TW202043271A - 重組抗人程序性細胞死亡蛋白1抗體及其應用 - Google Patents

重組抗人程序性細胞死亡蛋白1抗體及其應用 Download PDF

Info

Publication number
TW202043271A
TW202043271A TW109100705A TW109100705A TW202043271A TW 202043271 A TW202043271 A TW 202043271A TW 109100705 A TW109100705 A TW 109100705A TW 109100705 A TW109100705 A TW 109100705A TW 202043271 A TW202043271 A TW 202043271A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
antibody
fragment
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
TW109100705A
Other languages
English (en)
Inventor
張錦超
王榮娟
焦莎莎
王雙
Original Assignee
大陸商邁威（上海）生物科技有限公司
大陸商北京科諾信誠科技有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大陸商邁威（上海）生物科技有限公司, 大陸商北京科諾信誠科技有限公司 filed Critical 大陸商邁威（上海）生物科技有限公司
Publication of TW202043271A publication Critical patent/TW202043271A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39566—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against immunoglobulins, e.g. anti-idiotypic antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明係提供一種結合程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）的抗體或其片段，以及所述抗體或其片段用於預防或治療腫瘤或癌症的用途。本發明的抗體或其片段能夠有效阻斷PD-1/PD-L1、PD-1/PD-L2相互作用，且具有獨特的抗原結合表位，在藥效及安全性上具有獨特的性質。

Description

重組抗人程序性細胞死亡蛋白1抗體及其應用
本發明涉及抗體藥物領域，具體而言，本發明涉及針對人程序性細胞死亡蛋白1（programmed cell death 1，PD-1）的抗體及其用於製備藥物的用途。
程序性細胞死亡蛋白1（PD-1），也被稱為CD279，是T細胞受體CD28家族的成員，表現於多種免疫細胞，如T細胞，B細胞，單核細胞等的表面，是一種在腫瘤微環境中抑制CD4+ 及CD8+ T細胞功能的重要的免疫檢查點分子。PD-1的關鍵配體包括PD-L1（B7-H1）及PD-L2（B7-DC），它們由免疫細胞表現，且還可以在多種組織上誘導，當T細胞上的PD-1結合PD-L1或PD-L2時，T細胞接收抑制信號，從而抑制T細胞增殖及細胞因子產生，有效降低T細胞參與的免疫反應。而PD-L1及PD-L2在多種人類腫瘤細胞上高度表現，因此使得腫瘤細胞逃避T細胞的監督（Pardoll DM. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.Nat.Rev. Cancer . 12(4), 252-264 (2012)）。
目前在全球範圍內已上市的抗人PD-1的單抗共有3種。抗人PD-1的全人源抗體納武單抗（Nivolumab）顯示抑制PD-1與PD-L1和PD-L2的結合，臨床上用於治療晚期黑色素瘤、非小細胞肺癌、腎細胞癌、霍奇金淋巴瘤、頭頸部鱗癌、尿路上皮癌、結直腸癌及肝細胞癌；抗人PD-1的人源化抗體派姆單抗（Perbrolizumab）顯示抑制PD-1與PD-L1和PD-L2的結合，臨床上用於治療惡性黑色素瘤、非小細胞肺癌、經典型霍奇金淋巴瘤、頭頸部鱗癌、錯配修復功能缺陷（d-mmr）突變或MSI-H惡性腫瘤（Alsaab et al. PD-1 and PD-L1Checkpoint Signaling Inhibition for Cancer Immunotherapy: Mechanism, Combinations, and Clinical Outcome.Front.Pharmacol . 8:561）；抗人PD-1的Libtayo單抗（Cemiplimab）可與PD-1結合並阻斷其與PD-L1及PD-L2的相互作用，釋放PD-1通路介導之免疫反應抑制，包括抗腫瘤免疫反應，臨床上用於治療轉移性皮膚鱗狀細胞癌（CSCC）患者或局部晚期CSCC患者（Markham,A.&Duggan,S.Drugs . 2018. doi: 10.1007/s40265 -018-1012-5）。國內處於臨床階段的抗人PD-1的單抗就有10多種，適應症涵蓋復發難治惡性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、B細胞非霍奇金淋巴瘤、腺泡狀軟組織肉瘤、晚期或復發性惡性腫瘤、食管癌、胃癌或胃食管結合部癌、鼻咽癌、頭頸部鱗癌、肺癌、轉移性結直腸癌、局限性腎細胞癌、尿路上皮癌、肝細胞癌、黑色素瘤、晚期三陰性乳腺癌、胸膜間皮瘤、晚期神經內分泌腫瘤、不可切除或d-mmr突變或MSI-H實體瘤。其中恆瑞的SHR-1210、百濟神州的tislelizumab、信達的IBI-308已遞交上市申請，君實的JS001已於12月17日有條件批准上市，名為特瑞普利單抗注射液（商品名：拓益）。
國際上，抗PD-1的抗體已經有三個上市品項，多個臨床在研品項。涉及的專利包括：WO2004004771、WO2006121168、WO2008156712、WO2010029435、WO2012145493、WO2015085847、US20170044260、CN104250302、CN105330740、CN105531288等。藉由分析這些專利發現，可以透過雜交瘤篩選、人源化途徑，或透過噬菌體展示或者酵母表面展示技術，或透過轉殖基因小鼠技術獲得抗PD-1的抗體。其中WO2015085847中獲得抗人PD-1的抗體的方法為：利用雜交瘤技術獲得鼠抗體，透過抗體活性分析（ELISA（結合，阻斷），親和力動力學）獲得候選鼠抗體後；將鼠抗體輕重鏈基因可變區序列複製到編碼人抗體輕重鏈恆定區序列的上游，進行哺乳動物細胞表現，製備嵌合抗體，然後透過抗體活性分析，阻斷PD-1與其配體結合實驗，與CD28其他家族成員結合實驗，與細胞表面PD-1結合實驗，體外細胞學實驗確定先導抗體後；根據Germline資料庫選擇人源化範本，進行抗體序列人源化設計，獲得的人源化抗體再次透過抗體活性分析，阻斷PD-1與其配體結合實驗，與CD28其他家族成員結合實驗，與細胞表面PD-1結合實驗，體外細胞學實驗驗證後；再進行人源化抗體對體內外腫瘤細胞生長抑制實驗進行最後的成藥性評價，最終獲得親和力及特異性保持不變的PD-1人源化抗體序列。
抗體的抗原識別表位是抗體的重要特性之一。抗PD-1抗體，透過阻斷PD-1與其配體PD-L1/PD-L2的結合發揮活化T細胞的作用。目前已報導的抗體雖然都能阻斷PD-1與配體的相互作用，但其所針對的抗原表位卻並不完全相同（Tan S, Zhang H, Chai Y, et al. An unexpected N-terminal loop in PD-1 dominates binding by nivolumab.Nat Commun . 2017;8:14369）。而抗原表位的不同，可能導致抗體在藥效及安全性上具有獨特的特點。
本發明要解決的技術問題是，透過雜交瘤篩選及人源化技術，獲得特異性結合人PD-1的高親和力抗體，其不但能夠有效阻斷PD-1/PD-L1、PD-1/PD-L2相互作用，且具有獨特的抗原結合表位，因此在藥效及安全性上具有獨特的性質。
針對上述技術問題，本發明的目的是提供一種特異性結合人PD-1的抗體或其功能片段，並提供其用途。
本發明的技術方案如下。
一方面，本發明係提供一種結合程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含輕鏈可變區及／或重鏈可變區，其中所述輕鏈可變區及／或重鏈可變區係分別包含以下序列所示之輕鏈互補決定區1（light chain complementarity determining region，LCDR1）、輕鏈互補決定區2（LCDR2）、輕鏈互補決定區3（LCDR3）及／或重鏈互補決定區1（heavy chain complementarity determining region，HCDR1）、重鏈互補決定區2（HCDR2）、重鏈互補決定區3（HCDR3）：
LCDR1 LCDR2 LCDR3
X1ASQDVX2TX3VA （SEQ ID NO:1） X1ASTRX2X3 （SEQ ID NO:2） QQX1X2X3X4PX5 （SEQ ID NO:3）
X1= K或R； X2= E或S； X3= A，V或Y X1= A，G或W； X2= A，H或Q； X3= S或T X1= A，F或Y； X2= D，N或S； X3= R，N或S； X4= F或Y； X5= G，W或Y
HCDR1 HCDR2 HCDR3
X1X2X3MS （SEQ ID NO:4） TIX1X2X3X4X5X6TX7YPDSVKG （SEQ ID NO:5） PX1X2SGVAX3 （SEQ ID NO:6）
X1= D或S； X2= A，N或Y； X3= D，S或Y X1= K，S或W； X2= G，S或Y； X3= D，G或S； X4= G或S； X5= G或S； X6= T或Y； X7= A，T或Y X1= D，E或Y； X2= A或S； X3= T或Y
在本發明提供的抗體或其片段中，較佳地，所述輕鏈可變區及／或重鏈可變區係分別包含以下序列所示之LCDR1、LCDR2、LCDR3及／或HCDR1、HCDR2、HCDR3：
LCDR1 LCDR2 LCDR3
X1ASQDVX2TX3VA （SEQ ID NO:1） X1ASTRX2X3 （SEQ ID NO:2） QQX1X2X3X4PX5 （SEQ ID NO:3）
X1= K或R； X2= E； X3= A，V或Y X1= W； X2= H； X3= S或T X1= Y； X2= D，N或S； X3= R或S； X4= F或Y； X5= W
HCDR1 HCDR2 HCDR3
X1X2X3MS （SEQ ID NO:4） TIX1X2X3X4X5X6TX7YPDSVKG （SEQ ID NO:5） PX1X2SGVAX3 （SEQ ID NO:6）
X1= D或S； X2= A或Y； X3= D或S X1= S； X2= G或S； X3= D，G或S； X4= G或S； X5= S； X6= Y； X7= A或Y X1= D或Y； X2= S； X3= Y
在本發明提供的抗體或其片段中，較佳地，所述輕鏈可變區及／或重鏈可變區係分別包含以下序列所示之LCDR1、LCDR2、LCDR3及／或HCDR1、HCDR2、HCDR3： 選自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11的LCDR1； 選自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17的LCDR2； 選自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27的LCDR3；及／或 選自SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32及SEQ ID NO:33的HCDR1； 選自SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:46的HCDR2； 選自SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51的HCDR3。
在本發明提供的抗體或其片段中，較佳地，所述輕鏈可變區係包含以下序列組合所示之LCDR1、LCDR2、LCDR3：
組合 LCDR1 LCDR2 LCDR3
1 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18
2 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18
3 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18
4 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18
5 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18
6 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:18
7 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:18
8 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:18
9 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:18
10 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18
11 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:19
12 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:20
13 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:21
14 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:22
15 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:23
16 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:24
17 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:25
18 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:26
19 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:27
20 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18
21 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:22
22 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:25
23 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:22
24 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:22
及／或，所述重鏈可變區係包含以下序列組合所示之HCDR1、HCDR2、HCDR3：
組合 HCDR1 HCDR2 HCDR3
1 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
