WO2005083056A1 - セルロース固体培地とその製造方法 - Google Patents

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WO2005083056A1
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medium
gel
solid medium
solvent
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PCT/JP2005/003813
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French (fr)
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Shigeru Deguchi
Mikiko Tsudome
Susumu Ito
Koki Horikoshi
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Independent Administrative Institution, Japan Agency For Marine-Earth Science And Technology
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/22—Processes using, or culture media containing, cellulose or hydrolysates thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L1/00—Compositions of cellulose, modified cellulose or cellulose derivatives
    • C08L1/02—Cellulose; Modified cellulose

Definitions

  • the present invention relates to a solid medium used for culturing microorganisms and the like and a method for producing the same, and more particularly to a solid medium using cellulose gel as a medium solidifying component and a method for producing the same.
  • Methods for culturing microorganisms include a method using a liquid medium and a method using a solid medium.
  • the method using a liquid medium has problems such as the fragile growth of the bacterium, the inability to obtain a mutant strain, or the isolation of only a low-purity bacterium.
  • the method using a solid medium has few such problems and forms a clearly separated colony. Therefore, the method is excellent as a method for isolating microorganisms and purely culturing them, and has been used for a long time.
  • Agar gel has been used as a solidifying component of this solid medium since ancient times dating back to the Koch era.
  • Agar gel can be used to grow bacteria, as described in, for example, “New Biochemistry Experiment Course 17” (Japanese Society for Biochemistry, 1992, published by Tokyo Kagaku Dojinsha, pp. 15-20). It is a hard, transparent solid over a wide temperature range, has very limited microorganisms that can degrade agar, and has excellent properties such that liquefaction hardly poses a problem. It is very good, and it is no exaggeration to say that no excellent alternative medium solidification agent has been found to date.
  • such agar gel also depends on conditions such as temperature, pH or salt concentration.
  • it is necessary to culture microorganisms under a wider range of culture conditions such as temperature, PH, and salt concentration.
  • the development of a medium solidifying component that can be used below is desired.
  • hyperthermophilic bacteria capable of growing at a high temperature of 121 ° C have been found, and the enzymes produced by such hyperthermophilic bacteria are considered to be industrially useful.
  • liquid culture is significantly restricted compared to solid culture, such as its fragile growth, the inability to obtain mutant strains, and the low purity of isolated bacteria.
  • a medium-solidifying component that can be used under a wider range of culture conditions.
  • methods using dielan gum as a medium-solidifying component eg, Shungu, D., Valiant, M., Tutlane , V., Weniberg, E., Weissberger, B., Koupal, L., Gadebusch, H., and Stapley, E., "Appl. Environ.
  • a method of culturing on a silica gel plate containing a medium (see, for example, Shinsei Kagaku Kenkyusho, pages 17 and 15-20, The Biochemical Society of Japan, published in 1992 by Tokyo Kagaku Dojinsha), etc. is there.
  • the method using dielan gum has problems such that it does not solidify when the cation (metallic cation) in the medium is insufficient, or hardens when the acidity increases.
  • the method using a silica gel plate has problems that it is difficult to use it under alkaline conditions, has poor water retention, easily dries the plate surface, and adversely affects the growth of microorganisms.
  • solid media that can be used satisfactorily under a wide range of culture conditions, such as temperature, pH, and salt concentration, have to be said to be still undeveloped.
  • the present invention solves the problems of conventional solid media such as agar media that cannot be used depending on conditions such as temperature, pH, and salt concentration as described above, and can be used under a wider range of culture conditions. It is an object of the present invention to provide a solid medium which can be prepared and a method for producing the same. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the problems of the conventional solid medium as described above, and as a result, have found that these problems can be solved by using a cellulose gel as a medium solidifying component. Completed the invention.
  • the present invention has the following contents as its gist.
  • a solid medium containing a cellulose gel as a medium solidifying component (1) A solid medium containing a cellulose gel as a medium solidifying component.
  • the cellulose gel is a porous cellulose gel structure having a cell opening as a skeleton portion and a cellulose concentration of 0.01% or more.
  • the solid medium according to any one of the above.
  • cellulose gel is a porous gel-like material obtained by heating and dissolving cellulose in an aqueous thiocyanate solution and then cooling it.
  • the solid medium according to any one of the above.
  • the cellulose dispersed in a solvent is dissolved or swelled by mechanical mixing and / or heating, then solidified by cooling and removal of the solvent or Z, and then the nutrient component is infiltrated into the cellulose.
  • a method for producing a cellulose gel solid medium is a method for producing a cellulose gel solid medium.
  • a method for culturing microorganisms or cells comprising culturing microorganisms or cells on the surface of a solid medium using cellulose gel as a medium solidifying component.
  • the solid medium of the present invention using a cellulose gel as such a medium solidifying component has stable properties and shapes at high temperatures, a wide pH range, or a wide salt concentration range, and has good properties.
  • a solid medium with It is a solid medium that can be used without any additional treatment. Therefore, microorganisms cannot be used at high temperatures exceeding 100 ° C or severe conditions such as pH of 3 or less or 10 or more, which were not possible with solid media using agar, which is a conventional typical solid medium. Etc. can be cultured. Brief description of the drawings.
  • FIG. 1 is a scanning electron micrograph (magnification: 100,000 times) showing the surface state of a cellulose gel used for the solid medium of the present invention.
  • FIG. 1 is a scanning electron micrograph at a magnification of 100,000 times showing the surface state of a cellulose gel.
  • Cellulose for obtaining the cellulose gel used in the present invention is a polysaccharide or various derivatives thereof in which glucose produced by a plant or a microorganism is linearly linked via a) -3-1.4 darcoside bond.
  • a cellulose derivative for obtaining the cellulose gel of the present invention a cellulose derivative having a branch, a nitrate ester, a phosphate ester, a xanthate, a nitrite, a nitrate, a sulfate, a formate, an acetate, an acetate Esters such as onate, butyrate, valerate, propionate acetate, butyrate acetate, trifluoroacetate, benzoate, tosylester, phenylcarbanilate, alkylketene dimer ester and alkenyl succinic anhydride ester Derivatives: carboxymethyl cellulose, methylcellulose, ethylcellulose, propylcellulose,
  • cellulose gel may be chemically modified after obtaining the cellulose gel.
  • these celluloses or derivatives thereof have a molecular weight of 100,000 to 2,000,000, and particularly, a molecular weight of 100,000 to 100,000. ⁇ -cellulose is desirable.
  • the cellulose gel used in the present invention can be obtained by dissolving or swelling the above-described cellulose or a derivative thereof in a solvent, and then recrystallizing or solidifying the cellulose or the derivative.
  • the dissolution of celluloses in a solvent is complicatedly affected by the size of the cell opening molecule, the action of the oxygen atom in the hydroxyl group and the pyranose ring in the cellulose molecule, and the like.
  • the cellulose gel used in the present invention is obtained by dispersing and mixing celluloses in a solvent, heating or dissolving or swelling as necessary, and then cooling and solidifying as necessary, and removing the solvent. be able to.
  • Solvents for dissolving this cellulose or its derivatives include aqueous solutions of inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, and phosphoric acid; solutions of lithium hydroxide and sodium hydroxide; and solutions of zinc chloride, thiocyanate, and the like.
  • liquid ammonia ⁇ Chioshian salt an aqueous solution of liquid ammonia ⁇ Natoriumu, liquid ammonia Roh iodide Anmoniumu, inorganic compounds such as hydrazine;.
  • F e tartaric acid: metal complex solution such as NaOH; dimethyl sulfoxide / formaldehyde, N, ⁇ -dimethylformamidenoformaldehyde, N, AT-dimethylacetamide Z formaldehyde,
  • thiosocyanate when an aqueous solution of thiocyanate is used as a solvent, the cellulose swells to increase the interplanar spacing of the crystal faces of the cellulose, and is dissolved by further heating. Since it forms a porous gel-like structure suitable for the solid medium of the present invention, it is most preferable as a solvent.
  • a thiosocyanate alkali metal thiocyanates such as sodium thiocyanate and potassium thiocyanate, and alkaline earth metal thiocyanates such as calcium thiocyanate and magnesium thiocyanate are preferable.
  • a calcium thiocyanate aqueous solution containing 40% or more by mass of calcium thiocyanate or a sodium thiocyanate aqueous solution containing 50% or more of sodium thiocyanate by mass is preferable, and a saturated aqueous solution of calcium thiocyanate is most preferable.
  • purified water such as ultrapure water, distilled water and deionized water is used, but ⁇ water may be used.
  • the amount of cellulose to be added to the solvent for dissolving cellulose is not particularly limited, but the amount is adjusted according to the molecular weight of the cell to be dissolved. In general, it is desirable that the content be 0.01% by mass or more, preferably about 0.01% to 20% by mass, based on the solvent, from the viewpoint of easy operation.
  • the method of dispersing in the solvent is not particularly limited, and it may be dispersed in the solvent by various methods usually performed, and may be such that cellulose is added to the solvent and then simply stirred. In order to obtain the cellulose gel of the present invention, the cellulose is dispersed and mixed in a solvent, and further heated if necessary to swell the cellulose and further dissolve it.
  • the swollen or dissolved cellulose solution is cooled, if necessary, to be solidified, the solvent is removed, and the cellulose solution is used in the present invention.
