ES2690307T3 - Anticuerpos monoclonales anti-VAP-1 completamente humanos - Google Patents

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ES2690307T3 ES13190488.0T ES13190488T ES2690307T3 ES 2690307 T3 ES2690307 T3 ES 2690307T3 ES 13190488 T ES13190488 T ES 13190488T ES 2690307 T3 ES2690307 T3 ES 2690307T3
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Abstract

Un anticuerpo anti-VAP-1 o un fragmento de unión a VAP-1 del mismo, caracterizado porque es completamente humano y comprende i) tres CDR de polipéptido de cadena pesada representados en los SEQ ID NOs: 4 , 9 y 14, respectivamente, y tres CDR de polipéptido de cadena ligera representados en los SEQ ID NO: 27, 32 y 37, respectivamente; en donde el anticuerpo anti-VAP-1 o un fragmento de unión a VAP-1 del mismo tiene una KD inferior a la de un anticuerpo anti-VAP-1 quimérico denominado BTT-1002, habiéndose estimado KD con un ensayo de resonancia de plasmón superficial de Biacore.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos monoclonales anti-VAP-1 completamente humanos Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales completamente humanos, que reconocen un epítopo funcional de la proteína de adherencia celular endotelial humana VAP-1.
Antecedentes de la invención
Generalmente, los anticuerpos completos comparten una estructura en Y común compuesta por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Estas cuatro subunidades polipeptídicas se ensamblan de manera que las dos cadenas pesadas están unidas, y una cadena ligera está anclada a cada cadena pesada por medio de enlaces disulfuro. Cada polipéptido que constituye el anticuerpo consiste en una región variable y una constante.
La región variable está localizada en los brazos del anticuerpo en forma de Y, y determina la especificidad de unión al antígeno del anticuerpo. Esta región contiene secuencias de aminoácidos cortas, que son responsables de la unión del anticuerpo a su antígeno. Estas regiones se denominan regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Las partes restantes de las regiones variables son importantes para la conformación del bolsillo de unión al antígeno en su totalidad.
La región constante de un anticuerpo está localizada en la base de las cadenas pesadas, y determina la capacidad del anticuerpo para activar las reacciones inmunitarias a través de interacciones con receptores específicos. Estas regiones están generalmente muy conservadas, y la variabilidad está limitada a cinco isoformas básicas, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.
La proteína de adherencia vascular 1 (VAP-1) es una molécula de adherencia, inducible por inflamación, no clásica expresada sobre células endoteliales vasculares, donde media el rodamiento de leucocitos bajo condiciones de cizalla fisiológica. En este papel contribuye a la re-circulación de los linfocitos a través de vénulas endoteliales altas (HEV) de tejido linfoide secundario como parte del proceso normal de vigilancia inmunitaria.
No obstante, en condiciones inflamatorias, VAP-1 promueve la infiltración de leucocitos a tejido inflamado, contribuyendo de ese modo, y manteniendo, la respuesta inflamatoria. Esta infiltración puede a su vez estar perjudicando en enfermedades inflamatorias crónicas tales como artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis y muchas enfermedades autoinmunitarias y otras enfermedades inflamatorias. En otros entornos, la infiltración masiva de células proinflamatorias en el tejido después de un deterioro tisular grave resultante de infarto de miocardio, ictus y otras enfermedades, contribuye a la destrucción del tejido observada en estas respuestas inflamatorias agudas. Es probable que la reducción de la infiltración de células a los sitios de inflamación evitando la función de VAP-1 con anticuerpos bloqueadores permita resolver la inflamación y conducir a una mejora en los síntomas clínicos de estas enfermedades.
La Patente de los Estados Unidos 5580780 describe un anticuerpo monoclonal (mAb), 1 B2, que reconoce VAP-1 y que puede bloquear la unión de los linfocitos a HEV tonsilar en un análisis de sección congelada. El mAb 1 B2 es un anticuerpo IgM murino y es específico para VAP-1.
El uso de mAb murinos como agentes terapéuticos tiene un potencial limitado, puesto que el sistema inmunitario humano reconoce los anticuerpos murinos como material foráneo y produce anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) para aclararlos del organismo. Esta reacción inmunitaria es una limitación principal para el uso de anticuerpos murinos en la terapia a largo plazo cuando se necesitan administraciones repetidas. El uso de anticuerpos anti-VAP- 1 murinos en la medicina clínica podría estar limitado a pacientes tratados con inmunosupresores, y por lo tanto menos propensos a reacciones HAM, y a regímenes de tratamiento, en los que solamente es factible una única administración de los anticuerpos, tal como una lesión por isquemia-reperfusión en un infarto agudo o síndrome de dificultad respiratoria aguda.
Una desventaja adicional relacionada con el uso de anticuerpos anti-VAP-1 IgM murinos en terapia es el perfil cinético desfavorable de tales anticuerpos, esto es, la corta vida media, que los hace inadecuados para su uso en trastornos crónicos, tales como artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis y muchas otras enfermedades.
Se conocen en la técnica diversos métodos de creación de anticuerpos monoclonales menos inmunogénicos. Los enfoques preferidos incluyen "humanizar" los anticuerpos. Las estrategias utilizadas frecuentemente consisten en crear mAb quiméricos, mAb humanizados o mAb completamente humanos. Los mAb quiméricos son anticuerpos en los que la región variable deriva de ratón mientras la región constante es de origen humano. En los anticuerpos quiméricos, aproximadamente 70% de la molécula de anticuerpo de roedor es normalmente remplazado por las correspondientes secuencias humanas a la vez que mantienen los sitios de unión al antígeno de roedor con sus particulares especificidades y afinidades. Los anticuerpos humanizados son anticuerpos en donde la región variable
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puede ser derivada de roedor pero que ha sido mutada con el fin de que se asemeje más a un anticuerpo humano y puede contener una región constante de origen humano. Los anticuerpos completamente humanos son anticuerpos en donde tanto la región variable como la región constante son de origen humano.
La publicación de patente internacional WO 03/093319 describe un anticuerpo monoclonal anti-VAP-1 quimérico BTT-1002, que tiene el potencial de presentar una inmunogenicidad reducida en comparación con los correspondientes anticuerpos murinos. No obstante, al ser un anticuerpo quimérico, BTT-1002 todavía tiene secuencias de proteína correspondientes a las regiones variables del anticuerpo del que derivan directamente y sin modificación del anticuerpo de ratón original. Este anticuerpo todavía puede ser reconocido como foráneo y ser inmunogénico cuando se administra al ser humano. Sus propiedades farmacológicas, tales como su vida media de eliminación y sus propiedades funcionales, también pueden resultar comprometidas debido a su inmunogenicidad y a la producción de anticuerpos resultante contra él.
Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de un anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano con una inmunogenicidad reducida y mejores propiedades farmacológicas.
Breve descripción de la invención
La presente invención está ampliamente dirigida a anticuerpos anti-VAP-1 completamente humanos, a los métodos para producir tales anticuerpos y a los usos de los anticuerpos.
Un objeto de la presente invención es proporcionar anticuerpos monoclonales anti-VAP-1 completamente humanos o fragmentos de unión a VAP-1 del mismo mostrado en las reivindicaciones 1 a 3. Otro objeto de la presente invención hace referencia al uso de dichos anticuerpos en diagnósticos in vivo o in vitro y/o en terapia. Los presentes anticuerpos tienen un potencial reducido para provocar una respuesta inmunitaria en los pacientes y los cuales tienen un perfil farmacológico favorable para fines terapéuticos.
Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar vectores de expresión y células anfitrionas que incorporan ácidos nucleicos que codifican anticuerpos anti-VAP-1 completamente humanos, para la expresión recombinante de anticuerpos anti-VAP-1.
Otra realización de la presente invención está dirigida a métodos para producir los anticuerpos anti-VAP-1 completamente humanos de acuerdo con la presente invención por medio de métodos de producción recombinante.
También se describen las composiciones farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos y los usos terapéuticos de los mismos.
Breve descripción de las figuras
A continuación se describirá la invención con mayor detalle por medio de realizaciones preferidas con referencia a las figuras adjuntas, en las que
Las Figuras 1 a 5 muestran las secuencias de nucleótidos y las correspondientes secuencias de aminoácidos de las regiones variables de los anticuerpos anti-VAP-1 8C10 (Figura 1A-B), 8A4 (Figura 2A-B), 3F10 (Figura 3A-B), 5F12 (Figura 4A-B), y 4B3 (Figura 5A-B). Las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera variable (VL) (A) y la cadena pesada variable (VH) (B) se dedujeron de los ADNc clonados. Las tres CDR de cada cadena de aminoácidos se muestran en negrita con las correspondientes secuencias de nucleótidos subrayadas.
La Figura 6 muestra un alineamiento de la secuencia de proteínas de las regiones variables de la cadena pesada VH de 8C10, 8A4, 3F10, 5F12, y 4B3 que muestra la secuencia consenso (Fig. 6A). Se muestra un alineamiento de las CDR 1 a 3 de la cadena pesada VH con una secuencia consenso en Fig. 6B, Fig. 6C y Fig. 6D. La Figura 6E muestra un alineamiento de la secuencia de proteínas de las regiones variables de la cadena ligera VL de 8C10, 8A4, 3F10, 5F12, y 4B3 que muestra la secuencia consenso. Se muestra un alineamiento de las CDR 1 a 3 de la cadena ligera VL con una secuencia consenso en la Fig. 6F, Fig. 6G y Fig. 6H.
La Figura 7 ilustra la unión a VAP-1 del anticuerpo completamente humano recombinante r8C10 (BTT-1023) para células Ax que expresan VAP-1 humana sobre la superficie de la célula, demostrado por medio de análisis FACS (clasificación celular activada por fluorescencia) de células Ax con VAP-1 teñidas con BTT-1023 en comparación con células teñidas de control.
La Figura 8 ilustra el efecto de BTT-1023 sobre la transmigración de leucocitos in vitro. Se muestra el número de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) transmigradas a través de monocapas de células endoteliales tratadas con anticuerpos BTT-1023 o de control. Las barras de error son el error típico de la media, N= 6.
Descripción detallada de la invención
La presente invención está dirigida a anticuerpos monoclonales (mAb) completamente humanos, preferiblemente producidos recombinantemente que reconocen de manera específica la Proteína de Adherencia Vascular 1 humana, VAP-1. Los anticuerpos monoclonales completamente humanos de acuerdo con la presente invención tienen una
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inmunogenicidad reducida en comparación con los correspondientes anticuerpos humanizados y por tanto son útiles para el tratamiento de numerosas enfermedades autoinmunitarias, afecciones inflamatorias y enfermedades del tejido conectivo, la piel, y el tracto gastrointestinal, el sistema nervioso central, y los sistemas pulmonares, incluyendo afecciones tales como artritis crónicas, enfermedades inflamatorias intestinales, y dermatosis crónicas. Los anticuerpos contra VAP-1 completamente humanos son útiles adicionalmente para aplicaciones de diagnóstico in vitro e in vivo, incluyendo la formación de imágenes inmunoescintográficas in vivo de los sitios de inflamación.
Se pretende que el término "variante de secuencia conservativa" según se utiliza en la presente memoria, incluya modificaciones de la secuencia de nucleótidos y aminoácidos, que no alteran significativamente las propiedades de unión de los anticuerpos anti-VAP-1 completamente humanos de acuerdo con la presente invención. Las variantes de secuencia de nucleótidos conservativas incluyen variantes que se originan a partir de la degeneración del código genético y a partir de mutaciones silenciosas. También están incluidas las sustituciones, deleciones y adiciones de nucleótidos. Las variantes de aminoácidos conservativas incluyen variantes que se originan a partir de sustituciones de aminoácidos con aminoácidos similares bien conocidos en la técnica. También están incluidas las deleciones y adiciones de aminoácidos.
Los polipéptidos y polinucleótidos de acuerdo con la presente invención incluyen aquellos que tienen una identidad de al menos 80%, o una identidad de al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con los anticuerpos anti- VAP-1 completamente humanos o con los polinucleótidos que codifican dichos anticuerpos descritos más abajo.
La presente invención proporciona un anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano o un fragmento de unión a VAP-1 del mismo que comprende tres CDR de polipéptido de cadena pesada representados en los SEQ ID NOs: 4 , 9 y 14, respectivamente, y tres CDR de polipéptido de cadena ligera representados en los SEQ ID NO: 27, 32 y 37, respectivamente; en donde el anticuerpo anti-VAP-1 o un fragmento de unión a VAP-1 del mismo tiene una Kd inferior a la de un anticuerpo anti-VAP-1 quimérico denominado BTT-1002, habiéndose estimado Kocon un ensayo de resonancia de plasmón superficial de Biacore.
