WO2012057064A1 - セルロースゲルからなる培養基材、これを用いた固体培地及びこの培地を用いたセルラーゼ活性検定方法 - Google Patents

セルロースゲルからなる培養基材、これを用いた固体培地及びこの培地を用いたセルラーゼ活性検定方法 Download PDF

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medium
sample
culture substrate
gel
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和紀 名垣
康紀 黒澤
白石　卓夫
茂 出口
美紀子 津留
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極東製薬工業株式会社
独立行政法人海洋研究開発機構
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    • G01N2333/942—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) acting on beta-1, 4-glucosidic bonds, e.g. cellulase

Definitions

  • the present invention relates to a culture substrate for preparing a solid medium used for culturing microorganisms, a solid medium using the culture substrate, a method for producing the culture substrate, and the like.
  • solid culture methods using agar or agarose as a solidifying agent have been used for solid culture methods such as microorganisms. This is because it has advantages such as easy production, easy identification of cultured microorganisms, and easy isolation of microorganisms. However, since these gels dissolve in extreme environments such as high temperature and extreme pH, the microorganisms that can be cultured are limited.
  • Patent Document 1 International Publication WO2005 / 083056 discloses a porous cellulose gel structure in which cellulose is a skeleton part as a medium-solidifying component, the cellulose concentration is 0.01% or more, and the porosity is 50% or more.
  • a solid medium containing cellulose gel as a body and a method for producing the same are described.
  • cellulose is dispersed in a solvent (particularly an aqueous thiocyanate solution), dissolved by stirring and / or heating, and then gelled by cooling and / or solvent removal.
  • this cellulose gel is made from unmodified cellulose, it has a strong resistance to heat, extreme pH, high salt concentration, solubility in water and organic solvents, and the like. Therefore, the produced cellulose gel medium does not dissolve the gel even in an environment called “extreme environment” in the microorganism culture region. Therefore, it is described that this medium can be used under a wider range of culture conditions where a conventional solid medium such as an agar medium could not be used.
  • the solid medium using cellulose gel is softened and separated from water under conditions that are difficult to culture with a solid medium using agarose gel, gellan gum, or silica gel, for example, at a high temperature of 100 ° C. or under strongly acidic or strongly alkaline conditions. It has the excellent advantage that it can be cultivated without having to.
  • Non-Patent Document 1 (Deguchi et al., Soft Matter, (2007), 3, 1170-1175), in order to prepare a cellulose gel medium suitable for microbial culture, the cellulose concentration is 2-3 wt. % Is optimal, and below 1% by weight the gel loses its physical strength and becomes very brittle, making it impossible to apply or disperse microorganisms.
  • the present cellulose gel medium for cultivating microorganisms can be produced only in a very limited range.
  • a cellulose gel having a cellulose concentration suitable as a solid medium in terms of physical strength and smoothness as described above is not transparent and white as in agar or agarose gel medium. Since most colonies of microorganisms are white, the visibility of the colonies is poor on the cellulose gel medium and is not suitable for observing colonies, but there is no room for selection to improve them.
  • Cellulose gel medium is also useful for screening for cellulase-producing bacteria.
  • screening for cellulase-producing bacteria has been performed by a method using carboxymethylcellulose (CMC) or the like, but the use of a cellulose gel medium has dramatically improved the screening efficiency compared to the conventional method.
  • CMC carboxymethylcellulose
  • cellulose which is the material of the cellulose gel medium, is a direct substrate for cellulase, so when cellulose is degraded, it can be visually determined that cellulase-producing bacteria are present at that location. This is because the confirmation work is not required, and it is not necessary to prepare a replica for screening.
  • An object of the present invention is to provide a cellulose gel culture substrate and a method for producing the same for improving the drawbacks of the conventional cellulose gel medium as described above, and producing a cellulose gel medium having good visibility of microbial colonies. To do.
  • Another object of the present invention is to provide a solid medium using this culture substrate.
  • an object of the present invention is to provide a more rapid and efficient screening method for cellulase-producing microorganisms or cellulase activity.
  • a culture substrate composed of a cellulose gel containing cellulose and water as a medium-solidifying component, wherein the cellulose is added to dimethylacetamide containing dimethylacetamide containing 8% (W / V) lithium chloride.
  • a culture substrate characterized in that a solution dissolved at a concentration of 5 mg / mL has a viscosity at 26 ° C.
  • a method for producing a cellulose gel culture substrate comprising the steps of adding solid thiocyanate and then dissolving cellulose by heating and lowering the temperature to solidify; [7] Cellulase production by the test microorganism, comprising the step of bringing the test microorganism or test sample into contact with the solid medium described in [5] and determining the presence or absence or degree of dissolution of the cellulose gel.
  • a method for assaying cellulase activity of a test sample is provided.
  • the cellulose gel culture substrate of the present invention and the solid medium using the same have transparency (light transmittance) comparable to that of an agar medium, Visibility is dramatically improved, and colonies can be easily identified.
  • the cellulose gel culture substrate of the present invention and the solid medium using the same are physically strong, soluble, but have a low cellulose concentration and low gel density. All the advantageous features such as difficulty are retained. Therefore, it can be used in the same manner as a conventional cellulose gel medium for solid culture in an extreme environment such as various microorganisms.
  • the target microorganism in the screening of microorganisms, it is desirable that the target microorganism can be isolated quickly and accurately.
  • the cellulose gel culture substrate of the present invention and the solid medium using the same it is possible to further shorten the time. Can be screened. That is, the cellulose gel culture substrate of the present invention and the solid medium using the same do not require the production of replicas or separate assay for cellulase activity, and the presence or absence or strength of cellulase activity or recombinant cellulase activity of the isolated microorganism. Can be directly assessed visually on the medium.
  • the cellulose gel culture substrate of the present invention and the solid medium using the same have a gel density of about 1/7 to 1/2 as compared with the conventional cellulose gel medium, cellulase is degraded (cellulase). Activity) can be quickly and easily determined in a very short time. Therefore, according to the present invention, it is possible to efficiently search for cellulolytic microorganisms and determine the strength of enzyme activity.
  • the cellulose gel culture substrate of the present invention and the solid medium using the same have a wide selection range of cellulose raw materials, it can have any strength. It can be used for culture.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of molecular weight measurement by gel filtration of various celluloses.
  • Panel (A) shows the molecular weight distribution and peak top molecular weight of each cellulose sample calculated from the calibration curve;
  • Panel (B) shows the gel filtration pattern obtained by injecting each sample.
  • the black thick line represents Sample 1
  • the black thin line represents Sample 2
  • the gray thick line represents Sample 3.
  • the arrow represents the position of the peak top molecular weight of each sample.
  • FIG. 2 shows a photograph of each culture substrate taken from above with a digital camera.
  • Panel (A) is a culture substrate prepared using Sample 1 (cellulose concentration 3%);
  • Panel (B) is Sample 2 (cellulose concentration 1%).
  • FIG. 3 is a view showing a scanning electron micrograph of each culture substrate (magnification of 50,000 times).
  • Panel (A) is sample 1 (cellulose concentration 3%); Panel (B) is sample 2 (cellulose concentration 1%); Panel (C) is a culture prepared using sample 3 (cellulose concentration 1%). It is a substrate.
  • FIG. 4 is a diagram showing the light transmittance of each culture substrate.
  • Panel (A) represents the transmittance of the culture substrate prepared using 1% agar, sample 1 (1% and 3%), and sample 2 (0.5% and 1%), respectively.
  • Panel (B) shows the transmittance of the culture substrate prepared using Samples 1 to 3 (all 1%).
  • FIG. 5 is a diagram showing the stress measured for each culture substrate (cellulose concentration 1%). The arrow represents the maximum stress value.
  • the gray thick line represents Sample 1
  • the black thick line represents Sample 2
  • the black thin line represents Sample 3.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of an E. coli growth test on a cellulose gel medium.
  • Panel (A) is 1% agar
  • Panel (B) is Sample 1 (3%)
  • Panel (C) is Sample 2 (1%)
  • Panel (D) is Sample 2 (0.5%) It is the photograph of the colony produced on the prepared culture medium.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of a growth test of Bacillus subtilis on a cellulose gel medium.
  • Panel (A) is 1% agar
  • Panel (B) is Sample 1 (3%)
  • Panel (C) is Sample 2 (1%)
  • Panel (D) is Sample 2 (0.5%) It is the photograph of the colony produced on the prepared culture medium.
  • FIG. 10 is a view showing a photograph of a cellulose gel medium in which cellulose-degrading bacteria are grown.
  • the cellulose concentration is optimally 2 to 3%, and if the cellulose concentration is reduced, the physical strength cannot be maintained, and it is said that the cellulose concentration is not suitable for use as a medium. Since the viscosity of the high molecular compound increases as the molecular weight increases, the use of cellulose having a high molecular weight, such as bacterial cellulose, can be considered from the viewpoint of enhancement of physical strength.
  • the present inventors contrary to expectation, cannot produce a uniform medium because cellulose gel using such a large molecular weight cellulose at a low concentration causes unpredictable irregular shrinkage, The inventors have found that it is possible to produce a cellulose gel having sufficient strength even at a low concentration by using cellulose having a specific property that is not suitable for use, and completed the present invention.
  • the cellulose used in the present invention may be derived from a microorganism or a plant, but a plant-derived cellulose is preferred.
  • the molecular weight (peak top molecular weight) by gel filtration can be 115,000 to 1,100,000, preferably 115,000 to 550,000.
