ES2947168T3 - Cultivo celular tridimensional - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con métodos y materiales para cultivar y transportar células madre en un cultivo tridimensional. Los materiales comprenden nanofibrillas de celulosa en forma de entidades discontinuas tridimensionales en un hidrogel biocompatible. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Cultivo celular tridimensional

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de los sistemas de cultivo celular y de la tecnología celular.

Antecedentes

Las células troncales (“stem”) embrionarias humanas (hESC)1 y las células troncales pluripotentes inducidas humanas (hiPSC)₂3 son células pluripotentes que se autorrenuevan y que son capaces de diferenciarse en muchos tipos celulares en el organismo. Son muy prometedoras, por ejemplo, para la terapia celular, la investigación de fármacos y la ingeniería de tejidos. Además, se contempla que en el futuro las células troncales pluripotentes inducidas humanas, las células multipotentes y otras células indiferenciadas se proliferarán y dirigirán para diferenciarlas en linajes específicos de manera que desarrollen células o tejidos diferenciados que puedan trasplantarse en el organismo humano con fines terapéuticos. Las células troncales pluripotentes humanas y las células diferenciadas que pueden derivarse de ellas asimismo son herramientas científicas potentes para el estudio de los sistemas celulares y de desarrollo humanos.

Con el fin de expandir las hESC y las hiPSC y evitar su diferenciación espontánea, se han desarrollado algunos sistemas de cultivo in vitro. Convencionalmente se han cultivado las células en dichos sistemas sobre células nodriza1 y posteriormente se introdujo el recubrimiento de Matrigel4 para sustituir a las células nodriza, en combinación con la utilización de medio acondicionado o medio definido químicamente, por ejemplo medio mTeSR15 Sin embargo, el Matrigel incluye componentes de matriz mal definidos y la reproducción de cultivos celulares optimizados resulta difícil debido a la variación entre lotes del material. Más recientemente, varios estudios con vitronectina (VN)6, laminina-511 (LM-511)7, LM-521, péptido sintético-superficie de acrilato8 o recubrimiento de polímero sintético9 han avanzado en el desarrollo de sistemas de cultivo in vitro definidos químicamente para la propagación de hESC y hiPSC en estado indiferenciado. Sin embargo, la totalidad de dichos sistemas de cultivo utiliza superficies bidimensionales (2D), que no mimetizan el medio in vivo de las células troncales, denominado nicho de célula troncal. Además, las células cultivadas sobre superficies 2D no son fácilmente escalables a las cantidades más grandes requeridas para, por ejemplo, terapia e investigación.

Las células troncales adultas, o células troncales somáticas, son células indiferenciadas que se encuentran en todo el cuerpo tras la diferenciación. Son responsables de, por ejemplo, la regeneración de los órganos y son capaces de dividirse en estado pluripotente o multipotente y se diferencian en linajes celulares diferenciados.

Las células troncales mesenquimatosas humanas (hMSC) muestran un grado de plasticidad muy elevado y se encuentran en prácticamente todos los órganos, con la densidad más alta en la médula ósea. Las hMSC sirven de fuente renovable para las células mesenquimatosas y presentan la capacidad pluripotente de diferenciarse en varios linajes celulares, incluyendo osteoblastos, condrocitos, adipocitos, miocitos esqueléticos y cardíacos, células endoteliales y neuronas, in vitro con la estimulación adecuada e in vivo tras el trasplante.

El nicho de las células troncales es un microambiente 3D complejo bien definido que regula el destino de las células troncales mediante la presentación en el espacio de señales bioquímicas y físicas. Las células bajo condiciones fisiológicas no sólo se comunican entre ellas (“cross talk”) sino que asimismo interactúan con su microambiente celular y la matriz extracelular (ECM). La ECM proporciona soporte estructural a las células y contribuye, además, a la señalización y dirección del destino celular. La ECM está compuesta principalmente por glucosaminoglicanos y proteínas fibrilares, tales como el colágeno, la elastina, la laminina y la fibronectina, las cuales se autoensamblan formando una red nanofibrilar.

En el cultivo celular 3D, una matriz de cultivo adecuada debe poder mimetizar los componentes de la ECM nativa para proporcionar un andamiaje con propiedades similar a las de la ECM nativa, tales como el soporte estructural para las células y una red de poros interconectados para la migración celular eficiente y la transferencia de nutrientes a las células.

Los hidrogeles manipulados con propiedades mecánicas, químicas y biológicas modificadas tienen el potencial de mimetizar la ECM y de esta manera resultar útiles en los cultivos celulares 3D. Son productos comerciales para el cultivo celular 3D, por ejemplo, las matrices de cultivo celular PuraMatrix™ (3DM Inc.) y Matrigel (BD Biosciences). PuraMatrix™ es un hidrogel de nanofibras peptídicas autoensambladas con una estructura similar a la del colágeno fibrilar natural presente en la ECM, con diámetros de fibra de 5 a 10 nm. Además, presenta un contenido de agua elevado, típicamente de 99.5%. La patente US n° 7.449.180 y el documento WO 2004/007683 dan a conocer hidrogeles peptídicos. El Matrigel es una mezcla de proteínas gelatinosas secretadas por células tumorales de ratón. La mezcla es similar al complejo medio extracelular observado en muchos tejidos y es utilizado por biólogos celulares como un sustrato para el cultivo celular. La matriz ECM MaxGel™ (Sigma-Aldrich), que incluye una mezcla de componentes de la ECM humana, forma un gel a temperatura ambiente. Habitualmente, en estos sistemas se separan las células pluripotentes de la matriz de cultivo celular mediante tratamiento con proteasa, que rompe la red de proteínas extracelular utilizada por las células para unirse a la matriz de cultivo celular y a las células vecinas.

La celulosa bacteriana (BC) se ha utilizado en membranas de cicatrización de heridas y como andamiaje en cultivos celulares. La limitación en el uso de la celulosa bacteriana para el cultivo de células troncaless deriva de la estructura inherente del material fermentado: en el cultivo se forma BC en forma de membranas muy cerradas en la interfase aire-agua del fermentador. Las membranas formadas son excesivamente cerradas para el cultivo celular 3D y diversas modificaciones. Si se utiliza como matriz de cultivo celular, es necesario incrementar la porosidad de la matriz de BC para permitir una adecuada penetración celular y la formación de agregados celulares.

La patente US n° 5.245.471 da a conocer un portador para cultivo celular que comprende fibras ultrafinas. El documento WO 2009/126980 da a conocer hidrogeles basados en celulosa cuya sustancia de marco consiste esencial o totalmente en celulosa y se forman mediante regeneración a partir de solventes orgánicos. La patente europea EP1970436B1 da a conocer material de portador para cultivos de células indiferenciadas. Los actuales sistemas de cultivo celular 2D y 3D para cultivos de células pluripotentes, tales como las células troncales, se basan en matrices de origen animal. Los compuestos de origen animal en el medio de cultivo celular generan un riesgo de reacciones inmunitarias y diferentes tipos de problemas de toxicidad en el cultivo celular y en aplicaciones posteriores. Además, la recolección de células a partir de matrices de cultivo celular compuestas por material proteico requiere el tratamiento del cultivo celular con un enzima degradante de las proteínas, tal como una proteasa, que asimismo hidroliza estructuras extracelulares de las células en cultivo.

Breve descripción de la invención

Aunque se han realizado muchos avances en los sistemas de cultivo celular para células indiferenciadas, las soluciones anteriores no han podido proporcionar un sistema de cultivo celular que permita el cultivo 3D escalable y la recolección de células indiferenciadas y esferoides. Además, las soluciones anteriores requieren la utilización de sustancias químicas o compuestos de origen animal en el medio biomaterial para el mantenimiento del crecimiento y propagación de las células. El mantenimiento de las células troncales en estado pluripotente es exigente y requiere un control cuidadoso de las condiciones de cultivo, los materiales y la manipulación de las células. Además, el transporte de cultivos celulares pluripotentes de un laboratorio a otro para el cultivo adicional implica riesgos y con frecuencia únicamente una fracción de las células es viable y puede continuar la propagación en estado pluripotente. Actualmente no existen soluciones simples de matriz utilizadas con el medio de cultivo celular que permitan propagar células troncales en estado pluripotente y que permitirían la formación y recolección de células y esferoides celulares sin destruir la red intercelular.

Los inventores han desarrollado composiciones de células troncales, sistemas y métodos de cultivo escalables que permiten, por ejemplo, cultivar y propagar hESC pluripotentes en un entorno 3D. La invención hace uso de nanofibrillas de celulosa (CNF), materiales de origen no animal con diámetros de fibra de orden nanométrico y longitud de las fibras del orden micrométrico, en matriz de cultivo celular. Estas nanofibrillas de celulosa están compuestas por cadenas alineadas del polisacárido p-D-(1^4)glucopiranosa10. Las CNF pueden aislarse por ejemplo a partir de paredes celulares de madre, de otras plantas y de determinadas bacterias. Las CNF forman hidrogeles con propiedades físicas y químicas ajustables1112 y diversas aplicaciones farmacéuticas y biomédicas.

En un aspecto se proporciona una entidad discontinua tridimensional para el cultivo de células, que comprende un medio acuoso y cuerpos de hidrogel que comprenden nanofibrillas de celulosa y/o derivados de las mismas suspendidas en el medio acuoso.