2 SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
3 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
4 SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
5 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
6 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
7 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:47
8 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:47
9 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:47
10 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:47
11 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:47
12 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:47
13 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:47
14 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:47
15 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:47
16 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:47
17 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:47
18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:48
19 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:49
20 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:50
21 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:51
22 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:47
23 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:47
24 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:47
25 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:47
26 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:47
較佳地，所述輕鏈可變區和重鏈可變區係包含以下序列組合所示之LCDR1、LCDR2、LCDR3及HCDR1、HCDR2、HCDR3：
組合 LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
1 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
2 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
3 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
4 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
5 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
6 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
7 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
8 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
9 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
10 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
11 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
12 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
13 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
14 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
15 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
16 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
17 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
18 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
19 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
20 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
21 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
22 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
23 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
24 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
25 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
26 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
27 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
28 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
29 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47
30 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:47
31 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:47
32 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:47
33 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:47
34 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:47
35 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:47
36 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:47
37 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:47
38 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:47
39 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:47
40 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:47
41 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:48
42 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:49
43 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:50
44 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:51
45 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:47
46 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:47
47 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:47
48 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:47
49 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:47
本發明提供的抗體或其片段係具有以下活性中的一或多個： (1) 阻斷PD-1與其配體PD-L1或PD-L2的結合； (2) 特異性結合靈長類動物PD-1，與非靈長類動物PD-1無交叉反應； (3) 不結合除PD-1之外的其他CD28家族成員； (4) 在CD4+ T細胞中誘導IL-2及／或IFN-γ產生； (5) 無抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）效應功能。
較佳地，所述抗體或其片段結合人PD-1 N58糖鏈；較佳地，所述抗體或其片段的重鏈可變區係包含SEQ ID NO:47所示胺基酸序列。
較佳地，所述輕鏈可變區係包含SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:60所示胺基酸序列或者與所述胺基酸序列具有至少75%同一性之胺基酸序列；及／或， 所述重鏈可變區係包含SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:62所示之胺基酸序列或者與所述胺基酸序列係具有至少75%同一性之胺基酸序列； 較佳地，所述至少75%同一性為例如至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%、進一步較佳至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至99%同一性等大於或等於75%的任何百分比的同一性。
根據本發明的具體實施方式，在本發明提供的抗體或其片段中，所述輕鏈可變區係包含SEQ ID NO:52所示之胺基酸序列，所述重鏈可變區係包含SEQ ID NO:54所示之胺基酸序列；或者所述輕鏈可變區係包含SEQ ID NO:60所示之胺基酸序列，所述重鏈可變區係包含SEQ ID NO:62所示之胺基酸序列。
在本發明提供的抗體或其片段中，較佳地，所述輕鏈可變區係包含SEQ ID NO:60所示之胺基酸序列或所述胺基酸序列的變體，根據SEQ ID NO:60所示之胺基酸序列的殘基編號及組成，所述變體相對於SEQ ID NO:60係具有選自以下的一或多個（較佳一至三個）胺基酸置換：K24R、E30S、V32A、V32Y、W50A、W50G、H55A、H55Q、T56S、Y91A、Y91F、S92D、S92N、R93N、R93S、Y94F、W96G及W96Y；較佳地，所述變體相對於SEQ ID NO:60係具有選自以下的一或多個（較佳一至三個）胺基酸置換：K24R、V32A、V32Y、T56S、S92D、S92N、R93S及Y94F； 及／或 所述重鏈可變區係包含SEQ ID NO:62所示之胺基酸序列或所述胺基酸序列的變體，根據SEQ ID NO:62所示之胺基酸序列的殘基編號，所述變體相對於SEQ ID NO:62係具有選自以下的一個或多個（較佳一至三個）胺基酸置換：S31D、Y32A、Y32N、D33S、D33Y、S52K、S52W、G53S、G53Y、G54D、G54S、G55S、S56G、Y57T、Y59A、Y59T、D100E、D100Y、S101A及Y106T；較佳地，所述變體相對於SEQ ID NO:62係具有選自以下的一或多個（較佳一至三個）胺基酸置換：S31D、Y32A、D33S、G53S、G54S、G55S、Y59A及D100Y。
根據本發明的具體實施方式，本發明提供變體抗體或其片段，所述變體抗體或其片段的重鏈可變區係包含SEQ ID NO:62所示之胺基酸序列，而輕鏈可變區相較於SEQ ID NO:60所示之胺基酸序列的殘基編號及組成，僅具有以下胺基酸置換：1) K24R；2) E30S；3) V32A；4) V32Y；5) W50A；6) W50G；7) H55A；8) H55Q；9) T56S；10) Y91A；11) Y91F；12) S92D；13) S92N；14) R93N；15) R93S；16) Y94F；17) W96G；18) W96Y；19) K24R及T56S；20) K24R及S92N；21) K24R及Y94F；22) T56S及S92N；或，23) K24R、T56S及S92N。
根據本發明的具體實施方式，本發明提供變體抗體或其片段，所述變體抗體或其片段的輕鏈可變區係包含SEQ ID NO:60所示之胺基酸序列，而重鏈可變區相較於SEQ ID NO:62所示之胺基酸序列的殘基編號及組成，僅具有以下胺基酸置換：1) S31D；2) Y32A；3) Y32N；4) D33S；5) D33Y；6) S52K；7) S52W；8) G53S；9) G53Y；10) G54D；11) G54S；12) G55S；13) S56G；14) Y57T；15) Y59A；16) Y59T；18) D100E；19) D100Y；20) S101A；21) Y106T；22) D33S及G54S；23) D33S及Y59A；或，24) G54S及Y59A。
根據本發明的具體實施方式，本發明提供變體抗體或其片段，所述變體抗體或其片段的輕鏈可變區相較於SEQ ID NO:60所示之胺基酸序列的殘基編號及組成，僅具有K24R、T56S及S92N的胺基酸置換，且重鏈可變區相較於SEQ ID NO:62所示之胺基酸序列的殘基編號及組成，僅具有D33S及G54S的胺基酸置換，或僅具有G54S及Y59A的胺基酸置換。
本發明提供的抗體可以為單株抗體、單鏈抗體、雙功能抗體、單域抗體、奈米抗體、完全或部分人源化的抗體或者嵌合抗體等任意形式；較佳地，所述抗體為IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，更佳為IgG1或IgG4；
本發明提供的片段為所述抗體能夠特異性結合PD-1或其任何部分的片段；較佳地，所述片段為所述抗體的scFv、BsFv、dsFv、(dsFv)2 、Fab、Fab'、F(ab')2 或Fv片段。
