KR20210113635A - 재조합 항인간 pd-1 항체 및 이의 적용 - Google Patents

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진차오 장
롱주안 왕
샤샤 지아오
슈앙 왕
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맵웰 (상하이) 바이오사이언스 컴퍼니, 리미티드
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Abstract

본 발명은 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1)과 결합하는 항체 또는 이의 단편 및 종양 또는 암의 예방 또는 치료 방법에서의 항체 또는 이의 단편의 용도를 제공한다. 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 PD-1/PD-L1 및 PD-1/PD-L2의 상호작용을 효과적으로 차단할 수 있고, 고유한 항원 결합 에피토프 및 효능 및 안전성과 관련하여 고유한 특성을 갖는다.

Description

재조합 항인간 PD-1 항체 및 이의 적용
본 출원은 2019년 1월 10일에 출원된 중국 특허 출원 제 201910022548.9호의 우선권을 주장하며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 발명은 항체 기반 약물 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인간 PD-1에 대한 항체 및 약제 제조를 위한 항체의 용도에 관한 것이다.
프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(Programmed cell death protein 1) 또는 PD-1 (CD279로도 알려짐)은 T 세포 수용체의 CD28 계열의 구성원이며 T 세포, B 세포, 단핵구 등과 같은 다양한 면역 세포의 표면에 발현된다. PD-1은 종양 미세환경 내에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 기능을 억제하는 중요한 면역 체크포인트 분자(immune checkpoint molecule)이다. PD-L1 (B7-H1) 및 PD-L2 (B7-DC)를 포함하는 PD-1의 주요 리간드는 면역 세포에 의해 발현되며 또한 다양한 문제에 대해서 유도될 수 있다. T 세포는 PD-L1 또는 PD-L2가 PD-1에 결합할 때 억제 신호를 수신하고 T 세포의 증식 및 T 세포에 의한 사이토카인 생성을 억제하여 T 세포가 관여하는 면역 반응을 효과적으로 감소시킨다. 또한 많은 인간 종양 세포는 종양 세포에서 PD-L1 및 PD-L2의 높은 발현 수준으로 인해 T 세포 면역 감시를 피할 수 있다 (문헌[Pardoll DM. blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer12 (4), 252-264 (2012)]).
현재 전 세계적으로 승인된 3개의 항-인간 PD-1 단일클론 항체(monoclonal antibody)가 있다. 첫 번째는 PD-1과 PD-L1 및 PD-L2의 결합을 억제하는 활성을 나타내는 인간 PD-1에 대한 완전한 인간 항체인 니볼루맙 (Nivolumab)으로 진행성 흑색종, 비소세포 폐암, 신장 세포 암종, 호지킨 림프종 (Hodgkin's lymphoma), 두경부 편평 세포 암종, 요로상피 암종, 결장직장 암종 및 간세포 암종의 치료에 임상적으로 사용되고; 두 번째는 PD-1과 PD-L1 및 PD-L2의 결합을 억제하는 활성을 나타내는 인간 PD-1에 대한 인간화된 항체인 펨브롤리주맙 (Pembrolizumab)으로 악성 흑색종, 비소세포폐암, 통상적인 호지킨 림프종, 두경부 편평 세포 암종, d-mmr 돌연변이가 있는 악성 종양 또는 MSI-H 악성 종양 치료에 임상적으로 사용된다 (문헌[Alsaab et al. PD-1 and PD-L1 Checkpoint Signaling Inhibition for Cancer Immunotherapy: Mechanism, Combinations, and Clinical Outcome. Front. Pharmacol. 8:561]). 세 번째는 PD-1에 결합하고 PD-1과 PD-L1 및 PD-L2의 상호작용을 차단하여 PD-1 경로에 의해 매개되는 면역 반응 (항종양 면역 반응 포함)의 억제를 초래하는 항-인간 PD-1 단일클론 항체인 세미플리맙 (Cemiplimab) (Libtayo)이다. 세미플리맙은 전이성 피부 편평 세포 암종 (CSCC) 또는 국소 진행성 피부 편평 세포 암종 환자의 치료를 위해 임상적으로 사용된다 (문헌[Markham, A. & Duggan, S. Drugs. 2018. doi: 10.1007/s40265 -018-1012-5]). 중국에는 임상 단계에서 인간 PD-1에 대한 10개 초과의 단일클론 항체가 있으며, 적응증(indication)은 재발성 및 불응성 악성 림프종, 호지킨 림프종, B 세포 비호지킨 림프종, 폐포 연부 육종, 진행성 또는 재발성 악성 종양, 식도암, 위 암종 및 위식도 접합부 선암종, 비인두암종, 두경부 편평세포암종, 폐암, 전이성 결장직장암종, 국소신세포암종, 요로상피암종, 간세포암종, 흑색종, 진행성 삼중음성 유방암, 흉막 중피종, 진행성 신경내분비 종양, 또는 d-mmr 돌연변이를 갖거나 절제 불가능한 고형 종양 또는 MSI-H 고형 종양을 포함한다. 단일클론항체 중 Hengrui Medicine이 개발한 SHR-1210, Beigene이 개발한 티슬레리주맙 (tislelizumab), Innovent Biologics가 개발한 IBI-308이 시판 출시를 위해 신청되었으며; Junshi Biosciences가 개발한 테리플로리주맙 (Teriprolizumab) 주사인 JS001 (상표명: Tuoyi)은 2018년 12월 17일에 조건부 판매 승인을 받았다.
국제적으로 항-PD-1 항체의 3개의 시판 제품이 있고 다수의 제품이 임상 연구 중이다. 관련된 특허 또는 특허 출원에는 WO2004004771, WO2006121168, WO2008156712, WO2010029435, WO2012145493, WO2015085847, US20170044260, CN104250302, CN105330740, CN105531288 등이 포함된다. 이러한 특허 또는 특허 출원을 분석한 결과 항PD-1 항체는 하이브리도마 스크리닝, 및 인간화, 또는 파지 디스플레이 또는 효모 표면 디스플레이 기술, 또는 형질전환 마우스 기술을 통해 획득될 수 있음이 밝혀졌다. WO2015085847에 개시된 항-인간 PD-1 항체를 획득하는 방법에는 하이브리도마 기술을 사용하여 뮤린 항체를 생성하는 단계; 항체 활성 분석 (ELISA (결합 및 차단), 친화도/동역학)을 통해 뮤린 항체 후보를 획득하는 단계; 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 불변 영역 서열의 상류에 뮤린 항체 후보의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열을 클로닝하여 획득한 서열을 포유류 세포에서 발현시켜 키메라 항체를 제조하는 단계; 그 다음 항체 활성 분석, PD-1과 그 리간드의 결합의 차단 분석, CD28 계열의 다른 구성원과 항-PD-1 항체의 결합 분석, 세포 표면에서 PD-1과 항-PD-1 항체의 결합 분석 및 시험관내 세포 결합 분석을 통해 리드 항체를 결정하는 단계; Germline 데이터베이스에서 인간화된 주형을 선택하고 항체 서열의 인간화 설계를 수행하는 단계; 항체 활성 분석, PD-1과 그 리간드의 결합 차단 분석, CD28 계열의 다른 구성원과 항-PD-1 항체의 결합 분석, 세포 표면 상의 PD-1과 항-PD-1 항체의 결합 분석, 및 획득된 인간화된 항체에 대한 시험관내 세포 결합 분석을 다시 수행하는 단계; 시험관내 또는 생체내에서 종양 세포 성장 억제 실험을 통해 인간화된 항체의 약물 가능성을 평가하고 최종적으로 변하지 않은 친화도 및 특이성을 갖는 인간화된 항-PD-1 항체를 획득하는 단계가 있다.
항체의 항원 에피토프가 인식하는 것은 항체의 중요한 특성 중 하나이다. 항PD-1 항체는 PD-1이 그 리간드 PD-L1/PD-L2에 결합하는 것을 차단하여 T 세포를 활성화시키는 역할을 한다. 보고된 모든 항체가 PD-1과 그 리간드 사이의 상호작용을 차단할 수 있지만, 이들이 표적화하는 에피토프는 정확히 동일하지 않다 (문헌[Tan S, Zhang H, Chai Y, et al. An unexpected N-terminal loop in PD-1 dominates binding by nivolumab. Nat Commun. 2017;8:14369]). 사실, 상이한 에피토프는 약제학적 효과 및 안전성에서 고유한 특성을 갖는 항체를 초래할 수 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 하이브리도마 스크리닝 및 인간화를 통해 인간 PD-1에 높은 친화도로 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 획득하는 것이다. 본 발명의 항체는 PD-1/PD-L1 또는 PD-1/PD-L2의 상호작용을 효과적으로 차단할 수 있을 뿐만 아니라, 고유한 항원 결합 에피토프를 가지므로 약제학적 효과 및 안전성에서 고유한 특성을 갖는다.
상기 기술적 과제와 관련하여, 본 발명의 하나의 목적은 인간 PD-1에 특이적인 항체 또는 이의 기능적 단편 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명이 제공하는 기술적 해결방안은 다음과 같다.
일 양상에서, 본 발명은 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1)에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편으로서, 항체 또는 이의 단편은 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 각각 다음 서열에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR1 (LCDR1), CDR2 (LCDR2), CDR3 (LCDR3)을 포함하고/하거나, 중쇄 가변 영역은 중쇄 CDR1 (HCDR1), CDR2 (HCDR2) 및 CDR3 (HCDR3)을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다:
Figure pct00001
본 발명에 제공되는 항체 또는 이의 단편에서, 바람직하게는, 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역은 각각 다음 서열에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2, LCDR3 및/또는 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함한다:
Figure pct00002
본 발명에 제공되는 항체 또는 이의 단편에서, 바람직하게는, 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역은 각각 다음 서열에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2, LCDR3 및/또는 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함한다:
서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 LCDR1;
서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 LCDR2;
서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 및 서열번호 27로 이루어진 군으로부터 선택되는 LCDR3; 및/또는
서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32 및 서열번호 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCDR1;
서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45 및 서열번호 46으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCDR2;
서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 및 서열번호 51로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCDR3.
본 발명에 제공되는 항체 또는 이의 단편에서, 바람직하게는, 경쇄 가변 영역은 다음과 같은 서열 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 LCDR1, LCDR2, LCDR3을 포함하고/하거나:
Figure pct00003
중쇄 가변 영역은 다음과 같은 서열 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함한다:
Figure pct00004
바람직하게는, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은 다음과 같은 서열 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 LCDR1, LCDR2, LCDR3 및 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함한다:
Figure pct00005
Figure pct00006
본 발명에 제공되는 항체 또는 이의 단편은:
(1) PD-1과 이의 리간드 PD-L1 또는 PD-L2의 결합의 차단;
(2) 영장류 PD-1과의 특이적 결합 및 비영장류 PD-1과의 교차 반응성(cross-reactivity)의 부재;
(3) PD-1 이외의 CD28 계열 구성원과의 결합의 부재의 표시;
(4) CD4+ T 세포에서 IL-2 및/또는 IFN-γ의 생성의 유도; 및
(5) ADCC-효과기 기능(ADCC-effector function)의 부재
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 갖는다.
바람직하게는, 항체 또는 이의 단편은 인간 PD-1의 N58에서 탄수화물 사슬에 결합하고; 바람직하게는, 항체 또는 이의 단편의 중쇄 가변 영역은 서열번호 47에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 경쇄 가변 영역은 서열번호 52 또는 서열번호 60에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 서열번호 52 또는 서열번호 60에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나; 중쇄 가변 영역은 서열번호 54 또는 서열번호 62에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 서열번호 54 또는 서열번호 62에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 용어 "적어도 75% 서열 동일성"은 75% 이상의 임의의 동일성 퍼센트, 예를 들어 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 추가로 더욱 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 심지어 99% 동일성을 지칭한다.
