ES2654551T3 - Anticuerpo contra el CSF-1R - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado, recombinante o purificado que se une específicamente a CSF-1R, más preferentemente CSF-1R humano, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende: (i) (a) una primera región variable que consiste en la SEQ ID NO 42 y (b) una segunda región variable que consiste en la SEQ ID NO:44; o (ii) (a) una primera región variable que consiste en la SEQ ID NO:43, y (b) una segunda región variable que consiste en la SEQ ID NO:45; o (iii) (a) una primera región variable que consiste en la SEQ ID NO:42, y (b) una segunda región variable que consiste en la SEQ ID NO:46.

Description

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(continuación)

Aminoácido original

Sustitución conservativa preferida Sustitución conservativa más preferida

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D, Q D

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A A

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N, Q, K, R R

I

L, V, M, A, F L

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I, V, M, A, F I

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R, Q, N R

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L, F, I L

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W, L, V, I, A, Y Y

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A A

S

T T

T

V, S S

W

Y, F Y

Y

W, F, T, S F

V

L, M, F, A L

Se desvela también un procedimiento para modificar el anticuerpo de la invención mediante maduración por afinidad.

Tal como se usa en el presente documento, "maduración por afinidad" se refiere a la sustitución de uno o más aminoácidos comprendido(s) en una o más CDR, dando como resultado dicha sustitución una mejora en la afinidad del anticuerpo a CSF-1R, en comparación con un anticuerpo precursor que no posee aquella(s) sustitución(ones). Se conocen en la técnica procesos de maduración por afinidad. Véanse, por ejemplo, los procedimientos desvelados en MARKS, y col. By-passing immunization: building high affinity human antibodies by chain shuffling. Biotechnology. 1992, vol. 10, n.º 7, págs. 779-83 ; BARBAS, y col. In vitro evolution of a neutralizing human antibody to human immunodeficiency virus type 1 to enhance affinity and broaden strain cross-reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1994, vol. 91, n.º 9, págs. 3809-13. ; SCHIER. Identification of functional and structural amino-acid residues by parsimonious mutagenesis. Gene. 1996, vol. 169, n.º 2, págs. 14755 ; YELTON. Affinity maturation of the BR96 anti-carcinoma antibody by codon-based mutagenesis. J. immunol. 1995, vol.155, n.º 4, págs. 1994-2004 ; JACKSON, y col. In vitro antibody maturation. Improvement of a high affinity, neutralizing antibody against IL-1 beta. J. immunol. 1995, vol. 154, n.º 7, págs. 3310-9. y HAWKINS, y col. Selection of phage antibodies by binding affinity. Mimicking affinity maturation. Journal of molecular biology. 1992, vol. 226, n.º 3, págs. 889-96.

Por tanto, se desvela también un anticuerpo, que se une específicamente a CSF-1R, obtenido mediante maduración por afinidad como se ha descrito anteriormente.

Se describen también variantes del anticuerpo previamente descritas, que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferentemente al menos 85%, más preferentemente al menos 90%, incluso más preferentemente 98% homóloga a la secuencia de ácido nucleico del anticuerpo anteriormente descrito.

En otra realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención se une específicamente a más de un epítopo. Por ejemplo, el anticuerpo de acuerdo con la invención puede unirse a dos epítopos diferentes de CSF-1R. Como alternativa, el anticuerpo de acuerdo con la invención puede ser capaz de unirse a CSF-1R y a otra molécula. Tal como se usa en el presente documento, los anticuerpos que se unen específicamente a más de un epítopo pueden ser anticuerpos reticulados. Por ejemplo, un anticuerpo puede acoplarse a avidina, el otro a biotina. pueden prepararse anticuerpos reticulados utilizando cualesquiera procedimientos de reticulación convenientes bien conocidos en la materia. Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito por ejemplo en BRENNAN, y col. Preparation of bispecific antibodies by chemical recombination of monoclonal immunoglobulin G1 fragments. Science, 1985, vol. 229, n.º 4708, págs. 81-3 y SHALABY, y col. Development of humanized bispecific antibodies reactive with cytotoxic lymphocytes and tumor cells overexpressing the HER2 protooncogene. The Journal of experimental medicine. 1992, vol. 175, n.º 1, págs. 217-25; KOSTELNY, y col. Formation of a bispecific antibody by the use of leucine zippers. J. immunol. 1992,

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-Ensayo In Vivo: el anticuerpo de la presente invención ejerce efectos antitumorales frente a animales, incluyendo seres humanos, que transportan células de cáncer humano que expresan CSF1-R,

-Ensayo In Vivo: el anticuerpo de la presente invención inhibe la proliferación de células AML5 dependiente de CSF-1.

-Ensayo In Vivo: el anticuerpo de la presente inhibición inhibe parcialmente la fosforilación de CSF-1R dependiente de CSF-1;

-Ensayo In Vivo: el anticuerpo de la presente invención no tiene actividad agonista sobre CSF-1R.

El anticuerpo de acuerdo con la invención puede estar glicosilado o no glicosilado.

Tal como se usa en el presente documento, el término "glicosilación" se refiere a la presencia de unidades de hidratos de carbono que están unidas covalentemente al anticuerpo.

En otra realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención se conjuga con un agente radiosensibilizante, un receptor y/o un agente citotóxico

Tal como se usa en el presente documento, el término "radiosensibilizante" se refiere a una molécula que hace que las células sean más sensibles a la radioterapia. Los radiosensibilizantes incluyen, aunque no de forma limitativa, metronidazol, misonidazol, desmetilmisonidazol, pimonidazol, etanidazol, nimorazol, mitomicina C, RSU 1069, SR 4233, E09, RB 6145, nicotinamida, 5-bromodesoxiuridina (BUdR), 5-yododesoxiuridina (IUdR), bromodesoxicitidina, fluorodesoxiuridina (FUdR), hidroxiurea y cisplatino.

Tal como se usa en el presente documento, el término "receptor" se refiere a un compuesto capaz de unirse específicamente a un ligando. De acuerdo con una realización preferida de la invención, el receptor es biotina.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión agente citotóxico se refiere a un compuesto que es directamente tóxico para las células, evitando su reproducción o crecimiento. De acuerdo con una realización preferida, el agente citotóxico usado en el contexto de la presente invención se selecciona entre el grupo que comprende un agente terapéutico contra el cáncer, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o sus fragmentos), o un isótopo radioactivo.

En otra realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención se conjuga con un agente de marcado.

Tal como se usa en el presente documento, "un agente de marcado" se refiere a un compuesto detectable. El agente de marcado puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores de radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la modificación química de un compuesto sustrato que es detectable.

Tal como se usa en el presente documento, el término "conjugado" significa que el anticuerpo de acuerdo con la invención y el agente de marcado se unen covalentemente o no covalentemente.

"Unión covalente" se refiere a un acoplamiento mediante grupos funcionales reactivos, opcionalmente con el uso intermediario de un reticulador u otro agente de activación (véase, por ejemplo, HERMANSON. Bioconjugate techniques. Academic Press 1996). El anticuerpo de acuerdo con la invención y/o el agente conjugado puede estar modificado a fin de permitir su acoplamiento mediante, por ejemplo, sustitución en un grupo carbonilo activado (incluyendo aquellos activados in situ) o en un imidoéster, mediante la adición en un grupo carbonilo insaturado, mediante aminación reductora, sustitución nucleófila en un átomo de carbono saturado o en un heteroátomo, mediante reacción en ciclos aromáticos, En particular, se puede llevar a cabo el acoplamiento utilizando reactivos de reticulación homobifuncionales o heterobifuncionales. Se pueden usar reticuladores homobifuncionales incluyendo glutaraldehído, ácido succínico y bis-imidoéster análogos a DMS (dimetil suberimidato) para acoplar grupos amino que pueden estar presentes en los diversos restos. Se proporcionan numerosos ejemplo en HERMANSON. Bioconjugate techniques. Academic press, 1996. págs. 118-228. que son biern conocidos por los expertos en la materia. Los reticuladores heterobifuncionales incluyen aquellos que tienen grupos amina reactivos y grupos sulfhidrilo reactivos, los grupos carbonilo reactivos y los grupos sulfhidrilo reactivos y los grupos sulfhidrilo reactivos y enlazadores fotorreactivos. Los reticuladores heterobifuncionales adecuados se describen, por ejemplo, en HERMANSON. Bio-conjugate techniques. Academic press, 1996 págs. 229-285, Los ejemplos son, por ejemplo, SPDP (propionato de N-succinimidil 3-(2-piridilditio)), SMBP (butirato de succinimidil-4-(p-maleimidofenilo)), SMPT (succinimidiloxicarbonil-α-metil-α-(2-piridilditio)tolueno), MBS (éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida), SIAB (aminobenzoato de N-succinimidil (4 yodoacetilo)), GMBS (éster de γ-maleimidobutiriloxi) succinimida), SIAX (hexonato de succinimidil-6-iodoacetil amino), SIAC (succinimidil-4-yodoacetil aminometilo), NPIA (yodoacetato de pnitrofenilo). Otros ejemplos son útiles para acoplar moléculas que contienen hidratos de carbono (por ejemplo, glicoproteínas env, anticuerpos) a grupos sulfhidrilo reactivos. Los ejemplos incluyen MPBH (hidrazida del ácido 4(4-N maleimidofenil) butírico) y PDPH (4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxil-hydrazida (M2C2H y 3-2(2pyridyldithio) proprionil hidrazida).