En otro aspecto se proporciona una entidad tridimensional discontinua y un método para producirla, en el que el método para manufacturar una entidad discontinua tridimensional para el cultivo de células comprende: a. proporcionar nanofibrillas de celulosa y/o derivados de las mismas en una forma de: i. un hidrogel homogéneo, ii. una combinación del hidrogel homogéneo con un medio acuoso, y/o iii. cuerpos de gel deshidratados o nanofibrillas de celulosa granulada seca o derivados de las mismas hidratadas en un medio acuoso, y b. mezclar bajo condiciones que favorezcan la disrupción mecánica de la estructura homogénea del hidrogel con el fin de obtener una suspensión de cuerpos de hidrogel como entidad discontinua tridimensional.

En otro aspecto se proporciona una matriz de cultivo celular y un método para manufacturarla, en el que, en el método según los aspectos anteriores, se añaden células y el medio acuoso es un medio de cultivo celular.

En un aspecto se proporciona un artículo y la utilización del artículo para el cultivo celular, que comprende: a. un sustrato que presenta una superficie; b. una entidad discontinua tridimensional que comprende un medio acuoso y cuerpos de hidrogel que comprenden nanofibrillas de celulosa y/o derivados de las mismas suspendidas en el medio acuoso, o una entidad discontinua tridimensional que comprende un medio acuoso y cuerpos de hidrogel que comprenden nanofibrillas de celulosa y/o derivados de las mismas suspendidas en el medio acuoso en una forma deshidratada; c. y opcionalmente por lo menos un componente seleccionado de entre el grupo que consiste en un medio de cultivo celular, componentes de matriz extracelular, suero, factores de crecimiento, proteínas, antibióticos y conservantes. Los artículos que comprenden las entidades discontinuas tridimensionales inventivas pueden ser cualquier artículo adecuado para el cultivo de células, tal como botellas para cultivo celular, placas y platos, placas de cultivo de múltiples paredes, placas de microtitulación, placas de alto rendimiento y similares. Preferentemente, los artículos son de grado de cultivo celular.

En un aspecto ser proporciona la utilización de la entidad discontinua tridimensional anteriormente indicada para el cultivo de células o tejidos.

En un aspecto se proporciona un método de transporte de células, en el que las células se transportan en la entidad discontinua tridimensional anteriormente indicada.

En un aspecto se proporciona un método para el cultivo tridimensional o bidimensional de células o tejidos, que comprende proporcionar la entidad discontinua tridimensional anteriormente indicada, inocular por lo menos una célula en la entidad discontinua tridimensional, y el cultivo para obtener una masa celular.

En un aspecto se proporciona un kit que comprende un primer y un segundo recipiente, en el que el primer recipiente comprende la entidad discontinua tridimensional anteriormente indicada o la entidad discontinua tridimensional anteriormente indicada, en forma deshidratada, tal como de polvos secos, granulado concentrado o cuerpo de hidrogel concentrado, y en el que el segundo recipiente comprende celulasa.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa que las células WA07 e iPS(IMR90)-4 presentan un cariotipo normal. Las células se cultivaron en primer lugar en la entidad discontinua 3D de la invención y después se transfirieron a una plataforma de Matrigel 2D para el análisis del cariotipo.

La figura 2 representa que las células WA07 e iPS(IMR90)-4 transferidas desde un cultivo 3D en la entidad discontinua 3D de la invención a placas 2D recubiertas con laminina 511, recubiertas con laminina 521, recubiertas con vitronectina y recubiertas con Matrigel muestran la morfología habitual de las células troncales. Magnificación: 10x.

La figura 3 representa la tinción vivo/muerto de células WA07 e iPS(IMR90)-4 cultivadas durante 9 días en la entidad discontinua 3D de la invención obtenida mediante dilución y mezcla de hidrogel de nanofibrillas de celulosa al 2% p/v hasta 0.5% p/v: la mayoría de las células en los agregados están vivas (en verde) y las células individuales en el fondo del pocillo aparentemente están muertas (en rojo). Barra de escala: 100 μm.

La figura 4 representa la optimización de la concentración de celulasa: 200 μg de celulasa/mg de celulosa aparentemente no resultan tóxicos. Presentan un efecto negativo mínimo sobre la viabilidad celular 300 a 500 μg de celulosa/mg de celulosa. Se realizó un seguimiento de la proliferación y la viabilidad celulares mediante el ensayo AlamarBlue.

La figura 5 representa que las células iPS(IMR90)-4 subcultivadas a partir de un cultivo 3D en un nuevo cultivo 3D en la entidad discontinua 3D de la invención eran capaces de formar esferoides.

La figura 6 representa EB formados a partir de células iPS(IMR90)-4 que habían sido cultivadas en la entidad discontinua 3D de la invención. Las células se cultivaron en cultivo de flotación para formar los EB o sobre recubrimientos 2D sin CNF.

La figura 7 representa que las células iPS(IMR90)-4 transferidas de cultivo 3D en la entidad discontinua 3D de la invención a laminina-511 2D expresan SSEA4 y OCT4, aunque no beta-tubulina III, actina muscular ni HNF3B. Barra de escala: 100 μm.

La figura 8 representa que las células iPS(IMR90)-4 transferidas de cultivo 3D en la entidad discontinua 3D de la invención a laminina-521 2D expresan SSEA4 y OCT4, aunque no beta-tubulina III, actina muscular ni HNF3B. Barra de escala: 100 μm.

La figura 9 representa que las células iPS(IMR90)-4 transferidas de cultivo 3D en la entidad discontinua 3D de la invención a Matrigel 2D expresan SSEA4 y OCT4, aunque no beta-tubulina III, actina muscular ni HNF3B. Barra de escala: 100 μm.

La figura 10 representa que las células iPS(IMR90)-4 transferidas de cultivo 3D en la entidad discontinua 3D de la invención a vitronectina 2D expresan SSEA4 y OCT4, aunque no beta-tubulina III, actina muscular ni HNF3B. Barra de escala: 100 μm.

La figura 11 representa que las células WA07 transferidas de cultivo 3D en la entidad discontinua 3D de la invención a laminina-511 2D expresan SSEA4 y OCT4, aunque no beta-tubulina III, actina muscular ni HNF3B. Barra de escala: 50 |jm.

La figura 12 representa que las células WA07 transferidas de cultivo 3D en la entidad discontinua 3D de la invención a laminina-521 2^d expresan SSEA4 y OCT4, aunque no beta-tubulina III, actina muscular ni HNF3B. Barra de escala: 50 jm.

La figura 13 representa que las células WA07 transferidas de cultivo 3D en la entidad discontinua 3D de la invención a Matrigel 2D expresan SSEA4 y OCT4, aunque no beta-tubulina III, actina muscular ni HNF3B. Barra de escala: 50 jm.

La figura 14 representa que las células WA07 transferidas de cultivo 3D en la entidad discontinua 3D de la invención a vitronectina 2D expresan SSEA4 y OCT4, aunque no beta-tubulina III, actina muscular ni HNF3B. Barra de escala: 50 jm.

La figura 15 representa la diferenciación in vitro de células iPS(IMR90)-4 mediante formación de EB: en primer lugar se cultivaron las células iPS(IMR90)-4 en la entidad discontinua 3D de la invención y se prolongó el cultivo sobre placas recubiertas con Matrigel. Los cuerpos embrioides se formaron en cultivo de flotación. Las células diferenciadas expresaban beta-tubulina III, actina muscular y HNF3B. Barra de escala: 50 jm .

La figura 16 de RT-PCR en tiempo real muestra que las células WA07 e iPS(IMR90)-4 transferidas de cultivo 3D en la entidad discontinua 3D de la invención a cuatro plataformas 2D (LM-511: laminina-511; LM521: laminina-521; VN: vitronectina y M: Matrigel) expresaban niveles similares de NANOG y OCT4 a las cultivadas en la plataforma de Matrigel convencional (M ctrl) (n=3).

La figura 17 representa los perfiles de flujo de la estructura de hidrogel continua (A) y de la entidad discontinua 3D de la invención (B). Tanto para A como para B se utilizaron nanofibrillas de celulosa nativa sometida a intercambio iónico, en una proporción de 0.5% p/v en sistema acuoso.

La figura 18 representa los perfiles de flujo de la estructura de hidrogel continua (A) y de la entidad discontinua 3D de la invencion (B). Tanto para A como para B se utilizaron nanofibrillas de celulosa aniónicamente modificada en una proporción de 0.5% p/v en sistema acuoso.

La figura 19 representa imágenes de microscopía óptica de contraste de fases de la estructura de gel continua (parte superior) y discontinua (parte inferior) para las nanofibras de celulosa nativa sometida a intercambio iónico y dispersada en agua en una proporción de 0.5% p/v. Se preparó la estructura de gel discontinuo mediante dilución de una muestra de gel al 2% hasta 0.5% seguido de la mezcla cinco veces con una pipeta (en un vial de 50 ml con una pipeta Pasteur de 3 ml de 0.2 cm de diámetro).

La figura 20 representa imágenes de estereomicroscopía de la estructura de gel continua (parte superior) y discontinua (parte inferior) para las nanofibras de celulosa modificadas aniónicamente y dispersadas en agua en una proporción de 0.5% p/v. Se preparó la estructura de gel discontinua mediante dilución de una muestra de 1-3 mm de tamaño al 27% p/v hasta una proporción de 0.5%, seguido de la mezcla con un agitador magnético (decantador de vidrio de 400 ml; 5 minutos a 300 rpm).