본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 본 발명에 제공되는 항체 또는 이의 단편에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 52에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 54에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나; 경쇄 가변 영역은 서열번호 60에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 62에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 제공되는 항체 또는 이의 단편에서, 바람직하게는, 경쇄 가변 영역은 서열번호 60에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고; 서열번호 60에 제시된 바와 같은 서열의 아미노산 잔기의 번호매김(numbering) 및 조성을 기준으로 하여, 변이체는 서열번호 60과 비교하여 K24R, E30S, V32A, V32Y, W50A, W50G, H55A, H55Q, T56S, Y91A, Y91F, S92D, S92N, R93N, R93S, Y94F, W96G 및 W96Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의, 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산 치환(들)을 갖고; 바람직하게는, 변이체는 서열번호 60과 비교하여 K24R, V32A, V32Y, T56S, S92D, S92N, R93S 및 Y94F로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의, 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산 치환(들)을 갖고/거나; 중쇄 가변 영역은 서열번호 62에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고; 서열번호 62에 제시된 바와 같은 서열의 아미노산 잔기의 번호매김 및 조성을 기준으로 하여, 변이체는 서열번호 62와 비교하여 S31D, Y32A, Y32N, D33S, D33Y, S52K, S52W, G53S, G53Y, G54D, G54S, G55S, S56G, Y57T, Y59A, Y59T, D100E, D100Y, S101A 및 Y106T로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의, 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산 치환(들)을 갖고; 바람직하게는, 변이체는 서열번호 62와 비교하여 S31D, Y32A, D33S, G53S, G54S, G55S, Y59A 및 D100Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의, 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산 치환(들)을 갖는다.
본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 본 발명은 변이체 항체 또는 이의 단편의 중쇄 가변 영역은 서열번호 62에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; 서열번호 60에 제시된 바와 같은 서열의 아미노산 잔기의 번호매김 및 조성을 기준으로 하여, 변이체 항체 또는 이의 단편의 경쇄 가변 영역은 단지 다음 아미노산 치환(들): 1) K24R; 2) E30S; 3) V32A; 4) V32Y; 5) W50A; 6) W50G; 7) H55A; 8) H55Q; 9) T56S; 10) Y91A; 11) Y91F; 12) S92D; 13) S92N; 14) R93N; 15) R93S; 16) Y94F; 17) W96G; 18) W96Y; 19) K24R 및 T56S; 20) K24R 및 S92N; 21) K24R 및 Y94F; 22) T56S 및 S92N; 또는 23) K24R, T56S 및 S92N을 포함하는 변이체 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 본 발명은 변이체 항체 또는 이의 단편의 경쇄 가변 영역은 서열번호 60에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; 서열번호 62에 제시된 바와 같은 서열의 아미노산 잔기의 번호매김 및 조성을 기준으로 하여, 변이체 항체 또는 이의 단편의 중쇄 가변 영역은 단지 다음 아미노산 치환(들): 1) S31D; 2) Y32A; 3) Y32N; 4) D33S; 5) D33Y; 6) S52K; 7) S52W; 8) G53S; 9) G53Y; 10) G54D; 11) G54S; 12) G55S; 13) S56G; 14) Y57T; 15) Y59A; 16) Y59T; 18) D100E; 19) D100Y; 20) S101A; 21) Y106T; 22) D33S 및 G54S; 23) D33S 및 Y59A; 또는 24) G54S 및 Y59A를 포함하는 변이체 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 본 발명은 서열번호 60에 제시된 바와 같은 서열의 아미노산 잔기의 번호매김 및 조성을 기준으로 하여, 변이체 항체 또는 이의 단편의 경쇄 가변 영역은 단지 아미노산 치환(들) K24R, T56S 및 S92N을 포함하고, 서열번호 62에 제시된 바와 같은 서열의 아미노산 잔기의 번호매김 및 조성을 기준으로 하여, 변이체 항체 또는 이의 단편의 중쇄 가변 영역은 단지 아미노산 치환(들) D33S 및 G54S, 또는 아미노산 치환(들) G54S 및 Y59A를 포함하는 변이체 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명에 제공되는 항체는 단일클론 항체, 단일 사슬 항체, 이중기능성 항체(bifunctional antibody), 단일 도메인 항체, 나노바디(nanobody), 완전 또는 일부 인간화된 항체 또는 키메라 항체(chimeric antibody) 등 중 임의의 것일 수 있고; 바람직하게는, 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM 항체이고, 더욱 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 항체이다.
본 발명에 제공되는 단편은 PD-1에 결합할 수 있는 항체의 임의의 단편 또는 이의 임의의 일부분이고; 바람직하게는, 단편은 항체의 단편 scFv, BsFv, dsFv, (dsFv)2, Fab, Fab', F (ab')2 또는 Fv이다.
바람직하게는, 본 발명에 제공되는 항체의 중쇄 불변 영역은 IgG1 또는 IgG4 하위유형(subtype)이고 경쇄 불변 영역은 κ 유형이다.
더욱 바람직하게는, 항체의 경쇄 불변 영역은 서열번호 56 또는 서열번호 64에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 서열번호 56 또는 서열번호 64에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나; 항체의 중쇄 불변 영역은 서열번호 58 또는 서열번호 66에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 서열번호 58 또는 서열번호 66에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 용어 "적어도 75% 서열 동일성"은 75% 이상의 임의의 동일성 퍼센트, 예를 들어 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 추가로 더욱 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 심지어 99% 동일성을 지칭한다.
본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 본 발명에 제공되는 항체에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 52에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 불변 영역은 서열번호 56에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 54에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 불변 영역은 서열번호 58에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; 대안적으로, 경쇄 가변 영역은 서열번호 60에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 불변 영역은 서열번호 62에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 64에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 불변 영역은 서열번호 66에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 제공되는 항체 또는 이의 단편을 기반으로 하여, 본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 접합체(conjugate) 또는 융합 단백질을 제공한다. 접합체 또는 융합 단백질은 물리적으로 또는 화학적으로 본 발명의 항체 또는 이의 단편과 결합된 추가의 모이어티를 포함할 수 있으며, 상기 추가의 모이어티는 예를 들어 세포 표면 수용체, 소분자 화합물, 예컨대 아미노산 및 탄수화물, 소분자 중합체 또는 본 발명의 항체를 변형시키는 임의의 다른 모이어티, 또는 심지어 활성 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 예를 들어, 접합체 또는 융합 단백질은 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 이중특이성 항체일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 항체 또는 이의 단편의 중쇄 CDR, 경쇄 CDR, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
바람직하게는, 핵산 분자는 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 59, 서열번호 61, 서열번호 63, 서열번호 65 또는 서열번호 67에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
추가의 또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터(vector)를 제공한다. 벡터는 진핵생물 발현 벡터, 원핵생물 발현 벡터, 인공 염색체 및 파지 벡터 등일 수 있다.
본 발명의 벡터 또는 핵산 분자는 항체 등을 보존 또는 발현시키기 위해 숙주 세포(host cell)를 형질전환 또는 형질감염시키기 위해 사용될 수 있거나, 임의의 수단에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
따라서, 또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하거나, 본 발명의 핵산 분자 및/또는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 박테리아 또는 곤충, 진균, 식물 또는 동물 세포와 같은 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다.
본 발명의 개시내용에 따르면, 본 발명에 제공하는 항체 또는 이의 단편, 및 해당 접합체 또는 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터 및/또는 숙주 세포는 당 업계에 공지된 통상적인 기술 수단을 통해 획득될 수 있다. 항체 또는 이의 단편, 접합체 또는 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터 및/또는 숙주 세포는 실용적인 필요에 따라 다양한 목적을 위해 약제학적 조성물, 또는 특히 약제학적 제제에 포함될 수 있다.
따라서, 또 다른 양상에서, 본 발명은 또한 본 발명에 제공되는 항체 또는 이의 단편, 접합체 또는 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터 및/또는 숙주 세포, 및 선택적으로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
인간 PD-1 또는 이의 임의의 일부분에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 기반으로 하여, 본 발명은 또한 상기 언급된 물질의 관련 적용을 제공한다.
구체적으로, 추가의 또 다른 양상에서, 본 발명은 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 항체 또는 이의 단편, 접합체 또는 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 및/또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 종양 또는 암은 비-소세포성 폐암, 통상적 호지킨 림프종, 위암종, (원발성) 간암, 흑색종, d-mmr 돌연변이를 갖는 악성 종양 또는 MSI-H 악성 종양, 자궁경부암, 두경부 편평 세포 암종, 방광암, 원발성 종격동 B 세포 림프종, 신세포 암종, 결장직장암 및 요로상피암종으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 더욱 바람직하게는, 종양 또는 암은 비-소세포 폐암, 흑색종, 결장직장암, 간암, 두경부 편평 세포 암종, 통상적 호지킨 림프종 또는 요로상피 암종이다.
또한 또 다른 양상에서, 본 발명은
(1) 본 발명에 제공되는 항체 또는 이의 단편, 접합체 또는 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 및/또는 약제학적 조성물; (2) 다른 면역강화제(immunopotentiator) 또는 면역강화 수단, 예컨대 소분자 화학물질 약물, 표적화된 제제, 재조합 단백질 약물, 예컨대 항체 등, 백신, ADC, 종양용해성 바이러스, 유전자 및 핵산 요법용 약물, 및 방사선요법
을 포함하는 약제학적 조합을 제공한다.
추가로, 본 발명은 종양 또는 암의 예방 또는 치료 방법으로서, 항체 또는 이의 단편, 접합체 또는 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 및/또는 약제학적 조성물, 및 선택적으로 다른 약물 또는 수단을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 종양 또는 암은 비-소세포성 폐암, 통상적 호지킨 림프종, 위암종, (원발성) 간암, 흑색종, d-mmr 돌연변이를 갖는 악성 종양 또는 MSI-H 악성 종양, 자궁경부암, 두경부 편평 세포 암종, 방광암, 원발성 종격동 B 세포 림프종, 신세포 암종, 결장직장암 및 요로상피암종으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 더욱 바람직하게는, 종양 또는 암은 비-소세포 폐암, 흑색종, 결장직장암, 간암, 두경부 편평 세포 암종, 통상적 호지킨 림프종 또는 요로상피 암종이다. "임의의 다른 약물 또는 수단"이라는 용어는 소분자 화학물질 약물, 표적화된 제제, 재조합 단백질 약물, 예컨대 항체 등, 백신, ADC, 종양용해성 바이러스, 유전자 및 핵산 요법용 약물, 및 방사선요법과 같이 본 발명의 항체 또는 이의 단편, 접합체 또는 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 및/또는 약제학적 조성물과 조합하여 투여될 수 있는 다른 면역강화제 또는 면역강화 수단을 지칭한다. 둘의 조합 투여는 임의의 순서로 수행될 수 있으며, 예를 들어 이들은 동시에, 연속적으로 또는 특정 시간 간격으로 투여될 수 있다. 대상체는 포유류, 바람직하게는 인간이다.
또한 또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명에 제공되는 항체 또는 이의 단편, 접합체 또는 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 및/또는 약제학적 조성물을 포함하는 키트(kit)를 제공한다.
본 발명에서는 마우스를 재조합 인간 PD-1 세포외 도메인 단백질 (NCBI 수탁번호: NP_005009.2, 21aa-167aa)에 의해 면역화시킨 후, 마우스의 비장 세포를 채취하여 하이브리도마 기술에 의한 스크리닝을 통해 항체를 획득하였다. 획득된 항체 (본 발명에서는 "317"로 명명)는 세포 표면의 재조합 인간 PD-1 세포외 도메인 단백질 및 인간 PD-1 모두에 대해 높은 결합 친화도를 가지며, 또한 수용체와 리간드 PD-1/PD-L1, 및 PD-1/PD-L2 사이의 결합을 특이적으로 차단할 수 있다. 또한, 인간화 기술을 통해 친화도과 특이성이 변하지 않은 인간화된 항체 (본 발명에서는 "h317"로 명명)를 획득하였고, 이후 결합, 차단, T 세포 활성화 촉진 및 생체내 항종양 효능에 대한 분석으로 IgG4의 전체 항체의 활성에 대해 종합적으로 평가하였다. 또한, 획득된 항체의 Fab와 PD-1-ECD의 결정 복합체를 작제하고(constructing), 결정 회절을 통해 항체의 항원 결합 에피토프를 확인하고, 추가 변이체로 확인하였다.