  • the cellulose may be added in an amount not less than its solubility in the solvent. In this case, even after heating, the cellulose is cooled and solidified in a state in which a part of the cellulose is not dissolved, but the cellulose gel thus obtained also shows a porous gel state. It can be suitably used for the solid medium of the present invention.
  • cellulose When thiocyanate is used as a solvent, it is preferable that cellulose is heated to 70 ° C or more in the solvent to swell and dissolve the cell opening, and it is further preferable that the temperature be 80 to 200 ° C. It is more preferable to dissolve by heating.
  • the heating means is not particularly limited, but usually heating using an autoclave or a microwave is desirable in terms of production efficiency.
  • the cellulose when commercially available microcrystalline cellulose is used as the cell opening and a saturated aqueous solution of calcium thiocyanate is used as the solvent, the cellulose can be dissolved by heating for about 1 minute at 95 t :. Next, the solvent component of cellulose is removed from the gelled cellulose gel by washing.
  • the washing solvent used for washing the cellulose gel may be any solvent that dissolves the thiocyanate, and includes water and a polar organic solvent.
  • a washing solvent for example, it is desirable to use one or a mixture of two or more selected from the group consisting of water, methanol, ethanol, and acetone.
  • the water used here is purified water such as ultrapure water, distilled water, deionized water, etc., but may be tap water.
  • the washing method is not particularly limited, but is carried out by immersing in running water, immersing in a container containing washing water, and appropriately changing the washing water. It is desirable to use electrodialysis for washing in terms of washing efficiency. Further, the washing degree of the cellulose gel can be confirmed by measuring the electric conductivity of the washing solution.
  • the resulting cellulose gel has a crystallinity of 5 to 70%, especially 30 to 50%. Is desirable. Further, the molecular weight of cellulose used for the cellulose gel is 100,000 to 2,000,000, and preferably 100,000 to L0,000.
  • the cellulose gel obtained in this manner is a porous cellulose having cellulose as a skeleton and having a very large void having a cellulose concentration of 0.01% or more in the gel. It is a gel structure.
  • the porosity of such a porous cellulose gel structure is 50% or more, and it is more preferable to use one having a porosity of 80 to 99.99%.
  • the celerose gel solid medium of the present invention various media used for conventional agar media can be used as they are.
  • a natural medium a natural medium containing a natural substance such as gravy, peptone, yeast extract, malt extract, or serum as a main component, or a commercially available synthetic medium can be used.
  • a cellulose gel solid medium containing these nutrients can be obtained.
  • the shape of the cellulose gel solid medium of the present invention is not particularly limited, and can be used as a plate, a slope, a high-layer medium, and the like.
  • the properties of the obtained cellulose gel solid medium of the present invention are stable from a low temperature to a considerably high temperature and over a wide pH range, and are stable without being softened or dissolved even when heated to a high temperature. Thus, it retains its shape, has good water retention and is hardly dried, and can be used as an excellent solid medium. Specifically, it can be used in the temperature range of ⁇ 20 to 25, but it is preferable to use in the temperature range of 0 to 150. Further, the cellulose gel solid medium of the present invention is safe over a wide range of pH of 1 to 14. However, it is preferable to use 1) when 11 is in the range of 2 to 12. Furthermore, the cellulose gel solid medium of the present invention can be used as a medium by absorbing salts of an arbitrary concentration while maintaining its shape stably without being affected by the salt concentration of the medium to be permeated.
  • the solid medium of the present invention using the cellulose gel thus produced can be used under a wide range of culture conditions with respect to temperature and pH, and can be widely used for culturing many types of microorganisms and cells. it can.
  • microorganisms suitable for culturing on a solid medium using the cellulose gel of the present invention include, for example, a cellulase-producing bacterium, a xylanase-producing bacterium, a chitinase-producing bacterium, an amylase-producing bacterium, and a mannana bacterium.
  • thermophilic bacteria psychrophilic bacteria, alkalophilic bacteria, acidophilic bacteria, halophiles, piezophilic bacteria, organic solvent-resistant bacteria, etc.
  • Microorganisms can be cultured efficiently.
  • a hyperthermophilic bacterium that grows at a high temperature exceeding 8 O an eosinophilic bacterium that grows at a high acidity with a pH of 2 or less, or a high thermophilic bacterium with a pH of 12 or more can grow. It can be usefully used for culturing microorganisms under extreme environmental conditions such as bacteria.
  • each medium used for culturing microorganisms was prepared as described below.
  • TS BZ sodium carbonate medium 30 g of TSB (trypticase soy broth) and 5 g of separately sterilized sodium carbonate (0.5% with respect to distilled water) were dissolved in 1 liter of distilled water, and then sterilized by heating.
  • TSB trypticase soy broth
  • Yeast extract (10 g), bactopeptone (20 g), and glucose (20 g) were dissolved in 1 liter of distilled water and sterilized by heating.
  • Yeast extract 1 g ammonium sulfate 1.3 g, potassium dihydrogen phosphate 0.28 g, magnesium sulfate heptahydrate 0.25 tg, Shiridani calcium dihydrate 0.07 g, Shiridani iron ( III) Hexahydrate 0.02 g, manganese chloride tetrahydrate 1.8 mg, sodium tetraborate 4.5 m g, zinc sulfate heptahydrate 0.22 mg, salted copper (II) dihydrate 0.05 mg, sodium molybdate 03 mg, vanadium (IV) oxide dihydrate 0.03 mg, chloride After dissolving 0.0 lmg of cobalt (II) hexahydrate in 1 liter of distilled water, the pH was adjusted to pH2 with sulfuric acid, and sterilized by filtration.
  • SCD medium pH2: 15 g of casein-made peptone, 5 g of soybean-made peptone, and 5 g of sodium chloride were dissolved in 1 liter of distilled water, and after heating and sterilized, adjusted to pH 2 with sulfuric acid.
  • Triacetate triacetic acid 1 g, sulfuric acid J-residum hydrate 0.6 g, magnesium sulfate heptahydrate lg, sodium chloride 0.08 g, potassium nitrate 1.03 g, sodium nitrate 6.89 g, phosphorus Dissolution of 1.1 g of disodium hydrogen oxychloride, 10 mL of 0.03% aqueous iron chloride ( ⁇ ) solution and 1 OmL of Nitsch's trace elements in 1 liter of distilled water, and then adjust the pH to 8. It was adjusted to 2 and used as Castenholz basal salt solution.
  • Figures 1 and 2 show scanning electron micrographs of the cellulose gel thus obtained.
  • Fig. 1 is a photograph at a magnification of 100,000 and
  • Fig. 2 is a photograph at a magnification of 100,000.
  • the cellulose gel has a network structure with cellulose as a skeleton, and a porous structure with large voids. It turned out to be a sculpture.
  • LB (pH 7) agar medium, LB (pH 2) agar medium, LB (pH 4.5) agar medium, LB (PH 9.5) agar medium, LB (pH 12) agar medium, Nutrient (pH 7) ) Agar medium, Nu trient (pH2) agar medium, Nu trient (pH9.5) agar medium, Nu trient (pH12) agar medium, SCD (pH7) agar medium, SCD (pH2) agar medium, S A CD (pH 4.5) agar medium and an SCD (pH 12) agar medium were prepared.
  • Table 1 Comparison of stability of agar, dielan gum and cellulose media
  • An LB (pH 7) cellulose medium was prepared in the same manner as in Example 1. Coli W3110 strain (? D er cA7'a co 'W3110 ) during advance LB medium, the A 600 at 37 ° C 1 ⁇ : 1. precultured until 5. This culture was diluted with 0.9% physiological saline to a cell concentration of 1 ⁇ 10 3 cellsZmL, and 0.1 mL of the diluted solution was inoculated on a LB (pH 7) cellulose medium using a spreader. After culturing in an incubator maintained at 37 ° C for 16 to 18 hours, the number of colonies was counted.
  • LB (pH 7) cellulose medium was prepared in the same manner as in Example 1.
  • Bacillus subtilis strain 168 aci ⁇ subtil is 168) is, in advance LB medium, 371: In A 6. .
  • This culture solution is diluted with 0.9% saline so that the cell concentration becomes 1 ⁇ 10 3 cel lsZmL, and 0.1 mL is inoculated on LB (pH 7) cellulose medium using a spreader. After culturing for 16 to 18 hours in an incubator maintained at 37X, colonies were counted.
  • a YPD cell opening medium was prepared in the same manner as in Example 1. Saccharomyces Serebishi strain YPH499 (Saccharomyc6S cerevisiae YPH499) during advance YPD liquid medium, A 6 at 25 ° C (). The pre-culture was performed until the value became 3. This culture solution is diluted with 0.9% physiological saline so that the cell concentration becomes 1 ⁇ 10 3 cellsZmL, and 0.1 mL of the diluted solution is inoculated on a YPD cellulose medium using a spreader, and inoculated at 25 ° C.
  • Example 5 After culturing for 2 days in an incubator kept at, the number of colonies was counted. As a control for comparison, culturing was also performed on a YPD agar medium, and compared with one colony on a YPD cellulose medium. The number of yeast colonies was about 140 on the YPD cellulose medium and about 130 on the YPD agar medium, and the yeast showed the same growth on the YPD cell orifice medium as on the YPD agar medium.
  • Example 5 Example 5:
  • a HOR I KOSH I-II cellulose medium was prepared in the same manner as in Example 1, except that an H ⁇ RI KOSH I-II medium was used instead of the LB (pH 7) medium.