  • the cellulose used in the present invention has a viscosity at 12 ° C. of 12 to 35 mPa ⁇ S of a solution dissolved in dimethylacetamide containing 8% (W / V) lithium chloride at a concentration of 2.5 mg / mL.
  • 12 to 30 mPa ⁇ S are more preferred, and 12 to 27 mPa ⁇ S are particularly preferred.
  • the cellulose concentration in the cellulose gel culture substrate and medium of the present invention can be as low as 0.1 to 1.8%, preferably 0.2 to 1.5%, most preferably 0.5. ⁇ 1%.
  • the cellulosic gel of the culture substrate and medium of the present invention has a thickness of 2 mm ( ⁇ 0.1 mm) and a total light transmittance at a wavelength of 500 nm of 25% or more, preferably 30% or more and up to 100% at the maximum. .
  • the total light transmittance is measured as follows: Using a spectrophotometer ("Beckman Coulter DU800" or equivalent device), in a transmittance measurement (T%) mode, a cellulose gel (thickness of about 2 mm (2 mm ⁇ 0) at a wavelength of 500 nm and in a petri dish .1 mm)). Let the permeability of the petri dish containing the culture substrate be a blank.
  • the cellulose gel culture substrate basically consists of cellulose gel containing water (and its container).
  • the cellulose gel culture substrate may contain a substance or solvent that dissolves in water, if necessary.
  • optional components include organic solvents that dissolve in water (for example, polar organic solvents such as alcohol (methanol, ethanol, propanol, etc.) and acetone), components of various media such as pH adjusters and pigments, and the like. Can be mentioned.
  • the cellulose gel culture substrate of the present invention can be produced according to conventional methods described in Patent Document 1, Non-Patent Document 1, and the like, but can be preferably produced as follows.
  • Cellulose weighed to a desired concentration is added to a required amount of water calculated in advance and stirred to sufficiently disperse.
  • Solid thiocyanate is added to this so that it may become 50% (W / W) or more, and after sufficiently stirring and mixing at room temperature, the cellulose is dissolved by heating and stirring.
  • the heating temperature is about 90 ° C. to 100 ° C., and the heating time is about 10 to 30 minutes.
  • This solution is dispensed into a predetermined container and solidified by cooling to form a cellulose gel.
  • a culture substrate composed of water and cellulose gel is obtained.
  • alcohol treatment and desalting are performed. Specifically, the alcohol treatment is performed by adding an alcohol (ethanol, methanol, etc.) equal to or higher than cellulose gel (final concentration 50% (V / V)) and shaking for several hours at room temperature. Can do.
  • the desalting step can be performed, for example, by washing with water.
  • the cellulose gel culture substrate produced as described above can be sterilized by a known method.
  • the sterilization method high-pressure steam sterilization (typically about 121 to 20 minutes at 121 ° C.) is preferable.
  • any shape and material such as various sizes of petri dishes (for preparing flat plate medium) and test tubes (for preparing slant medium etc.) can be used.
  • the material is preferably transparent or translucent, and most preferably transparent (for example, glass, plastic, etc.).
  • a solid medium can be produced by adding nutrient components to this culture substrate.
  • the nutrient component is added to a culture substrate by adding a liquid medium (culture solution) having a double volume of the same volume as the cellulose gel volume and replacing the water in the gel to obtain a single concentration. It can be contained in the material.
  • a nutrient component any one can be selected according to the purpose of use from various media of known formulations or those obtained by adding or removing any component based on them.
  • microorganisms that can be cultured using the culture substrate and culture medium of the present invention are very diverse. These microorganisms include conventionally known bacteria, fungi, archaea, etc. that can grow under standard conditions, in extreme environments such as high temperature, extreme pH, and high salt concentration, or in the presence of organic solvents, etc. It can also be used to isolate unknown microorganisms that inhabit special environments.
  • Cellulose constituting the cellulose gel is an original substrate for cellulase. Therefore, unlike the conventional agar medium or cellulose-containing agarose gel medium, the cellulose medium has an advantage that cellulase degrading activity can be directly visually confirmed on the medium. Since the degradation rate of cellulose gel by cellulase depends on the density of cellulose, the presence or absence of cellulase activity can be easily visually discerned by using a low-density gel using low-concentration cellulose. it can. In the cellulose gel culture substrate and the medium of the present invention, the amount of cellulose per unit volume can be reduced to about 1/7 to 1/2 of the conventional cellulose gel plate. Occurring and cellulase activity detection and activity intensity can be observed quickly and easily. Therefore, the medium of the present invention is particularly suitable for screening for cellulase activity or its strength in addition to the culture of various microorganisms as described above.
  • An example of the screening method is as follows.
  • an NB (Nutrient broth) medium or the like is used as a medium, and diluted to about 1/2 to 1/100 of the medium concentration normally used.
  • This medium is infiltrated into the cellulose gel culture substrate of the present invention to prepare a screening medium.
  • a sample for example, a piece of wood, a stem, a leaf, etc. are collected, washed with sterilized water, dried on a filter paper, etc., and subjected to cutting or the like as necessary, and left directly in the medium. .
  • the finely cut sample is suspended in sterilized water and then applied to the medium.
  • This medium is allowed to stand in an incubator and cultured at a constant temperature within a temperature range of 20 ° C.
  • Sample 1 Molecular Weight Measurement by Gel Filtration of Cellulose Samples
  • Sample 2 trade name “Serish”, manufactured by Daicel Chemical
  • Example 3 bacterial cellulose
  • Samples 1 and 2 are plant-derived cellulose. Sample 1 is equivalent to that used in the experiments described in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1.
  • each cellulose sample 150 mg was dispersed in 100 mL of pure water, and the mixture was shaken and stirred at room temperature for 24 hours or more on a shaker (rotation speed: 140 rpm, Takasaki Scientific Instruments; the same applies below). Suction filtration using filter paper was performed, and the collected cellulose sample was redispersed in 100 mL of acetone (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and washed by shaking and stirring on a shaker at room temperature for 24 hours or more.
  • the solution was removed by suction filtration using filter paper, and then washed with dimethylacetamide (DMAc, Wako Pure Chemical Industries). That is, the cellulose sample was redispersed in 100 mL of DMAc, and the mixture was shaken and stirred at room temperature for 24 hours or more on a shaker.
  • DMAc dimethylacetamide
  • molecular weight markers polyethylene glycol (PEG, Kanto Chemical) of various molecular weights and polyethylene oxide (PEO, Kanto Chemical) were added to DMAc containing 1% LiCl so that the final concentration was 0.5 mg / mL.
  • the sizes of the molecular weight markers were 900,000, 580,000, 270,000, 190,000, 100,000, 43,000, 21,000, 6,000, 4,000, thousand, six hundred, four hundred and two hundred. After preparing the molecular weight marker, it was allowed to stand at 40 ° C. until PEG and PEO were dissolved, and centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes, and the supernatant was collected.
  • HPLC analysis was performed as follows. As the analysis model, the product name “Waters 2e2695” manufactured by Waters was used as the HPLC main body, and the product name “differential refractometer 2414” manufactured by Waters was used as the detector.
  • the column is manufactured by Tosoh Corporation under the trade name “TSKgelHSuperAWM-H” (particle diameter 9 ⁇ m, 6.0 mm ID ⁇ 15 cm) ⁇ 2, Tosoh Corporation under the trade name “Guard Column: SuperSKW-H” (4.6 mm ID ⁇ 3.5 cm) was used.
  • the flow rate was 0.6 mL / min, and DMAc containing 1% LiCl was used as the eluent.
  • the sample injection volume was set to 50 ⁇ L, and the column temperature was set to 40 ° C.
  • the differential refractometer was set to polarity (+) and Res (1 s).
  • Panel (A) represents the molecular weight distribution and peak top molecular weight of each cellulose sample calculated from the calibration curve.
  • Sample 1 had a peak top molecular weight of about 100,000
  • sample 2 had a peak top molecular weight of 440,000
  • sample 3 had a peak top molecular weight of 2.5 million.
  • Panel (B) is a diagram showing a pattern of gel filtration obtained by injecting each sample, and is data used to create panel (A).
  • the vertical axis represents the signal intensity obtained from the differential refractometer, and the horizontal axis represents the retention time.
  • cellulose gel culture substrate 3-1 Cellulose Gel Culture Substrate Using Sample 1
  • a cellulose culture substrate having a cellulose concentration of 3% was prepared as follows. Distilled water was added to commercially available calcium thiocyanate (Kanto Chemical) to prepare an aqueous calcium thiocyanate solution so that the final concentration was 57% (W / W) or more. 3 g of cellulose of Sample 1 was added to 100 mL of this calcium thiocyanate solution and stirred at room temperature for 3 hours or more. After 15 mL of the obtained suspension was dispensed into a plastic petri dish having an inner diameter of 8.4 cm, cellulose was dissolved by heating at 120 ° C. for 1 minute. The petri dish was allowed to stand at 4 ° C. for 2 hours, then moved to room temperature, an equal amount or more of methanol (Wako Pure Chemical Industries) was added, and the mixture was shaken for 2 hours using a shaker.
  • methanol Wako Pure Chemical Industries
  • the petri dish was placed in a container filled with tap water, and desalted while flowing water. After 2 hours or more have passed, the tap water is replaced with distilled water, and the electrical conductivity in the desalting vessel is measured using a conductivity meter (TWIN COMPACT METER, HORIBA), and the electrical conductivity is 10 ⁇ S. Desalination was completed when the pressure became less than / cm.
  • the desalted cellulose gel was transferred to a container such as a glass petri dish or a heat-resistant petri dish, and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes.