Figura 21. Las células H9-GFP cultivadas en la entidad discontinua 3D de la invención mostraban una fuerte tinción de OCT4. La expresión de OCT4 no se vio comprometida por el tratamiento con celulasa. Las células se muestran en verde, mientras que OCT4 está teñido en rojo. Barra de escala: 50 jm .

Figura 22. En primer lugar las células H9-GFP se cultivaron en la entidad discontinua 3D de la invención y después se transfirieron a placas 2D recubiertas con laminina-511, recubiertas con laminina-521, recubiertas con vitronectina o recubiertas con Matrigel. Las células aparecen de color verde y OCT4 está teñido en rojo. Barra de escala: 50 jm .

Figura 23. Tinción de CNF y obtención de imágenes de células vivas mediante la utilización de un microscopio confocal. Las células H9-GFP, mostradas en verde, se cultivaron en la entidad discontinua 3D de la invención; las CNF en ellas se muestran en azul. Tras el tratamiento con celulasa, se redujo la tinción azul de manera dependiente de la concentración. Barra de escala: 50 jm .

Figura 24. Dibujo esquemático de diferentes entidades de hidrogel discontinuo 3D realizadas en nanofibrillas de celulosa.

Figura 25. Actividad metabólica mitocondrial de células H9-GFP tratadas con celulasa. Se trataron células H9-GFP cultivadas en una plataforma de Matrigel con celulasa a las concentraciones de 0, 50, 100, 200, 300, 400 y 500 jg/mg de CNF durante 24 horas a 37°C. Se determinó la actividad metabólica mitocondrial relativa mediante ensayo AlamarBlue® un día antes y un día después del tratamiento enzimático. Se calcularon los incrementos medios de intensidad de fluorescencia a partir de tres experimentos independientes en los que se prepararon seis muestras en paralelo para cada condición. Los resultados se expresan como medias±SD (n=3). CNF durante 24 horas a 37°C. La actividad metabólica mitocondrial relativa se determinó mediante ensayo AlamarBlue® un día antes y un día después del tratamiento enzimático. Los incrementos medios de intensidad de fluorescencia se calcularon a partir de tres experimentos independientes en los que se prepararon seis muestras en paralelo para cada condición. Los resultados se expresan como medias±SD (n=3).

Descripción detallada de la invención

Algunos aspectos de la presente invención se refieren a composiciones de cultivo celular, a entidades discontinuas tridimensionales y a métodos de manufactura y utilización de los mismos en el cultivo y transporte celular. Las nanofibrillas de celulosa para la utilización según la presente invención pueden obtenerse a partir de material no animal, tal como plantas o microbios, o derivar de procedimientos de fermentación bacteriana. Las composiciones y sistemas pueden utilizarse para cultivar células, tales como las células troncales embrionarias de mamífero o las células pluripotentes inducidas. En un aspecto, las células pueden ser de origen humano. En otro aspecto, las células pueden ser de origen no humano.

A menos que se especifique lo contrario, las expresiones que se utilizan en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, presentan los significados utilizados habitualmente en el campo de los cultivos celulares. Específicamente, las expresiones siguientes presentan los significados indicados a continuación.

La expresión “entidad discontinua tridimensional” se refiere a un sistema que presenta una estructura discontinua tridimensional. Dicha entidad comprende un medio acuoso y cuerpos de hidrogel que comprenden nanofibrillas de celulosa y/o derivados de las mismas suspendidos en el medio acuoso.

La expresión “medio acuoso” se refiere a cualquier medio acuoso, tal como agua, agua desionizada, solución tampón o medio nutricional, adecuado para mantener, transportar, aislar, cultivar, propagar, subcultivar o diferenciar células o tejidos. El medio acuoso puede contener, además, diversos aditivos, tales como componentes especiales de la matriz extracelular, suero, factores de crecimiento, antibióticos, conservantes y proteínas. Como es conocido en la técnica, la selección del medio de cultivo celular depende del tipo celular que debe cultivarse. Existen muchos medios comerciales de cultivo celular que dan soporte al crecimiento indiferenciado o diferenciado de células. Entre los ejemplos de medios de cultivo celular adecuados en la presente invención se incluyen mTeSRI (StemCell Technologies), medio de células troncales mesenquimatosas (Lonza, Walkersville, MD, n.° PT-3001), medio STEMPRO SFM para hESC (Invitrogen), medio E de William (Invitrogen) y medios de diferenciación.

El término “discontinuo” se refiere a la estructura heterogénea de la entidad o a interrupciones en la continuidad física dentro de la entidad, por ejemplo interrupciones en el medio acuoso por cuerpos de hidrogel o interrupciones dentro y/o entre los cuerpos de hidrogel por el medio acuoso.

“Hidrogel”, “gel” o “hidrogel de nanofibrillas de celulosa” se refieren a una dispersión acuosa de nanofibrillas de celulosa que presenta una estructura de gel homogénea y continua. El hidrogel puede formarse mediante la combinación de nanofibrillas de celulosa con, por ejemplo, agua, solución tampón o medio de cultivo celular, o cualquier otra solución acuosa opcionalmente complementada con aditivos.

Un “cuerpo de hidrogel” y un “dominio de hidrogel” se refieren a una alícuota, división, dominio, fracción, parte o dosis de un hidrogel. El cuerpo de hidrogel puede presentar una forma bien definida, indefinida, simétrica o asimétrica.

“Suspendido” o “suspensión”, utilizados en el contexto de la entidad discontinua tridimensional o cuerpos de hidrogel, se refieren a una mezcla heterogénea de un medio acuoso e hidrogel en la que el hidrogel puede estar presente en forma de cuerpos de hidrogel separados o interconectados.

“Interconectado” e “ interconexión”, utilizados en el contexto de cuerpos de hidrogel se refiere a un sistema en el que los cuerpos de hidrogel están en contacto mutuo. El contacto puede ser una conexión directa entre los cuerpos de hidrogel o los cuerpos de hidrogel pueden estar laxamente conectados. En el caso de que la estructura homogénea del hidrogel se rompa, por ejemplo, mediante mezcla, la estructura discontinua resultante se caracteriza por cuerpos de hidrogel de diferentes tamaños y formas. En un aspecto, el sistema resultante puede contener cavidades acuosas entre cuerpos de gel interconectados o los cuerpos de hidrogel laxamente conectados pueden “flotar” en el medio acuoso con contactos entre ellos. En un aspecto, los cuerpos de hidrogel pueden estar indirectamente conectados mediante, por ejemplo, células u otros componentes presentes en el sistema.

La expresión “matriz de cultivo celular” se refiere a un sistema que comprende células y/o tejido, y la entidad discontinua tridimensional, las células y/o el tejido están presentes por lo menos parcialmente incluidos dentro de dicha entidad en una organización tridimensional o bidimensional. “Tridimensional” y “bidimensional” en el contexto de los cultivos celulares se refiere a la manera en que están dispuestas las células; por ejemplo, “3D” puede referirse a una agrupación o disposición de tipo esferoide y “2D” puede referirse a una disposición individual o en capas.

La expresión “cultivo celular” o “cultivo de células” se refiere a mantener, transportar, aislar, cultivar, propagar, hacer pases o diferenciar células o tejidos. Las células pueden encontrarse en cualquier disposición, tal como células individuales, monocapas, agrupaciones de células o esferoides, o en forma de un tejido.

La expresión “materia prima de celulosa” se refiere a cualquier furente de materia prima de celulosa que pueda utilizarse en la producción de pulpa de celulosa, pulpa refinada o nanofibrillas de celulosa. La materia prima puede estar basada en cualquier material vegetal que contenga celulosa. La materia prima asimismo puede derivar a partir de determinados procesos de fermentación bacteriana. El material vegetal puede ser madera. La madera puede ser de una conífera, tal como de una pícea, pino, abeto, alerce, abeto de Douglas o cicuta, o de árbol caducifolio, tal como abedul, arce, álamo, aliso, eucalipto o acacia, o de una mezcla de coníferas y caducifolios. El material no leñoso puede ser de residuos agrícolas, hierbas u otras sustancias vegetales, tales como paja, hojas, corteza, semillas, cáscaras, flores, verduras o frutos de algodón, maíz, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, lino, cáñamo, cáñamo de Manila, cáñamo de Sisal, yute, ramio, kenaf, bagazo, bambú o caña. La materia prima de celulosa asimismo podría obtenerse a partir de microorganismos productores de celulosa. Los microorganismos pueden ser del género Acetobacter, Agrobacteriium, Rhizobium, Pseudomonasor, Alcaligenes, preferentemente del género Acetobacter, más preferentemente de la especie Acetobacter xylinumor o Acetobacterpasteurianus.

La expresión “pulpa de celulosa” se refiere a fibras de celulosa, que se aíslan a partir de cualquier materia prima de celulosa mediante la utilización de procedimientos mecánicos de fabricación de papel químicos, mecánicos, termomecánicos o químico-térmicos. Típicamente, el diámetro de las fibras varía entre 15 y 25 μm y la longitud es superior a 500 μm, aunque la presente invención no pretende estar limitada a dichos parámetros.