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para la expresión del anticuerpo de acuerdo con la invención.

Los elementos necesarios para la expresión consisten en todos lo elementos que permiten transcribir la secuencia de ácido nucleico en el ARN y al ARNm traducirse en el polipéptido. Estos elementos comprenden, en particular, un promotor que puede ser regulable o constitutivo. Naturalmente, el promotor es adecuado para el vector seleccionado y la célula hospedadora. Los ejemplos que se pueden mencionar son los promotores eucariotas de la PGK (fosfoglicerato quinasa), MT (metalotioneína; MCIVOR. Purina nucleósido fosforilasa y adenosina desaminasa humanas: transferencia génica en células cultivadas y hemocitoblastos de murino utilizando retrovirus anfotrópicos recombinantes. Molecular and cellular biology. 1987, vol. 7, n.º 2, págs. 838-46), antitripsina a-1, CFTR, tensioactivo, inmunoglobulina, actina (TABIN, y col. Adaptation of a retrovirus as a eukaryotic vector transmitting the herpes simplex virus thymidine kinase gene. Molecular and cellular biology. 1982, vol. 2, n.º 4, págs. 426-36 y SRa (TAKEBE, y col. SR alpha promoter: an efficient and versatile mammalian cDNA expression system composed of the simian virus 40 early promoter and the R-U5 segment of human T-cell leukemia virus type 1 long terminal repeat. Molecular and cellular biology. 1988, vol. 8, n.º 1, págs.466-72). Los genes, del promotor temprano del virus SV40 (virus de simio), de la LTR del VSR (virus del sarcoma de Rous), del promotor TK del HHS-I, del promotor temprano del virus CMV (Citomegalovirus), de los promotores p7.5K pH5R, de pK1 L, p28 y p11 del virus vaccinia, de promotores quiméricos tales como p11K7.5 y los promotores adenovíricos E1A y MLP. El promotor puede ser también un promotor que estimula la expresión en una célula tumoral o cancerosa. Se puede hacer mención particular de los promotores del gen MUC-I, que se expresan en exceso en los cánceres de mama y próstata (CHEN, y col. Breast cancer selective gene expression and therapy mediated by recombinant adenoviruses containing the DF3/MUC1 promoter. The Journal of clinical investigation. 1995, vol. 96, n.º 6, págs. 2775-82), del gen CEA (que significa antígeno de carcinoma embriónico), que se expresa en exceso en cánceres de colon (SCHREWE, y col. Cloning of the complete gene for carcinoembryonic antigen: analysis of its promoter indicates a region conveying cell type-specific expression. Molecular any cellular biology. 1990, vol. 10, n.º 6, págs 2738-48.) del gen de la tirosinasa, que se expresa en exceso en melanomas (VILE, y col. Use of tissue-specific expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene to inhibit growth of established murine melanomas following direct intratumoral injection of DNA. Cancer res. 1993, vol. 53, n.º 17, págs. 3860-4), del gen ERBB-2, que se expresa en exceso en los cánceres de mama y de páncreas (HARRIS, y col. Gene therapy for cancer using tumor-specific prodrug activation. Gene therapy. 1994, vol. 1, n.º 3, págs.170-5.) y del gen de la α-fetoproteína, que se expresa en exceso en cánceres de hígado (KANAI, y col. In vivo gene therapy for alpha-fetoprotein-producing hepatocellular carcinoma by adenovirus-mediated transfer of cytosine deaminase gene. Cancer res. 1997, vol. 57, n.º 3, págs. 4615). El promotor temprano del citomegalovirus (CMV) es muy particularmente preferido.

No obstante, cuando se usa un vector que se deriva de un virus Vaccinia (como por ejemplo, un vector MVA), el promotor del gen 7.5K de la timidina quinasa y el promotor pH5R son particularmente preferidos.

Los elementos necesarios pueden incluir además elementos adicionales que mejoran la expresión de la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención o su mantenimiento en la célula hospedadora. Se pueden mencionar en concreto las secuencias intrónicas, las secuencias de señalización de la secreción, las secuencias de localización nuclear, los sitios internos para el reinicio de la traducción de tipo IRES, las secuencias poli A de terminación de la transcripción, los líderes tripartitos y los orígenes de la replicación. Estos elementos son conocidos por las personas expertas. Entre la secuencia de señalización de la secreción, son particularmente preferidas las secuencias que codifican los polipéptidos que se muestran en la SEQ ID NO 5 y/u 8.

El vector recombinante de acuerdo con la invención puede comprender también uno o más genes de interés adicionales, siendo posible para estos genes colocarse bajo el control de los mismos elementos reguladores (casete policistrónico) o de elementos independiente. Los genes que se pueden mencionar en particular son los genes que codifican las interleuquinas IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, quimioquinas tales como CCL19, CCL20, CCL21, CXCL-14, interferones, factor de necrosis tumoral (TNF) y factores que actúan sobre la inmunidad innata y la angiogénesis (por ejemplo PAI-1, que significa inhibidor del activador del plasminógeno). En una realización particular, el vector recombinante de acuerdo con la invención comprende el gen de interés que codifica IL-2.

La presente invención se refiere también a una célula que comprende la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención. En una realización preferida, la célula de acuerdo con la invención es una célula eucariota y más preferentemente una célula de mamífero. Las células de mamíferos disponibles como hospedadores para la expresión son bien conocidas en la materia e incluyen muchas líneas de células inmortalizadas, tales como, aunque no de forma limitativa, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón de cría de hámster (BHK) y muchas otras. Las células eucariotas adicionales adecuadas incluyen levaduras y otros hongos.

La presente invención se refiere también a un procedimiento para producir un anticuerpo de acuerdo con la invención que comprende cultivar la célula de acuerdo con la invención en condiciones que permiten la expresión del anticuerpo y la purificación del anticuerpo a partir de la célula o el medio que rodea la célula.

En otra realización, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende uno cualquiera del anticuerpo, la secuencia de ácido nucleico o el vector de acuerdo con la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende además un compuesto de interés.

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El vehículo farmacéuticamente aceptable es preferentemente isotónico, hipotónico o débilmente hipertónico y tiene una fuerza iónica relativamente baja, tal como por ejemplo, una solución de sacarosa. Por otra parte, tal como un vehículo puede contener cualquier disolvente, o líquido acuoso o parcialmente acuoso tal como agua estéril no pirógena. El pH de la composición farmacéutica se ajusta, además, y se tampona con el fin de cumplir los requerimientos del uso in vivo. La composición farmacéutica puede incluir también un diluyente, adyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable, así como agentes solubilizantes, estabilizantes y conservantes. Para la administración inyectable, se prefiere una formulación en una solución acuosa, no acuosa o isotónica. esta puede proporcionarse en una única dosis o en una multidosis en forma líquida o seca (polvo, liofilizado y similar) que puede reconstituirse en el momento del uso con un diluyente adecuado.

Se desvela también un kit de una parte que comprende (i) una composición farmacéutica, un anticuerpo, una secuencia de ácido nucleico o un vector de acuerdo con la invención y, (ii) un compuesto de interés.

Como se usa en el presente documento, la expresión, "compuesto de interés" se refiere a un compuesto terapéutico y preferentemente a un agente terapéutico contra el cáncer o un compuesto útil en el tratamiento de disminución de la masa ósea.