  • a cellulose gel culture substrate having a cellulose concentration of 1% was prepared in the same manner as described above except that the amount of cellulose in Sample 1 was changed to 1 g.
  • the petri dish was placed in a container filled with tap water, and desalted while flowing water. After 2 hours or more have passed, the tap water is replaced with distilled water, and the electrical conductivity in the desalting vessel is measured using a conductivity meter (TWIN COMPACT METER, HORIBA), and the electrical conductivity is 10 ⁇ S. Desalination was completed when the pressure became less than / cm.
  • the desalted cellulose gel was transferred to a container such as a glass petri dish or a heat-resistant petri dish, and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes.
  • a cellulose gel culture substrate having a cellulose concentration of 0.5% was prepared in the same manner as described above except that the amount of cellulose in Sample 2 was changed to 0.5 g.
  • FIG. 2 shows a photograph of each culture substrate prepared as described above taken with a camera from above.
  • Panel (A) uses sample 1 (cellulose concentration 3%), and panel (B) uses sample 2 (cellulose concentration 1%).
  • the culture substrate using Sample 1 was clearly opaque and white, whereas the culture substrate using Sample 2 was transparent.
  • each culture substrate prepared above was observed using a fine structure scanning electron microscope (model number JSM-6700F, manufactured by JEOL Ltd.) (magnification 50,000 times). The results are shown in FIG. Panel (A) uses sample 1 (cellulose concentration 3%), and panel (B) uses sample 2 (cellulose concentration 1%). Panel (C) is a culture substrate prepared using Sample 3 (cellulose concentration 1%). From the electron micrographs, it was confirmed that all the culture substrates formed a network structure having cellulose as a skeleton part made of nanofibers, and were porous structures having large voids.
  • a spectrophotometer (“Beckman Coulter DU800”) is used, and the transmittance measurement (T%) mode is used at wavelengths from 300 nm to 800 nm.
  • the cellulose gel in the petri dish was scanned.
  • the thickness of each cellulose gel was about 2 mm (2 mm ⁇ 0.1 mm), and the permeability of the petri dish containing the culture substrate was used as a blank.
  • the transmittance of the cellulose gel was evaluated by a measured value at a wavelength of 500 nm. For comparison, the same measurement was performed on a culture substrate using 1% agar (Shimizu Foods, trade name “Taiyo-Agar, BMM-5”).
  • Panel (A) represents the transmittance of 1% agar, Sample 1 (1% and 3%), Sample 2 (0.5% and 1%).
  • Panel (B) represents the transmittance of samples 1 to 3 (all are 1%).
  • the transmittance at a wavelength of 500 nm is 45.8% (SD ⁇ 4.2) at a cellulose concentration of 1% and 74.0% (SD ⁇ 1 at a cellulose concentration of 0.5% in the culture substrate using the sample 2. 3).
  • the transmittance of Sample 2 with a cellulose concentration of 0.5% was comparable to that of agar.
  • the culture substrate using Sample 1 uses 12.5% (SD ⁇ 1.0) at 3% cellulose concentration, 51.4% (SD ⁇ 4.0) at 1% cellulose concentration, and uses Sample 3.
  • the cellulose concentration was 23.0% (SD ⁇ 2.0) at 1%.
  • the stress of each culture substrate was measured.
  • the measurement result of the cellulose concentration of 1% is shown in FIG.
  • the maximum stress values are 0.14 ⁇ 0.08 N for the culture substrate prepared using Sample 1, 0.47 ⁇ 0.07 N for the culture substrate prepared using Sample 2, and Sample 3 It was 0.23 ⁇ 0.02N in the culture substrate using the above.
  • Sample 2 with a cellulose concentration of 0.5% it was 0.14 ⁇ 0.00N
  • Sample 1 with a cellulose concentration of 3% it was 0.88 ⁇ 0.04N. It was shown that the cellulose gel produced by Sample 2 has a higher stress value than the cellulose gel produced by Samples 1 and 3 having the same concentration.
  • Tensile strength The tensile strength of each culture substrate was measured. Tensile strength was measured by using a rheometer CR-500DX-SII manufactured by Sun Science Co., Ltd. as follows. A test specimen (thickness 2 mm ⁇ 0.1 mm) was prepared by cutting a gel sample of each culture substrate into a dumbbell shape having a width of 1 cm and a length of 3 cm. The test piece was set on a measuring machine, the sample stage was moved at a speed of 0.42 mm / 1 second, and the force required for cutting and the tensile distance when the gel was cut were measured.
  • the test piece of sample 1 having a cellulose concentration of 1% could not be placed on the measuring machine due to insufficient strength and could not be measured.
  • the culture substrate produced with the cellulose concentration of 1% of the sample 2 required less cutting force than the culture substrate produced with the cellulose concentration of 3% of the sample 1, but the tensile distance was the cellulose concentration of the sample 1 of 3 % Was about twice as large as the culture substrate prepared. This has shown that the culture base material produced using the sample 2 is a gel excellent in the elasticity.
  • Pre-culture of the fungi was performed using a soy soy blood agar medium (sheep) no. 2 (Kyokuto Pharmaceutical) at 37 ° C. for 18-24 hours by aerobic culture.
  • the obtained colonies were collected and suspended in a physiological saline that had been autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes to prepare a bacterial solution of McFarland # 0.5. Further, this bacterial solution was diluted 50,000 times with sterilized physiological saline. 50 ⁇ L of the bacterial solution was inoculated into each assay solid medium and spread evenly with a congeal bar.
  • Panel (A) is agar medium (1%)
  • panel (B) is sample 1 (3%)
  • panel (C) is sample 2 (1%)
  • panel (D) is sample 2 (0.5%)
  • the photographs taken from above of the colonies generated in the medium are respectively shown.
  • the colonies on the medium using the sample 2 were easily visible as in the agar medium.
  • E. coli showed the same growth in any solid medium (panel (E)).
  • Pre-culture of the fungi was performed using a soy soy blood agar medium (sheep) no. 2 (Kyokuto Pharmaceutical) at 37 ° C. for 18-24 hours by aerobic culture.
  • the obtained colonies were collected and suspended in a physiological saline that had been autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes to prepare a bacterial solution of McFarland # 0.5.
  • this bacterial solution was diluted 10,000 times with sterilized physiological saline.
  • 50 ⁇ L of the bacterial solution was inoculated into each assay solid medium and spread evenly with a congeal bar.
  • the culture was performed by aerobic culture at 35 ° C. for 18 hours.
  • Panel (A) is agar medium (1%)
  • panel (B) is sample 1 (3%)
  • panel (C) is sample 2 (1%)
  • panel (D) is sample 2 (0.5%)
  • the photographs taken from above of the colonies generated in the medium are respectively shown.
  • the colonies on the medium using the sample 2 were easily visible as in the agar medium.
  • E. coli showed the same growth in any solid medium (panel (E)).
  • Panel (A) is agar medium (1%)
  • panel (B) is sample 1 (3%)
  • panel (C) is sample 2 (1%)
  • panel (D) is sample 2 (0.5%)
  • the photographs taken from above of the colonies generated in the medium are respectively shown.
  • the colonies on the medium using the sample 2 were easily visible as in the agar medium.
  • E. coli showed the same growth in any solid medium (panel (E)).
  • S. degradans DSM 17024 was used as a culture test strain using 5-4 cellulase-producing bacteria .
  • As the medium for the assay ammonium sulfate (Wako Pure Chemical Industries) was added to a double concentration of Daigo artificial seawater SP solution (Wako Pure Chemical Industries) to 2 mM, and then autoclaved at 121 ° C for 20 minutes. Using. Add 15 mL of the test liquid medium to the various culture substrates prepared as described above, and shake for 2 hours with a shaker (Tytec) to infiltrate the culture substrate, so that the concentration of water in the culture substrate is 1 ⁇ . The medium was replaced with a liquid having the same composition.
  • the culture substrate used was a culture substrate prepared using Sample 1 (cellulose concentration 3%) and Sample 2 (cellulose concentration 1%).
  • Preparation of the culture medium for preculture of bacteria was performed according to the following procedure. 1.87 g of Marine broth (Becton Dickinson & Company) was dissolved in 50 mL of distilled water and stirred well with a magnetic stirrer. A 1% cellobiose (MP ⁇ ⁇ bio.) Solution in distilled water was separately prepared. Marine Broth and cellobiose solution were autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes and cooled to room temperature, and then, Marine broth was filtered through a 0.45 ⁇ m membrane filter in a clean bench. 300 ⁇ L of the cellobiose solution was added to 3 mL of Marine broth and stirred well with a vortex mixer.
  • glycerol-preserved bacterial solution 50 to 100 ⁇ L of glycerol-preserved bacterial solution was dropped into 3 mL of the preculture medium prepared as described above, mixed, and then aerobically cultured at 30 ° C. for 20 to 24 hours to preculture the bacteria.
  • the pre-cultured bacterial solution was diluted with Marine broth solution that had been autoclaved at 121 ° C for 20 minutes to give McFarland # 0.5, and the bacterial solution was further diluted 100 to 500 times with Marine broth solution.
  • 50 ⁇ L of the bacterial solution was inoculated into each assay solid medium and spread evenly with a congeal bar.
  • the culture was performed at 30 ° C. by aerobic culture.
  • Panels (A), (C), and (E) are media for sample 1 (cellulose concentration 3%); panels (B), (D), and (F) are samples 2 (cellulose concentration 1%). Panels (A) and (B) are photographs for 48 hours, and (C) to (F) are photographs showing the surface of the medium after 72 hours of cultivation (panels (A), (B), (E) and (F) )).