La expresión “nanofibrilla de celulosa” se refiere a una colección de nanofibras de celulosa (CNF) aisladas o haces de nanofibras derivados de materia prima de celulosa o pulpa de celulosa. Las nanofibrillas habitualmente presentan una elevada relación de aspecto: la longitud podría exceder un micrómetro, mientras que el diámetro medio en número habitualmente es inferior a 200 nm. El diámetro de los haces de nanofibras asimismo puede ser mayor de 1 μm, aunque generalmente es inferior. Las nanofibrillas más pequeñas son similares a las denominadas fibrillas elementales, que habitualmente presentan un diámetro de 2 a 12 nm. Las dimensiones de las fibrillas o haces de fibrillas dependen de la materia prima y del método de desintegración. Las nanofibrillas de celulosa pueden contener, además, algunas hemicelulosas; la cantidad depende de la fuente vegetal. La desintegración mecánica de las nanofibrillas de celulosa a partir de materia prima de celulosa, pulpa de celulosa o pulpa refinada se lleva a cabo con equipos adecuados, tales como un refinador, triturador, homogeneizador, extractor de coloides, triturador de fricción, sonicador de ultrasonidos, fluidizador, tal como un microfluidizador, macrofluidizador u homogeneizador de tipo fluidizador. En un aspecto, las nanofibrillas de celulosa se obtienen de plantas. Las “nanofibrillas de celulosa” asimismo pueden aislarse directamente a partir de determinados procesos de fermentación. El microorganismo productor de celulosa de la presente invención puede ser del género Acetobacter, Agrobacterium o Rhizobium, o Pseudomonasor alcaligenes, preferentemente del género Acetobacterand, más preferentemente de la especie Acetobacter sylinumor o Acetobacter pasterianus. Las nanofibrillas de celulosa se caracterizan por valores de retención de agua muy elevados, un elevado grado de accesibilidad química y la capacidad de formar geles estables, hidrogeles, en agua u otros solventes polares. El producto de nanofibrillas de celulosa habitualmente es una red densa de celulosa altamente fibrilada.

Con el fin de obtener nanofibrillas de celulosa, se lleva a cabo la desintegración mecánica de la pulpa de celulosa o materia prima de celulosa oxidada, con equipos adecuados, tales como un refinador, triturador, homogeneizador, extractor de coloides, triturador de fricción, sonicador de ultrasonidos, fluidizador, tal como un microfluidizador, macrofluidizador u homogeneizador de tipo fluidizador. Preferentemente se utilizan nanofibrillas de celulosa desintegradas mecánicamente.

Se han desarrollado varios grados diferentes de nanofibrillas de celulosa mediante la utilización de diversas técnicas de producción. Los grados presentan diferentes propiedades según el método de fabricación, el grado de fibrilación y la composición química. Las composiciones químicas de los grados asimismo varían. Según la fuente de la materia prima, por ejemplo, pulpa HW versus SW, existen diferentes composiciones de polisacáridos en el producto de nanofibrillas de celulosa final. Habitualmente, los grados no iónicos o nativos presentan un diámetro de fibrilla más grande, mientras que los grados modificados químicamente son mucho más delgados y muestran una red continua. El diámetro de fibrilla medio en número de las nanofibrillas de celulosa convenientemente es de entre 1 y 200 nm, preferentemente el diámetro de fibrilla medio en número de los grados nativos es de entre 1 y 100 nm, y de los grados químicamente modificados es de entre 1 y 20 nm. La distribución de tamaños asimismo es más estrecha en los grados modificados. Las nanofibrillas de celulosa nativa sometida a intercambio iónico muestran una estructura discontinua que es parcialmente no homogénea. Para las aplicaciones de cultivo celular, las nanofibrillas de celulosa preferentemente no resultan tóxicas para las células.

El derivado de nanofibrilla de celulosa puede ser cualquier derivado modificado química o físicamente de nanofibrillas de celulosa o haces de nanofibras. La modificación química podría basarse en, por ejemplo, una reacción de carboximetilación, oxidación, esterificación o eterificación de las moléculas de celulosa. La modificación asimismo podría llevarse a cabo mediante adsorción física de sustancias aniónicas, catiónicas o no iónicas o cualquier combinación de ellas sobre la superficie de celulosa. La modificación indicada puede llevarse a cabo antes, después o durante la producción de nanofibrillas de celulosa. Determinadas modificaciones pueden conducir a materiales de CNF que son degradables en el cuerpo humano.

La pureza microbiana de las nanofibrillas de celulosa e hidrogeles que las contienen resulta esencial para el rendimiento del cultivo celular. Por lo tanto, las nanofibrillas de celulosa pueden esterilizarse antes de los experimentos de cultivo celular en una forma de hidrogel. Además de ello es importante minimizar la contaminación microbiana del producto antes y durante la fibrilación. Antes de la fibrilación resulta ventajoso recoger asépticamente la pulpa de celulosa procedente de la fábrica de pasta de papel inmediatamente después de la etapa de blanqueado, cuando la pulpa todavía es estéril.

Se utilizan ampliamente diversos sinónimos para referirse a las nanofibrillas de celulosa. Por ejemplo: nanocelulosa, celulosa nanofibrilada (CNF), celulosa nanofibrilar, nanofibra de celulosa, celulosa fibrilada a nanoescala, celulosa microfibrilar, celulosa microfibrilada (MFC) o microfibrillas de celulosa. Además, las nanofibrillas de celulosa producidas por determinados microorganismos asimismo poseen diversos sinónimos. Por ejemplo, celulosa bacteriana, celulosa microbiana (MC), biocelulosa, nata de coco (NDC) o coco de nata.

Químicamente, es conocido que las macromoléculas de celulosa son moléculas muy estables. La hidrólisis de la celulosa requiere la utilización de condiciones duras y habitualmente se utilizan ácidos fuertes, tal como ácido sulfúrico al 56%.

Las dimensiones de las nanofibrillas de celulosa individuales son próximas a las dimensiones de las fibras de colágeno en la ECM, es decir, 4 a 10 nm. Por lo tanto, pueden utilizarse hidrogeles a base de CNF en una matriz 3D de cultivo celular.

En los experimentos de cultivo celular de la presente invención se utilizaron dos tipos de nanofibrillas de celulosa: CNF nativas que formaban hidrogeles opacos y CNF aniónicas modificadas químicamente que formaban hidrogeles ópticamente transparentes. Se presenta una descripción detallada de los materiales en los apartados de Ejemplos y de Materiales y métodos. La concentración de las CNF en el hidrogel se ajusta a una concentración adecuada para la célula que se cultiva. La concentración de las CNF en el volumen total puede variar dentro del intervalo de 0.01% a 10% (p/v) dependiendo de, por ejemplo, el tipo celular y la estirpe celular. En el cultivo de células troncales habitualmente resultan preferidas las concentraciones en el rango inferior, mientras que las concentraciones más altas son habituales al cultivar células diferenciadas, tales como células hepáticas. Debido a la naturaleza discontinua del hidrogel de CNF, la concentración total de CNF puede ser diferente de la concentración local de CNF en la entidad discontinua tridimensional. Para las células pluripotentes, puede utilizarse una concentración de CNF en el volumen total de la entidad discontinua tridimensional comprendida en el intervalo de entre 0.05% y 1.5% (p/v), tal como concentraciones p/v de 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.55%, 0.6%, 0.65%, 0.7%, 0.75%, 0.8%, 0.85%, 0.9%, 0.95%, 1%, 1.05%, 1.1%, 1.15%, 1.2%, 1.25%, 1.3%, 1.35%, 1.4%, 1.45% o 1.5%. La concentración total de CNF asimismo puede ser de 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5% o 10%. Resulta evidente a partir de la estructura de la entidad discontinua tridimensional según la invención que la concentración de CNF anteriormente indicada se refiere a la concentración de CNF en el volumen de la entidad discontinua tridimensional total y las concentraciones locales de CNF varían en diferentes partes de la entidad discontinua tridimensional. Para entender correctamente la naturaleza de la entidad discontinua tridimensional según la invención debe apreciarse que, en un caso especial, la concentración total de las CNF puede ser muy superior a la concentración en el volumen total si el cuerpo de hidrogel llena completamente la zona de interés. Por otra parte, si la zona de interés se encuentra dentro de una cavidad acuosa circundada por el hidrogel de CNF discontinuo, la concentración local de CNF puede ser de 0% (ver la figura 24).

La fracción de volumen de los cuerpos de gel que comprenden la entidad discontinua tridimensional puede variar entre 50% y 99% del volumen total de la entidad discontinua tridimensional y, de acuerdo con ello, la concentración local de c Nf puede ser superior o inferior a la de la entidad total. La fracción de volumen de los cuerpos de gel puede ser, por ejemplo, de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. La fracción de los cuerpos de gel puede determinarse cualitativamente de manera fácil, por ejemplo, mediante inspección al microscopio o mediante análisis de sedimentación.

El límite elástico o punto de cedencia se refiere a la tensión a la que un material empieza a deformarse plásticamente. El límite elástico puede definirse mediante cualquier método conocido en la materia. El límite elástico de un único cuerpo de hidrogel es esencialmente igual a la deformación elástica del hidrogel homogéneo de nanofibras de celulosa.

Las nanofibrillas de celulosa o un derivado de las mismas de la presente invención pueden comprender derivados modificados química o físicamente de nanofibrillas de celulosa o de haces de nanofibras.

La expresión “matriz de cultivo celular” se refiere al material configurado para el cultivo celular y que proporciona una matriz de crecimiento que incrementa la superficie de unión disponible para la adhesión de las células, de manera que mimetiza la infraestructura del tejido.