La presente invención también proporciona un anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano, o un fragmento de unión a VAP-1 del mismo, que comprende:
i) una región variable de cadena pesada representada en el SEQ ID NO:19 o en sus variantes de secuencia conservativa, y una región variable de cadena ligera representada en el SEQ ID NO: 42 o en sus variantes de secuencia conservativa;
ii) una región variable de cadena pesada representada en el SEQ ID NO:20 o en sus variantes de secuencia conservativa, y una región variable de cadena ligera representada en el SEQ ID NO: 43 o en sus variantes de secuencia conservativa; o
iii) una región variable de cadena pesada representada en el SEQ ID NO:21 o en sus variantes de secuencia conservativa, y una región variable de cadena ligera representada en el SEQ ID NO: 44 o en sus variantes de secuencia conservativa;
donde el anticuerpo anti-VAP-1 o un fragmento de unión a VAP-1 del mismo tiene una Kd inferior a la de un anticuerpo anti-VAP-1 quimérico denominado BTT-1002, habiéndose estimado KDcon un ensayo de resonancia de plasmón superficial de Biacore.
La presente invención también proporciona un anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano, o un fragmento de unión a VAP-1 del mismo, que comprende:
i) una región variable de cadena pesada representada en el SEQ ID NO:19 y una región variable de cadena ligera representada en el SEQ ID NO: 42;
ii) una región variable de cadena pesada representada en el SEQ ID NO:20 y una región variable de cadena ligera representada en el SEQ ID NO: 43; o
iii) una región variable de cadena pesada representada en el SEQ ID NO:21 y una región variable de cadena ligera representada en el SEQ ID NO: 44.
Las moléculas de anticuerpo de la presente invención pueden comprender: una molécula de anticuerpo natural completa, que tiene cadenas pesadas y ligeras completas; un fragmento de la misma, tal como un fragmento Fab, Fab', F(ab')2 o Fv; un monómero o dímero de cadena ligera o cadena pesada; o un anticuerpo de cadena sencilla, p. ej. un Fv de cadena sencilla en el que las regiones variables de la cadena pesada y ligera están unidas por un conector peptídico; o cualquier otra molécula recombinante o injertada con CDR. De un modo similar, la región variable de la cadena pesada y ligera se puede combinar con otros dominios de anticuerpo según sea apropiado.
Es bien sabido en la técnica que el dominio CDR3, independientemente de los dominios CDR1 y/o CDR2, solo puede determinar la especificidad de unión de un anticuerpo para un antígeno cognado y que se pueden generar múltiples anticuerpos de manera predecible que tengan la misma especificidad de unión basándose en una
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secuencia de CDR3 común.
Por consiguiente, la presente descripción proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o más dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo derivado de un animal humano o no humano, en donde el anticuerpo monoclonal es capaz de unirse específicamente a VAP-1. En ciertos aspectos, la presente descripción proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o más dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo no humano, tal como un anticuerpo de ratón o rata, en donde el anticuerpo monoclonal es capaz de unirse específicamente a VAP-1. En algunas realizaciones, tales anticuerpos de la invención que comprenden uno o más dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo no humano (a) son capaces de competir por la unión con; (b) conservan las características funcionales; (c) se unen al mismo epítopo; y/o (d) tienen una afinidad de unión similar a la del correspondiente anticuerpo no humano parental.
En otros aspectos, la presente descripción proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o más dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo humano, tal como, por ejemplo, un anticuerpo humano obtenido de un animal no humano, en donde el anticuerpo humano es capaz de unirse específicamente a VAP-1. En otros aspectos, la presente descripción proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o más dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un primer anticuerpo humano, tal como, por ejemplo, un anticuerpo humano obtenido de un animal no humano, en donde el primer anticuerpo humano es capaz de unirse específicamente a VAP-1 y en donde el dominio CDR3 del primer anticuerpo humano remplaza al dominio CDR3 de un anticuerpo humano que carece de especificidad de unión para VAP-1 para generar un segundo anticuerpo humano que es capaz de unirse específicamente a VAP-1. En algunas realizaciones, tales anticuerpos de la invención que comprenden uno o más dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera del primer anticuerpo humano (a) son capaces de competir por la unión con; (b) conservan las características funcionales; (c) se unen al mismo epítopo; y/o (d) tienen una afinidad de unión similar a la del correspondiente primer anticuerpo humano parental.
Los anticuerpos de la presente descripción se pueden caracterizar adicionalmente por las diversas propiedades físicas de los anticuerpos anti-VAP-1. Se pueden utilizar diferentes análisis para detectar y/o diferenciar las diferentes clases de anticuerpos basándose en estas propiedades físicas.
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente descripción pueden contener uno o más sitios de glicosilación en la región variable de la cadena ligera o pesada. La presencia de uno o más sitios de glicosilación en la región variable puede dar como resultado el aumento de la inmunogenicidad del anticuerpo o una alteración de la farmacocinética del anticuerpo debido a la alteración de la unión al antígeno como es sabido en la técnica. Se ha sabido que la glicosilación se produce en motivos que contienen una secuencia N-X-S/T. La glicosilación de la región variable se puede someter a ensayo utilizando el análisis Glycoblot, que escinde el anticuerpo para producir un Fab, y después somete a ensayo la glicosilación utilizando un análisis que mide la oxidación de peryodato y la formación de bases de Schiff. Alternativamente, la glicosilación de la región variable se puede someter a ensayo utilizando la cromatografía líquida Dionex (Dionex-LC), que escinde los sacáridos de un Fab a monosacáridos y analiza el contenido individual de sacáridos. En algunos casos, se prefiere tener un anticuerpo anti-VAP-1 que no contenga glicosilación en la región variable. Esto se puede lograr seleccionando anticuerpos que no contienen el motivo de glicosilación en la región variable o mutando los residuos del motivo de glicosilación utilizando mecanismos convencionales bien conocidos en la técnica.
En una realización preferida, los anticuerpos de la presente descripción no contienen sitios de isomería de asparragina. Se puede producir un efecto desamidación o ácido isoaspártico en secuencias N-G o D-G, respectivamente. La creación de ácido isoaspártico se puede medir utilizando un análisis Iso-Quant, que utiliza una HPLC de fase inversa para someter a ensayo el ácido isoaspártico.
Cada anticuerpo tendrá un único punto isoeléctrico (pl), pero generalmente los anticuerpos estarán en el intervalo de pH entre 6 y 9,5. El pl para un anticuerpo IgG1 se encuentra típicamente en el intervalo de pH de 7 a 9,5 y el pl para un anticuerpo lgG4 se encuentra típicamente en el intervalo de pH de 6 a 8. Los anticuerpos pueden tener un pl que esté fuera de este intervalo. El punto isoeléctrico se puede someter a ensayo utilizando un análisis de isoelectroenfoque capilar, que crea un gradiente de pH y se puede utilizar un enfoque por láser para aumentar la exactitud como es bien sabido en la técnica. En algunos casos, se prefiere tener un anticuerpo anti-VAP-1 que contenga un valor de pl que se encuentre en el intervalo normal. Esto se puede lograr seleccionado los anticuerpos con un pl en el intervalo normal, o mutando los residuos de la superficie cargada utilizando mecanismos convencionales bien conocidos en la técnica.
Cada anticuerpo tendrá una temperatura de fusión que será indicativa de la estabilidad térmica. Una estabilidad térmica superior indica una estabilidad global mayor del anticuerpo in vivo. El punto de fusión de un anticuerpo se puede medir utilizando mecanismos tales como la calorimetría de barrido diferencial. La TM1 indica la temperatura del desplegamiento inicial del anticuerpo. La TM2 indica la temperatura del desplegamiento completo del anticuerpo. Generalmente, se prefiere que la TM1 de un anticuerpo de la presente descripción sea mayor de 60°C, preferiblemente mayor de 65°C, incluso más preferiblemente mayor de 70°C. Alternativamente, la estabilidad térmica de un anticuerpo se puede medir utilizando el dicroísmo circular como es bien sabido en la técnica.
En una realización preferida, se seleccionan anticuerpos que no se degradan rápidamente. La fragmentación de un
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anticuerpo anti-VAP-1 se puede medir utilizando la electroforesis capilar (CE) y la Espectrometría de Masas con Ionización por Desorción Láser Asistida por Matriz (MALDI-MS), como es bien sabido en la técnica.
En otra realización preferida, se seleccionan anticuerpos que tienen unos efectos de agregación mínimos. La agregación puede conducir al desencadenamiento de una respuesta inmunitaria no deseada y/o alterada o a propiedades farmacocinéticas desfavorables. Generalmente, son aceptables anticuerpos con una agregación de 25% o menos, preferiblemente 20% o menos, incluso más preferiblemente 15% o menos, incluso más preferiblemente 10% o menos e incluso más preferiblemente 5% o menos. La agregación se puede medir por medio de varios mecanismos bien conocidos en la técnica, incluyendo la columna de exclusión por tamaño (SEC), la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), y la dispersión de luz para identificar monómeros, dímeros, trímeros o multímeros.
Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención son preferiblemente de tipo IgG y más preferiblemente de tipo IgG4. No obstante, se incluyen otros isotipos de anticuerpos, tales como IgG1, IgG2, IgG3, IgM e IgE.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de acuerdo con la presente invención comprende regiones variables de cadena pesada y ligera que comprenden secuencias de aminoácidos que son homólogas a las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos preferidos descritos en la presente memoria, y en donde los anticuerpos conservan las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-VAP-1 de la invención.
Por ejemplo, la descripción proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, en donde: (a) la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es homóloga al menos en 80% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 19 a 23; (b) la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos 80% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 42 a 46; (c) el anticuerpo se une a VAP-1 con una Kd de 1 x 10'7 M o menor.
En otras realizaciones descritas, las secuencias de aminoácidos de VH y/o VL pueden ser homólogas en 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a las secuencias mostradas más arriba. Se puede obtener un anticuerpo que tiene regiones VH y VL que tienen una alta homología (esto es, 80% o mayor) con las regiones VH y VL de las secuencias mostradas anteriormente, por medio de mutagénesis (p. ej., mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codifican los SEQ ID NO: 19 a 23 y 42 a 46, seguido del ensayo del anticuerpo alterado codificado para determinar la función conservada.
Según se utiliza en la presente memoria, el porcentaje de homología entre dos secuencias de aminoácidos es equivalente al porcentaje de identidad entre las dos secuencias. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (esto es, % homología = núm. de posiciones idénticas/núm. total de posiciones x 100), tomando en consideración el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden completar utilizando métodos convencionales conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, se pueden diseñar anticuerpos de la invención para que incluyan modificaciones en la región Fc, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como la vida media, la fijación del complemento, la unión al receptor de Fc, y/o la citotoxicidad celular dependiente del antígeno. Además, se puede modificar químicamente un anticuerpo de la invención (p. ej., se pueden anclar uno o más radicales químicos al anticuerpo) o se pueden modificar para alterar su glicosilación, de nuevo para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo.
Por ejemplo, la región Fc se puede alterar remplazando al menos un residuo de aminoácido seleccionado entre los residuos de aminoácido 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 (la numeración de los residuos en la región Fc es la del índice EU de Kabat) por un residuo de aminoácido diferente de manera que el anticuerpo tenga una afinidad alterada para un ligando efector pero conserve la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo parental. El ligando efector para el cual se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor de Fc o el componente Cl del complemento. Este enfoque se describe con mayor detalle, p. ej., en las Patentes de los Estados Unidos 5.624.821 y 5.648.260.
Otra modificación de los anticuerpos de la presente memoria que es contemplada por la invención es la pegilación. Un anticuerpo puede ser pegilado, por ejemplo, para incrementar la vida media biológica (p. ej., en suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, se hace reaccionar típicamente el anticuerpo, o fragmento del mismo con polietilenglicol (PEG), tal como un derivado éster o aldehído reactivo de PEG, en condiciones en las cuales uno o más grupos PEG se anclan al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferiblemente, la pegilación se lleva a cabo por medio de una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que el término "polietilenglicol" incluya cualquiera de las formas de PEG que haya sido utilizada para derivatizar otras proteínas, tales como mono(Cl-ClO)alcoxi- o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas realizaciones, el
anticuerpo que se va a pegilar es un anticuerpo aglicosilado. Los métodos para pegilar proteínas son conocidos en la técnica y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invención.