  • Panel (A) is the medium of sample 1
  • panel (B) is the medium of sample 2.
  • the size of the hole after 7 days was 1.3 mm for the sample 2 medium, and 0.4 mm for the sample 1 medium.
  • the degradation rate of the cellulose medium by S. degradans was faster in the sample 2 medium than in the sample 1 medium, and it was shown that the presence of degrading bacteria can be confirmed quickly and easily.
  • the transmittance at a wavelength of 500 nm increased with decreasing molecular weight and viscosity (Tables 3 and 4).
  • sample 3 it was already known that when the culture substrate was prepared using untreated cellulose, the gel contracted (Table 1), but this contraction increased the density of the cellulose and inevitably transmitted light. The rate drops.
  • the culture substrate prepared using cellulose after the ball mill treatment has a relative volume% approaching 100% as the treatment time increases. That is, the cellulose density of the cellulose gel decreased with an increase in the treatment time, and the shrinkage of the culture substrate was suppressed accordingly.
  • the transmittance reached its maximum when the ball mill treatment time was 30 hours.
  • the molecular weight and viscosity are reduced by treatment for 5 to 43 hours, and the physical properties of the culture substrate prepared are within the range of this molecular weight reduction (or viscosity reduction). It became clear that it does not affect (transmittance, stress, density). However, with respect to the cellulose of Sample 2 treated for 91 hours, the physical properties of the prepared culture substrate were very brittle.

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Abstract

　本発明は、従来のセルロースゲル培地の欠点を改良した、微生物コロニーの視認性のよいセルロースゲル培地、これを作製するためのセルロースゲル培養基材及びその製造方法、ならびにより迅速で効率のよいセルラーゼ産生微生物又はセルラーゼ活性のスクリーニング法を提供する。　本発明の一つの態様は、培地固化成分としてのセルロースと水とを含有するセルロースゲルからなる培養基材であって、前記セルロースが、当該セルロースを８％(W/V)塩化リチウムを含有するジメチルアセトアミド中に２.５mg/mLの濃度で溶解した溶液の２６℃における粘度が１２～３５mPa・Sであるものであることを特徴とする、培養基材である。

Description

セルロースゲルからなる培養基材、これを用いた固体培地及びこの培地を用いたセルラーゼ活性検定方法
　本発明は、微生物等の培養に用いる固体培地作製のための培養基材、この培養基材を用いた固体培地、及び前記培養基材の製造方法等に関する。
　微生物等の固体培養法には、従来から寒天（アガー）又はアガロースを固化剤として使用した固体培地が使用されている。この理由は、作製が容易で、培養された微生物を目視で容易に判別しやすく、微生物の単離を容易に行える等の利点を有しているからである。しかし、これらの固体培地は、高温や極端なｐＨ等の極限環境下ではゲルが溶解してしまうため、培養できる微生物が制限される。
　このような極限環境下での微生物の培養を可能にするために、セルロースのみを固化剤としたセルロースゲル培地が開発された。例えば、特許文献１（国際公開公報ＷＯ２００５／０８３０５６）には、培地固化成分として、セルロースを骨格部分とし、セルロース濃度が０．０１％以上、空隙率が５０％以上である多孔質のセルロースゲル構造体であるセルロースゲルを含む固体培地及びその製造方法が記載されている。この発明の固体培地は、セルロースを溶媒（特にチオシアン酸塩水溶液）に分散させて、攪拌及び／又は加熱により溶解し、次いで冷却及び／又は溶媒除去によりゲル化させて得たセルロースゲルに、栄養素を浸透させることによって製造される。このセルロースゲルは、未修飾のセルロースを原料としているため、熱、極端なｐＨ、高塩濃度、水や有機溶媒に対する溶解性等に対しても強い耐性を持つ。そのため、作製されたセルロースゲル培地は、微生物培養領域で「極限環境」と呼ばれる環境においてもゲルが溶解することはない。したがって、この培地は、寒天培地等の従来の固体培地を使用することができなかった、より広い範囲の培養条件下で使用することができることが記載されている。
　このように、セルロースゲルを使用した固体培地は、アガロースゲル、ジェランガム又はシリカゲルを用いた固体培地では培養が困難な条件下、例えば１００℃の高温下や強酸性、強アルカリ性条件下でも軟化、離水することなく培養ができるという優れた利点を持つ。しかし、非特許文献１（Deguchi et al., Soft Matter, (2007), 3, 1170‐1175）には、微生物培養に適したセルロースゲル培地を作製するためには、セルロース濃度は２～３重量％が最適であり、１重量％未満ではゲルの物理強度は失われ、非常に脆くなるため、微生物の塗布又は分散が不可能となることが記載されている。また、セルロース濃度が３重量％を超えると、固化後の培地表面が平らでなくなり、微生物の播種ができなくなることが記載されている。したがって、現状の微生物培養用セルロースゲル培地は、非常に限定された範囲のものしか作製できない。
　さらに、上記のような、物理的強度や平滑性の点で固体培地として適したセルロース濃度のセルロースゲルは、寒天やアガロースゲル培地のような透明性がなく、白色である。微生物の大部分のコロニーは白色系であるため、セルロースゲル培地上ではコロニーの視認性は悪く、コロニーの観察には適していないが、これを向上させるような選択の余地がなかった。
　セルロースゲル培地は、セルラーゼ産生菌のスクリーニングにも有用である。従来、セルラーゼ産生菌のスクリーニングはカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等を使用した方法により行われていたが、セルロースゲル培地の使用により、従来の方法と比較して、スクリーニング効率が飛躍的に向上した。これは、セルロースゲル培地の材料であるセルロースが、セルラーゼの直接の基質であるため、セルロースが分解された場合、その場所にセルラーゼ産生菌が存在することを目視で判断できるので、別途のセルラーゼ活性の確認作業を必要としない、スクリーニング用のレプリカの作製を要しない等の理由によるものである。
　スクリーニングにおいて、作業の効率、特に検出時間の短縮は、その後の開発状況に大きく影響を及ぼすため、スクリーニングの迅速化は恒常的に望まれている。セルラーゼによるセルロースゲルの分解は、セルロース密度が低いほどその影響を顕著に観察することができる。しかし、現状ではセルロースゲル中のセルロース濃度を低減させることが不可能であったため、これ以上の迅速化は望めなかった。また、セルロース培地が白色を呈しているため、分解により生じた穴の確認が培養初期段階においては困難であった。
国際公開公報ＷＯ２００５／０８３０５６（発明の名称：「セルロース固体培地とその製造方法」）
Deguchi et al., Preparation and characterization of nanofibrous cellulose plate as a new solid support for microbial culture.  Soft Matter, (2007), 3, p.1170-1175
　本発明は、上記のような従来のセルロースゲル培地の欠点を改良し、微生物コロニーの視認性のよいセルロースゲル培地を作製するためのセルロースゲル培養基材及びその製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、この培養基材を使用した固体培地を提供することを目的とする。さらに、本発明は、より迅速で効率のよいセルラーゼ産生微生物又はセルラーゼ活性のスクリーニング法を提供することを目的とする。