較佳地，本發明提供之抗體的重鏈恆定區為IgG1或IgG4亞型，輕鏈恆定區為κ型； 進一步較佳地，所述抗體的輕鏈恆定區係包含SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:64所示之胺基酸序列或者與所述胺基酸序列係具有至少75%同一性之胺基酸序列；及／或，所述重鏈恆定區係包含SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:66所示之胺基酸序列或者與所述胺基酸序列係具有至少75%同一性之胺基酸序列；其中，所述至少75%同一性為例如至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%、進一步較佳至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至99%同一性等大於或等於75%的任何百分比的同一性。
根據本發明的具體實施方式，在本發明提供的抗體中，所述輕鏈可變區係包含SEQ ID NO:52所示之胺基酸序列，輕鏈恆定區係包含SEQ ID NO:56所示之胺基酸序列，重鏈可變區係包含SEQ ID NO:54所示之胺基酸序列，重鏈恆定區係包含SEQ ID NO:58所示之胺基酸序列；或者，所述輕鏈可變區係包含SEQ ID NO:60所示之胺基酸序列，輕鏈恆定區係包含SEQ ID NO:62所示之胺基酸序列，重鏈可變區係包含SEQ ID NO:64所示之胺基酸序列，重鏈恆定區係包含SEQ ID NO:66所示之胺基酸序列。
基於本發明的抗體或其片段，本發明還提供包含本發明的抗體或其片段的綴合物或融合蛋白。該綴合物或融合蛋白可包含透過化學或物理方法結合於本發明所述抗體或其片段的其他部分，例如細胞表面受體、小分子化合物（如胺基酸及糖類）、小分子聚合物或對本發明所述抗體進行修飾的任何其它部分，或者甚至是活性蛋白或多肽。舉例言之，該綴合物或融合蛋白可以是包含本發明所述抗體或其片段的雙特異性抗體。
另一方面，本發明還提供一種核酸分子，其編碼本發明任意抗體或其片段中的重鏈CDR、輕鏈CDR、重鏈可變區、輕鏈可變區、重鏈或輕鏈； 較佳地，所述核酸分子係包含SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:67所示之核苷酸序列。
還一方面，本發明係提供一種載體，其係包含本發明的核酸分子。所述載體可以為真核表現載體、原核表現載體、人工染色體及噬菌體載體等。
本發明的載體或核酸分子可以用於轉化或轉染宿主細胞或以任何方式進入宿主細胞內，用於保存或表現抗體等目的。
因此，另一方面，本發明係提供一種宿主細胞，所述宿主細胞係包含本發明的核酸分子及／或載體，或者所述宿主細胞係被本發明的核酸分子及／或載體轉化或轉染。宿主細胞可以是任何原核或真核細胞，例如細菌、昆蟲、真菌、植物或動物細胞。
基於本發明的揭露內容，本發明提供的抗體或其片段以及相應的綴合物或融合蛋白、核酸分子、載體及／或宿主細胞可以透過使用本領域已知的任何常規技術方法獲得。所述抗體或其片段、綴合物或融合蛋白、核酸分子、載體及／或宿主細胞可以被包含在藥物組合物中，更特別地被包含在藥物製劑中，從而根據實際需要用於各種目的。
因此，在又一方面，本發明還提供一種藥物組合物，所述藥物組合物係包含本發明所述的抗體或其片段、綴合物或融合蛋白、核酸分子、載體及／或宿主細胞，以及任意之藥學上可接受的輔料。
作為特異性結合人PD-1或其任何部分的抗體或其片段，本發明還提供上述主題的相關應用。
具體而言，再一方面，本發明係提供本發明所述的抗體或其片段、綴合物或融合蛋白、核酸分子、載體、宿主細胞及／或藥物組合物在製備用於預防或治療腫瘤或癌症的藥物中的用途。較佳地，所述腫瘤或癌症係選自非小細胞肺癌、經典霍德金淋巴瘤、胃癌、（原發性）肝癌、黑色素瘤、d-mmr突變或MSI-H惡性腫瘤、宮頸癌、頭頸部鱗癌、尿道膀胱癌、原發性縱隔B細胞淋巴瘤、腎細胞癌、結直腸癌及尿路上皮癌；更佳地，所述腫瘤或癌症為非小細胞肺癌、黑色素瘤、結直腸癌、肝癌、頭頸部鱗癌、經典霍德金淋巴瘤或尿路上皮癌。
還一方面，本發明係提供一種藥物組合，其係包括： (1) 本發明所述的抗體或其片段、綴合物或融合蛋白、核酸分子、載體、宿主細胞及／或藥物組合物；(2) 其他免疫增強藥物或手段，例如小分子化藥、靶向藥、抗體等重組蛋白藥，疫苗、抗體藥物複合體（antibody-drug conjugate，ADC）、溶瘤病毒、基因與核酸治療藥物及放射療法。
另外，本發明係提供一種預防或治療腫瘤或癌症的方法，所述方法係包括對有此需要的受試者施用所述抗體或其片段、綴合物或融合蛋白、核酸分子、載體、宿主細胞及／或藥物組合物，以及任意的其他藥物或手段。較佳地，所述腫瘤或癌症係選自非小細胞肺癌、經典霍德金淋巴瘤、胃癌、（原發性）肝癌、黑色素瘤、d-mmr突變或MSI-H惡性腫瘤、宮頸癌、頭頸部鱗癌、尿道膀胱癌、原發性縱隔B細胞淋巴瘤、腎細胞癌、結直腸癌及尿路上皮癌；更佳地，所述腫瘤或癌症為非小細胞肺癌、黑色素瘤、結直腸癌、肝癌、頭頸部鱗癌、經典霍德金淋巴瘤或尿路上皮癌。該任意的其他藥物或手段係指可以與本發明抗體或其片段、綴合物或融合蛋白、核酸分子、載體、宿主細胞及／或藥物組合物聯合施用的其他免疫增強藥物或手段，例如小分子化藥、靶向藥、抗體等重組蛋白藥、疫苗、ADC、溶瘤病毒、基因與核酸治療藥物及放射療法。二者的聯合施用可以採取任意形式進行，例如同時、連續或間隔一定時間進行。所述受試者為哺乳類動物，較佳地，所述受試者為人。
再一方面，本發明係提供一種試劑盒，所述試劑盒係包括本發明所述的抗體或其片段、綴合物或融合蛋白、核酸分子、載體、宿主細胞及／或藥物組合物。
在本發明中，利用人PD-1胞外區結構域重組蛋白（序列號：NP_005009.2，21aa-167aa），免疫小鼠後取脾細胞，利用雜交瘤技術篩選獲得與人PD-1胞外區結構域重組蛋白及細胞表面人PD-1均具有高親和力結合，且能特異性阻斷PD-1/PD-L1、PD-1/PD-L2配受體結合的抗體分子（本發明中命名為317），進一步透過人源化技術獲得親和力及特異性保持不變的人源化抗體（本發明中命名為h317），對其全抗體IgG4的結合、阻斷、促進T細胞活化及體內抗腫瘤藥效進行全面的評估，並且構建了其Fab及PD-1-ECD的晶體複合物，透過晶體繞射及進一步的突變體驗證確認其抗原結合表位。
實驗證明，本發明抗體能夠有效阻斷PD-1與PD-L1/PD-L1的結合，同時與Nivolumab和帕博利珠單抗（Keytruda）具有競爭結合關係；但是，透過抗原抗體複合物晶體結構分析發現，本發明抗體的抗原結合表位與Nivolumab及Keytruda均不同，是第一個明確抗原表位與PD-1的第58位Glu的N糖基化位點相關的抗體分子。
具體而言，與先前技術相比，本發明係具有以下有益之處：
第一，本發明的抗體為具有高親和力的抗PD-1人源化抗體。
本發明的人源化抗PD-1抗體h317可以特異性結合人PD-1蛋白，其親和力（KD）為6.16E-09M，而對照抗體Nivolumab親和力（KD）為8.06E-09M，且在同等條件下，h317解離（kd(1/s): 9.50E-04）優於Nivolumab解離（kd(1/s):1.69E-03），顯示h317與人PD-1具有高親和力，為h317對PD-1/PD-L1信號通路的抑制作用提供了依據。
第二，本發明的抗體係具有良好的生物學活性。
實驗證明，本發明的h317可以有效阻斷重組人PD-1與其配體PD-L1及PD-L2的結合作用，二者IC50均為1.4nM，與對照抗體Nivolumab（IC50：1.3 nM）的阻斷活性相近，且在體外實驗中證明h317可以促進人混合淋巴細胞分泌殺傷性細胞因子IL-2及IFN-γ，即，可以誘導Th1型細胞介導的免疫反應。
第三，本發明的抗體係具有特殊的抗原識別表位。
本發明抗體特異性結合人PD-1，其結合的抗原表位係具有獨特性。
PD-1-h317-Fab複合物整體結構分析顯示，PD-1抗原（胞外區1-167aa）以單體形式存在，與PD-1抗體的h317-Fab片段形成一個1:1的複合物結構。PD-1與抗體的結合部位主要是在其loop區，包括BC loop、C’ D loop及FG loop區域。此外，在PD-1抗原結構中可以觀察到N49、N58、N116位點的糖基化，N74的糖基化位點不明確，其中N58位的糖鏈參與了與h317-Fab的結合。相較之下，其他已報導的PD-1抗原抗體複合物結構中該位元點的糖鏈沒有參與二者相互作用。此外，根據晶體複合物資訊將PD-1上的4個糖基化位元點分別定點突變為丙氨酸（A），並瞬轉至293細胞，透過FACS檢測h317與PD-1-mut分子的結合情況，結果顯示PD-1的N58位突變為A失去糖基化使得h317失去與PD-1的結合能力，因此h317是第一個明確抗原表位與N58糖鏈相關的抗體分子。
第四，本發明抗體在PD-1轉殖基因鼠移植瘤模型中有明顯的抑瘤效果。
在PD-1轉殖基因鼠移植瘤模型中，h317在高劑量（10毫克／公斤（mg/kg））及中劑量（2 mg/kg）下可顯著抑制PD-1轉殖基因鼠皮下移植瘤的生長，在高中劑量水準下h317與其參考抗體Nivolumab的抑瘤效果相當。
以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域中具通常知識者能夠理解，這些實施例僅用於說明本發明，其不以任何方式限制本發明的範圍。
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。
實施例 1 ： 抗人PD-1抗體雜交瘤細胞株的篩選、鑒定及抗體序列測定
免疫：小鼠免疫採用弗氏佐劑及水溶佐劑兩種免疫方法，在第0天及第14天對小鼠進行兩次腹腔免疫注射弗氏佐劑，在第0天及第21天對8-10週齡之Balb/c小鼠進行兩次肌肉免疫注射水溶佐劑，免疫抗原為：人PD-1/mFc重組蛋白（序列號：NP_005009.2，21aa-167aa，Lot：2016.3.16），由北京科諾信誠科技有限公司在HEK293細胞中進行重組表現。第一次免疫劑量為50微克（μg），第二次免疫劑量為25 μg。免疫前取小鼠血清作為檢測時的陰性對照，弗氏佐劑在初次免疫後第28天，水溶佐劑在初次免疫後第35天尾靜脈取血，用重組人PD-1蛋白塗覆的96孔酶標板以ELISA法檢測血清滴度；當血清滴度達到融合要求的小鼠加強免疫時，將25 μg抗原用D-PBS稀釋成500微升（μL），並進行腹腔注射。初次免疫後第38天取血清滴度高的小鼠的脾細胞用於下一步的細胞融合。
細胞融合及雜交瘤製備：初次免疫後第38天，選取滴度達到要求的小鼠，摘除眼球採血，並分離血清作為抗體檢測時的陽性對照血清；並無菌取小鼠脾臟，製備B淋巴細胞懸浮液，與FO骨髓瘤細胞以5：1的比例混合，在PEG4000作用下使兩種細胞融合。融合後的細胞用HAT培養基再懸浮後，分裝於含有巨噬細胞的96孔細胞培養板中，並置於37°C，5% CO2 之培養箱內培養。兩週後換成HT培養基繼續培養2週，然後換成R1640完全培養基。
陽性雜交瘤篩選：融合後10-14天，以人PD-1/His重組蛋白（序列號：NP_005009.2，21aa-167aa，Lot：2016.2.22）（10微克／毫升（μg/mL），pH9.6，0.1莫耳濃度（M）之NaHCO3 ）進行酶標板之塗覆，並置於4°C隔夜；用4%脫脂奶粉-PBS進行封閉，置於37°C，歷時2小時；用PBST（0.05% Tween20-PBS）清洗三次，加入雜交瘤殖株培養上清液，並置於37°C，歷時1小時。設計以下對照：(1) 陽性對照：免疫後小鼠血清（用PBS以1:1000之倍率稀釋）；(2) 陰性對照：免疫前小鼠血清（用PBS以1:1000之倍率稀釋）；(3) 空白對照：PBS。經PBST（0.05% Tween20-PBS）清洗三次，加入HRP-羊抗小鼠IgG（Fcγ），以1:20000之倍率稀釋，並置於37°C，歷時1小時；再經PBST（0.05% Tween20-PBS）清洗五次，加入鄰苯二胺（o-Phenylenediamine，OPD）顯色液，避光顯色歷時10-15分鐘後，再加入2M H2 SO4 終止反應；酶標儀讀A490值。檢測孔A490值大於陰性對照孔A490值2.1倍以上判斷為陽性。為確定陽性殖株的可靠性，再一次篩選換液後隔一天再進行第二輪篩選，共進行三輪篩選。經檢測鑒定，共獲得多個抗體分泌陽性細胞株（圖1）：6、317、500、763、795、904號。
以重組人PD-1/His（序列號：NP_005009.2，21aa-167aa，Lot：2016.2.22）、食蟹猴（Cat：90311-C08H，北京義翹神州）、大鼠（Cat：80448-R08H，北京義翹神州）及小鼠（Cat：50124-M08H，北京義翹神州）PD-1蛋白於4°C進行塗覆隔夜，塗覆濃度為1 μg/mL；以PBS清洗板3次後，加入含有5% BSA的PBS，於37°C進行封閉歷時60分鐘後，以PBST清洗板3次；加入稀釋100倍的雜交瘤上清液，於37°C培養60分鐘，再以PBST清洗板4次；加入以1:5000之倍率稀釋的HRP-羊抗小鼠IgG(Fcr)（Cat：115-035-071，Jackson Immuno Research)，於37°C培養30 min，再以PBST清洗板4次；加入TMB底物顯色，37°C培養10分鐘後，加入2M HCl終止反應；以630奈米（nm）為參考波長，讀取並記錄波長450nm下孔板的吸光值A450 nm-630 nm。共選用五個（317、500、763、795、904號）雜交瘤上清液進行不同種屬重組PD-1之間的交叉反應檢測，ELISA結果顯示五個抗體均可以特異性地與重組人、食蟹猴PD-1結合，但與重組大鼠、小鼠PD-1則無結合活性，不產生交叉反應（圖2）。選擇其中317號殖株用於下一步的序列鑒定。
將分泌抗人PD-1抗體的雜交瘤細胞317號殖株擴大培養後，用小鼠單株抗體IgG亞型測試卡（Mouse Monoclonal Antibody IgG Subclass Test Card；Cat：A12403）及小鼠單株抗體輕／重鏈測試卡（Mouse Monoclonal Antibody Light/Heavy Chain Test Card；Cat：A12401）按照試劑操作規程進行亞型檢測，亞型鑒定為：重鏈為IgG1，輕鏈為Kappa鏈（圖3），為317抗體基因的殖株提供依據。
將317雜交瘤細胞按照TRIzol試劑盒（Cat：15596026，Invitrogen）所附說明書之步驟萃取細胞總RNA；利用M-MuLV反轉錄酶（Cat：M0253S，NEB）將雜交瘤細胞總RNA反轉錄成cDNA；使用退化引子（degenerate primer）（表1、表2）及Phusion試劑盒（Cat：E0553L，NEB）擴增抗體輕鏈可變區IgVL(κ)和重鏈可變區VH 序列；利用膠回收試劑盒（Cat：AP-GX-250，Axygen）純化PCR擴增產物；按照T載體複製試劑盒（Cat：ZC205，莊盟生物）所附之說明書將擴增PCR產物連接至T載體並轉化大腸桿菌感受態細胞，菌株擴增、萃取質體後進行DNA定序獲得單株抗體可變區序列。定序結果顯示317抗體輕鏈可變區DNA的核苷酸序列（見SEQ ID NO:53），由該DNA序列推測得到317抗體輕鏈可變區胺基酸序列（見SEQ ID NO:52）；317抗體重鏈可變區DNA的核苷酸序列（見SEQ ID NO:55），由該DNA序列推測得到317抗體重鏈可變區胺基酸序列（見SEQ ID NO:54）。 表1. 輕鏈PCR擴增引子
上游引子 MKV1 ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTG（SEQ ID NO:68）
MKV2 ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGTG（SEQ ID NO:69）
MKV3 ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGSGTTG（SEQ ID NO:70）
MKV4 ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGMWTCTTG（SEQ ID NO:71）
MKV5 ATGGATTTWCAGGTGCAGATTWTCAGCTTC（SEQ ID NO:72）