La expresión “artículo para el cultivo celular” se refiere a cualquier artículo adecuado para el cultivo celular, incluyendo placas de pocillo único y multipocillo, tales como placas de 6, 12, 96, 384 o 1536 pocillos, frascos, placas de Petri, matraces, matraces multicapa, vasos, placas, botellas de cultivo giratorias, portaobjetos, tales como portaobjetos de cultivo con cámara y multicámara, tubos, cubreobjetos, bolsas, membranas, fibras huecas, perlas y microportadores, copas, matraces de centrifugación, cámaras de perfusión, jeringas, biorreactores y fermentadores.

“En forma deshidratada” se refiere a la forma del material que resulta de eliminar parte del agua, aunque no necesariamente toda el agua, del material en cuestión. De esta manera, el término “deshidratado” comprende, por ejemplo, suspensiones concentradas, gránulos, escamas y polvos.

El término “kit” se refiere a una combinación de artículos o recipientes que facilita un método, ensayo o la manipulación de la entidad discontinua tridimensional o artículos para el cultivo celular que los utilizan. Los kits pueden contener opcionalmente instrucciones que explican cómo utilizar el kit (por ejemplo, instrucciones que explica los métodos de la invención), cartuchos, estaciones de mezcla, reactivos químicos, así como otros componentes. Los componentes del kit pueden empaquetarse juntos en un recipiente (por ejemplo, caja, embalaje o similar) para el envío, almacenamiento o uso, o puede empaquetarse en dos o más recipientes.

La presente entidad discontinua tridimensional, matriz o artículo de cultivo celular puede comprender, además, aditivos adecuados seleccionados de entre el grupo que consiste en nutrientes, agentes tamponadores, indicadores de pH, componentes de la matriz extracelular, suero, factores de crecimiento, antibióticos, conservantes y proteínas.

Puede cultivarse cualquier célula mediante la utilización de la presente entidad discontinua tridimensional y los presentes artículos de cultivo celular. Pueden cultivarse células eucarióticas, tales como células animales, por ejemplo, células de mamífero, células vegetales, células de algas y fúngicas, mediante la utilización de la entidad discontinua tridimensional y artículo, así como células procarióticas, tales como células bacterianas. En un aspecto, las células pueden ser células primarias humanas de cualquier tipo de tejido normal o anormal, estirpes celulares secundarias humanas de cualquier tipo de tejido, estirpes celulares inmortalizadas humanas y células de cáncer humano procedentes de un tumor primario o tumor metastásico. En un aspecto, las células pueden ser cualesquiera células indiferenciadas, tales como células pluripotentes, multipotentes, oligopotentes o unipotentes, incluyendo células troncales embrionarias, células troncales embrionarias no humanas, células troncales pluripotentes inducidas, células troncales multipotentes somáticas, células troncales pluripotentes somáticas, células troncales específicas de tejido, células troncales mesenquimatosas o células progenitoras, células troncales neurales, células troncales hepáticas o células troncales endoteliales. Una célula adecuada para el cultivo mediante la utilización de la presente entidad discontinua tridimensional o artículo es una ESC humana o no humana. Asimismo resulta adecuada una iPSC humana o no humana. En un aspecto, la célula que debe utilizarse en los productos según la invención es cualquier célula troncal que derive de estirpes celulares de hES establecidas disponibles para el público, que se obtenga mediante un método que no implique exclusivamente la destrucción de embriones humanos a partir de los que deriva dicho producto. En un aspecto, se cultiva más de un tipo celular de origen diferente en forma de cocultivo.

Los presentes entidad, artículo y métodos discontinuos tridimensionales proporcionan el cultivo de células durante un tiempo prolongado. En el caso de que se cultiven células indiferenciadas, pueden propagarse y hacerse pases varias veces, manteniendo simultáneamente la pluripotencia de la masa celular. Esto ayuda a incrementar la masa celular pluripotente hasta formar las cantidades más grandes que se requieren para, por ejemplo, la terapia.

Las células cultivadas mediante la utilización de los presentes entidad, artículo y métodos discontinuos tridimensionales pueden transportarse en el sistema o artículo de cultivo sin necesidad de congelar las células antes del transporte. En los presentes sistemas y aplicaciones, las células en cultivo pueden transportarse directamente después de cultivarlas en la entidad o artículo discontinuo tridimensional, por ejemplo, a 37°C, sin etapas adicionales y el cultivo de las células transportadas puede continuarse mediante la utilización de los mismos sistema y aparato que se utilizaron en el transporte. Las células transportadas pueden recolectarse de la matriz y el cultivo puede continuarse en cultivo 2D o 3D.

Dependiendo de la estirpe celular y el uso deseado de la célula en cultivo, el cultivo puede llevarse a cabo en formato 2D o 3D. Las células se dispersan o se inoculan en la entidad o artículo discontinuo tridimensional, permitiendo el crecimiento 2D o 3D de las células en los cuerpos de hidrogel y la penetración de las células en propagación y de las estructuras extracelulares de células en cultivo en el interior de los cuerpos de hidrogel.

La eliminación de nanofibras de celulosa puede llevarse a cabo con, por ejemplo, mezclas enzimáticas que comprendan todos los enzimas necesarios para la degradación total de las moléculas de celulosa, así como otros componentes derivados de la madera contenidos en ella, tales como las hemicelulosas. Los enzimas adecuados son, por ejemplo, mezclas enzimáticas diseñadas para las CNF en concreto y preparaciones de celulasahemicelulasa disponibles comercialmente, La composición de la mezcla puede variar dependiendo de la composición química de la materia prima utilizada para la producción de esas CNF. Por ejemplo, en el caso de que se utilice pulpa de abedul para la producción de las CNF, la mezcla incluye por lo menos endocelulasas y exocelulasas intactas o partes de ellas, endoxilanasas y p-D-glucosidasas y p-D-xilosidasas. Para la hidrólisis de CNF derivadas de madera de caducifolio, la mezcla debe suplementarse con por lo menos endomananasas y p-D-manosidasas. El beneficio de las mezclas diseñadas que se han agrupado a partir de componentes enzimáticos purificados es que no contienen proteínas adicionales u otros componentes no deseados, tales como actividades laterales, residuos del organismo de cultivo o residuos del caldo de cultivo, lo que ocurre con frecuencia en el caso de las preparaciones enzimáticas comerciales. Resulta especialmente perjudicial que la preparación contenga proteasas, las cuales podrían atacar las superficies de las células en cultivo. Las mezclas enzimáticas comerciales diseñadas para la hidrólisis total de los materiales de origen vegetal asimismo pueden utilizarse en la hidrólisis de las CNF, aunque más preferentemente después de por lo menos una etapa de purificación a partir del material en bruto, tal como la filtración en gel o la diálisis. Con independencia de la preparación del enzima, sea una mezcla diseñada o una mezcla comercial, los componentes se seleccionan de manera que puedan hidrolizar óptimamente las CNF, por ejemplo con respecto al pH, la temperatura y la fuerza iónica. Se encuentran disponibles preparaciones comerciales, que actúan en los valores de pH ácidos (pH 3,5 a 5) o en los valores de pH básicos (pH 6 a 8) y a temperatura de entre la temperatura ambiente y hasta 60-80°C. Muy frecuentemente las células se cultivan a 37°C, que es la temperatura óptima para la mayoría de celulasas y hemicelulasas.

Las estirpes celulares en cultivo asimismo pueden manipularse genéticamente para producir la proteína enzimática necesaria en el sistema de cultivo.

La degradación enzimática de los hidrogeles de CNF se ha demostrado mediante la hidrólisis de cascajo que contenía 0.5% de hidrogeles producidos mediante procesamiento de pulpa de abedul con una preparación enzimática diseñada, que contenía (en proporciones de proteína) 50%, 20%, 13% y 5% de las celulasas CBH I, CBH II, EG I y EG II, respectivamente, y 10% y 2% de endoxilanasa y p-D-xilosidasa, respectivamente, calculadas a partir del contenido total de proteínas de la mezcla. Al utilizar CNF de otra materia prima para el cultivo, la composición de la mezcla se personaliza correspondientemente con los enzimas adecuados. Celluclast 1.5 LFG, CCN0367 (Novozymes, pH opt. 5), Prot. 90 mg/ml. La degradación de las CNF nativas se llevó a cabo a pH 5 a 50°C durante 4 días y la degradación de las CNF transparentes, a pH 7 a 21°C durante una hora. La dosis de enzima era de 5 mg de enzima por gramo de CNF.