  • the alkalophilic Bacillus halodurans C-125 strain (Bacillus halodurans C-125) was precultured in advance on a HOR I KOSH I-II agar medium.
  • HOR IKOSH I-II cellulose medium The number of colonies on HOR IKOSH I-II cellulose medium is 191 and the number of colonies on HOR I KOSH I-II agar is 186.
  • Bacillus halodurans C-125 is HOR I KOSH I-II cellulose. The growth on the medium was equivalent to that on the HOR I KOSH I-II agar medium.
  • a TS BZ sodium cellulose medium was prepared in the same manner as in Example 1, except that a LB (pH 7) medium was replaced with a TS BZ sodium carbonate medium.
  • Bacillus agaradhaerans JAMB-602 an alkalophilic Bacillus agaradhaerans strain JAMB-602, was previously cultured in a TSBZ sodium carbonate medium at 37 ° C at A6Q . Preculture was performed until the value was 1: 1.5.
  • This culture solution is diluted with 0.9% physiological saline to a cell concentration of 1 ⁇ 10 3 cells / mL, and 0.1 mL of the diluted solution is inoculated on a TSBZ sodium carbonate cellulose medium using a spreader.
  • TSB (pH 5.6) cellulose medium was prepared in the same manner as in Example 1, except that a TSB (pH 5.6) medium was used instead of the LB (pH 7) medium.
  • a strain of the strain Illux Lacteus NBRC5367 (/ rpe ⁇ NBRC5367) pre-cultured on an agar medium was inoculated and cultured at room temperature for 8 days.
  • the cells were cultured on a TSB (pH 5.6) agar medium and compared with the growth on a TSB (pH 5.6) cellulose medium.
  • Irpex lacteus NBRC5367 also showed growth on a TSB (pH 5.6) cellulose medium as well as on a TSB (pH 5.6) agar medium.
  • thermoacidophilic bacteria Cultivation of thermoacidophilic bacteria on a solid cellulose medium
  • a BA cellulose medium was prepared in the same manner as in Example 1 except that a BA medium was used instead of the LB (pH 7) medium.
  • 0.1 mL of this culture was inoculated on a BA cellulose medium using a spreader, and cultured at 70 ° C for 18 to 24 hours.
  • the cells were cultured on BA agar medium and BA dielan gum medium, and compared with growth on BA cellulose medium.
  • Alicyclobacillus acidocaldarius JCM5260 showed no colony formation on BA cellulose culture medium, BA dielan gum medium, and colony formation on BA agar medium.
  • SULFOLOBUS medium instead of LB (pH 7) medium, as in Example 1.
  • a SULFOLOBUS cellulose medium was prepared. Thermophilic eosinophilic Saruhorobasu ⁇ shea Dokarudarisu DSM639 strain (Sulfolobus acidocaldarius DSM639) during pre-SUL FOLOBUS medium, A 6 at 70 ° C. . The preculture was performed until the value became 0.8. The culture was diluted with SULFOLOBUS medium 1 0 3 fold, was inoculated with a spreader scratch its 0. LML on SULFOLO BUS cellulose medium and cultured for 4 days at 7 0 ° C. As a control for comparison, the cells were cultured on SULFOLOBUS agar medium and SULFOLOBUS dielan gum medium, and compared with growth on SULFOLOBUS cellulose medium.
  • thermophilic bacteria Cultivation of thermophilic bacteria on solid cellulose medium
  • TM cell-mouthed medium was prepared in the same manner as in Example 1.
  • Konetsukinsaichi Mass thermophilus HB8 (Thermus therinophi lusm) is, A 6 at 70 using the previously TM medium.
  • Preculture was performed until Q became 1 to L.5.
  • the culture 1 was diluted with 0 5 times up to 0.9% chloride Natoriumu solution, the 0. 1 mL was inoculated with spreader one on TM cellulose medium, in an incubator one maintained at 70 ° C And cultured for 17 hours.
  • culture on TM agar medium The growth was compared with growth on a lurose medium.
  • TM dielan gum medium the medium did not solidify at room temperature. Colonies were formed on TM cellulose medium and TM agar medium, but colonies varied in shape due to softening of the surface of TM agar medium. The colonies on the TM cellulose medium had a uniform shape. When culturing was performed for 24 hours even at 80 ° C, colonies were formed on the TM cellulose medium, but the TM agar medium was completely dissolved.
  • the solid medium using the cellulose gel of the present invention softens and dissolves even at a high temperature, a wide pH range, and even now various salt concentrations, which were difficult with an agar medium, which is a typical conventional solid medium. Therefore, the properties and shape can be stably maintained. Therefore, solid-state culture of various microorganisms is possible, and it can be used to isolate or produce novel microorganisms that produce useful enzymes and chemicals.

