ES2908704T3 - Construcción de colecciones de secuenciación de nueva generación (NGS) usando desplazamiento de hebra competitivo - Google Patents

Abstract

Un método de preparación de un fragmento de ácido nucleico diana bicatenario para secuenciación, comprendiendo el método: a. ligamiento de una primera secuencia adaptadora al extremo 3' del fragmento de ácido nucleico diana con una primera ligasa, en donde la primera ligasa realiza un ligamiento de extremos romos; y b. ligamiento de una segunda secuencia adaptadora al extremo 5' de dicho fragmento de ácido nucleico diana con una segunda ligasa, en donde la segunda ligasa realiza un ligamiento entablillado, en el que la primera secuencia adaptadora es un entablillado para el ligamiento de la segunda secuencia adaptadora; c. por lo que dicha primera secuencia adaptadora se adenila en su extremo 5'; y d. por lo que dicha primera ligasa es una ligasa dependiente de ATP deficiente de adenilación.

Description

DESCRIPCIÓN

Construcción de colecciones de secuenciación de nueva generación (NGS) usando desplazamiento de hebra competitivo

Campo de la invención

La invención se refiere a la construcción de colecciones de secuenciación de ADN de nueva generación (NGS - nextgeneration sequencing) para secuenciación de todo el genoma, secuenciación del exorna completo, resecuenciación dirigida, ensayos de cribado basados en secuenciación, metagenómica o cualquier otra aplicación que requiera preparación de muestras para NGS. La invención se expone en las reivindicaciones.

Antecedentes de la invención

La secuenciación de nueva generación (NGS) ha evolucionado en una herramienta muy potente en biología molecular, que permite el progreso rápido en campos tales como identificación genómica, pruebas genéticas, descubrimiento de fármacos y diagnóstico de enfermedades. Según sigue avanzando esta tecnología, el volumen de los ácidos nucleicos que pueden secuenciarse de una vez va aumentando. Esto permite a los investigadores secuenciar muestras más grandes, así como aumentar el número de lecturas por muestra, posibilitando la detección de pequeñas variaciones de secuencia dentro de esa muestra.

Según aumenta el volumen y complejidad del procesamiento de NGS, lo hace también la tasa de error experimental. Aunque gran parte de este error se produce en las etapas de secuenciación y procesamiento, también puede producirse durante las etapas de preparación de muestras. Esto es particularmente cierto durante la conversión de la muestra en una colección de NGS legible mediante la que se fijan secuencias adaptadoras a los extremos de cada fragmento de una muestra fragmentada (fragmento de colección) de un modo uniforme.

Hay varios tipos de errores que pueden producirse durante la ejecución de secuenciación de nueva generación (NGS), y es importante poder diferenciar entre variantes infrecuentes verdaderas, tales como alelos o mutaciones infrecuentes que existen en el paciente y errores que surgen de la secuenciación y/o preparación de muestras. Son particularmente problemáticos los errores que se introducen durante la construcción de la colección, antes de la amplificación de la colección mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Dichos errores pueden propagarse durante la PCR, dando lugar a múltiples copias de secuencias que contienen el error, haciendo difícil distinguir entre los errores y las variantes verdaderas. La estrategia general usada para superar esto es la identificación de consenso, por la que lecturas de secuencia que son copias de PCR de un solo fragmento original se agrupan juntas y se comparan con grupos similares de copias, derivadas de otros fragmentos originales, que solapan en secuencia. Si hay una variación presente en un grupo de clones y no los otros, entonces es muy probable que un error se propague por PCR, mientras que variaciones presentes en varios grupos es más probable que sean variantes verdaderas. Para realizar este análisis se debe poder diferenciar entre clones derivados de una molécula y aquellos derivados de otra.

El documento WO 2014/144979 divulga métodos para ligamiento de polinucleótidos que contienen componentes de ligamiento modificados, particularmente cofactores de ligasa modificados, aceptadores modificados y donadores modificados. Los métodos se describen como aplicados a ensayos basados en ligamiento para la detección de una secuencia de ácido nucleico donde el uso del cofactor modificado mejora la discriminación entre moldes emparejados y desapareados.

El documento US 2015/0099671 divulga métodos y composiciones para preparar y construir colecciones de ADNc. En algunos de los métodos divulgados en el mismo, se describen adaptadores de ADN usados en los métodos como preadenilados.

Las expresiones "fragmentos", "fragmentos diana" o "insertos", como se usan en el presente documento, se refieren a fragmentos de ADN, creados a partir de la fragmentación de una muestra de ADN, que se procesan en una colección de NGS y se secuencian. El procesamiento de estos fragmentos habitualmente implica la reparación de extremo y adición de colas de A, seguido de la adición de adaptadores de secuenciación y amplificación.

Las expresiones "profundidad de la cobertura", "profundidad de cobertura" o "cobertura diana", como se usan en el presente documento, se refieren al número de fragmentos de ADN secuenciados (es decir, lecturas) que se cartografían en una diana genómica. Cuanto más profunda sea la cobertura de una región diana (es decir, cuantas más veces se secuencie la región), mayor será la fiabilidad y sensibilidad del ensayo de secuenciación. En general, una profundidad de cobertura de 500-1000X, o mayor, se requiere a menudo para la detección de variaciones de secuencia de baja frecuencia.

Los términos "adenilado" o "preadenilado", como se usan en el presente documento, se refieren a un estado por el que una hebra de ADN tiene un 5'-monofosfato de adenosina (AMP) fijado covalentemente a su fosfato 5'-terminal mediante un enlace pirofosfato. Los términos "adenilato" o "adenilación", como se usan en el presente documento, se refieren al proceso de fijación covalente de un AMP a una cadena lateral proteínica o al fosfato 5'-terminal de una hebra de ADN. La expresión "grupo adenilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un AMP que se fija covalentemente a, o se transfiere entre, una cadena lateral proteínica y/o hebra de ADN.

La expresión "secuencia consenso", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia obtenida comparando múltiples secuencias dentro de una familia de secuencias. Las variaciones de secuencia que están presentes en algunas, aunque no en la mayoría de las secuencias, en la familia pueden indicarse como errores y posteriormente eliminarse del análisis. Por otro lado, las variaciones de secuencia que están presentes en la mayoría de secuencias dentro de una familia pueden indicarse como variantes verdaderas que estaban presentes en el material genético original que se está analizando. La expresión "identificación de consenso", como se usa en el presente documento, se refiere al proceso para determinar si una variación genética es una variación verdadera o un error.

La expresión "identificación de variante", como se usa en el presente documento, se refiere al proceso de determinar si una variación de secuencia es una variante verdadera derivada de la muestra original y, por tanto, se usa en el análisis, o el resultado de un error de procesamiento y se desecha.

El término "familia", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de lecturas que se determina que son duplicados basándose en que tienen los mismos sitios de inicio y parada y/o UMI. En la identificación de variante, son deseables familias grandes con múltiples clones ya que pueden usarse para construir secuencias consenso más fuertes que aquellas con solamente unos pocos clones para comparar. Para tamaños de familia muy pequeños con uno o dos clones, no puede identificarse un consenso, provocando que se desechen datos potencialmente importantes.