실험에 의해 본 발명에 제공되는 항체가 PD-1 및 PD-L1/PD-L2 사이의 결합을 효과적으로 차단할 수 있고, 항원 결합에 대해 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 (Keytruda)과 경쟁할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 항원-항체 복합체의 결정 구조 분석 결과에 따르면, 본 발명에 제공되는 항체의 항원 결합 에피토프는 니볼루맙 또는 Keytruda와 상이함을 알 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 항체는 PD-1의 58번 위치에서 Glu의 N-글리코실화 부위와 관련된 항원 에피토프를 인식하는 것으로 확인된 최초의 항체이다.
구체적으로, 본 발명은 종래 기술과 비교하여 다음과 같은 이점을 갖는다:
먼저, 본 발명의 항체는 친화도가 높은 항PD1 인간화된 항체이다.
본 발명의 인간화된 항PD-1 항체인 h317은 6.16E-09M의 친화도 (KD)로 인간 PD-1 단백질에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났으나, 대조군 항체 니볼루맙의 친화도 (KD)는 8.06E-09M이었다. 또한, 동일한 조건에서 h317의 해리 상수 (kd (1/s) 9.50E-04)가 니볼루맙의 해리 상수 (kd (1/s): 1.69E-03)보다 더 낮으며, 이는 h317이 PD-1/PD-L1 신호전달 경로에 대한 h317의 억제 효과에 대한 기반을 제공하는 인간 PD-1에 대해 높은 친화도를 가짐을 시사한다.
둘째, 본 발명의 항체는 우수한 생체 활성을 나타낸다.
실험 결과, 본 발명의 h317은 재조합 인간 PD-1과 이의 리간드 PD-L1 및 PD-L2 사이의 결합을 효과적으로 차단할 수 있음을 보여주었고, 둘 모두에 대한 IC50 값은 1.4 nM이었으며, 대조군 항체 니볼루맙의 차단 활성 (IC50: 1.3 nM)과 유사하였다. 또한, 시험관내 실험에서 입증된 바와 같이, h317은 인간 혼합 림프구에 의한 킬러 사이토카인 IL-2 및 IFN-γ의 분비를 촉진할 수 있으며, 즉 h317은 Th1 유형 세포에 의해 매개되는 면역 반응을 유도할 수 있다.
셋째, 본 발명의 항체는 특수한 항원 에피토프를 인식한다.
본 발명의 항체는 인간 PD-1에 특이적으로 결합하고, 이것이 결합하는 항원 에피토프는 고유하다.
PD-1-h317-Fab 복합체의 전체 구조 분석 결과 PD-1 항원 (세포외 영역 1-167aa)이 단량체로 존재하며 1:1 비율로 항-PD-1 항체의 h317-Fab 단편과 복합체를 형성하는 것으로 나타났다. 항체가 결합하는 PD-1 부위는 BC 루프, C' D 루프 및 FG 루프를 포함하는 PD-1 루프에 주로 위치하였다. 또한 PD-1 항원의 구조에서 N49, N58, N116 부위의 글리코실화를 관찰할 수 있으며, N74 부위의 글리코실화는 명확하지 않았다. 또한, h317-Fab에 대한 결합에서 N58의 탄수화물 사슬의 관여 또한 관찰할 수 있었다. 이와 달리, PD-1 항원과 이의 항체 사이에 형성된 임의의 다른 보고된 복합체의 구조에서 이 부위의 탄수화물 사슬은 PD-1 항원과 항체 사이의 상호작용에 관여하지 않는다. PD-1 상의 4개의 글리코실화 부위는 결정 복합체에 의해 제공된 정보에 따라 부위 지정 돌연변이에 의해 각각 알라닌 (A)으로 돌연변이시키고, 획득된 돌연변이된(mutating) PD-1 (PD-1-mut)을 운반하는 플라스미드를 293개 세포로 일시적으로 형질감염시키고, h317과 PD-1-mut 사이의 결합을 FACS에 의해 검출하였다. 그 결과 PD-1의 N58 위치에 있는 아미노산이 A로 돌연변이되면 해당 위치가 글리코실화되지 않아 h317이 PD-1에 대한 결합 능력을 상실하게 되는 것으로 나타났다. 이와 관련하여 h317은 N58 탄수화물 사슬과 관련된 항원 에피토프를 인식하는 것으로 확인된 최초의 항체이다.
넷째, 본 발명의 항체는 PD-1 형질전환 마우스 이종이식 종양 모델에서 명백한 항종양 효과를 갖는다.
PD-1 형질전환 마우스 이종이식 종양 모델에서, h317은 고 투여량 (10 mg/kg) 및 중간 투여량 (2 mg/kg)에서 PD-1 형질전환 마우스에서 피하 이종이식 종양의 성장을 유의하게 억제하는 것으로 나타났으며, 대조군 항체 니볼루맙과 유사한 종양에 대한 억제 효과가 h317에서 고 투여량 및 중간 투여량에서 관찰되었다.
본 발명의 실시형태는 첨부된 도면과 함께 이하에서 상세히 기재되며,
도 1은 ELISA에 의해 검출된 재조합 인간 PD-1 세포외 도메인 단백질에 대한 양성 하이브리도마의 상청액의 결합을 보여주는 도 1a 내지 도 1c를 포함하며, 도 1a, 도 1b 및 도 1c는 각각 1차, 2차 및 3차 스크리닝의 결과를 나타낸다.
도 2는 ELISA에 의해 검출된 상이한 종으로부터의 재조합 PD-1과 양성 하이브리도마의 상청액의 교차 반응성을 나타내며, Nivo는 니볼루맙을 나타낸다.
도 3은 클론 317의 항체 하위유형 확인을 나타내며, 결과는 중쇄가 IgG1 하위유형이고 경쇄가 카파(Kappa) 사슬임을 나타낸다.
도 4는 재조합 인간 PD-1 세포외 도메인 단백질에 대한 키메라 항체 317 (도 4a) 및 니볼루맙 (도 4b)의 친화도가 검출된 친화도 분석의 결과를 나타낸다.
도 5는 재조합 인간 PD-1 세포외 도메인 단백질에 대한 h317 (도 5a) 및 니볼루맙 (도 5b)의 친화도를 검출한 친화도 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 ELISA에 의해 검출된 PD-1과 PD-L1의 결합 (도 6a) 및 PD-1과 PD-L2의 결합 (도 6b)을 억제하기 위한 니볼루맙과 h317의 경쟁을 보여준다.
도 7은 상이한 종으로부터의 재조합 PD-1과 h317의 결합을 분석하기 위한 곡선을 나타낸다.
도 8은 CD28 계열의 구성원과 h317의 결합을 분석하기 위한 곡선을 나타낸다.
도 9는 MLR에서 h317에 의해 자극된 IL-2 (도 9a) 및 IFN-γ (도 9b) 생성의 검출 결과를 나타낸다.
도 10은 h317에 의해 매개되는 293T/hPD-1 세포에 대한 인간 PBMC의 ADCC 효과의 결과를 나타낸다.
도 11은 h317에 의해 성장이 억제된 PD-1 형질전환 마우스에서 피하 이식된 종양 부피의 통계적 결과를 나타낸다.
도 12는 PD-1에 의해 매개되는 h317의 세포내 이입을 나타낸다.
도 13은 PD-1-h317-Fab 복합체의 전체 구조를 나타낸다.
도 14는 PD-1-h317-Fab 복합체를 형성하는 분자들 사이의 상호작용을 보여주는 패널 AD를 포함하고, 패널 A는 PD-1과 h317-Fab의 결합 영역을 보여주고, 패널 B는 BC 루프와 h317-Fab 사이의 상호작용을 보여주고, 패널 C는 C' D 루프와 h317-Fab 사이의 상호작용을 보여주고, 패널 D는 FG 루프와 h317-Fab 사이의 상호작용을 보여준다.
도 15는 PD-1의 N58에서 탄수화물 사슬과 h317-Fab 사이의 상호작용을 보여준다.
도 16은 재조합 인간 PD-1-mut 단백질에 대한 h317의 결합을 보여준다.
도 17은 h317-Fab이 PD-1에 결합하기 위해 PD-L1과 경쟁한다는 것을 보여주는 패널 A 및 B를 포함하고, 패널 A는 PD-1-h317-Fab 복합체와 PD-1-PD-L1 간의 구조 비교를 보여주고, PD-1은 회색으로 표시되고 PD-L1은 적갈색으로 표시되며 h317-Fab의 중쇄 및 경쇄는 각각 청색 및 녹색으로 표시되고; 패널 B는 상호작용 표면의 비교를 보여주고, PD-1의 표면은 회색으로 표시되고, 녹색으로 표시된 부분은 317-Fab과 상호작용하는 부분이고, 적갈색으로 표시된 부분은 PD-L1과 상호작용하는 부분이고, 황색으로 표시된 부분은 317-Fab 및 PD-L1 모두와 상호작용하는 부분이다.
본 발명은 이하의 특정 실시형태와 조합하여 더욱 상세하게 설명될 것이다. 제공된 실시형태는 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하는 것이 아니라 단지 본 발명을 예시하기 위해 사용된다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
하기 실시예의 실험 방법은 특별히 언급하지 않는 한 모두 통상적인 방법이다. 하기 실시예에 사용된 원료 및 시약은 특별한 언급이 없는 한 모두 시판되는 제품이다.
실시예 1: 항-인간 PD-1 항체를 생성하는 하이브리도마 세포 균주의 스크리닝 및 확인 및 항체 서열 분석
면역화: 각각 Freund 애주번트(adjuvant) 및 수용성 애주번트를 사용하는 두 가지 면역화 방법을 마우스의 면역화에 사용하였다. Freund 애주번트를 이용한 면역화 방법은 0일 및 14일에 2회 Freund 애주번트를 복강내 주사하여 마우스를 면역화하였고, 수용성 애주번트를 이용한 면역화 방법은 8 내지 10주령 Balb/c 마우스를 0일과 21일에 수용성 애주번트를 2회 근육내 주사하여 면역화하였다. 면역화에 사용된 항원은 재조합 인간 PD-1/mFc 단백질 (NCBI 수탁번호: NP_005009.2, 21aa-167aa, Lot: 2016.3.16)이었고, 이는 HEK293 세포에서 재조합적으로 발현되는 것이며, Beijing Kohnoor Science & Technology Co., Ltd.에서 제공하였다. 1차 면역화를 위한 투여량은 50 μg이었고, 2차 면역화를 위한 투여량은 25 μg이었다. 면역화 전에 채취한 마우스의 혈청을 시험을 위한 음성 대조군으로 사용하였다. Freund 애주번트 1차 면역화 후 28일째와 수용성 애주번트 1차 면역화 후 35일째 마우스의 꼬리 정맥으로부터 혈액 샘플을 채혈한 후, 재조합 인간 PD-1 단백질로 코팅된 96-웰 플레이트(plate)를 이용하여 ELISA로 혈청 역가를 측정하였다. 혈청 역가가 융합 요건을 충족하는 마우스에 D-PBS로 희석된 25 μg 항원 500 μl를 복강내 주사하여 부스팅(boosting)하였다. 추가 세포 융합을 위해 1차 면역화 후 38일째에 혈청 역가가 높은 마우스의 비장 세포를 수집하였다.
세포 융합 및 하이브리도마의 제조: 1차 면역화 후 38일째에 혈청 역가가 융합 요건을 충족하는 마우스의 안구를 적출하여 혈액을 채취하고, 단리된 혈청을 항체 검출에 대한 양성 대조군 혈청으로 사용하였다. 또한, 마우스의 비장을 무균 상태에서 채취하여 B 림프구 현탁액을 제조하여 FO 골수종 세포와 5:1의 비율로 혼합하고 PEG4000의 작용하에 두 종류의 세포를 융합시켰다. 융합된 세포를 HAT 배지에 재현탁시키고 대식세포를 함유하는 96-웰 플레이트에 분취하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터에 2주 동안 배치한 후, 그 안의 HAT 배지를 HT 배지로 교체하고 세포를 2주 더 배양한 후 HT 배지를 R1640 완전 배지로 교체하였다.