MKV6 ATGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRGG（SEQ ID NO:73）
MKV7 ATGGGCWTCAAGATGGAGTCACAKWYYCWGG（SEQ ID NO:74）
MKV8 ATGTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAATTG（SEQ ID NO:75）
MKV9 ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG（SEQ ID NO:76）
MKV10 ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT（SEQ ID NO:77）
MKV11 ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC（SEQ ID NO:78）
下游引子 MCK TCATCAACACTCATTCCTgTTgAAgCTCTTgA（SEQ ID NO:79）
表2. 重鏈PCR擴增引子
上游引子 MHV1 ATGAAATGCAGCTGGGGCATSTTCTTC（SEQ ID NO:80）
MHV2 ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT（SEQ ID NO:81）
MHV3 ATGAAGWTGTGGTTAAACTGGGTTTTT（SEQ ID NO:82）
MHV4 ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRTTT（SEQ ID NO:83）
MHV5 ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTT（SEQ ID NO:84）
MHV6 ATGGCTTGTCYTRGSGCTRCTCTTCTGC（SEQ ID NO:85）
MHV7 ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT（SEQ ID NO:86）
MHV8 ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG（SEQ ID NO:87）
MHV9 ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGCTATTCCTG（SEQ ID NO:88）
MHV10 ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCTG（SEQ ID NO:89）
MHV11 ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG（SEQ ID NO:90）
MHV12 ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTG（SEQ ID NO:91）
下游引子 MIgG1CH1 CTAACAATCCCTgggCACAATTTTCTTgTCCACC（SEQ ID NO:92）
實施例 2 ： 抗人PD-1嵌合抗體的製備
將複製獲得的單株抗體輕鏈可變區及重鏈可變區基因透過如下引子（表3）PCR引入酶切位點，分別複製到裝有人-kappa輕鏈恆定區及人IgG4重鏈恆定區編碼基因上游的真核表現載體中，獲得人-鼠嵌合輕鏈（pKN019-317L）及人-鼠嵌合重鏈（pKN034-317H）表現質體，轉殖入大腸桿菌擴增，分離獲得大量含人-鼠嵌合抗體輕鏈及重鏈的質體，將二者與293fectin混合後共轉染入HEK293細胞中。細胞轉染5至6天，取培養上清液，利用ProA親和層析柱對表現上清液進行純化，獲得的317嵌合抗體利用Fortebio（BLITZ pro1.1.0.28）儀器，採用抗人抗體捕獲法測定抗體親和力。測定時將抗人抗體Fc段的捕獲抗體（AHC）生物探針浸泡於PBS，歷時10分鐘；將4 µL稀釋後的抗體樣品（317嵌合抗體，Nivolumab，20 μg/mL）分別裝入2根AHC生物探針，然後在PBS中平衡30秒，進一步將AHC探針與不同稀釋濃度的人PD-1-His重組蛋白（序列號：NP_005009.2，21aa-167aa，Lot：2016.2.22）(1 μM、0.6 μM及0 nM)進行結合反應，結合時間45秒，之後將AHC探針轉移至PBS中，進行解離反應，時間為120秒。實驗完畢，扣除空白對照回應值，用軟體進行1:1 Langmuir結合模式擬合，計算抗原抗體結合的動力學常數。
317嵌合抗體（圖4，4A）及對照抗體Nivolumab（圖4，4B）與人PD-1重組蛋白的反應曲線如圖4所示，擬合曲線並計算親和力，317嵌合抗體親和力（KD）為1.02E-09M，Nivolumab親和力（KD）為1.01E-09M。詳細動力學參數如表4所示。結果顯示317嵌合抗體與人PD-1具有高親和力，且在同等條件下，解離值與對照抗體Nivolumab相近。該結果為317抗體的人源化及對PD-1/PD-L1信號通路的抑制作用提供了理論依據。 表3. 317抗體輕鏈及重鏈可變區複製引子
輕鏈可變區複製引子 上游引子 hM-hl5 CTCAAGCTTAATTGCCGCCACCATG（SEQ ID NO:93）
SP-317L-F CCTGGAGCCATCGGAGACATTGTGATGACC（SEQ ID NO:94）
下游引子 SP-317L-R GGTCATCACAATGTCTCCGATGGCTCCAGG（SEQ ID NO:95）
317L-R GCTGGCGCCGCATCAGCCCGTTTGATTTC（SEQ ID NO:96）
重鏈可變區複製引子 上游引子 hM-hl5 CTCAAGCTTAATTGCCGCCACCATG（SEQ ID NO:97）
SP-317H-F GAAGGGCGTGCAGTGCGAAGTGAAGCTGGTG（SEQ ID NO:98）
下游引子 SP-317H-R CACCAGCTTCACTTCGCACTGCACGCCCTTC（SEQ ID NO:99）
317H-R GCGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAG（SEQ ID NO:100）
表4. 317嵌合抗體與人PD-1胞外區結構域重組蛋白的親和力測定結果
親和力 （KD值(M)） 結合速率（kon(1/Ms)） 解離 （kd(1/s)）
317 2.64E-09 2.15E+05 5.66E-04
Nivolumab 2.018E-09 3E+05 6.05E-04
實施例 3 ： 抗人PD-1單株抗體的人源化及穩定細胞株的構建
首先對鼠源抗體重鏈序列進行綜合分析，確定抗體與抗原結合的抗原互補決定區（CDR）及支撐抗體保守三維構象的框架區（framework，FR）。隨後根據同源性比對結果，在人抗體germline庫（http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/alignments2.php#VHEX）尋找最相似人源抗體範本，選擇VH3(3-21)為基礎範本，結合全序列經軟體blast（basic local alignment search tool）檢測後之結果，考慮重排（rearranged）抗體在特定FR區位點胺基酸出現頻率（A49），進行CDR移植，考慮FR3區（S98）靠近CDR3區，不進行更換，根據CDR3序列（Pdssgvay）情況，選擇JH4（wgqgtlvtvss）為J區序列，實現H1在框架區的高度人源化。根據同源性比對結果，在人抗體germline庫（http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/alignments2.php#VHEX）尋找最相似人源抗體範本，選擇VK II (A19)為基礎範本，結合全序列經軟體blast檢測後之結果，考慮重排抗體在特定FR區位點胺基酸出現頻率（R45），進行CDR移植，根據CDR3序列（Qqysrypw）情況，選擇JK1（fgqgtkveik）為JK區序列，實現輕鏈框架區的全人源化。
將317抗體鼠源序列進行全人源化設計並全合成該序列，並將人源化後的317抗體命名為h317，將人源化的h317-VH1透過酶切複製到真核表現載體pKN034的人IgG4的重鏈恆定區編碼基因的上游，將人源化的h317-VL2透過酶切複製到真核表現載體pKN019的人輕鏈Cκ的編碼基因的上游，構建人源化317輕、重鏈表現載體，將h317-H與L透過酶切的方法複製到pKN002真核穩定高表現載體，透過Pvu I線性化後，利用Nucleofector 2b電轉儀（300452，Lonza），將h317基因整合到中國倉鼠卵巢上皮細胞（CHO細胞）的DNA中，經過甲硫胺酸磺醯亞胺（L-Methionine sulfoximine，MSX；Cat：M5379-500MG，Sigma）加壓篩選及次選殖得到最終高表現h317的穩定細胞株。317人源化後輕鏈可變區DNA的核苷酸序列見SEQ ID NO:61，胺基酸序列見SEQ ID NO:60；人源化後重鏈可變區DNA的核苷酸序列見SEQ ID NO:63，胺基酸序列見SEQ ID NO:62。
實施例 4 ： h317與人PD-1蛋白的結合動力學研究
h317及Nivolumab的生物素化（biotinylation）：將200微升之5 mg/mL EZ-LinkNHS-LC-LC-Biotin（Cat：21343，Thermo）室溫放置5分鐘，與1毫升之1 mg/mL的h317（Lot：DP201805002，江蘇泰康生物醫藥有限公司）或Nivolumab（Lot：AAW4553，BMS）蛋白溶液混勻，室溫放置30分鐘。超濾濃縮至0.5毫升，以280 nm的吸收值測定蛋白含量，分裝並保存於-80°C，凍融不超過1次。
結合動力學測定：利用Fortebio公司的Octet QKe system儀器，採用Streptavidin捕獲Biotin標記抗體法測定抗體親和力。測定時將Biotin標記的抗體（h317-biotin，Nivolumab-biotin）用PBS緩衝液稀釋至5 μg/mL，流經預塗覆Streptavidin的探針（Cat：1612101，PALL）表面，時間為120秒。人PD-1重組蛋白（序列號：NP_005009.2，21aa-167aa）作為流動相，用PBS作兩倍濃度梯度稀釋，其濃度範圍為100 nM至12.5 nM。結合時間為300秒，解離時間為300秒。實驗完畢，扣除空白對照回應值，用軟體進行1:1 Langmuir結合模式擬合，計算抗原抗體結合的動力學常數。
結果顯示h317（圖5，5A）及對照抗體Nivolumab（圖5，5B）與人PD-1重組蛋白的反應曲線如圖5所示，擬合曲線並計算親和力，h317親和力（KD）為6.16E-09M，Nivolumab親和力（KD）為8.06E-09M。詳細動力學參數如表5所示。結果顯示h317與人PD-1具有高親和力，且在同等條件下，解離值優於對照抗體Nivolumab。該結果為h317對PD-1/PD-L1信號通路的抑制作用提供了理論依據。 表5. h317與人PD-1胞外區結構域重組蛋白的親和力測定結果
KD值(M) kon(1/Ms) kd(1/s)
h317 6.16E-09 1.54E+05 9.50E-04
Nivolumab 8.06E-09 2.09E+05 1.69E-03
實施例 5 ： ELISA檢測h317對PD-1與其配體PD-L1、PD-L2結合的抑制作用
ELISA檢測h317對PD-1與PD-L1結合的抑制作用：將人PD-1-hFc（序列號：NP_005009.2，21aa-167aa，Lot：20180329）濃度稀釋至0.5 μg/mL，於4°C進行塗覆過夜，用5% BSA於37°C恆溫培養箱中進行封閉歷時60分鐘。加入h317（Lot：DP201805002，江蘇泰康生物醫藥有限公司）或Nivolumab（Lot：AAW4553，BMS）（起始濃度為3 μg/mL，1.5倍連續稀釋），於37°C恆溫培養箱中進行反應歷時120分鐘，加入1 μg/mL的PD-L1-mFc（序列號：NP_054862.1，19aa-238aa，Lot：20180412）與抗體共培養，於37°C恆溫培養箱中進行反應歷時60分鐘。然後加入以1:5000之倍率稀釋的HRP-anti-mouse Fc（Cat：115-035-071，Jackson Immuno Research），進行反應歷時45分鐘，加入TMB（Cat：ME142，北京泰天河生物）底物顯色歷時15分鐘，再以2M HCl終止後讀板。以630nm為參考波長，讀取並記錄波長450 nm下孔板的吸光值A450 nm-630 nm。
ELISA檢測h317對PD-1與PD-L2結合的抑制作用：將PD-1-hFc（序列號：NP_005009.2，21aa-167aa，Lot：20180329）濃度稀釋至0.5 μg/mL，於4°C進行塗覆過夜，用5% BSA於37°C恆溫培養箱中進行封閉歷時60分鐘。加入h317（Lot：DP201805002，江蘇泰康生物醫藥）或Nivolumab（Lot：AAW4553，BMS）（起始濃度為3 μg/mL，1.5倍連續稀釋），於37°C恆溫培養箱中進行反應歷時120分鐘，加入2 μg/mL的PD-L2-hFc-Biotin（序列號：NP_079515.2，20aa-220aa，Lot：2016.12.05），與抗體共培養，於37°C恆溫培養箱中進行反應歷時60分鐘。然後加入以1:2000之倍率稀釋的HRP-streptavidin（Cat：S2438，Sigma）進行反應歷時30分鐘，加入TMB底物顯色歷時15分鐘，再以2M HCl終止後讀板。以630 nm為參考波長，讀取並記錄波長450 nm下孔板的吸光值A450 nm-630 nm。
結果顯示h317可以有效阻斷重組人PD-1與其配體PD-L1及PD-L2的結合作用。透過ELISA測定h317及Nivolumab對PD-1與其配體PD-L1結合的競爭抑制效應，其半數有效抑制濃度（IC50）值分別1.4 nM及1.3 nM（圖6，6A）。透過ELISA測定h317及Nivolumab對PD-1與其配體PD-L2結合的競爭抑制效應，其半數有效抑制濃度（IC50）值分別1.2 nM及1.0 nM（圖6，6B）。與Nivolumab相比，h317阻斷活性相近。
實施例 6 ： ELISA檢測h317與PD-1結合的種屬特異性研究
將重組人（序列號：NP_005009.2，21aa-167aa，Lot：20180423）、食蟹猴（Cat：90311-C08H，北京義翹神州）、大鼠（Cat：80448-R08H，北京義翹神州）及小鼠（Cat：50124-M08H，北京義翹神州）PD-1蛋白於4°C進行塗覆過夜，塗覆濃度為1 μg/mL；以PBS清洗板3次後，加入含有5% BSA的PBS，於37°C進行封閉歷時60分鐘，再以PBST清洗板3次；加入不同稀釋倍數之生物素化的h317（同實施例4）（起始濃度為1 μg/mL，3倍梯度依次稀釋11個濃度），於37°C進行培養歷時60分鐘，再以PBST清洗板4次；加入以1:100之倍率稀釋的HRP-streptavidin（Cat：019-035-098，Jackson Immuno Research），於37°C進行培養歷時30分鐘，再以PBST清洗板4次；加入TMB底物顯色，於37°C進行培養歷時10分鐘後，加入2M HCl終止反應；以630 nm為參考波長，讀取並記錄波長450 nm下孔板的吸光值A450 nm-630 nm。
實驗結果顯示，h317可以特異性地與重組人、食蟹猴PD-1結合（圖7），其半數有效結合濃度（EC50）值分別為0.004703 nM及0.01823 nM，但與重組大鼠、小鼠PD-1則無結合活性，不產生交叉反應（圖7），為h317進行體內外藥效學實驗提供依據。
實施例 7 ： ELISA檢測h317與CD28家族成員結合的專一性研究