El término "desduplicación" o "desdup.", como se usa en el presente documento, se refiere a la eliminación de lecturas que se determina que son duplicados, del análisis. Se determina que las lecturas son duplicados si comparten los mismos sitios de inicio y parada y/o secuencias UMI. Un propósito de la desduplicación es crear una secuencia consenso por la que esos duplicados que contienen errores se eliminen del análisis. Otro propósito de la desduplicación es estimar la complejidad de la colección. La "complejidad" o "tamaño" de una colección, como se usa en el presente documento, se refiere al número de lecturas de secuencia individuales que representan fragmentos originales únicos y que se cartografían en la secuencia que se está analizando.

Las expresiones "sitios de inicio y parada" o "extremos de fragmento", como se usan en el presente documento, se refieren a las secuencias en los extremos 5' y 3' de un fragmento de colección troceada que llegan a ligarse directamente a los adaptadores de secuenciación. Los sitios de inicio y parada pueden usarse para determinar si dos secuencias similares derivan de moléculas separadas o son copias clonadas del mismo fragmento original. Para que diferentes fragmentos originales tengan los mimos sitios de inicio y parada, los acontecimientos de troceado que los crearon tendrían que hacer escindido exactamente en los mismos sitios, lo que tiene baja probabilidad. Los clones, por otro lado, siembre deben tener los mismos sitios de inicio y parada. Por tanto, fragmentos cualesquiera que compartan el mismo sitio de inicio y parada (debido a troceado aleatorio), habitualmente se consideran duplicados. La expresión "basado en la posición", como se usa en el presente documento, se refiere al uso de sitios de inicio y parada como criterio para determinar si una lectura es un duplicado de otra o no.

Una "colisión de inicio y parada", como se define en el presente documento, es la aparición de múltiples fragmentos únicos que contienen los mismos sitios de inicio y parada. Debido a la infrecuencia de las colisiones de inicio y parada, habitualmente se observan solamente cuando se realiza secuenciación ultraexhaustiva con un número muy alto de lecturas, tal como cuando se realiza detección de variante baja, o cuando se trabaja con muestras de ADN que tienen una distribución de tamaño pequeña, tal como ADN plasmático. Por tanto, los sitios de inicio y parada pueden no ser suficiente en esos escenarios ya que se procesaría el riesgo erróneamente eliminando fragmentos únicos, equivocados como duplicados, durante la etapa de desduplicación. En estos casos, la incorporación de UMI en el flujo de trabajo puede rescatar potencialmente gran cantidad de complejidad.

La expresión "UMI (unique molecular identifier)'' o "identificador molecular único", como se usa en el presente documento, se refiere a una marca, que consiste en una secuencia de bases degeneradas o variables, que se usa para marcar moléculas originales en una muestra de ácido nucleico troceado. En teoría, debido a la cantidad extremadamente grande de diferentes secuencias UMI que pueden generarse, dos fragmentos originales no deben tener la misma secuencia UMI. Por tanto, los UMI pueden usarse para determinar si dos lecturas de secuencia similares derivadas cada una de un fragmento original diferente o si son simplemente duplicados, creados durante la amplificación por PCR de la colección, que se obtuvieron del mismo fragmento original.

Los UMI son especialmente útiles, cuando se usan en combinación con sitios de inicio y parada, para identificación de consenso de variantes de secuencia infrecuentes. Por ejemplo, si dos fragmentos tienen el mismo sitio de inicio y parada, pero tienen diferentes secuencias UMI, que de lo contrario se habrían considerado dos clones que surgen del mismo fragmento original ahora podrían indicarse apropiadamente como moléculas únicas. Por tanto, el uso de UMI combinado con los sitios de inicio y parada a menudo da lugar a un salto en el número de cobertura ya que fragmentos únicos que se habrían marcado como duplicados usando los sitios de inicio y parada en solitario se marcarán como únicos entre sí debido a que tienen diferentes UMI. También ayuda a mejorar el valor predictivo positivo ("PPV" -positive predictive value) eliminando los positivos falsos. Actualmente hay mucha demanda de UMI, ya que hay algunas variantes infrecuentes que pueden encontrarse solamente mediante identificación de consenso usando UMI.

El "PPV", o el valor predictivo positivo, es la probabilidad de que una secuencia identificada como única sea realmente única. PPV = positivo verdadero / (positivo verdadero positivo falso). La "sensibilidad" es la probabilidad de que una secuencia que es única se identifique como única.

Sensibilidad = positivo verdadero / (positivo verdadero negativo falso).

Dos errores que se producen durante la construcción de la colección, y que se reducen mediante la presente invención, son la formación de (1) quimeras de fragmentos y (2) dímeros de adaptadores.

Las quimeras de fragmentos son el resultado de fragmentos de la colección que se ligan entre sí sin las secuencias adaptadoras, provocando fragmentos más largos que contienen secuencias no relacionadas yuxtapuestas entre sí. Estas secuencias no relacionadas, por tanto, se leerían equivocadamente como una secuencia continua. Por tanto, la supresión de la formación de quimeras de fragmentos durante la construcción de la colección es importante para reducir los errores se secuenciación posteriores.

Los dímeros de adaptadores son el resultado de autoligamiento de los adaptadores sin una secuencia de inserto de la colección. Estos dímeros forman grupos de manera muy eficaz, reducen las eficacias de reacción y consumen espacio valioso en la cubeta de lectura. Esto es especialmente problemático cuando se trata con cantidades de introducción de ADN ultrabajas en el intervalo de picogramos. A dichos niveles bajos de introducción de ADN, los dímeros de adaptadores pueden constituir una mayoría de las moléculas de la colección NGS formadas, por tanto, reduciendo la cantidad de información útil generada por secuenciación de ADN. Por esta razón, la supresión de la formación de dímeros de adaptadores durante la construcción de la colección es una tera muy importante, pero problemática.

En el presente documento se proporcionan métodos de alto rendimiento para la construcción de una biblioteca NGS basados en estrategias de ligamiento de adaptadores novedosas que pueden minimizar las formaciones tanto de quimeras de fragmentos como de dímeros de adaptadores y convertir de manera precisa muestras de ADN en colecciones de secuenciación en menos de un día. Estas y otras ventajas de la invención, así como características innovadoras adicionales, serán evidentes a partir de la descripción de la invención proporcionada en el presente documento.

Sumario de la invención

Los métodos de la invención se exponen en las reivindicaciones.