　本発明によれば、
　〔１〕　培地固化成分としてセルロースと水とを含有するセルロースゲルからなる培養基材であって、前記セルロースが、当該セルロースを８％(W/V)塩化リチウムを含有するジメチルアセトアミド中に２.５mg/mLの濃度で溶解した溶液の２６℃における粘度が１２～３５mPa・Sであるものであることを特徴とする、培養基材；
　〔２〕　前記セルロースゲルの厚さ２mmの波長５００nmでの光線透過率が、２５％以上である、前記〔１〕記載の培養基材；
　〔３〕　前記セルロースのゲルろ過によるピークトップ分子量が、１１５，０００～１,１００，０００である、前記〔１〕又は〔２〕記載の培養基材；
　〔４〕　容器に収容されている、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載の培養基材；
　〔５〕　前記セルロースゲルが栄養成分を含む前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項記載の培養基材からなることを特徴とする固体培地；
　〔６〕　８％(W/V)塩化リチウムを含有するジメチルアセトアミド中に２.５mg/mLの濃度で溶解した溶液の２６℃における粘度が１２～３５mPa・Sであるセルロースを水に分散させ、固形チオシアン酸塩を添加した後、セルロースを加熱溶解させ、温度を下げて固化させる工程を含むことを特徴とする、セルロースゲル培養基材の製造方法；
　〔７〕　前記〔５〕記載の固体培地に被検微生物又は被検試料を接触させ、セルロースゲルの溶解の有無又は程度を判定する工程を含むことを特徴とする、被検微生物によるセルラーゼ産生又は被検試料のセルラーゼ活性の検定方法、が提供される。
　本発明のセルロースゲル培養基材及びそれを用いた固体培地は、寒天培地と同程度の透明性（光線透過率）を有するため、従来のセルロースゲル培地の欠点であった培地上でのコロニーの視認性が飛躍的に向上しており、コロニーの判別が容易に行えるようになる。また、本発明のセルロースゲル培養基材及びそれを用いた固体培地は、セルロース濃度が低く、ゲルが低密度であるにもかかわらず、従来のセルロースゲル培地が有する、物理的に強い、溶解しにくい等の有利な特徴をすべて保持している。そのため、種々の微生物等の極限環境下における固体培養に、従来のセルロースゲル培地と同様に使用できる。
　また、微生物のスクリーニングにおいては迅速に且つ正確に目的の微生物の単離作業が行えることが望ましいが、本発明のセルロースゲル培養基材及びそれを用いた固体培地を使用することにより、さらに短時間でのスクリーニングが可能になる。すなわち、本発明のセルロースゲル培養基材及びそれを用いた固体培地は、レプリカの作製や別途のセルラーゼ活性のアッセイを必要とせず、単離した微生物のセルラーゼ活性や組換えセルラーゼ活性の有無又は強弱を培地上で直接目視で評価することができる。さらに、本発明のセルロースゲル培養基材及びそれを用いた固体培地は、従来のセルロースゲル培地と比較してゲル密度が１／７～１／２程度であるため、セルラーゼの分解の様子（セルラーゼ活性）を非常に短い時間で迅速に且つ容易に判断することができる。したがって、本発明によれば、セルロース分解微生物の探索やその酵素活性の強弱を判定する作業の効率化が可能となる。
　また、本発明のセルロースゲル培養基材及びそれを用いた固体培地は、セルロース原料の選択範囲が広いため、任意の強度とすることが可能であり、微生物培養用以外にも、例えば植物のカルス培養などに使用が可能である。
図１は、各種セルロースのゲルろ過による分子量測定の結果を表す図である。パネル（Ａ）は、検量線から算出した各セルロース試料の分子量分布及びピークトップ分子量；パネル（Ｂ）は、各試料をインジェクションして得られたゲルろ過のパターンを表す図である。黒の太線は試料１、黒の細線は試料２、グレーの太線は試料３をそれぞれ表す。矢印は、各試料のピークトップ分子量の位置を表す。 図２は、各培養基材を上からデジタルカメラにて撮影した写真を示す。パネル（Ａ）は、試料１（セルロース濃度３％）；パネル（Ｂ）は試料２（セルロース濃度１％）をそれぞれ用いて作製した培養基材である。 図３は、各培養基材の走査型電子顕微鏡写真を示す図である（倍率５０,０００倍）。パネル（Ａ）は、試料１（セルロース濃度３％）；パネル（Ｂ）は試料２（セルロース濃度１％）；パネル（Ｃ）は、試料３（セルロース濃度１％）をそれぞれ用いて作製した培養基材である。 図４は、各培養基材の光線透過率を表す図である。パネル（Ａ）は、１％寒天、試料１（１％及び３％）、試料２（０．５％及び１％）をそれぞれ用いて作製した培養基材の透過率を表す。パネル（Ｂ）は、試料１～３（いずれも１％）をそれぞれ用いて作製した培養基材の透過率を表す。「ａ」の線は１％寒天（比較例）、「ｂ」の線は試料２（０．５％）、「ｃ」の線は試料２（１％）、「ｄ」の線は試料１（１％）、「ｅ」の線は試料１（３％）、「ｆ」の線は試料３（１％）をそれぞれ表す（ｎ＝３）。 図５は、各培養基材（セルロース濃度１％）について測定した応力を示す図である。矢印は、最大応力値を表す。グレーの太線は試料１、黒の太線は試料２、黒の細線は試料３をそれぞれ表す。 図６は、試料１（３％）及び試料２（１％）をそれぞれ用いて作製した培養基材の引張り強度を示す図である（ｎ＝３）。点線は試料１（３％）、グレーの線は試料２（１％）をそれぞれ表す。 図７は、セルロースゲル培地上での大腸菌の生育試験の結果を示す図である。パネル（Ａ）は１％寒天、パネル（Ｂ）は試料１（３％）、パネル（Ｃ）は試料２（１％）、パネル（Ｄ）は試料２（０．５％）を固化剤とした培地上に生じたコロニーの写真である。パネル（Ｅ）は各培地上に生じたコロニー数を示す図である（ｎ＝９）。 図８は、セルロースゲル培地上での枯草菌の生育試験の結果を示す図である。パネル（Ａ）は１％寒天、パネル（Ｂ）は試料１（３％）、パネル（Ｃ）は試料２（１％）、パネル（Ｄ）は試料２（０．５％）を固化剤とした培地上に生じたコロニーの写真である。パネル（Ｅ）は各培地上に生じたコロニー数を示す図である（ｎ＝９）。 図９は、セルロースゲル培地上での酵母菌の生育試験の結果を示す図である。パネル（Ａ）は１％寒天、パネル（Ｂ）は試料１（３％）、パネル（Ｃ）は試料２（１％）、パネル（Ｄ）は試料２（０．５％）を固化剤とした培地上に生じたコロニーの写真である。パネル（Ｅ）は各培地上に生じたコロニー数を示す図である（ｎ＝９）。 図１０は、セルロース分解菌を生育させたセルロースゲル培地の写真を示す図である。パネル（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）は試料１（３％）、パネル（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）は試料２（１％）を固化剤とした培地上に生じたコロニー（溶解穴）の写真である。培養時間は、パネル（Ａ）及び（Ｂ）は４８時間、パネル（Ｃ）～（Ｆ）は７２時間である。１目盛＝０．１mm。 図１１は、セルロース分解菌を生育させたセルロース培地の写真を示す図である。パネル（Ａ）は試料１（３％）、パネル（Ｂ）試料２（１％）を固化剤とした培地上に培養７日後に生じたコロニーの写真である。矢印はコロニー（溶解穴）の位置を示す。１目盛＝０．１mm。
　従来のセルロースゲル培地では、セルロース濃度は２～３％が最適であり、セルロース濃度を低減させると物理強度が保てず、培地として使用に適さないとされていた。高分子化合物は、分子量が大きくなるほど粘性が増加することから、物理強度の増強という点からすると、分子量の大きいセルロース、例えばバクテリアセルロースの使用が考えられる。しかし、本発明者らは、予想に反して、このような分子量の大きいセルロースを低濃度で用いたセルロースゲルは予測不能な不規則な収縮を起こすため均一な培地を作製することができず、使用に適さないこと、ある特定の性質を有するセルロースを用いることにより低濃度でも十分な強度を有するセルロースゲルの作製が可能であることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明において使用されるセルロースとしては、微生物由来又は植物由来のいずれでもよいが、植物由来のセルロースが好ましい。ゲルろ過による分子量（ピークトップ分子量）は、１１５，０００～１,１００，０００であることができ、１１５，０００～５５０，０００が好ましい。本発明において使用されるセルロースは、８％(W/V)塩化リチウムを含有するジメチルアセトアミド中に２.５mg/mLの濃度で溶解した溶液の２６℃における粘度が、１２～３５mPa・Sであるものが好ましく、１２～３０mPa・Sがさらに好ましく、１２～２７mPa・Sが特に好ましい。
　本発明のセルロースゲル培養基材及び培地におけるセルロース濃度は、０．１～１．８％程度の低濃度とすることができ、好ましくは０．２～１．５％、最も好ましくは０．５～１％である。
　上記のようなセルロースを上記の濃度で用いることにより、従来のものと比較して透明性が高く、寒天培地に匹敵する透明性を有するセルロースゲルの製造が可能となる。本発明の培養基材及び培地のセルロースゲルは、厚さ２mm（±０．１mm）で波長５００nmでの全光線透過率が２５％以上であり、好ましくは３０％以上、最大１００％までである。なお、全光線透過率は、以下のとおりに測定する：
　分光光度計（「ベックマン・コールター DU800」又は同等の機器）を使用し、透過率測定（Ｔ％）モードにて、波長５００nmで、シャーレに収容されたセルロースゲル（厚さ約２mm（２mm±０．１mm））を測定する。培養基材を収容したシャーレの透過率をブランクとする。
