADN que tiene de 4 a 20 nucleótidos de longitud; (bb) un espaciador no-ácido nucleico seleccionado entre un espaciador de oligoetilenglicol y un espaciador de oligometileno; y (bc) una segunda porción de ADN que tiene de 4 a 20 nucleótidos de longitud; en donde dicha primera porción de ADN y dicha segunda porción de ADN no son complementarias entre sí; (c) un saliente monocatenario en su extremo 5', teniendo dicho saliente de 5 a 40 nucleótidos de longitud, en donde (ca) el enlace que conecta dicha porción bicatenaria con el nucleótido de dicho saliente que está directamente adyacente a dicha porción bicatenaria es escindible en condiciones alcalinas; y (cb) dicho saliente comprende opcionalmente una secuencia de código de barras, teniendo preferentemente dicha secuencia de código de barras de 5 a 10 nucleótidos de longitud; y opcionalmente (d) dentro de uno, más o todos de (a), (b) y (c), uno, más o todos los siguientes: (da) uno o más nucleótidos modificados; (db) una o más secuencias que confieren compatibilidad con los kits de secuenciación de ácidos nucleicos, siendo dicha compatibilidad preferentemente la presencia de regiones dentro de dicho oligonucleótido que son complementarias a los cebadores comprendidos en dichos kits de secuenciación; y (dc) una o más bases aleatorias.
Se encuentran disponibles varios métodos para estudiar la interacción proteína-ADN en células vivas. Estos métodos generalmente utilizan reticulación de formaldehído para fijar las interacciones ADN-proteína in vivo, después de lo cual las células se tratan con ultrasonidos para liberar trozos de cromatina que contienen fragmentos de ADN de un tamaño en el intervalo de ~ 150-500 pb. Después se aísla el ADN, se clona usando kits disponibles comercialmente y se secuencia. Esto ahora se considera una práctica convencional y los resultados de numerosos experimentos de este tipo están disponibles públicamente.
Estudiar las interacciones proteína-ARN es más desafiante. Aunque existen algunos protocolos, estos métodos no se aplican ampliamente porque son muy laboriosos y requieren el uso de radiactividad.
Con más detalle, un protocolo establecido generalmente implica: (i) reticulación de la proteína de interés al ARN con UV-C o un reticulante químico tal como formaldehído; (ii) inmunoprecipitar la proteína con un anticuerpo específico; (iii) aislar el ARN unido; (iv) clonar el ARNmc con un kit disponible comercialmente; (v) secuenciar; y (vi) analizar las secuencias determinadas.
Los datos resultantes suelen ser extremadamente complicados debido a la presencia de ARN contaminante, tal como los ARNt, ARNnp (en inglés, snRNAs), ARN ribosómicos, etc. En segundo lugar, los fragmentos secuenciados tendrán un perfil amplio, es decir, la mayoría de las proteínas de unión a ARN reconocerán de 6 a 12 nts, pero los fragmentos que se secuencian serán ~ 100-200 nt sin ninguna información de posición sobre dónde podría haberse producido la unión de las proteínas de unión al ARN en la célula.
Protocolos más recientes (CLIP, HITS-CLIP, PAR-CLIP, iCLIP, CRAC, CLASH) evitan estas deficiencias. Al final del protocolo, con frecuencia se obtienen datos relativamente limpios (mucha menos contaminación por ARNt, ARNnp, ARN ribosómico). Además, se puede determinar la posición del sitio de reticulación. Los inconvenientes incluyen que estos protocolos son difíciles, especialmente en la medida en que dependen del uso de radiactividad (y-32P ATP se utiliza para marcar los ARN unidos); y por lo general tardan alrededor de una semana en completarse.
El documento WO2012/103154 describe medios y métodos para manipular moléculas de ácidos nucleicos, especialmente por amplificación y unión del adaptador. El documento describe cebadores/adaptadores de horquilla quiméricos de ARN/ADN que se utilizan durante la manipulación del ácido nucleico diana. El documento no aborda el tema de la generación de bibliotecas a partir de ácido nucleico monocatenario. Por otra parte, la noción de un adaptador que comprende un enlazador no-ácido nucleico es ajena al presente documento.
Dadas las deficiencias de la técnica anterior, el problema técnico que subyace a la presente invención puede verse en la provisión de medios y métodos alternativos o mejorados para secuenciar ácidos nucleicos monocatenarios, para producir bibliotecas a partir de ácidos nucleicos monocatenarios y para analizar interacciones proteína-ácido nucleico. La solución a estos problemas técnicos la proporcionan los aspectos y realizaciones divulgados a continuación.
La invención se define por las reivindicaciones.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un oligonucleótido que comprende (a) una porción bicatenaria, cuya porción bicatenaria es ADN y tiene de 9 a 30 pares de bases de longitud; (b) un bucle que conecta el extremo 3' de la primera cadena de dicha porción bicatenaria con el extremo 5' de la segunda cadena de dicha porción bicatenaria, comprendiendo dicho bucle, en dirección de 5' a 3': (ba) una primera porción de ADN que tiene de 4 a 20 nucleótidos de longitud; (bb) un espaciador no-ácido nucleico seleccionado entre un espaciador de oligoetilenglicol y un espaciador de oligometileno; y (bc) una segunda porción de ADN que tiene de 4 a 20 nucleótidos de longitud; en donde dicha primera porción de a Dn y dicha segunda porción de ADN no son complementarias entre sí; (c) un saliente monocatenario en su extremo 5', teniendo dicho saliente de 5 a 40 nucleótidos de longitud, en donde (ca) el enlace que conecta dicha porción bicatenaria con el nucleótido de dicho saliente que está directamente adyacente a dicha porción bicatenaria es escindible en condiciones alcalinas; y (cb) dicho saliente comprende opcionalmente una secuencia de código de barras, teniendo preferentemente dicha secuencia de código de barras de 5 a 10 nucleótidos de longitud; y opcionalmente (d) dentro de uno, más o todos de (a), (b) y (c), uno, más o todos los siguientes: (da) uno o más nucleótidos modificados; (db) una o más secuencias que confieren compatibilidad con los kits de secuenciación de ácidos nucleicos, siendo dicha compatibilidad preferentemente la presencia de regiones dentro de dicho oligonucleótido que son complementarias a los cebadores comprendidos en dichos kits de secuenciación; y (dc) una o más bases aleatorias.
El término "oligonucleótido" (a veces brevemente "oligo") tiene su significado establecido en la técnica. Se refiere a un policondensado de nucleótidos. Los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos y nucleótidos modificados. Los nucleótidos modificados, cuya presencia es opcional, pueden ser nucleótidos bloqueados. El uso de nucleótidos bloqueados es un medio de estabilizar la porción bicatenaria.
El oligonucleótido de la invención también se denomina "adaptador" en el presente documento.
Un requisito de que una determinada parte del oligonucleótido de la invención sea ADN implica que esta parte consiste exclusivamente en desoxirribonucleótidos o en desoxirribonucleótidos y nucleótidos modificados. Se excluye la presencia de ribonucleótidos.
De manera similar, en la medida en que sea necesario que una parte del oligonucleótido sea ARN (esto se aplica a una realización preferida divulgada a continuación), esto implica que esta parte bien consiste exclusivamente en ribonucleótidos o en ribonucleótidos y nucleótidos modificados. También en este contexto, se da preferencia a los nucleótidos modificados que son nucleótidos bloqueados.
Preferentemente, la presencia de nucleótidos modificados no supera el 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 2 % o 1 % de las posiciones en toda la molécula y/o dentro de cualquiera de (a), (ba), (bc) y (c).
Otros nucleótidos modificados contemplados son nucleótidos con bases modificadas y/o modificaciones de la ribosa y/o modificaciones del fosfato. Las modificaciones de la ribosa preferidas incluyen modificaciones 2' tales como 2'-O-metilo. Las modificaciones del fosfato preferidas incluyen tiofosfato.