La invención se refiere a la construcción de colecciones de secuenciación de ADN de nueva generación (NGS) para secuenciación de todo el genoma, resecuenciación dirigida, ensayos de cribado basados en secuenciación, metagenómica o cualquier otra aplicación que requiera preparación de muestras para NGS. Los métodos propuestos consisten cada uno en un proceso de ligamiento de dos etapas por el que un primer adaptador de secuenciación se liga a fragmentos de ADN con los extremos reparados mediante ligamiento de extremos romos y un segundo adaptador de secuenciación se liga entonces al primer producto de ligamiento mediante ligamiento de extremos entablillados (splinted). Esto proceso de preparación de colección NGS se denominará aquí desplazamiento de hebra competitivo (CSD - competitive strand displacement). Aunque el trabajo inicial se ha centrado en la fijación de adaptadores P5 y P7 para secuenciación Illumina, este método podría usarse en plataformas alternativas que también requieren la fijación de una o más secuencias sintéticas (plataforma de secuenciación Ion Torrent®, por ejemplo).

En una primera realización del método (figura 1), el ADN fragmentado se somete a una reacción de reparación de extremos que produce insertos fosforilados 5' romos con extremos 3' OH libres. Esto puede conseguirse mediante la polinucleótido cinasa T4 (PNK) y la ADN polimerasa T4, o cualquier otra combinación de enzimas que deje extremos romos con fosfatos 5' y grupos hidroxilo 3'. Después de la reparación de extremos, el primer adaptador de secuenciación (P5 o P7 para plataformas Illumina) se fija al extremo 3' del ADN de inserto mediante ligamiento romo usando la ADN ligasa T4; una hebra del adaptador se fosforila 5' para facilitar el ligamiento, mientras la hebra complementaria se bloquea en el extremo 3' con un didesoxi nucleótido (ddN) para evitar el ligamiento. El segundo adaptador de secuenciación entonces se fija a los extremos 5' de insertos biológicos a través de reacción de ligamiento entablillado que conecta los extremos 3' de las moléculas adaptadoras con los extremos 5' fosforilados de los insertos. Este ligamiento puede realizarse usando la ADN ligasa Taq, o cualquier otra ligasa que pueda realizar ligamientos entablillados con poca actividad sobre sustratos de extremos romos (Ampligase, 9°N, Tth, etc.). Como estas ligasas prefieren el ligamiento entablillado, se minimizan los dímeros de adaptadores, lo que mitiga la necesidad de selección de tamaños tras el ligamiento. Después del segundo ligamiento, las moléculas de la colección recién construidas puede secuenciarse directamente ("sin PCR") o amplificarse mediante PCR antes de la secuenciación. Ejemplos representativos de la primera y segunda hebra del primer adaptador de secuenciación para la primera realización se proporcionan como SEQ ID NO:3-10 y SEQ ID NO:17, respectivamente. Ejemplos representativos del segundo adaptador de secuenciación para la primera realización se proporcionan como SEQ ID NO:1-2. Todos los ejemplos representativos para la primera realización se ofrecen para ilustrar, pero no limitar, la invención reivindicada.

En una segunda realización del método descrito anteriormente, una ADN ligasa T4 mutante, K159S (véase la publicación de Estados Unidos US 2017/0226498 A1), se usa para el primer ligamiento (figura 2). Este mutante no puede utilizar ATP para adenilar sustratos antes del ligamiento y, por tanto, solamente puede ligar sustratos que se preadenilaron. Este rasgo característico puede explotarse realizando ligamiento con adaptadores de secuenciación preadenilados ya que esto solamente provocará acontecimientos de ligamiento de adaptador-a-inserto (en lugar de inserto-a-inserto), lo que suprime enormemente la formación de quimeras. Además, se cree que la eficacia de ligamiento de ADN ligasa T4 de tipo silvestre se impide por acontecimientos de "ligamiento abortado" donde unidades de ligasa adeniladas transfieren grupos adenilo a insertos, pero no logran unir de forma eficaz extremos 5' y 3'. En dichos casos, las unidades de ligasa se readenilarán rápidamente volviéndolas inactivas sobre el ADN que se ha adenilado. Como el mutante no puede adenilarse, los acontecimientos de ligamiento abortado no son problemáticos y la eficacia de ligamiento se aumenta con respecto a la de la ADN ligasa T4 de tipo silvestre. Ejemplos representativos del primer adaptador de secuenciación para la segunda realización se proporcionan como SEQ ID NO:11-16. Todos los ejemplos representativos para la segunda realización se ofrecen para ilustrar, pero no limitar, la invención reivindicada.

En una tercera realización de la presente invención, los adaptadores preadenilados en la primera etapa de ligamiento se ligan en extremos 3' de los fragmentos diana mediante una ligasa T4 de tipo silvestre, en lugar del mutante K159S, y en ausencia de ATP, evitando, por tanto, la formación de quimeras de fragmentos (figura 3).

En una cuarta realización de los métodos descritos anteriormente, los adaptadores de secuenciación pueden ligarse al extremo 5' de insertos en primer lugar (figura 4). En esta realización, el extremo 3' del primer adaptador de secuenciación (P5 o P7 para secuenciación Illumina) se fija al extremo 5' de insertos fosforilados mediante ligamiento romo. Para evitar la formación de dímeros, este adaptador no se fosforila en 5' en la parte bicatenaria, de modo que no se ligará a insertos u otras moléculas adaptadoras. La segunda secuencia adaptadora (P5 o P7 para secuenciación Illumina) se fija al extremo 3' de insertos mediante ligamiento entablillado usando un oligonucleótido monocatenario que tiene grupos fosfato en los extremos 5' y espaciadores C3 en los extremos 3'. Este ligamiento puede realizarse usando la ADN ligasa Taq, o cualquier otra ligasa que pueda realizar ligamientos entablillados con poca actividad sobre sustratos de extremos romos (Ampligase, 9°N, Tth, etc.). Como la ligasa prefieren ligamiento entablillado, se minimizan los dímeros de adaptadores, lo que mitiga la necesidad de selección de tamaños tras el ligamiento.

En una quinta realización de la presente invención, hay una base de ARN en el extremo 3' del oligonucleótido auxiliar de ligamiento trincado, en lugar de un ddN. En este caso, tanto el extremo 5' del adaptador como el extremo 3' del tallo truncado se ligan al inserto. Sin embargo, el tallo entonces se elimina por escisión mediante la actividad de la enzima RNasa H2 que escinde 5' de la base de ARN. Después de una etapa de limpieza con SPRI, tiene lugar el segundo ligamiento (figura 5).