Hidrólisis enzimática. Es conocido comúnmente que determinados enzimas, las celulasas, son capaces de hidrolizar los enlaces [beta]-(1-4) en la celulosa. Por ejemplo, las endo-1,4-p-glucanasas (EG) con diana en cadenas de celulosa en localizaciones aleatorias alejadas de los extremos de la cadena; las exoglucanasas o exocelobiohidrolasas (CBH) que degradan la celulosa mediante la escisión de moléculas de ambos extremos de la cadena, produciendo dímeros de celobiosa; y las [beta]-glucosidasas (BGL), que hidrolizan los oligosacáridos producidos y las unidades de celobiosa (producidas durante el ataque de EG y CBH), hasta producir glucosa. De esta manera, las nanofibras de celulosa pueden hidrolizarse enzimáticamente hasta formar glucosa con la ayuda de celulasas (Ahola, S., Turon, X., Osterberg, M., Laine, J., Rojas, O.J., Langmuir, 2008, 24, 11592-11599). La hidrólisis total de las CNF en azúcares monoméricos exige que la mezcla enzimática contenga, además, hemicelulosas de acción endo, tales como xilanasas y mananasas, y p-D-glucosidasas, p-D-xilosidasas y D-manosidasas. En el caso de que el objetivo sea únicamente la hidrólisis parcial, por ejemplo para reducir la viscosidad del hidrogel, la composición de la mezcla enzimática puede ajustarse para incluir un exceso de endoglucanasas y una proporción menor o nula de celobiohidrolasas. En el último caso, pueden incluirse hemicelulasas en la mezcla, ya que potencian la actividad hidrolítica de las celulasas. La hidrólisis enzimática de la celulosa puede utilizarse en sistemas de cultivo celular que contienen nanofibras de celulosa por diversos motivos. Tras la hidrólisis del hidrogel de CNF, se reduce drásticamente la viscosidad del medio y las estructuras celulares en cultivo resultan fácilmente accesibles, por ejemplo, para la tinción. Además, después de la hidrólisis, las estructuras celulares pueden transferirse o trasplantarse sin el material que contiene celulosa. El producto de degradación, la glucosa, generalmente no es tóxica para las células y puede utilizarse como nutriente en el cultivo celular.

La hidrólisis enzimática de nanofibras de celulosa puede llevarse a cabo con la ayuda de diferentes celulasas en diferentes medios. En la figura 14, se muestra el efecto de los enzimas comerciales Celluclast sobre los polvos en suspensión de los geles. Tanto los hidrogeles de CNF nativos como los transparentes pierden el poder de suspensión debido a la degradación enzimática de la estructura del gel. Las estirpes celulares en cultivo asimismo pueden manipularse genéticamente para producir la proteína enzima necesaria en el sistema de cultivo.

En el caso de que se utilice la hidrólisis enzimática, tal como una celulasa, para romper el hidrogel de CNF, el enzima puede inactivarse o eliminarse del sistema de cultivo celular. Al experto en la materia le resultará fácil seleccionar cualquier método apropiado para inactivar o eliminar el enzima. Entre los ejemplos de métodos adecuados se incluyen la inactivación por inhibidores o anticuerpos neutralizantes, y la eliminación de la celulasa mediante lavado, filtración, purificación por afinidad o cualquier otro método que resulte adecuado para la aplicación seleccionada. La inactivación o eliminación del enzima evita la presencia de un enzima activa que sea capaz de romper la estructura de gel de las CNF en el caso de que las células se cultiven en una matriz basada en CNF después del tratamiento enzimática. Asimismo puede ser necesaria la eliminación del enzima en determinadas aplicaciones posteriores de las células en cultivo.

Puede hacerse un seguimiento de la diferenciación de las células tras la expresión de cualquier gen marcador conocido en la materia. Por ejemplo, pueden utilizarse marcadores tempranos o tardíos dependiendo de, por ejemplo, la aplicación específica y el tipo celular. La tabla 1 presenta ejemplos de marcadores que pueden seguirse durante la utilización de los métodos y productos según la invención.

Tabla 1. Marcadores celulares utilizados habitualmente para identificar células troncales y para caracterizar los tipos de células diferenciadas.

Pueden detectarse células en el cultivo mediante la utilización de cualquier medio de detección conocido o pigmento conocido en la materia.

Ejemplos de referencia

Los ejemplos a continuación se proporcionan exclusivamente con el fin de ilustrar diversos aspectos de la invención y no pretenden ser limitativos de la presente invención en modo alguno.

Reactivos

Se adquirió solución de dispasa (1 mg/ml) y medio mTeSR1 de Stemcell Technologies. Se adquirió medio DMEM-F12, Versene 1:5000, reactivo AlamarBlue®, Alexa Fluor 594 y SYTOX Green, de Invitrogen. La matriz de membrana basal de factor de crecimiento reducido Matrigel™ se adquirió de BD Biosciences (Bedford, MA, EE. UU.); la vitronectina humana recombinante, de R&D Systems; LM-511 y LM-521 recombinantes humanas, de BioLamina (Sundbyberg, Suecia). El hidrogel de nanofibrillas de celulosa (CNF) fue proporcionado por UPM-Kymmene Corporation (Espoo, Finlandia) y la celulasa, por VTT (Turku, Finlandia). La tinción blanca Calcofluor, el anticuerpo monoclonal antitubulina p III (T5076) y el anticuerpo monoclonal anti-a-fetoproteína (A8452) se obtuvieron de Sigma FLUKA; los anticuerpos Oct-3/4 (sc-9081), h Nf 3B (asimismo denominado FOXA2 y sc-6554), IgG de conejo de control e IgG de ratón e IgG de cabra, de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, EE. UU.); el anticuerpo monoclonal de ratón antiactina muscular humana (IS700), de Dako; el anticuerpo anti-SSEA-4, del Developmental Studies Hybridoma Bank, Universidad de Iowa (IA, EE. UU.); sueros normales de cabra y de burro, de Millipore (Temecula, CA, EE. UU.) y medio de montaje VECTASHIELD (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. u U.). El kit de ARN-a-ADNc de alta capacidad y la mezcla maestra Fast SYBR Green eran de Applied Biosystems. El kit RNeasy Mini se adquirió de Qiagen.

La densidad de colonias de hESC y hiPSC en hidrogel de CNF al 0.5% p/v era cinco veces superior que en la plataforma de Matrigel 2D. La solución madre de hidrogel de CNF (al 1.8% p/v) se diluyó en medio mTeSRI y se mezcló con las colonias de células troncales. Se añadió la misma cantidad de medio mTeSRI sobre la mezcla de células-hidrogel. El medio se renovó diariamente.

Se produjeron nanofibrillas de celulosa nativa mediante homogeneización a alta presión (cinco ciclos consecutivos) de pulpa de abedul blanqueada altamente purificada, seguido de esterilización en autoclave. Tras la fluidización, las nanofibrillas de celulosa se encontraban en forma de un hidrogel diluido (al 2% en peso). Se obtuvieron de una manera similar nanofibrillas de celulosa nativa sometida a intercambio iónico, aunque adicionalmente antes de la fibrilación se sometieron a tratamiento ácido-base con el fin de eliminar los cationes de alta valencia (método descrito en secciones anteriores). Tras la homogeneización a alta presión (15 ciclos consecutivos), las nanofibrillas de celulosa sometidas a intercambio iónico forman un hidrogel fuerte que presenta una turbidez inferior a la de la otra muestra. Las nanofibrillas de celulosa se esterilizaron en autoclave en caso necesario. Se obtuvo celulosa de fibrillas aniónicas transparentes en forma de hidrogel (al 2% en peso) mediante un procedimiento similar de homogeneización de una pulpa de celulosa modificada químicamente (pulpa de celulosa oxidada con TEMPO).

Estructura del hidrogel

Las nanofibras de celulosa típicamente son objetos muy hidrófilos debido a la presencia de grupos hidroxilo en los anillos glucósidos y fracciones de hemicelulosa parcialmente cargadas. De esta manera, las fibrillas forman estructuras de hidrogel al dispersarlas en agua a concentraciones superiores a la concentración solapante, es decir, típicamente 0.05% a 0.2% p/v. La estructura del gel es altamente dependiente de los antecedentes de cizalla a la que se haya sometido la muestra: pueden conseguirse estructuras continuas o discontinuas dependiendo del método de mezcla después de la dilución.

La entidad discontinua tridimensional puede obtenerse mediante un método que comprende las etapas de proporcionar nanofibrillas de celulosa y/o derivados de las mismas; mezclar dichas nanofibrillas de celulosa y/o derivados de las mismas con un primer medio acuoso a fin de obtener un hidrogel, y mezclar dicho hidrogel con un segundo medio acuoso con el fin de obtener una suspensión de cuerpos de hidrogel en el segundo medio acuoso. Los primer y segundo medios acuosos pueden ser del mismo tipo, aunque asimismo pueden ser diferentes, en donde el primer medio sea, por ejemplo, agua y el segundo sea un medio de cultivo celular. Asimismo pueden prepararse entidades discontinuas tridimensionales a partir de hidrogeles de nanofibrillas de celulosa concentrada o a partir de nanofibrillas de celulosa seca, mediante la granulación del hidrogel concentrado, o de las nanofibrillas de celulosa seca, para obtener gránulos, seguido de la hidratación de los gránulos en un medio acuoso y la mezcla de los gránulos hidratados, opcionalmente añadiendo medio acuoso, con el fin de obtener una suspensión de cuerpos de hidrogel. La estructura discontinua del hidrogel puede verificarse, por ejemplo, mediante simple análisis de microscopía o mediante la determinación del límite elástico y la comparación con el hidrogel homogéneo que presenta la concentración de CNF correspondiente.