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Abstract

　本発明は、培地固化成分として、セルロースゲル、特にセルロースを骨格部分とし、セルロース濃度が０．０１％以上、空隙率が５０％以上である多孔質のセルロースゲル構造体であるセルロースゲルを含む固体培地とその製造方法である。本発明の固体培地は、セルロースを溶媒、特にチオシアン酸塩水溶液に分散して、攪拌および／または加熱により溶解し、次いで冷却および／または溶媒除去によりゲル化させて得たセルロースゲルに、栄養素を浸透させることによって製造することができる。　寒天培地などの従来の固体培地では使用することができなかった、より広い範囲の培養条件下で使用することができる固体培地とその製造方法を提供する。

Description

明 細 書 セルロース固体培地とその製造方法 ， 技術分野
本発明は、 微生物等の培養に用いる固体培地とその製造方法に関し、 特に培地固化 成分としてセルロースゲルを用いた固体培地とその製造方法に関する発明である。 背景技術
微生物の培養方法としては、 液体培地による方法と固体培地による方法がある。 液 体培地を用いる方法では、 菌の生育が脆弱であったり、 変異株が取得できない、 或い は純度の低い菌しか単離することができないなどといった問題があった。 一方、 固体 培地を用いる方法は、 このような問題が少なく、 明瞭に分離したコロニーが形成され るため、 微生物の単離とその純粋培養方法として優れており、 古くから使用されてい る。 この固体培地の固化成分としてはコッホの時代にさかのぼる古くから、 寒天ゲル が使用されている。 寒天ゲルは、 例えば、 「新生化学実験講座 1 7」 （日本生化学会偏 、 1 9 9 2年、 東京化学同人社発行） の 1 5— 2 0頁に記載されているように、 細菌 の生育する広い温度範囲で硬く透明な固体であり、 寒天を分解できる微生物はごく限 られたものしかなく、 液化が問題となることがほとんどないなどの優れた性質を有す るため、 培地固化剤として非常に優れたものであり、 現在までこれに代わる優れた培 地固化剤は見出されていないと言っても過言ではない。
しかしながら、 このような寒天ゲルも温度、 p H或いは塩濃度などの条件によって は、 軟化したり溶解してしまうため、 培地固化成分として使用できる範囲には一定の 制限があった。 時に、 近年になり、 新たな有用微生物を探索するために、 より広い範 囲の温度， P H、 塩濃度などの培養条件下での微生物の培養が必要となり、 このよう なより広い範囲の培養条件下で使用可能な培地固化成分の開発が望まれている。 例え ば、 今までに 1 2 1 °Cという高温で生育可能な超好熱菌が見つかつており、 このような 超好熱菌の産生する酵素は、 工業的に有用であると考えられるが、 そのような微生物が 増殖する温度は、 寒天の軟化温度以上であるため固体培養ができず、 もっぱら液体培養 によって生産されている。 しかし、 液体培養では、 既に述べたように、 生育が脆弱であ り、 変異株が取得できない、 単離された菌の純度が低いなど、 固体培養と比べて著しい 制限を受けることとなる。
従って、 より幅広い培養条件下でも使用可能な培地固化成分を開発する試みが種々な されており、 例えばジエランガムを培地固化成分として使う方法 (例えば、 Shungu，D.， Val iant, M. , Tut lane, V. , Weniberg, E. , Weissberger, B. , Koupal, L. , Gadebusch, H. , and Stapley, E. , "Appl . Environ. Microbial. " , 1983, 46, 840- 845.を参照）、 培地を 含有したシリカゲルプレート上で培養を行う方法 (例えば、 新生化学実験講座 1 7、 1 5— 2 0頁、 日本生化学会偏、 1 9 9 2年東京化学同人社発行を参照)などがある。 し かしながら、 ジエランガムを用いる方法では、 培地中のカチオン （金属性陽イオン） が 不足すると固まらない、或いは酸性度が増すと固まりにくくなる等の問題がある。また、 シリカゲルプレートを使う方法では、 アルカリ条件下での使用が困難であり、 かつ保水 性が悪く、 プレート表面が乾燥しやすく、 微生物の生育に悪影響を与えるという問題が ある。 つまり、 幅広い温度、 p H、 塩濃度などの培養条件で十分に満足して利用可能な 固体培地は依然として未開発であると言わざるを得ない。 本発明は、 以上のような、 温度、 pH或いは塩濃度などの条件によっては使用する ことができない寒天培地などの従来の固体培地の問題点を解決し、 より広い範囲の培 養条件下で使用することができる固体培地とその製造方法を提供することを目的とす るものである。 発明の開示
本発明者らは、 以上のような従来の固体培地の問題点を解決すベく鋭意研究を重ね た結果、 培地固化成分としてセルロースゲルを用いることによってこれらの課題を解 決できることを見出し、 本発明を完成した。
即ち、 本発明は、 以下の内容をその要旨とするものである。
( 1 ) 培地固化成分としてセルロースゲルを含む固体培地。
(2) セルロースゲルの結晶化度が 5〜 70%であることを特徴とする、 前記 （1) 記 載の固体培地。
(3) 用いるセルロースの分子量が 10， 000〜2， 000， 000であることを特 徴とする、 前記 （1) または （2) に記載の固体培地。
(4) セルロースゲルが、 セル口一スを骨格部分とし、 セルロース濃度が 0. 01%以 上である多孔質のセルロースゲル構造体であることを特徴とする、前記（1)ないし（3) のいずれかに記載の固体培地。
(5) セルロースゲルが、 空隙率が 50%以上の多孔質ゲル状構造体であることを特 徴とする、 前記 （1) ないし （4) のいずれかに記載の固体培地。
(6) セルロースゲルが、 セルロースをチオシアン酸塩水溶液中で加熱 '溶解し、 次い で冷却して得られる多孔質のゲル状材料であることを特徴とする、前記（ 1 )ないし（ 5 ) のいずれかに記載の固体培地。
(7) 溶媒に分散したセルロースを、 機械的混合及び/又は加熱によって溶解又は膨潤 させ、 次いで冷却及び Z又は溶媒の除去により固化させた後、 これに栄養素成分を浸透 させることを特徴とする、 セルロースゲル固体培地の製造方法。
(8) 溶媒に分散したセルロースを加熱することにより溶解し、 次いで冷却して固化さ せ、 溶媒成分を除去した後、 栄養素成分を浸透させることを特徴とする、 前記 (7) に 記載のセルロースゲル固体培地の製造方法。
(9) 溶媒がチォシアン酸のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩の水溶液である ことを特徴とする、 前記 (7) または （8) に記載のセルロースゲル固体培地の製造方 法。
(10) 溶媒がチォシアン酸カルシウムの水溶液であることを特徴とする、 前記 （7) ないし （9) のいずれかに記載のセルロースゲル固体培地の製造方法。
(11) 溶媒がチォシアン酸カルシウムの飽和水溶液で、 加熱温度が 70〜20 O で あることを特徴とする、 前記（7)ないし （10) のいずれかに記載のセルロースゲル固 体培地の製造方法。
(12) 培地固化成分としてセルロースゲルを用いた固体培地の表面で微生物または細 胞を培養することを特徴とする、 微生物または細胞の培養方法。
(13) セルロースゲルを用いた固体培地で培養する微生物が極限環境微生物である ことを特徴とする、 前記 （12) に記載の微生物の培養方法。
このような培地固化成分としてセルロースゲルを用いた本発明の固体培地は、 高い温 度や広い pH範囲、 或いは広い塩濃度の範囲で安定な諸性質と形状を保持しており、 良 好な性質を有する固体培地が得られ、 広範囲の培養条件下で軟化したり溶解することが なく使用することができる固体培地である。 したがって、 従来の代表的な固体培地であ る寒天を用いた固体培地では不可能であった、 1 0 0 °Cを超える高い温度や、 p Hが 3 以下或いは 1 0以上という厳しい条件でも微生物等の培養が可能となる。 図面の簡単な説明.
第 1図は、本発明の固体培地に使用するセルロースゲルの表面状態を示す倍率 1 0， 0 0 0倍の走査型電子顕微鏡写真であり、 第 2図は、 本発明の固体培地に使用するセ ルロースゲルの表面状態を示す倍率 1 0 0， 0 0 0倍の走査型電子顕微鏡写真である。 発明を実施するための最良の形態
本発明で使用するセルロースゲルを得るためのセルロースは、 植物あるいは微生物に よって生産されるグルコースが )3 - 1 - 4ダルコシド結合を介して直鎖状に結合した多糖 類またはその種々の誘導体である。 本発明のセルロースゲルを得るためのセルロース誘 導体としては、分岐を持つものや、硝酸エステル、 リン酸エステル、キサントゲン酸塩、 亜確酸エステル、 硝酸エステル、 硫酸エステル、 ギ酸エステル、 酢酸エステル、 プロピ オン酸エステル、 酪酸エステル、 吉草酸エステル、 酢酸プロピオン酸エステル、 酢酸酪 酸エステル、 トリフルォロ酢酸エステル、 安息香酸エステル、 トシルエステル、 フエ二 ルカルバニレート、 アルキルケテンダイマーエステル、 アルケニル無水コハク酸エステ ル等のエステル化誘導体；カルポキチメチルセルロース、 メチルセルロース、 ェチルセ ルロース、 プロピルセルロース、 ヒドロキシェチルセルロース、 メチルヒドロキシェチ ルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、 ェチルヒドロキシェチルセルロース、 シァノエチルセルロース、 ジェチルアミノエチル ェチルセルロース、 トリメチルアンモノィルヒドロキシプロピルセルロース、 トリフエ ニルメチルセルロース等のエーテルィヒ誘導体；フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素などを導入 したハロゲン化誘導体；アミノ基を導入した誘導体、 チォ一ル基を導入した誘導体、 高 分子をグラフトした誘導体、 ポリウロン酸型の酸ィ匕物誘導体等のセルロース誘導体であ つてもよい。 またセルロースゲルを得た後に、 化学修飾を施したものでもよい。 これら のセルロースまたはその誘導体は、 その分子量が 1 0 , 0 0 0〜2， 0 0 0， 0 0 0の ものが好ましく、 特に、 分子量が 1 0， 0 0 0〜 1 0 0， 0 0 0の α -セルロースが望ま しレ。