En una sexta realización de la presente invención, el primer adaptador de secuenciación tiene una secuencia marcadora en su extremo 5' que sirve para marcar independientemente las hebras de sentido y de antisentido de la diana en sus extremos 3' (figuras 6 y 7). Estas marcas de secuencia no se limitan a ninguna longitud o secuencia particular. Las bases pueden ser degeneradas, fijas o una combinación de ambas. También pueden usarse bases modificadas. Como antes, el extremo 5' del adaptador se preadenila y se liga al extremo 3' reparado de la diana mediante ADN ligasa T4 mutante K159S, o mediante ligasa T4 de tipo silvestre en ausencia de ATP. El segundo adaptador de secuenciación se hibrida entonces al primer adaptador ligado en su secuencia de tallo complementaria, dejando un hueco que abarca la secuencia marcadora. El hueco entonces se llena con una polimerasa, creando un u M i in situ que es complementario al primer UMI. Después de la etapa de llenado, el extremo 3' del UMI in situ recién creado se liga al extremo 5' del fragmento diana. Opcionalmente, esto va seguido de una etapa de amplificación por PCR usando cebadores que ceban la primera y segunda secuencia adaptadora y pueden añadir opcionalmente secuencias adicionales tales como códigos de barras de muestra y/o secuencias P5/P7. Ejemplos representativos de la primer hebra del primer adaptador de secuenciación para la sexta realización se proporcionan como SEQ ID NO:18-33. Ejemplos representativos de la segunda hebra del primer adaptador de secuenciación para la sexta realización se proporcionan como SEQ ID NO: 34-49. Un ejemplo representativo del segundo adaptador de secuenciación para la sexta realización se proporciona como SEQ ID NO:50. Ejemplos representativos de cebadores directos e inversos opcionales que podrían usarse para la etapa de amplificación por PCR de la sexta realización se proporcionan como SEQ ID NO:75-98 y SEQ ID NO:51-74, respectivamente. Estos cebadores de PCR directos e inversos representativos particulares contienen secuencias adaptadoras P5 y P7, respectivamente, así como secuencias de código de barras. Todos los ejemplos representativos para la sexta realización se ofrecen para ilustrar, pero no limitar, la invención reivindicada.

La séptima realización de la presente invención es una variación de la sexta realización en que el segundo adaptador de secuenciación tiene una secuencia adicional que es complementaria a la secuencia marcadora añadida durante la primera etapa de ligamiento (figura 7). Como resultado, no hay hueco presente después de que el segundo adaptador de secuenciación hibride con el primer producto de ligamiento y la etapa de llenado con una ADN polimerasa es innecesaria antes del ligamiento. Esto puede conseguirse usando un número finito de marcas variables. Por ejemplo, esta realización podría consistir potencialmente en una pluralidad de primeros adaptadores de secuenciación, cada uno con una de 24 secuencias marcadoras variables distintivas, y una pluralidad de segundos adaptadores de secuenciación, cada uno con una de 24 secuencias distintivas que son complementarias a las secuencias variables de los primeros adaptadores de secuenciación.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, pueden incorporarse identificadores moleculares únicos (UMI) y códigos de barras de muestra en uno o ambos adaptadores de secuenciación. Los identificadores moleculares pueden construirse usando secuencias fijas o degeneradas de cualquier longitud compatible con secuenciadores Illumina.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, uno o más de los adaptadores de secuenciación usados para el primer y/o segundo ligamiento son versiones acortadas de los adaptadores de secuenciación completos, en cuyo caso las partes restantes de los adaptadores de secuenciación se añaden posteriormente mediante PCR con cebadores con cola

La invención puede usarse para cualquier aplicación que implique secuenciación de ADN, pero es especialmente valiosa para el diagnóstico del cáncer donde es crucial la detección de variantes infrecuentes en poblaciones mixtas de ADN tumoral y normal. La invención también puede usarse para construir colecciones de secuenciación a partir de muestras incrustadas en parafina fijadas en formol (FFPE - formalin-fixed paraffin-embedded). La invención también puede usarse para construir colecciones de secuenciación a partir de introducciones ultrabajas de ADN con o sin PCR, lo que puede ayudar en estudios forenses o microbiológicos donde están disponibles cantidades limitadas de ADN y/o no puede tolerarse PCR.

A diferencia de la técnica anterior que requiere selección de tamaños debido a la formación de dímeros de adaptadores, la invención plasma una estrategia de ligamiento que no requiere selección de tamaños. La ausencia de selección de tamaños posibilita una recuperación superior de ADN, lo que aumenta enormemente la complejidad/cobertura de la colección y la sensibilidad a variantes de baja frecuencia. Los dímeros de adaptadores también son problemáticos para la cuantificación y secuenciación de colecciones, porque los métodos convencionales de cuantificación de ADN están enormemente sesgados por su presencia. Esto puede provocar una densidad de agrupación subóptima y reducir significativamente el número de lecturas que alienan con muestras reales, lo que aumenta los costes de secuenciación. Además, a diferencia de la técnica anterior, la realización de la invención que emplea K159S no crea quimeras mediante ligamiento, lo que debe mejorar enormemente la detección de variantes estructurales infrecuentes asociadas con cáncer.

Descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra la primera realización del método de desplazamiento de hebra competitivo (CSD). La primera etapa consiste en la fijación de un primer adaptador de secuenciación (2) al fragmento diana de ADN (1) mediante ligamiento de extremos romos catalizado por ADN ligasa T4. Dicho primer adaptador de secuenciación consiste en una primera y segunda hebra de ADN. La primera hebra de a Dn (4) tiene un grupo de bloqueo C3 en su extremo 3', un grupo fosfato en su extremo 5' (5' PO), y consiste en una primera secuencia (6) que es complementaria a, pero más larga que, la segunda hebra de ADN (3) y una segunda secuencia marcadora no complementaria (5) que contiene el primer sitio de unión al cebador de secuenciación y, opcionalmente, un UMI y/o secuencia de código de barras de muestra. La segunda hebra de ADN (3) es un oligonucleótido truncado, con una base didesoxi nucleotídica (ddN) en su extremo 3', y sirve para facilitar el ligamiento de extremos romos del 5' PO de la segunda hebra de ADN al 3' OH del fragmento diana, dando lugar al primer producto de ligamiento (7). La segunda etapa consiste en la fijación de un segundo adaptador de secuenciación (8) al primer producto de ligamiento (7) mediante ligamiento de extremos entablillados catalizado por ligasa Taq. Dichos segundo adaptador de secuenciación tiene un 3' OH y consiste en una primera secuencia (10) que es complementaria a la primera secuencia (6) del primer adaptador de secuenciación y una segunda secuencia (9) que contiene el segundo sitio de unión al cebador de secuenciación y, opcionalmente, un segundo UMI y/o secuencia de código de barras de muestra. Como la longitud de la secuencia complementaria del segundo adaptador (10) es más larga que la del oligonucleótido truncado del primer adaptador (3), el segundo adaptador puede desplazar el oligonucleótido truncado durante la etapa de hibridación que precede el ligamiento de extremos entablillados. El ligamiento de extremos entablillados da lugar al producto de colección final (11).

La figura 2 ilustra la segunda realización del método CSD. Los elementos de la segunda realización son similares a los de la primera realización, siendo la diferencia que el primer adaptador de secuenciación se preadenila en el extremo 5' (5' ppA) de la primera hebra y que el ligamiento de extremos romos se cataliza por una ADN ligasa T4 mutante, K159S, que no puede usarse ATP como sustrato para ligamiento y, por tanto, puede ligar solamente la hebra preadenilada del primer adaptador al 3' OH del fragmento diana.