En realizaciones preferidas, la presente invención proporciona anticuerpos anti-VAP-1 completamente humanos específicos 8C10, 3F10 y 4B3. En otras realizaciones preferidas, la presente invención proporciona anticuerpos anti- 5 VAP-1 completamente humanos recombinantes, tales como 8C10, 3F10 y 4B3 recombinantes. En r8C10 (bTt-1023) recombinante, la cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos representada en el SEQ ID NO: 47 y la cadena ligera consiste en la secuencia de aminoácidos representada en el SEQ ID NO: 48.
TABLA 1. Secuencias de aminoácidos anti-VAP-1 humanas
SEQ ID NO
Descripción de la secuencia
1
Consenso CDR1 cadena pesada
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Consenso CDR2 cadena pesada
3
Consenso CDR3 cadena pesada
4
CDR1 cadena pesada 8C10
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CDR1 cadena pesada 8A4
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CDR1 cadena pesada 3F10
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CDR1 cadena pesada 5F12
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CDR1 cadena pesada 4B3
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CDR2 cadena pesada 8C10
10
CDR2 cadena pesada 8A4
11
CDR2 cadena pesada 3F10
12
CDR2 cadena pesada 5F12
13
CDR2 cadena pesada 4B3
14
CDR3 cadena pesada 8C10
15
CDR3 cadena pesada 8A4
16
CDR3 cadena pesada 3F10
17
CDR3 cadena pesada 5F12
18
CDR3 cadena pesada 4B3
19
Región variable cadena pesada 8C10
20
Región variable cadena pesada 8A4
21
Región variable cadena pesada 3F10
22
Región variable cadena pesada 5F12
23
Región variable cadena pesada 4B3
24
Consenso CDR1 cadena ligera
25
Consenso CDR2 cadena ligera
26
Consenso CDR3 cadena ligera
27
CDR1 cadena ligera 8C10
28
CDR1 cadena ligera 8A4
SEQ ID NO
Descripción de la secuencia
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CDR1 cadena ligera 3F10
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CDR1 cadena ligera 5F12
31
CDR1 cadena ligera 4B3
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CDR2 cadena ligera 8C10
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CDR2 cadena ligera 8A4
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CDR2 cadena ligera 3F10
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CDR2 cadena ligera 5F12
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CDR2 cadena ligera 4B3
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CDR3 cadena ligera 8C10
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CDR3 cadena ligera 8A4
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CDR3 cadena ligera 3F10
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CDR3 cadena ligera 5F12
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CDR3 cadena ligera 4B3
42
Región variable cadena ligera 8C10
43
Región variable cadena ligera 8A4
44
Región variable cadena ligera 3F10
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Región variable cadena ligera 5F12
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Región variable cadena ligera 4B3
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Cadena pesada r8C10 recombinante
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Cadena ligera r8C10 recombinante
Los anticuerpos anti-VAP-1 completamente humanos se preparan preferiblemente inmunizando ratones en los que se han inactivado los genes de inmunoglobulina de ratón nativa y se han remplazado funcionalmente por todo o parte del repertorio de genes de inmunoglobulina humana. Tales ratones se inmunizan con antígeno VAP-1 y a 5 continuación se generan hibridomas productores de anticuerpos humanos a partir de los ratones utilizando procedimientos normales. Las células de hibridoma clonadas que producen anticuerpos monoclonales que son reactivos con el antígeno VAP-1 se identifican a continuación y se expanden para producir anticuerpos monoclonales completamente humanos purificados.
Los modos alternativos para elaborar un anticuerpo humano incluyen transferir la especificidad de un anticuerpo de 10 animal a una inmunoglobulina humana. Por ejemplo, los ratones se inmunizan con antígeno VAP-1 y a continuación se generan hibridomas productores de anticuerpo a partir de ratones utilizando procedimientos normales. Las células de hibridoma clonadas que producen anticuerpos monoclonales que son reactivos con el antígeno VAP-1 se identifican a continuación y se expanden para producir anticuerpos monoclonales purificados. Se determinan las secuencias de ADNc de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras y se identifican las regiones 15 determinantes de la complementariedad (CDR). Las secuencias de aminoácidos de las CDR de las cadenas pesadas y ligeras se utilizan para remplazar las CDR coincidentes de un anticuerpo humano, transfiriendo de ese modo la especificidad del anticuerpo anti-VAP-1 de roedor a un anticuerpo humano. El anticuerpo anti-VAP-1 resultante es completamente humano en el sentido de que, aunque las secuencias de aminoácidos de las CDR originales derivan de roedores, las mismas secuencias de aminoácidos son susceptibles de ser generadas en un 20 anticuerpo derivado de ser humano y no pueden ser definidas con exactitud como específicas de roedores.
Para generar hibridomas productores de anticuerpos monoclonales humanos de la invención, se pueden aislar esplenocitos y/o células de los ganglios linfáticos de ratones inmunizados y se pueden fusionar a una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea de células de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes se pueden escrutar para determinar la producción de anticuerpos específicos de antígenos. Por ejemplo, se pueden fusionar
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suspensiones de una sola célula de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados a un sexto del número de células de mieloma de ratón no secretoras P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con PEG al 50%. Las células se cultivan en placa aproximadamente 2 x 105en placas de microtitulación de fondo plano, seguido de una incubación de dos semanas en medio selectivo que contiene Clone Serum fetal al 20%, medio acondicionad "653" al 18%, Origen al 5% (IGEN), L-glutamina 4 mM, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina y IX HAT (Sigma; el HAT se añade 24 horas después de la fusión). Después de aproximadamente dos semanas, las células se pueden cultivar en medio en el que se ha remplazado HAT por HT. A continuación se pueden escrutar los pocillos individuales por medio de ELISA para determinar los anticuerpos IgM e IgG monoclonales humanos. Una vez que se produce el crecimiento intensivo del hibridoma, el medio se puede observar normalmente después de 10-14 días. Los hibridomas secretores de anticuerpo se pueden volver a cultivar en placa, escrutar de nuevo, y si todavía son positivos para IgG humana, se pueden subclonar los anticuerpos monoclonales al menos dos veces mediante dilución limitante. Los subclones estables se pueden cultivar de nuevo in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en el medio de cultivo de tejido para la caracterización. Para purificar anticuerpos monoclonales humanos, se pueden desarrollar los hibridomas seleccionados en dos matraces de agitación de dos litros para la purificación del anticuerpo monoclonal. Los sobrenadantes se pueden filtrar y concentrar antes de la cromatografía de afinidad con proteína A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ.). La IgG eluida se puede verificar mediante electroforesis en gel y cromatografía de alto rendimiento para garantizar la pureza. La disolución tampón se puede cambiar por PBS, y la concentración se puede determinar por medio de DO280 utilizando un coeficiente de extinción de 1,43. Los anticuerpos monoclonales se pueden dividir en alícuotas y almacenar a -80°C.
Los anticuerpos completamente humanos también se pueden producir a partir de bibliotecas de presentación en fagos, que utilizan fagos modificados genéticamente para presentar y producir proteínas de anticuerpos humanos sobre la superficie del fago recombinante. Los anticuerpos de cadena sencilla con una elevada afinidad y especificidad para una diana dada se seleccionan mediante escrutinio y las secuencias de anticuerpos se pueden aislar a continuación del fago para producir un anticuerpo completamente humano recombinante. Tales métodos de presentación en fagos para aislar anticuerpos humanos están establecidos en la técnica. Los anticuerpos monoclonales completamente humanos de acuerdo con la presente invención también se pueden preparar utilizando ratones SCID en los que se han reconstituido células inmunitarias humanas de manera que se puede generar una respuesta de anticuerpos humanos después de la inmunización. Tales ratones de describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos 5.476.996 y 5.698.767.
Cuando se desea, se puede aislar el ADN que codifica las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo y se pueden fusionar al ADN que codifica cualquier región constante humana, o humana modificada deseada con el fin de producir un constructo de ADN que pueda ser insertado en un vector de expresión y transfectado a un anfitrión de expresión adecuado para producir un anticuerpo completamente humano recombinante. De este modo, los anticuerpos de acuerdo con la presente invención también pueden ser producidos en un transfectoma de células anfitrionas utilizando, por ejemplo, una combinación de mecanismos de ADN recombinante y métodos de transfección génica como es bien sabido en la técnica.
Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de los mismos, se pueden obtener los ADN que codifican las cadenas ligeras y pesadas completas o parciales, mediante mecanismos de biología molecular convencionales (p. ej., amplificación por PCR o clonación de ADNc utilizando un hibridoma que expresa el anticuerpo de interés) y se pueden insertar los ADN en vectores de expresión de manera que los genes estén conectados operativamente a secuencias de control de la transcripción y la traducción. En este contexto, se pretende que el término “conectado operativamente” signifique que un gen de un anticuerpo está ligado en un vector de manera que las secuencias de control de la transcripción y la traducción dentro del vector sirven para su función pretendida de regulación de la transcripción y la traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se seleccionan para que sean compatibles con la célula anfitriona de expresión utilizada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo se pueden insertar en vectores separados o, más típicamente, se insertan ambos genes en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpos se insertan en el vector de expresión mediante métodos convencionales (p. ej., ligación de sitios de restricción complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y el vector, o ligación de extremos romos si no se encuentran presentes sitios de restricción). Las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos descritos en la presente memoria se pueden utilizar para crear genes de anticuerpos completos de cualquier isotipo de anticuerpo insertándolos en vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de la cadena pesada y regiones constantes de la cadena ligera del isotipo deseado de manera que el segmento VH está conectado operativamente al segmento o los segmentos constantes de la cadena pesada (CH) dentro del vector y el segmento VK está conectado operativamente al segmento constante de la cadena ligera (CL) dentro del vector. Adicionalmente o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo desde una célula anfitriona. El gen de la cadena de anticuerpo se puede clonar en el vector de manera que el péptido señal está conectado en marco al extremo amino del gen de la cadena de anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (esto es, un péptido señal de una proteína distinta de una inmunoglobulina).
Además de los genes de cadenas de anticuerpos, los vectores de expresión recombinantes de la invención portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadenas de anticuerpos en una célula anfitriona.
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Se pretende que el término "secuencia reguladora” incluya promotores, intensificadores y otros elementos de control de la expresión (p. ej., señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o la traducción de los genes de las cadenas de anticuerpos, como es bien sabido en la técnica. Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de las secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula anfitriona que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión de células anfitrionas de mamífero incluyen elementos virales que dirigen niveles elevados de expresión de proteína en células de mamífero, tales promotores y/o intensificadores derivados de citomegalovirus (CMV), Virus de simios 40 (SV40), adenovirus, (p. ej., el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP) y polioma. Alternativamente, se pueden utilizar secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor de ubicuitina o el promotor de p-globina. Aún más, los elementos reguladores compuestos por secuencias de diferentes fuentes, tales como el sistema promotor SRalpha, contienen secuencias del promotor temprano de SV40 y la repetición terminal larga del virus de la leucemia de células T humana de tipo 1.
Además de los genes de las cadenas de anticuerpos y de las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células anfitrionas (p. ej., orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. Como es bien sabido en la técnica, el gen marcador seleccionable facilita la selección de células anfitrionas en las cuales se ha introducido el vector. Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, a una célula anfitriona en la cual se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células anfitrionas dhfr- con selección/amplificación por metotrexato) y el gen neo (para la selección por G418).
Para la expresión de las cadenas ligeras y pesadas, los vectores de expresión que codifican las cadenas pesadas y ligeras son transfectados a una célula anfitriona por medio de mecanismos convencionales. Se pretende que las diversas formas del término “transfección” incluyan una amplia variedad de mecanismos comúnmente utilizados para la introducción de ADN exógeno en una célula anfitriona procariota o eucariota, p. ej., electroporación, precipitación con fosfato de calcio, y transfección con DEAE-dextrano. Aunque teóricamente es posible expresar los anticuerpos de la invención en células anfitrionas procariotas o eucariotas, la expresión de anticuerpos en células eucariotas, y muy preferiblemente células anfitrionas de mamífero, es la más preferida debido a que tales células eucariotas, y en particular las células de mamífero, son más propensas que las células procariotas a ensamblar y secretar un anticuerpo adecuadamente plegado e inmunológicamente activo. Se ha hecho referencia a que la expresión procariótica de los genes de anticuerpos es ineficaz para la producción de elevados rendimientos de anticuerpo activo.