本発明で使用するセルロースゲルは、 上記のようなセルロースまたはその誘導体を、 溶媒に溶解または膨潤させ、 次いで再結晶化または固化させることによって得ることが できる。
セルロース類の溶媒への溶解は、 セル口一ス分子の大きさ、 セルロース分子中の水酸 基ゃピラノース環の酸素原子の作用等が複雑に影響する。 本発明で使用するセルロース ゲルは、 溶媒中にセルロース類を分散 '混合し、 必要に応じて加熱して溶解または膨潤 させ、 その後、 必要に応じて冷却して固化させ、 溶媒を除去して得ることができる。 このセルロースまたはその誘導体を溶解する溶媒としては、 塩酸、 硫酸、 硝酸、 リン 酸等の無機酸水溶液；水酸ィ匕リチウム、 τΚ酸化ナトリゥムなどのアル力リ溶液；塩化亜 鉛、チォシアン酸塩、液体アンモニア Ζチォシアン酸塩、液体アンモニア Ζナトリゥム、 液体アンモニアノヨウ化アンモニゥム、 ヒドラジン等の無機化合物の水溶液； [C u (Ν H3) 4] (OH) . [C u (エチレンジァミン) 2] (OH) 2、 [C o (エチレンジァミン) 2] (OH) 2、 [N i (NH3) 2] (OH) 2、 [N i (エチレンジァミン) 3] (OH) 2、 [C d (エチレンジァミン) 3] (OH) 2、 [ Z n (エチレンジァミン) 3] (OH) 2、 F e：酒石酸： N a OH等の金属錯体溶液；ジメチルスルホキシド/ホルムアルデヒド、 N, Λ—ジメチルホルムアミドノホルムアルデヒド、 N, AT—ジメチルァセトアミド Z ホルムアルデヒド、 ジメチルスルホキシドノクロラール、 N, Λ—ジメチルホルムアミ ド /クロラール、 N, AT—ジメチルァセトアミド Zクロラール、 ジメチルスルホキシド Zクロラール/ピリジン、 N, Λ—ジメチルホルムアミド Zクロラール/ピリジン、 N, Λ—ジメチルァセトアミド Zクロラール/ピリジン、 ジメチルスルホキシド Zクロラー ル/トリェチルァミン、 N， JV—ジメチルホルムアミド Zクロラール Zトリェチルアミ ン、 N, i —ジメチルァセトアミド クロラール Zトリェチルァミン、 ジメチルスルホ キシド /無水亜硫酸 Zジェチルァミン、 N, Λ—ジメチルホルムアミド Z無水亜硫酸/ ジェチルァミン、 ジメチルスルホキシド /無水亜硫酸 Zトリェチルァミン、 N, N—ジ メチルホレムアミド Z無水亜硫酸 Zトリェチルアミン、 ジメチルスルホキシドノ無水亜 硫酸 Zピぺリジン、 N, Λ—ジメチルホルムアミド Z無水亜硫酸 Zピぺリジン、 ジメチ ルスルホキシド Z無水亜硫酸 /イソアミルァミン、 N, AT—ジメチルホルムアミドノ無 水亜硫酸 Zイソアミルァミン、 ジメチルスルホキシド /Ν 204、 Ν， Λ—ジメチルホル ムアミド ZN 204、 ジメチルスルホキシド ZN〇C 1、 N, Λ—ジメチルホルムアミド /NO C l、 ジメチルスルホキシド/ NO S〇4H、 N, V—ジメチルホルムアミド / NO S 04 H、 N, iV—ジメチルァセトアミド/塩化リチウム、 AT—メチル一2—ピロ リドン Z塩ィ匕リチウム、 1 , 3—ジメチル— 2—イミダゾリジノン Z塩化リチウム、 V, V—ジメチルァセトアミド Z臭化リチウム、 AT—メチルー 2—ピロリドン/臭化リチウ ム、 1， 3—ジメチルー 2 _イミダゾリジノン Z臭化リチウム、 トリフルォロ酢酸、 ト リフルォロ酢酸ノクロ口ホルム、 トリフルォロ酢酸、 トリフルォロ酢酸/酢酸、 JV—メ チルモルフォリンー N—ォキシド含水塩、 V_メチルモルフオリン— V_ォキシド含水 塩 Zジメチルスルホキシド、 V—アルキルピリジゥムハロゲン類等の有機溶媒から選ば れる 1種又は 2種以上の混合物などを使用することができる。
これらの中でも、 チォシアン酸塩水溶液を溶媒として使用すると、 セルロースを膨潤 させてセルロースの結晶面の面間隔を増大させ、 さらに加熱することによって溶解し、 次いでこれを冷却すると固化してゲル状となり、 本発明の固体培地に適した多孔質のゲ ル状構造体を形成するので、 溶媒として最も好ましいものである。 このようなチオシァ ン酸塩としては、 チ才シアン酸ナトリウム、 チォシアン酸カリウム等のチォシアン酸ァ ルカリ金属塩、 及びチォシアン酸カルシウム、 チォシアン酸マグネシウム等のチオシァ ン酸アルカリ土類金属塩が好ましい。特に、チォシアン酸カルシウムを質量濃度で 4 0 % 以上含むチォシアン酸カルシウム水溶液、 またはチォシアン酸ナトリゥムを質量濃度で 5 0 %以上含むチォシアン酸ナトリウム水溶液が好ましく、 チォシアン酸カルシウムの 飽和水溶液が最も望ましい。
また、 ここで使う水としては、 超純水、 蒸留水、 脱イオン水など精製水が使用される が、 τΚ道水であってもよい。
セルロース溶解用の溶媒中へのセルロースの添加量は特に制限されないが、 溶解する セル口 スの分子量等によってその量を調整する。 一般的に、 溶媒に対して 0 . 0 1質 量％以上、 好ましく 0 . 0 1 - 2 0質量％程度にするのが、 操作の容易さの点で望ま しい。 溶媒中への分散方法は、 特に制限はなく通常行なわれる種々の方法で溶媒中に分 散すればよく、 セルロースを溶媒に添加した後、 単に撹拌する程度でもよい。 本発明の セルロースゲルを得るには、 セルロースを溶媒中に分散'混合して、 必要に応じてさら に加熱して、 セルロースを膨潤させ、 更に溶解させる。 次いで、 膨潤し、 又は溶解した セルロース溶液を、 必要に応じて冷却して、 固化させ、 溶媒を除去して、 本発明に使用 するに適した多孔質のセルロースゲルを形成させる。 この際、 セルロースは、 溶媒に対 してその溶解度以上の量を添加してもよい。 この場合は、 加熱後であってもセルロース の一部が溶解しない伏態のままで冷却固化されることとなるが、 このようにして得られ たセルロースゲルも多孔質のゲル状を示し、 本発明の固体培地に好適に使用することが できる。
溶媒としてチォシアン酸塩を使用する場合には、 セルロースは溶媒中で 7 0 °C以上に 加熱してセル口一スを膨潤させ溶解させることが好ましく、 更には 8 0〜2 0 0 °Cに加 熱して溶解することがより好ましい。 加熱手段は特に制限されないが、 通常はオートク レーブやマイクロ波を使用して加熱するのが製造効率の面で望ましい。 例えば、 セル口 —スとして市販の微結晶セルロースを、 溶媒としてチォシアン酸カルシウムの飽和水溶 液を使用した場合、 9 5 t:では約 1分間の加熱でセルロースを溶解することができる。 次に、 ゲル化したセルロースゲルから、 セルロースの溶媒成分を洗浄して除去する。 この溶媒がチォシアン酸塩の場合には、 セルロースゲルの洗浄に用いる洗浄溶媒は、 チ オシアン酸塩を溶解するものであればよく、 水や極性有機溶媒が挙げられる。 このよう な洗浄溶媒としては、 例えば、 水、 メタノール、 エタノール、 アセトンの群から選ばれ る 1種または 2種以上の混合物を用いるのが望ましい。ここで使う水は超純水、蒸留水、 脱イオン水等精製水が使用されるが、 道水でもよい。 洗浄方法は、 特に制限されない が、 流水中に浸漬したり、 洗浄水を入れた容器中に浸漬し、 洗浄水を適宜交換する方法 などによって行なう。 洗浄に際して電気透析を使用することが洗浄効率の面から望まし い。 また、 セルロースゲルの洗浄度は、 洗浄液の電気伝導度を測定することによって確 認することができる。
得られるセルロースゲルの結晶化度は 5〜 7 0 %であり、 特に 3 0〜5 0 %であるの が望ましい。 また、 セルロースゲルに用いるセルロースの分子量は 1 0， 0 0 0〜2 , 0 0 0， 0 0 0であり、 1 0， 0 0 0〜； L 0 0 , 0 0 0のものが好ましい。
このようにして得られたセルロースゲルは、 図 1および図 2に示すようにセルロース を骨格部分とし、 ゲル中のセルロース濃度が 0 . 0 1 %以上の非常に大きい空隙を有 する多孔質のセルロースゲル構造体である。 このような多孔質のセルロースゲル構造 体の空隙率は 5 0 %以上であり、 更には空隙率が 8 0〜9 9 . 9 9 %のものを用いる ことがより好ましい。 このようなセル口一スゲルに様々な栄養素成分を含んだ培地を 接触させると、 この培地が固体のセルロースゲルの内部の空隙部分に効率よく浸透し て栄養素成分を取り込み、 固体培地を形成することができる。
本発明のセレロースゲル固体培地は、 従来の寒天培地に用いられる種々の培地がそ のまま使用することができる。 例えば、 天然培地としては、 肉汁、 ペプトン、 酵母ェ キス、 麦芽エキス、 血清などの天然物を主成分として含む天然培地や、 市販の合成培 地等を使用することができる。 これらの培地を前記セルロースゲルに接触させること によって、 これらの栄養素を含んだセルロースゲル固体培地とすることができる。 本発明のセルロースゲル固体培地は、 その形状は特に制限されず、 平板、 斜面、 高 層培地などとして用いることができる。