En vista de las definiciones dadas anteriormente, un oligonucleótido según la invención puede comprender hasta 140 nucleótidos. Para facilitar la referencia, también para moléculas de esa longitud, se usa en el presente documento el término "oligonucleótido". La longitud mínima, contando solo nucleótidos y no el espaciador no-ácido nucleico, es de 31 nucleótidos. El oligonucleótido ilustrativo que se describe más adelante y se muestra en las figuras tiene una longitud de 50 nucleótidos.
El oligonucleótido según la invención tiene tres componentes obligatorios, designados (a), (b) y (c).
La porción bicatenaria de acuerdo con (a) es ADN en el sentido de la definición dada anteriormente. Puede tener una longitud de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 pares de bases. Se da preferencia a la perfecta complementariedad. Como alternativa, pueden estar presentes uno o más emparejamientos incorrectos, por ejemplo, uno, dos o tres emparejamientos incorrectos. En cualquier caso, el número total de nucleótidos comprendidos en la porción bicatenaria (a) es un número par entre 18 y 60. La presencia de protuberancias, preferentemente no más de 1, 2 o 3, aunque no se prefiere, no está excluida. Dado que una protuberancia da como resultado la no identidad del número de nucleótidos comprendidos en la primera y segunda cadena, respectivamente, se deduce que la porción bicatenaria puede comprender un número total de nucleótidos que es cualquier valor entero de 18 a 60.
La porción bicatenaria, cuando se considera de forma aislada, se puede considerar que consiste en una primera y una segunda cadena. La primera cadena es la cadena que lleva el saliente 5' de acuerdo con la característica (c). La segunda cadena es la cadena complementaria.
El bucle de acuerdo con (b) contiene tanto ADN como un espaciador no-ácido nucleico. Las dos porciones de ADN de acuerdo con (ba) y (bc) tienen cada una e independientemente una de la otra una longitud de entre 4 y 20 nucleótidos, mucho más preferentemente entre 5 y 10 nucleótidos. También se prevé cualquier otro valor entero que se encuentre en estos intervalos, incluyendo también 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 y 19. La primera y segunda porciones de ADN (ba) y (bc) pueden tener una longitud igual o diferente.
El espaciador no-ácido nucleico se define en términos funcionales en la presente divulgación. La química no está particularmente limitada. El requisito "no interfiere con la formación de una horquilla por dicho oligonucleótido" implica un cierto grado de flexibilidad. En particular, se excluye cualquier implementación estructural que no permita el emparejamiento de bases de las dos cadenas de la porción bicatenaria de acuerdo con (a). Las implementaciones de acuerdo con la invención se divulgan a continuación.
A diferencia de las dos cadenas que forman la porción bicatenaria de acuerdo con (a), las porciones de ADN primera y segunda de acuerdo con (ba) y (bc) no son complementarias entre sí. Preferentemente, la expresión "no complementarias" se refiere a la ausencia de cualquier complementariedad entre la primera y la segunda porciones de ADN de acuerdo con (ba) y (bc). Esto no excluye, no obstante, que en una realización menos preferida pueda haber 1, 2 o 3 pares de bases entre la primera y la segunda porciones de ADN de acuerdo con (ba) y (bc).
A modo de explicación, se consideran dos moléculas hipotéticas bicatenarias totalmente complementarias. La primera molécula consiste en (i) una cadena que a su vez consiste en la primera cadena de dicha porción bicatenaria (a) y la porción de ADN adyacente (ba), y (ii) una cadena que es perfectamente complementaria a la misma. De manera análoga, la segunda molécula hipotética completamente bicatenaria consiste en (iii) una cadena que a su vez consiste en la segunda porción de ADN (bc) y la segunda cadena adyacente de la porción bicatenaria (a), y (iv) una cadena que es perfectamente complementaria a la misma. Se entiende que mientras en estas dos moléculas hipotéticas, cada una de (ba) y (bc) tiene una secuencia complementaria, esto no se aplica al oligonucleótido de la invención. Se determina o calcula la temperatura de fusión de cada una de las dos moléculas hipotéticas completamente bicatenarias. La diferencia de temperatura de fusión entre las dos moléculas hipotéticas no superará los 5 °C. Este es un medio de optimizar la amplificación por PCR.
El constituyente (c) tiene un saliente monocatenario que tiene 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleótidos de longitud. La única característica obligatoria de dicho saliente está definida por la característica (ca). Se describe con más detalle a continuación una implementación estructural preferida del requisito (ca), en concreto, que el primer nucleótido en el extremo 3' del saliente 5' es un ribonucleótido.
Una finalidad del oligonucleótido de la invención es servir como adaptador en la generación de una biblioteca, preferentemente una biblioteca de secuenciación. Una biblioteca de secuenciación es una biblioteca diseñada para secuenciar. Los adaptadores de última generación están diseñados normalmente por material de ácido nucleico que es bicatenario, especialmente ADN bicatenario. El oligonucleótido según la presente invención está equipado con características estructurales que lo hacen útil para la generación de bibliotecas a partir de ácido nucleico monocatenario. La expresión "ácido nucleico monocatenario" incluye ADN monocatenario, así como ARN monocatenario, siendo preferido el ARN monocatenario.
Un ARN monocatenario común es el ARNm. De este modo, el oligonucleótido de la presente invención es particularmente útil para experimentos que tienen como objetivo dilucidar las interacciones proteína-ARN monocatenario, especialmente interacciones proteína-ARNm. El término "dilucidar" en este contexto incluye determinar el tipo de interacción, más específicamente, la secuencia del ARN monocatenario que interacciona con una proteína dada y/o el sitio o sitios específicos de interacción entre dicha proteína y dicho ARN monocatenario.
Alternativamente, se va a generar una biblioteca a partir de ADN monocatenario como material de partida. El ADN monocatenario puede tener como origen diversas fuentes, incluyendo dichas fuentes ADNbc (en inglés, dsDNA) tratado con exonucleasas 5'-3'. En la medida en que se investiguen las interacciones ADN-proteína, la proteína y el ADN pueden estar reticulados, por ejemplo, mediante formaldehído, antes de someter la mezcla a un tratamiento con exonucleasas 5'-3'. Antes del tratamiento con exonucleasas, el ADN puede fragmentarse mediante ultrasonidos. Otra fuente de ADN monocatenario es el ADN bicatenario desnaturalizado por calor. Por ejemplo, calentar el ADN bicatenario de 95 a 100 °C lo convierte en ADNmc (en inglés, ssDNA) que puede usarse como material de partida para los métodos de acuerdo con la presente invención, haciendo uso estos métodos del oligonucleótido de acuerdo con el primer aspecto. Un tercer origen posible del ADN monocatenario es el ADN degradado de forma natural. Dicho material se encuentra generalmente en fragmentos óseos o tejidos en descomposición. Este es un material de partida con el que normalmente se enfrentan los antropólogos y los científicos forenses.
Desviándose de los adaptadores de última generación, el oligonucleótido de la presente invención se caracteriza, entre otras, por las siguientes características: (i) La presencia de un saliente 5', es decir, característica (c) del primer aspecto. Esto permite la transcripción inversa de la construcción formada mediante la unión del ácido nucleico monocatenario al oligonucleótido de la invención (para detalles adicionales, véase a continuación). (ii) Mientras que los adaptadores de última generación comprenden normalmente dos cadenas sencillas separadas que se asocian de forma no covalente, el adaptador de la presente invención es un oligonucleótido monocatenario (que contiene una porción bicatenaria como se define anteriormente). Como consecuencia, el oligonucleótido de la invención asume la estructura de una horquilla. La porción de horquilla contiene elementos de ácido nucleico, así como (iii) un espaciador no-ácido nucleico. El espaciador no-ácido nucleico hace que dejen de funcionar las polimerasas. Como consecuencia, en el protocolo que hace uso del oligonucleótido como se divulga adicionalmente a continuación, no hay ningún requisito de linealización antes de la amplificación por PCR.