El agente terapéutico contra el cáncer puede seleccionarse entre el grupo que comprende Abraxano (Formulación de nanopartículas estabilizada con paclitaxel albúmina), Adriamicina (Clorhidrato de doxorrubicina), Adrucil (Fluorouracilo), Aldara (Imiquimod), Alemtuzumab, Alimta (Pemetrexed disódico), Ácido aminolevulínico, Anastrozol, Aprepitant, Arimidex (Anastrozol), Aromasin (Exemestano), Arranon (Nelarabina), Trióxido de arsénico, Avastina (Bevacizumab), Azacitidina, Bevacizumab, Bexaroteno, Bortezomib, Campath (Alemtuzumab), Camptosar (Clorhidrato de irinotecan), Capecitabina, Carboplatino, Cetuximab, Cisplatino, Clafen (Ciclofosfamida), Clofarabina, Clofarex (Clofarabina), Clolar (Clofarabina), Ciclofosfamida, Citarabina, Citosar-U (Citarabina), Citoxan (Ciclofosfamida), Dacogen (Decitabina), Dasatinib, Decitabina, DepoCyt (Citarabina liposómica), DepoFoam (Citarabina liposómica), Clorhidrato de dexrazoxano, Docetaxel, Doxil (Liposomas de clorhidrato de doxorrubicina), Clorhidrato de doxorrubicina, Liposomas de clorhidrato de doxorrubicina, Dox-SL (Liposomas de clorhidrato de doxorrubicina), Efudex (Fluorouracilo), Ellence (clorhidrato de epirrubicina), Eloxatin (Oxaliplatino), Emend (Aprepitant), Clorhidrato de epirrubicina, Erbitux (Cetuximab), Clorhidrato de erlotinib, Evacet (Liposomas de clorhidrato de doxorrubicina), Evista (Clorhidrato de raloxifeno), Exemestano, Faslodex (Fulvestrant), Femara (Letrozol), Fluoroplex (Fluorouracilo), Fluorouracilo, Fulvestrant, Gefitinib, Clorhidrato de gemcitabina, Gemtuzumab Ozogamicina, Gemzar (Clorhidrato de gemcitabina), Gleevec (Mesilato de imatinib), Herceptina (Trastuzumab), Hicamtin (Clorhidrato de topotecan), Mesilato de imatinib, Imiquimod, Iressa (Gefitinib), Clorhidrato de irinotecan, Ixabepilona, Ixempra (Ixabepilona), Keoxifeno (Clorhidrato de raloxifeno), Kepivance (Palifermina), Ditosilato de lapatinib, Lenalidomida, Letrozol, Levulan (Ácido aminolevulínico), LipoDox (Liposomas de clorhidrato de doxorrubicina), Citarabina liposómica, Metazolastona (Temozolomida), Metotrexato, Milosar (Azacitidina), Milotarg (Gemtuzumab ozogamicina), Paclitaxel en forma de nanopartículas (Formulación de nanopartículas estabilizada con paclitaxel albúmina), Nelarabina, Neosar (Ciclofosfamida), Nexavar (Tosilato de sorafenib), Nilotinib, Nolvadex (Citrato de tamoxifeno), Oncaspar (Pegaspargasa), Oxaliplatino, Paclitaxel, Formulación de nanopartículas estabilizada con paclitaxel albúmina, Palifermina, Panitumumab, Paraplat (Carboplatino), Paraplatino (Carboplatino), Pegaspargasa, Pemetrexed disódico, Platinol-AQ (Cisplatino), Platinol (Cisplatino), Clorhidrato de raloxifeno, Revlimid (Lenalidomida), Rituxan (Rituximab), Rituximab, Aerosol intrapleural de esclerosol (Talco), Tosilato de sorafenib, Espricel (Dasatinib), Polvo de talco estéril (Talco), Esteritalco (Talco), Malato de sunitinib, Sutent (Malato de sunitinib), Sinovir (Talidomida), Talco, Citrato de tamoxifeno, Tarabina PFS (Citarabina), Tarceva (Clorhidrato de erlotinib), Targretina (Bexaroteno), Tasigna (Nilotinib), Taxol (Paclitaxel), Taxotere (Docetaxel), Temodar (Temozolomida), Temozolomida, Temsirolimus, Talomida (Talidomida), Talidomida, Totect (Clorhidrato de dexrazoxano), Clorhidrato de topotecan, Torisel (Temsirolimus), Trastuzumab, Trisenox (Trióxido de arsénico), Tikerb (Ditosilato de lapatinib), Vectibix (Panitumumab), Velcade (Bortezomib), Vidaza (Azacitidina), Vorinostat, Xeloda (Capecitabina), Zinecard (Clorhidrato de dexrazoxano), Ácido zoledrónico, Zolinza (Vorinostat) y Zometa (Ácido zoledrónico).

El compuesto útil en el tratamiento de la disminución de la masa ósea es un bifosfonato, unos moduladores selectivos de los receptores de estrógeno (SERM), una hormona paratiroidea (PTH) (por ejemplo teriparatida (Forteo)), ranelato de estroncio, Denosumab o calcitonina, o una de sus combinaciones. El bifosfonato puede seleccionarse entre el grupo que comprende Alendronato (Fosamax, Fosamax Plus D), Etidronato (Didronel), Ibandronato (Boniva), Pamidronato (Aredia), Risedronato (Actonel, Actonel W/Calcio), Tiludronato (Skelid), y ácido zoledrónico (Reclast, Zometa). Los SERM pueden seleccionarse entre el grupo que comprende raloxifeno (Evista), bazedoxifeno/premarina (Aprelal) y tamoxifeno.

De acuerdo con otra realización, la presente invención se refiere al uso del anticuerpo, la secuencia de ácido nucleico, el vector, o la composición farmacéutica de acuerdo con la invención para el tratamiento de las enfermedades asociadas con una actividad aumentada de los osteoclastos. Dichas enfermedades comprenden, aunque no de forma limitativa, endocrinopatías (hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatiroidismo primario o secundario, hipertiroidismo), hipercalcemia, estados de deficiencia (raquitismo/osteomalacia, escorbuto, desnutrición), enfermedades crónicas (síndromes de mala absorción, insuficiencia renal crónica (osteodistrofia renal), enfermedad hepática crónica (osteodistrofia hepática), fármacos (glucocorticoides (osteoporosis inducida por glucocorticoides), tratamiento de privación de andrógenos, tratamiento con inhibidores de la aromatasa, heparina,

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Figuras 29:A/B/C/D: Inhibición de la proliferación de células AML3 dependiente de CSF-1. Para la Figura 29A, Se tiñeron células AML5 tanto con el mAN 3291 dirigido contra CD115 humano (panel izquierdo) como con chCXIIG6 (panel derecho). Para cada panel, el histograma de la izquierda corresponde a células AML5 teñidas con los controles de isotipos (respectivamente IgG1 de ratón y rituximab). La Figura 29B muestra que el crecimiento de las células AML5 está estimulado por CSF-1 de una manera dependiente de la dosis. La Figura 29C muestra que las variantes de hCXIIG6 y chCXIIG6 inhiben la proliferación de las células AML5 dependiente de CSF-1, que muestra los resultados de tres experimentos independientes. La Figura 29D incluye los valores cuadrados de la CE50 y R, como se calculan mediante de software GraphPad Prism, a partir de los resultados que se muestran en la Figura 29C.

Figuras 30 A/B: Actividad de ADCC sobre las células EL4-CSF-R diana. En 30A, se utilizaron PBMC procedentes del donante de sangre n.º 1 como células efectoras para medir la actividad citotóxica de H27K5, H27K15 y H19K12 sobre las células EL4-CD115 diana a una relación E:T de 25. En 30B, se ensayaron PBMC procedentes del donante n.º 2 en el mismo ensayo que la Figura 30A en las relaciones E:T indicadas. Los asteriscos (*) indican p<0,05 en comparación con rituximab, mientras que los símbolos theta (Φ) indican p<0,05 en comparación con chCXIIG6.

Figuras 31 A/B: Efecto terapéutico en el modelo de tumor BeWo de coriocarcinoma

Figura 32: Listado de secuencias SEQ ID NO: 37 a SEQ ID NO:47

Ejemplos

Tinción específica de células NIH/3T3 transfectadas con CSF-1R por el mAb CXIIG6

Se generó la línea de células B4-800-5 mediante transfección estable de células NIH/3T3 con un plásmido de expresión que codifica el CSF-1R humano de longitud completa. Se verifico la expresión de CSF-1R en la superficie de la célula sobre células B4-800-5 mediante inmunotinción indirecta con los mAb 61701 dirigidos contra CSF-1R humano IgG1 de ratón, R&D Systems) o 2-4A5-4 (IgG1,k de rata, GeneTex), en comparación con los controles de isotipos (Figura 1, paneles superior e intermedio). Se utilizaron los sobrenadantes de los cultivos del hibridoma de CXIIG6 o de un hibridoma del control negativo para la inmunotinción de las células B4-800-5 o de las células NIH/3T3 precursoras (Figura 1 paneles inferiores).