得られた本発明のセルロースゲル固体培地は、 低い温度からかなり高温まで、 また 広い p H範囲にわたってその性質が安定しており、 高い温度に加熱しても軟化したり 溶解することがなく、安定してその形状を保持し、かつ保水性も良好で乾燥しにくく、 優れた固体培地として使用することができる。 具体的には— 2 0 から 2 5 の温 度範囲で使用することが可能であるが、 0で〜 1 5 0 の温度範囲での使用が好まし い。 また、 本発明のセルロースゲル固体培地は、 p Hが 1〜1 4という広い範囲で安 定して使用することができるが、 1) 11が2〜1 2の範囲での使用が好ましい。さらに、 本発明のセルロースゲル固体培地は、 浸透させる培地の塩濃度には影響されず安定に その形状を保持しながら、 任意の濃度の塩類を吸収して培地として使用することがで さる。
かくして製造されたセルロースゲルを用いた本発明の固体培地は、 温度や p Hについ て幅広い培養条件下で使用可能であり、 多くの種類の微生物や細胞の培養などの用途に 幅広く使用することができる。
この本発明のセルロースゲルを用いた固体培地上で培養するのに適した微生物とし ては、 例えば、 セルラ一ゼ産生菌、 キシラナ一ゼ産生菌、 キチナ一ゼ産生菌、 アミラー ゼ産生菌、 マンナナ一ゼ産生菌、 マンノシダーゼ産生菌、 ァガラ一ゼ産生菌、 プルラナ —ゼ産生菌、 ダルカナ一ゼ産生菌、 ぺクチナーゼ産生菌、 ガラクトシダーゼ産生菌、 ァ ルギナーゼ産生菌、 シクロデキストリン合成酵素産生菌、 プロテアーゼ産生菌、 リパー ゼ産生菌、 カタラーゼ産生菌、 ポリアミンォキシダ一ゼ産生菌、 RNase産生菌、 DNase産 生菌、 DNAポリメラ一ゼ産生菌などが挙げられる。
また、本発明のセルロースゲルを用いた固体培地の特性を生かして、好熱菌、好冷菌、 好アルカリ性菌、 好酸性菌、 好塩菌、 好圧菌、 有機溶媒耐性菌などの極限環境微生物を 効率よく培養することができる。 例えば、 8 O を超える高温で生育する超好熱菌や、 P Hが 2以下のような高酸性で生育する好酸性菌ぁるいは p Hが 1 2以上の高アル力 リ性で生育する好アル力リ性菌のような極限環境条件での微生物の培養に有用に使用 することができる。
次に、本発明を実施例によって更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限 定されるものではない。 なお、 実施例中で 「％」 は特に異なる注記をしない限り質量基 準である。
以下の実施例において、 微生物の培養に用いた各培地は下記のようにして調製した ものを用いた。
(A) LB培地 (pH7) ：
トリプトン 10 g、 酵母エキス 5 g、 塩化ナトリウム 10 gを 1リツトルの蒸留水に 溶解し、 これを水酸ィ匕ナトリウムにて pHを 7に調整し、 加熱滅菌して調製した。
(B) LB培地 (pH2) ：
トリプトン 10 g、 酵母エキス 5 g、 塩化ナトリウム 10 gを 1リツトルの蒸留水に 溶解し、 これを硫酸にて pHを 2に調整し、 加熱滅菌して調製した。
(OLB培地 （ρΗ4·5)：
トリプトン 10 g、 酵母エキス 5 g、 塩化ナトリウム 10 gを 1リツトルの蒸留水に 溶解し、 これを硫酸にて pHを 4. 5に調整し、 加熱滅菌して調製した。
(D)LB培地 (pH9.5)：
トリプトン 10 g、 酵母エキス 5 g、 塩化ナトリウム 10 gを 1リツトルの蒸留水に 溶解し、 これを水酸化ナトリウムにて pHを 9. 5に調整し、 加熱滅菌して調製した。
(E)LB培地 (pH12)：
トリプトン 10 g、 酵母エキス 5 g、 塩化ナトリウム 10 gを 1リツトルの蒸留水に 溶解し、 これを水酸ィ匕ナトリウムにて pHを 12に調整し、 加熱滅菌して調製した。
(F) TSB培地：
TSBCtrypticase soy broth)の 30 gを 1リツトルの蒸留水に溶解した後、 加熱滅 菌して調製した。
(G) T S BZ炭酸ナトリゥム培地： TSB (trypticase soy broth) の 30 gと、 別途滅菌した炭酸ナトリウム 5 g (対 蒸留水 0. 5%) を 1リットルの蒸留水に溶解した後、 加熱滅菌して調製した。
(H) TSB培地 (pH5.6) ：
TSB (trypticase soy broth)の 3 0 gを 1リツトルの蒸留水に溶解し、 加熱滅菌し た後、 塩酸にて pHを 5. 6に調整して調製した。
(I) YPD培地：
酵母エキス 10 g、 バクトペプトン 20 g、 グルコース 20 gを 1リツトルの蒸留水 に溶解し、 加熱滅菌して調製した。
(J) HOR I KOSH I一 II培地：
可溶性でんぷん 10 g、 ポリべプ卜ン 5 g、 酵母エキス 5 g、 リン酸水素二力リゥム 1 g、 硫酸マグネシウム七水和物 0. 28を0. 8mLの蒸留水に溶解した後、 7]c酸化 ナトリゥム水溶液で pH 7.5に調整した。別途 10 %炭酸水素ナトリゥム水溶液を 0. 2リットル調製した。 これらを加熱威菌した後、 混合して調製した。
(K)BA培地：
酵母エキス 1 g、 硫酸アンモニゥム 0. 2 g、 硫酸マグネシウム七水和物 0. 5g、 塩化カルシウム二水和物 0. 25g、 およびリン酸二水素カリウム 0. 6 を0. 5リ ットルの蒸留水に溶解後、 pHを硫酸で 3に調整した。 グルコース l gを 0. 5リット ルの蒸留水に溶解した。 これらを加熱滅菌した後、 混合し 1リットルとした。
(L) SULFOLOBUS培地：
酵母エキス 1 g、 硫酸アンモニゥム 1. 3g、 リン酸二水素カリウム 0. 28g、 硫 酸マグネシウム七水和物 0. 25 t g、塩ィ匕カルシウム二水和物 0. 07 g、塩ィ匕鉄（III) 六水和物 0. 02 g、 塩化マンガン四水和物 1. 8mg、 四ホウ酸ナトリウム 4. 5 m g、 硫酸亜鉛七水和物 0. 22 m g、 塩ィ匕銅（II)二水和物 0. 05 m g、 モリブテン酸 ナトリウム 03 mg、 酸化硫酸バナジウム（IV)二水和物 0. 03mg、 塩化コバル ト（II)六水和物 0. 0 lmgを 1 リットルの蒸留水に溶解した後、 pHを硫酸で pH2 に調整し、 濾過滅菌して調製した。
( ) Nutrient培地 (pH7)：
Nutrient broth (DIFCO製） の 8 gを 1リットルの蒸留水に溶解し、 加熱滅菌して調製 しノ
(N) Nutrient培地 (pH2)：
Nutrient broth (DIFCO製） の 8 gを 1リットルの蒸留水に溶解し、 加熱滅菌後硫酸を 用いて p H 2に調整したものを用いた。
(0) Nutrient培地 (pH9.5) ：
Nutrient broth (DIFCO製） の 8 gを 1リットルの蒸留水に溶解し加熱滅菌後、 別途滅 菌した 10 %炭酸ナトリゥム水溶液と 1 N7K酸化ナトリゥム水溶液を用いて p H 9. 5 に調整した後、 1リットルにメスアップした。
(P) Nutrient培地 (pH12) ：
Nutrient broth (DIFCO製） の 8 gを 1リットルの蒸留水に溶解し加熱滅菌後、 別途滅 菌した 10%炭酸ナトリウム水溶液と ΙΝτΚ酸ィ匕ナトリウム水溶液を用いて p HI 2に 調整した後、 1リットルにメスアップした。
(Q) SCD培地 (pH7)：
カゼイン製ペプトン 15 g、 大豆製ペプトン 5 g、 塩ィ匕ナトリウム 5 gを 1リットル の蒸留水に溶解し、 加熱滅菌して用いた。 （pH未調整で pH6. 9)
(R) SCD培地 (pH2)： カゼィン製ぺプトン 1 5 g、 大豆製ぺプトン 5 g、 塩化ナトリウム 5 gを 1リツトル の蒸留水に溶解し、 加熱滅菌後硫酸を用いて pH 2に調整したものを用いた。
(S) SCD培地 (pH4.5)：
カゼイン製ペプトン 1 5 g、 大豆製ペプトン 5 g、 塩化ナトリウム 5 gを 1リットル の蒸留水に溶解し、 加熱滅菌後硫酸を用いて pH4. 5に調整したものを用いた。
(T) SCD培地 （pH12)
カゼイン製ペプトン 1 5 g、 大豆製ペプトン 5 g、 塩化ナトリウム 5 gを 0. 8リツ トルの蒸留水に溶解し、 加熱滅菌後、 別途滅菌した 1 0%炭酸ナトリウム水溶液と 1N 水酸化ナトリウム水溶液を用いて PH1 2調整した後、 1リットルにメスアップした。 (U) TM培地：
硫酸 0. 5ミリリットル、硫酸マンガン（II)五水和物 2. 2 g、硫酸亜鉛七水和物 0. 5 g、 ホウ酸 0. 5 g、 硫化銅 0. 0 1 6 g、 モリブテン （IV) 酸ニナトリウム二水和 物 0. 025 g、塩化コバルト（I I)六水和物 0. 046 gを蒸留水 1リットルで溶解し、 Nitsch's trace elementsとし 7こ。
二トリ口三酢酸 1 g、 硫酸力 Jレシゥムニ水和物 0. 6 g、 硫酸マグネシウム七水和物 l g、 塩化ナトリウム 0. 08 g、 硝酸カリウム 1. 03 g、 硝酸ナトリウム 6. 8 9 g、リン酸水素ニナトリウム 1. 1 1 g、 0. 03 %塩化鉄 (Π)水溶液 1 0 mL、 Nitsch's trace elements 1 OmLを 1リツトルの蒸留水に溶解した後、 τΚ酸化ナトリウム水溶液 にて pHを 8. 2に調整して調製し、 Castenholz basal salt solutionとした。
ポリペプトン 4 g、 酵母エキス 2 g、 塩化ナトリウム l g、 Castenholz basal salt solution 1 OmLを加え、 1リットルの蒸留水に溶解した後、 水酸化ナトリゥム水溶液 にて PH7. 2に調整後、 加熱滅菌して調製した。 実施例 1 ：
( i ) セルロースゲルの調製