En comparación con los complicados protocolos conocidos del estado de la técnica anterior con el fin de dilucidar las interacciones de los ácidos nucleicos monocatenarios con proteínas, el oligonucleótido de la presente invención permite un procedimiento fuerte, rápido y capaz de alto rendimiento. Este procedimiento es objeto de otros aspectos de la presente invención que se divulgan a continuación.
Volviendo a las características opcionales del oligonucleótido de acuerdo con el primer aspecto, cabe señalar que, para determinadas aplicaciones, es deseable la multiplexación. Multiplexar significa que el ácido nucleico, en particular el ácido nucleico monocatenario, procedente de una pluralidad de fuentes, se agrupa. El material agrupado se somete a un procesamiento posterior, incluyendo normalmente el procesamiento posterior, la secuenciación. Este es un medio para aumentar adicionalmente el rendimiento. Por otro lado, surge la necesidad de determinar, tras la secuenciación, de qué fuente particular se obtuvo originalmente una secuencia de interés. Esto se realiza usando secuencias de códigos de barras, en donde cada fuente recibe un código de barras diferente. Las secuencias de códigos de barras son secuencias de oligonucleótidos cortas que tienen una longitud de preferentemente 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos. Las secuencias de códigos de barras, si están presentes, normalmente se producen en una posición conocida con el oligonucleótido.
El oligonucleótido según el primer aspecto puede comprender, además, dentro de uno, más o todos de (a), (b) y (c), una o más características opcionales que se divulgan anteriormente y se explicarán con más detalle a continuación. Estas características opcionales no implican la adición de nucleótidos o secuencias. Más bien, definen como pueden implementarse uno, más o todos de (a), (b) y (c).
La expresión anterior "uno, más o todos de (a), (b) y (c) "indica que, por ejemplo, pueden estar presentes uno o más nucleótidos modificados solo dentro de (a), solo dentro de (b), solo dentro de (c), dentro de (a) y (b), dentro de (a) y (c), dentro de (b) y (c), o dentro de todos de (a), (b) y (c). Lo mismo aplica mutatis mutandis para las secuencias que confieren compatibilidad de acuerdo con (db). Por ejemplo, y esto se hará evidente también a la vista de las realizaciones preferidas o ilustrativas que se divulgan a continuación, la secuencia de (a) más (ba) puede comprender o consistir en una secuencia que es complementaria a un cebador establecido en la técnica. De manera similar, la secuencia de (a) más (bb) puede comprender o consistir en una secuencia que es complementaria a otro cebador establecido en la técnica.
Una característica opcional adicional es la presencia de una o más secuencias en dicho oligonucleótido, confiriendo dichas secuencias compatibilidad con los kits de secuenciación de ácidos nucleicos. Los kits de secuenciación de ácidos nucleicos están bien establecidos en el mercado y pueden obtenerse de varios fabricantes tal como Illumina (San Diego, EE. UU.) y Life Technologies (Carlsbad (CA), EE.UU.; nombre del producto: IonTorrent). Más específicamente, las secuencias particulares elegidas para implementar los requisitos establecidos en el primer aspecto pueden diseñarse de manera que los cebadores disponibles comercialmente, p. ej. de Illumina, las reconozcan y se unan a ellas. Dichos cebadores, a su vez, pueden contener características adicionales, en particular, otras secuencias que no están comprendidas en el oligonucleótido según la invención ni tienen un homólogo en el oligonucleótido según la invención, cuyas secuencias adicionales proporcionan la unión al césped de oligonucleótidos presente en la superficie, por ejemplo, de las celdas de flujo de Illumina.
Lo mismo aplica mutatis mutandis para la compatibilidad con el sistema IonTorrent. Además, esto se puede realizar eligiendo las secuencias de acuerdo con los elementos anteriores (a), (ba) y (bc) apropiadamente.
Para explicar más la característica de compatibilidad con los kits de secuenciación, se presta atención a las construcciones ilustrativas que se muestran en las figuras adjuntas al presente documento. En particular, las secuencias de (a) más (ba) de la construcción mostrada en las figuras comprenden juntas una secuencia que es complementaria a una secuencia de cebador denominada "TruSeq Read 1" del sistema Illumina. Este es el cebador convencional para secuenciar los extremos 5' de las bibliotecas. Sin embargo, esto no es obligatorio para la secuenciación o la generación de grupos en las celdas de flujo de Illumina. En principio, uno se es libre de cambiar (a) y (ba); esto simplemente implicaría el requisito de utilizar un cebador diferente para la secuenciación posterior. De manera similar, las secuencias de (a) más (bb) de la construcción mostrada en las figuras juntas comprenden una secuencia que es complementaria a otro cebador de secuenciación convencional de Illumina ("Multiplex Read 2"). Este cebador se usa comúnmente para las secuencias del extremo 3' de las bibliotecas. "Complementario" en este contexto significa preferentemente 100 % de complementariedad, pero permite 1, 2 o 3 emparejamientos incorrectos.
La compatibilidad con los kits de secuenciación disponibles comercialmente no implica el requisito de adaptar el saliente de acuerdo con (c). Este saliente es una característica especial de acuerdo con la presente invención que hace que el oligonucleótido sea susceptible de transcripción inversa.
Otra característica opcional son una o más, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, bases aleatorias. Preferentemente, dichas bases aleatorias están ubicadas en el saliente 5' (c). La expresión "bases aleatorias" designa una base con naturaleza química indeterminada. Más específicamente, una base aleatoria puede ser cualquiera de A, C, G o T/U. Puede aparecer una base aleatoria dentro de un ribonucleótido o un desoxirribonucleótido.
Se pueden utilizar bases aleatorias para el control de calidad, más específicamente para diferenciar entre verdaderos duplicados de PCR y lecturas de secuencia que parecen ser duplicados de PCR pero que en realidad proceden de eventos de unión independientes.
Una posición preferida de una base aleatoria es el extremo 5' del oligonucleótido según la invención.
Una, más o la totalidad de dichas bases aleatorias pueden ser bases semialeatorias. Una base semialeatoria es una base que puede elegirse entre menos de cuatro de las bases naturales en el ADN o en el ARN. Las bases semialeatorias preferidas son pirimidinas (Y) y purinas (R). En consecuencia, las bases semialeatorias Y deben elegirse entre C y T/U, mientras que las bases semialeatorias R deben elegirse entre A y G.
Las condiciones alcalinas de acuerdo con (ca) implican preferentemente un pH superior a 12.
Un oligonucleótido ilustrativo según la invención se muestra en la parte (A) de la figura 2. En la figura 1 se muestra un dibujo esquemático que ilustra las características estructurales clave. Como se ha indicado anteriormente, el saliente monocatenario (c) puede ser ADN o ARN. Las dos alternativas se muestran en la figura 1. El nucleótido en el extremo 3' del saliente que es el nucleótido de dicho saliente que está directamente adyacente a la porción bicatenaria (a) es un ribonucleótido, en cualquier caso. El nucleótido 5' del saliente (que también es el extremo 5' del oligonucleótido completo) está fosforilado. Las posiciones 3 a 8 son una secuencia de código de barras ilustrativa. El espaciador noácido nucleico de acuerdo con la presente invención se muestra como una línea curva en la figura 1 así como en la parte (B) de la figura 2. En la parte (A) de la figura 2, se indica como "~18C~".
En una realización preferida, (a) la temperatura de fusión de dicha porción bicatenaria está entre 37 °C y 70 °C, preferentemente entre 60 °C y 65 °C; y/o (b) el número de emparejamientos incorrectos entre dicha primera cadena y dicha segunda cadena es 0, 1, 2 o 3.