El análisis de citometría de flujo mostró que el sobrenadante del cultivo de células B4-800-5 tiño selectivamente el hibridoma de CXIIG6, demostrando la especificidad del mAb para el CSF-1R de la superficie celular.

Inhibición parcial de la unión de CSF-1 para el CSF-1R de la superficie celular

Se incubaron 3 x 105 células THP-1 (línea de células de leucemia monocítica positivas para CSF-1R humano) durante 30 min a 4ºC en presencia de cualesquiera sobrenadantes del cultivo de hibridoma, suero de un ratón no expuesto anteriormente a tratamiento o de un ratón inmunizado contra CSF-1R (dilución 1:1000), el mAb 2-4A5-4 dirigido contra CSF-1R (GeneTex) o una IgG1 de rata del control (10 µg/ml), o sin reactivo. Después de dos lavados con PBS frío, se incubaron las células con 1 µg/ml de CSF-1 humano recombinante biotinilado durante 30 min. Se lavaron las células dos veces y se incubaron adicionalmente durante 30 min a 4ºC con 10 µg/ml de estreptavidina-Alexa Fluor 488 (Invitrogen). Tras el lavado con PBS y la fijación con paraformaldehído al 4%, se analizó la tinción de células mediante citometría de flujo.

Las intensidades de fluorescencia disminuidas en comparación con las muestras del control reflejan la inhibición de la unión de CSF-1 al CSF-1R de la superficie de la célula. El suero de un ratón inmunizado contra CSF-1R bloquea la unión de CSF-1 a las células TPH-1 (Figura 2). Mientras que el sobrenadante del hibridoma del control negativo o un mAb irrelevante no muestran efecto, El sobrenadante del cultivo del hibridoma de CXIIG6 parece inhibir, al menos parcialmente, la unión de CSF-1 a células THP-1 (Figura 2, panel de la derecha inferior).

Primera localización del sitio de unión del mAb CXIIG6.

Para identificar el sitio de unión del mAb CXIIG6 en el CSF-1R, se llevó a cabo una transferencia Western utilizando formas solubles del CSF-1R que comprenden cualquiera de los cinco dominios extracelulares análogos a inmunoglobulina (Met 1 a Glu 512, R&D Systems) o únicamente los tres dominios análogos a inmunoglobulina en el extremo N de la región extracelular de CSF-1R (Met 1 a Ser 290), fusionados ambos en sus extremos C-terminales a la región Fc de una IgG1 humana. Se usó una forma soluble del EGFR fusionado a una IgG1 Fc humana (R&D Systems) como un control negativo.

Se sometieron cientos de nanogramos de cada receptor soluble a electroforesis en condiciones naturales antes de la transferencia a la lámina de nitrocelulosa y sondeando con cualesquiera sobrenadantes de hibridoma, pAb cfms/CSF-1R H300 de conejo (Santa Cruz Biotechnology), mAb 61701 de ratón (R&D Systems) o suero de ratones no expuestos anteriormente a tratamiento o de ratones inmunizados contra CSF-1R.

Se detectaron ambas formas solubles del CSF-1R como bandas amplias cuando se sondearon con pAb c-fms/CSF

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1R H300, mAb 61701 o suero de los ratones inmunizados. No se observaron señales detectables con el suero de ratones no expuestos anteriormente a tratamiento o un sobrenadante de hibridoma del control negativo. El sobrenadante del hibridoma de CXIIG6 reconoció CSF-1R1-290:Fc así como CSF-1R1-512:Fc, pero no EGFR:Fc, indicando que CXIIG6 se une específicamente a un epítopo que descansa sobre los tres dominios análogos a inmunoglobulina del extremo N (entre los restos 1 a 290) del CSF-1R humano.

Bloqueo específico del CSF-1R humano soluble por el mAb CXIIG6

Se usó la línea de células M-NFS-60 (n.º CRL-1838, ATCC) de leucemia mieloide de murino dependiente de CSF-1 para evaluar la actividad bloqueante del sobrenadante del hibridoma de CXIIG6 en CSF-1R de humano y murino. Se preincubaron cinco nanogramos de CSF-1R humano (CSF-1R1-512:Fc de R&D Systems) en microplacas con 96 pocillo blancos con diluciones en serie tanto de sobrenadantes de hibridoma, mAb 61701 (R&D Systems) o mAb del control de isotipo de murino. Se cultivaron durante la noche células 10E4 M-NFS-60 en ausencia de CSF-1, se añadieron a continuación en los pocillos del cultivo junto con 0,1 ng de CSF-1 humano en un volumen de ensayo final de 100 µl. Se incubaron los cultivos durante 48 h a 37ºC y se cuantificó la proliferación mediante la incorporación de BrdU utilizado un ELISA de proliferación celular (Roche).

CSF-1R humano soluble inhibió completamente la proliferación de células M-NFS-60 mediada por CSF-1 humano, como se muestra en presencia de sobrenadante de hibridoma negativo que contiene una IgG1 del control negativo o no (Figura 3; promedio +/-SEM de 3 pocillos). Por el contrario, el sobrenadante del hibridoma de CXIIG6 y el mAb 61701 del control positivo fueron capaces de restaurar la proliferación celular de una manera dependiente de la dosis, mostrando que fueron capaces de neutralizar el CSF-1R humano soluble.

En este ensayo, la proliferación de células M-NFS-60 en presencia de diluciones bajas de sobrenadante del hibridoma de CXIIG6 mostró que el mAb CXIIG6 fue incapaz de bloquear el CSF-1R de murino expresado por las células M-NFS-60. Por otra parte, en un ensayo de proliferación de M-NFS-60 soportado por CSF-1 de murino llevado a cabo en ausencia de CSF-1R soluble, el tratamiento con el mAb AFS98 dirigido contra CSF-1R de ratón (eBioscience) dio como resultado una drástica disminución del crecimiento celular dependiente de la concentración (no se muestran los datos). El sobrenadante del hibridoma de CXIIG6, los anticuerpos análogos del control negativo, y el sobrenadante del hibridoma negativo, no produjeron reducción en la proliferación celular. Estos resultados demuestran que el mAb CXIIG6 se une específicamente al CSF-1R humano.

Inhibición de la diferenciación de los osteoclastos humanos y secreción de la metaloproteasa-9 de matriz (MMP-9)

Se generaron osteoclastos a partir de monocitos humanos obtenidos mediante elutriación de PBMC a partir de un donante de sangre sano. En resumen, se sembraron monocitos a 2 x 10E4 por pocillo en placas de 96 pocillos y se trataron durante 45 min tanto con sobrenadantes de cultivo de hibridoma, mAb 61701 dirigidos contra CSF-1R humano (R&D Systems) o 2-4A5-4 (GeneTex), mAb 26730 dirigido contra CSF-1 humano (R&D Systems), controles de isotipo de murino o rata, o sueros de ratones no expuestos anteriormente a tratamiento e inmunizados contra CSF-1R diluidos en medio de cultivo de hibridoma. Se añadió medio a-MEM completo a los pocillos del cultivo con o sin CSF-1 y RANKL (PeproTech, 25 y 40 ng/ml respectivamente). Los sobrenadantes de hibridoma, los mAb o/y el medio con o sin citoquinas se repusieron cada 3 días durante 9 días. Los sobrenadantes de cultivo acondicionados se recogieron en el día 9 y se evaluaron para la MMP-9 humana total utilizando un ensayo ELISA (R&D Systems). Se evaluó la formación de osteoclastos mediante la tinción de la fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) utilizando el kit de la fosfatasa ácida de leucocitos de Sigma-Aldrich.

CSF-1 + RANKL indujeron monocitos para diferenciarse en osteoclastos, definidos como grandes células multinucleadas positivas para TRAP, mientras que no se obtuvieron osteoclastos positivos para TRAP en ausencia de citoquinas. La adición de 0,5 µg/ml de mAb 26730 dirigido contra CSF-1 anuló la diferenciación de los osteoclastos, como se muestra por la ausencia de secreción de MMP-9. Los mAb 61701 o 2-4A5-4 dirigidos contra CSF-1R a la misma concentración, y el suero de ratón inmunizado (dilución 1:1000) inhibieron la formación de osteoclastos solo parcialmente (Figura 4; con (+) o sin (-) citoquinas; promedio +/-SEM de 3 pocillos; *: promedio de 2 pocillos). El tratamiento con sobrenadante del cultivo del hibridoma de CXIIG6 diluido 1:20 o 1:100 redujo significativamente el nivel de producción de MMP-9, en comparación con los dos sobrenadantes de hibridoma del cultivo (A, B). Estos resultados demuestran que el mAB CXIIG6 inhibe la diferenciación de los osteoclastos procedentes de monocitos humanos bloqueando la función del CSF-1R en la superficie de la célula.