La figura 3 ilustra la tercera realización del método CSD. Los elementos de la tercera realización son similares a los de la segunda realización, siendo la diferencia que el ligamiento de extremos romos se cataliza por la ADN ligasa T4 de tipo silvestre en ausencia de ATP. Como el ATP no está disponible como sustrato para ligamiento, la ADN ligasa T4 de tipo silvestre, por tanto, puede ligar solamente la hebra preadenilada del primer adaptador al 3' OH del fragmento diana.

La figura 4 ilustra la cuarta realización del método CSD. La primera etapa consiste en la fijación de un primer adaptador de secuenciación (12) al fragmento diana de ADN mediante ligamiento de extremos romos catalizado por ADN ligasa T4. Dicho primer adaptador de secuenciación consiste en una primera y segunda hebra de ADN. La primera hebra de ADN tiene un grupo 3' OH en su extremo 3' y consiste en una primera secuencia (14) que es complementaria a, pero más larga que, la segunda hebra de ADN (15) y una segunda secuencia marcadora no complementaria (13) que contiene el primer sitio de unión al cebador de secuenciación y, opcionalmente, un UMI y/o secuencia de código de barras de muestra. La segunda hebra de ADN (15) es un oligonucleótido truncado con un grupo de bloqueo C3 en su extremo 3', un extremo 5' desfosforilado, y sirve para facilitar el ligamiento de extremos romos del 5' PO del fragmento diana con el 3' OH de la primera hebra del primer adaptador de secuenciación, dando lugar al primer producto de ligamiento (16). La segunda etapa consiste en la fijación de un segundo adaptador de secuenciación (17) al primer producto de ligamiento mediante ligamiento de extremos entablillados catalizado por ligasa Taq. Dichos segundo adaptador de secuenciación tiene un 5' PO y consiste en una primera secuencia (40) que es complementaria a la primera secuencia (14) del primer adaptador de secuenciación y una segunda secuencia (41) que contiene el segundo sitio de unión al cebador de secuenciación y, opcionalmente, un segundo UMI y/o secuencia de código de barras de muestra. Como la longitud de la secuencia complementaria del segundo adaptador (40) es más larga que la del oligonucleótido truncado del primer adaptador (15), el segundo adaptador puede desplazar el oligonucleótido truncado durante la etapa de hibridación que precede el ligamiento de extremos entablillados. El ligamiento de extremos entablillados da lugar al producto de colección final.

La figura 5 ilustra la quinta realización del método CSD. Los elementos de la quinta realización son similares a los de la segunda realización, siendo la diferencia que la segunda hebra truncada (18) del primer adaptador de secuenciación tiene un residuo de ARN en su extremo 3'. Dicho primer adaptador de secuenciación entonces se fija al fragmento diana de ADN mediante ligamiento de extremos romos catalizado por la ADN ligasa T4 mutante K159S. A diferencia de las realizaciones previas, tanto la primera como la segunda hebra del primer adaptador de secuenciación se ligan al fragmento diana, ligándose la segunda hebra truncada, mediante su 3'R, al 5' PO del fragmento diana, provocando un primer producto de ligamiento (19). Las segundas hebras truncadas entonces se eliminan mediante escisión con RNasa H2, lo que se produce en el enlace fosfodiéster en el lado 5' de un residuo de ARN. El producto resultante (20) es similar al primer producto de ligamiento de las realizaciones previas, siendo la diferencia que tiene residuos de ARN 3'. Dichos residuos de ARN 3' se ligan entonces a los extremos 5' PO de los segundos adaptadores de secuenciación durante la segunda etapa de ligamiento, provocando un producto de colección (21) con residuos de ARN internos.

La figura 6 ilustra la sexta realización del método CSD. Los elementos de la sexta realización son similares a los de la segunda realización, aunque con las siguientes diferencias. En esta realización, la primera hebra de ADN (24) del primer adaptador de secuenciación (22) contiene una secuencia marcadora variable (26, 27) en su extremo 5'. Esto sirve para marcar de manera diferencial las hebras de sentido y de antisentido de los fragmentos diana durante la primera etapa de ligamiento, dando lugar a un primer producto de ligamiento con cada hebra marcada de forma deferente (28). Como con las realizaciones previas, el ligamiento de extremos romos se potencia usando una segunda hebra bloqueada y truncada (23) que, en esta realización, es complementaria a la región variable (26, 27) y parte de la región constante (25) de la primera hebra de ADN (24). Durante la segunda etapa de ligamiento, el segundo adaptador de secuenciación (29) hibrida con el primer producto de ligamiento mediante su secuencia (30) que es complementaria a la secuencia constante añadida por el primer adaptador de secuenciación (25) , pero no a la región variable (26, 27). Esto provoca un hueco que se llena con una ADN polimerasa y una ADN ligasa (31), dando lugar a un producto de colección final (32) con su hebra de sentido y de antisentido marcadas de forma diferente.

La figura 7 ilustra la séptima realización del método CSD. Los elementos de la séptima realización son similares a los de la sexta realización, siendo la diferencia que el segundo adaptador de secuenciación (33) tiene una secuencia adicional (34, 35) que es complementaria a la secuencia marcadora variable (36, 37) añadida por el primer adaptador de secuenciación. Como resultado, no se crea hueco después de que el segundo adaptador de secuenciación hibride con el primer producto de ligamiento y no se necesita etapa de polimerasa.

Figura 8A. Valores de profundidad de cobertura para cada una de las tres colecciones replicadas, obtenidas usando el método descrito en el ejemplo 1, se representan para CSD (círculos grises oscuros) y NEB (círculos grises claros) para 10 ng (lado izquierdo) y 1 ng (lado derecho) de ADN introducido. Para 10 ng de ADN introducido, la profundidad promedio de cobertura para CSD fue 1009X, frente a 598X para NEB. Para 1 ng de ADN introducido, la profundidad promedio de cobertura para CSD fue 131X, frente a 53X para NEB.

Figura 8B. Valores de profundidad de cobertura para cada una de las tres colecciones replicadas, obtenidas del experimento descrito en el ejemplo 1, se representan para CSD (círculos grises oscuros) y Kapa (círculos grises claros). La profundidad promedio de cobertura para c Sd fue 1006X, frente a 628X para Kapa.

Figura 8C. Valores de profundidad de cobertura para cada una de las tres colecciones replicadas, obtenidas del experimento descrito en el ejemplo 2, se representan para CSD (círculos grises oscuros) y NEB (círculos grises claros) para colecciones derivadas del ADNlc "verdadero" (lado izquierdo) y "simulado" (lado derecho). Para el ADN introducido "verdadero", la profundidad promedio de cobertura para CSD fue 276X, frente a 77X para NEB. Para el ADN introducido "simulado", la profundidad promedio de cobertura para CSD fue 241X, frente a 104X para NEB. Figura 8D. Valores de profundidad de cobertura para cada una de las tres colecciones replicadas, obtenidas del experimento descrito en el ejemplo 3, se representan para CSD (gris oscuro) y NEB (gris claro) para 1 ng (lado izquierdo), 5 ng (centro) y 10 ng (lado derecho) de ADN introducido. Cuando se compara con el método NEB, la profundidad promedio de cobertura para CSD fue 1,8X, 1,4X y 1,3X mayor con 1 ng, 5 ng o 10 ng del ADN genómico derivado de FFPE, respectivamente.