Según la invención, dicho espaciador no-ácido nucleico es un espaciador de oligoetilenglicol o un espaciador de oligometileno.
En una realización preferida, dicho un espaciador de oligoetilenglicol es -(CH2CH2O)n-, siendo n un número entero entre 3 y 10, preferentemente 6. En otras palabras, el fosfato que conecta dos nucleótidos adyacentes se reemplaza preferentemente por -O-(CH2CH2O),-OPO3-,
En una realización preferida, dicho espaciador de oligometileno es -(CH2)m-, siendo m un número entero entre 5 y 50, siendo 18 un valor preferido de m.
En términos generales, existe una gran cantidad de implementaciones estructurales a disposición del experto de un espaciador no-ácido nucleico que cumple los requisitos (i) y (ii) como se especifica de acuerdo con el primer aspecto. Los ejemplos incluyen nucleótidos abásicos, tal como 1',2'-didesoxirribosa (también llamada dBase); espaciador de trietilenglicol tal como colesterol TEG; enlazadores fotoescindibles; bases no naturales; bases naturales con modificaciones que bloquean las polimerasas tales como dímeros de timidina glicol y cis-syn de timina; versiones zurdas de nucleótidos; y tiol SS Serinol Dipod. Los productos correspondientes están disponibles de diversos fabricantes, incluido Gene Link (Hawthorne, NY, EE.UU.). Todas estas implementaciones estructurales del enlazador no-ácido nucleico de acuerdo con la presente invención proporcionan suficiente flexibilidad para que no interfieran con la formación de una horquilla de dicho oligonucleótido y además provoquen que deje de funcionar cualquier polimerasa. Pueden determinarse fácilmente longitudes apropiadas y/o número de grupos (tal como el número de nucleótidos abásicos, etc.).
En una realización preferida adicional, dicho nucleótido de dicho saliente que está directamente adyacente a dicha porción bicatenaria comprende ribosa.
En una realización preferida adicional, dicho saliente es ARN. En la medida en que los nucleótidos modificados estén comprendidos en dicho saliente, se entiende que también se prefiere que los enlaces químicos de la cadena principal que conectan con cualquiera de dichos nucleótidos modificados con partes tanto cadena arriba como cadena abajo dentro de dicho saliente sean susceptibles de escisión en aquellas condiciones en las que el ARN sea susceptible de escisión. Las condiciones de escisión preferidas se divulgan a continuación en el presente documento.
Alternativamente, el saliente puede ser ADN o puede contener tanto ribonucleótidos como desoxirribonucleótidos. Además, y como se ha mencionado anteriormente, la opción de nucleótidos modificados se aplica a toda la molécula. En cualquier caso, también cuando el saliente esté hecho de ADN, debe cumplirse la característica (ca) del primer aspecto en su definición más amplia, en donde elegir dicho nucleótido de dicho saliente que está directamente adyacente a dicha porción bicatenaria para que sea un ribonucleótido es una opción para implementar la característica (ca).
El extremo 5' de dicho oligonucleótido puede ser susceptible de unión y/o comprende un fosfato 5', un grupo hidroxi 5', un trifosfato 5' o un fosfato 5' adenilado previamente; y/o el extremo 3' de dicho oligonucleótido puede ser capaz de funcionar como un cebador y/o comprende un hidroxi 3' o un fosfato 3'.
Un extremo 5' adenilado previamente es un extremo 5' en donde una riboadenosina difosfato se une mediante un éster de fosfato al grupo hidroxi 5' del nucleótido 5' terminal. Se puede realizar la adenilación previa, por ejemplo, con un kit disponible comercialmente como el kit de New England Biolabs (Ipswich, MA, EE.UU.). Como alternativa, la ARN ligasa 1 de T4 se puede utilizar para la adenilación previa (por ejemplo, como se describe en Song et al., Scientific Reports 5, Artículo N.°: 15620 (2015)).
En una realización particularmente preferida, dicho extremo 5' de dicho oligonucleótido está 5' adenilado previamente, dicho extremo 3' lleva un fosfato 3' y dicho saliente es ARN. Junto con este diseño del oligonucleótido, se prefiere eliminar el fosfato 3' de acuerdo con la etapa (ac) como se describe con más detalle a continuación.
La combinación de características divulgadas anteriormente es una forma posible de evitar total o casi totalmente la formación de dímeros adaptadores. La formación de dímeros adaptadores no es deseable ya que, en lugar de producir el producto de clonación deseado, los adaptadores se dimerizan y ya no están disponibles para la reacción deseada. Existe una preocupación significativa en el estado de la técnica anterior acerca de la formación de dímeros adaptadores. Los métodos establecidos en la técnica son complicados porque normalmente requieren etapas de purificación separadas con el fin de evitar la formación de dímeros adaptadores.
El extremo 3' del oligonucleótido es el punto de partida para la transcripción inversa.
Dichos uno o más nucleótidos modificados, en la medida en que estén presentes, puede incluir LNA (por sus siglas en inglés).
El término “LNA ” designa ácidos nucleicos bloqueados. Se conocen en la técnica ácidos nucleicos bloqueados, así como sus componentes básicos, nucleótidos bloqueados. Un puente de metileno conecta el 2' O y el 4' C de la ribosa. Los nucleótidos bloqueados son un medio para estabilizar la conformación helicoidal de las porciones bicatenarias. Por consiguiente, los nucleótidos bloqueados se pueden usar para acortar las porciones bicatenarias mientras se mantiene una temperatura de fusión determinada.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona el uso del oligonucleótido como se define en cualquiera de los aspectos y realizaciones anteriores para la generación de una biblioteca, preferentemente una biblioteca de secuenciación, a partir de ácido nucleico monocatenario.
En una realización preferida de dicho uso, dicha generación implica transcripción inversa y amplificación. Los medios y métodos preferidos para implementar la transcripción inversa, así como la amplificación se divulgan con más detalle a continuación.
En otra realización preferida de dicho uso, dichos oligonucleótido y cebadores para dicha amplificación son los únicos oligonucleótidos que se utilizarán.
Como se ha indicado anteriormente, una característica destacada del oligonucleótido según la invención es que contiene sitios para la transcripción inversa, así como sitios de unión para cebadores, utilizándose dichos cebadores para la amplificación. Como consecuencia, el oligonucleótido según la invención es la única molécula adaptadora necesaria para generar bibliotecas a partir de ácido nucleico monocatenario.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método de producción de una biblioteca, preferentemente una biblioteca de secuenciación, a partir de ARN monocatenario y/o ADN monocatenario, comprendiendo o consistiendo dicho método en: (a) unir dicho ARN monocatenario y/o a Dn monocatenario al oligonucleótido según el primer aspecto; (b) transcribir de manera inversa o transcribir, respectivamente, dicho ARN monocatenario o ADN monocatenario; (c) hidrolizar cualquier ARN; (d) circularizar el a Dn restante; y (e) someter el producto de (d) a amplificación por PCR.
Este método produce una biblioteca que está amplificada y preparada para secuenciación. En principio, la secuenciación se puede efectuar por cualquier medio. En la medida en que la característica de compatibilidad opcional descrita anteriormente se utilice para implementar la complementariedad con los cebadores de un determinado kit de secuenciación, obviamente se prefiere realizar la etapa de secuenciación posterior con ese kit en particular.
La unión de acuerdo con (a) se puede efectuar con cualquier ligasa. Se prefiere el uso de ARN ligasa 1 de T4, en cuyo caso se daría preferencia a los oligos 5' fosforilados. Como alternativa, es posible utilizar ARN ligasa 2 de T4 (forma truncada, preferentemente el mutante KQ) en cuyo caso se da preferencia a un oligo adenilado previamente. Los oligos adenilados previamente también son compatibles con la a Rn ligasa 1 de T4. Finalmente, puede usarse ligasa RtcB, preferentemente junto con un oligonucleótido 5' OH.