Las estructuras de gel homogéneas y continuas habitualmente presentan un límite elástico elevado, incluso a concentraciones bajas. Correspondientemente, las estructuras de gel discontinuas habitualmente presentan un valor más bajo del límite elástico que los casos bien activados, incluso a la misma concentración. Se muestra esta diferencia en los perfiles de flujo en las figuras 17 y 18 para dos tipos de hidrogel de nanofibras de celulosa a una concentración de 0.5% p/v. Las muestras han sido diluidas a partir de muestra de gel al 2% homogénea, seguido de la mezcla. La figura 17 muestra el perfil de flujo para las nanofibras de celulosa nativa sometida a intercambio iónico, en las que la estructura de gel ha sido bien homogeneizada tras la dilución de 2% a 0.5% con un mezclador de alta velocidad para formar una estructura de gel continua (curva A). En la figura 17, asimismo se muestra el perfil de flujo de una estructura de gel discontinua (curva B). El límite elástico es claramente inferior para la muestra de gel discontinua, es decir, el caso (B). La estructura de gel discontinua se produjo mediante la utilización de simplemente un método de mezcla débil después de diluir la muestra de 2% a 0.5%, por ejemplo la agitación magnética o el pipeteado. Asimismo pueden obtenerse observaciones similares para los hidrogeles de nanofibras de celulosa modificadas químicamente. La figura 18 muestra los perfiles de flujo correspondientes para nanofibras modificadas aniónicamente y dispersadas en agua a una concentración de 0.5% p/v, para hidrogeles continuos (A) y discontinuos (B).

Se obtuvo celulosa de fibrillas nativa sometida a intercambio iónico, de una manera similar aunque antes de la fibrilación se sometió adicionalmente a tratamiento ácido-base con el fin de eliminar los cationes de alta valencia (método descrito en secciones anteriores). Tras la homogeneización a alta presión (15 ciclos consecutivos), la celulosa de fibrillas sometida a intercambio iónico forma un hidrogel fuerte que presenta una turbidez inferior a la de la otra muestra. Se esterilizaron las nanofibrillas de celulosa en autoclave en caso necesario. Se obtuvieron nanofibrillas de celulosa modificadas aniónicamente transparentes en forma de hidrogel (0.9% en peso) mediante un procedimiento de homogeneización similar de una pulpa de celulosa oxidada.

Las muestras de hidrogel se diluyeron a partir de una muestra de gel homogénea al 2%, seguido de la activación o la mezcla. La figura 17 muestra el perfil de flujo de las nanofibrillas de celulosa nativa sometida a intercambio iónico en el que la estructura del gel ha sido bien homogeneizada tras la dilución de 2% a 0.5% con un mezclador de alta velocidad para producir una estructura de gel continua (curva A). En la figura 17 asimismo se muestra el perfil de flujo de una estructura de gel discontinua de la entidad discontinua tridimensional (curva B). El límite elástico es claramente inferior para la muestra de gel discontinua, es decir, el caso (B). La estructura de gel discontinua se produjo mediante la utilización de simplemente un método de activación débil después de diluir la muestra de 2% a 0.5%, por ejemplo la agitación magnética o el pipeteado. Asimismo pueden obtenerse observaciones similares para los hidrogeles de nanofibras de celulosa modificadas químicamente. La figura 18 muestra los perfiles de flujo correspondientes para nanofibras modificadas aniónicamente y dispersadas en agua a una concentración de 0.5% p/v, para hidrogeles continuos (A) y discontinuos (B).

Las diferencias en las estructuras de gel asimismo pueden visualizarse a partir de imágenes de microscopía óptica. La figura 19 muestra las diferencias de estructura de gel entre estructuras continuas (parte superior) y estructuras discontinuas (parte inferior) de las nanofibras de celulosa nativa sometida a intercambio iónico dispersadas en agua. En la estructura de gel discontinua, los huecos entre las fases de nanofibras son perfectamente visibles. En una dispersión al 0.5% p/v, las cavidades ricas en agua habitualmente presentan un diámetro de entre 10 y 200 micrómetros. La estructura discontinua asimismo puede observarse a partir de las imágenes de microscopía del cultivo celular, figura 23, en la que las nanofibras de celulosa forman zonas agregadas en torno a las células.

La distribución relativa de los huecos y el tamaño real dependen de la concentración inicial, la concentración total y el método de mezcla. Por ejemplo, en el caso de que la concentración total sea inferior a la concentración del gel (habitualmente inferior a 0.05-0.2% p/v), las nanofibras de celulosa forman entidades de masa floculada de gel que están en contacto laxo entre sí con determinadas cavidades que contienen agua. En el caso de que la concentración total sea superior a la concentración del gel en el caso de un gel homogéneo, los huecos forman las estructuras porosas mostradas en la figura 19 si el exceso de agua o medio se dispersa cuidadosamente en el sistema. La porosidad puede ajustarse mediante la alteración de la fuerza de los dominios de gel, es decir, incrementando la concentración en las zonas donde están presentes las fibrillas y mezclando cantidades variables de agua/medio en exceso dentro de la estructura.

Pueden producirse estructuras de gel discontinuas asimismo a partir de muestras de nanofibras de celulosa concentrada (por ejemplo, 10% a 30% p/v) o incluso seca. En el caso de que se utilicen materiales secos o concentrados, la muestra en primer lugar se granula hasta un tamaño apropiado (por ejemplo, 0.1 a 2 mm), se hidrata en agua o en medio de cultivo celular, y después se activa en forma continua o discontinua mediante la utilización de métodos apropiados. Como material de partida asimismo pueden utilizarse partículas secadas por pulverización, de tamaño entre 2 y 20 micrómetros. La porosidad controlada en estos tipos de geles discontinuos depende del tamaño de partícula y de la concentración total, es decir, la distancia entre los dominios de gel hinchado o cuerpos de gel; ver las figuras 20 y 24.

Se representan esquemáticamente en la figura 24 ejemplos de procedimientos adecuados para las estructuras mencionadas anteriormente. El caso 1 corresponde a la situación visualizada asimismo en la figura 19: la estructura de gel discontinua se produce mediante dilución de hidrogel homogéneo con agua/medio mediante un método que genera cavidades ricas en agua en el hidrogel. Pueden incorporarse células durante o después de la etapa de dilución y mezcla. El caso 2 muestra la situación en la que el volumen relativo de agua/medio es superior a la del caso 1. Una fracción de agua más alta conduce a que las partículas de gel estén conectadas laxamente. Las células pueden incorporarse durante o después de la etapa de dilución y mezcla. El exceso de agua/medio puede eliminarse en caso necesario, por ejemplo mediante un ciclo de centrifugación suave, decantación o filtración (caso 2b). Asimismo pueden introducirse células en esta etapa. El caso 3 muestra el procedimiento en que se produce la estructura deseada a partir de granulados de gel de NFC concentrado o incluso a partir de partículas secas. En primer lugar habitualmente se hidratan las partículas secas o concentradas con agua/medio (3a), seguido de la eliminación opcional del exceso de agua (3b). Pueden introducirse células durante o después de la etapa de hidratación o después de la etapa opcional de eliminación de agua. El exceso de agua puede eliminarse mediante, por ejemplo, centrifugación, decantación o filtración. Los casos 2 y 3 se visualizan en la imagen de microscopía en la figura 20.

Ejemplo 1. Subcultivo de hPSC en hidrogel de CNF al 0.5% y recuperación de cultivo 3D en plataformas 2D.

Para subcultivar las hPSC 3D y recuperar esferoides del hidrogel 3D en plataformas 2D se utilizó celulasa. Antes del tratamiento con celulasa, se eliminó el medio mTeSR1 y se añadió el enzima diluido en medio mTeSR1 fresco y se incubó con mezcla de células-hidrogel a 37°C durante 24 horas.

Tras la eliminación de las CNF mediante tratamiento enzimático, se recogieron los esferoides de células troncales mediante un filtrador celular de 100 μm para eliminar la celulasa y después se trataron con Versene 1:5000 durante 7 min. para reducir su tamaño. Para el subcultivo, se mezclaron las colonias celulares más pequeñas con hidrogel de CNF al 0.5% p/v tal como se ha indicado anteriormente (figura 5). Para transferir las células a plataformas 2D, se sembraron las colonias celulares más pequeñas en cuatro recubrimientos diferentes: Matrigel, VN, LM-511 y LM-521. Se preparó el recubrimiento de Matrigel de la manera habitual. Los recubrimientos de LM-511 y LM-521 se prepararon mediante incubación de las soluciones de proteína (LM-511 20 μg/ml o LM-521 20 μg/ml) a 37°C durante 2 horas y después a 4°C durante la noche. Se preparó el recubrimiento de VN mediante incubación de VN 5 μg/ml a 4°C durante la noche (figura 2).

Ejemplo 2. Actividad metabólica mitocondrial.

Se utilizó reactivo AlamarBlue® para medir la actividad metabólica mitocondrial de las células troncales antes y después del tratamiento enzimático con el fin de seleccionar la concentración enzimática no tóxica (figura 4). Antes y después del tratamiento con diversas concentraciones de enzima celulasa asimismo se utilizó reactivo AlamarBlue® al 2.5% durante el cultivo celular en hidrogel de CNF al 0.5% p/v. Se añadió el reactivo AlamarBlue® al medio mTeSR1 y se incubó con las células a 37°C durante 24 horas. Se midió la fluorescencia del metabolito de AlamarBlue® a la longitud de onda de excitación de 570 nm y a la longitud de onda de emisión de 585 nm con el lector multimodo de escaneo espectral Varioskan Flash 2.4.2 (Thermo Scientific).

Ejemplo 3. Tinción de las CNF y obtención de imágenes de células vivas mediante la utilización de un microscopio confocal.

Con el fin de evaluar la eliminación enzimática de las CNF, se añadió tinción de blanco de calcoflúor al cultivo para teñir la celulosa. Se visualizó la fluorescencia de GFP en las células vivas y las CNF teñidas bajo un microscopio confocal Leica TCS SPTII HCS A, mediante la utilización de los láseres de argón de 488 nm y de UV de 405 nm, respectivamente, a 37°C con 5% de CO² (figura 3).