Inhibición de la fosforilación de CSF-1R dependiente de CSF-1

Se utilizó la línea de células B4-800-5 mediante transfección estable de células NIH/3T3 con un plásmido que expresa CSF-1R humano para investigar el efecto del hibridoma de CXIIG6 sobre la fosforilación de CSF-1R dependiente de CSF-1. Se sembraron las células a 2 x 10E5 células por placa Petri de 60 mm durante 48 a 72 h. Tras la privación de suero durante 1 h a 37ºC, se trataron las células durante 1 h a 37ºC con medio de cultivo que contenía tanto sobrenadante del hibridoma de CXIIG6, mAb 2-4A5-4 (NeoMarkers) o los mAb del control del isotipo (diluidos en sobrenadante del hibridoma negativo), y a continuación se estimularon con 100 ng/ml de hCSF-1 o se dejaron sin estimular durante 5 min a 37ºC. A continuación se lisaron las capas de células y se extrajeron las

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de anticuerpos activos dirigidos contra CSF-1R, como se midió por la unión al antígeno en un ensayo del biosensor SPR. La comparación entre los mAb CXIIG6 y su respectivo mAb de control se llevaron a cabo cargando cantidades iguales de anticuerpo total (ensayo del biosensor SPR mediante la unión a Fc).

Bioensayo de M-NFS-60: En el bioensayo de M-NFS-60, se trataron las células con 0,23 ng/ml a 0,5 µg/ml de mAb CXIIG6 activos (CXIIG6 de murino recombinante; IgG1 de CXIIG6 quimérica) o las correspondientes concentraciones de mAb del control en presencia de 50 ng/ml de CSF-1R soluble humano y 1 ng/ml de CSF-1 humano durante 48 h. Los resultados representados en la Figura 17 muestran que el crecimiento de células M-NFS60 aumentó en respuesta a concentraciones crecientes de ambos mAb CXIIG6 (CXIIG6 de murino recombinante; IgG1 de CXIIG6 quimérica) demostrando que antagonizaron la unión de CSF-1R soluble a CSF-1 (promedio +/-SEM de células por triplicado). La IgG1 de CXIIG6 quimérica fue tan eficaz como CXIIG6 de murino recombinante en la restauración de la proliferación celular. La IgG2a de murino del control y la IgG1 quimérica no tuvieron efecto sobre la neutralización de CSF-1 por CSF-1R soluble sobre su intervalo de concentración respectivo. Estos resultados muestran que CXIIG6 de murino recombinante purificado e IgG1 de CXIIG6 quimérica inhiben CSF-1R humano soluble.

Bioensayo de osteoclastos: En el bioensayo de osteoclastos, se incubaron monocitos humanos elutriados durante 8 días con 0,85 ng/ml a 0,62 µg/ml de mAb CXIIG6 activos (CXIIG6 de murino recombinante; IgG1 de CXIIG6 quimérica) en presencia de 25 ng/ml de CSF-1 (ImmunoTools) y 40 ng/ml de RANKL. el medio y todos los agentes añadidos se repusieron en el día 4 y 6 y se midió la MMP-9 total en el medio de cultivo acondicionado desde el día 6 a 8. Los resultados representados en la Figura 18 muestran que en comparación con los anticuerpos del control, CXIIG6 de murino recombinante y su variante quimérica (IgG1 de CXIIG6 quimérica) redujeron cada una significativamente la producción de MMP-9 que es paralela a la diferenciación de osteoclastos, indicando que se produjo un retardo en el crecimiento (Figura 18; promedio +/-SEM de pocillos por triplicado).

Estos resultados demuestran además que CXIIG6 de murino recombinante purificado e IgG1 de CXIIG6 quimérica inhiben la función de CSF-1R en la superficie celular.

Cartografía de epítopos del anticuerpo de la invención frente a anticuerpos comerciales

Estos experimentos se han diseñado a fin de determinar la localización de los epítopos de los anticuerpos de la presente invención, y, determinar de forma más precisa si se unen a epítopos idénticos o diferentes de numerosos anticuerpos dirigidos contra CSF-1R comercialmente disponibles.

CXIIG6 quimérico (chCXIIG6) de la invención, mAb 3291 (IgG1 de murino, clon 61701, R&D Systems MAB3291) y mAb JF14 (IgG1 de murino, Santa Cruz sc-80174) se unen a CSF-1R humano pero no de murino. Se han seleccionado los anticuerpos monoclonales 3291 y JF14 tal como se han generado frente al resto del extremo N del CSF-1R humano. A fin de cartografiar los sitios de unión de mAb sobre CSF-1R, se construyeron los mutantes truncados de CSF-1R humano y las quimeras entre CSF-1R de D1-D3 de ser humano y murino fusionadas con etiquetas histidina (véanse las figuras 19 y 20 para los detalles). se expresaron estas construcciones como proteínas secretadas utilizando células CHO. Se comprobó la expresión de las construcciones mediante el análisis de la inmunotransferencia utilizando un anticuerpo dirigido contra la etiqueta His para la detección. Se capturaron todas las construcciones en placas ELISA incubando el sobrenadante del cultivo de células CHO en pocillos revestidos con un anticuerpo dirigido contra la etiqueta His. Se biotinilaron los anticuerpos utilizando Biotina-NHS (Sigma ref B329510MG). Se añadieron anticuerpos biotinilados a cada pocillo y se detectó la unión con estreptavidina-HRP. Se utilizó rituximab biotinilado (Du y col., 2007, J. Biol. Chem. 282 (20), 15073-15080, Números de registro NCBI 20SL_H & 20SL_L) como control de isotipo negativo (sin unión a CSF-1R). Se resumen los resultados en la Figura 19.

Resultados: Como se esperaba, rituximab no se une a ninguna construcción ensayada. el CXIIG6 quimérico, mAb 3291 y el mAb JF14 son capaces de unirse al dominio 1 aislado (D1) del CSF-1R humano (véase la construcción pTG18038; Figura 19). Por otro lado, la sustitución de D1 humano por D1 de murino eliminó completamente la unión de los tres mAb (véase la construcción pTG18003; Figura 19). Los resultados obtenidos utilizando las construcciones pTG18015 y pTG18000 combinando los subdominios humano y de murino D1 muestran que la unión de los mAb 3291 y JF14 requiere el extremo N y la parte central del dominio D1 de CSF-1R humano, mientras que la unión del anticuerpo monoclonal de la invención requiere solo la parte del extremo N del dominio D1 humano (véase la construcción pTG18016; Figura 19).

Estos datos muestran que el epítopo del anticuerpo monoclonal de la invención se une a CSF-1R humano en un epítopo diferente que los anticuerpos monoclonales 3291 y JF14. De forma interesante, las partes del extremo N de CSF-1R humano y de murino difieren solo en 4 restos: I20A, V27G, K33E y A36E (la metionina de inicio es el resto 1).

Anticuerpos monoclonales H19K12, H27K5 y H27K15

Se ha descrito anteriormente la generación del hibridoma CXIIG6 que produce la IgG2a de ratón con actividad bloqueante para la función de CSF-1R humano. Se clonaron y secuenciaron las cadenas pesada y ligera de la IgG2a de CXIIG6 (véanse las Figuras 6 y 7). Se construyó una versión quimérica del anticuerpo monoclonal (chCXIIG6), combinando los dominios variables VH y VL del mAb CXIIG6 con las regiones constantes de la IgG1 humana (véase

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anteriormente). Para aumentar la homología con las secuencias del anticuerpo humano y disminuir la inmunogenicidad potencial de los anticuerpos monoclonales, se generaron variantes humanizadas introduciendo mutaciones en los dominios VH y VL (véanse las Figuras 15 y 16).

262 versiones del anticuerpo monoclonal inmunizado de la invención se expresaron transitoriamente en células de ovario de hámster chino (CHO) y se ensayaron para su capacidad de unión a CSF-1R. Fuera de este primer cribado, treinta y una variantes de CXIIG6 humanizado (hCXIIG6) se seleccionaron sobre la base de (i) la afinidad con el CSF-1R humano, (ii) mayor homología con secuencias de la línea germinal humana (preferentemente dicha homología es al menos de un 76%, más preferentemente de al menos un 85% y (iii) menor inmunogenicidad realizada mediante simulación por ordenador. Los estudios de afinidad utilizando tecnología de microequilibrio de cristales de cuarzo (Attana) mostró que todas las variantes de hCXIIG6 seleccionadas tenían afinidades similares para el CSF-1R humano recombinante, en el intervalo de 10-9 a 10-10 M análogo al mAb chCXIIG6 precursor. Se seleccionaron tres de 30 variantes humanizadas caracterizadas por la elevada afinidad con CSF-1R, mayor grado de homología humana y i menor inmunogenicidad realizada mediante simulación por ordenador para los estudios adicionales: H19K12, H27K5 y H27K15.