將重組人PD-1（序列號：NP_005009.2，21aa-167aa，Lot:20180423）、CD28（Cat：11524-HCCH，北京義翹神州）、CTLA4（Cat：11159-H08H，北京義翹神州）及ICOS（序列號：NP_036224.1，1aa-199aa）蛋白於4°C進行塗覆過夜，塗覆濃度為1 μg/mL；以PBS清洗板3次後，加入含有5% BSA的PBS，於37°C進行封閉歷時60分鐘，再以PBST清洗板3次；加入不同稀釋倍數之生物素化的h317（同實施例4）（起始濃度為1 μg/mL，3倍梯度依次稀釋11個濃度），於37°C進行培養歷時60分鐘，再以PBST清洗板4次；加入以1:100之倍率稀釋的HRP-streptavidin（Cat：019-035-098，Jackson Immuno Research），於37°C進行培養歷時30分鐘，再以PBST清洗板4次；加入TMB底物顯色，於37°C進行培養歷時10分鐘後，加入2M HCl終止反應；以630 nm為參考波長，讀取並記錄波長450 nm下孔板的吸光值A450 nm-630 nm。
實驗結果顯示，h317可以特異性地與重組人PD-1結合，與其他CD28家族成員無結合活性，不產生交叉反應（圖8），為h317進行體內外藥效學實驗提供依據。
實施例 8 ： h317體外刺激人T細胞（PBMC）活性研究
A. 分離CD14+ 單核細胞及樹突細胞（DC細胞）的分化
根據Ficoll-Paque PLUS（Cat：17-1440-03，Lot：10246684，GE Healthcare）試劑萃取說明進行PBMC萃取後，按照CD14磁珠（Cat：130-050-201，Lot：5170814438，Miltenyi）說明，陽選CD14+ 單核細胞。隨後將細胞用ImmunoCult™的樹突細胞分化培養基（ImmunoCult™ DC Differentiation Medium；Cat：10988，Lot：17G83035，STEMCELL）再懸浮至每毫升培養基含有5×105 個細胞，將5毫升體積之前述含有細胞的培養基接入到一個T-25細胞培養瓶中，置於37°C、5% CO2 培養箱中培養3天後，離心換液，置於37°C、5% CO2 培養箱中培養2天後，加入50微升的ImmunoCult™的樹突細胞成熟補充劑（ImmunoCult™ Dendritic Cell Maturation Supplement；Cat：10989，Lot：17B77271，STEMCELL），混勻後，置於37°C、5% CO2 培養箱中培養2天，用於MLR實驗。
B. CD4+ T細胞的分離萃取
根據Ficoll-Paque PLUS（Cat：17-1440-03，Lot：10246684，GE Healthcare）試劑萃取說明進行PBMC萃取後，按照CD4+ T細胞分離試劑盒（Cat：130-096-533，Lot：5171016623，Miltenyi）的說明，從PBMC中分離CD4+ T細胞，用於MLR實驗。
C. MLR實驗
先用完全培養基配置濃度為8 μg/mL的待測抗體（h317（Lot：DP201805002，江蘇泰康生物醫藥）、Nivolumab（Lot：AAW4553，BMS）、Human NC-IgG4對照（Lot：AB170090））溶液，再進行10倍梯度稀釋，共配製6個濃度。隨後根據實驗板的設計加50微升的抗體到相應的孔中。將CD4+ T細胞的濃度調整到每毫升含有1×106 個細胞，加100微升（1×105 細胞／孔）的細胞懸浮液到相應的孔中。用2mM的EDTA消化DC細胞，以1500 rpm之轉速離心5分鐘，調整DC細胞的濃度為每毫升含有2×105 個細胞，加50微升（1×104 細胞／孔）DC細胞懸浮液到相應孔中，總體積為200微升，CD4+ T細胞：DC細胞之體積比 = 10：1。將96孔細胞培養板置於37°C細胞培養箱中培養5天後，收集細胞上清液，用IFN-γ ELISA試劑盒（Cat：430106，Lot：B247782，Biolegend）及IL-2 ELISA試劑盒（Cat：DY202，Lot：P155804，R&D）檢測IFN-γ及IL-2的濃度。
檢測結果顯示，h317體外刺激人混合淋巴細胞，可促進其分泌殺傷性細胞因子IL-2（圖9，9A）及IFN-γ（圖9，9B），暗示h317可以誘導Th1型細胞介導的免疫反應。
實施例 9 ： h317對293T/hPD-1細胞的ADCC毒性作用研究
根據Ficoll-Paque PLUS（Cat：17-1440-03，Lot：10246684，GE Healthcare）試劑萃取說明進行PBMC萃取後，將細胞再懸浮於ADCC培養基（無酚紅RPMI1640 培養基（Cat：11835-030，Lot：1860152，Gibco）+2% FBS（Cat：SH30084.03，Lot：GAE0138，Hyclone））中。對得到的PBMC進行細胞計數，按照NK細胞分離試劑盒（Cat：130-092-657，Lot：5170911524，Miltenyi）的說明，進行NK細胞之分離，用於ADCC毒性分析。按照CytoTox 96®非放射性細胞毒性檢測試劑盒（Cat：G1781，Lot：0000265175，Promega）之說明，取在對數生長期之表現人PD-1蛋白的293T細胞，用ADCC培養基稀釋調整最終細胞懸浮液濃度為每毫升50×104 個細胞，在96孔圓底板中每孔加入40微升之細胞懸浮液，每孔加入10微升之藥物溶液（每個細胞濃度設置三個複孔），並在室溫培養歷時30分鐘。被測抗體（h317（Lot：DP201805002，江蘇泰康生物醫藥）、h317-hIgG1（Lot：20180528）、Human NC-IgG4（Lot：20180521））之最終濃度為10000奈克／毫升（ng/mL）、1000 ng/mL、100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、0.1 ng/mL、0.01 ng/mL。透過加入調整至不同濃度的50微升之NK細胞細胞懸浮液，設置兩個E：T比例為10：1、5：1。將96孔板以250 g之轉速離心4分鐘，讓效應細胞及目的細胞充分接觸，在37°C、5% CO2 、95%之空氣條件下進行細胞培養歷時4小時。轉移上清液前45分鐘時，在最大裂解（max lysis）對照孔中加入10微升之裂解液（每100微升加入10微升）。培養4小時後，以250 g之轉速離心5分鐘。將50微升之上清液轉移到乾淨的96孔平板中。加入50微升之反應底物並混合30秒後，在室溫培養歷時30分鐘。加入50微升之終止液並混合30秒後，讀取吸光值（OD 490 nm）。
將實驗組孔數值、目的細胞對照孔數值、NK細胞+目的細胞孔數值減去培養基對照孔數值。將得到的數值用下列公式計算細胞毒性。 實驗組孔數值–目的細胞對照孔平均值 細胞毒性%  =                                                                                       × 100% （NK細胞+目的細胞孔）平均值–培養基對照孔平均值
實驗結果顯示，h317與293T細胞表面的hPD-1結合後並不會啟動人PBMC中NK細胞對標靶細胞的殺傷作用（圖10）。與不加抗hPD-1抗體的對照組相比，h317對高度表現hPD-1的293T細胞沒有ADCC活性。結論是h317沒有ADCC效應功能。
實施例 10 ： h317在PD-1轉殖基因鼠移植瘤模型中的藥效體內抗腫瘤藥效評價
試驗共選用65隻HuGEMMPD-1小鼠（6至8週，上海南方模式生物），在受試小鼠右側皮下接種MC38-hPD-L1腫瘤細胞（1×106 細胞／隻，1×106 個細胞再懸浮於100微升之PBS中）。當荷瘤鼠之平均腫瘤體積到達約60至100立方毫米（mm3 ）時，測定動物體重，並用遊標卡尺測量腫瘤體積，開始給藥，給藥前使用StudyDirectorTM （版本號3.1.399.19，供應商Studylog System, Inc.，S.San Francisco，CA，USA）進行隨機分組，共分為6組，進行給藥（D0），每組的動物數及詳細的給藥途徑、劑量及方案參見表6，給藥、腫瘤測量及體重稱量等全部過程都在生物安全櫃或超淨工作臺中進行。實驗中使用StudyDirectorTM （版本號3.1.399.19，供應商Studylog System, Inc.）軟體收集資料，包括腫瘤之長短徑的測量及動物體重的稱量，原始資料由天秤及遊標卡尺測量後直接導入軟體，當對照組小鼠瘤體積均值超過2000 mm3 時或最後一次給藥後一星期終止實驗。並收集腫瘤塊，測量腫瘤重量，拍攝腫瘤照片，結束實驗當天取瘤做FACS，每組4隻（與採集血液動物編號對應），Marker：CD3，CD4，CD8，CD45，Live/Dead。結束實驗當天取全血做FACS，每組4隻（與採集腫瘤動物編號對應），Marker：CD3，CD4，CD8，CD45。 表6. 藥效學實驗設計
組別 動物數 給藥組 劑量(mg/kg) 給藥方式 給藥週期
1 8 hIgG control 10 腹腔注射（i.p.） 每週2次（BIW）×3周
2 8 h317-H 10 i.p. BIW×3周
3 8 h317-M 2 i.p. BIW×3周
4 8 h317-L 0.5 i.p. BIW×3周
5 8 Nivolumab-L 2 i.p. BIW×3周
6 6-8 （待討論的） Nivolumab-H 10 i.p. BIW×3周
注：給藥體積為10 μL/g；hIgG對照（Lot：20180521），h317（Lot：DP201805002，江蘇泰康生物醫藥），Nivolumab（Lot：AAW4553，BMS）
HuGEMMPD-1小鼠模型是基因工程鼠，是在C57BL/6J遺傳背景下，將人源PD-1蛋白編碼區插入到小鼠PD-1的ATG位置，表現人源PD-1，取代小鼠PD-1的表現。MC38是在C57BL/6小鼠中誘導所獲得的鼠源腸癌細胞株。透過基因工程的方法，移除MC38的鼠源PD-L1，並殖入人源PD-L1，以獲得表現人源PD-L1的MC38細胞株，即，MC38-hPD-L1細胞株。在PD-1轉殖基因鼠移植瘤模型上進行評估並比較h317及其參考抗體Nivolumab對腫瘤生長的抑制效果。結果顯示（見圖11，表7），h317在高劑量及中劑量下可顯著抑制PD-1轉殖基因鼠皮下移植瘤的生長，且在高劑量及中劑量下h317與其參考抗體Nivolumab的抑瘤效果相當。 表7. 各組PD-1轉基因鼠皮下移植瘤的瘤重資料及統計分析
組號 治療 第0天 腫瘤體積 (mm3 )a 第11天 腫瘤體積(mm3 )a T/C（RTV） % TGI P
(%) Valueb
1 hIgG對照，10mg/kg  BIW*4次，i.p. 68.21±9.16 2600.18±178.98 - - -
2 h317-H，10mg/kg，  BIW*4次，i.p. 67.90±8.74 76.84±33.94 2.96 97.04 >0.001
3 h317-M，2mg/kg，  BIW*4次，i.p. 68.09±8.40 354.89±157.70 11.25 88.75 >0.001
4 h317-L，0.5mg/kg，  BIW*4次，i.p. 67.51±7.62 2581.85±230.58 101.60 -1.60 1.000
5 Nivolumab-L，2mg/kg， BIW*4次，i.p. 67.17±8.05 594.63±212.98 23.72 76.28 >0.001
6 Nivolumab-H，10mg/kg， BIW*4次，i.p. 67.75±7.83 84.82±66.02 2.31 97.69 >0.001
注釋：a. 資料以「平均值 ± 標準誤差」表示；n=8 b. p值係運用單因子變異數（one way ANOVA） 分析腫瘤體積所得，F值有顯著性差異（p>0.05），應用Dunnett’s T3法進行分析。 T/C（RTV）：為以相對腫瘤體積（Relative Tumor Volume，RTV）計算的T/C，是腫瘤對治療的反應的指標，為最常用的評價指標。公式：T/C（RTV）%= TRTV /CRTV × 100%，其中TRTV ：治療組平均RTV，CRTV ：對照組平均RTV。 TGI：相對腫瘤抑制率（Tumor growth inhibition，TGI），是腫瘤對於治療的反應的指標之一。公式：TGI% = (1-T/C) × 100%；其中，T/C%為相對腫瘤增殖率，在某一時間點，治療組及對照組相對腫瘤體積的百分比值，T及C分別為治療組及對照組某一特定時間點的相對腫瘤體積。
實施例 11 ： h317結合PD-1受體之內化（internalization）
瞬時表現人PD-1的293細胞株的構建：將HEK293細胞按每毫升6×105 個細胞的密度接入搖瓶中，體積10毫升，置於37°C，5% CO2 的震盪培養箱中以130 rpm之轉速震盪培養歷時24小時。將編碼全長人PD-1（NP_005009.2，21aa-288aa）表現質體與293fectin（Cat：12347019，Gibco）按1：1.2的比例分別在0.5毫升之減血清培養基（Opti-MEM；Cat：11058021，Gibco）中靜置5分鐘後，二者混勻並於室溫靜置15分鐘，然後將前述加入到HEK293細胞中。置於37°C，5% CO2 的震盪培養箱中以130 rpm之轉速震盪培養歷時48小時，293/hPD-1細胞用於FACS檢測。
PD-1介導的h317內吞：以Mix-n-Stain™ CF™ 488A（Cat：MX488AS100，Sigma）標記h317（Lot：DP201805002，江蘇泰康生物醫藥有限公司）及Nivolumab（Lot：AAW4553，BMS）；用5%的BSA將標記好的抗體稀釋至10 μg/mL，以PBS清洗293/hPD-1細胞1次，加入稀釋好的h317-CF488A或Nivolumab-CF488A，一組放置於37°C電熱恆溫培養箱，一組放置於4°C冰箱作為陰性對照；培養1小時後，以PBS清洗3次，仍繼續放置於原來的溫度37°C或4°C進行培養；放置3小時及6小時後，各用螢光顯微鏡觀察一次並拍照。
透過螢光顯微鏡觀察PD-1介導的h317內吞，實驗結果（見圖12）顯示，h317及Nivolumab在37°C條件下都能夠被PD-1介導進行內吞。
實施例 12 ： 317識別表位研究
PD-1-h317-Fab複合物的製備：人PD-1胞外區結構域（序列號：NP_005009.2，21aa-167aa，Lot：20170626）重組蛋白分子量為16.4Kd，h317-Fab（Lot：20170626）分子量約為46.5KD，在20mM Tris與150mM NaCl溶液，根據二者的莫耳比進行計算，選擇以PD1：h317-Fab = 1：1.5的比例混合，冰上放置30分鐘，複合物形成以後，將複合物超濾濃縮至濃度為12 mg/mL，用於結晶分析。
PD-1-h317-Fab複合物結晶及晶體繞射資料的收集及結構解析：採用座滴法（Sessile Drop method），利用結晶篩選機器人完成，該裝置每孔消耗0.2微升之蛋白樣品，加樣結束後密封晶體板，放置恆溫室培養。晶體生長溫度為16°C及4°C，蛋白的濃度為8 mg/mL、12 mg/mL。篩選的試劑盒包括：HAMPTON公司：Crystalscreen（1-98）、Index（1-96）、PEGRX（1-96）、SaltRx（1-96）、Nartrix（1-96）、PEG/ion（1-96）；QIAGEN公司：Protein Complex Suite（1-96）；Emerald Biosystems公司：WIZARD I/II（1-96）、WIZARD III/IV（1-96）。15天內觀察晶體生長結果，對初篩晶型較好的晶體生長條件進行優化。優化後獲得之晶體，在繞射實驗前將晶體於添加10%乙二醇的結晶溶液中浸泡數秒，然後浸入液氮快速冷凍。晶體繞射實驗在上海同步輻射光源（SSRF）BL17U線站進行，使用的X射線波長為0.9792Å，晶體繞射溫度為100K，繞射資料使用ADSC公司Q315r探測器收集。繞射資料處理使用HKL2000軟體，確定晶體空間群為P2，晶體繞射解析度為2.90 Å。使用PHASER軟體透過分子置換法解析結構，所選用的分子置換模型為PD-1單獨蛋白結構（PDB ID 3RRQ）及PD-1 Fab（PDB ID 5WT9）結構。使用COOT軟體重新搭建模型，並用REFMAC5及PHENIX軟體進行結構精鍊。