Ejemplo 4. Inmunotinción.

Las células troncales cultivadas en hidrogel de CNF (figura 21) o sobre diferentes pocillos recubiertos con proteína (figuras 7 a 14 y 22) se fijaron con paraformaldehído al 3.7% durante 10 a 30 min a temperatura ambiente y después se permeabilizaron con Triton X-100 al 0.1% o saponina al 0.5% durante 10 a 30 min. Tras el bloqueo con suero normal de cabra o burro al 10%, se incubaron las células con anticuerpo anti-Oct-3/4, anti-SSEA-4, anti-p-tubulina isotipo III, antiactina muscular o anti-FOXA2 a 4°C durante la noche. En paralelo se prepararon muestras de control negativo incubadas con IgG de conejo de control, IgG de ratón o IgG de cabra. Se utilizó el anticuerpo secundario de cabra anticonejo-Alexa Fluor 594, de cabra antirratón-Alexa Fluor 594 o de burro anticabra-Alexa Fluor 594 a una dilución de 1:400 a temperatura ambiente durante una hora (2D) o seis horas (3D). Todos los lavados con PBS-Tween-20 al 0.2% se repitieron tres veces, durante 5 min. cada uno. Tras la inmunotinción, se tiñeron los núcleos con SYTOX Green. A continuación, se montaron las células con medio de montaje VECTASHIELD. Las tinciones se visualizaron bajo un microscopio confocal Leica TCS SP5II HCS A, mediante la utilización de láseres de argón de 488 nm para la GFP, SYTOX Green y DPSS 561, y láser de 561 nm para Alexa Fluor 594. Las imágenes confocales se analizaron con el software Imaris 7.4 (Bitplane AG, Zurich, Suiza).

Ejemplo 5. Extracción de ARN y PCR cuantitativa en tiempo real.

Se extrajo el ARN total mediante la utilización del minikit RNeasy (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se cuantificaron las muestras de ARN mediante la utilización de un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, EE. UU.). Se convirtieron todas las muestras de ARN en ADNc en el mismo experimento con el fin de garantizar la misma eficiencia de la transcripción inversa. Se llevó a cabo la síntesis del ADNc mediante la utilización del kit de ARN-a-ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). Se analizaron todas las muestras de ADNc por duplicado mediante la utilización de una mezcla maestra de Fast SYBR Green (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) en un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). Para cada gen, se generó una curva patrón para OCT4 y NANOG. Se realizó un seguimiento de la calidad del producto de PCR mediante análisis de curvas de disociación post-PCR (figura 16). Todos los cebadores fueron sintetizados por Oligomer Oy, Finlandia. Como control endógeno se utilizó el gen de mantenimiento RPLP0. Las condiciones del ciclado de PCR fueron: 40 ciclos de 3 s a 95°C y 30 s de hibridación/extensión a 60°C. Se muestran las secuencias de los cebadores en la Tabla 2.

Tabla 2. Secuencias de los cebadores.

Referencia:

1. Yu, J. et al. Induce pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318, 1917-1920 (2007).

Ejemplo 6. Cariotipado.

Para los análisis de cariotipado, se recuperaron colonias celulares a partir del hidrogel en placas recubiertas con Matrigel, siguiendo el procedimiento anteriormente mencionado. Se llevaron a cabo análisis de bandas G cromosómicas en Yhtyneet Medix laboratoriot, Finlandia. Se observó un cariotipo normal en todas las células analizadas (WA07 e ÍPS-IMR91-4) (figura 1).

Ejemplo 7. Formación de cuerpos embrioides.

Para formar cuerpos embrioides, se utilizaron dos métodos. En el método directo, los esferoides celulares recuperados a partir de hidrogel de CNF se cultivaron directamente durante 4 semanas en medio IMDM que contenía FBS Defined Hyclone al 15%. En el método indirecto, en primer lugar se recuperaron células a partir del hidrogel de CNF y después se cultivaron en placas recubiertas con Matrigel. A continuación, se utilizaron las colonias celulares 2D para formar cuerpos embrioides en medio IMDM sobre placas recubiertas con Matrigel que contenía FBS Defined HyClone al 15% durante 4 semanas (figuras 6 y 15).

Ejemplo 8. Formación de teratomas.

Los esferoides celulares del cultivo 3D se recolectaron después del tratamiento con celulasa, se recogieron en tubos y se sedimentaron mediante centrifugación. Las pruebas de teratomas se llevaron a cabo en Biomedicum stem cell centre, Finlandia.

Referencias

1. Thomson, J.A. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282, 1145-1147 (1998).

2. Takahashi, K. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861-872 (2007).

3. Yu, J. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318, 1917-1920 (2007).

4. Xu, C. et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature biotechnology 19, 971-974 (2001).

5. Ludwig, T.E. et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature biotechnology 24, 185-187 (2006).

6. Braam, S.R. et al. Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin. Stem Cells 26, 2257-2265 (2008).

7. Rodin, S. et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nature biotechnology 28, 611-615 (2010).

8. Melkoumian, Z. et al. Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Nature biotechnology 28, 606-610 (2010).

9. Villa-Diaz, L.G. et al. Synthetic polymer coatings for long-term growth of human embryonic stem cells. Nature biotechnology 28, 581-583 (2010).

10. Walther, A., Timonen, J.V., Diez, I., Laukkanen, A. & Ikkala, O. Multifunctional high-performance biofibers based on wet-extrusion of renewable native cellulose nanofibrils. Adv Mater 23, 2924-2928 (2011).

11. Pahimanolis, N. et al. Surface functionalization of nanofibrillated cellulose using click-chemistry approach in aqueous media. Cellulose 18, 1201-1212 (2011).

12. Filpponen, I. et al. Generic method for modular surface modification of cellulosic materials in aqueous medium by sequential "click" reaction and adsorption. Biomacromolecules 13, 736-742 (2012).

13. Yu, J. et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science 324, 797-801 (2009).

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Entidad discontinua tridimensional para el cultivo celular que comprende

a. una matriz que contiene un primer medio acuoso y cuerpos de hidrogel de interconexión que comprenden nanofibrillas de celulosa y/o derivados de las mismas que se suspenden en dicho primer medio acuoso, b. una pluralidad de huecos que contienen un segundo medio acuoso entre dichos cuerpos de hidrogel.

2. Entidad discontinua tridimensional según la reivindicación 1, en la que el segundo medio acuoso es un medio de cultivo celular.

3. Entidad discontinua tridimensional según la reivindicación 1 o 2, en la que la relación de volumen total de los cuerpos de hidrogel a volumen total de entidad discontinua tridimensional es 10% -99% (v/v), preferentemente 50%-95% (v/v).

4. Entidad discontinua tridimensional según una cualquiera de las reivindicaciones 1a 3, en la que el límite elástico de la entidad discontinua tridimensional es inferior al límite elástico del hidrogel continuo correspondiente en las mismas condiciones.

5. Entidad discontinua tridimensional según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el límite elástico de la entidad discontinua tridimensional es 1-95% del límite elástico del hidrogel continuo correspondiente en las mismas condiciones.

6. Entidad discontinua tridimensional según una cualquiera de las reivindicaciones 1a 5, en la que las nanofibrillas de celulosa son de origen vegetal.

7. Entidad discontinua tridimensional según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el diámetro de las nanofibrillas de celulosa es inferior a 1 μm, preferentemente inferior a 200 nm, más preferentemente inferior a 100 nm.

8. Entidad discontinua tridimensional según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que las nanofibrillas de celulosa comprenden derivados nativos intercambiados iónicamente, modificados químicamente o modificados físicamente de nanofibrillas de celulosa o haces de nanofibrilla.

9. Entidad discontinua tridimensional según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el medio acuoso es un medio de cultivo celular que comprende por lo menos una fuente de nutrientes y por lo menos un componente requerido para sostener un crecimiento celular indiferenciado, de diferenciación o diferenciado.

10. Matriz de cultivo celular que comprende células y/o tejido y una entidad discontinua tridimensional según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que las células y/o el tejido están presentes por lo menos parcialmente incluidos en dicha entidad en una disposición tridimensional o bidimensional.

11. Matriz de cultivo celular según la reivindicación 10, en la que las células son células de mamífero diferenciadas o indiferenciadas.

12. Matriz de cultivo celular según la reivindicación 10, en la que las células son células troncales indiferenciadas.

13. Matriz de cultivo celular según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en la que las células son células troncales embrionarias o células troncales pluripotentes inducidas.

14. Matriz de cultivo celular según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en la que las células son células humanas o células no humanas.

15. Matriz de cultivo celular según la reivindicación 14, en la que las células son células troncales embrionarias no humanas o células troncales pluripotentes inducidas.

16. Artículo para el cultivo celular que comprende

a. un sustrato que presenta una superficie;

b. una entidad discontinua tridimensional según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9;

c. y opcionalmente por lo menos un componente seleccionado de entre el grupo que consiste en un medio de cultivo celular, componentes de matriz extracelular, suero, factores de crecimiento, proteínas, antibióticos y conservantes.

17. Utilización de la entidad discontinua tridimensional según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o artículo según la reivindicación 16, para cultivar células o tejidos.

18. Kit que comprende un primer y un segundo recipiente, comprendiendo el primer recipiente la entidad discontinua tridimensional según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y comprendiendo el segundo recipiente una celulasa.