양성 하이브리도마 스크리닝: 융합 10 내지 14일 후, 플레이트를 4℃에서 밤새 재조합 인간 PD-1/His 단백질 (NCBI 수탁번호: NP_005009.2, 21aa-167aa, Lot: 2016.2.22) (10 μg/ml, pH 9.6, 0.1 M NaHCO3)로 코팅하였다. 플레이트를 4% 탈지분유-PBS로 37℃에서 2시간 동안 차단하고, PBST (0.05% Tween 20-PBS)로 3회 세척하였다. 이후, 배양된 하이브리도마 클론의 상청액을 플레이트에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다음 대조군을 설정하였다: (1) 양성 대조군: 면역화 후 분리된 마우스의 혈청 (1:1000의 희석으로 PBS에 의해 희석함); (2) 음성 대조군: 면역화 전에 분리된 마우스의 혈청 (1:1000 희석으로 PBS에 의해 희석함); (3) 블랭크 대조군: PBS. 다시 PBST (0.05% Tween 20-PBS)로 플레이트를 3회 세척하고 1:20000으로 희석한 HRP-염소 항마우스 IgG (Fcγ)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다시 PBST (0.05% Tween 20-PBS)로 플레이트를 5회 세척하고 암소에서 10 내지 15분간 발색(developing color)을 위해 발색시약 OPD를 가한 후 2M H2SO4를 가하여 반응을 종결시켰다. 490 nm (A490)에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기로 판독하였다. A490이 음성 대조군 웰보다 2.1배 더 많은 웰의 클론을 양성으로 고려하였다. 양성 클론의 신뢰도를 결정하기 위해 이전 스크리닝에서 사용한 배지를 교체한 후 격일로 다른 스크리닝을 수행하여 총 3회의 스크리닝을 수행하였다. 검출 및 확인 후, 항체를 분비하는 다수의 양성 세포 균주를 획득하고 클론: 6, 317, 500, 763, 795, 및 904로 지정하였다 (도 1).
플레이트에 재조합 인간 PD-1/His 단백질 (NCBI 수탁번호: NP_005009.2, 21aa-167aa, Lot: 2016.2.22), 사이노몰구스 (cynomolgus) 원숭이 PD-1 (Cat: 90311-C08H, Sino Biological Inc.), 랫트 PD-1 (Cat: 80448-R08H, Sino Biological Inc.) 및 마우스 PD-1 (Cat: 50124-M08H, Sino Biological Inc.)을 4℃에서 밤새 1 μg/mL 농도로 코팅하고, 그 후 PBS로 3회 세척하고, 5% BSA-PBS를 첨가하여 37℃에서 60분 동안 차단하였다. 이후 PBST로 플레이트를 3회 세척하고 100배로 희석한 하이브리도마 상청액을 첨가하고 37℃에서 60분간 인큐베이션하였다. 다시, 플레이트를 PBST, HRP-염소 항-마우스 IgG (Fcγ) (Cat: 115-035-071, Jackson Immuno Research)로 1:5000으로 희석하여 4회 세척하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 다시 한 번 PBST로 플레이트를 4회 세척하고 TMB 기질을 첨가하여 37℃에서 10분간 인큐베이션하여 발색시킨 후 2M HCl을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 630 nm를 기준 파장으로 하여 플레이트 내의 각 웰의 450 nm (A450nm-630nm)에서의 흡광도를 읽고 기록하였다. 하이브리도마 세포의 5개 상청액 (클론 317, 500, 763, 795 및 904에 해당)을 다른 종의 재조합 PD-1과의 교차 반응성 검출에 사용하였다. ELISA로부터 획득된 결과는 5개의 상청액 내의 모든 항체가 재조합 인간 PD-1 및 사이노몰구스 원숭이 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있었지만 재조합 랫트 PD-1 및 마우스 PD-1에는 결합하지 않았음을 보여주었으며, 이는 항체가 교차 반응성이 없음을 나타낸다 (도 2). 다음 서열 확인을 위해 클론 317을 선택하였다.
항인간 PD-1 항체를 분비하는 클론 317의 하이브리도마 세포를 확장하고, 마우스 단일클론 항체 IgG 하위종류 시험 카드 (Cat: A12403) 및 마우스 단일클론 항체 경쇄/중쇄 시험 카드 (Cat: A12401)를 사용하여 시약 프로토콜을 따라 항체의 하위유형을 검출하였다. 하위유형은 다음과 같이 확인되었다: 항체는 중쇄의 경우 IgG1이고 경쇄의 경우 카파였다 (도 3). 결과는 항체 317의 유전자 클로닝에 대한 기반을 제공한다.
지침서에 기재된 단계에 따라 TRIzol (Cat: 15596026, Invitrogen)을 사용하여 클론 317의 하이브리도마 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. 하이브리도마 세포의 전체 RNA를 M-MuLV 역전사효소 (CAT: M0253S, NEB)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 항체의 경쇄 가변 영역 IgVL (κ) 및 중쇄 가변 영역 VH의 서열을 축퇴 프라이머 (표 1 및 표 2 참조) 및 Phusion 키트 (Cat: E0553L, NEB)를 사용하여 증폭시켰다. PCR 산물을 겔 추출 키트 (Cat: AP-GX-250, Axygen)로 정제하고, 정제된 PCR 산물을 T 벡터 클로닝 키트 (Cat: ZC205, ZOMANBIO)의 지침에 따라 T 벡터에 결찰시킨 다음 벡터 증폭을 위해 E. 콜라이 (E. coli)의 기능성 세포로 형질전환시켰다. 그 다음, DNA 시퀀싱을 위해 플라스미드를 추출하여 단일클론 항체의 가변 영역 서열을 획득하였다. 시퀀싱 결과 항체 317의 경쇄 가변 영역은 서열번호 53에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것으로 나타났고, DNA 서열로부터 추론된 항체 317의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 52에 제시되고; 항체 317의 중쇄 가변 영역은 서열번호 55에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 갖고, DNA 서열로부터 추론된 항체 317의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 54에 제시된다.
[표 1]
Figure pct00007
[표 2]
Figure pct00008
실시예 2: 항-인간 PD-1 키메라 항체의 제조
하기 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 도입된 제한효소의 절단 부위(표 3)에 의한 클로닝을 통해 획득된 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역 유전자 및 중쇄 가변 영역 유전자를 진핵생물 발현 벡터에 보유된 인간-카파 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 유전자의 상류 및 인간 IgG4 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 유전자의 상류에 각각 클로닝하였다. 획득된 인간-마우스 키메라 경쇄 발현 플라스미드 (pKN019-317L) 및 인간-마우스 키메라 중쇄 발현 플라스미드 (pKN034-317H)를 증폭을 위해 E. 콜라이에 형질전환시켰다. 인간-마우스 키메라 경쇄 및 중쇄를 보유하는 다수의 플라스미드를 단리하고 293fectin과 혼합하고 HEK293 세포에 공동 형질감염시켰다. 형질도입 5 내지 6일 후 배양 상청액을 수집하여 ProA 친화도 크로마토그래피 컬럼으로 정제하여 키메라 항체 317을 획득하였다. 항체의 친화도를 Fortebio (BLITZ pro1.1.0.28)를 사용한 항-인간 항체 포획 분석에 의해 결정하였다. 결정을 위해 항-인간 IgG Fc 포획 (AHC) 바이오센서를 PBS에 10분 동안 담가두었다. 4 μl의 희석된 항체 샘플 (키메라 항체 317, 니볼루맙; 20 μg/mL)을 각각 2개의 AHC 바이오센서에 로딩한 다음 PBS에서 30초 동안 평형화시켰다. 이어서, AHC 바이오센서를 다양한 농도 (1 μM, 0.6 μM 및 0 nM)의 희석된 재조합 인간 PD-1-His 단백질 (NCBI 수탁번호: NP_005009.2, 21aa-167aa, Lot: 2016.2.22)과 반응시켜 45초 동안 결합시킨 다음 PBS로 옮겨 120초 동안 해리시켰다. 실험 종료 후, 소프트웨어에 의해 1:1 Langmuir 결합 모델을 사용하여 블랭크 대조군의 반응 값을 뺀 데이터를 적용한 후 항원-항체 결합에 대한 동역학 상수를 계산하였다.
도 4는 재조합 인간 PD-1과 결합하는 키메라 항체 317 (도 4, 4a) 및 대조군 항체 니볼루맙 (도 4, 4b)의 동역학 곡선을 보여준다. 곡선을 적용하여 친화도를 계산한 결과 키메라 항체 317의 친화도 (KD)는 1.02E-09M이고 니볼루맙의 친화도 (KD)는 1.01E-09M인 것으로 나타났다. 동역학 매개변수에 대한 자세한 내용은 표 4를 참조한다. 결과는 키메라 항체 317이 인간 PD-1에 대해 높은 친화도를 가지며 동일한 조건에서 키메라 항체 317의 해리 상수가 니볼루맙의 해리 상수와 유사함을 보여주었다. 결과는 항체 317의 인간화 및 PD-1/PD-L1 신호전달 경로에 대한 317의 억제 효과에 대한 이론적 근거를 제공한다.
[표 3]
Figure pct00009
[표 4]
Figure pct00010
실시예 3: 항-인간 PD-1 단일클론 항체의 인간화 및 안정한 세포 균주의 작제
먼저, 항체에서 항원과 결합하는 항원 상보성 결정 영역 (CDR)을 결정하기 위한 마우스 항체의 중쇄 서열 및 항체의 보존된 3차원 입체형태를 지지하는 프레임워크 영역에 대해 포괄적인 분석을 수행하였다. 가장 가까운 인간 항체 매칭을 상동성 비교 결과에 따라 인간 항체 생식세포 라이브러리 (http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/alignments2.php#VHEX)에서 확인하였다. 최종적으로 VH3 (3-21)을 기본 주형으로 선택하고, 완전한 서열의 확인 결과와 조합하여 재배열된 항체에서 FR 영역 (A49)의 특정 위치의 아미노산의 빈도를 고려하여 CDR 이식을 수행하였다. 또한, 마우스 항체의 FR3의 S98은 CDR3 영역에 가깝기 때문에 대체하지 않았다. 한편, JH4 (wgqgtlvtvss)를 CDR3 (Pdssgvay)의 서열에 따라 J 영역에 대한 서열로 선택하였다. 그 결과 H1에서 프레임 영역의 높은 인간화를 달성하였다. 또한, 상동성 비교 결과에 따라 인간 항체 생식세포 라이브러리 (http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/alignments2.php#VHEX)에서 가장 가까운 인간 항체 매칭을 확인하였다. 최종적으로 VK II (A19)를 기본 주형으로 선택하고, 완전한 서열의 확인 결과와 조합하여 재배열된 항체에서 FR 영역 (R45)의 특정 위치의 아미노산의 빈도를 고려하여 CDR 이식을 수행하였다. 한편, JK1 (fgqgtkveik)을 CDR3 (Qqysrypw)의 서열에 따라 JK 영역에 대한 서열로 선택하였다. 따라서 경쇄 프레임 영역의 높은 인간화를 달성하였다.
뮤린 유래 항체 317의 서열에 대해 완전한 인간화를 설계하고, 획득된 인간화 서열을 전체적으로 합성하고, 항체 317을 인간화하여 획득된 항체를 h317로 명명하였다. 또한, 효소분해를 통해 인간화 h317-VH1을 진핵생물 발현벡터 pKN034에 보유된 인간 IgG4의 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 유전자의 상류에 클로닝하고, 효소분해를 통해 인간화 h317-VL2를 진핵생물 발현 벡터 pKN019에 보유된 인간 경쇄의 Cκ를 인코딩하는 유전자의 상류에 클로닝하여 h317의 경쇄 및 중쇄를 발현하는 발현벡터를 작제하였다. 이어서, 효소 분해를 통해 획득된 h317의 중쇄 (h317-H) 및 h317의 경쇄 (h317-L)를 진핵생물 발현 벡터 pKN002에 클로닝하였다. 그런 다음 재조합 벡터를 Pvu I로 선형화하고, h317의 유전자를 Nucleofector 2B (300452, Lonza)를 사용하여 CHO 세포의 DNA에 혼입시켰다. CHO 세포를 MSX (Cat: M5379-500MG, Sigma)로 스크리닝하고 서브클로닝한 후 최종적으로 h317을 고도로 발현하는 안정한 세포 균주를 획득하였다. h317의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 61에 제시된 바와 같고, 아미노산 서열은 서열번호 60에 제시된 바와 같고; h317의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 63에 제시된 바와 같고, 아미노산 서열은 서열번호 62에 제시된 바와 같다.