結晶性セルロース （フナセル、 フナコシ製） を、 チォシアン酸カルシウム四水和物 （ 和光純薬製） の飽和水溶液 （5 9 %) に 3 %の濃度になるように加え、 室温で 1時間撹 拌して、 セルロース分散液を得た。 セルロース分散液 2 O mLをガラス製シャーレ （外 径 9 O mm、深さ 1 7 mm)に分注した後、これをォ一トクレーブ（トミ一精ェ製、 KS-243 ) 内に設置して 1 2 0 °Cで 1分間加熱し、 セ レ口一スを加熱溶解した。 このセルロース 溶液をー晚室温で放冷し、 固化させた。 次いで、 メタノール、 続いて流水で固化したセ ルロースのチォシアン酸カルシウムを洗浄後、 蒸留水 5 Lを含む水槽中で、 軽く撹拌し ながら洗浄を続けた。 1日に 2度の頻度で水を交換しながら、 洗浄液の電気伝導度が 5 II S / c m以下になった時点で洗浄を終了し、 セルロースゲルを得た。
図 1および図 2に、 このようにして得たセルロースゲルの走査型電子顕微鏡写真を示 す。 図 1が 1 0 , 0 0 0倍、 図 2が 1 0 0， 0 0 0倍の写真であり、 これからこのセル ロースゲルがセルロースを骨格部分とした網目構造の、 大きな空隙を有する多孔質の構 造体であることがわかった。
このセルロースゲルは、 ォ一トクレーブ内で 1 2 0 °Cで、 9時間の間加熱滅菌しても その形状に軟ィ匕や溶融等の変化は全く見られず、 優れた熱安定性を有することがわかつ た。
比較のために、 寒天を培地固化成分として用いた固体培地で同様の加熱試験を行なつ たところ、 オートクレープで 1 2 O 、 1 5分間の加熱滅菌によって固体培地が溶解し た。 また、 同様にジエランガムを培地固化成分として用いた固体培地では、 ォ一トク レーブで 120°C, 15分間の加熱滅菌によって溶解した。
(ii) セルロース固体培地の調製
上記の（i)で得られたセルロースゲルを加熱滅菌した後、 2倍濃度の LB培地 (pH7) の 20mLを重層し、 軽く撹拌しながら 4時間放置した後、 過剰の培地を除去して、 L B(pH7)セルロース培地を得た。同様にして B培地 (pH7)の代わりに、 L B培地 (pH2)、 LB(pH4.5)培地、 LB(pH9.5)培地、 1^8培地(01112)、 Nu t r i en t (pH7)培地、 N u t r i e n t (pH2)培地、 Nu t r i en t (pH12)培地、 S CD (pH4.5)培地、 S CD (pH7)培地、 SCD(pH2)培地、 S CD (pH12)培地を用いて、それぞれ L B (pH2)セルロー ス培地、 LB(pH4.5)セルロース培地、 LB(pH9.5)セルロース培地、 LB(pH12)セル口 ース培地、 Nu t r i en t (pH7)セルロース培地、 Nu t r i en t (pH2)セルロース 培地、 Nu t r i en t (pH12)セルロース培地、 S CD (pH7)セルロース培地、 SCD (pH¾セルロース培地、 S CD(pH4.5)セルロース培地、 S CD (ρΗ12)セルロース培地を 得た。
このようにして得た種々のセルロース培地をそれぞれ含むシャーレをビニールテープ で密封し、それぞれを 60 、 70t\ 80°Cに保ったインキュべ一夕一中に放置した。 放置時間の経過とともにセルロース固体培地の状態を目視観察した。 その結果は、 表 1 に示すように、 これらの条件下では 7曰が経過しても、 セルロース固体培地はすべての 温度と pHの条件で軟化 ·溶解することなく安定にその状態と形状を保持しており、 固 体培養に使用可能であった。 比較例 1 ：
上記実施例 1の （ii) と同様にして、 培地固化成分としてセルロースゲルの代わりに 寒天を用いて、 LB(pH7)寒天培地、 LB(pH2)寒天培地、 L B (pH4.5)寒天培地、 LB (PH9.5)寒天培地、 LB(pH12)寒天培地、 Nu t r i en t (pH7)寒天培地、 Nu t r i e n t (pH2)寒天培地、 Nu t r i en t (pH9.5)寒天培地、 Nu t r i en t (pH12)寒 天培地、 SCD(pH7)寒天培地、 SCD(pH2)寒天培地、 S CD (pH4.5)寒天培地、 SCD (pHl 2)寒天培地を調製した。 これらの寒天培地を含むシャーレをビニールテ一プで密封 し、 60° (：、 70°C、 80°Cに保ったインキュベータ一中に放置した。 放置時間の経過 とともに寒天培地の状態を目視観察した。 その結果、 LB(pH2)寒天培地、 LB(pH4.5) 寒天培地、 LB(pH9.5)寒天培地、 LB(pH12)寒天培地、 Nu t r i en t (pH7)寒天培 地、 Nu t r i en t (pH2)寒天培地、 Nu t r i e n t (pH9.5)寒天培地、 Nu t r i e n t (pHl 2)寒天培地、 SCD (pH2)寒天培地、 S CD (pH4.5)寒天培地、 SCD (pHl 2) 寒天培地は 7 で、 また 80 ではすベての培地が軟化 ·溶解し、 固体培養には使用 できる状態ではなかった。 比較例 2 ：
上記実施例 1の (ii) と同様にして、 培地固化成分としてセルロースゲルの代わりに ジエランガムを用いて、 LB(pH7) ジエランガム培地、 L B (pH2) ジエランガム培地、 L B (pH4.5) ジェランガム培地、 L B (pH9.5) ジェランガム培地、 L B (pHl 2) ジェラン ガム培地、 Nu t r i en t (pH7) ジエランガム培地、 Nu t r i en t (pH2) ジエラ ンガム培地を、 Nu t r i en t (pH12) ジエランガム培地、 SCD(pH7) ジエランガム 培地、 SCD(pH2) ジエランガム培地、 SCD(pH4.5) ジエランガム培地、 SCD(pH12) ジエランガム培地を調製した。これらの培地を含むシャーレをビニールテ一プで密封し、 60°C、 70°C、 80°Cに保ったインキュベータ一中に放置した。 放置時間の経過とと もにジエランガム培地の状態を目視観察した。 その結果、 Nu t r i en t (pH7) ジェ ランガム培地、 Nu t r i en t (pH2) ジエランガム培地、 Nu t r i en t (pH12) ジ エランガム培地は 60でで、 SCD(pH2) ジエランガム培地は 70でで、 また 80°Cで はすべての培地が軟化 ·溶解し、 固体培養には使用できる状態ではなかった。
表 1 :寒天培地、ジエランガム培地、セルロース培地の安定性の比較
Figure imgf000022_0001
〇：使用可能、 X：使用不可
符号の下のカツコ内の数値は放置期間 (時間または日）を示す。
実施例 2 ：
(iii) セルロース固体培地による大腸菌の培養
実施例 1と同様にして LB (pH7)セルロース培地を調製した。 大腸菌 W3110 株 ( d?er cA7'a co ' W3110) は、 あらかじめ LB培地中、 37 °Cで A600が 1〜： 1. 5 になるまで前培養を行った。 この培養液を菌体濃度が 1 X 103cellsZmLになるよう に 0. 9%生理食塩水で希釈し、その 0. lmLを LB (pH7)セルロース培地上にスプレ ッダーを用いて植菌し、 37 °Cに保ったインキュベータ一中で、 16〜18時間培養し た後、 コロニー数をカウントした。比較の対照として、 LB(pH7)寒天培地上でも培養を 行い、 LB(pH7)セルロース培地上でのコロニ一数と比較した。その結果、大腸菌のコロ 二一数は、 LB(pH7)セルロース培地、 1^ 117)寒天培地ともに100個前後となり、 大腸菌は、 LB(pH7)セルロース培地上でも、 LB(pH7)寒天培地上と同等の生育を示し た。 実施例 3 ：
(iv) セルロース固体培地による枯草菌の培養
実施例 1と同様にして LB(pH7)セルロース培地を調製した。枯草菌 168株 aci ^ subtil is 168) は、 あらかじめ LB培地中、 371:で A6。。が 1〜： L . 5になるまで前 培養を行った。 この培養液を菌体濃度が 1 X 103cel lsZmLになるように 0. 9 %生 理食塩水で希釈し、その 0. lmLを LB(pH7)セルロース培地上にスプレッダ一を用い て植菌し、 37 Xに保ったインキュベーター中で、 1 6〜18時間培養した後、 コロニ —数をカウントした。 比較の対照として、 LB(pH7)寒天培地上でも培養を行い、 LB (PH7)セルロース培地上でのコロニー数と比較した。 その結果、 枯草菌のコロニー数は、 LB(pH 7)セルロース培地、 LB(pH 7)寒天培地ともに 120〜150偭となり、 枯草 菌は、 L B (pH7)セルロース培地上でも、 L B (pH7)寒天培地上と同等の生育を示した。 実施例 4 ：
(V) セルロース固体培地による酵母菌の培養
LB(pH 7)培地の代わりに YPD培地を用い、 実施例 1と同様にして YPDセル口 —ス培地を調製した。 サッカロミセス セレビシー YPH499株 (Saccharomyc6S cerevisiae YPH499) は、 あらかじめ Y P D液体培地中、 25°Cで A6()。が 3になるま で前培養を行った。 この培養液を菌体濃度が 1 X 103cellsZmLになるように 0. 9 %生理食塩水で希釈し、 その 0. lmLを YPDセルロース培地上にスプレッダ一を用 いて植菌し、 25°Cに保ったインキュベータ一中で、 2日間培養した後、 コロニー数を カウントした。 比較の対照として、 YPD寒天培地上でも培養を行い、 YPDセルロー ス培地上でのコロニ一数と比較した。 酵母菌のコロニー数は、 YPDセルロース培地上 で 140個前後、 YPD寒天培地では 130個前後となり、 本酵母は YPDセル口一ス 培地上でも、 YPD寒天培地上と同等の生育を示した。 実施例 5 ：
(vi) セルロース固体培地による好アル力リ性バチルス属細菌の培養