去糖基化之人PD-1重組蛋白與h317的結合：在人PD-1抗原（NP_005009.2）結構中可以觀察到N49、N58、N116、N74位四個糖基化位元點，透過定點突變的方法，將糖基化位點突變為丙氨酸（A），裝入帶有EGFP的表現載體共構建5種人PD-1全長表現質體（WT、N49A、N58A、N116A、N74A），將質體分別與293fectin混合後共轉染入HEK293細胞中。細胞轉染2天後，取細胞，並收集細胞置於96孔板中，以1500 rpm之轉速離心2分鐘，移除上清液。加入200微升之PBS再懸浮，以1500 rpm之轉速離心2分鐘，移除上清液。加入200微升之以5% BSA稀釋的一抗（h317（Lot：2017.05.24）、Nivolumab（Lot：2017.04.26）），作用濃度為2 μg/ml，陰性對照不加一抗，室溫培養歷時1小時。以1500 rpm之轉速離心2分鐘，移除上清液。加入200微升之PBS再懸浮，以1500 rpm之轉速離心2分鐘，移除上清液。加入200微升之以5% BSA稀釋的羊抗人IgG(Fc)-Cy5（Cat：12136，Lot：017M4800V，Sigma），於4°C培養歷時1小時。以1500 rpm之轉速離心2分鐘，移除上清液。加入200微升之PBS再懸浮，以1500 rpm之轉速離心2分鐘，移除上清液。加入200微升之PBS再懸浮，以流式細胞儀（型號B49007AD，SNAW31211）進行檢測。
PD-1-h317-Fab複合物整體結構分析顯示，PD-1抗原（胞外區1-167aa）以單體形式存在，與PD-1抗體的h317-Fab片段形成一個1：1的複合物結構（圖13）。PD-1與抗體的結合部位主要是在其loop區，包括BC loop，C’D loop及FG loop區域（圖14）。相互作用方式包括氫鍵、鹽橋、凡得瓦力及疏水相互作用，其中參與相互作用的胺基酸及作用力參見表8。 表8. PD-1與Fab317相互作用的胺基酸
PD-1 重鏈 輕鏈 相互作用
區 殘基 區 殘基 區 殘基
BC loop T59 CDR2 Y57     氫鍵
S60 CDR2 Y57     凡得瓦力相互作用
E61 CDR1 D33 氫鍵（透過水）
CDR2 S52 氫鍵
CDR2 G53     氫鍵（透過水）
CDR2 G54     氫鍵
CDR2 G55     氫鍵
CDR2 S56     氫鍵
S62 CDR1 D33     氫鍵
V64 CDR3 S101     凡得瓦力相互作用
C’D loop F82 CDR1 S31     凡得瓦力相互作用
P83 CDR1 S31     凡得瓦力相互作用
CDR1 Y32     凡得瓦力相互作用
E84 CDR1 Y32     氫鍵
R86 N-ter V2 疏水相互作用
CDR1 F27 凡得瓦力相互作用
CDR1 Y32 凡得瓦力相互作用
CDR3 S98 氫鍵
CDR3 D100 鹽橋
CDR3 Y106     疏水相互作用
S87 CDR3 Y106     凡得瓦力相互作用
    CDR2 H55 凡得瓦力相互作用
    CDR2 T56 凡得瓦力相互作用
Q88     CDR2 T56 凡得瓦力相互作用
FG loop I126 CDR3 S101     凡得瓦力相互作用
CDR2 W50 疏水相互作用
L128 CDR1 D33 凡得瓦力相互作用
CDR3 D100 凡得瓦力相互作用
CDR3 S101 凡得瓦力相互作用
    CDR3 Y91 疏水相互作用
    CDR3 Y94 凡得瓦力相互作用
    CDR3 W96 凡得瓦力相互作用
 A129 CDR2 Y59     疏水相互作用
    CDR3 Y94 疏水相互作用
 P130 CDR2 Y59     疏水相互作用
    CDR3 R93 凡得瓦力相互作用
    CDR3 Y94 疏水相互作用
 K131     CDR1 E30 鹽橋
      CDR3 S92 凡得瓦力相互作用
      CDR3 R93 氫鍵
 A132     CDR1 E30 凡得瓦力相互作用
    CDR1 V32 疏水相互作用
    CDR3 Y91 凡得瓦力相互作用
    CDR3 S92 氫鍵
 I134     CDR2 W50 疏水相互作用
此外，在PD-1抗原結構中可以觀察到N49、N58、N116位點的糖基化，N74的糖基化位點不明確，其中N58位的糖鏈參與與h317-Fab的結合（圖15）。其他已報導的PD-1抗原抗體複合物結構中該位元點的糖鏈沒有參與二者相互作用，因此h317-Fab與N58糖鏈的相互作用有可能提高二者識別及結合的特異性。將PD-1上的糖基化位點突變，並瞬轉至293細胞，透過FACS檢測h317與PD-1-mut分子的結合情況；FACS結果顯示，人PD-1的N58糖鏈參與h317與PD-1的結合，N58突變為A失去糖基化使h317失去與PD-1表現細胞結合（圖16），PD-1的N58糖鏈參與h317與PD-1的結合。透過比較PD-1-h317-Fab複合物結構與PD-1/PD-L1的複合物結構發現，h317-Fab及PD-L1在與PD-1相互作用介面上存在很大面積的重疊（圖17A），大部分重疊部位在PD-1的FG loop（圖17B），顯示h317-Fab結合PD-1與PD-L1具有競爭性，能夠阻斷PD-1與PD-L1之間的相互作用。
實施例 13 ： h317輕、重鏈CDR區定向突變
1. 根據PD-1-h317Fab晶體複合物結構解析，構建h317輕、重鏈CDR區突變體，表現載體的構建採用質體定點突變的方法進行，具體可參照王榮浩，陳瑞川，劉潤忠之文獻（快速點突變的優化方法。廈門大學學報，自然科學版，2008, Vol 47, sup 2, 282-285）。突變體抗體表現及純化方法同上。
2. 突變體相對親和力之比較
突變體與親本抗體親和力之比較係採用Fortebio公司的Octet QKe system儀器完成。具體方法同實施例4，不同之處在於所有突變體親和力僅測定單線以評估相對親和力。首先塗覆相同目標值的待測抗體，並以100 nM的人PD-1重組蛋白（序列號：NP_005009.2，21aa-167aa）為流動相進行相對親和力測定。
對突變體抗體親和力之測定結果顯示，多個位點突變後抗體的親和力發生較大改變，突變位元點資訊如表9，部分親和力變化如表10所示。 表9. h317突變體CDR區的胺基酸序列
LCDR1 LCDR2 LCDR3
X1ASQDVX2TX3VA X1ASTRX2X3 QQX1X2X3X4PX5
X1= K或R X2= E或S X3= A或V或Y X1= A或G或W X2= A或H或Q X3= S或T X1= A或F或Y X2= D或N或S X3= R或N或S X4= F或Y X5= G或W或Y
HCDR1 HCDR2 HCDR3
X1X2X3MS TIX1X2X3X4X5X6TX7YPDSVKG PX1X2SGVAX3
X1= D或S X2= A或N或Y X3= D或S或Y X1= K或S或W X2= G或S或Y X3= D或G或S X4= G或S X5= G或S X6= T或Y X7= A或T或Y X1= D或E或Y X2= A或S X3= T或Y
表10. h317 CDR區突變體親和力變化情況統計表（除所示突變位點外，可變區其餘胺基酸與h317相同）
LCDR1: KASQDVETVVA HCDR1: SYDMS
MUT KD(M) MUT KD(M)
K24R 1.02E-09 S31D 5.12E-09
E30S 1.42E-08 Y32A 6.83E-09
V32A 6.21E-09 Y32N 1.81E-08
V32Y 9.81E-09 D33S 2.89E-09
LCDR2: WASTRHT D33Y 2.36E-07
MUT KD(M) HCDR2: TISGGGSYTYYPDSVKG
W50A 1.23E-08 MUT KD(M)
W50G 6.14E-08 S52K 2.72E-08
H55A 1.72E-07 S52W 3.94E-08
H55Q 1.42E-08 G53S 5.53E-09
T56S 3.02E-09 G53Y 1.03E-08
LCDR3: QQYSRYPW G54D 2.93E-08
MUT KD(M) G54S 1.32E-09
Y91A 5.12E-08 G55S 9.09E-09
Y91F 4.76E-08 S56G 1.48E-07
S92D 7.52E-09 Y57T 6.12E-08
S92N 3.49E-09 Y59A 3.29E-09
R93N 3.64E-08 Y59T 1.89E-08
R93S 7.94E-09 HCDR3: PDSSGVAY
Y94F 6.81E-09 MUT KD(M)
W96G 1.53E-08 D100E 7.44E-08
W96Y 4.12E-07 D100Y 8.23E-09
LCDR 聯合突變 S101A 1.63E-08
MUT KD(M) Y106T 2.94E-07
24R(CDR1) 56S(CDR2) 3.23E-09 HCDR 聯合突變
24R(CDR1) 92N(CDR3) 4.17E-09 MUT KD(M)
24R(CDR1) 94F(CDR3) 5.32E-09 33S(CDR1) 54S(CDR2) 3.12E-09
56S(CDR2) 92N(CDR3) 3.98E-09 33S(CDR1) 59A(CDR2) 3.96E-09
24R(CDR1) 56S(CDR2) 92N(CDR3) 2.91E-09 54S(CDR2) 59A(CDR2) 2.68E-09
LCDR+HCDR 聯合突變
MUT KD(M) MUT KD(M)
L-： 24R(CDR1) 56S(CDR2) 92N(CDR3)； H-： 33S(CDR1) 54S(CDR2) 3.38E-09 L-： 24R(CDR1) 56S(CDR2) 92N(CDR3)； H-： 54S(CDR2) 59A(CDR2) 2.88E-09
從表中資料看出，個別位置的胺基酸突變後，對親和力會產生較大影響，有些位點親和力降低10倍以上。同時，有些位點突變後抗體的親和力有所提升，例如輕鏈第24位K突變為R、第56位T突變成S、第92位S突變為N後，重鏈第33位D突變為S、第54位G突變成S、第59位Y突變為A後，均可使抗體親和力得到一定提高，且這些突變位點可以進一步疊加突變，其親和力保持不變或進一步提高。HCDR3對結合至關重要，突變後大多親和力下降。
以上對本發明具體實施方式的描述並不限制本發明，本領域中具通常知識者可以根據本發明作出各種改變或修飾，只要不脫離本發明的精神，均應屬於本發明之申請專利範圍。
以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中：
圖1係顯示ELISA檢測陽性雜交瘤上清液與人PD-1胞外區結構域重組蛋白的結合情況，其中1A、1B、1C分別顯示出第一輪、第二輪、第三輪的結果。
圖2係顯示ELISA檢測陽性雜交瘤殖株上清液與不同種屬重組PD-1之間的交叉反應情況，其中Nivo為納武單抗。
圖3係顯示殖株317的抗體亞型鑒定，其中顯示重鏈為IgG1，輕鏈為Kappa鏈。
圖4係顯示317嵌合抗體（4A）及Nivolumab（4B）對人PD-1胞外區結構域重組蛋白的親和力分析結果。
圖5係顯示h317抗體（5A）及Nivolumab（5B）對人PD-1胞外區結構域重組蛋白的親和力分析結果。
圖6係顯示ELISA測定h317抗體及Nivolumab競爭抑制PD-1與PD-L1（6A）、PD-1與PD-L2（6B）的結合情況。
圖7係顯示h317與不同種屬重組PD-1的結合分析曲線。
圖8係顯示h317與CD28家族成員的結合分析曲線。
圖9係顯示h317刺激混合型淋巴球反應（mixed lymphocyte reaction，MLR）生成IL-2（9A）及IFN-γ（9B）的檢測結果。
圖10係顯示h317介導人周邊血液單核球細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）對293T/hPD-1細胞ADCC效應的結果。
圖11係顯示h317抑制PD-1轉殖基因鼠皮下移植瘤增長的腫瘤體積統計結果。
圖12係顯示PD-1介導的h317內吞（endocytosis）情況。
圖13係顯示PD-1-h317-Fab複合物整體結構。
圖14係顯示PD-1-h317-Fab複合物分子間相互作用，其中A為PD-1與h317-Fab的結合部位，B為BC loop與h317-Fab相互作用，C為C’D loop與h317-Fab相互作用，D為FG loop與h317-Fab相互作用。
圖15係顯示PD-1 N58的糖鏈與h317-Fab的相互作用。
圖16係顯示h317與人PD-1-mut重組蛋白結合情況，其中每次實驗各抗體與WT的抗原呈現細胞（antigen presenting cell，APC）作為標準，取值為1，計算本次實驗其他各組的APC，三次平行實驗的結果。
圖17係顯示h317-Fab與PD-L1競爭性結合PD-1，其中A為PD-1-h317-Fab複合物與PD-1-PD-L1結構比較，灰色為PD-1，磚紅色為PD-L1，藍色及綠色為h317-Fab的重鏈及輕鏈；B為作用表面比較，灰色為PD-1分子表面，綠色為317-Fab作用部分，磚紅色為PD-L1作用部分，黃色為317-Fab及PD-L1都作用的部分。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036

Claims (24)

  1. 一種結合程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）的抗體或其片段，該抗體或其片段係包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中該輕鏈可變區及重鏈可變區係分別包含以下序列所示之輕鏈互補決定區1（light chain complementarity determining region 1，LCDR1）、輕鏈互補決定區2（LCDR2）、輕鏈互補決定區3（LCDR3）及重鏈互補決定區1（heavy chain complementarity determining region 1，HCDR1）、重鏈互補決定區2（HCDR2）、重鏈互補決定區3（HCDR3）： LCDR1 LCDR2 LCDR3 X1ASQDVX2TX3VA （SEQ ID NO:1） X1ASTRX2X3 （SEQ ID NO:2） QQX1X2X3X4PX5 （SEQ ID NO:3） X1= K或R； X2= E或S； X3= A，V或Y X1= A，G或W； X2= A，H或Q； X3= S或T X1= A，F或Y； X2= D，N或S； X3= R，N或S； X4= F或Y； X5= G，W或Y HCDR1 HCDR2 HCDR3 X1X2X3MS （SEQ ID NO:4） TIX1X2X3X4X5X6TX7YPDSVKG （SEQ ID NO:5） PX1X2SGVAX3 （SEQ ID NO:6） X1= D或S； X2= A，N或Y； X3= D，S或Y X1= K，S或W； X2= G，S或Y； X3= D，G或S； X4= G或S； X5= G或S； X6= T或Y； X7= A，T或Y X1= D，E或Y； X2= A或S； X3= T或Y
    。
  2. 如請求項1所述的抗體或其片段，其中該輕鏈可變區及重鏈可變區係分別包含以下序列所示之LCDR1、LCDR2、LCDR3及HCDR1、HCDR2、HCDR3： LCDR1 LCDR2 LCDR3 X1ASQDVX2TX3VA （SEQ ID NO:1） X1ASTRX2X3 （SEQ ID NO:2） QQX1X2X3X4PX5 （SEQ ID NO:3） X1= K或R； X2= E； X3= A，V或Y X1= W； X2= H； X3= S或T X1= Y； X2= D，N或S； X3= R或S； X4= F或Y； X5= W HCDR1 HCDR2 HCDR3 X1X2X3MS （SEQ ID NO:4） TIX1X2X3X4X5X6TX7YPDSVKG （SEQ ID NO:5） PX1X2SGVAX3 （SEQ ID NO:6） X1= D或S； X2= A或Y； X3= D或S X1= S； X2= G或S； X3= D，G或S； X4= G或S； X5= S； X6= Y； X7= A或Y X1= D或Y； X2= S； X3= Y