실시예 4: 인간 PD-1 단백질에 대한 h317의 결합에 대한 동역학 연구
h317 및 니볼루맙의 비오틴화: 200 μL의 5 mg/ml EZ-LinkNHS-LC-LC-비오틴 (Cat: 21343, Thermo)을 실온에 5분 동안 배치한 다음 1 ml의 1 mg/mL의 h317 (Lot: DP201805002, Jiangsu T-mab BioPharma) 또는 니볼루맙 (Lot: AAW4553, BMS)과 혼합하였다. 획득된 혼합물을 실온에 30분 동안 배치한 다음, 한외여과에 의해 0.5 mL로 농축하였다. 280 nm에서 단백질 함량을 결정한 후 농축된 단백질을 분취하여 -80℃에 저장하고 냉동 및 해동은 1회 이하로 하였다.
결합 동역학의 결정: 스트렙타비딘으로 비오틴 표지된 항체를 포획하는 분석을 사용하여 Fortebio의 Octet QKe 시스템으로 항체의 친화도를 결정하였다. 구체적으로, 비오틴 표지 항체 (h317-비오틴, 니볼루맙-비오틴)를 PBS로 5 μg/mL로 희석한 후, 스트렙타비딘으로 사전 코팅된 바이오센서 (Cat: 1612101, PALL) 표면을 120초 동안 통과시켰다. 이동상인 재조합 인간 PD-1 단백질 (NCBI 수탁번호: NP_005009.2, 21aa-167aa)을 PBS에 연속적으로 희석하여 100 nM 내지 12.5 nM의 농도 범위를 포괄하는 2배 연속 희석액을 획득하였다. 결합 및 해리를 모두 300초 동안 수행하였다. 실험 종료 후, 소프트웨어에 의해 1:1 Langmuir 결합 모델을 이용하여 블랭크 대조군의 반응 값을 뺀 데이터를 적용한 후 항원-항체 결합에 대한 동역학 상수를 계산하였다.
도 5는 재조합 인간 PD-1 단백질과 결합하는 h317 (도 5, 5a) 및 대조군 항체 니볼루맙 (도 5, 5b)의 동역학 곡선을 보여준다. 곡선을 적용하여 친화도를 계산한 결과 h317의 친화도 (KD)는 6.16E-09M이고 니볼루맙의 친화도 (KD)는 8.06E-09M인 것으로 나타났다. 동역학 매개변수에 대한 자세한 내용은 표 5를 참조한다. 결과는 h317이 인간 PD-1에 대해 높은 친화도를 가지며 동일한 조건에서 h317의 해리 상수가 니볼루맙의 해리 상수보다 더 낮음을 보여주었다. 결과는 PD-1/PD-L1 신호전달 경로에 대한 h317의 억제 효과에 대한 근거를 제공한다.
[표 5]
Figure pct00011
실시예 5: ELISA에서 PD-1과 리간드 PD-L1 및 PD-L2의 결합에 대한 h317의 억제 효과 검출
ELISA에서 PD-1과 PD-L1의 결합에 대한 h317의 억제 효과 검출: 플레이트에 0.5 μg/mL의 희석 농도의 인간 PD-1-hFc (NCBI 수탁번호: NP_005009.2, 21aa-167aa, Lot: 20180329)를 4℃에서 밤새 코팅한 후, 37℃에서 60분 동안 항온 인큐베이터에서 5% BSA로 차단하였다. h317 (Lot: DP201805002, Jiangsu T-mab BioPharma) 또는 니볼루맙 (Lot: AAW4553, BMS) (초기 농도가 3 μg/mL인 1.5배 연속 희석액)을 연속적으로 첨가하여 37℃의 항온 인큐베이터에서 120분 동안 반응시켰다. 1 μg/mL PD-L1-mFc (NCBI 수탁번호: NP_054862.1, 19aa-238aa, Lot: 20180412)를 플레이트에 첨가하여 항체와 함께 37℃에서 60분 동안 항온 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 이후 1:5000으로 희석한 HRP-항-마우스 Fc (Cat: 115-035-071, Jackson Immuno Research)를 플레이트에 첨가하여 45분간 반응시켰다. 이후, TMB 기질 (Cat: ME142, Beijing Taitianhe Biotech Co., Ltd.)을 첨가하여 15분 동안 발색시킨 후 2 M HCl을 첨가하여 반응을 종결시킨 다음 플레이트를 마이크로플레이트 판독기로 검출하였다. 630 nm를 기준 파장으로 하여 플레이트 내의 각 웰의 450 nm (A450nm-630nm)에서의 흡광도를 읽고 기록하였다.
ELISA에서 PD-1과 PD-L2의 결합에 대한 h317의 억제 효과 검출: 플레이트에 0.5 μg/mL의 희석 농도의 인간 PD-1-hFc (NCBI 수탁번호: NP_005009.2, 21aa-167aa, Lot: 20180329)를 4℃에서 밤새 코팅한 후, 37℃에서 60분 동안 항온 인큐베이터에서 5% BSA로 차단하였다. h317 (Lot: DP201805002, Jiangsu T-mab BioPharma) 또는 니볼루맙 (Lot: AAW4553, BMS) (초기 농도가 3 μg/mL인 1.5배 연속 희석액)을 연속적으로 첨가하여 37℃의 항온 인큐베이터에서 120분 동안 반응시켰다. 2 μg/mL PD-L2-hFc-비오틴 (NCBI 수탁번호: NP_079515.2, 20aa-220aa, Lot: 2016.12.05)를 플레이트에 첨가하여 항체와 함께 37℃에서 60분 동안 항온 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 이후 1:2000으로 희석한 HRP-스트렙타비딘 (Cat: S2438, Sigma)를 플레이트에 첨가하여 30분간 반응시켰다. 이후, TMB 기질을 첨가하여 15분 동안 발색시킨 후 2 M HCl을 첨가하여 반응을 종결시킨 다음 플레이트를 마이크로플레이트 판독기로 검출하였다. 630 nm를 기준 파장으로 하여 플레이트 내의 각 웰의 450 nm (A450nm-630nm)에서의 흡광도를 읽고 기록하였다.
결과는 h317이 재조합 인간 PD-1과 이의 리간드 PD-L1 및 PD-L2 사이의 결합을 효과적으로 차단할 수 있음을 보여주었다. PD-1과 리간드 PD-L1의 결합에 대한 h317 및 니볼루맙의 경쟁적 억제 효과를 ELISA에 의해 결정하였고, 획득된 절반 최대 억제 농도 (IC50)는 각각 1.4 nM 및 1.3 nM이었다 (도 6, 6a). 한편, PD-1과 리간드 PD-L2의 결합에 대한 h317 및 니볼루맙의 경쟁적 억제 효과를 ELISA에 의해 결정하였고, 획득된 절반 최대 억제 농도 (IC50)는 각각 1.2 nM 및 1.0 nM이었다 (도 6, 6a). h317은 니볼루맙과 유사한 차단 활성을 가지고 있음을 실험에서 알 수 있다.
실시예 6: ELISA에 의한 PD-1과 h317의 결합의 종-특이성 연구
ELISA 플레이트를 1 μg/mL 농도의 재조합 인간 PD-1 (NCBI 수탁번호: NP_005009.2, 21aa-167aa, Lot: 20180423), 사이노몰구스 원숭이 PD-1 (Cat: 90311-C08H, Sino Biological Inc.), 랫트 PD-1 (Cat: 80448-R08H, Sino Biological Inc.) 및 마우스 PD-1 (Cat: 50124-M08H, Sino Biological Inc.) 단백질을 각각 4℃에서 밤새 코팅하였다. 이후에 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 5% BSA-PBS를 첨가하여 37℃에서 60분 동안 차단하였다. 그런 다음 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 다양한 희석액 (실시예 4에서 사용한 것과 동일)을 사용하여 비오틴화된 h317 (11개의 농도를 초기 농도 1 μg/mL의 3배 구배 희석액으로 연속적으로 희석하여 획득함)을 첨가하고 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 다시, 플레이트를 PBST로 4회 세척한 다음, 1:100으로 희석된 HRP-스트렙타비딘 (Cat: 019-035-098, Jackson Immuno Research)을 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 다시 PBST로 플레이트를 4회 세척하고 TMB 기질을 첨가하여 37℃에서 10분간 인큐베이션하여 발색시킨 후 2 M HCl을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 630 nm를 기준 파장으로 하여 플레이트 내의 각 웰의 파장 450 nm (A450nm-630nm)에서의 흡광도를 읽고 기록하였다.
결과에 따르면 h317이 각각 0.004703 nM 및 0.01823 nM의 절반 최대 유효 농도 (EC50)에서 재조합 인간 PD-1 및 사이노몰구스 원숭이 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있고, 랫트 PD-1 및 마우스 PD-1에는 결합 친화도가 없는 것으로 나타났으며, 이는 h317이 교차 반응성이 없음을 나타낸다 (도 7). 결과는 h317의 생체내 및 시험관내 약역학 실험의 기반을 제공한다.
실시예 7: h317이 CD28 계열의 구성원에 결합하는 특이성에 대한 연구
ELISA 플레이트를 1 μg/mL 농도의 재조합 인간 PD-1 (NCBI 수탁번호: NP_005009.2, 21aa-167aa, Lot: 20180423), CD28 (Cat: 11524-HCCH, Sino Biological Inc.), CTLA4 (Cat: 11159-H08H, Sino Biological Inc.) 및 ICOS (NCBI 수탁번호: NP_036224.1, 1aa-199aa) 단백질로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 이후에 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 5% BSA-PBS를 첨가하여 37℃에서 60분 동안 차단하였다. 그 다음, 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 상이한 희석액으로 비오틴화된 h317 (실시예 4에서 사용한 것과 동일) (11개의 농도는 초기 농도 1 μg/mL의 3배 구배 희석으로 희석하여 획득됨)을 첨가하고 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 다시, 플레이트를 PBST로 4회 세척한 다음, 1:100으로 희석된 HRP-스트렙타비딘 (Cat: 019-035-098, Jackson Immuno Research)을 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 다시 PBST로 플레이트를 4회 세척하고 TMB 기질을 첨가하여 37℃에서 10분간 인큐베이션하여 발색시킨 후 2 M HCl을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 630 nm를 기준 파장으로 하여 플레이트 내의 각 웰의 파장 450 nm (A450nm-630nm)에서의 흡광도를 읽고 기록하였다.
결과는 h317이 재조합 인간 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있고 CD28 계열의 다른 구성원에 대한 결합 친화도가 없음을 보여주었으며, 이는 h317에 교차 반응성이 없음을 나타낸다 (도 8). 결과는 h317의 생체내 및 시험관내 약역학 실험의 기반을 제공한다.