Durante la unión, dicho ARN monocatenario o ADN monocatenario se une preferentemente a un soporte sólido tal como perlas.
Teniendo en cuenta el procesamiento previo anterior preferido como se detalla a continuación, se puede introducir, por ejemplo, un soporte sólido tal como perlas en el transcurso de la etapa (2) de dicho procesamiento previo, siendo la etapa la purificación de una proteína dada. En el transcurso de dicha purificación, se puede hacer uso de perlas.
También se puede introducir un soporte sólido tal como perlas en el procedimiento en la etapa de unión. El uso de un soporte sólido proporciona una implementación específica que permite evitar por completo o evitar sustancialmente por completo la formación de dímeros adaptadores. De este modo, además de la reacción en solución evitando la formación de dímeros adaptadores como se describe anteriormente, la presente invención proporciona un segundo método que permite evitar la formación de dímeros adaptadores, empleando el segundo método un soporte sólido. Más detalles en relación con los mismos se describen con más detalle a continuación en relación con la etapa (aa) de eliminar el exceso de oligonucleótido después de la etapa (a) de unión.
Después de la unión, se puede proceder convenientemente a la transcripción inversa o la transcripción, respectivamente, de acuerdo con (b). No es necesario añadir ni hibridar un oligonucleótido para cebar una transcripción inversa. Esta propiedad ventajosa es inherente al oligonucleótido según el primer aspecto de la presente invención. Se puede hacer uso de cualquier polimerasa que tenga actividad transcriptasa inversa. La polimerasa puede comprender otras actividades, aunque no es necesario. Las actividades adicionales que pueden estar presentes en ciertas polimerasas además de la actividad transcriptasa inversa incluyen la actividad helicasa y la actividad de desplazamiento de cadena. Un ejemplo de una polimerasa que tiene actividad transcriptasa inversa y actividad de desplazamiento de cadena es la ADN polimerasa Bst. Si se va a producir una biblioteca a partir de ADN monocatenario como material de partida, se da preferencia a las polimerasas que tienen actividad transcriptasa inversa y actividad de desplazamiento de cadena. Un producto de polimerasa Bst disponible comercialmente es Bst 3.0 de New England Biolabs (Ipswich, MA, EE.UU.).
Con el fin de hidrolizar de acuerdo con (c), se puede utilizar cualquier medio que no destruya la parte que no es ARN de la molécula de ácido nucleico generada en (b). Los medios preferidos se analizan con más detalle a continuación.
La circularización de acuerdo con (d) se realiza preferentemente con CircLigase o CircLigase II.
Finalmente, la amplificación de acuerdo con (e) puede efectuarse sin ninguna purificación o linealización adicional. Esto es posible gracias al espaciador no-ácido nucleico que hace que deje de funcionar la polimerasa.
En una realización preferida del método según el tercer aspecto, dicho método comprende una o más de las siguientes etapas adicionales: (aa) eliminar el exceso de oligonucleótido después de la etapa (a) y antes de la etapa (b); (ab) agrupar diferentes muestras que contienen productos de unión obtenidos en (a), en donde los productos de unión que se originan a partir de diferentes muestras tienen un código de barras diferente de acuerdo con la característica (c) (cb) del primer aspecto divulgado anteriormente, y en donde dicha etapa (ab) debe efectuarse después de la etapa (a) y antes de la etapa (b); (ac) eliminar, después de la etapa (a) y antes de la etapa (b), el fosfato 3' de dichos productos de unión en la medida en que esté presente; y (ca) eliminar proteínas y moléculas pequeñas del ADN monocatenario obtenido en (c), la etapa (ca) debe realizarse después de la etapa (c) y antes de la etapa (d).
Un orden preferido de las etapas (aa), (ab) y (ac), en particular, en la medida en que se vayan a realizar dos o los tres, es el siguiente orden temporal: (aa), seguida de (ab) y después (ac).
En la medida en que el ARN monocatenario o el ADN monocatenario estén unidos a un soporte sólido tal como perlas (véase anteriormente), eliminar el exceso de oligonucleótido después de la etapa (a) de acuerdo con la etapa (aa) es especialmente preferido y se realiza preferentemente mediante lavado. Como consecuencia, después de unir de acuerdo con la etapa (a) y lavar de acuerdo con la etapa (aa), cada diana unida tiene un solo cebador de transcripción inversa que ya está unido covalentemente a la misma. Al adoptar este procedimiento, sorprendentemente, se elimina la gran mayoría de la formación de dímeros adaptadores. Es importante destacar que no es necesaria ninguna etapa de purificación separada, tal como la purificación mediante electroforesis en gel. Esto aumenta enormemente la eficacia y la capacidad de ampliación del protocolo.
La etapa (ab) posibilita la multiplexación mencionada anteriormente.
Se prefiere la presencia de un fosfato 3' en el oligonucleótido de la invención para prevenir su unión consigo mismo. La unión consigo mismo daría lugar a una unión incompleta del ARN o ADN monocatenario, lo cual no es deseable. Después de la unión en la etapa (a), el fosfato 3' se elimina de acuerdo con (ac).
La presencia de un 3' en el oligonucleótido de la invención durante la unión y la etapa (ac) posterior también es especialmente útil si se quiere evitar la formación de dímeros adaptadores en solución (en contraposición al uso de un soporte sólido). Se prefiere especialmente el uso y la eliminación del fosfato 3' de acuerdo con la etapa (ac) junto con el diseño de oligonucleótidos específico que se divulga anteriormente en el presente documento. Según este diseño específico, el extremo 5' de dicho oligonucleótido está 5' adenilado previamente, su extremo 3' lleva un fosfato 3' y el saliente es ARN. En ese caso, la etapa (aa) no es necesaria y preferentemente no se realiza y la etapa (ac) se realiza preferentemente en la mezcla obtenida directamente en la etapa (a).
La etapa (ac) generalmente se implementa añadiendo fosfatasa.
En principio, se puede utilizar cualquier fosfatasa a efectos de eliminar el fosfato 3'. Se puede utilizar fosfonucleótido quinasa de T4 (T4 PNK, por sus siglas en inglés), preferentemente a un pH de aproximadamente 6, para este fin. Se puede utilizar como alternativa cualquier otra fosfatasa tal como CIP, SAP, fosfatasa antártica, FastAP, en las condiciones especificadas por los fabricantes.
En una realización preferida, la eliminación del fosfato 3' de acuerdo con la etapa (ac) se realiza añadiendo fosfatasa a la mezcla de unión formada en la etapa (a). Preferentemente, se deja transcurrir una cantidad de tiempo definida después del inicio del procedimiento de unión (a) hasta que se añade la fosfatasa de acuerdo con la etapa (ac). Las cantidades de tiempo preferidas son entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 2 horas, más preferentemente entre aproximadamente 30 y aproximadamente 90 minutos, lo más preferido aproximadamente 60 minutos.
Como alternativa a la adición de fosfatasa a la mezcla de unión formada en la etapa (a), pero menos preferido, puede producirse una etapa de transferencia de un recipiente a otro recipiente y/o una etapa de purificación entre la unión de acuerdo con (a) y la adición de fosfatasa de acuerdo con (ac).
En una realización más preferida del método de la invención, dicha hidrolización de cualquier ARN se efectúa, (c1) si el saliente de dicho oligonucleótido es ARN, añadiendo RNasaH; o (c2) si dicho saliente contiene ADN, añadiendo NaOH 0,1 M.
De forma habitual, la incubación con RNasaH se realiza a 37 °C durante 10 a 60 minutos.
Para la eliminación de proteínas y moléculas pequeñas de acuerdo con (ca), se puede hacer uso de los medios y métodos establecidos en la técnica, incluida la extracción con fenol/cloroformo seguida de precipitación con etanol, columnas de sílice o fibra de vidrio adecuadas para purificación de ADN o perlas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI, por sus siglas en inglés).