    。
  3. 如請求項1所述的抗體或其片段，其中該輕鏈可變區及重鏈可變區係分別包含以下序列所示之LCDR1、LCDR2、LCDR3及HCDR1、HCDR2、HCDR3： 選自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11的LCDR1； 選自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17的LCDR2； 選自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27的LCDR3；及 選自SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32及SEQ ID NO:33的HCDR1； 選自SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:46的HCDR2； 選自SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51的HCDR3。
  4. 如請求項1所述的抗體或其片段，其中該輕鏈可變區係包含以下序列組合所示之LCDR1、LCDR2、LCDR3： 組合 LCDR1 LCDR2 LCDR3 1 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 2 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 3 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 4 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 5 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 6 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:18 7 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:18 8 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:18 9 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:18 10 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18 11 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:19 12 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:20 13 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:21 14 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:22 15 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:23 16 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:24 17 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:25 18 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:26 19 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:27 20 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18 21 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:22 22 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:25 23 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:22 24 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:22
    及，該重鏈可變區係包含以下序列組合所示之HCDR1、HCDR2、HCDR3： 組合 HCDR1 HCDR2 HCDR3 1 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 2 SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 3 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 4 SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 5 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 6 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 7 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:47 8 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:47 9 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:47 10 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:47 11 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:47 12 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:47 13 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:47 14 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:47 15 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:47 16 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:47 17 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:47 18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:48 19 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:49 20 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:50 21 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:51 22 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:47 23 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:47 24 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:47 25 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:47 26 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:47
  5. 如請求項1所述的抗體或其片段，其中該輕鏈可變區及重鏈可變區係包含以下序列組合所示之LCDR1、LCDR2、LCDR3及HCDR1、HCDR2、HCDR3： 組合 LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3 1 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 2 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 3 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 4 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 5 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 6 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 7 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 8 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 9 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 10 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 11 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 12 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 13 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 14 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 15 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 16 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 17 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 18 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 19 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 20 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 21 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 22 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 23 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 24 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 25 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 26 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 27 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 28 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 29 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:47 30 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:47 31 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:47 32 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:47 33 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:47 34 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:47 35 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:47 36 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:47 37 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:47 38 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:47 39 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:47 40 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:47 41 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:48 42 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:49 43 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:50 44 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:51 45 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:47 46 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:47 47 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:47 48 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:47 49 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:47
  6. 如請求項1至5中任一項所述的抗體或其片段，其中該抗體或其片段係具有以下活性中的一或多個： (1) 阻斷PD-1與其配體PD-L1或PD-L2的結合； (2) 特異性結合靈長類動物PD-1，與非靈長類動物PD-1無交叉反應； (3) 不結合除PD-1之外的其他CD28家族成員； (4) 在CD4+ T細胞中誘導IL-2產生； (5) 在CD4+ T細胞中誘導IFN-γ產生； (6) 無抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）效應功能。