　セルロースゲル培養基材は、基本的には水を含んだセルロースゲル（及びその収容容器）からなっている。セルロースゲル培養基材には、上記以外に、必要に応じて、水に溶解する物質又は溶媒を含有させても良い。このような任意の成分としては、水に溶解する有機溶媒（例えばアルコール（メタノール、エタノール、プロパノール等）やアセトンなどの極性有機溶媒）、ｐＨ調整剤や色素などの各種の培地の構成成分などが挙げられる。
　本発明のセルロースゲル培養基材は、特許文献１及び非特許文献１等に記載された従来の方法にしたがって製造することができるが、好ましくは以下のようにして製造することができる。所望の濃度となるように計量したセルロースを、予め算出した必要量の水に添加して攪拌することにより、十分に分散させる。これに固形のチオシアン酸塩を５０％(W/W)以上になるように添加し、室温で十分に攪拌混合した後、加熱攪拌することによりセルロースを溶解させる。加熱温度は９０℃～１００℃程度が適温であり、加熱時間は１０分～３０分程度である。この溶液を所定の容器に分注し、冷ますことによって固化させ、セルロースゲルを形成させる。その後、十分に脱塩することにより、水とセルロースゲルとからなる培養基材が得られる。例えば、固化後、アルコール処理及び脱塩を行う。具体的には、アルコール処理は、セルロースゲルと等量（終濃度５０％（V/V））以上のアルコール（エタノール、メタノール等）を添加して数時間室温で振とうすること等により行うことができる。脱塩工程は、例えば水洗により行うことができる。
　上記のようにして製造したセルロースゲル培養基材は、公知の方法によって滅菌することができる。滅菌方法としては、高圧蒸気滅菌（典型的には１２１℃で１５～２０分程度）が好ましい。
　上記のセルロースゲルを収容する容器としては、各種サイズのシャーレ（平板培地作製用）や試験管（斜面培地等作製用）等、任意の形状及び材質のものを利用することができる。微生物の視認性の点から、材質は、透明又は半透明のものが好ましく、透明のもの（例えばガラス、プラスチック等）が最も好ましい。
　この培養基材に栄養成分を含ませることにより、固体培地を作製することができる。栄養成分は、例えば、培養基材に、セルロースゲル体積と同容積の２倍濃度の液体培地（培養液）を添加し、ゲル内の水と置換させて１倍濃度とすることにより、培養基材に含有させることができる。栄養成分としては、使用目的に応じて、公知の処方の各種培地又はそれらに基づいて任意の成分を添加又は除去したもの等から、任意のものを選択することができる。
　本発明の培養基材及び培地を使用して培養可能な微生物は、非常に多岐にわたる。これらの微生物としては、標準的な条件下で生育可能な従来公知の細菌、真菌、古細菌等に加え、高温、極端なｐＨ、高塩濃度等の条件の極限環境下又は有機溶媒存在下等の特殊環境下に生息する未知の微生物の単離にも使用することができる。
　セルロースゲルを構成するセルロースは、セルラーゼの本来の基質である。そのため、セルロース培地は、従来の寒天培地又はセルロース含有アガロースゲル培地と違い、セルラーゼの分解活性を培地上で、直接目視で確認できる利点がある。セルラーゼによるセルロースゲルの分解速度はセルロースの密度に依存しているため、低濃度のセルロースを用いた低密度のゲルを使用することにより、容易にセルラーゼ活性の有無等を視覚的に判別することができる。本発明のセルロースゲル培養基材及び培地は、単位体積あたりのセルロース量を従来のセルロースゲルプレートの１／７～１／２程度にすることができるので、セルラーゼによるゲルの分解が迅速かつ広範囲で起こり、セルラーゼ活性の検出及び活性の強弱も迅速かつ容易に観察することができる。したがって、本発明の培地は、上記のとおり各種微生物の培養に加えて、セルラーゼ活性又はその強度についてのスクリーニングに特に適している。
　スクリーニング方法の一例は、以下のとおりである。例えば培地としてＮＢ（Nutrient broth）培地等を使用し、通常使用する培地濃度の１／２～１／１００程度に希釈する。この培地を本発明のセルロースゲル培養基材に浸透させてスクリーニング用培地を作製する。試料としては、例えば木片、茎、葉等を採取し、滅菌水で洗浄した後、ろ紙等の上で乾燥させ、必要に応じて裁断等を行ったものを試料とし、培地に直接静置する。あるいは、細かく裁断した試料を滅菌水等に懸濁した後、培地に塗布する。この培地をインキュベーターに静置して、２０℃～４０℃の温度範囲内の一定の温度で、適当な時間、培養を行う。培養後、セルロースゲルの溶解により生じる穴の大きさ、数等を目視で観察し、陽性及び陰性コントロールと比較することにより、試料中のセルラーゼ活性又はセルラーゼ産生微生物の有無又は活性の強弱を判定することができる。
　以下、本発明のセルロースゲル培養基材及び固体培地の製造例及び試験例に基づいて、本発明をさらに説明する。なお、以下においては、「％」は特に示さない限り「％（W/V）」である。
１．セルロース試料のゲルろ過による分子量測定
　セルロース試料として、商品名「Avicel」、Merck社製（「試料１」）、商品名「セリッシュ」、ダイセル化学製（「試料２」）、及びバクテリアセルロース（ＢＣ）（「試料３」）を使用した。試料１及び２は、植物由来セルロースである。なお、試料１は、特許文献１及び非特許文献１において記載された実験において使用されたものと同等である。
　各セルロース試料１５０ mgを純水１００ mLに分散し、振とう機（回転数：１４０rpm, 高崎科学器械；以下も同じ）上で室温で２４時間以上振とう攪拌した。ろ紙を用いた吸引ろ過を行い、集めたセルロース試料をアセトン（和光純薬工業）１００ mL中に再分散させ、振とう機上で室温で２４時間以上振とう攪拌することにより洗浄した。
　次に、ろ紙を用いた吸引ろ過にて脱液した後、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ、和光純薬工業）で洗浄した。すなわち、ＤＭＡｃ　１００mL中にセルロース試料を再分散させ、振とう機上で室温で２４時間以上振とう攪拌した。
　ろ紙を用いた吸引ろ過にて脱液した後、ろ紙に試料をはさみ、余分な液体を除去した。室温にて一晩真空乾燥を行い、８％ ＬｉＣｌ（和光純薬工業）を含むＤＭＡｃを、試料濃度が１０ mg/mLになるように加え、溶解するまで４０℃で静置した。１％ ＬｉＣｌを含むＤＭＡｃにてそれぞれの溶液を２０倍希釈し、高速遠心機 (CF16RXII, 日立製作所)を用いて、１５，０００ rpmで１５分間遠心し、上清を回収した。
　分子量マーカーとして、各種分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ、関東化学）及びポリエチレンオキシド（ＰＥＯ、関東化学）を、それぞれ終濃度が０．５ mg/mLになるように１％ ＬｉＣｌを含むＤＭＡｃに添加した。分子量マーカーのサイズは、９０万、５８万、２７万、１９万、１０万、４．３万、２．１万、６千、４千、千、６百、４百、２百とした。分子量マーカーを調製後、ＰＥＧ及びＰＥＯが溶解するまで４０℃で静置させ、１５，０００ rpmで１５分間遠心し、上清を回収した。
　ＨＰＬＣ分析は以下のとおりに行った。分析機種としては、ＨＰＬＣ本体はWaters社製商品名「Waters e2695」を使用し、検出器としてWaters社製商品名「示差屈折計2414」使用した。カラムは、東ソー社製商品名「TSKgel SuperAWM-H」(粒径９μm、６．０ mm I.D.×１５ cm)×２本、東ソー社製商品名「ガードカラム：TSKguardcolumn SuperAW-H」(４．６ mm I.D.×３．５ cm)を使用した。流速は、０．６ mL/minとし、溶離液には、１％ ＬｉＣｌを含むＤＭＡｃを使用した。サンプル注入量は５０ μL、カラム温度は４０℃に設定した。示差屈折計の設定は、極性（＋）、Res (1s) とした。
　結果を図１に示す。パネル（Ａ）は、検量線から算出した各セルロース試料の分子量分布及びピークトップ分子量を表す。試料１のピークトップ分子量は約１０万、試料２のピークトップ分子量は４４万、試料３のピークトップ分子量は２５０万であった。パネル（Ｂ）は、各試料をインジェクションして得られたゲルろ過のパターンを表す図であり、パネル（Ａ）の作成に使用したデータである。縦軸は示差屈折計から得られたシグナル強度、横軸は保持時間を表す。
　２．セルロース溶液の粘度測定
　セルロース溶液の粘度測定は、エー・アンド・デイ社製音叉振動式粘度計(ＳＶ－１０Ａ)を使用して行った。各セルロース試料を、８％ ＬｉＣｌを含むＤＭＡｃに２.５mg/mLの濃度で溶解させ、２６℃で粘度を測定した。粘度計の較正は、水及び粘度計校正用標準液(日本グリース、ＪＳ－１００)を使用して行った。２６℃での水及び標準液の粘度値は０．９及び５４．０ mPa・Sである。
　その結果、８％ ＬｉＣｌ／ＤＭＡｃ（溶媒）、試料１（ピークトップ分子量１０万）、試料２（ピークトップ分子量４４万）、試料３（ピークトップ分子量２５０万）の粘度は、それぞれ、５．３、７．９、２６．９、４１．４ mPa・Sであった。
３．セルロースゲル培養基材の作製
３－１　試料１を用いたセルロースゲル培養基材
　セルロース濃度３％のセルロース培養基材を、以下のようにして作製した。
　市販のチオシアン酸カルシウム（関東化学）に蒸留水を添加し、終濃度が５７％(W/W)以上になるようにチオシアン酸カルシウム水溶液を調製した。このチオシアン酸カルシウム溶液１００mLに対し、試料１のセルロース３gを添加し、室温で３時間以上攪拌した。得られた懸濁液を内径８．４cmのプラスチック製シャーレに１５mLずつ分注した後、１２０℃、１分間の加熱によりセルロースを溶解した。シャーレを４℃で２時間静置した後、室温に移し、等量以上のメタノール（和光純薬工業）を添加して、振とう機を使用して２時間振とうした。
　振とう後、水道水を張った容器にシャーレを入れ、水を流しながら脱塩を行った。２時間以上経過した後、水道水を蒸留水に置換し、脱塩を行っている容器内の導電率を、導電率計（TWIN COMPACT METER、HORIBA）を使用して測定し、導電率が１０μS/cm以下になった時点で脱塩を終了した。