Figura 9. Valores porcentuales de quimeras para cada una de tres colecciones replicadas obtenidas del experimento descrito en el ejemplo 4, se representan para CSD (gris oscuro) y NEB (gris claro) para colecciones derivadas del ADNlc "verdadero" (lado izquierdo) y "simulado" (lado derecho). Cuando se compara con el método NEB, el % promedio de quimeras presente para CSD fue 1,6X menor con el ADNIc introducido "verdadero" y 1,8X menor con el ADNlc introducido "simulado".

Figura 10A. Trazados, generadas con un chip Bioanalyzer DNA1000, que muestran la distribución de tamaños de moléculas de ADN presentes en cada una de tres colecciones replicadas generadas con los métodos NEB o CSD a partir del ADN de muestra con un 1 % o 0,5 % de fracciones de alelo minoritario. La ausencia de picos de dímeros en la señal de 150 pb (39) para el método CSD, y la presencia de dichos picos en el método NEB (38), demuestra la existencia reducida de dímeros de adaptadores para colecciones preparadas con CSD, en comparación con las preparadas con el método NEB.

Figura 10B. Trazados generados con el chip Bioanalyzer DNA1000 (tras PCR) para cada una de tres colecciones replicadas creadas con 10 ng de ADN genómico de alta calidad troceado a 150 pb, 200 pb o 300 pb (ADNg extraído de la línea celular NA12878 conseguido de la ATCC). Para las tres longitudes de fragmento, hubo una ausencia de picos de dímeros que se observan normalmente en el intervalo de 125 pb-150 pb.

Figura 10C. Trazados generados con el chip Bioanalyzer DNA1000 (tras PCR) para cada una de tres colecciones replicadas creadas con 10 ng o 1 ng de ADN genómico de alta calidad troceado a 200 pb. Para ambas cantidades introducidas, hubo una ausencia de picos de dímeros que se observan normalmente en el intervalo de 125 pb-150 pb.

Los siguientes ejemplos ilustran, pero no limitan la invención reivindicada.

Ejemplo 1

Este ejemplo demuestra la profundidad potenciada de cobertura obtenida de colecciones NGS, preparadas a partir de ADN genómico de alta calidad, usando la segunda realización del método CSD en comparación con el obtenido cuando se usa la colección NEB® Ultra™ II (New England BioLabs) o métodos Kapa Hyper Prep (Kapa Biosystems). El ADN genómico de alta calidad se extrajo de la línea celular NA12878 (ATCC). Se troceó 1 o 10 ng del ADN extraído hasta un tamaño promedio de 150 pb usando fragmentación ultrasónica (Covaris S220) y después se sometió a reparación de extremos, que incluyó fosforilación de los extremos 5' con polinucleótido cinasa t 4 (PNK), durante 30 minutos, seguido de purificación mediante microesferas AMPure 2,5X. Para el tratamiento de CSD, adaptadores P7 (SEQ ID NO:11-16), hibridados con oligonucleótidos bloqueados con 3' ddN truncados (SEQ ID NO:17), se ligaron en los fragmentos diana de extremos reparados mediante ligamiento de extremos romos usando la ADN ligasa T4 mutante K159S durante 15 minutos, seguido de una etapa de destrucción térmica de 15 minutos. Adaptadores P5 (SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2) entonces se ligaron en el primer producto de ligamiento usando ADN ligasa Taq durante 15 minutos, seguido de purificación usando microesferas AMPure 2,5X. Para el tratamiento de NGS, se prepararon colecciones según las instrucciones del fabricante. Ambas colecciones entonces se sometieron a una amplificación por PCR con cebadores que contienen secuencias que son complementarias a los adaptadores P5 y P7 en las siguientes condiciones: 98 °C durante 45 segundos, 12 ciclos de: 98 °C 15 s, 60 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 1 minuto, 4 °C de mantenimiento. Las colecciones entonces experimentaron captura de híbridos, usando un panel personalizado de aproximadamente 800 sondas IDT Lockdown, para extraer fragmentos que contenían secuencias diana que se usaron para determinar los valores de profundidad de cobertura. El producto enriquecido con diana resultante se purificó mediante microesferas AMPure 1,8X y se secuenció en un secuenciador MiSeq® (Illumina) usando 2 X 150 lecturas de extremos emparejados y siguiendo el protocolo del fabricante. Las colecciones se prepararon por triplicado. Los valores de profundidad de cobertura para cada una de las tres colecciones obtenidas de CSD para 10 y 1 ng de ADN introducido, se representan en comparación con los valores obtenidos de los métodos NEB (figura 8A) y Kapa (figura 8B). Cuando se compara con el método NEB, la profundidad promedio de cobertura para CSD fue 1,7X mayor con 10 ng de ADN introducido, y 2,5X mayor con 1 ng de ADN introducido (figura 8A). Cuando se compara con el método Kapa, con 10 ng de ADN introducido, la profundidad promedio de cobertura para CSD fue 1,6X mayor (figura 8B). Los valores de profundidad de cobertura se determinaron mediante el número de lecturas únicas (sin contar los duplicados de PCR) que se cartografiaron en las secuencias diana esperadas que se enriquecieron mediante el panel de 800 sondas Lockdown.

Ejemplo 2

Este ejemplo demuestra la profundidad potenciada de cobertura obtenida de colecciones NGS, preparadas a partir de ADN libre de células (ADNlc) circulante, usando la segunda realización del método CSD en comparación con la obtenida cuando se usa la colección NEBNext® Ultra™ II. Las muestras de ADNlc "verdadero" son ADN libre de células real aislado por Biochain de individuos sanos, mientras que las muestras de ADNlc "simulado" son ADN genómico de línea celular (NA12878) troceado hasta 150 pb usando un Covaris S2. Las colecciones se prepararon con 1 ng del ADNlc usando los métodos CSD y NEB, como se describe en el ejemplo 1, por triplicado. Cuando se compara con el método NEB, la profundidad promedio de cobertura para CSD fue 3,6X mayor con el ADNlc "verdadero" introducido, y 2,3X mayor con el ADNlc "simulado" introducido (figura 8C).

Ejemplo 3

Este ejemplo demuestra la profundidad potenciada de cobertura obtenida de colecciones NGS, preparadas a partir de ADN genómico de baja calidad extraído de muestras FFPE, usando la segunda realización del método CSD en comparación con la obtenida cuando se usa la colección NEB Ultra II. Las muestras FFPE se consiguieron de Asterand Bioscience. Las colecciones se prepararon como se describe anteriormente usando 1 ng, 5 ng o 10 ng del ADN genómico derivado de FFPE, troceado hasta una tamaño promedio de 200 pb, como material de partida. Cuando se compara con el método NEB, la profundidad promedio de cobertura para CSD fue 1,8X, 1,4X y 1,3x mayor con 1 ng, 5 ng o 10 ng del ADN genómico derivado de FFPE, respectivamente (figura 8D).