실시예 8: 시험관내에서 인간 T 세포 (PBMC) 자극에서의 h317의 활성에 관한 연구
A. CD14+ 단핵구의 단리 및 수지상 세포의 분화
제조사의 지침에 따라 Ficoll-Paque PLUS (Cat: 17-1440-03, Lot: 10246684, GE Healthcare)를 사용하여 PBMC를 추출한 다음 CD14 MicroBeads (Cat: 130-050-201, Lot: 5170814438, Miltenyi)로 CD14+ 단핵구를 양성으로 선택하였다. 획득된 세포를 ImmunoCult™ DC 분화 배지 (Cat: 10988, Lot: 17G83035, STEMCELL)을 이용하여 5x105 세포/ml로 재현탁시킨 후, 5 ml의 현탁액을 취하여 T-25 플라스크에 접종한 후 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에서 3일 동안 배양하였다. 배양물을 원심분리하고 37℃, 새로운 배지를 첨가하고 5% CO2의 인큐베이터에서 2일 동안 배양하였다. 그런 다음 ImmunoCult™ 수지상 세포 성숙 보충제 (Cat: 10989, Lot: 17B77271, STEMCELL) 50μl를 첨가하고 혼합하고 세포를 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에서 2일 동안 배양하였다. 획득된 세포를 하기 MLR 분석에 사용하였다.
B. CD4+ T 세포의 추출 및 단리
제조사의 지침에 따라 Ficoll-Paque PLUS (Cat: 17-1440-03, Lot: 10246684, GE Healthcare)를 사용하여 PBMC를 추출한 후 제조사의 지침에 따라 CD4+ T 세포 단리 키트 (Cat : 130-096-533, Lot: 5171016623, Miltenyi)를 사용하여 CD4+ T 세포로부터 PBMC를 단리하였다. 획득된 세포를 하기 MLR 분석에 사용하였다.
C. MLR 분석
8 μg/mL에서 시험될 항체 (h317 (Lot: DP201805002, Jiangsu T-mab BioPharma)), 니볼루맙 (Lot: AAW4553, BMS), 및 인간 NC-IgG4 대조군 (Lot: AB170090)의 용액을 완전 배지로 각각 제조한 후 10배 구배 희석액으로 연속 희석하여 총 6가지 농도를 제조하였다. 그 후, 항체를 포함하는 각각의 용액 50 μL를 실험에 사용된 플레이트의 설정에 따라 96-웰 플레이트의 해당 웰에 첨가하였다. 그 후, 1x106 세포/mL의 조정된 농도를 갖는 CD4+ T 세포의 100 μL 현탁액을 해당 웰에 첨가하였다 (1x105 세포/웰). DC를 2 mM EDTA로 분해하고, 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 2x105 세포/mL의 조정된 농도를 갖는 DC의 50μL 현탁액을 해당 웰에 첨가하였다 (1x104 세포/웰). 그런 다음, 하나의 웰 내의 혼합물의 총 부피는 200 μL이었고, CD4+ T 세포 대 DC의 비율은 10:1이었다. 그런 다음 96웰 플레이트를 인큐베이터에 배치하고 37℃에서 5일 동안 배양하였다. 획득된 세포 상청액을 수집하여 IFN-γ ELISA 키트 (Cat: 430106, Lot: B247782, Biolegend) 및 IL-2 ELISA 키트 (Cat: DY202, Lot: P155804, R&D)를 이용하여 IFN-γ 및 IL-2의 농도를 검출하였다.
검출 결과는 h317이 시험관내에서 인간 혼합 림프구를 자극하고 세포가 킬러 사이토카인 IL-2 (도 9, 9a) 및 IFN-γ (도 9, 9b)를 분비하도록 촉진할 수 있음을 보여주었고, 이는 h317이 Th1 유형 세포에 의해 매개되는 면역 반응을 유도할 수 있음을 나타낸다.
실시예 9: 293T/hPD-1 세포에 대한 h317의 ADCC 활성 연구
제조사의 지침에 따라 Ficoll-Paque PLUS (Cat: 17-1440-03, Lot: 10246684, GE Healthcare)를 사용하여 PBMC를 추출한 다음 2% FBS (Cat: SH30084.03, Lot: GAE0138, Hyclone))를 포함하는 ADCC 분석용 배지 (페놀-레드-무함유 RPMI 1640 배지) (Cat: 11835-030, Lot: 1860152, Gibco)에 재현탁시켰다. 획득된 PBMC를 계수하고, NK 세포를 NK 세포 단리 키트 (Cat: 130-092-657, Lot: 5170911524, Miltenyi)의 지침에 따라 단리하여, 이후 ADCC 분석에 사용하였다. 지수기에서 인간 PD-1을 발현하는 293T 세포를 취하고, CytoTox 96® 비방사성 세포독성 분석 (Cat: G1781, Lot: 0000265175, Promega)에 따라, 293T 세포를 ADCC용 배지로 희석하여 50 x 104 세포/mL의 농도로 표적 세포를 포함하는 세포 현탁액을 획득하였다. 96-웰 둥근 바닥 플레이트의 각 웰에 40 μL의 세포 현탁액 및 10 μL의 시험 항체 용액 (시험 항체의 각 농도는 3중 반복 실험으로 분석됨)을 첨가한 다음 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 시험 항체 (h317 (Lot: DP201805002, Jiangsu T-mab BioPharma), h317-hIgG1 (Lot: 20180528), 및 인간 NC-IgG4 (Lot: 20180521))의 최종 농도는 10000 ng/mL, 1000 ng/mL, 100 ng/mL, 10 ng/mL, 1 ng/mL, 0.1 ng/mL 및 0.01 ng/mL이었다. 또한, 10:1 및 5:1의 두 가지 E:T 비율을 각 웰에 서로 다른 농도의 NK 세포 현탁액 50μL를 첨가하여 설정하였다. 그 후, 96웰 플레이트를 4분 동안 250 g에서 원심분리하여 효과기 세포와 표적 세포 사이에 충분한 접촉을 가능하게 한 후 세포를 37℃, 5% CO2/95% 공기에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 10 μL 용해 완충액 (100 μl당 10μl)을 최대 용해 대조군 웰에 45분 동안 첨가한 후 플레이트를 5분 동안 250 g에서 원심분리하고 상청액을 옮겼다. 웰의 상청액 50 μl를 깨끗한 96웰 플레이트로 옮기고, 각 웰에 반응 기질 50 μl를 첨가하고, 30초 동안 혼합하고, 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 50 μL 종결 용액을 플레이트에 첨가하고 30초 동안 혼합하였다. 흡광도 (OD490 nm)를 판독하였다.
배양 배지를 포함하는 대조군 웰의 평균 값을 시험 웰, 표적 세포를 포함하는 대조군 웰, 및 NK 세포 및 표적 세포를 포함하는 웰의 평균 값에서 감산(subtracting)하였다. 세포독성 %를 하기 식에 따라 구한 값을 사용하여 계산하였다.
Figure pct00012
실험 결과는 표적 세포에 대한 인간 PBMC (말초 혈액 단핵 세포)에서 NK 세포의 사멸 효과가 293T 세포에 대한 hPD-1과 h317의 결합에 의해 개시되지 않았다는 것을 보여주었다 (도 10). 항-hPD-1 항체가 없는 대조군 그룹과 비교하여, h317은 hPD-1 발현이 높은 293T 세포에 대해 ADCC 활성을 나타내지 않았으며, 이는 h317이 ADCC-효과기 기능을 갖지 않음을 나타낸다.
실시예 10: PD-1 형질전환 마우스 이종이식 종양 모델에서 h317의 항종양 효능 평가
총 65마리의 HuGEMMPD-1 마우스 (6 내지 8주령, 상하이 모델 유기체)를 선택하고 우측에 MC38-hPD-L1 종양 세포 (1x106 세포/마우스, 100 μL PBS에 재현탁된 1x106개의 세포)로 피하 접종하였다. 종양 보유 마우스의 평균 종양 부피가 약 60 내지 100 mm3에 도달했을 때 각 마우스의 중량을 측정하고 버니어 캘리퍼 (vernier caliper)로 종양 부피를 측정하였다. 투여 전에 StudyDirector™ (버전 3.1.399.19, Studylog System, Inc., S. San Francisco, CA, USA에서 제공)를 사용하여 마우스를 6개 그룹으로 무작위로 나누었다. 투여를 0일 (D0)에 개시하였고, 각 그룹의 동물 수와 투여 경로, 투여량 및 프로토콜에 대한 정보를 표 6에 상세히 나타내었다. 투여, 종양 부피의 측정, 중량 측정 등은 모두 생물안전 캐비닛 또는 클린 벤치에서 수행되었다. 실험 동안, 종양의 장경(long diameter) 및 단경(short diameter) 측정 및 마우스 중량 측정을 포함한 실험 데이터를 소프트웨어 StudyDirector™ (버전 3.1.399.19, Studylog System, Inc. 제공)로 수집하고 초기 데이터를 저울과 버니어 캘리퍼를 사용하여 측정하여 획득한 후 소프트웨어에 직접 입력하였다. 대조군의 평균 종양 부피가 2000 mm3를 초과하거나 마지막 투여 1주 후에 실험을 종료하였다. 종양을 수집하고 중량을 측정하고 사진을 찍었다. 각 그룹의 4마리의 마우스 (마우스의 수는 하기에 혈액이 샘플링된 마우스의 수에 해당함)에서 실험 종료일에 샘플링된 종양을 사용하여 FACS 분석을 수행하였으며 마커는 CD3, CD4, CD8 및 CD45 생존/사멸이었다. 실험 종료일에 각 그룹의 4마리 마우스 (마우스의 수는 종양이 샘플링된 마우스의 수에 해당함)에서 샘플링한 전혈을 사용하여 또 다른 FACS 분석을 수행하였으며 마커는 CD3, CD4, CD8 및 CD45이었다.
[표 6]
Figure pct00013
참조: 투여 부피는 10 μL/g; hIgG 대조군 (Lot: 20180521), h317 (Lot: DP201805002, Jiangsu T-mab BioPharma), 니볼루맙 (Lot: AAW4553, BMS)이었다.
유전자 조작 마우스의 일종인 HuGEMMPD-1 마우스 모델을 C57BL/6J의 유전적 배경하에서 마우스 PD-1의 ATG 위치에 인간 PD-1 단백질의 코딩 영역을 삽입하여, 마우스가 마우스 PD-1 대신 인간 PD-1을 발현하도록 함으로써 확립한다. MC38은 C57BL/6 마우스에서 유도된 뮤린 장암 세포주이다. MC38-hPD-L1 세포주로 명명된 인간 PD-L1을 발현하는 MC38 세포주는 유전공학을 사용하여 MC38의 뮤린 PD-L1을 녹아웃 (knock out)시키고 인간 PD-L1을 녹인 (knock in)시킴으로써 획득된 것이다. PD-1 형질전환 마우스 이종이식 종양 모델을 사용하여 종양 성장에 대한 h317 및 대조군 항체 니볼루맙의 억제 효과를 평가하고 비교하였다. 결과 (도 11 및 표 7 참조)는 h317이 고 투여량 및 중간 투여량에서 PD-1 형질전환 마우스에서 피하 이종이식 종양의 성장을 유의하게 억제할 수 있고 대조군 항체 니볼루맙에 필적하는 종양에 대한 억제 효과가 고 투여량 및 중간 투여량에서 h317에 의해 관찰되었다.
[표 7]
Figure pct00014
참조: 데이터는 "평균 ± 표준 오차"로 표시되었다: n=8b. P 값은 종양 부피의 일원 ANOVA를 사용하여 획득하였으며 Dunnett T3에 의해 분석된 F 값은 유의하게 달랐다 (P <0.05).
실시예 11: PD-1 수용체에 대한 결합 및 h317의 내재화
인간 PD-1을 일시적으로 발현하는 293 세포주의 작제: 10 ml의 HEK293 세포 현탁액을 6x105 세포/mL의 밀도로 교반 플라스크에 접종하고, 37℃, 5% CO2에서 교반하고, 교반 인큐베이터에서 130 rpm으로 24시간 동안 배양하였다. 1:1.2의 비율로 전장 인간 PD-1 (NP_005009.2, 21aa-288aa) 및 293fectin (Cat:12347019, Gibco)을 인코딩하는 발현 플라스미드를 각각 0.5 mL Opti-MEM (Cat: 11058021, Gibco)를 5분 동안 방치시킨 후 혼합하고 실온에서 15분 동안 방치한 다음 HEK293 세포에 첨가하였다. 37℃, 5% CO2의 교반 인큐베이터에서 130 rpm으로 48시간 교반 배양한 후, 획득된 293/hPD-1 세포를 FACS를 통한 검출에 사용하였다.