Las células anfitrionas de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de Ovario de Hámster Chino (células CHO) (incluyendo células CHO dhfr- conocidas en la técnica), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican los genes de anticuerpos se introducen en células anfitrionas de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células anfitrionas durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células anfitrionas o, más preferiblemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual se desarrollan las células anfitrionas. Los anticuerpos pueden ser recuperados del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteínas convencionales.
Un aspecto adicional de la presente descripción es proporcionar una molécula de ADN que codifica una región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano, que comprende una primera secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 49 a 53, y sus variantes de secuencia conservativa, y/o una segunda secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 54 a 58, y sus variantes de secuencia conservativa, y/o una tercera secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 59 a 63, y sus variantes de secuencia conservativa, codificando dichas secuencias de ADN las regiones CDR 1 a 3, respectivamente. De acuerdo con un aspecto concreto, la presente descripción proporciona una molécula de ADN que codifica una región variable de la cadena pesada y que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 64 a 68 y sus variantes de secuencia conservativa.
Otro aspecto adicional más de la presente descripción es proporcionar una molécula de ADN que codifica una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano, que comprende una primera secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 69 a 73, y sus variantes de secuencia conservativa, y/o una segunda secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 74 a 78, y sus variantes de secuencia conservativa, y/o una tercera secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 79 a 83, y sus variantes de secuencia conservativa, codificando dichas secuencias de ADN las regiones CDR 1 a 3, respectivamente. De acuerdo con un aspecto concreto, la presente descripción proporciona una molécula de ADN que codifica una región variable de la cadena pesada y que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 84 a 88, y sus variantes de secuencia conservativa.
En una realización, la presente descripción proporciona moléculas de ADN que codifican anticuerpos anti-VAP-1 completamente humanos recombinantes, tales como 8C10, 8A4, 3F10, 4B3 y 5F12 recombinantes. En r8C10 (BTT- 1023) recombinante, la cadena pesada está codificada por ADN que comprende la secuencia de polinucleótidos representada en el SEQ ID NO: 89 y la cadena ligera está codificada por ADN que comprende la secuencia de
nucleótidos representada en el SEQ ID NO: 90.
TABLA 2. Secuencias de nucleótidos anti-VAP-1 completamente humanas
SEQ ID NO
Descripción de la secuencia
49
CDR1 cadena pesada 8C10
50
CDR1 cadena pesada 8A4
51
CDR1 cadena pesada 3F10
51
CDR1 cadena pesada 5F12
53
CDR1 cadena pesada 4B3
54
CDR2 cadena pesada 8C10
55
CDR2 cadena pesada 8A4
56
CDR2 cadena pesada 3F10
57
CDR2 cadena pesada 3F12
58
CDR2 cadena pesada 4B3
59
CDR3 cadena pesada 8C10
60
CDR3 cadena pesada 8A4
61
CDR3 cadena pesada 3F10
62
CDR3 cadena pesada 5F12
63
CDR3 cadena pesada 4B3
64
Región variable cadena pesada 8C10
65
Región variable cadena pesada 8A4
66
Región variable cadena pesada 3F10
67
Región variable cadena pesada 5F12
68
Región variable cadena pesada 4B3
69
CDR1 cadena ligera 8C10
70
CDR1 cadena ligera 84A
71
CDR1 cadena ligera 3F10
72
CDR1 cadena ligera 5F12
73
CDR1 cadena ligera 4B3
74
CDR2 cadena ligera 8C10
75
CDR2 cadena ligera 8A4
76
CDR2 cadena ligera 3F10
77
CDR2 cadena ligera 5F12
78
CDR2 cadena ligera 4B3
79
CDR3 cadena ligera 8C10
80
CDR3 cadena ligera 8A4
5
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SEQ ID NO
Descripción de la secuencia
81
CDR3 cadena ligera 3F10
82
CDR3 cadena ligera 5F12
83
CDR3 cadena ligera 4B3
84
Región variable cadena ligera 8C10
85
Región variable cadena ligera 8A4
86
Región variable cadena ligera 3F10
87
Región variable cadena ligera 5F12
88
Región variable cadena ligera 4B3
89
Cadena pesada r8C10 recombinante
90
Cadena ligera r8C10 recombinante
La presente invención proporciona adicionalmente vectores de expresión que comprenden las secuencias de nucleótidos descritas anteriormente. Los vectores de expresión adecuados incluyen vectores que contienen elementos importantes para la expresión y secreción de proteínas en células anfitrionas de mamífero. El vector puede comprender ADN que codifica regiones constantes de cadenas pesadas o regiones constantes de cadenas ligeras humanas, o ambas. Se puede utilizar el mismo vector para la expresión de cadenas tanto pesadas como ligeras o, alternativamente, se pueden utilizar diferentes vectores que contienen regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras.
En una realización de acuerdo con la presente invención, el vector de expresión comprende la región constante de la cadena pesada de IgG4 humana, modificada para reducir la unión a FcyRI y la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) sustituyendo el residuo de aminoácido leucina 235 por alanina, como se describe en la Patente de los Estados Unidos 5.624.821. La numeración de residuos de la región Fc es la del índice EU de Kabat.
La presente invención todavía proporciona adicionalmente células anfitrionas transfectadas con vectores de expresión de acuerdo con la presente invención. Se puede utilizar cualquier sistema de célula anfitriona/vector apropiado para la expresión de las secuencias de ADN que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo completamente humano. Se pueden utilizar sistemas bacterianos, p. ej. Escherichia coli, y otros sistemas microbianos, en particular para la expresión de fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fab y F(ab')2, y especialmente fragmentos Fv y fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla p. ej. Fv de cadena sencilla. Se pueden utilizar sistemas de expresión de células anfitrionas eucariotas, p. ej. plantas, levaduras o mamíferos o plantas o animales transgénicos para la producción de productos de anticuerpos más grandes, incluyendo moléculas de anticuerpos completas, y/o si se requieren productos glicosilados. Las células anfitrionas de mamífero adecuadas incluyen células CHO (ovario de hámster Chino) y líneas celulares de mieloma o hibridoma como se ha expuesto anteriormente. Las células anfitrionas preferidas son las células CHO.
Un aspecto adicional de la presente invención es proporcionar un método para producir anticuerpos anti-VAP-1 completamente humanos recombinantes por medio de un proceso que comprende transfectar una célula anfitriona con un vector de expresión que comprende secuencias de ADN que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo completamente humano de acuerdo con la presente invención bajo el control de promotores y señales de secreción adecuados, y propagar dicha célula anfitriona en condiciones en las que cada cadena es expresada, y aislar dicho anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano expresado y ensamblado o los derivados biológicamente reactivos del mismo del cultivo. Los métodos generales por medio de los cuales se pueden construir vectores, los métodos de transfección y los métodos de cultivo son bien conocidos en la técnica.
La presente invención proporciona adicionalmente una composición farmacéutica que comprende un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable y, como ingrediente activo, un anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano de acuerdo con la presente invención. La composición de la presente invención contiene anticuerpos anti- VAP-1 completamente humanos de acuerdo con la presente invención en cantidades suficientes para ejercer un efecto antagónico (completo o parcial) sobre la unión de VAP-1 nativa del paciente a los ligandos biológicos de VAP- 1 en pacientes que necesitan semejante antagonismo, y específicamente a ligandos de VAP-1 presentados sobre leucocitos.
Las cantidades y los regímenes de administración de los anticuerpos anti-VAP-1 completamente humanos de
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acuerdo con la presente invención pueden ser determinados fácilmente por los expertos normales en la técnica clínica de tratamiento de trastornos relacionados con la inflamación. Generalmente, la dosificación del tratamiento con anticuerpos anti-VAP-1 completamente humanos variará dependiendo de consideraciones tales como: la edad, el género y la salud general paciente que se vaya a tratar; de la clase de tratamiento concurrente, si lo hubiera; de la frecuencia del tratamiento y de la naturaleza del efecto deseado; del grado de lesión del tejido; de la duración de los síntomas; y de otras variables que deben ser ajustadas por el médico individual. Se puede administrar una dosis deseada en una o más aplicaciones para obtener los resultados deseados. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se pueden proporcionar en formas de dosificación unitarias.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se pueden administrar en cualquier portador farmacológico apropiado para la administración. Se pueden administrar en cualquier forma que provoque efectos profilácticos, paliativos, preventivos o curativos de afecciones médicas mediadas por VAP en pacientes humanos o animales.
Las composiciones farmacéuticas de los anticuerpos anti-VAP-1 completamente humanos de acuerdo con la presente invención para la administración parenteral y tópica incluyen disolventes, suspensiones y emulsiones acuosos o no acuosos estériles. Los ejemplos de los disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal, aceite de pescado, y ésteres orgánicos inyectables. Los portadores acuosos incluyen agua, disoluciones de agua-alcohol, incluyendo vehículos parenterales salinos y en medios tamponados incluyendo disolución de cloruro de sodio, disolución de dextrosa de Ringer, disolución de dextrosa más cloruro de sodio, disolución de Ringer que contiene lactosa, o aceites fijados. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos, tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer. Las composiciones acuosas de acuerdo con la invención pueden comprender agentes tamponadores adecuados, tales como fosfatos de sodio y potasio, tampones de citrato, acetato, carbonato o glicina dependiendo del intervalo de pH elegido como diana. El uso de cloruro de sodio como agente para el ajuste de la tonicidad también resulta útil. Las composiciones pueden incluir otros excipientes, tales como agentes estabilizantes o conservantes. Los excipientes estabilizantes útiles incluyen tensioactivos (Polysorbate 20 y 80, poloxámero 407), polímeros (polietilenglicoles, povidonas), carbohidratos (sacarosa, manitol, glucosa, lactosa), alcoholes (sorbitol, glicerol propilenglicol, etilenglicol), proteínas adecuadas (albúmina), aminoácidos adecuados (glicina, ácido glutámico), ácidos grasos (etanolamina), antioxidantes (ácido ascórbico, cisteína, etc.), agentes quelantes (sales de EDTA, histidina, ácido aspártico) o iones metálicos (Ca, Ni, Mg, Mn). Entre los agentes conservantes útiles se encuentran alcohol bencílico, clorobutanol, cloruro de benzalconio y posiblemente parabenos.
La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se puede proporcionar en forma concentrada o en forma de polvo para reconstituir a demanda. En tales casos, se pueden utilizar formulaciones de polvo para disolución para excipientes de inyección/infusión mencionados anteriormente. En el caso de la liofilización, se prefieren ciertos crioprotectores, incluyendo polímeros (povidonas, polietilenglicol, dextrano), azúcares (sacarosa, glucosa, lactosa), aminoácidos (glicina, arginina, ácido glutámico) y albúmina. Si se añade disolución para reconstitución al envase, ésta puede consistir, p. ej., en agua pura para inyectables o disolución de cloruro de sodio o disoluciones de dextrosa o glucosa.
La composición de la invención es adecuada para diagnosticar o tratar cualquier afección que implique una reacción inflamatoria en la que la adherencia de VAP-1 juega un papel en la mediación de la transmigración y la infiltración de los leucocitos desde la sangre al sitio de la inflamación. De este modo, la composición es útil para el diagnóstico o tratamiento de artritis inflamatorias y enfermedades del tejido conectivo tales como artropatías reactivas, artropatías postinfecciosas, poliartropatías inflamatorias, trastornos sistémicos del tejido conectivo, espondilopatías inflamatorias, miositis, sinovitis, enfermedad de Reiter, artritis reumatoide seropositiva, artritis reumatoide, enfermedad reumatoide extraarticular, artropatías psoriásicas y enteropáticas, artritis juvenil, artritis, poliarteritis nodosa y afecciones relacionadas, vasculopatías necrotizantes, dermatopolimiositis, esclerosis sistémica, enfermedades con implicación sistémica del tejido conectivo, espondilitis anquilosante y otras espondiloartropatías inflamatorias. Además, enfermedades inflamatorias intestinales tales como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, las dermatosis tales como los trastornos bulosos, la dermatitis, los trastornos papuloescuamosos, el eritema, el líquen escleroso y atrófico, craurosis vulvar, el lupus eritematoso discoide, la morfea, el pénfigo, el penfigoide, la dermatitis herpetiforme, la dermatitis atópica, la dermatitis de contacto alérgica, la dermatitis de contacto irritante, la dermatitis de contacto, la psoriasis, el eritema multiforme, enfermedades inflamatorias tales como la esclerosis múltiple, la neuropatía inflamatoria, la miopatía inflamatoria, la encefalomielitis diseminada aguda, la vasculitis del sistema nervioso central, el síndrome de Sjogren, la diabetes, el lupus eritematoso generalizado, el asma y la enfermedad inflamatoria del hígado, la enfermedad de Graves y la tiroiditis, la aterosclerosis, la inflamación del ojo incuyendo uveitis, iritis, iridociclitis, la hepatitis alcohólica, el transplante con aloinjerto, el transplante con xenoinjerto, la glomerulonefritis, la lesión por reperfusión y las afecciones inflamatorias agudas después del infarto de miocardio y el ictus pueden ser adecuadas para el diagnóstico o el tratamiento por medio de la composición de la invención.