Ejemplo 4

Este ejemplo demuestra la tasa reducida de quimeras en colecciones NGS preparadas a partir de ADNlc usando la segunda realización del método CSD en comparación con la presente en colecciones de ADNlc preparadas usando el método NEB. Las colecciones se prepararon como se describe anteriormente, usando 1 ng de ADNlc "verdadero" 0 "simulado" como aporte, por triplicado. Cuando se compara con el método NEB, el % promedio de quimeras presente para CSD fue 1,6X menor con el ADNlc introducido "verdadero" y 1,8X menor con el ADNlc introducido "simulado" (figura 9). Los valores de % de quimeras se calcularon basándose en el número de lecturas únicas que se alinearon inapropiadamente con la secuencia de referencia (hg19). Los fragmentos clasificados como "quiméricos" tienen (1) lecturas emparejadas que enfocan en la misma dirección (misma orientación), (2) lecturas emparejadas que alinean con regiones de la secuencia de referencia que está separadas más de 3 kb, y/o (3) lecturas emparejadas que alinean con diferentes cromosomas.

Ejemplo 5

Este ejemplo demuestra la existencia reducida de dímeros de adaptadores en colecciones NGS preparadas a partir de ADN genómico de alta calidad cuando se usa la segunda realización del método CSD en comparación con la presente en colecciones preparadas usando el método NEB. Las muestras de ADN genómico de alta calidad se extrajeron de dos líneas celulares, NA12878 y NA24385, y se mezclaron a dos relaciones diferentes, provocando dos mezclas que tenían un 1 % y 0,5 % de fracciones de alelo minoritario, respectivamente. Las muestras se trocearon hasta fragmentos de 300 pb. Se crearon colecciones NEB usando una relación de AMPure 0,9X tras el ligamiento, que está pensada para seleccionar el tamaño alejado del adaptador-dímero. Se crearon colecciones CSD con una relación 2,5X tras el ligamiento, que es demasiado alta para eliminar de forma eficaz los dímeros de adaptadores de longitud completa. Las colecciones NEB se trataron con AMPure 1,0X tras la PCR para eliminar cualquier dímero residual, mientras que las colecciones CSD se trataron con una relación 1,8X. Los productos de colección final se analizaron en un chip Bioanalyzer DNA1000, mediante el que se generaron trazados que mostraron la distribución de tamaños de las moléculas de ADN presentes en cada colección. La ausencia de picos de dímeros en la señal de 150 pb para el método CSD sin selección de tamaños indica que la formación de dímeros es insignificante o inexistente en colecciones preparadas con el método CSD (figura 10A). Las colecciones preparadas usando el método NEB, por otro lado, aún contienen pequeñas cantidades de dímeros de adaptadores, a pesar de las dos etapas de selección de tamaños, como se indica por los pequeños picos en la señal de 150 pb en los trazados (figura 10A).

Ejemplo 6

Este ejemplo demuestra que la presencia reducida de dímeros de adaptadores en colecciones NGS preparadas usando la segunda realización del método CSD es independiente de las longitudes de los fragmentos diana usados como punto de partida. Se crearon colecciones como se describe anteriormente con 10 ng de ADN genómico de alta calidad, extraído de la línea celular NA12878, y se troceó hasta 150 pb, 200 pb o 300 pb. Como se describe anteriormente, los productos de colección final se analizaron en un chip Bioanalyzer DNA1000, generando trazados de distribución de tamaños. Para las tres longitudes de fragmento, hubo una ausencia de picos de dímeros que se observan normalmente en el intervalo de 125 pb-150 pb (figura 10B).

Ejemplo 7

Este ejemplo demuestra que la presencia reducida de dímeros de adaptadores en colecciones NGS preparadas usando la segunda realización del método CSD es independiente de la cantidad de ADN introducido usado como material de partida. Se crearon colecciones como se describe anteriormente con 10 ng o 1 ng de ADN genómico de alta calidad, extraído de la línea celular NA12878, y se troceó hasta 200 pb. Para ambas cantidades introducidas, hubo una ausencia de picos de dímeros que se observan normalmente en el intervalo de 125 pb-150 pb (figura 10C). Como referencia, el pico secundario a aproximadamente 1500 pb combinado con el marcador superior es un fenómeno conocido debido a sobreamplificación durante PCR.

Ejemplo 8

Este ejemplo demuestra la sensibilidad potenciada conseguida en colecciones NGS preparadas a partir de ADN genómico de alta calidad usando la sexta realización del método CSD en comparación con la obtenida cuando se usa el método Kapa Hyper Prep. El ADN genómico de alta calidad se extrajo de líneas celulares NA12878 y NA24385 y se mezcló a una relación de 1/100, generaron una frecuencia de alelo minoritario homocigótico y heterocigótico de un 1 % y un 0,5 %, respectivamente. Las mezclas genómicas, con aportes que varían de 1 a 25 ng, se trocearon hasta un tamaño promedio de 150 pb usando fragmentación ultrasónica (Covaris S220) y después se sometieron a reparación de extremos, que incluyó fosforilación de los extremos 5' con polinucleótido cinasa T4 (PNK), durante 30 minutos, seguido de purificación mediante microesferas AMPure 2,5X. Para el tratamiento de CSD, adaptadores P7 truncados (SEQ ID NO:18-33), hibridados con oligonucleótidos bloqueados con 3' ddN truncados (s Eq ID NO:34-49), se ligaron en los fragmentos diana de extremos reparados mediante ligamiento de extremos romos usando la ADN ligasa T4 mutante K159S durante 15 minutos, seguido de una etapa de destrucción térmica de 15 minutos. Los adaptadores P5 truncados (SEQ ID NO:50) entonces se hibridaron con la secuencia constante añadida por el primer adaptador de secuenciación (25 en la figura 6), pero no con la región variable (26 y 27 en la figura 6). El hueco resultante se llenó usando la ADN polimerasa Taq, seguido de ligamiento con la ADN ligasa Taq. Esto estuvo seguido de purificación usando microesferas AMPure 2,5X. El producto entonces se sometió a una amplificación por PCR con cebadores con cola que contenían las partes restantes de las secuencias adaptadoras P7 y P5. Las secuencias cebadoras con cola P7 se enumeran como SEQ ID NO:51-74 mientras que las secuencias con cola P5 se enumeran como SEQ ID NO:75-98. Las condiciones de PCR fueron como sigue: 98 °C durante 45 segundos; 12 cicles de 98 °C durante 15 s, 60 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 30 segundos; 72 °C durante 1 minuto; 4 °C de mantenimiento. Para el tratamiento de Kapa, se prepararon colecciones según las instrucciones del fabricante. Las colecciones experimentaron captura de híbridos, usando un panel personalizado de ~100 kb de sondas IDT Lockdown®, para extraer subconjuntos de los genotipos mixtos. En estos subconjuntos, había 291 diferencias nucleotídicas conocidas entre las secuencias de NA12878 y NA24385 y estas se usaron para evaluar las sensibilidades y PPV de los dos métodos de preparación de colecciones. Las colecciones experimentaron secuenciación ultraexhaustiva en un secuenciador MiSeq® (Illumina) usando 2 X 150 lecturas de extremos emparejados y siguiendo el protocolo del fabricante. Esto estuvo seguido por identificación de variante, usando el programa informático VarDict. Aunque hubo tres positivos falsos identificados con la colección Kapa a 20 ng introducidos, hubo cero positivos falsos identificados con la colección Kapa a 10 ng de ADN introducido y la colección CSD tanto a 10 como a 20 ng de ADN introducido, provocando un PPV de uno para ambas colecciones. El número de negativos falsos, sin embargo, fue 3x menor cuando se usaban las colecciones CSD a 20 ng introducidos y 2x menor a 10 ng introducidos, en comparación con los obtenidos usando las colecciones Kapa a las mismas cantidades introducidas. Los resultados se muestran en la tabla 2.