PD-1: h317 (Lot: DP201805002, Jiangsu T-mab BioPharma) 및 니볼루맙 (Lot: AAW4553, BMS)에 의해 매개된 h317의 세포내이입을 Mix-n-Stain™ CF™ 488A (Cat: MX488AS100, Sigma)로 표지하고; 표지된 항체 (h317-CF488A 및 니볼루맙-CF488A)를 5% BSA로 10 μg/mL로 희석하였다. 293/hPD-1 세포를 PBS로 1회 세척한 후, 희석된 h317-CF488A 및 니볼루맙-CF488A를 각각 첨가하였다. 각 혼합물을 두 그룹으로 나누어 하나는 37℃의 전기가열 상온 배양기에 배치하고 다른 하나는 음성 대조군으로서 4℃의 냉장고에 배치하였다. 1시간 인큐베이션 후 세포를 PBS로 3회 세척하고 37℃ 또는 4℃에서 인큐베이션을 위해 재배치하였다. 6시간 동안 3개의 핸드 인큐베이션 (hand incubation)에 대한 인큐베이션 후 세포를 관찰하고 형광 현미경으로 사진을 찍었다.
PD-1에 의해 매개된 h317의 세포내이입을 형광 현미경으로 관찰하였고 결과 (도 12)는 37℃에서 h317 및 니볼루맙이 PD-1에 의한 매개를 통해 세포내이입될(endocytosing) 수 있음을 보여주었다.
실시예 12: 317에 의해 인식되는 에피토프에 대한 연구
PD-1-h317-Fab 복합체의 제조: 재조합 인간 PD-1 세포외 도메인 단백질 (NCBI 수탁번호: NP_005009.2, 21aa-167aa, Lot: 20170626)의 분자량은 16.4 Kd이고 h317-Fab (Lot: 20170626)의 분자량은 약 46.5 Kd이다. PD1 및 h317-Fab를 20 mM Tris 150 mM NaCl에 1:1.5의 몰비로 혼합하여 혼합물을 획득한 후 얼음 위에 30분간 배치하여 복합체를 형성하였다. 복합체를 결정화 분석을 위해 한외여과에 의해 12 mg/ml의 농도로 농축시켰다.
PD-1-h317-Fab 복합체의 결정화 및 획득된 결정의 회절 데이터 수집 및 구조 분석: 이 실험을 자동 결정화 스크리닝 시스템을 사용하여 시팅 드롭 방법 (sitting drop method)에 의해 수행하였다. 시스템에 구비된 결정화 플레이트의 각 웰에 0.2 μl의 단백질 샘플을 첨가하고, 첨가가 완료되면 결정화 플레이트를 밀봉하고 항온 챔버에 배치하여 배양하였다. 결정 성장을 위한 온도는 16℃ 또는 4℃였고, 첨가된 단백질 농도는 8 mg/ml 또는 12 mg/ml이었다. 스크리닝에 사용된 키트에는 Crystalscreen (1-98), Index (1-96), PEGRX (1-96), SaltRx (1-96), Nartrix (1-96), 및 PEG/ion (1-96) (HAMPTON 제공); 단백질 복합체 슈트 (Protein Complex Suite) (1-96) (QIAGEN 제공); WIZARD I/II (1-96), 및 WIZARD III/IV (1-96) (Emerald Biosystems 제공)가 포함되었다. 결정 성장을 15일 동안 관찰하였으며 예비 스크리닝에서 결정이 더 잘 형성되는 성장 조건을 최적화하였다. 회절 실험 전에 최적화된 조건에서 획득된 결정을 10% 에틸렌 글리콜이 보충된 결정화 용액에 몇 초 동안 담그고 액체 질소에 담가 급속 동결시켰다. 회절 실험을 0.9792 Å의 X선 파장, 결정 회절 온도 100K를 사용하여 Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF)에서 BL17U에서 수행하였다. 회절 데이터를 ADSC에서 공급한 Q315r 검출기를 사용하여 수집한 다음 HKL2000 소프트웨어를 사용하여 처리하였다. 결정은 P2 공간군에 속하는 것으로 결정되었고, 2.90 Å의 분해능으로 회절되었다. PHASER 소프트웨어를 이용한 분자 치환법을 통해 결정 구조를 분석하였으며, 분자 치환에 사용된 모델은 PD-1 단일 단백질 구조 (PDB ID 3RRQ) 및 PD-1 Fab (PDB ID 5WT9) 구조였다. 그 후 COOT 소프트웨어를 사용하여 모델을 재구성하고 Refmac5 및 Phenix 소프트웨어를 구조 개선에 사용하였다.
탈글리코실화된 재조합 인간 PD-1 단백질과 h317 간의 결합: 인간 PD-1 항원 (NP_005009.2)의 구조에서 관찰될 수 있는 4개의 글리코실화 부위 N49, N58, N116 및 N74를 알라닌 (A)으로 부위 지정 돌연변이에 의해 돌연변이시켰다. 획득된 돌연변이체를 EGFP를 보유하는 발현 벡터에 삽입하여 전장 인간 PD-1을 발현하는 5개의 플라스미드 (WT, N49A, N58A, N116A, N74A)를 작제하였다. 그 후, 플라스미드를 293fectin과 혼합하고 HEK293 세포에 공동 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 세포를 96-웰 플레이트에 수집하고, 1500 rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 웰의 상청액을 따라 내었다. 200 μl PBS를 첨가하여 세포를 재현탁시키고, 획득된 현탁액을 1500 rpm에서 2분 동안 원심분리한 다음, 상청액을 따라 내었다. 5% BSA로 희석된 각 1차 항체 (h317 (Lot: 2017.05.24) 또는 니볼루맙 (Lot: 2017.04.26)) 200 μl를 세포에 첨가하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1차 항체의 작업 농도는 2 μg/ml이었고, 1차 항체 무함유 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 획득된 혼합물을 1500 rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 상청액을 따라 내었다. 200 μl PBS를 첨가하여 각 웰의 세포를 재현탁시킨 다음, 획득된 현탁액을 1500 rpm에서 2분 동안 원심분리한 후, 상청액을 따라 내었다. 이후, 획득된 세포를 실온에서 1시간 동안 각 웰에 첨가한 5% BSA로 희석한 염소 항인간 IgG (Fc)-Cy5 (Cat: 12136, Lot: 017M4800V, Sigma) 200 μl와 함께 인큐베이션한 후, 1500 rpm에서 2분간 원심분리하고, 상청액을 따라 내었다. PBS 200 μl를 첨가하여 세포를 재현탁시킨 후 획득된 현탁액을 1500 rpm에서 2분간 원심분리한 후 상청액을 따라 내었다. 다시 PBS 200 μl를 첨가하여 세포를 재현탁시키고, 유세포 분석 (B49007AD, SNAW31211)에 의해 검출하였다.
PD-1-h317-Fab 복합체의 전체 구조 분석 결과 PD-1 항원 (세포외 영역 1-167aa)이 단량체로 존재하며 1:1 비율로 항 PD-1 항체의 h317-Fab 단편과 복합체를 형성하는 것으로 나타났다 (도 13). 항체가 결합하는 PD-1 부위는 BC 루프, C' D 루프 및 FG 루프를 포함하는 PD-1 루프에 주로 위치하였다 (도 14). PD-1과 Fab317 사이의 상호작용에는 수소결합, 염 다리(salt bridge), 반데르발스 상호작용 및 소수성 상호작용이 포함되었다. 표 8은 상호작용에 관여하는 아미노산과 이에 해당하는 상호작용을 나타낸다.
[표 8]
Figure pct00015
Figure pct00016
또한, PD-1 항원의 구조에서 N49, N58 및 N116 부위의 글리코실화를 관찰할 수 있었지만, N74 부위의 글리코실화는 명확하지 않았다. 또한, h317-Fab에 대한 결합에서 N58의 탄수화물 사슬이 관여하는 것을 또한 관찰할 수 있었다 (도 15). 이와 달리, PD-1 항원과 이의 항체 사이에 형성된 임의의 다른 보고된 복합체의 구조에서 이 부위의 탄수화물 사슬은 PD-1 항원과 항체 사이의 상호작용에 관여하지 않는다. 이와 관련하여, h317-Fab과 N58의 탄수화물 사슬 간의 상호작용은 이들 사이의 인식 및 결합의 특이성을 향상시킬 수 있다. PD-1 상의 글리코실화 부위를 돌연변이시키고, 획득된 돌연변이 PD-1 (PD-1-mut)을 보유하는 플라스미드를 293 세포로 일시적으로 형질감염시킨 다음, h317과 PD-1-mut 사이의 결합을 FACS에 의해 검출하였다. FACS 결과는 PD-1의 N58의 탄수화물 사슬이 h317과 PD-1의 결합에 관여함을 보여주었다. 구체적으로, PD-1의 아미노산 N58이 알라닌 (A)으로 돌연변이되면 h317이 PD-1을 발현하는 세포에 대한 결합 능력을 상실하게 되며 (도 16), 이는 PD-1의 N58의 탄수화물 사슬이 h317 및 PD-1의 결합에 관여함을 나타낸다. 또한 PD-1-h317-Fab 복합체와 PD-1/PD-L1 복합체의 구조 비교에서도 h317-Fab과 PD-1의 상호작용 계면과 PD-L1 및 PD-1의 상호작용 계면 사이에 다수 중첩되고 (도 17a) 대부분의 중첩이 PD-1의 FG 루프에 존재했으며 (도 17b), 이는 h317-Fab이 PD-1에 대한 결합에 대해 PD-L1과 경쟁함을 나타내고, PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 차단할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 13: h317의 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR의 부위 지정 돌연변이
1. PD-1-h317Fab 복합체의 구조 분석에 따라 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR의 돌연변이체를 작제하였다. 발현 벡터를 부위 지정 돌연변이 방법을 사용하여 작제하였다. 자세한 내용은 문헌[Ronghao Wang, Runchuan Chen, and Runzhong Liu, Journal of Xiamen University (Natural Science) 2008, Vol 47, sup 2, 282-285]을 참조한다. 변이체 항체의 발현 및 정제 방법은 상기와 동일하였다.
2. 변이체 항체의 상대적인 친화도 비교
변이체 항체와 모항체 사이의 친화도 비교를 Fortebio에서 제공하는 Octet QKe 시스템을 사용하여 수행하였다. 사용된 방법은 상대적 친화도를 평가하기 위해 모든 변이체 항체에 대한 단일 항원 농도 결합만을 통해 친화도를 측정하였다는 점을 제외하고는 실시예 4에서 사용된 방법과 유사하였다. 먼저, 동일한 표적 값의 시험 항체를 코팅하고, 100 nM 재조합 인간 PD-1 단백질 (NCBI 수탁번호: NP_005009.2, 21aa-167aa)을 이동상으로 사용하여 상대 친화도를 결정하였다.
변이체 항체의 친화도를 검출한 결과, 다양한 돌연변이를 갖는 변이체 항체의 친화도가 크게 변한 것으로 나타났다. 표 9는 돌연변이를 나타내고 표 10은 특정 친화도 변화를 보여준다.
[표 9]
Figure pct00017
[표 10]
Figure pct00018
Figure pct00019
표의 데이터는 특정 위치의 아미노산이 돌연변이된 경우 친화도가 크게 영향을 받는 것으로 나타났으며, 예를 들어 10배 초과하여 감소하였다. 항체의 친화도는 특정 위치의 아미노산이 돌연변이된 경우 개선되었으며, 예를 들어 경쇄의 위치 24의 K를 R로, 경쇄의 위치 56의 T를 S로, 경쇄 위치 92의 S를 N으로, 중쇄의 위치 59의 D를 S로, 중쇄의 위치 54의 G를 S로 및/또는 중쇄 위치 59의 Y를 A로 돌연변이시키면 친화도가 어느 정도 향상되었다. 더욱이, 상기 위치에서 돌연변이의 일부를 조합함으로써 친화도가 변함없이 유지되거나 추가로 개선되었다. 한편, HCDR3은 항체의 결합에 필수적이며 HCDR3에 돌연변이를 갖는 대부분의 변이체 항체는 감소된 친화도를 나타냄을 또한 발견하였다.