El tratamiento con NaOH 0,1 M de acuerdo con (c2) se realiza preferentemente a una temperatura entre 37 °C y 70 °C, preferentemente a 70 °C, durante aproximadamente 10 minutos. Esto producirá un grupo hidroxi en el extremo 5' de la molécula de ADN restante. Este se puede convertir en un fosfato usando T4 PNK a pH neutro o ligeramente básico (pH 7 a 8) en presencia de ATP.
El método de generación de una biblioteca como se ha descrito hasta ahora puede combinarse opcionalmente con un procesamiento previo anterior. Este es el tema de la siguiente realización preferida.
Por consiguiente, en una realización preferida adicional del método de acuerdo con el tercer aspecto, dicho método comprende las siguientes etapas antes de la etapa (a): (1) opcionalmente reticular una muestra que comprende células; (2) purificar a partir de dicha muestra una proteína dada, estando dicha proteína unida o reticulada a ácido nucleico monocatenario o bicatenario; (3) convertir dicho ácido nucleico, si es bicatenario, en ácido nucleico monocatenario; y (4) recortar el ácido nucleico monocatenario unido o reticulado a dicha proteína.
La conversión de ADN bicatenario en ADN monocatenario puede efectuarse con exonucleasa lambda.
El recorte de acuerdo con la etapa (4) se realiza preferentemente con RNasas. Las enzimas útiles incluyen RNasa I, RNasa A, RNasa V1, RNasa T1, MNasa y benzonasa.
Dado que las enzimas RNasa pueden dejar un fosfato 2',3' cíclico, un fosfato 3' o un fosfato 2' en el extremo 3', se necesitarán más modificaciones para generar un extremo que sea adecuado para la unión. Se puede utilizar cualquier fosfatasa tal como CIP, SAP, fosfatasa antártica, FastAP y T4 PNK. Se da preferencia a T4 PNK a un pH de aproximadamente 6.
En una realización particularmente preferida de la realización preferida divulgada anteriormente, (1) el reticulación se efectúa mediante (1.1) UV-C; (1.2) UV-A después de proporcionar 4-tiouridina a dichas células; o (1.3) formaldehído; (2) la purificación se efectúa usando (2.1) purificación por afinidad en tándem, en cuyo caso el reticulación es obligatoria; (2.2) un anticuerpo específico para dicha proteína; y/o (3) el recorte de dicho ácido nucleico monocatenario, en la medida en que sea a Rn , se efectúa con una RNasa y/o mediante ultrasonidos.
En cuanto a la purificación, se da preferencia a la purificación por afinidad en tándem. A ese respecto, se prefiere aprovechar la interacción biotina/estreptavidina en una de las dos etapas. También se puede utilizar avidina; neutravidina o cualquier derivado de estreptavidina adecuado.
En una realización adicional particularmente preferida, dicho método comprende las siguientes etapas adicionales después de la etapa (e): (f) secuenciar uno, más o todos los miembros de la biblioteca obtenida en la etapa (e); y (g) determinar el nucleótido más 5' y/o el nucleótido más 3' de dicho ácido nucleico unido o reticulado a dicha proteína, determinando así el sitio de unión de dicha proteína en dicho ácido nucleico.
Suponiendo que el sitio donde deja de funcionar la polimerasa debe interpretarse como el sitio de unión de la proteína de unión al ARN, esta realización permite identificar sitios de unión de proteína/ácido nucleico monocatenario. En general, es el nucleótido más 5' en la cadena positiva y/o el nucleótido más 3' en la cadena negativa lo que permite determinar el sitio de unión.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un kit que comprende (a) un oligonucleótido de acuerdo con el primer aspecto; (b) una o más enzimas seleccionadas de una ligasa, una transcriptasa inversa, una CircLigase y una ADN polimerasa; y (c) opcionalmente un manual que contiene instrucciones para realizar el método de acuerdo con el tercer aspecto.
En cuanto a las realizaciones caracterizadas en esta memoria descriptiva, en particular en las reivindicaciones, se pretende que cada realización mencionada en una reivindicación dependiente se combine con cada realización de cada reivindicación (independiente o dependiente) de la que depende dicha reivindicación dependiente. Por ejemplo, en el caso de una reivindicación 1 independiente que recita 3 alternativas A, B y C, una reivindicación 2 dependiente que recita 3 alternativas D, E y F y una reivindicación 3 que depende de las reivindicaciones 1 y 2 y que recita 3 alternativas G, H e I, debe entenderse que la memoria descriptiva divulga de forma inequívoca realizaciones correspondientes a las combinaciones A, D, G; A, D, H; A, D, I; A, E, G; A, E, H; A, E, I; A, F, G; A, F, H; A, F, I; B, D, G; B, D, H; B, D, I; B, E, G; B, E, H; B, E, I; B, F, G; B, F, H; B, F, I; C, D, G; C, D, H; C, D, I; C, E, G; C, E, H; C, E, I; C, F, G; C, F, H; C, F, I, a menos que se mencione específicamente lo contrario.
Del mismo modo, y también en aquellos casos en los que las reivindicaciones independientes y/o dependientes no recitan alternativas, se entiende que, si las reivindicaciones dependientes se refieren a una pluralidad de reivindicaciones anteriores, se considera que cualquier combinación de la materia objeto cubierta por las mismas se divulga de manera explícita. Por ejemplo, en caso de una reivindicación 1 independiente, una reivindicación 2 dependiente que hace referencia a la reivindicación 1, y una reivindicación 3 dependiente que hace referencia a ambas reivindicaciones 2 y 1, se deduce que la combinación de la materia objeto de las reivindicaciones 3 y 1 se divulga de forma clara e inequívoca, al igual que la combinación de la materia objeto de las reivindicaciones 3, 2 y 1. En caso de que esté presente una reivindicación 4 dependiente adicional que se refiera a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, se deduce que la combinación de la materia objeto de las reivindicaciones 4 y 1, de las reivindicaciones 4, 2 y 1, de las reivindicaciones 4, 3 y 1, así como de las reivindicaciones 4, 3, 2 y 1 se divulga de forma clara e inequívoca.
Las Figuras muestran:
Figura 1: Representación esquemática de un oligonucleótido ilustrativo de la invención.
Figura 2: Implementación con secuencias compatibles con Illumina. (A) Oligonucleótido ilustrativo. (B) Ilustración del flujo de trabajo.
Figura 3: Ejemplo de perfiles de unión a ARN después de la secuenciación con Illumina. Capturas de pantalla de IGV (Visor de Genómica Integrativa; distribuido por Broad Institute) que muestran la distribución de eventos de reticulación en tres genes de ejemplo. KHDRBS2_old: método del estado de la técnica anterior uvCLAP, no usa el oligonucleótido del perfil de la invención de la proteína KHDRBS2. KHDRBS2_New_RNA: Método de la invención que usa un oligonucleótido de ARN completo y fosforilación mediada por RNasaH del extremo 5' del ADNc. KHDRBS2_New_DNA: Método de la invención que usa un solo resto de ARN en el saliente 5 'que se escinde con NaOH después de lo cual el extremo 5' del ADNc se fosforila con T4 PNK. La fosforilación 5' es necesaria para la etapa de circularización.
Figura 4: Prevención de la formación de dímeros adaptadores. Flujo de trabajo.