Los anticuerpos anti-VAP-1 completamente humanos terapéuticamente útiles de acuerdo con la presente invención se pueden conjugar, químicamente o mediante ingeniería genética, con otros agentes, que proporcionan el direccionamiento de los anticuerpos al sitio deseado de acción. Alternativamente, se pueden conjugar otros compuestos, químicamente o por medio de ingeniería genética, con los anticuerpos de acuerdo con la presente
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invención, con el fin de intensificar o proporcionar otras propiedades adicionales a los anticuerpos, especialmente propiedades, que intensifican la capacidad de los anticuerpos para promover el alivio de los efectos nocivos mediados por la unión a VAP-1.
Los anticuerpos anti-VAP-1 completamente humanos de acuerdo con la presente invención pueden ser marcados, químicamente o mediante ingeniería genética, para proporcionar anticuerpos detectables. Tales anticuerpos marcados serán herramientas útiles para la formación de imágenes de los sitios de inflamación en seres humanos, especialmente para la formación de imágenes inmunoescintográficas in vivo de los sitios de inflamación. Este tipo de formación de imágenes puede remplazar el método de formación de imágenes de leucocitos más engorroso y costoso utilizado en la actualidad. Con el propósito de tomar imágenes, será preferible el uso de fragmentos de anticuerpos frente al enfoque de utilización de anticuerpos completos para la terapia anti-inflamatoria y los fragmentos derivados de anticuerpos completamente humanos deber ser aún más segura que sus equivalentes quiméricos o de ratón.
Los presentes anticuerpos se pueden utilizar para disminuir o tratar la inflamación, in vivo, en el organismo humano, mediante la administración, a un paciente humano que necesite semejante tratamiento, de niveles eficaces del anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano de acuerdo con la presente invención. Se pretende que el término "tratamiento" o "tratar" incluya la administración de anticuerpos anti-VAP-1 completamente humanos a un sujeto con fines que pueden incluir la profilaxis, el alivio, la prevención o la curación de trastornos mediados por eventos de adherencia de VAP-1. Los anticuerpos anti-VAP-1 concretos adecuados para tal fin son anticuerpos anti-VAP-1 completamente humanos recombinantes purificados de la presente invención.
Por “nivel eficaz” de un anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano se quiere significar un nivel en el que los efectos nocivos de los eventos mediados por VAP-1, como mínimo, mejoran. Una cantidad eficaz del anticuerpo de la presente invención es aquella que es suficiente para bloquear, o bloquear parcialmente, la unión endotelial de los leucocitos con el fin de inhibir la infiltración de los leucocitos a los sitios inflamatorios, donde semejante infiltración es nociva o no deseada. Las cantidades y los regímenes de administración de los anticuerpos anti-VAP-1 completamente humanos pueden ser determinados fácilmente por los expertos en la técnica clínica de tratamiento de trastornos relacionados con la inflamación. Preferiblemente, los anticuerpos anti-VAP-1 completamente humanos de acuerdo con la presente invención se proporcionan intravascularmente a intervalos que oscilan entre una vez a la semana y una vez cada tres meses a dosis en el intervalo de 0,01 a 20 mg/kg, más preferiblemente en el intervalo de 0,1 a 10 mg/kg, muy preferiblemente de 0,5 a 5 mg/kg. Alternativamente, los anticuerpos anti-VAP-1 completamente humanos de acuerdo con la presente invención se proporcionan subcutáneamente a intervalos que oscilan entre una vez a la semana y una vez cada tres meses a dosis en el intervalo de 0,1 a 20 mg/kg, más preferiblemente en el intervalo de 0,2 a 10 mg/kg, muy preferiblemente de 0,5 a 5 mg/kg.
Ejemplos
Ejemplo 1
Aislamiento de hibridomas que expresan anticuerpo monoclonal anti-VAP-1 humano
Se utilizó la cepa de ratón transgénica para inmunoglobulina humana (HuMAb Mouse®; Medarex Inc.) para desarrollar células de hibridoma que expresaban anticuerpo monoclonal anti-VAP-1 humano. HuMAb Mouse® contiene miniloci del gen de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (|j y y) y de cadena ligera k no reordenadas, junto con las mutaciones elegidas como diana que inactivan los loci de la cadena j y k endógenas (véase p. ej., Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Por consiguiente, los ratones mostraron una expresión reducida de IgM o k de ratón, y en respuesta a la inmunización, los transgenes de la cadena pesada y ligera humanas introducidos experimentan un cambio de clase y una mutación somática para generar anticuerpos monoclonales IgG k humanos de alta afinidad. La preparación y el uso de ratones HuMab, y las modificaciones genómicas llevadas a cabo por los ratones, se describen p. ej. en las Patentes de los Estados Unidos 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; todas de Lonberg y Kay; la Patente de los Estados Unidos 5.545.807 de Surani et al; Publicaciones PCT WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas de Lonberg y Kay; y Publicación PCT WO 01/14424 de Korman et al.
Cuando se inmunizan con VAP-1 humana recombinante (rhVAP-1), este ratón transgénico produce anticuerpos IgG específicos humanos contra VAP-1 humana.
El esquema de inmunización fue el siguiente: los ratones fueron inmunizados mediante múltiples inyecciones intraperitoneales y subcutáneas de rhVAP-1 purificada a partir de células CHO transfectadas establemente con un plásmido de expresión que contenía ADNc de VAP-1 humana y que expresaba VAP-1 humana (Smith et al., J. Exp. Med. (1998) 188:17-27) mezclada con coadyuvante completo de Freund seguido de rhVAP-1 mezclada con coadyuvante incompleto de Freund o rhVAP-1 mezclada con coadyuvante Ribi. Las muestras de suero de los ratones inmunizados se analizaron para determinar el estado inmunitario controlado por un ELISA de captura de anticuerpo utilizando rhVAP-1 inmovilizada y Fluorometric Microvolume Assay Technology (FMAT) utilizando células CHO transfectadas establemente con un plásmido de expresión que contenía ADNc de VAP-1 humana y que
expresaba VAP-1 humana. Se administraron inyecciones de refuerzo finales de rhVAP-1 intravenosamente e intraperitonealmente antes de la esplecnotomía.
Los hibridomas que expresaban el anticuerpo monoclonal anti-VAP-1 humano se obtuvieron fusionando células de mieloma P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580) con esplenocitos de ratones inmunizados como antes utilizando 5 polietilenglicol (PEG) como fusionógeno. Los sobrenadantes de hibridoma se escrutaron inicialmente por medio de ELISA para determinar la presencia de anticuerpos IgG humanos con una cadena ligera kappa. Las células positivas para IgG humana se escrutaron a continuación mediante ELISA sobre rhVAP-1 y mediante FMAT para determinar la unión a VAP-1 expresada sobre la superficie de células CHO transfectadas establemente con un plásmido de expresión que contiene un ADNc de VAP-1 humana. Se seleccionaron cinco clones de hibridoma IgG1 anti-VAP-1 10 humana, a saber 5F12, 4B3, 3F10, 8A4 y 8C10.
Ejemplo 2
Propiedades de unión a VAP-1 de los anticuerpos 5F12, 4B3, 3F10, 8A4 y 8C10 completamente humanos
Se utilizó un análisis inmunofluorométrico resuelto en el tiempo para examinar cuantitativamente la unión de 5F12, 4B3, 3F10, 8A4 y 8C10 a rhVAP-1. Se recubrió una placa de microtitulación con rhVAP-1 y a continuación se 15 bloqueó con disolución de albúmina de suero bovino. Con posterioridad se añadió una cantidad de anticuerpo entre 2 y 4320 ng/ml para la unión a rhVAP-1 y el anticuerpo unido se detectó por medio de un anti-anticuerpo humano de ratón conjugado con europio (Perkin Elmer Inc.). La marca se detectó midiendo la fluorescencia resuelta con el tiempo (contador multi marca Victor3, Perkin Elmer Inc.) a 615 nm. Los recuentos de fluorescencia se correspondían directamente con cuándo anticuerpo se había unido a su diana. Los datos de las muestras se analizaron a 20 continuación en comparación con la curva patrón de referencia. Los datos muestran que 5F12, 4B3, 3F10, 8A4 y 8C10 se unen a rhVAP-1 y las afinidades (Kd) se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. Unión de mAb 5F12, 4B3, 3F10, 8A4 y 8C10 a rhVAP-1
mAb
Kd (nM)
8C10
0,21
3F10
0,25
4B3
0,31
8A4
0,28
5F12
0,65
Ejemplo 3
25 Preparación de ADNc, clonación y secuenciación de las regiones variables de los anticuerpos 5F12, 4B3, 3F10, 8A4 y 8C10 completamente humanos
Con el fin de construir anticuerpos recombinantes, se aislaron los ADNc que codificaban las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras humanas de los anticuerpos obtenidos en el Ejemplo 1 y se clonaron en vectores plasmídicos para el análisis de la secuencia.
30 Los clones de ADNc de las regiones variable de la cadena pesada (Vh) y variable de la cadena ligera (Vl)
de la inmunoglobulina (Ig) humana se obtuvieron de las células de hibridoma que expresaban los anti-VAP-1 5F12, 4B3, 3F10, 8A4 y 8C10 de la siguiente manera. El ARN total se preparó a partir de 5 x 106 células de hibridoma utilizando el kit RNeasy de Qiagen. Los ADNc de Vl y Vh se prepararon mediante transcripción inversa de ARN seguido del procedimiento de "amplificación rápida de los extremos de ADNc (RACE)" utilizando "el kit de
35 amplificación de ADNc SMART RACE" y el "Advantage-HF 2 PCR kit" de alta fidelidad de bD Biosciences Clontech. Los productos amplificados por PCR se purificaron a continuación, se clonaron en el vector pCR4-TOPO TA (Invitrogen) y se transformaron en la cepa de E. coli, TOP10 (Invitrogen). Los ADN de la Miniprep para los clones plasmídicos de Vl y Vh para cada uno de 5F12, 4B3, 3F10, 8A4 y 8C10 se secuenciaron y las secuencias de nucleótidos y de proteínas correspondientes deducidas se muestran en las Figuras 1 a 6.
40 Ejemplo 4
Construcción de un vector de expresión de mamífero para expresar mAb r8C10 recombinante
Se insertaron las regiones variables de 8C10 en un vector de expresión de mamífero apropiado que contenía regiones constantes de las cadenas pesadas y ligeras apropiadas, como se describe más abajo, con el fin de producir un anticuerpo r8C10 recombinante funcional (denominado BTT-1023) en células CHO.
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Se sabe que la región Fc de un anticuerpo determina la capacidad de los complejos de anticuerpo/antígeno para dirigir las respuestas inmunitarias. El propósito era producir anticuerpos terapéuticos que bloquearan la unión de los leucocitos al endotelio vascular y no reclutaran ninguna función efectora. Por lo tanto se utilizó en el vector de expresión la región constante de la cadena pesada de la IgG4 humana, modificada para reducir la unión de FcyRI y la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) sustituyendo el aminoácido leucina 235 por alanina, como se describe en la patente de los Estados Unidos 5624821. Los ADNc de Vl y Vh de 8C10 se amplificaron para que contuvieran sitios de clonación apropiados y una secuencia consenso de Kozak óptima en el extremo 5' utilizando PCR Supermix (Invitrogen). Se diseñaron cebadores de PCR directos e inversos para que tuvieran sitios de restricción apropiados para la clonación. Los productos de la PCR, que incluyen las secuencias señal de Vl y Vh nativas respectivamente, se purificaron y se clonaron en un vector plasmídico que portaba una región constante de la cadena ligera kappa humana y una cadena pesada gamma 4 humana que contenía las mutaciones serina 228 por prolina y leucina 235 por alanina y se denominó plCO-g4PA(VAP1.8C10), generando plásmidos que después se transformaron en células de E. coli TOP10. Las regiones Vl y Vh del plásmido se secuenciaron para confirmar la integridad de los productos de la PCR clonados.