LB(pH7)培地の代わりに H〇R I KOSH I— II培地を用い、 実施例 1と同様にし て HOR I KOSH I -IIセルロース培地を調製した。好アルカリ性バチルス ハロデ ュランス C-125株 (Bacillus halodurans C - 125) は、 あらかじめ HOR I KOSH I 一 II寒天培地で前培養を行った。 コロニーを数個集め、 1 X 103 cells/mLになる ように 1 OmM硫酸マグネシウム水溶液で希釈し、 その 0. lmLを HOR I KOSH I -IIセルロース培地上にスプレッダ一を用いて植菌し、 37°Cに保ったインキュべ一 ター中で、 16 1 8時間培養した後、コロニー数をカウントした。比較の対照として、 HOR I KOSH I一 II寒天培地上でも培養を行い、 HO R I KOSH I一 IIセルロー ス培地上でのコロニー数と比較した。 HOR IKOSH I — IIセルロース培地でのコロ ニー数は 191個であり、 HOR I KOSH I—II寒天培地でのコロニー数は 186個 であり、 Bacillus halodurans C-125は、 HOR I KOSH I— IIセルロース培地上で も、 HOR I KOSH I— II寒天培地上と同等の生育を示した。
また、 L B (pH7)培地の代わりに T S BZ炭酸ナトリゥム培地を用い、実施例 1と同様 にして T S BZ炭酸ナトリゥムセルロース培地を調製した。好アル力リ性バチルス ァガ ラドハランス JAMB - 602株 (Bacillus agaradhaerans JAMB-602) は、 あらかじめ T SB Z炭酸ナトリウム培地中で、 37°Cで A6Q。が 1〜： I. 5になるまで前培養を行った。 この培養液を、 菌体濃度が 1 X 103 cells/mLになるように 0. 9 %生理食塩水で 希釈し、 その 0. lmLを TSBZ炭酸ナトリウムセルロース培地上にスプレッダ一を 用いて植菌し、 37°Cに保ったインキュベータ一中で、 1 6〜18時間培養した後、 コ ロニー数をカウントした。 比較の対照として、 T SB/炭酸ナトリウム寒天培地上でも 培養を行い、 T SB/炭酸ナトリウムセルロース培地上での生育と比較した。 Bacillus agaradhaerans JAMB-602は、 T S BZ炭酸ナトリゥムセルロース培地上でも、 TSBZ 炭酸ナトリウム寒天培地上と同等の生育を示し、 約 200個のコロニーを形成した。 実施例 6 ：
(vii) セルロース固体培地による担子菌の培養 L B (pH7)培地の代わりに T S B (pH5.6)培地を用い、 実施例 1と同様にして T S B (pH5.6)セルロース培地を調製した。プレート中央部に、寒天培地上で前培養したィルぺ ックス ラクテウス NBRC5367株 （/rpe ^ NBRC5367) を植菌し、 室温で 8日間培 養した。 比較の対照として、 TSB(pH5.6)寒天培地上でも培養を行い、 TSB(pH5.6) セルロース培地上での生育と比較した。 Irpex lacteus NBRC5367 は、 TSB(pH5.6)セ ルロース培地上でも、 T S B (pH5.6)寒天培地上と同等の生育を示した。
また、 TS B (PH5.6)セルロース培地では、 ex / ^ひ s NBRC5367 が産生するセル ラ一ゼによって、 セルロースが分解し、 溶班 ひ、口一） を形成した。 セルロース培地が セルラ一ゼ産生菌のスクリ一ニングに利用可能であることがわかった。 実施例 7 ：
(viii)セルロース固体培地による好熱好酸性菌の培養
LB(pH 7)培地の代わりに B A培地を用い、 実施例 1と同様にして BAセルロース培 地を調製した。 好熱好酸性アリシクロバチルス ァシドカルダリス ； FCM5260 株 (Alicyclobacillus acidocaldarius JCM5260) は、 あらかじめ BA培地中、 7 Ot:で A6QQが 0. 5になるまで前培養を行った。 この培養液 0. lmLを BAセルロース培地 上にスプレッダ一を用いて植菌し、 70°Cで 1 8〜2 4時間培養した。 比較の対照とし て、 B A寒天培地、 B Aジエランガム培地上でも培養を行い、 B Aセルロース培地上で の生育と比較した。 Alicyclobacillus acidocaldarius JCM5260 は、 B Aセルロース培 地、 B Aジエランガム倍地上ではコロニ一を形成した力 S、 B A寒天培地ではコロニー形 成が見られなかった。
また L B (pH 7)培地の代わりに S U L F〇 L O B U S培地を用い、 実施例 1と同様に して SULFOLOBUSセルロース培地を調製した。好熱好酸性サルホロバス ァシ ドカルダリス DSM639株 (Sulfolobus acidocaldarius DSM639) は、 あらかじめ SUL FOLOBUS培地中、 70°Cで A6。。が 0. 8になるまで前培養を行った。 この培養 液を 1 03倍に SULFOLOBUS培地で希釈し、 その 0. lmLを SULFOLO BUSセルロース培地上にスプレッダ一を用いて植菌し、 7 0°Cで 4日間培養した。 比 較の対照として、 SULFOLOBUS寒天培地、 SULFOLOBUSジエランガム 培地上でも培養を行い、 SULFOLOBUSセルロース培地上での生育と比較した。
Sulfolobus acidocaldarius DSM639 は、 SULFOLOBUSセルロース培地、 SU LFOLOBUSジエランガム培地上ではコロニーを形成したが、 SULFOLO BU S寒天培地ではコロニー形成が見られなかった。 また 80°Cでも 6日間培養を行ったと ころ、 SULFOLOBUSセルロース培地上で 5〜6個、 SULFOLOBUSジェ ランガム培地上で 1個のコロニーを形成し、 SULFOLOBUSセルロース培地上で、 より良好な生育を示した。 実施例 8 ：
(ix) セルロース固体培地による好熱菌の培養
LB (pH7)培地の代わりに TM培地を用い、 実施例 1と同様にして、 TMセル口一ス 培地を調製した。好熱菌サ一マスサーモフィルス HB8 (Thermus therinophi lusm) は、 あらかじめ TM培地を用いて 70 で A6。Qが 1〜： L. 5になるまで前培養を行った。 この培養液を 1 05倍まで 0. 9 %塩化ナトリゥム水溶液で希釈し、 その 0. 1 mLを TMセルロース培地上にスプレッダ一を用いて植菌し、 70°Cに保ったインキュベータ 一中で、 1 7時間培養した。 比較の対照として、 TM寒天培地でも培養を行い、 TMセ ルロース培地上での生育と比較した。 TMジエランガム培地については、 室温で培地が 固まらなかった。 TMセルロース培地、 TM寒天培地上でコロニ一を形成したが、 TM 寒天培地表面の軟化のため、 コロニーの形状がまちまちであった。 TMセルロース培地 上のコロニーは均一の形状であった。 また 8 0 °Cでも 2 4時間培養を行ったところ、 T Mセルロース培地上ではコロニーを形成したが、 TM寒天培地は完全に溶解した。 産業上の利用可能性
本発明のセルロースゲルを使用する固体培地は、 従来の代表的な固体培地である寒 天培地では困難であった高い温度や広い p H範囲、 あるいま種々の塩濃度でも、 軟化 したり溶解することなく、 その性質と形状を安定して保持することができる。 したが つて、 さまざまな微生物の固体培養が可能となり、 有用な酵素や化学物質を産生する 新規な微生物を単離したり、 生産するために利用することができる。

Claims

1 . 培地固化成分としてセルロースゲルを含む固体培地。
口胄
2 . セルロースゲルの結晶化度が 5〜 7 0 %であることを特徴とする、 請求の範囲第 1 項記載の固体培地。 の
3 . 用いるセルロースの分子量が 1 0， 0 0 0〜2 , 0 0 0， 0 0 0であることを特徴 囲
とする、 請求の範囲第 1項または第 2項に記載の固体培地。
4. セルロースゲルが、 セルロースを骨格部分とし、 セルロース濃度が 0 . 0 1 %以上 である多孔質のセルロースゲル構造体であることを特徴とする、 請求の範囲第 1項ない し第 3項のいずれかに記載の固体培地。
5 . セルロースゲルが、 空隙率が 5 0 %以上の多孔質ゲル状構造体であることを特徴と する、 請求の範囲第 1項ないし第 4項のいずれかに記載の固体培地。
6 . セルロースゲルが、 セル口一スをチオシアン酸塩水溶液中で加熱 ·溶解し、 次いで 冷却'固化して得られるゲル状材料であることを特徴とする、請求の範囲第 1項ないし第 5項のいずれかに記載の固体培地。
7 . 溶媒に分散したセルロースを、 機械的混合及び/又は加熱によって溶解又は膨潤さ せ、 次いで冷却及び/又は溶媒の除去により固化させた後、 これに栄養素成分を浸透さ せることを特徴とする、 セルロースゲル固体培地の製造方法。
8 .溶媒に分散したセルロースを加熱することにより溶解し、次いで冷却して固化させ、 溶媒成分を除去した後、 栄養素成分を浸透させることを特徴とする、 請求の範囲第 7項 記載のセルロースゲル固体培地の製造方法。
9. 溶媒がチォシアン酸のアル力リ金属塩またはアル力リ土類金属塩の水溶液であるこ とを特徴とする、 請求の範囲第 7項又は第 8項に記載のセノレロースゲル固体培地の製造 方法。
1 0 . 溶媒がチォシアン酸カルシウムの水溶液であることを特徴とする、 請求の範囲第 7項ないし第 9項のいずれかに記載のセルロースゲル固体培地の製造方法。
1 1 . 溶媒がチォシアン酸カルシウムの飽和水溶液で、 加熱温度が 7 0〜2 0 0 °Cであ ることを特徴とする、 請求の範囲第 7項ないし第 1 0項のいずれかに記載のセルロース ゲル固体培地の製造方法。
1 2. 培地固化成分としてセルロースゲルを用いた固体培地の表面で微生物または細胞 を培養することを特徴とする、 微生物または細胞の培養方法。
1 3 . セルロースゲルを用いた固体培地で培養する微生物が極限環境微生物であること を特徴とする、 請求の範囲第 1 2項に記載の微生物の培養方法。
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