Diana: T
grupo preadenilo: App
Extensión de ARNmc del oligonucleótido horquilla: R
Parte superior de la hélice que sigue a R: A
Parte superior del ADNmc que sigue a la hélice: B
Espaciador C18: S
Parte inferior del ADNmc que sigue a S: C
Parte inferior de la hélice que sigue a C: D
fosfato 5': 5p
fosfato 3': 3p
hidroxilo 3': 3-OH
Figura 5: Prevención de la formación de dímeros adaptadores. Evidencia. Se prepararon tres bibliotecas de secuenciación a partir de poli(A+) ARN fragmentado enzimáticamente usando un adaptador fosforilado (carril 1) y dos adaptadores adenilados previamente (carriles 2 y 3). En el carril 2, el adaptador fosforilado se adeniló previamente con ARN ligasa Mth, en el carril 3, la adenilación previa se llevó a cabo con ARN ligasa 1 de T4. Las reacciones de unión se llevaron a cabo con ARN Ligasa 2 KQ de T4 en ausencia de ATP. En el carril 1, solo se pueden amplificar los dímeros adaptadores, mientras que en los carriles 2 y 3 la formación de dímeros adaptadores se redujo considerablemente y se pudieron generar bibliotecas de secuenciación adecuadas.
Los ejemplos ilustran la invención.
Ejemplo 1
Protocolo ilustrativo
El protocolo que se proporciona a continuación utiliza un oligonucleótido de la invención, por ejemplo, el oligonucleótido mostrado en las figuras.
(1) La proteína de interés está enriquecida con una purificación por afinidad en tándem.
(2) El ARN unido se recorta con una enzima RNasa. Se utiliza RNasal, que digiere todos los enlaces y deja un grupo fosfato 2',3' cíclico en el extremo 3' de los ARN.
(3) Determinadas enzimas RNasa pueden dejar un fosfato 2',3' cíclico, un grupo fosfato 3'o fosfato 2' en el extremo 3'. Este tipo de extremo no es apto para unión y debe repararse. Se puede utilizar T4 PNK a pH bajo (6,0) para este fin.
(4) El oligo sencillo se une después al ARN recortado y reparado, por ejemplo, sobre perlas. Se utilizan ARN ligasa 1 de T4 y oligos 5' fosforilados.
(5) El exceso de oligo sencillo se elimina por lavado. En esta fase, si se desea, las muestras marcadas de manera diferencial a través de la parte de índice interno (código de barras) en el oligo sencillo se pueden mezclar entre sí, antes de la transcripción inversa. Dependiendo de cómo se diseñen los índices, se pueden mezclar entre dos y cientos de muestras entre sí.
(6) Si el oligo sencillo contiene un grupo fosfato 3' que inhibe la unión consigo mismo, se elimina antes de la transcripción inversa. Se utiliza T4 PNK a pH bajo (6,0).
(7) La transcriptasa inversa se añade junto con los reactivos necesarios, tal como dNTP, etc. No es necesario añadir ni hibridar un oligo para cebar la transcripción inversa.
(8) Después de la transcripción inversa, se realizan dos cosas:
a. Eliminar todo el ARN
b. Proporcionar ADN monocatenario que tenga fosfato 5' e hidroxilo 3' (necesarios para la reacción de CircLigase)
Hay dos formas de conseguirlo:
(9)
a) Si la extensión monocatenaria del oligo sencillo está hecha completamente de ARN, entonces, se añade RNasaH a la muestra y se incuba a 37 °C durante 10-60 minutos. La RNasaH es una RNasa de procesamiento que degrada el ARN en los híbridos ARN/ADN y deja un fosfato 5' en el extremo 5'.
b) Como alternativa, la muestra se trata primero con NaOH 0,1 N (pH> 13) a 70 °C durante 10 minutos (o condiciones similares que degradan el ARN, pero dejan el ADN intacto). Esto destruye todo el ARN de la muestra y desnaturaliza el ADNbc para dar lugar ADNmc. Sin embargo, el extremo 5' de la molécula de ADN es un hidroxilo. Este grupo se convierte después en un fosfato usando T4 PNK a pH neutro o ligeramente básico (7-8) en presencia de ATP. La segunda forma se puede utilizar en todo tipo de extensiones, por ejemplo, todo ARN, ARN sencillo, o cualquier cosa intermedia, siempre que el primer nucleótido inmediatamente después de la porción bicatenaria sea ARN.
(10) La reacción se limpia con cualquier método que elimine moléculas pequeñas y proteínas mientras conserva el ADNmc. Pueden usarse perlas o columnas SPRI (AMPure o SILANE), o extracción con fenolcloroformo seguida de precipitación con etanol.
(11) El ADNmc purificado, con fosfato 5', hidroxilo 3' se circulariza con CircLigase o CircLigasell.
(12) El ADN circularizado, sin más purificación o linealización (el espaciador no-ácido nucleico lo hace posible), se utiliza después directamente como plantilla en una reacción de PCR para generar la biblioteca de secuenciación final.
Resultados
La determinación de un sitio de unión de una proteína de unión a ARN en su ARNm afín se ilustra en la figura 3. Los nucleótidos 5' terminales de las lecturas de secuenciación de la cadena positiva son indicativos de un sitio de unión. De manera similar, los nucleótidos 3' terminales de las lecturas de secuenciación de la cadena negativa son indicativos de un sitio de unión. La altura de estos picos en esta figura corresponde al número de lecturas de secuenciación que terminan en la posición dada.
Ejemplo 2
Prevención de la formación de dímeros adaptadores en solución
Este es un proceso preferido que es particularmente adecuado para evitar la formación de dímeros adaptadores. El procedimiento comienza con el ARN diana T y el oligonucleótido AppRABSCD3p donde A y D forman un par de bases, R está formado por ribonucleótidos y A, B, C y D son desoxirribonucleótidos. "3p" designa un fosfato 3'.
El flujo de trabajo se muestra a continuación y se ilustra en la figura 4. Este oligonucleótido es un oligonucleótido de la invención.
(1) T se une al oligonucleótidohorquilla: se genera TRABSCD3p. El grupo 3p evita la unión de la parte AppR del oligonucleótido a D, que sería el evento de unión preferido debido a la proximidad de estos grupos. Cuando el extremo 3' está desprotegido (es decir, cuando está un grupo 3'-OH en su lugar), esto crea un círculo a partir del oligonucleótido horquilla y reduce la eficacia de la unión al agotar la cantidad disponible de oligonucleótido horquilla. Preferentemente, en esta fase, habrá un exceso de oligonucleótido horquilla en la solución para poder capturar tanta diana como sea posible.
(2) Transcripción inversa de la diana unida. El grupo 3p, sin embargo, no lo permite ya que es un inhibidor de la polimerización, así como un inhibidor de la unión. La fosfatasa se añade directamente a la mezcla de unión. En esta fase se producen dos reacciones:
a) TRABSCD3p se convierte en TRABSCD3-OH, que puede someterse a transcripción inversa
b) El exceso de oligonucleótido, AppRABSCD3p pasa por una transformación muy inesperada: primero se convierte en AppRABSCD3-OH, pero después, debido a que la desfosforilación se lleva a cabo en la mezcla de reacción de unión, se circulariza con una eficacia muy alta y se convierte en RABSCD (imagínese una línea que conecta R y D). Esto esencialmente neutraliza e inactiva químicamente el exceso de oligonucleótido horquilla, sin necesidad de electroforesis en gel o cualquier otro tipo de purificación.
(3) Los tampones de unión y transcripción inversa preferentemente son muy similares en su composición. Para la transcripción inversa, la fosfatasa se puede inactivar con calor (por ejemplo, se recomienda 65 °C durante 5 minutos para la fosfatasa rSAP), se añade dNTP y la transcriptasa inversa en el tubo y se permite que tenga lugar la transcripción inversa, preferentemente a 40 - 60 °C y dependiendo de la enzima. No se añade cebador, como se describe anteriormente.
a) TRABSCD3-OH se convierte después en TRABSCDR'T'3-OH donde R' y T son los complementos inversos de R y T respectivamente, están hechos de desoxirribonucleótidos y se emparejan perfectamente con R y T formando híbridos de ARN/ADN.
b) No le pasa nada al exceso de oligonucleótido horquilla circularizado, ya que no tiene un grupo 3'-OH libre para la extensión del cebador. Se mantiene como RABSCD y, lo que es más importante, no contiene híbridos de ARN/ADN.