La cadena ligera de 8C10 se amplificó mediante PCR para que contuviera un sitio de clonación HindlII y una secuencia consenso de Kozak óptima en el extremo 5', y un sitio de clonación EcoRI en el extremo 3', utilizando el plásmido plCO-g4PA(VAP1.8C10) como molde y PCR Supermix. El producto de la PCR, que incluye la secuencia señal de la cadena ligera de 8C10 nativa, se digirió con HindIII y EcoRI, se purificó y se clonó en el vector de expresión pEE12.4, que se obtuvo de Lonza Biologies, en los sitios HindlII y EcoRI, generando el plásmido 2116. El plásmido 2116 se transformó células de E. coli competentes DH5a Max Efficiency (Invitrogen Inc.).
La cadena pesada de 8C10 se amplificó mediante PCR para que contuviera un sitio de clonación HindIII y una secuencia consenso de Kozak óptima en el extremo 5', y un sitio de clonación EcoRI en el extremo 3', utilizando el plásmido plCO-g4PA(VAP1.8C10) como molde y PCR Supermix. El producto de la PCR, que incluye la secuencia señal de la cadena pesada de 8C10 nativa, se digirió con HindIII y EcoRI. EL fragmento que contenía la cadena pesada de 8C10 se purificó y se clonó en el vector de Lonza pEE6.4, que se obtuvo de Lonza Biologies, en los sitios HindIII y EcoRI, generando el plásmido 2117. El plásmido 2117 se transformó en células competentes DH5a Max Efficiency. Los plásmidos 2116 y 2117 se digirieron con SalI y NotI, y el fragmento más grande de cada producto digerido se ligó utilizando ADN ligasa de T4 dando como resultado el plásmido 2118 [2118-pEE12.4-VAP1(8C10)]. El plásmido 2118 se transformó en células competentes DH5a Max Efficiency. El ADN que codificaba la cadena pesada y ligera completas se secuenció para confirmar la exactitud y la integridad de la secuencia.
Ejemplo 5
Expresión del anticuerpo BTT-1023 completamente humano recombinante en células CHO
Se produjo el anticuerpo BTT-1023 completamente humano a partir de células CHO como sigue. El ADN del plásmido 2118-pEE12.4-VAP1(8C10) se linealizó con Pvul. El ADN se transfectó por electroporación en células CHOK1SV obtenidas de Lonza Biologies. Las células se cultivaron a continuación en placa a 50 pL/pocillo en placas de 96 pocillos (2,5 x 103 células/pocillo) en medio post-transfección de CHO (Número de Catálogo Núm. 04-0119, Gibco Invitrogen Inc.) definidas químicamente (DC) (CHO DC libre de L-glutamina + 1X suplemento de GS (glutamina sintetasa) + 2,16 mg/L de timidina). A continuación las placas se alimentaron 24 horas después con 150 pL/pocillo de medio de selección CHO DC (CHO DC libre de L-glutamina + 1X suplemento GS + 2,16 mg/L de timidina + MSX 66,6 pM (metionina sulfoximina) o MSX 133,3 pM) dando como resultado una concentración de MSX global final 50 pM o 100 pM. Los niveles de producción de anticuerpo por las colonias resistentes a MSX se midieron mediante un ELISA sándwich de IgG humana. Las colonias que producían elevados niveles de anticuerpo se seleccionaron para determinar la expansión en medio de expansión de CHO DC (CHO DC libre de L-glutamina + 1X suplemento de GS + 2,16 mg/L de timidina + MSX 50 pM o MSX 100 pM), primero a placas de 24 pocillos, después a matraces T. Las células se expandieron en matraces oscilantes antes de la preparación de un banco de células de transfectoma (TCB) en 5 viales. Se seleccionó la línea celular 15B7 a partir de las placas de MSX 50 pM y se mantuvo en medio de expansión de CHO DC que contenía MSX 50 pM. Se produjo anticuerpo cultivando las células CHO transfectadas como antes para generar medio acondicionado a partir del cual se pudo purificar BTT-1023 utilizando técnicas convencionales para purificar anticuerpos monoclonales a partir de sobrenadante de cultivo.
Ejemplo 6
Propiedades de unión del anticuerpo BTT-1023 completamente humano recombinante
Se utilizó un análisis inmunofluorométrico resuelto en el tiempo para examinar cuantitativamente la unión de BTT-1023 a rhVAP-1. Se recubrió una placa de microtitulación con rhVAP-1 y a continuación se bloqueó con disolución de albúmina de suero bovino. Con posterioridad se añadió una cantidad de BTT-1023 entre 2 y 4320 ng/ml para la unión a VAP-1 y se detectó el BTT-1023 unido por medio de un anti-anticuerpo humano de ratón conjugado con europio (Perkin Elmer Inc.). La marca se detectó midiendo la fluorescencia resuelta en el tiempo (contador multimarca Victor3, Perkin Elmer Inc.) a 615 nm. Los recuentos de fluorescencia se correspondían directamente con cuánto BTT-1023 se había unido a su diana. Los datos de las muestras se analizaron a continuación en comparación con una curva patrón de referencia. Los datos demuestran que BTT-1023 se une a
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VAP-1 humana recombinante con una afinidad (Kd) de 0,38 nM.
Se utilizó un análisis de unión directa en tiempo real utilizando un análisis de resonancia de plasmón superficial de Biacore para analizar la cinética de unión de rhVAP-1 a BTT-1023. La proteína G' biotinilada (Sigma) inmovilizada sobre un chip recubierto con estreptavidina (Biacore AB) se utilizó para capturar BTT-1023 a partir de la fase móvil. Cada ronda consistió en dos fases sucesivas: una inyección de mAb BTT-1023 y una inyección de analito de unión a ligando (rhVAP-1). Se utilizaron cantidades constantes de rhVAP-1 como analito para la concentración saturante de los mAb (ligandos). Los experimentos se llevaron a cabo utilizando un equipo BIAlite (Biacore AB) y los datos se analizaron utilizando el soporte lógico de Biacore. Los datos demuestran que la VAP-1 humana recombinante se une a BTT-1023 con una afinidad (Kd) de 0,13 nM.
La unión del BTT-1023 completamente humano a VAP-1 humana se analizó por medio de tinción por inmunofluorescencia y citometría de flujo. Para la citometría de flujo, se utilizaron células transfectadas de una línea de células endoteliales de rata (células Ax) que expresaba ADNc de VAP-1 humana (Smith et al., J. Ex. Med. (1998) 188:17-27). Éstas se hicieron crecer en matraces de 175 cm3 en medio RPMI 1640 (Sigma) con un suplemento de FCS (suero de ternera fetal) al 20%, L-glutamina 2 mM, piruvato de Na 1 mM, p-ME (beta-mercaptoetanol) 10 |jM, aminoácidos no esenciales al 1%, 100 U/ml de penicilina, 100 jg/ml de estreptomicina y 0,75 mg/ml de Geneticina™. Con el fin de liberar las células, éstas se lavaron dos veces con PBS (solución salina tamponada con fosfato) y se incubaron en 10 ml de Tampón de Disociación Celular (Gibco BRL) durante 3 min a 37°C. Después de la adición de 10 ml de medio, las células se sedimentaron (5 min, 1000 g, a la temperatura ambiente), se resuspendieron en tampón de lavado [PBS, BSA (albúmina de suero bovino) al 0,1% (p/v), NaN3 al 0,1% (v/v)] a 106 células/ml y se mantuvieron sobre hielo.
La suspensión celular (100 jl/pocillo) se transfirió a placas de 96 pocillos, las células se sedimentaron (4 min, 1000 g, 10°C) y se añadieron alícuotas de 100 jl de disolución de anticuerpo a los pocillos. Después de una incubación de 30 min sobre hielo, las células se lavaron tres veces con 150 jl de tampón de lavado/pocillo y a continuación se incubaron con 100 jl de anti-IgG humana (específica de Fc, Sigma) conjugado con FITC (isotiocianato de fluoresceína) de 39 jg/ml durante 30 minutos sobre hielo. Finalmente, las células se lavaron como antes y se fijaron añadiendo 100 jl de Tampón de Lavado con formaldehído al 1% (v/v) y se mantuvieron a 4°C hasta su análisis en un citómetro de flujo. Las muestras de control se tiñeron con anticuerpo secundario anti-IgG humana conjugado con FITC solo.
Todas las muestras de la citometría de flujo se analizaron en un FACScan™ (Becton Dickinson). Para cada muestra, se recogieron los datos para un mínimo de 10.000 eventos acotados y se calculó el canal medio geométrico de fluorescencia utilizando el soporte lógico Lysys Il.
BTT-1023 se unió específicamente a VAP-1 humana como se muestra mediante la tinción de las células Ax transfectadas que expresan VAP-1 sobre su superficie (Figura 7).
Ejemplo 7
Características funcionales de BTT-1023
Se utilizó un análisis de transmigración in vitro para someter a ensayo la capacidad funcional de BTT-1023 para inhibir la transmigración de leucocitos a través de una monocapa endotelial. Se hizo crecer una monocapa de células endoteliales de rata Ax, transfectadas con el fin de expresar VAP-1 humana recombinante sobre su superficie, en la cámara superior de un aparato Transwell (Becton Dickinson). Las células mononucleares de sangre periférica humana recién aisladas se colocaron en las cámaras de más arriba y se permitió que migraran hacia el péptido quimioatrayente de monocitos fMLP (N-formil-metionil-leucil-fenilalanina, 100 nM) a las cámaras de más abajo durante 2 horas. Las monocapas se trataron con BTT-1023 o con BTT-1008, un anticuerpo de control negativo sin unión con una región constante humana (Kirton et al., Eur. J. Immunol. (2005) 35:3119-30) o con BTT-1002, un mAb anti-VAP-1 quimérico de control positivo que se sabe que bloquea la adherencia y la transmigración mediadas por VAP-1. Las células que migraron a través de la monocapa se recogieron de la cámara de más abajo y se contaron microscópicamente. BTT-1023 redujo significativamente la migración de las células a través de la capa de células endoteliales a 10 ng ml'1, y bloqueó la migración a 1 jg ml'1. El anticuerpo BTT-1008 de control negativo no tuvo efecto a 1 jg ml-1 mientras el BTT-1002 de control positivo también bloqueó la transmigración completamente a 1 jg ml-1 como se observa en la Figura 8.
Ejemplo 8
Propiedades farmacocinéticas mejoradas del anticuerpo BTT-1023 completamente humano recombinante en comparación con el anticuerpo quimérico BTT-1002
Se administraron 25 mg/kg de BTT-1023 a dos titís hembra (primates no humanos), mediante inyección intravenosa en embolada. Se recogieron muestras de sangre para el análisis de la concentración de BTT-1023 10 minutos, 1, 3, 6, 24, 48, 72 y 144 horas después de la dosificación.
Un análisis inmunofluorométrico resuelto en el tiempo para la cuantificación de la concentración de analito
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(BTT-1002 o BTT-1023) en suero de tití utiliza un anticuerpo policlonal de conejo específico de analito conjugado con biotina como captador sobre una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina. Tales anticuerpos policlonales se elaboraron por medio de inmunización repetida de los conejos con BTT-1002 o BTT-1023, recogida de suero y purificación por afinidad de los anticuerpos policlonales anti-BTT-1002 o anti-BTT-1023 resultantes. La detección de analito unido se realizó utilizando un anticuerpo secundario conjugado con europio. La marca se detectó midiendo la fluorescencia resuelta en el tiempo (contador multimarca Victor3, Perkin Elmer Inc.) a 615 nm. Los recuentos de fluorescencia se correspondían directamente con cuánto analito estaba presente en la muestra. Los datos de las muestras se analizaron a continuación en comparación con una curva patrón de referencia.