Caracterización bioquímica del anticuerpo monoclonal H27K15 de la invención

A-Radiomarcado del anticuerpo H27K15 con Yodo-125

Materiales

Se proporcionó el anticuerpo monoclonal H27K15 de la invención como una solución acuosa (PBS pH 7,5) a una concentración de 2,1 mg/ml.

Se adquirió el radionucleido Yodo-125 de Perkin Elmer como Yoduro de sodio en hidróxido de sodio10-5N (actividad específica: 643,8 GBq/mg -pureza del radionucleido: 99,95%).

Cloramina-T (N-cloro-p-toluenosulfonamida, PM: 227,6 g.mol-1), se adquirieron metalbisufito de sodio (PM=190,1 g.mol-1), albúmina de suero de bovino (BSA) y ácido tricloroacético de Sigma.

Se preparó solución salina tamponada con fosfato 0,1 M, pH 7,2 en el laboratorio de los inventores.

Procedimiento

A 100 µg de anticuerpo, se añadieron 1,2 mCi de solución de Na125I (44,4 MBq) y 7,6 µl de solución de cloramina T preparada de forma reciente (1 mg/ml en tampón fosfato). Después de 2 min a temperatura ambiente, se detuvo la reacción añadiendo 12,7 µl de metabisulfito de sodio (1 mg/ml en tampón fosfato).

Se eliminó el Yodo-125 no incorporado mediante filtración en gel en una columna Sephadex G-25 (PD-10, Pharmacia) previamente saturada con tampón de elución (tampón fosfato 0,1 M pH 7,2/ BSA al 0,5%). La columna se eluyó en 40 alícuotas de 0,5 ml. Se midió la radioactividad en cada fracción en un contador gamma automático calibrado para el radionucleido yodo-125 (Contador gamma automático Wallace Wizard 2470 calibrado para el radionucleido yodo-125 -Perkin Elmer) y se combinaron con las fracciones que contenían el producto radioyodado deseado.

Se estimó la pureza radioquímica del compuesto radiomarcado mediante el análisis ITLC llevado a cabo en placas de gel de sílice prerrevestidas de Gelman Sciences, utilizando TCA al 10% como eluyente.

Resultados y características de las soluciones de anticuerpos radiomarcados

Antes de la purificación, el rendimiento radioquímico como se determinó mediante ITLC fue del 97,8%.

Las características de la solución del anticuerpo radiomarcado se resumen a continuación:

125I-H27K15

Peso molecular (Da)

150 000

Concentración en µg/ml

58,19

nM

387,93

Actividad específica (mCi/mg)

10,51

Relación Yodo/Anticuerpo

0,72

Actividad volúmica

612,57

Pureza radioquímica (%)

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Se evaluaron la pureza y la integridad del anticuerpo radiomarcado mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio (SDS_PAGE) en condiciones reductoras y no reductoras. Se usó una amplia gama de patrones de peso molecular (Biorad Laboratories) consistente en 10 marcadores de peso molecular de 10 a 250 kDa para calibrar el gel. Se tiñeron los geles mediante azul de comassie. En una segunda etapa, se secaron los geles y se expusieron en una pantalla para autorradiografía utilizando PhosphorImager 445 SI (Amersham Biosciences). Se usó el software ImageJ (Molecular Dynamics) para el análisis de datos.

Los perfiles electroforéticos obtenidos tras la tinción del azul de coomassie y la autorradiografía son idénticos. En condiciones no reductoras, se visualizó una banda principal a 150 kDa, que corresponde a la molécula de IgG completa. En condiciones reductoras, se detectaron bandas a 50 kDa y 25 kDa, que corresponden a las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, respectivamente. Los resultados de estas electroforesis confirman que el procedimiento de la cloramina T no altera la integridad del anticuerpo.

B-Ensayos de unión del anticuerpo H27K15 radiomarcado sobre células EL4-CSF-1R

b1 Medición de la afinidad de unión de 125I-H27K15

Se usó la constante de disociación del equilibrio (KD) como una medición de la afinidad de unión. Se determinó la KD para el anticuerpo 125I-H27K15 mediante un ensayo de saturación cuando se añadió una concentración creciente de anticuerpo radiomarcado a un número constante de células.

Materiales

Solución de anticuerpo radiomarcado en PBS que contiene BSA al 0,5%

125I-H27K15

Actividad específica (mCi/mg)

10,51

Radiopureza (%)

99,84

Dilución en PBS que contiene BSA al 0,5%

Intervalo de concentraciones: diluciones en serie 2 veces de 4,5 µg/ml a 0,54 ng/ml (30 nM a 3,6 pM)

Soluciones de anticuerpo radiomarcado con un exceso molar de 100 veces de anticuerpo sin marcar (unión no específica): Se preparó una solución que contenía 45 µg/ml de anticuerpo sin marcar y 0,45 µg/ml de anticuerpo radiomarcado y a continuación se llevaron a cabo diluciones en serie 4 veces en PBS/BSA al 0,5%.

Células: Se preparó una suspensión de células EL4-CSF-1R a 40 x 106 células/ml en PBS que contenía BSA al 0,5%.

Procedimiento

Se incubaron las células EL4-CSF-1R (2x106 en 50 µl de PBS/BSA al 0,5%) con concentraciones crecientes de anticuerpo radiomarcado en un volumen final de 150µl durante 1 h en hielo con agitación.

Se determinó la unión no específica incubando simultáneamente un exceso de anticuerpo sin marcar (exceso molar de 100 veces).

Tras la incubación, las mezclas de reacción se superpusieron sobre 200 µl de un amortiguador de aceite de dibutilftalato y se centrifugaron en tubos de micrófuga a 12000 rpm durante 3 min. Se congelaron los tubos en nitrógeno líquido y los extremos de los tubos que contenían los aglomerados celulares se cortaron para la determinación de la radioactividad utilizando un contador gamma automático Wallace Wizard 2470 calibrado para el radionucleido yodo-125 (eficacia del 63%).

Se determinó la unión no específica midiendo la radioactividad unida e una concentración de cuatro puntos de anticuerpo radiomarcado que contenía un exceso molar de 100 veces de anticuerpo sin marcar. Se realizó un gráfico que traza la fracción unida frente a la fracción libre y se usó una regresión lineal a fin de definir la pendiente de la línea recta. Se definió la unión específica mediante la sustracción de la unión observada en presencia (unión no específica) de la observada en ausencia (unión total) de un exceso de anticuerpo sin marcar.

Resultados

Se determinaron la constante de afinidad del anticuerpo 125I-H27K15 humanizado para las células EL4-CSF-1R y los sitios de unión máxima por célula mediante el software Prism.

A continuación se resumen las características de unión del anticuerpo 125I-H27K15 para las células EL4-CSF-1R:

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H27K15

CI50 En nM En µg/ml

0,856 ± 0,090 0,128, 0,013

Constante de inhibición En nM En µg/ml

0,504 ± 0,053 0,076 ± 0,008

b3 Estudio de competición entre 125I-H27K15 y diversos anticuerpos

Materiales Solución de anticuerpo H27K15 radiomarcado en PBS que contiene BSA al 0,5%: Como anteriormente Soluciones de anticuerpo sin marcar

Los diferentes anticuerpos se presentan en la tabla de la siguiente manera:

H19K12

H27K5 chCXIIG6 3291 JF14 2-4A5

Concentración de la solución madre (mg/ml)

2,4 0,3 1 8,9 2 2 2

Para cada anticuerpo, se preparó una solución a 450 nM (67,5 µg/ml) y a continuación se llevaron a cabo diluciones en serie 2,5 veces en PBS/BSA al 0,5%. Concentración del intervalo: 450 nM a 7,56 pM.

Células: Se preparó una suspensión de células EL4-CSF-1R a 40 x 106 células/ml en PBS que contenía BSA al 10 0,5%.

Procedimiento

Se incubaron las células (2x106 en 50 µl de PBS/BSA al 0,5%) con 50 µl de anticuerpo 125I-H27K15 a 1,5 nM en ausencia (unión total: pocillo del control) y en presencia de concentraciones variables (anteriormente mencionadas en 50 µl de competidor sin marcar durante 1 h en hielo con agitación.