(4) Se sigue utilizando el mismo tubo único en donde se realizó la unión. Al final de la transcripción inversa, se añade RNasaH en el mismo tubo y las muestras se incuban, preferentemente a 37 °C durante 20-60 minutos.
a) La RNasaH no se usa para eliminar el ARN. Se utiliza para marcar específicamente el extremo 5' de TRABSCDR'T'3-OH con un grupo fosfato. Ahora TRABSCDR'T'3-OH se convierte en 5pABSCDR'T'3-OH. En el proceso, T y R se degradan.
b) El exceso de oligonucleótido horquilla circularizado permanece nuevamente como RABSCD y no contiene un grupo fosfato 5'.
(5) Para eliminar todo el ARN y romper el exceso de oligonucleótido horquilla circularizado, se añade hidróxido de sodio a la reacción (hasta ~ 0,1 N) y las muestras se incuban a 70-80 °C durante 10-30 minutos.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un oligonucleótido que comprende
(a) una porción bicatenaria, cuya porción bicatenaria es ADN y tiene de 9 a 30 pares de bases de longitud;
(b) un bucle que conecta el extremo 3' de la primera cadena de dicha porción bicatenaria con el extremo 5' de la segunda cadena de dicha porción bicatenaria, comprendiendo dicho bucle, en dirección de 5' a 3':
(ba) una primera porción de ADN que tiene de 4 a 20 nucleótidos de longitud;
(bb) un espaciador no-ácido nucleico seleccionado entre un espaciador de oligoetilenglicol y un espaciador de oligometileno; y
(bc) una segunda porción de ADN que tiene de 4 a 20 nucleótidos de longitud; en donde dicha primera porción de ADN y dicha segunda porción de ADN no son complementarias entre sí;
(c) un saliente monocatenario en su extremo 5', teniendo dicho saliente de 5 a 40 nucleótidos de longitud, en el que
(ca) el enlace que conecta dicha porción bicatenaria con el nucleótido de dicho saliente que está directamente adyacente a dicha porción bicatenaria es escindible en condiciones alcalinas; y
(cb) dicho saliente comprende opcionalmente una secuencia de código de barras, teniendo preferentemente dicha secuencia de código de barras de 5 a 10 nucleótidos de longitud;
y opcionalmente
(d) dentro de uno, más o todos de (a), (b) y (c), uno, más o todos los siguientes:
(da) uno o más nucleótidos modificados;
(db) una o más secuencias que confieren compatibilidad con los kits de secuenciación de ácidos nucleicos, siendo dicha compatibilidad preferentemente la presencia de regiones dentro de dicho oligonucleótido que son complementarias a los cebadores comprendidos en dichos kits de secuenciación; y
(dc) una o más bases aleatorias.
2. El oligonucleótido de la reivindicación 1, en el que
(a) la temperatura de fusión de dicha porción bicatenaria está entre 37 °C y 70 °C; y/o
(b) el número de emparejamientos incorrectos entre dicha primera cadena y dicha segunda cadena es 0, 1, 2 o 3.
3. El oligonucleótido de la reivindicación 1 o 2, en el que
(a) dicho espaciador de oligoetilenglicol es -(CH2CH2O V, siendo n un número entero entre 3 y 10, preferentemente 6 y
(b) dicho espaciador de oligometileno es -(CH2)m-, siendo m un número entero entre 5 y 50, preferentemente 18.
4. El oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que
(a) dicho nucleótido de dicho saliente que está directamente adyacente a dicha porción bicatenaria comprende ribosa y/o
(b) dicho saliente es ARN.
5. El oligonucleótido de la reivindicación 4, en el que el extremo 5' de dicho oligonucleótido está adenilado previamente y el extremo 3' de dicho oligonucleótido comprende un fosfato 3'.
6. El uso del oligonucleótido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la generación de una biblioteca, preferentemente una biblioteca de secuenciación, a partir de ácido nucleico monocatenario.
7. El uso de la reivindicación 6, en el que dicha generación implica transcripción inversa y amplificación.
8. El uso de la reivindicación 6 o 7, en el que dicho oligonucleótido y cebadores para dicha amplificación son los únicos oligonucleótidos que se van a usar.
9. Un método de producción de una biblioteca, preferentemente una biblioteca de secuenciación, a partir de ARN monocatenario y/o ADN monocatenario, comprendiendo o consistiendo dicho método en:
(a) unir dicho ARN monocatenario y/o ADN monocatenario al oligonucleótido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5;
(b) transcribir de manera inversa o transcribir, respectivamente, dicho ARN monocatenario o ADN monocatenario; (c) hidrolizar cualquier ARN;
(d) circularizar el ADN restante; y
(e) someter el producto de (d) a amplificación por PCR.
10. El método de la reivindicación 9, que comprende una o más de las siguientes etapas adicionales:
(aa) eliminar el exceso de oligonucleótido después de la etapa (a) y antes de la etapa (b);
(ab) agrupar diferentes muestras que contienen productos de unión obtenidos en (a), en el que los productos de unión que se originan a partir de diferentes muestras tienen un código de barras diferente de acuerdo con la reivindicación 1 (c) (cb), y en el que dicha etapa (ab) debe efectuarse después de la etapa (a) y antes de la etapa (b);
(ac) eliminar, después de la etapa (a) y antes de la etapa (b), el fosfato 3' de dichos productos de unión en la medida en que esté presente; y
(ca) eliminar proteínas y moléculas pequeñas del ADN monocatenario obtenido en (c), la etapa (ca) debe realizarse después de la etapa (c) y antes de la etapa (d).
11. El método de la reivindicación 10, en el que la etapa (ac) se realiza mientras que la etapa (aa) no se realiza, en el que dicho oligonucleótido es como se define en la reivindicación 6 y en el que preferentemente la etapa (ac) se realiza en la mezcla obtenida directamente en la etapa (a).
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que se efectúa la hidrolización de cualquier ARN,
(c1) si el saliente de dicho oligonucleótido es ARN, añadiendo RNasaH; o
(c2) si dicho saliente contiene ADN, añadiendo NaOH 0,1 M.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que comprende las siguientes etapas antes de la etapa (a):
(1) opcionalmente reticular una muestra que comprende células;
(2) purificar a partir de dicha muestra una proteína dada, estando dicha proteína unida o reticulada a ácido nucleico monocatenario o bicatenario; y
(3) convertir dicho ácido nucleico, si es bicatenario, en ácido nucleico monocatenario; y
(4) recortar el ácido nucleico monocatenario unido o reticulado a dicha proteína
en el que preferentemente
(1) la reticulación se efectúa mediante
(1.1) UV-C;
(1.2) UV-A después de proporcionar 4-tiouridina a dichas células; o
(1.3) formaldehído;
(2) la purificación se efectúa usando
(2.1) purificación por afinidad en tándem, en cuyo caso la reticulación es obligatoria;
(2.2) un anticuerpo específico para dicha proteína;
y/o
(3) el recorte de dicho ácido nucleico monocatenario, en la medida en que sea ARN, se efectúa con una RNasa y/o mediante ultrasonidos.
14. El método de la reivindicación 13, que comprende una o más de las siguientes etapas adicionales después de la etapa (e):
(f) secuenciar uno, más o todos los miembros de la biblioteca obtenida en la etapa (e); y
(g) determinar el nucleótido más 5' y/o el nucleótido más 3' de dicho ácido nucleico unido o reticulado a dicha proteína, determinando así el sitio de unión de dicha proteína en dicho ácido nucleico.
15. Un kit que comprende
(a) un oligonucleótido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5;
(b) una o más enzimas seleccionadas de una ligasa, una transcriptasa inversa, una CircLigase y una ADN polimerasa; y
(c) opcionalmente, un manual que contiene instrucciones para realizar el método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14.
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