Se determinaron los parámetros farmacocinéticos utilizando el análisis no compartimental. Cuando se compararon con los datos derivados de un estudio similar realizado con BTT-1002, en el que se administraron intravenosamente 40 mg/kg a cada uno de los dos titís hembra, el anticuerpo para VAP-1 completamente humano muestra mejores propiedades farmacocinéticas con un perfil de concentración en suero mejorado a lo largo del tiempo (AUC) y una vida media de eliminación prolongada (Tabla 4).
Tabla 4. Propiedades farmacocinéticas de BTT-1023 en comparación con BTT-1002
Dosis (mg/kg)
AUC (0-último) AUC (o-«) T 1/2 (h) Vd (ml/kg)
(|jg*h/mL) (|jg*h/mL)
25 de BTT-1023
33200 55100 120 71
25 de BTT-1023
20600 23900 53 69
40 de BTT-1002
19100* 19100* * LO CM -vi en *
*media de n=2
Ejemplo 9
Composiciones farmacéuticas de los anticuerpos completamente humanos
Ejemplos de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano de acuerdo con la presente invención, adecuada para la administración parenteral, administrada como una solución para inyectable o para infusión o en forma de producto concentrado para semejante disolución.
Cantidad porcentual de ingrediente con respecto a 1 ml de anticuerpo anti-VAP-1 0,1 -10%
Cloruro de sodio o cloruro de potasio 0,5 -1,5%
Hidrogenofosfato disódico dihidratado 0,1 - 2%
Dihidrogenofosfato de sodio o potasio 0,1 - 2%
Sacarosa 0,5 -10%
Polysorbate 20 u 80 0,01 - 1%
Agua para inyectables hasta 1 ml
Cantidad porcentual de ingrediente con respecto a 1 ml de anticuerpo anti-VAP-1 0,1 -10%
Cloruro de sodio 0,5 -1,5%
EDTA / DTPA 0,01 -1,5%
Manitol 0,1 -5 %
Polysorbate 20 u 80 0,01 - 1 %
Citrato de sodio en forma de dihidrato 0,5 - 5%
Agua para inyectables hasta 1 ml
Ejemplo 10
Eficacia de anticuerpos completamente humanos en modelos in vivo de inflamación
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Eficacia del tratamiento con anticuerpo para VAP-1 completamente humano en la artritis inducida por colágeno en mono rhesus
Se evalúa el efecto de los anticuerpos completamente humanos en el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA) en el mono rhesus cuyo objeto es reunir datos de la utilidad del anticuerpo BTT-1023 en indicaciones artríticas.
Se seleccionan para el estudio monos rhesus adultos, negativos en términos de MHC A26, que tienen una incidencia de CIA de 99%, inmunizados con colágeno de tipo II bovino. Se dividen diez animales en dos grupos de cinco animales. Se induce la artritis inyectando 3-5 mg de colágeno bovino en coadyuvante completo de Freund en 10 aplicaciones en el dorso del animal. Utilizando este enfoque, la artritis es clínicamente evidente a las 3 - 5 semanas de la inmunización y dura normalmente 7-9 semanas.
El tratamiento intravenoso de cuatro semanas con los anticuerpos completamente humanos a dosis entre 1 y 50 mg/kg dos veces por semana se inicia cuando se detecta un nivel de CRP > 20 mg/l en dos registros consecutivos. La disolución de vehículo se administra a los animales de control. Se evalúa el estado de los animales utilizando una puntuación clínica global (0 = sin síntomas clínicos de artritis, 0,5 = fiebre (> 0,5°C), 1 = apatía, movilidad reducida y pérdida de apetito, 2 = pérdida de peso, extremidades y/o articulaciones calientes, dolor pero sin hinchazón de tejidos blandos (STS), 3 = enrojecimiento moderado y STS de las articulaciones, flexibilidad normal de las extremidades, 4 = enrojecimiento grave y STS de las articulaciones, sin rigidez de la articulación, 5 = artritis tan grave que está indicada la eutanasia), y puntuación de la gravedad de CIA (la gravedad de la hinchazón de los tejidos blandos, flexibilidad y crepitación puntuadas en una escala de - a +++: - ninguna, ± dudosa, + moderada, ++ grave, +++ extrema). Todos estos parámetros dan como resultado una puntuación clínica global de la gravedad de la CIA que es una escala semi-cuantitativa.
Eficacia de los anticuerpos para VAP-1 completamente humanos en el tratamiento de la artritis inducida por anticuerpos contra el colágeno en ratón con VAP-1 humanizada
Se puede evaluar la eficacia de los anticuerpos completamente humanos sobre la artritis inducida por anticuerpos contra el colágeno en ratones transgénicos que expresan VAP-1 humana sobre el endotelio. Se induce una artritis que progresa rápidamente inyectando un cóctel de anticuerpos seguido de lipopolisacárido intraperitoneal tres días más tarde. Se administran dosis intravenosas de 3, 10 o 30 mg kg_1 del anticuerpo completamente humano a los ratones los días 1, 3 y 7. Los animales de control reciben vehículo. Se puede demostrar una reducción de la enfermedad artrítica, como evidencian las reducciones estadísticamente significativas de la puntuación artrítica en comparación con los controles.
Eficacia del tratamiento con anticuerpo para VAP-1 en un modelo de psoriasis de ratón humanizado
El reciente establecimiento y la validación de un modelo de xenotransplante humanizado han proporcionado una herramienta valiosa para incrementar la comprensión de esta enfermedad y para someter a ensayo nuevas terapias con fármacos (Nickoloff BJ. Expert Opin. Investig. Drugs. (1999) 8:393-401).
En este modelo, se transplantan biopsias de piel de grosor completo, sin lesión procedentes de pacientes psoriásicos a ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) anestesiados de aproximadamente 7-9 semanas de edad, como se ha descrito previamente (Wrone-Smith T. et al. J. Clin. Invest. (1996) 98:1878-1887). Se permite que los animales se recuperen de la cirugía durante al menos 2-3 semanas antes de la inducción de la enfermedad. Se aíslan células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) a partir de una muestra de sangre tomada en la biopsia y se activan con el superantígeno SEB (enterotoxina B Estafilocócica). La inyección de las PBMC activadas, intravenosamente o intradérmicamente en el xenoinjerto, induce la enfermedad.
El anticuerpo para VAP-1 completamente humano o el vehículo se administran intravenosamente o subcutáneamente. Son posibles regímenes de dosificación tanto profilácticos como terapéuticos de diferente duración. Además, se pueden inyectar intravenosamente células T humanas marcadas después del tratamiento con anticuerpo para VAP-1 completamente humano con el fin de investigar el efecto sobre la infiltración celular con más detalle.
Al final del período de tratamiento, los ratones se sacrifican y los injertos se escinden junto con piel circundante del ratón y se fijan en formalina o se congelan instantáneamente en nitrógeno. Se realizan la histología y la inmunohistoquimica con el fin de puntuar los cambios patológicos como cambios en el grosor de la epidermis, infiltración celular, y expresión de las moléculas de adherencia. Se puede demostrar una reducción en la enfermedad psoriásica, como evidencian las reducciones estadísticamente significativas en la puntuación en comparación con los controles.
Eficacia del anticuerpo para VAP-1 completamente humano en el tratamiento de la inflamación del hígado resultante de la administración de CCU al ratón con VAP-1 humanizada
El efecto del anticuerpo para VAP-1 completamente humano sobre la inflamación del hígado y la fibrosis se evalúa en un modelo murino de fibrosis del hígado resultante de la administración de CCU. Se inyectan 0,25 pl/g de CCU ip dos veces por semana durante 12 semanas a ratones transgénicos que expresan VAP-1 humana en el endotelio. Se
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desarrollan una inflamación del hígado y unas cicatrices considerables a lo largo de 12 semanas, pero, al cesar las inyecciones de CCU, las cicatrices se resuelven completamente. La eficacia del anticuerpo completamente humano administrado i.v. o i.p. a dosis entre 1 y 25 mg/kg dos veces por semana en la prevención de la lesión y la resolución de las fibrosis existentes utilizando este modelo se investiga por medio de la puntuación de los cambios patológicos e histólogicos en el hígado. Se puede demostrar una reducción de la enfermedad, como evidencian las reducciones estadísticamente significativas en la puntuación en comparación con los controles.
Eficacia del tratamiento con anticuerpo para VAP-1 en un modelo de infarto de miocardio agudo en conejo anestesiado
Se realiza una toracotomía izquierda en conejos blancos New Zealand ventilados mecánicamente anestesiados. El corazón se expone y se aísla la arteria coronaria izquierda (LCA) y se ocluye. El anticuerpo para VAP-1 completamente humano se administra intravenosamente 25 minutos después del inicio de la oclusión. Cinco minutos después de la administración del anticuerpo, la oclusión se elimina y a continuación se reperfunde la zona hasta durante 6 horas. El animal se sacrifica por medio de una sobredosis del anestésico utilizado y el corazón se retira y se enjuaga con solución salina. De nuevo se ocluye la LCA y se perfunde Azul Monastral o de Evans a través del corazón, coloreando el miocardio, pero dejando la zona en riesgo sin colorear. El corazón se congela y el ventrículo izquierdo se corta en secciones finas. Se determinan las secciones cortadas totales y la zona en riesgo utilizando un sistema de análisis por imágenes. Las secciones se incuban a continuación con una disolución de cloruro de trifeniltetrazolio al 1% (TTC) en solución salina tamponada con fosfato seguido de incubación en formalina tamponada neutra al 10%. El miocardio viable se colorea de color rojo mediante incubación con TTC y la zona infartada se determina de ese modo midiendo la zona de tejido no teñida y se expresa como el porcentaje de la zona en riesgo determinada. Se puede demostrar una reducción del daño tisular, como evidencian las reducciones estadísticamente significativas en el porcentaje de la zona en riesgo en comparación con los controles.
Eficacia del tratamiento con anticuerpo para VAP-1 en la artritis inducida por mBSA en conejos
Se mezcla albúmina de suero bovino metilada (mBSA) disuelta en solución salina fisiológica con un volumen igual de coadyuvante completo de Freund, y se prepara una emulsión. Se inmunizan ratones blancos New Zealand mediante inyección intradérmica de la emulsión dos veces, con una diferencia de catorce días. Aproximadamente 10 días después de la segunda inmunización, se recoge suero de los animales, y se administra una inyección intradérmica de disolución de mBSA. Los animales que muestran reacciones cutáneas positivas se seleccionan, y se dividen al azar en grupos de tratamiento basándose en los títulos en suero de IgG anti-mBSA.
Catorce días después de la segunda inmunización se administra intravenosamente o subcutáneamente anticuerpo para VAP-1 o vehículo, justo antes de la inyección de disolución de mBSA en la cavidad de la articulación de la rodilla derecha. En la rodilla izquierda de cada animal se inyecta solución salina fisiológica. Se administran inyecciones de anticuerpo para VAP-1 o de control negativo una vez o dos veces por semana a lo largo de todo el estudio.
Desde el día de la inducción (día 0), se observan el comportamiento de los conejos y la apariencia externa mediante inspección y palpación diaria y se registran los pesos corporales a intervalos especificados a lo largo de todo el estudio. Se evalúa la hinchazón de la rodilla en momentos puntuales determinados de antemano comparando el diámetro de las rodillas inflamada (derecha) y no inflamada (izquierda).
Al final de la parte experimental del estudio (día 21) los animales se sacrifican. Se recoge fluido sinovial para la determinación del número total de glóbulos blancos de la sangre y el contenido de proteína. La membrana sinovial de cada animal se disecciona de las articulaciones de la rodilla y se divide longitudinalmente en dos especímenes en el lugar de la patella. Uno se congela profundamente en nitrógeno líquido para la determinación del anticuerpo para VAP-1 y la expresión de VAP-1, y los otros especímenes de la membrana sinovial y los tejidos de la articulación de la rodilla residual se fijan en formalina tamponada neutra al 10% para la tinción con hematoxilina y eosina (HE), y ácido fosfotúngstíco-hematoxilina (PTAH). Las secciones teñidas con HE se evalúan para determinar las reacciones inflamatorias, y las secciones teñidas con PTAH se evalúan para determinar el grado de depósito de fibrina sobre la superficie de la membrana sinovial. Se puede demostrar una reducción en la enfermedad artrítica, como evidencian las reducciones estadísticamente significativas en la puntuación en comparación con los controles.