  7. 如請求項6所述的抗體或其片段，其中該抗體或其片段係結合人PD-1 N58糖鏈。
  8. 如請求項1至5中任一項所述的抗體或其片段，其中該抗體或其片段的重鏈可變區係包含SEQ ID NO:47所示胺基酸序列。
  9. 如請求項1至5中任一項所述的抗體或其片段，其中該輕鏈可變區係包含SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:60所示之胺基酸序列或者與該胺基酸序列具有至少75%同一性之胺基酸序列；及 該重鏈可變區係包含SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:62所示之胺基酸序列或者與該胺基酸序列具有至少75%同一性之胺基酸序列。
  10. 如請求項1至5中任一項所述的抗體或其片段，其中該輕鏈可變區係包含SEQ ID NO:60所示之胺基酸序列或該胺基酸序列的變體，根據SEQ ID NO:60所示之胺基酸序列的殘基編號，該變體相對於SEQ ID NO:60係具有選自以下的一至三個胺基酸置換：K24R、E30S、V32A、V32Y、W50A、W50G、H55A、H55Q、T56S、Y91A、Y91F、S92D、S92N、R93N、R93S、Y94F、W96G及W96Y。
  11. 如請求項10所述的抗體或其片段，其中該變體相對於SEQ ID NO:60係具有選自以下的一至三個胺基酸置換：K24R、V32A、V32Y、T56S、S92D、S92N、R93S及Y94F。
  12. 如請求項1至5中任一項所述的抗體或其片段，其中該重鏈可變區係包含SEQ ID NO:62所示之胺基酸序列或該胺基酸序列的變體，根據SEQ ID NO:62所示之胺基酸序列的殘基編號，該變體相對於SEQ ID NO:62係具有選自以下的一至三個胺基酸置換：S31D、Y32A、Y32N、D33S、D33Y、S52K、S52W、G53S、G53Y、G54D、G54S、G55S、S56G、Y57T、Y59A、Y59T、D100E、D100Y、S101A及Y106T。
  13. 如請求項12所述的抗體或其片段，其中該變體相對於SEQ ID NO:62係具有選自以下的一至三個胺基酸置換：S31D、Y32A、D33S、G53S、G54S、G55S、Y59A及D100Y。
  14. 如請求項1至5中任一項所述的抗體或其片段，其中該抗體為單株抗體、單鏈抗體、雙功能抗體、單域抗體、奈米抗體、完全或部分人源化的抗體或者嵌合抗體； 該片段為抗體的scFv、BsFv、dsFv、(dsFv)2 、Fab、Fab'、F(ab')2 或Fv片段。
  15. 如請求項14所述的抗體或其片段，其中該抗體的重鏈恆定區為IgG1或IgG4亞型，輕鏈恆定區為κ型。
  16. 如請求項15所述的抗體或其片段，其中該抗體的輕鏈恆定區包含SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:64所示之胺基酸序列或者與該胺基酸序列具有至少75%同一性之胺基酸序列；及 該重鏈恆定區係包含SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:66所示之胺基酸序列或者與該胺基酸序列具有至少75%同一性之胺基酸序列。
  17. 一種綴合物或融合蛋白，其係包含請求項1至16中任一項所述的抗體或其片段。
  18. 一種核酸分子，其編碼請求項1至16中任一項所述之抗體或其片段中的重鏈CDR、輕鏈CDR、重鏈可變區、輕鏈可變區、重鏈或輕鏈。
  19. 一種載體，其係包含請求項18所述的核酸分子。
  20. 一種宿主細胞，其係包含請求項18所述的核酸分子或請求項19所述的載體，或者被請求項18所述的核酸分子或請求項19所述的載體轉化或轉染。
  21. 一種藥物組合物，其係包含請求項1至16中任一項所述的抗體或其片段、請求項17所述的綴合物或融合蛋白、請求項18所述的核酸分子、請求項19所述的載體或請求項20所述的宿主細胞，以及任意之藥學上可接受的輔料。
  22. 一種使用請求項1至16中任一項所述的抗體或其片段、請求項17所述的綴合物或融合蛋白、請求項118所述的核酸分子、請求項19所述的載體、請求項20所述的宿主細胞或請求項21所述的藥物組合物在製備用於預防或治療腫瘤或癌症的藥物中的用途。
  23. 一種藥物組合，其包括： (1) 請求項1至16中任一項所述的抗體或其片段、請求項17所述的綴合物或融合蛋白、請求項18所述的核酸分子、請求項19所述的載體、請求項20所述的宿主細胞或請求項21所述的藥物組合物； (2) 其他免疫增強藥物或手段； 該其他免疫增強藥物或手段係包括選自小分子化藥、靶向藥、抗體等重組蛋白藥，疫苗、抗體藥物複合體（antibody-drug conjugate，ADC）、溶瘤病毒、基因與核酸治療藥物及放射療法。
  24. 一種試劑盒，其係包括請求項1至16中任一項所述的抗體或其片段、請求項17所述的綴合物或融合蛋白、請求項18所述的核酸分子、請求項19所述的載體、請求項20所述的宿主細胞或請求項21所述的藥物組合物。
TW109100705A 2019-01-10 2020-01-09 重組抗人程序性細胞死亡蛋白1抗體及其應用 TW202043271A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910022548.9A CN111423510B (zh) 2019-01-10 2019-01-10 重组抗人pd-1抗体及其应用
CN201910022548.9 2019-01-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202043271A true TW202043271A (zh) 2020-12-01

Family

ID=71521975

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW109100705A TW202043271A (zh) 2019-01-10 2020-01-09 重組抗人程序性細胞死亡蛋白1抗體及其應用

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230104769A1 (zh)
EP (1) EP3919514A4 (zh)
JP (1) JP2022517216A (zh)
KR (1) KR20210113635A (zh)
CN (1) CN111423510B (zh)
CA (1) CA3126302A1 (zh)
TW (1) TW202043271A (zh)
WO (1) WO2020143749A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113929781A (zh) * 2020-07-14 2022-01-14 迈威(上海)生物科技股份有限公司 抗pd-1抗体及其稳定制剂

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1537878E (pt) 2002-07-03 2010-11-18 Ono Pharmaceutical Co Composições de imunopotenciação
RU2406760C3 (ru) 2005-05-09 2017-11-28 Оно Фармасьютикал Ко., Лтд. Моноклональные антитела человека к белку программируемой смерти 1 (pd-1) и способы лечения рака с использованием анти-pd-1-антител самостоятельно или в комбинации с другими иммунотерапевтическими средствами
SI2170959T1 (sl) 2007-06-18 2014-04-30 Merck Sharp & Dohme B.V. Protitelesa proti receptorjem pd-1 za humano programirano smrt
CA2736829C (en) 2008-09-12 2018-02-27 Isis Innovation Limited Pd-1 specific antibodies and uses thereof
RU2625034C2 (ru) 2011-04-20 2017-07-11 МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи Антитела и другие молекулы, которые связывают в7-н1 и pd-1
CN104250302B (zh) 2013-06-26 2017-11-14 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd‑1抗体及其应用
CA3080200A1 (en) 2013-09-13 2015-03-19 Beigene Switzerland Gmbh Anti-pd1 antibodies and their use as therapeutics and diagnostics
CA2932966C (en) 2013-12-12 2022-03-22 Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. Pd-1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical use thereof
CA2955788C (en) * 2014-07-22 2024-01-16 Ziyong Sun Anti-pd-1 antibodies
CN105330740B (zh) 2014-07-30 2018-08-17 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 抗pd-1抗体及其应用
PE20231958A1 (es) * 2015-07-30 2023-12-06 Macrogenics Inc Moleculas de union a pd-1 y metodos de uso de las mismas
WO2017024465A1 (en) 2015-08-10 2017-02-16 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Pd-1 antibodies
KR20180083318A (ko) * 2015-09-29 2018-07-20 아시아 바이오테크 피티이. 엘티디. Pd-1 항체 및 그의 용도
CN106632674B (zh) * 2015-10-30 2018-11-16 泽达生物医药有限公司 一种抗pd-1单克隆抗体、其药物组合物及其用途
CN106699889A (zh) * 2015-11-18 2017-05-24 礼进生物医药科技（上海）有限公司 抗pd-1抗体及其治疗用途
CN109152798B (zh) * 2015-12-02 2022-10-21 斯特库比股份有限公司 特异于糖基化的pd-1的抗体及其使用方法
CN108079292A (zh) * 2016-11-23 2018-05-29 苏州盛迪亚生物医药有限公司 一种抗pd-1抗体在制备治疗肝癌的药物中的用途
CN107446048B (zh) * 2017-09-13 2021-03-30 北京韩美药品有限公司 一种能够特异性地结合pd-1的抗体及其功能片段
CN108218988B (zh) * 2017-11-29 2019-10-11 广西医科大学 抗PD-1的纳米抗体PD-1/Nb52及其制备方法与应用
CN108727504B (zh) * 2018-04-16 2021-08-27 泉州向日葵生物科技有限公司 一种ifn与抗pd-l1抗体的融合蛋白及其应用
EP3983433A4 (en) * 2019-06-14 2023-08-09 Cugene Inc. NOVEL INTERLEUKIN-2 VARIANTS FOR CANCER TREATMENT
CA3164337A1 (en) * 2019-12-13 2021-06-17 Cugene Inc. Novel interleukin-15 (il-15) fusion proteins and uses thereof
EP4072593A4 (en) * 2019-12-13 2024-01-03 Cugene Inc BIOACTIVABLE CYTOKINE DRUGS AND ASSOCIATED METHODS OF USES

Also Published As

Publication number Publication date
CN111423510A (zh) 2020-07-17
US20230104769A1 (en) 2023-04-06
JP2022517216A (ja) 2022-03-07
WO2020143749A1 (zh) 2020-07-16
EP3919514A4 (en) 2022-12-07
KR20210113635A (ko) 2021-09-16
EP3919514A1 (en) 2021-12-08
CN111423510B (zh) 2024-02-06
CA3126302A1 (en) 2020-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11161904B2 (en) Anti-PD-1 antibody and use thereof
US20210024635A1 (en) Anti-wt1/hla-specific antibodies
JP7369688B2 (ja) 抗ｃｄ１３７分子及びその使用
TWI652345B (zh) 與４-１ｂｂ結合之分子類
JP5068270B2 (ja) 癌を処置するためのｉｌ−１７アンタゴニスト抗体
WO2020228806A1 (zh) 针对密蛋白18a2的抗体及其应用
TW201632555A (zh) 對ｃｄ７３具專一性之結合分子及其用途
US11359021B2 (en) PD-L1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof
MX2012011234A (es) Anticuerpos contra csf-1r.
JP2022523710A (ja) Ｃｄ４４に特異的な抗体
KR20230051163A (ko) Tigit 및 cd112r 차단
JP2022514693A (ja) Ｍｕｃ１８に特異的な抗体
JP2023546508A (ja) 抗ｔｉｇｉｔ抗体、その医薬組成物及び用途
TW202043271A (zh) 重組抗人程序性細胞死亡蛋白1抗體及其應用
JP2022514786A (ja) Ｍｕｃ１８に特異的な抗体
WO2022100613A1 (zh) 针对密蛋白18a2和cd3的双特异性抗体及其应用
CN115715297A (zh) 抗flt3抗体和组合物
WO2022012428A1 (zh) 抗pd-1抗体及其稳定制剂
US20230064703A1 (en) Anti-gitr antibodies and uses thereof
WO2023138579A1 (zh) 抗b7-h7抗体或其抗原结合片段及制备方法和应用
WO2023001303A1 (zh) 药物组合物及用途
JP2018505144A (ja) 抗ｃｘｃｌ１２抗体分子およびその使用
TW202302630A (zh) 新穎多特異性抗體
WO2020176605A1 (en) Antibodies to neoantigens and uses thereof
NZ793343A (en) Anti- LAG-3 antibodies and compositions