Tabla 1: Secuencias

continuación

continuación

continuación

continuación

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método de preparación de un fragmento de ácido nucleico diana bicatenario para secuenciación, comprendiendo el método:

a. ligamiento de una primera secuencia adaptadora al extremo 3' del fragmento de ácido nucleico diana con una primera ligasa, en donde la primera ligasa realiza un ligamiento de extremos romos; y

b. ligamiento de una segunda secuencia adaptadora al extremo 5' de dicho fragmento de ácido nucleico diana con una segunda ligasa, en donde la segunda ligasa realiza un ligamiento entablillado, en el que la primera secuencia adaptadora es un entablillado para el ligamiento de la segunda secuencia adaptadora;

c. por lo que dicha primera secuencia adaptadora se adenila en su extremo 5'; y

d. por lo que dicha primera ligasa es una ligasa dependiente de ATP deficiente de adenilación.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la primera ligasa es ADN ligasa T4 con una sustitución aminoacídica en K159.

3. El método de la reivindicación 2, en el que la sustitución aminoacídica es K159S.

4. El método según la reivindicación 1, en el que la segunda ligasa es una ligasa dependiente de ATP o una ligasa no dependiente de ATP.

5. El método de la reivindicación 4, en el que la segunda ligasa es una ligasa dependiente de NAD.

6. Un método de preparación de una muestra de fragmentos de ácido nucleico diana bicatenario para secuenciación, comprendiendo el método:

a. ligamiento de una pluralidad de primeras secuencias adaptadoras a los extremos 3' de los fragmentos de ácido nucleico diana con una primera ligasa, por lo cual las primeras secuencias adaptadoras comprenden

i. secuencias marcadoras variables en los extremos 5' que sirven para marcar independientemente las hebras de sentido y de antisentido de cada fragmento diana en los extremos 3' y

ii. una secuencia constante localizada 3' de las secuencias marcadoras variables,

b. hibridación de una segunda secuencia adaptadora a la secuencia constante de cada una de las primeras secuencias adaptadoras ligadas, por lo cual la segunda secuencia adaptadora comprende una secuencia constante en su extremo 3' que es complementaria a la secuencia constante de cada primera secuencia adaptadora,

c. llenado de huecos resultantes que abarcan las primeras secuencias marcadoras variables con una polimerasa, creando una pluralidad de segundas secuencias marcadoras variables, cada una complementaria a su primera secuencia marcadora variable correspondiente, que sirve para marcar independientemente las hebras de sentido y de antisentido de los fragmentos diana en sus extremos 5' y,

d. ligamiento de los extremos 3' de las segundas secuencias marcadoras a los extremos 5' de la secuencia diana con una segunda ligasa,

e. por lo que dicha primera secuencia adaptadora se adenila en su extremo 5' y

f. por lo que dicha primera ligasa es una ligasa dependiente de ATP deficiente de adenilación.

7. El método de la reivindicación 6, en el que la primera ligasa es ADN ligasa T4 con una sustitución aminoacídica en K159.

8. El método de la reivindicación 7, en el que la sustitución aminoacídica es K159S.

9. El método de la reivindicación 6, en el que la segunda ligasa es una ligasa dependiente de ATP, una ligasa no dependiente de ATP o una ligasa dependiente de NAD.

10. El método de la reivindicación 6, donde los nucleótidos de las secuencias marcadoras son degenerados y/o fijos, y opcionalmente en el que las secuencias marcadoras tienen una longitud de entre 3 y 20 nucleótidos.

11. Un método de preparación de una muestra de fragmentos de ácido nucleico diana bicatenario para secuenciación, comprendiendo el método:

a. ligamiento de una pluralidad de primeras secuencias adaptadoras a los extremos 3' de los ácidos nucleicos diana con una primera ligasa, por lo que las primeras secuencias adaptadoras comprenden

i. primeras secuencias marcadoras variables en sus extremos 5' que sirven para marcar independientemente las hebras de sentido y de antisentido de cada fragmento diana en sus extremos 3' y

ii. una secuencia constante localizada 3' de las secuencias marcadoras variables,

b. hibridación de una pluralidad de segundas secuencias adaptadoras con las secuencias marcadoras constantes y variables de las primeras secuencias adaptadoras ligadas, por lo que las segundas secuencias adaptadoras comprenden

i. segundas secuencias marcadoras variables en sus extremos 3' que son complementarias a sus primeras secuencias marcadoras correspondientes y sirven para marcar independientemente las hebras de sentido y de antisentido de cada fragmento diana en sus extremos 5' y

ii. una segunda secuencia constante localizada 5' de las segundas secuencias marcadoras variables que es complementaria a la primera secuencia constante de cada primera secuencia adaptadora,

c. ligamiento de los extremos 3' de las segundas secuencias marcadoras a los extremos 5' de la secuencia diana con una segunda ligasa,

d. por lo que dichas primeras secuencias adaptadoras se adenilan en sus extremos 5' y

e. por lo que dicha primera ligasa es una ligasa dependiente de ATP deficiente de adenilación.

12. El método de la reivindicación 11, en el que la primera ligasa es ADN ligasa T4 con una sustitución aminoacídica en K159.

13. El método de la reivindicación 12, en el que la sustitución aminoacídica es K159S.

14. El método de la reivindicación 11, en el que la segunda ligasa es una ligasa dependiente de ATP, una ligasa no dependiente de ATP o una ligasa dependiente de NAD.

15. El método de la reivindicación 11, donde los nucleótidos de las secuencias marcadoras son degenerados y/o fijos, y opcionalmente en el que las secuencias marcadoras tienen una longitud de entre 3 y 20 nucleótidos.