En conclusión, estos ejemplos demuestran que los anticuerpos anti-VAP-1 completamente humanos conservaban las propiedades de reconocimiento de VAP-1 específicas de los anticuerpos anti-VAP-1 (Ejemplo 2 y 6), bloqueaban la transmigración de leucocitos a través del endotelio dependiente de VAP-1 (Ejemplo 7) y tenían mejores propiedades farmacocinéticas en comparación con los anticuerpos monoclonales anti-VAP-1 anteriores (Ejemplo 8).

Claims (22)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo anti-VAP-1 o un fragmento de unión a VAP-1 del mismo, caracterizado porque es completamente humano y comprende
    i) tres CDR de polipéptido de cadena pesada representados en los SEQ ID NOs: 4 , 9 y 14, respectivamente, y tres CDR de polipéptido de cadena ligera representados en los SEQ ID NO: 27, 32 y 37, respectivamente;
    en donde el anticuerpo anti-VAP-1 o un fragmento de unión a VAP-1 del mismo tiene una Kd inferior a la de un anticuerpo anti-VAP-1 quimérico denominado BTT-1002, habiéndose estimado KDcon un ensayo de resonancia de plasmón superficial de Biacore.
  2. 2. Un anticuerpo anti-VAP-1 o un fragmento de unión a VAP-1 del mismo, caracterizado por que es completamente humano y comprende:
    i) una región variable de cadena pesada representada en el SEQ ID NO:19 o en sus variantes de secuencia conservativa, y una región variable de cadena ligera representada en el SEQ ID NO: 42 o en sus variantes de secuencia conservativa;
    ii) una región variable de cadena pesada representada en el SEQ ID NO:20 o en sus variantes de secuencia conservativa, y una región variable de cadena ligera representada en el SEQ ID NO: 43 o en sus variantes de secuencia conservativa; o
    iii) una región variable de cadena pesada representada en el SEQ ID NO:21 o en sus variantes de secuencia conservativa, y una región variable de cadena ligera representada en el SEQ ID NO: 44 o en sus variantes de secuencia conservativa;
    donde el anticuerpo anti-VAP-1 o un fragmento de unión a VAP-1 del mismo tiene una Kd inferior a la de un anticuerpo anti-VAP-1 quimérico denominado BTT-1002, habiéndose estimado KDcon un ensayo de resonancia de plasmón superficial de Biacore.
  3. 3. Un anticuerpo anti-VAP-1, o un fragmento de unión a VAP-1 del mismo, caracterizado por que es completamente humano y comprende:
    i) una región variable de cadena pesada representada en el SEQ ID NO:19 y una región variable de cadena ligera representada en el SEQ ID NO: 42;
    ii) una región variable de cadena pesada representada en el SEQ ID NO:20 y una región variable de cadena ligera representada en el SEQ ID NO: 43; o
    iii) una región variable de cadena pesada representada en el SEQ ID NO:21 y una región variable de cadena ligera representada en el SEQ ID NO: 44.
  4. 4. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo i) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende un polipéptido de cadena pesada representado en el SEQ ID NO:47, y un polipéptido de cadena ligera representado en el SEQ ID NO:48.
  5. 5. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho fragmento de anticuerpo es un Fab, Fab', F(ab')2, Fv o Fv de cadena sencilla.
  6. 6. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo recombinante.
  7. 7. Un vector de expresión que codifica el anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:
    i) las secuencias de ácido nucleico representadas en los SEQ ID NOs: 49, 54, 59, 69, 69, 74 y 79, o en sus variantes de secuencia conservativa;
    ii) las secuencias de ácido nucleico representadas en los SEQ ID NOs: 50, 55, 60, 70, 75 y 80, o en sus variantes de secuencia conservativa;
    iii) las secuencias de ácido nucleico representadas en los SEQ ID NOs: 51, 56, 61, 71, 76 y 81, o en sus variantes de secuencia conservativa;
  8. 8. El vector de expresión según la reivindicación 7, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID Nos: 64 a 68 y sus variantes de secuencia conservativa.
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  9. 9. El vector de expresión según la reivindicación 7, que comprende una secuencia de nucleótidos representada en el SEQ ID NO 89, o su variante de secuencia conservativa.
  10. 10. El vector de expresión según la reivindicación 7, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NOs: 84 a 88 y sus variantes de secuencia conservativa.
  11. 11. El vector de expresión según la reivindicación 7, que comprende una secuencia de nucleótidos representada en el SEQ ID NO 90, o su variante de secuencia conservativa.
  12. 12. Una célula anfitriona o un organismo no humano que comprende un vector de expresión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11.
  13. 13. Un método para producir un anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano, que comprende las etapas de
    a) transformar un anfitrión adecuado con al menos un vector de expresión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11,
    b) cultivar dicho anfitrión en condiciones que favorecen la expresión, y
    c) purificar los anticuerpos completamente humanos ensamblados a partir del medio de cultivo.
  14. 14. Un anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso como medicamento o para su uso in vivo como agente de diagnóstico.
  15. 15. Un método de diagnóstico in vitro que comprende un anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
  16. 16. El uso de un anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno inflamatorio mediado por VAP-1 seleccionado del grupo que consiste en artritis y enfermedades del tejido conectivo, enfermedades inflamatorias intestinales, dermatosis, esclerosis múltiple, neuropatía inflamatoria, miopatía inflamatoria, encefalomielitis diseminada aguda, vasculitis del sistema nervioso central, síndrome de Sjogren, diabetes, lupus eritematoso generalizado, asma, enfermedad inflamatoria del hígado, enfermedad de Graves y tiroiditis.
  17. 17. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
  18. 18. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 17 para usar en el tratamiento o el diagnóstico de un trastorno inflamatorio mediado por VAP-1 seleccionado del grupo que consiste en artritis y enfermedades del tejido conectivo, enfermedades inflamatorias intestinales, dermatosis, esclerosis múltiple, neuropatía inflamatoria, miopatía inflamatoria, encefalomielitis diseminada aguda, vasculitis del sistema nervioso central, síndrome de Sjogren, diabetes, lupus eritematoso generalizado, asma, enfermedad inflamatoria del hígado, enfermedad de Graves y tiroiditis.
  19. 19. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dichas artritis y enfermedades del tejido conectivo se seleccionan del grupo que consiste en artropatías reactivas, artropatías postinfecciosas, poliartropatías inflamatorias, trastornos sistémicos del tejido conectivo, espondiloartropatías inflamatorias, miositis, sinovitis, enfermedad de Reiter, artritis reumatoide seropositiva, artritis reumatoide, enfermedad reumatoide extraarticular, artropatías psoriásicas y enteropáticas, artritis juvenil, artritis, poliarteritis nodosa y afecciones relacionadas, vasculopatías necrotizantes, dermatopolimiositis, esclerosis sistémica, implicación sistémica del tejido conectivo, espondilitis anquilosante y espondilopatías inflamatorias.
  20. 20. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicha enfermedad intestinal inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.
  21. 21. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dichas dermatosis se seleccionan del grupo que consiste en trastornos bulosos, dermatitis, trastornos papuloescuamosos, eritema, líquen escleroso y atrófico, craurosis vulvar, lupus eritematoso discoide, morfea, pénfigo, penfigoide, dermatitis herpetiforme, dermatitis atópica, dermatitis de contacto alérgica, dermatitis de contacto irritante, dermatitis de contacto, psoriasis, eritema multiforme.
  22. 22. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicho trastorno inflamatorio se selecciona del grupo que consiste en aterosclerosis, inflamación del ojo incuyendo uveitis, iritis, iridociclitis, hepatitis alcohólica, transplante con aloinjerto, transplante con xenoinjerto, glomerulonefritis, lesión por reperfusión y afecciones inflamatorias agudas después de infarto de miocardio e ictus.
    1VI QLTQS PSS LSASVGDRVT
    1 gtcatccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcacc 21 I T C R A S Q G I S R A L A W Y Q Q K P
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    Fig. 1A
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    1QVQLVESGGGVVQPGRSLRL 1 caggtgcaactggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactc 21SCAASGFTFFSYAMHWVRQT 61 tcctgtgcagcgtctggattcaccttctttagctatgccatgcactgggtccgccagact 41PGKGLEWVAVIWFDGSNENY 121 ccaggcaaggggc tggagtgggtggcagttatatggt ttgatggaagtaatgaaaactat 61VDSVKGRFTI SRDNSKNTLY 181 qtaqactccqtqaaqqqccqattcaccatctccaqaqacaattccaaqaacacqctqtat 81 L QMNTLRAE D TAVYY CARDA 241 ctgcaaatgaacaccctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagatgcc 101 WSYFDYWGQGTLVTVS S 301 tggagctactttqactactgqqqccaqqqaaccctqqtcaccqtctcctca
    Fig. 1B
    1EIVLT Q S PAT LSLS PG ERAT
    l gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccacc 21 I> S C R A S Q S V S SYLAWYQ QKP
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    Fig. 2A
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    101 fgsgtyffyfdywgqgtlvt
    301 tttggttcggggacttatttcttctactttgactactggggccagggaaccctggtcacc 121 F S S 361 ttctcctca
    Fig. 2B
    ÍAI'QLTQSPSSLSASVGDRVT 1 gccatccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcacc 21 I T CRA S Q G I S R A L A W Y Q Q K P
    61 atcacttgccgggcaagtcagggcattagcagagctttagcctggtatcagcagaaacca 41GKA PKLLI YDASNL ERGVPS 121 gggaaagctcctaagctcctgatctatgatgcctccaatttggaaagaggggtcccatca 61 R F SG S G S GTD FTLT I S S LQ P
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    301 gggaccaaggtggagatcaaa
    Fig. 3A
    3F10 VH
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    301 tggggatacttteactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
    Fig. 3B

    1DIQMTQSPSSLSASVGDRVT l gacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcacc 21I.TCRA8.QG I S SWLAWY Q Q K P

    61 atcacttqtcggqcqaqtcagqqtattagcaqctqqttaqcctgqtatcaqcaqaaacca 41 E K A P KS L I Y. GAS SLQS G V P S

    121 gagaaagcccctaagtccctgatctatggtgcatccagtttgcaaagtggggtcccatca 61 R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P
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    Fig. 4A
    5F12Vh
    1QVQLVD SGGDVVQ PGRS LRL 1 caggtgcagctggtggactctgggggagacgtggtccagcctgggaggtccctgagactc 21 S CAASGF S FSRSG XHWVRQA 61 tcctgtgcagcgtctggattcagtttcagtcggtctggcatacactgggtcegccaggct 41PGKG. LEWVAVIWYDGIYKYY 121 ccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatqgtatgatggaatttataagtactat 61ADSVKGRFTISRDNSKNTLY 181 gcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaat.tccaagaacacgctgtat 81LQMNSLRAEDTAVYYCAREK 241 ctqcaaatqaacaqcctqaqqqccqaqqacacqqctqtqtattactqtqcgaqaqaqaaq 101 N WGXDYWGQGTL VTVSS 301 aactgggqaattgactactqqqqccaqqqaaccctqqtcaccgtctcctca
    Fig. 4B
    1 E I V L T Q S P G T L S L S P G D R A T
    1 gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggatagagccacc 21 L S C RAS Q S V S S S F L-AWY Q Q K
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    Fig. 5A
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    1EVQLVQSGGGLVHPGGSLRL 1 gaggttcagctggtgcagtctgggggaggcttggtacatccgggggggtccctgagactc 21SCAGSGFPVSSYGMHWVR QA 61 tcctgtgcaggctctggattccccgtcagtagctatggaatgcactgggttcgccaggct 41PGKGLEWVSAI GVGGGTYHV 121 ccaqqaaaaggtctqgagtgqqtatcaqctattqqtgttqqtqqtqqcacataccatgta 61DSVKGRFTI SRDNAKNSLYL 181 gattccqtgaaqqqccgattcaccatctccagagacaatqccaaqaactccttqtatctt 81QMNSLRAGDMAVYY CARDPG 241 caaatgaacagcctgagagccgqggacatgqctgtgtattactgtgcaagagatcctgqq 101 FGEVYFDYWGQGTLVTVSS 301 ttcqgqqaggtctactttgactattqqqqccaqggaaccctqgtcaccgtctcctca
    Fig. 5B
    imagen1
    imagen2
    imagen3
    imagen4
    Eventos
    Eventos
    Fluorescencia
    Flg. 7
    h-
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    en
    oo
    Figuras
    PBMC Migradas,campo
    imagen5
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