15 Tras la incubación, las mezclas de reacción se superpusieron sobre 200 µl de un amortiguador de aceite de dibutilftalato y se centrifugaron en tubos de micrófuga a 12000 rpm durante 3 min. Se congelaron los tubos en nitrógeno líquido y los extremos de los tubos que contenían los aglomerados celulares se cortaron para la determinación de la radioactividad utilizando un contador gamma automático.

Se calculó el porcentaje de unión relativa del anticuerpo radiomarcado como:

20 Radioactividad en el pocillo de ensayo x 100 Radioactividad en el pocillo del control

El pocillo del control es aquel sin presencia de competidor.

Resultados

En la Figura 22 se presentan los datos de la unión

25 Se determinó el valor de la CI50 obtenido de la curva de competición mediante el software Prism y se convirtió en una constante de inhibición absoluta Ki utilizando la ecuación de Cheng-Prusoff:

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[L] es la concentración de anticuerpo 125I-H27K15 utilizada en el ensayo CI50 es la concentración de competidor necesaria para conseguir un 50% de inhibición del anticuerpo 125I-H27K15 KD es la constante de afinidad del anticuerpo 125I-H27K15.

Para cada competidor, a continuación se resumen los valores de CI50 y Ki constantes:

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chCXIIG6

H19K12 H27K5 3291 JF14 2-4A5

CI50 (nM)

1,483 ± 0,220 1,280 ± 0,246 0,998 ± 0,173 2,176 ± 0,281 3,025 ± 0,568 Sin competición

Ki (nM)

0,874 ± 0,130 0,754 ± 0,145 0,588 ± 0,102 1,281 ± 0,165 1,781 ± 0,334

La afinidad de los anticuerpos monoclonales de la invención (H27K15, chCXIIG6, H19K12 y H27K5) son muy similares, con un valor de Ki de 0,5 a 0,8 nM.

Los valores de Ki de los anticuerpos monoclonales comerciales 3291 y JF14 son mayores que 1 nM. Por consiguiente, estos anticuerpos tienen una afinidad más baja para el antígeno de CSF-1R que los anticuerpos monoclonales de la invención.

C -Ensayos de unión competitivos de CSF-1 humano a CSF-1R de D1-D5 humano

Se biotinilaron CSF-1(1-444) utilizando Biotina-NHS (Sigma referencia B3295-10MG). Se añadió CSF-1 biotinilado (100 µl/pocillo a 0,012 µg/ml) a los pocillos revestidos con CSF-1R de FC-D1-D5 humano (100 µl/pocillo a 1 µg/ml) (R&D systems referencia 329-MR-100) y se detectaron las moléculas unidas utilizando estreptavidina-HRP. Para los experimentos de competición, se preincubaron, incubaron simultáneamente o incubaron posteriormente cantidades crecientes de anticuerpos monoclonales (100 µl/pocillo a partir de 0,030 µg/ml a 200 µg/ml) con CSF-1 biotinilado.

Los inventores han ensayado el anticuerpo monoclonal comercial 3291 (R&D Systems referencia MAB3291), un H27K15 de la invención, un anticuerpo monoclonal X (documento WO2009/026303) como control positivo, ya que se sabe que compite con la unión de CSF-1 a su receptor, y rituximab como control negativo.

En caso de preincubación, los anticuerpos monoclonales se incubaron con CSF-1R humano revestido 1 hora antes de la adición del CSF-1 biotinilado.

En caso de incubación posterior, el CSF-1 biotinilado se incubó con CSF-1R humano revestido una hora antes de la adición de anticuerpos monoclonales.

En el caso de incubación simultánea, el CSF-1 biotinilado y los anticuerpos monoclonales se incubaron juntos con CSF-1R humano revestido.

Resultados: Se ha mostrado previamente (véase anteriormente) que los anticuerpos 3291 y H27K15 reconocen un epítopo (es decir: el dominio 1 análogo a Ig) que es diferente de aquel reconocido por el anticuerpo X del control positivo conocido por unirse al mismo sitio de unión que CSF-1 (es decir: en los dominios 2-3 análogos a Ig). En este caso, los inventores muestran que al contrario que el control positivo, los anticuerpos 3291 y H27K15 son competidores parciales de la unión de CSF-1, incluso a una elevada dosis de anticuerpo (es decir, ~100 veces la CI50). en todos los escenarios (preincubación, incubación simultánea o incubación posterior), y a dosis de saturación, H27K15 es capaz de disminuir la unión de CSF-1 a CSF-1R en aproximadamente 10 a 20% (véanse las Figuras 23, 24 y 25), mientras que el anticuerpo 3291 es capaz de disminuir la misma unión en aproximadamente 30 a 40% dependiendo del escenario experimental.

Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales de la presente invención son capaces de evitar parcialmente la unión de CSF1 con su receptor CSF-1R.

Esto se ha confirmado en el siguiente experimento.

Se revistieron microplacas ELISA con 0,1 µg (es decir, 100 µl a 1 µg/ml) de CSF1 1-444 humano (Geneart-véase la SEQ ID NO:47, Figura 32). 100 µl de CSF-1R de Fc-D1-D5 humano (R&D systems referencia 329-MR-100) a 0,125 µg/ml se incubaron simultáneamente en presencia de una concentración d una concentración creciente de anticuerpo. Se detectó CSF-1R de Fc-D1-D5 humano unido a CSF1 utilizando un HRP dirigido contra IgG-Fc humana (Bethyl A80-204P). debido a que el anticuerpo utilizado para la detección se une al Fc humano, se usó el anticuerpo CXIIG6 de murino en vez del anticuerpo H27K15 para la competición. el mAb X competidor (documento WO2009/026303) se usó como control positivo ya que se sabe que se une al CSF-1R en el mismo sitio que CSF-1. Se usó la IgG2a de rata como control negativo (anticuerpo isotípico irrelevante que no se une a hCD115).

Resultados: el mAb X, como se indicó en el documento WO2009/026303, inhibe totalmente la unión de CSF1 (1444) a CSF-1R de Fc-D1-D5 humano como esperaba para un anticuerpo competitivo. los anticuerpos 3291 y mCXIIG6, disminuyen solo parcialmente la unión de CSF-1r de Fc-D1-D5 a CSF1 incluso a una dosis elevada de anticuerpo (es decir, 100 µg/ml). mCXIIG6 y 3291 disminuyeron la unión de CSF1 a Fc-hCD115 en aproximadamente 5-10% y 10-20%, respectivamente (véase la figura 26). Estos resultados están de acuerdo con los descritos anteriormente que demuestran una inhibición parcial de la unión de CSF1 a CSF-1R de Fc-D1-D5 humano mediante H27K15 o el mAb 3291.

La Figura 26 muestra la disminución parcial de la unión de D1-D5 CD115 de Fc humano a CSF1 humano mediante varios mAb (experimento de incubación simultánea). CSF1 humano (0,1 µg/ml) se revistió en placas de 96 pocillo y

se incubó durante 1 h 45 min con una mezcla (experimento de incubación simultánea) de CSF-1R de Fc-D1-D5 humano recombinante (0,125 µg/ml) y concentraciones crecientes de mAb. El CD115 que se une a hCSF-1 se detectó utilizando una IgG dirigida contra Fc humano conjugada con HRP.

D-Estudio de competición entre 125I-H27K15 e IL-34, conocido como uno de los ligandos naturales del receptor CSF-1R.

Materiales

Soluciones de anticuerpos radiomarcados en PBS que contienen BSA al 0,5% 125I-H27K15 (como anteriormente)

Soluciones de ligandos: Se adquirió IL-34 humana recombinante (26,1 kDa) de R&D Systems a una concentración de 0,422 mg/ml. Se preparó una solución a 450 nM y a continuación se llevaron a cabo diluciones en serie 2,5 veces en PBS/BSA al 0,5%. Concentración del intervalo: 450 nM a 7,56 pM.

Células: Se preparó una suspensión de células EL4-CSF-1R a 40 x 106 células/ml en PBS que contenía BSA al 0,5%.

Procedimiento

Se llevaron a cabo dos protocolos diferentes durante este estudio de competición con los ligandos naturales.

En el primero, se incubaron simultáneamente las células (2x106 en 50 µl de PBS/BSA al 0,5%) con 50 µl de anticuerpo 125I-H27K15 a 1,5 nM en ausencia (unión total: pocillo del control) y en presencia de concentraciones variables (anteriormente mencionadas) en 50 µl de competidor sin marcar durante 1 h en hielo con agitación.