　脱塩したセルロースゲルをガラスシャーレ又は耐熱性シャーレ等の容器に移し、１２１℃で２０分間高圧蒸気滅菌した。
　また、試料１のセルロース量を１gとした以外は上記と同様にして、セルロース濃度１％のセルロースゲル培養基材を作製した。
３－２　試料２を用いたセルロースゲル培養基材
　試料２のセルロース１ gに対し２９．７ mLの水の割合になるように、セルロースと水とを混合し、ビーカー中で十分に攪拌（１０分間以上）した。チオシアン酸カルシウム（４水和物、関東化学）の終濃度が５０％(W/W)になるよう固形のチオシアン酸カルシウムを添加し、全量１００mLとなった液を室温で３時間以上攪拌した。その後、この溶液を９０℃程度で１０分間攪拌し、内径８．４cmのプラスチック製シャーレに１５mLずつ分注後、１２０℃、１分間の加熱によりセルロースを溶解させた。この加熱処理後、４℃で２時間冷却し、室温の等量以上のエタノール（純正化学）を添加し、室温で２時間振とう処理をした。
　振とう後、水道水を張った容器にシャーレを入れ、水を流しながら脱塩を行った。２時間以上経過した後、水道水を蒸留水に置換し、脱塩を行っている容器内の導電率を、導電率計（TWIN COMPACT METER、HORIBA）を使用して測定し、導電率が１０μS/cm以下になった時点で脱塩を終了した。
　脱塩したセルロースゲルをガラスシャーレ又は耐熱性シャーレ等の容器に移し、１２１℃で２０分間高圧蒸気滅菌した。
　また、試料２のセルロース量を０．５gとした以外は上記と同様にして、セルロース濃度０．５％のセルロースゲル培養基材を作製した。
３－３　試料３を用いたセルロースゲル培養基材
　上記３－２と同様の方法にしたがって、試料３を用いたセルロース濃度１％のセルロースゲル培養基材を作製した。
　このようにして作製した各培養基材の特徴を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１において、「密度」は含有セルロース理論値をセルロースゲルの体積（直径及び厚さをノギス又はレオメーターで測定して算出）で除して算出した。また、「相対体積％」は、各セルロースゲルの体積を、試料１（１％）のセルロースゲルの体積を１００％とし、これに対する相対値（％）として算出した。
４．培養基材の外観及び微細構造等
４－１　外観
　図２に、上記のようにして作製した各培養基材を、上からカメラにて撮影した写真を示す。パネル（Ａ）は試料１（セルロース濃度３％）、パネル（Ｂ）は試料２（セルロース濃度１％）を用いたものである。
　試料１を用いた培養基材は明らかに不透明で白色であるのに対し、試料２を用いた培養基材は透明性を有していた。
４－２　微細構造
　走査型電子顕微鏡（型番ＪＳＭ－６７００Ｆ、日本電子製）を用いて上記で作製した各培養基材の構造を観察した（倍率５０,０００倍）。結果を図３に示す。パネル（Ａ）は試料１（セルロース濃度３％）、パネル（Ｂ）は試料２（セルロース濃度１％）を用いたものである。パネル（Ｃ）は、試料３（セルロース濃度１％）を用いて作製した培養基材である。
　電子顕微鏡写真により、いずれの培養基材もナノファイバー化したセルロースを骨格部分とした網目構造を形成しており、大きな空隙を有する多孔質の構造体であることが確認された。
４－３　透明性
　培養基材の透明性をさらに評価するために、分光光度計（「ベックマン・コールター DU800」）を使用し、透過率測定 (Ｔ％)モードにて３００nm～８００nmまでの波長でシャーレ内のセルロースゲルをスキャンした。セルロースゲルの厚さはいずれも約２mm（２mm±０．１mm）であり、培養基材を収容したシャーレの透過率をブランクとした。セルロースゲルの透過率は波長５００nmでの測定値にて評価した。比較のため、１％寒天（清水食品、商品名「Taiyo-Agar, BMM-5」）を用いた培養基材についても同様に測定した。
　結果を、図４に示す。パネル（Ａ）は、１％寒天、試料１（１％及び３％）、試料２（０．５％及び１％）の透過率を表す。パネル（Ｂ）は、試料１～３（いずれも１％）の透過率を表す。波長５００nmでの透過率は、試料２を用いた培養基材では、セルロース濃度１％で４５．８％（ＳＤ±４．２）、セルロース濃度０．５％で７４．０％（ＳＤ±１．３）であった。試料２のセルロース濃度０．５％の透過率は、寒天に匹敵するものであった。
　一方、試料１を用いた培養基材では、セルロース濃度３％で１２．５％（ＳＤ±１．０）、セルロース濃度１％で５１．４％（ＳＤ±４．０）、試料３を用いた培養基材では、セルロース濃度１％で２３．０％（ＳＤ±２．０）であった。
４－４　応力
　各培養基材の応力測定を行った。応力の測定は、サン科学社製レオメーター　CR-500DX-SIIを使用して、以下のように行った。直径３mmの感圧軸を使用し、１mm/６秒の速度で試料台を移動させ、感圧軸がセルロースゲル（直径６．６～８．４cm×厚さ２mm±０．１mm）表面に接してから１mm押し込むまでの応力の変化をモニターした（ｎ＝３）。最大応力は、感圧軸を１mm押し込んだ時に測定された。
　セルロース濃度１％の測定結果を図５に示す。最大応力値（矢印で示す）は、試料１を用いて作製した培養基材では０．１４±０．０８N、試料２を用いて作製した培養基材では０．４７±０．０７N、試料３を用いた培養基材では０．２３±０．０２Nであった。また、セルロース濃度０．５％の試料２では０．１４±０．００N、セルロース濃度３％の試料１では０．８８±０．０４Nであった。
　試料２で作製したセルロースゲルは同濃度の試料１及び３で作製したセルロースゲルと比較して応力値が高いことが示された。
４－５　引張り強度
　各培養基材の引張り強度を測定した。引張り強度の測定はサン科学社製レオメーター　CR-500DX-SIIを使用して、以下のようにして行った。各培養基材のゲル試料を幅１cm、長さ３cmのダンベル状に切り抜いた試験片（厚さ２mm±０．１mm）を用意した。試験片を測定機にセットし、試料台を０．４２mm/1秒の速度で移動させ、切断に要した力とゲルが切断した時の引張り距離を測定した。
　結果を図６及び表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　試料１のセルロース濃度１％の試験片は、強度不足のため測定機に設置することができず、測定ができなかった。試料２のセルロース濃度１％で作製した培養基材は、試料１のセルロース濃度３％で作製した培養基材よりも、切断に要した力は小さかったが、引張り距離は試料１のセルロース濃度３％で作製した培養基材よりも２倍程度大きかった。このことは、試料２を用いて作製した培養基材が伸縮性に優れたゲルであることを示している。
５．培地の作製及び各種微生物の培養試験
　微生物培養に関連する操作は、滅菌済みの器具及び溶液等を用いて、全て無菌的に行った。
５－１　大腸菌を使用した培養試験
　菌株として、E. coli ＡＴＣＣ　２５９２２を使用した。検定用培地としては普通ブイヨン培地（極東製薬工業）を用いた。上記のように作製した各種培養基材に、１２１℃、２０分で高圧蒸気滅菌済みの２倍濃度の検定用液体培地を１５mL加え、シェーカー（タイテック）にて２時間振とうすることにより、培養基材に浸透させ、培養基材中の水を１倍濃度の培地組成の液体に置換した。２時間後、シャーレ内に余った培地をアスピレータで吸引除去し、クリーンベンチ内で１０分間乾燥させた後、検定用固定培地として使用した。
　菌の前培養を、トリ・ソイ血液寒天培地（ヒツジ）Ｎｏ．２（極東製薬工業）で３７℃、１８～２４時間、好気培養によって行った。得られたコロニーを採取して、１２１℃、２０分で高圧蒸気滅菌済みの生理食塩水に懸濁し、McFarland #0.5の菌液を調製した。更にこの菌液を滅菌済みの生理食塩水で５０，０００倍希釈した。この菌液５０μLを各検定用固体培地に接種し、コンラージ棒で均一に塗り広げた。培養は、３５℃、１８時間、好気培養により行った。菌株の評価は、発育コロニー数を測定することにより行った（ｎ＝９）。
　結果を図７に示す。パネル（Ａ）は寒天培地（１％）、パネル（Ｂ）は試料１（３％）、パネル（Ｃ）は試料２（１％）、パネル（Ｄ）は試料２（０．５％）の培地に生じたコロニーを上から撮影した写真を、それぞれ表す。試料２を用いた培地上のコロニーは、寒天培地上のものと同様、容易に視認できた。また、大腸菌は、いずれの固体培地においても同等の生育を示した（パネル（Ｅ））。
５－２　枯草菌を使用した培養試験
　菌株として、B. subtilis ＡＴＣＣ ６６３３を使用した。検定用培地としては普通ブイヨン培地（極東製薬工業）を用いた。上記のように作製した各種培養基材に１２１℃、２０分で高圧蒸気滅菌済みの２倍濃度の検定用液体培地を１５mL加え、シェーカー（タイテック）にて２時間振とうすることにより、培養基材に浸透させ、培養基材中の水を１倍濃度の培地組成の液体に置換した。２時間後、シャーレ内に余った培地をアスピレータで吸引除去し、クリーンベンチ内で１０分間乾燥させた後、検定用固定培地として使用した。
　菌の前培養を、トリ・ソイ血液寒天培地（ヒツジ）Ｎｏ．２（極東製薬工業）で３７℃、１８～２４時間、好気培養によって行った。得られたコロニーを採取して、１２１℃、２０分で高圧蒸気滅菌済みの生理食塩水に懸濁し、McFarland #0.5の菌液を調製した。更にこの菌液を滅菌済みの生理食塩水で１０，０００倍希釈した。この菌液５０μLを各検定用固体培地に接種し、コンラージ棒で均一に塗り広げた。培養は、３５℃、１８時間、好気培養により行った。菌株の評価は、発育コロニー数を測定することにより行った（ｎ＝９）。
　結果を図８に示す。パネル（Ａ）は寒天培地（１％）、パネル（Ｂ）は試料１（３％）、パネル（Ｃ）は試料２（１％）、パネル（Ｄ）は試料２（０．５％）の培地に生じたコロニーを上から撮影した写真を、それぞれ表す。試料２を用いた培地上のコロニーは、寒天培地上のものと同様、容易に視認できた。また、大腸菌は、いずれの固体培地においても同等の生育を示した（パネル（Ｅ））。
５－３　酵母を使用した培養試験
　菌株として、C. albicans ＡＴＣＣ １０２３１を使用した。検定用培地としてはサブローブドウ糖培地（極東製薬工業）を用いた。上記のように作製した各種培養基材に１２１℃、２０分で高圧蒸気滅菌済みの２倍濃度の検定用液体培地を１５mL加え、シェーカー（タイテック）にて２時間振とうすることにより、培養基材に浸透させ、培養基材中の水を１倍濃度の培地組成の液体に置換した。２時間後、シャーレ内に余った培地をアスピレータで吸引除去し、クリーンベンチ内で１０分間乾燥させた後、検定用固定培地として使用した。
　菌の前培養を、サブロー寒天培地（極東製薬工業）で３７℃、２０～２４時間好気培養によって行った。得られたコロニーを採取して、１２１℃、２０分で高圧蒸気滅菌済みの生理食塩水に懸濁し、McFarland #0.5の菌液を調製した。更にこの菌液を滅菌済みの生理食塩水で２，５００倍希釈した。この菌液５０μLを各検定用固体培地に接種し、コンラージ棒で均一に塗り広げた。培養は、３５℃、２４時間、好気培養により行った。菌株の評価は、発育コロニー数を測定することにより行った（ｎ＝９）。
　結果を図９に示す。パネル（Ａ）は寒天培地（１％）、パネル（Ｂ）は試料１（３％）、パネル（Ｃ）は試料２（１％）、パネル（Ｄ）は試料２（０．５％）の培地に生じたコロニーを上から撮影した写真を、それぞれ表す。試料２を用いた培地上のコロニーは、寒天培地上のものと同様、容易に視認できた。また、大腸菌は、いずれの固体培地においても同等の生育を示した（パネル（Ｅ））。
５－４　セルラーゼ産生菌を使用した培養試験
　菌株として、S. degradans ＤＳＭ １７０２４を使用した。検定用培地としては２倍濃度のダイゴ人工海水ＳＰ溶液（和光純薬工業）に２ mMとなるように硫酸アンモニウム（和光純薬工業）を添加し、１２１℃、２０分で高圧蒸気滅菌したものを用いた。上記のように作製した各種培養基材に検定用液体培地を１５mL加え、シェーカー（タイテック）にて２時間振とうすることにより、培養基材に浸透させ、培養基材中の水を１倍濃度の培地組成の液体に置換した。２時間後、シャーレ内に余った培地をアスピレータで吸引除去し、クリーンベンチ内で１０分間乾燥させた後、検定用固定培地として使用した。使用した培養基材は、試料１（セルロース濃度３％）及び試料２（セルロース濃度１％）を用いて作製した培養基材であった。
　菌の前培養用培地調製は、以下の手順で行った。Marine broth（ベクトンディッキンソンアンドカンパニー） １．８７gを蒸留水５０ mLに溶解し、マグネティックスターラーでよく攪拌した。また、蒸留水中１％セロビオース(MP bio.)溶液を別途調製した。Marine Broth及びセロビオース溶液を１２１℃、２０分で高圧蒸気滅菌し、室温に冷ました後、クリーンベンチ内でMarine brothを０．４５μmのメンブレンフィルターでろ過した。３mLのMarine brothにセロビオース溶液を３００μL添加し、ボルテックスミキサーでよく攪拌した。
　上記のように調製した前培養用培地３mLにグリセロール保存菌液を５０～１００μL滴下し、混合した後、３０℃、２０～２4時間好気培養することにより、菌を前培養した。前培養した菌液を１２１℃、２０分で高圧蒸気滅菌済みのMarine broth 溶液にてMcFarland ＃0.5になるよう希釈し、さらにMarine broth溶液にて菌液を１００～５００倍希釈した。この菌液５０μLを各検定用固体培地に接種し、コンラージ棒で均一に塗り広げた。培養は、３０℃、好気培養により行った。培地上に形成された穴（溶解穴）の直径を、顕微鏡の接眼ミクロメーターを用いて測定した。各培地（ｎ＝３）からランダムに５個の穴を選び、それらの直径の平均値を算出した。
　結果を図１０に示す。パネル（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）は試料１（セルロース濃度３％）；パネル（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）は試料２（セルロース濃度１％）の培地である。パネル（Ａ）及び（Ｂ）は４８時間、（Ｃ）～（Ｆ）は７２時間培養後の培地表面の写真を示す図である（パネル（Ａ）、（Ｂ）、（Ｅ）及び（Ｆ））。
　４８時間の培養後、試料２（セルロース濃度１％）の培地では０．４ mmの穴が観察されたが、試料１を用いた培地では、顕微鏡（ミクロメーター)は測定できない小さな穴しか観察されなかった。さらに、７２時間培養後の穴の大きさを測定したところ、試料２の培地では０．８mmであり、試料１の培地では０．２mmであった。
　さらに、培養７日後においても同様に測定した。結果を図１１に示す。パネル（Ａ）は試料１の培地、パネル（Ｂ）は試料２の培地である。７日後の穴の大きさは、試料２の培地では１．３mmであったのに対し、試料１の培地では０．４mmであった。
　したがって、S. degradansによるセルロース培地の分解速度は、試料１の培地よりも試料２の培地の方が速く、分解菌の存在を早く容易に確認できることが示された。
６．種々のセルロース試料を用いた培養基材の作製
　試料２及び試料３を用い、遠藤貴士著「ボールミル処理による非晶セルロースの調製」（Cellulose Commun., 13 (2): 80-84, 2006）を参考として、種々の分子量のセルロース試料を調製した。
　ボールミル容器（体積１L）へ試料２のセルロース原料を１０g入れ、０、５、１８、３０、４３、９１時間、ボールミル処理を行った。同様に、試料３のセルロース試料については、０、５、１８、３０、４３時間、ボールミル処理を行った。
　処理後の各試料について、上記１．に記載したとおりにゲルろ過により分子量を測定した。また、上記２．に記載したとおりに、セルロース溶液を調製し、溶液の粘度を測定した。さらに、上記３．に記載した方法にしたがって、それぞれの試料を１％のセルロース濃度で含む培養基材を作製し、上記４．に記載したとおりに透過率、最大応力、密度を測定した。
　結果を表３及び４にそれぞれまとめて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　試料２及び試料３のいずれも、ボールミル処理時間の増大とともに分子量の低下及び粘度の低下が起こっていること、及びセルロース分子量と粘度とには正の相関があることが確認された。
　試料２及び３をそれぞれ固化剤として作製した培養基材のいずれについても、波長５００nmでの透過率は分子量及び粘度の減少と共に増加した（表３及び４）。試料３については、未処理のセルロースを用いて培養基材を作製した場合、ゲルが収縮することが既にわかっていたが（表１）、この収縮によりセルロース密度は増加し、必然的に光線透過率が低下する。しかし、ボールミル処理後のセルロースを用いて作製した培養基材は、処理時間の増大と共に相対体積％が１００％に近づいた。すなわち、セルロースゲルのセルロース密度が処理時間の増大と共に低下し、それに伴って培養基材の収縮も抑制されたため、培養基材の透過率が上昇したと考えられる。透過率は、ボールミル処理時間が３０時間の時に最大になった。
　一方、４３時間処理した試料３のセルロースを用いた場合は、密度は低下しているものの、透過率も減少し、透明性が低下していた。この現象は９１時間処理した試料２のセルロースにおいても確認された（表４）。
　試料２を固化剤として作製した培養基材について、５時間～４３時間の処理で分子量及び粘度が低下すること、及びこの分子量の低下（あるいは粘度の低下）の範囲では作製した培養基材の物性（透過率、応力、密度）には影響を与えないこと、が明らかになった。しかし、９１時間処理した試料２のセルロースについては、作製された培養基材の物性が非常に脆いものとなっていた。
　この出願は、平成２２年１０月２９日出願の日本特許出願、特願２０１０－２４４３２７に基づくものであり、特願２０１０－２４４３２７の明細書及び特許請求の範囲に記載された内容は、すべてこの出願明細書に包含される。

Claims (7)

  1. 　培地固化成分としてのセルロースと水とを含有するセルロースゲルからなる培養基材であって、前記セルロースが、当該セルロースを８％(W/V)塩化リチウムを含有するジメチルアセトアミド中に２.５mg/mLの濃度で溶解した溶液の２６℃における粘度が１２～３５mPa・Sであるものであることを特徴とする、培養基材。
  2. 　前記セルロースゲルの厚さ２mmの波長５００nmでの光線透過率が、２５％以上である、請求項１記載の培養基材。
  3. 　前記セルロースのゲルろ過によるピークトップ分子量が、１１５，０００～１,１００，０００である、請求項１又は２記載の培養基材。
  4. 　容器に収容されている、請求項１～３のいずれか１項記載の培養基材。
  5. 　前記セルロースゲルが栄養成分を含む請求項１～４のいずれか１項記載の培養基材からなることを特徴とする固体培地。
  6. 　８％(W/V)塩化リチウムを含有するジメチルアセトアミド中に２.５mg/mLの濃度で溶解した溶液の２６℃における粘度が１２～３５mPa・Sであるセルロースを水に分散させ、固形チオシアン酸塩を添加した後、セルロースを加熱溶解させ、温度を下げて固化させる工程を含むことを特徴とする、セルロースゲル培養基材の製造方法。
  7. 　請求項５記載の固体培地に被検微生物又は被検試料を接触させ、セルロースゲルの溶解の有無又は程度を判定する工程を含むことを特徴とする、被検微生物によるセルラーゼ産生能力又は被検試料のセルラーゼ活性の検定方法。
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