El segundo protocolo era incubar células EL4-CSF-1R con concentraciones crecientes de ligando durante 30 min en hielo antes de la adición de anticuerpo H27K15 radiomarcado. Posteriormente, se llevó a cabo también la segunda incubación en hielo durante 1 hora con agitación.

Para los dos experimentos, las mezclas de reacción se superpusieron sobre 200 µl de un amortiguador de aceite de dibutilftalato y se centrifugaron en tubos de micrófuga a 12000 rpm durante 3 min. Se congelaron los tubos en nitrógeno líquido y los extremos de los tubos que contenían los aglomerados celulares se cortaron para la determinación de la radioactividad utilizando un contador gamma.

Se calculó el porcentaje de unión relativa del anticuerpo radiomarcado como:

Radioactividad en el pocillo de ensayo x 100 Radioactividad en el pocillo del control

(El pocillo del control es aquel sin presencia de ligando)

Resultados: No se observó desplazamiento de la unión del anticuerpo 125I-H27K15. Por consiguiente, el anticuerpo H27K15 y el ligando IL-34 reconocen diferentes epítopos del antígeno de CSF-1R.

Por otra parte, se ha llevado a cabo el estudio de unión de la competición entre 125I-IL-34 y el anticuerpo H27K15 humanizado que ha mostrado que la unión de 125I-IL-34 no se desplazó con una concentración creciente del anticuerpo H27K15 que ilustrando en el presente documento que el anticuerpo de la invención no compite con IL-34 por la unión con el receptor CSF-1R.

Caracterización biológica de las variantes H27K5, H27K15 y H19K12 de hCXIIG6

A, Expresión y purificación de anticuerpos monoclonales

CXIIG6 quimérico, las variantes H19K12, H27K5, H27K15 de hCXIIG6 y rituximab se expresaron tanto mediante transfección transitoria de células CHO-K1 o CHO-DG44 como mediante combinados policlonales de transfectantes CHO-DG44 estables.

B. Especificidad de H27K5, H27K15 y H19K12 para CSF-1R entre otros receptores de la tirosina quinasa

Procedimiento

Se revistieron placas de microvaloración (Maxisorp, Nunc) con 300 ng por pocillo de cada uno de los siguientes receptores solubles, adquiridos de R&D Systems: CSF-1R20-512-Fc (n.º de catálogo 329-MR/CF), (EGFR)2-Fc-6xhis (n.º de catálogo 1129-ER), Flt-3-Fc-6xhis (n.º de catálogo 368-ST/CF), PDGFRβ-Fc-6xhis (n.º de catálogo 385-PR/CF), receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR)2-Fc-6xhis (n.º de catálogo 357-KD/CF), VEGFR1-Fc-6xhis (n.º de catálogo 321-FL-050), SCFR humano (n.º de catálogo 332-SR/CF) y PDGFRα ECDs (n.º de catálogo 322-PR/CF. Se añadieron cincuenta µl tanto de los mAb H27K5, H27K15, H19K12 o rituximab (500 ng/ml en PBS) a los pocillos y las placas se incubaron durante 1 h a 37ºC. Para controlar un revestimiento eficaz de los pocillos, un anticuerpo dirigido contra IgG (anticuerpo de cabra dirigido contra IgG humana, Sigma n.º de

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(Promega n.º de catálogo G182A) para controlar pocillos que contenían medio de cultivo o células diana solas y se incubaron adicionalmente placas durante 45 min a 37ºC. Se cuantificó la lactato deshidrogenasa (LDH) en los sobrenadantes del cultivo utilizando el Ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega n.º de catálogo. G1780) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se registró la absorbancia a 490 nm utilizando el lector TriStar LB 941 y el software MikroWin 2000 de Berthold Technologies.

Se sustrajo el fondo de CM promedio de los valores de SR diana y de SR efectoras experimentales. El fondo del CM promedio ´la solución de lisis se sustrajo de los valores de MR diana. Se llevó a cabo el análisis estadístico utilizando los valores de la DO, tras la sustración de CM promedio y los controles de SR, con el software GraphPad Prism utilizando un test monolateral de Mann-Whitney no paramétrico (para comparar chCXIIG6 o cada variante de hCXIIG6 con rituximab) o un test de la t bilateral (para comparar cada variante de hCXIIG6 con chCXIIG6). Se calculó el porcentaje de lisis utilizando la siguiente fórmula:

% de lisis = SR diana promedio experimental -SR efector promedio x 100 MR diana promedio -SR diana promedio

Resultados

Se ensayaron las actividades de ADCC de las variantes de chCXIIG6 y de hCXIIG6 (IgG1 humana) en las células EL4-CSF-1R diana, utilizando PBMC de diferentes donantes de sangre.

Las células efectoras procedentes del donante n.º 1 se utilizaron a una relación E:T de 25:1 /Figura 30A). En este experimento, se observó aproximadamente un 10% de lisis directa en ausencia de mAb, que puede reflejar la actividad de linfocitos NK contenidos en las PBMC. Los valores obtenidos con el control negativo rituximab estuvieron en el mismo intervalo. Se ha verificado mediante análisis de citometría de flujo que las células EL4-CSF1R no se unen a rituximab (no se muestran los datos). A 10 ng/ml de mAb, no se encontró lisis específica (por encima de la lisis no específica observada en presencia de rituximab) con los mAb dirigidos contra CSF-1R. A 0,3 µg/ml de mAb, chCXIIG6 indujo una citotoxicidad por encima del 20%. La lisis en las 3 variantes de hCXIIG6 estuvo en el mismo orden de magnitud. A altas concentraciones de mAb (10 µg/ml), las 3 variantes de hCXIIG6 produjeron cerca de un 35% de citotoxicidad, mientras que la lisis por chCXIIG6 permaneció por debajo del 20%.

Se llevó a cabo otro experimento utilizando células efectoras del donante n.º 2 a relaciones E:T de 25:1, 50:1 o 100:1 (Figura 30B). No se detectó la lisis directa, en contraste con el primer experimento. La citotoxicidad de fondo fue inferior al 10% con rituximab a todas las relaciones E:T ensayadas. Los resultados estuvieron en buena correlación con aquellos del experimento anterior: no se observó lisis específica a bajas concentraciones de mAb (10 ng/ml) sino a 0,3 y 10 µg/ml, chCXIIG6 y las 3 variantes de hCXIIG6 indujeron una lisis específica significativa de las células EL4-CSF-1R. A ambas de estas concentraciones de mAb y todas las relaciones E:T ensayadas, la lisis de las células diana fue de nuevo mayor con H27K5, H27K15 y H19K12 que con chCXIIG6 (p=0,02).

Estos resultados demuestran que chCXIIG6 y las variantes de hCXIIG6 tienen el potencial de destruir las células diana que expresan CSF-1R en la superficie.

El efecto terapéutico de los mAb quiméricos y humanizados dirigidos contra CSF-1R en el modelo de tumo BeWo

Debido a que las variantes chCXIIG6 y hCXIIG6 son específicas para el CSF-1R humano y no reconocen su homólogo de murino, sus efectos in vivo pueden solo investigarse en modelos de ratón utilizando tumores positivos para CSF-1R humanos. No obstante, en ausencia de CSF-1 humano, el CSF-1R humano permanece inactivo y no se puede estudiar el bloqueo de su función. Por otra parte, el bloqueo de células hospedadoras positivas para CSF1R (macrófagos asociados a tumor, osteoclastos), que se espera que proporcione beneficio terapéutico, no es factible en este sistema de modelo. En los siguientes experimentos que utilizan tumores BeWo positivos para CSF1R humano, solo los efectos citotóxicos de los mAb sobre las células tumorales pueden dar como resultado una eficacia terapéuticos.

Las células de coriocarcinoma BeWo humano expresan CSF 1R en la superficie

Las células BeWo cultivadas in vitro se inmunotiñeron con el mAB H27K15 (que conduce al anticuerpo humanizado dirigido contra CSF-1R) y se analizó la fluorescencia mediante microscopía confocal. La tinción específica observada con H27K15, en comparación con el control negativo rituximab, muestra que las células BeWo expresan CSF-1R humano sobre su superficie. Las células BeWo no secretan CSF-1, como se encuentra mediante la valoración ELISA de los sobrenadantes del cultivo (no se muestran los resultados).

Un tumor sólido derivado de células Bewo implantado subcutáneamente en ratones alotímicos NMR1 se incluyó en OCT para el análisis por inmunohistoquímica. Las secciones de tejido congelado se tiñeron con la versión de CXIIG6 de murino o un control del isotipo. Se observó una fuerte tinción específica a lo largo del tumor, reflejando la superficie de la célula y la expresión citoplásmica de hCSF-1R en células de tumor Bewo in vivo.

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