본 발명의 실시형태에 대한 상기 설명은 본 발명을 제한하려는 것이 아니며, 당업자는 본 발명에 따라 다양한 변경 및 변형을 할 수 있으며, 이는 본 발명의 사상을 벗어나지 않고 하기 청구범위의 보호 범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> MABWELL (SHANGHAI) BIOSCIENCE CO., LTD. <120> RECOMBINANT ANTI-HUMAN PD-1 ANTIBODY AND APPLICATION THEREOF <130> LC19210015P <150> CN201910022548.9 <151> 2019-01-10 <160> 100 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X= K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X= E or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X= A, V or Y <400> 1 Xaa Ala Ser Gln Asp Val Xaa Thr Xaa Val Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X= A, G or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X= A, H or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X= S or T <400> 2 Xaa Ala Ser Thr Arg Xaa Xaa 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X= A, F or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X= D, N or S <220> <221> MISC_FEATURE 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LCDR3 <400> 22 Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Trp 1 5 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR3 <400> 23 Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Trp 1 5 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR3 <400> 24 Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Trp 1 5 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR3 <400> 25 Gln Gln Tyr Ser Arg Phe Pro Trp 1 5 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR3 <400> 26 Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Gly 1 5 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR3 <400> 27 Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Tyr 1 5 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR1 <400> 28 Ser Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR1 <400> 29 Asp Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR1 <400> 30 Ser Ala Asp Met Ser 1 5 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR1 <400> 31 Ser Asn Asp Met Ser 1 5 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> 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Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR2 <400> 40 Thr Ile Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR2 <400> 41 Thr Ile Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR2 <400> 42 Thr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 43 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR2 <400> 43 Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 44 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR2 <400> 44 Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Ala Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 45 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR2 <400> 45 Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Thr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 46 <211> 17 <212> PRT <213> 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Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Asp Ser Ser Gly Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 63 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VH <400> 63 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggaggc ctggtgaagc ctggcggttc cctgagactg 60 tcctgcgctg cctctggctt caccttctcc tcctacgaca tgtcctgggt gagacaggct 120 cccggaaagg gactggagtg ggtggccacc atctctggcg gaggctccta cacctactac 180 cctgactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtac 240 ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc ctctcccgac 300 tcttccggag tggcctactg gggccaggga accctggtga ccgtgtcttc c 351 <210> 64 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CL <400> 64 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 20 25 30 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 35 40 45 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 50 55 60 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 65 70 75 80 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 85 90 95 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 110 <210> 65 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CL <400> 65 gagatcaagc ggaccgtggc ggcgccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 60 ttgaaatctg gtaccgctag cgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 120 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 180 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 240 gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 300 gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 330 <210> 66 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CH <400> 66 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 67 <211> 981 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CH <400> 67 gctagcacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60 agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300 aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360 ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420 tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600 tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660 gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840 gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900 aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960 ctctccctgt ctctgggtaa a 981 <210> 68 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 68 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg 30 <210> 69 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 69 atggagwcag acacactcct gytatgggtg 30 <210> 70 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 70 atgagtgtgc tcactcaggt cctggsgttg 30 <210> 71 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 71 atgaggrccc ctgctcagwt tyttggmwtc ttg 33 <210> 72 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 72 atggatttwc aggtgcagat twtcagcttc 30 <210> 73 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 73 atgaggtkcy ytgytsagyt yctgrgg 27 <210> 74 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 74 atgggcwtca agatggagtc acakwyycwg g 31 <210> 75 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 75 atgtggggay ctktttycmm tttttcaatt g 31 <210> 76 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 76 atggtrtccw casctcagtt ccttg 25 <210> 77 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 77 atgtatatat gtttgttgtc tatttct 27 <210> 78 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 78 atggaagccc cagctcagct tctcttcc 28 <210> 79 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 79 tcatcaacac tcattcctgt tgaagctctt ga 32 <210> 80 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 80 atgaaatgca gctggggcat sttcttc 27 <210> 81 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 81 atgggatgga gctrtatcat sytctt 26 <210> 82 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 82 atgaagwtgt ggttaaactg ggttttt 27 <210> 83 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 83 atgractttg ggytcagctt grttt 25 <210> 84 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 84 atggactcca ggctcaattt agttttcctt 30 <210> 85 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 85 atggcttgtc ytrgsgctrc tcttctgc 28 <210> 86 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 86 atggratgga gckggrtctt tmtctt 26 <210> 87 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 87 atgagagtgc tgattctttt gtg 23 <210> 88 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 88 atggmttggg tgtggamctt gctattcctg 30 <210> 89 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 89 atgggcagac ttacattctc attcctg 27 <210> 90 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 90 atggattttg ggctgatttt ttttattg 28 <210> 91 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 91 atgatggtgt taagtcttct gtacctg 27 <210> 92 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 92 ctaacaatcc ctgggcacaa ttttcttgtc cacc 34 <210> 93 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 93 ctcaagctta attgccgcca ccatg 25 <210> 94 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 94 cctggagcca tcggagacat tgtgatgacc 30 <210> 95 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 95 ggtcatcaca atgtctccga tggctccagg 30 <210> 96 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 96 gctggcgccg catcagcccg tttgatttc 29 <210> 97 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 97 ctcaagctta attgccgcca ccatg 25 <210> 98 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 98 gaagggcgtg cagtgcgaag tgaagctggt g 31 <210> 99 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 99 caccagcttc acttcgcact gcacgccctt c 31 <210> 100 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 100 gcgctagctg cagagacagt gaccagag 28

Claims (17)

  1. 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (programmed cell death protein 1; PD-1)에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편으로서, 항체 또는 이의 단편은 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 각각 다음 서열에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR1 (LCDR1), CDR2 (LCDR2), CDR3 (LCDR3)을 포함하고/하거나, 중쇄 가변 영역은 중쇄 CDR1 (HCDR1), CDR2 (HCDR2) 및 CDR3 (HCDR3)을 포함하는, 항체 또는 이의 단편:

    Figure pct00020
  2. 제1항에 있어서, 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역은 각각 다음 서열에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2, LCDR3 및/또는 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함하는, 항체 또는 이의 단편:

    Figure pct00021
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역은 각각 다음 서열에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2, LCDR3 및/또는 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함하는, 항체 또는 이의 단편:
    서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 LCDR1;
    서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 LCDR2;
    서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 및 서열번호 27로 이루어진 군으로부터 선택되는 LCDR3; 및/또는
    서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32 및 서열번호 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCDR1;
    서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45 및 서열번호 46으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCDR2;
    서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 및 서열번호 51로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCDR3.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역은 다음과 같은 서열 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 LCDR1, LCDR2, LCDR3을 포함하고/하거나:
    Figure pct00022


    중쇄 가변 영역은 다음과 같은 서열 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함하고:
    Figure pct00023


    바람직하게는, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은 다음과 같은 서열 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 LCDR1, LCDR2, LCDR3 및 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함하는, 항체 또는 이의 단편:
    Figure pct00024

    Figure pct00025

  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은:
    (1) PD-1과 이의 리간드 PD-L1 또는 PD-L2의 결합의 차단;
    (2) 영장류 PD-1과의 특이적 결합 및 비영장류 PD-1과의 교차 반응성(cross-reactivity)의 부재;
    (3) PD-1 이외의 CD28 계열 구성원과의 결합의 부재의 표시;
    (4) CD4+ T 세포에서 IL-2 및/또는 IFN-γ의 생성의 유도; 및
    (5) ADCC-효과기 기능(ADCC-effector function)의 부재
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 갖고;
    바람직하게는, 항체 또는 이의 단편은 인간 PD-1의 N58에서 탄수화물 사슬에 결합하고; 바람직하게는, 항체 또는 이의 단편의 중쇄 가변 영역은 서열번호 47에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 경쇄 가변 영역은 서열번호 52 또는 서열번호 60에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 서열번호 52 또는 서열번호 60에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나; 중쇄 가변 영역은 서열번호 54 또는 서열번호 62에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 서열번호 54 또는 서열번호 62에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
    바람직하게는, "적어도 75% 서열 동일성"은 75% 이상의 임의의 동일성 퍼센트, 예를 들어 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 추가로 더욱 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 심지어 99% 동일성을 지칭하는, 항체 또는 이의 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 60에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고; 서열번호 60에 제시된 바와 같은 서열의 아미노산 잔기의 번호매김(numbering) 및 조성을 기준으로 하여, 변이체는 서열번호 60과 비교하여 K24R, E30S, V32A, V32Y, W50A, W50G, H55A, H55Q, T56S, Y91A, Y91F, S92D, S92N, R93N, R93S, Y94F, W96G 및 W96Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의, 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산 치환(들)을 갖고;
    바람직하게는, 변이체는 서열번호 60과 비교하여 K24R, V32A, V32Y, T56S, S92D, S92N, R93S 및 Y94F로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의, 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산 치환(들)을 갖는, 항체 또는 이의 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 62에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고; 서열번호 62에 제시된 바와 같은 서열의 아미노산 잔기의 번호매김 및 조성을 기준으로 하여, 변이체는 서열번호 62와 비교하여 S31D, Y32A, Y32N, D33S, D33Y, S52K, S52W, G53S, G53Y, G54D, G54S, G55S, S56G, Y57T, Y59A, Y59T, D100E, D100Y, S101A 및 Y106T로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의, 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산 치환(들)을 갖고;
    바람직하게는, 변이체는 서열번호 62와 비교하여 S31D, Y32A, D33S, G53S, G54S, G55S, Y59A 및 D100Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의, 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산 치환(들)을 갖는, 항체 또는 이의 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 단일클론 항체(monoclonal antibody), 단일 사슬 항체, 이중기능성 항체(bifunctional antibody), 단일 도메인 항체, 나노바디(nanobody), 완전 또는 일부 인간화된 항체 또는 키메라 항체(chimeric antibody) 등 중 임의의 것일 수 있고; 바람직하게는, 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM 항체이고, 더욱 바람직하게는 IgGl 또는 IgG4 항체이고;
    바람직하게는, 단편은 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 임의의 단편 또는 이의 임의의 일부분이고; 더욱 바람직하게는, 단편은 항체의 단편 scFv, BsFv, dsFv, (dsFv)2, Fab, Fab', F (ab')2 또는 Fv이고;
    더욱 바람직하게는, 항체의 중쇄 불변 영역은 IgG1 또는 IgG4 하위유형(subtype)이고, 경쇄 불변 영역은 κ 유형이고;
    추가로 바람직하게는, 항체의 경쇄 불변 영역은 서열번호 56 또는 서열번호 64에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 서열번호 56 또는 서열번호 64에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나; 중쇄 불변 영역은 서열번호 58 또는 서열번호 66에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 서열번호 58 또는 서열번호 66에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
    바람직하게는, "적어도 75% 서열 동일성"은 75% 이상의 임의의 동일성 퍼센트, 예를 들어 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 추가로 더욱 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 심지어 99% 동일성을 지칭하는, 항체 또는 이의 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 포함하는 접합체 또는 융합 단백질.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편의 중쇄 CDR, 경쇄 CDR, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자로서;
    바람직하게는, 핵산 분자는 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 59, 서열번호 61, 서열번호 63, 서열번호 65 또는 서열번호 67에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  11. 제10항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터(vector).
  12. 제10항에 따른 핵산 분자 및/또는 제11항에 따른 벡터를 포함하거나, 제10항에 따른 핵산 분자 및/또는 제11항에 따른 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포(host cell).
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편, 제9항에 따른 접합체 또는 융합 단백질, 제10항에 따른 핵산 분자, 제11항에 따른 벡터 및/또는 제12항에 따른 숙주 세포, 및 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  14. 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편, 제9항에 따른 접합체 또는 융합 단백질, 제10항에 따른 핵산 분자, 제11항에 따른 벡터, 제12항에 따른 숙주 세포 및/또는 제13항에 따른 약제학적 조성물의 용도.
  15. (1) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편, 제9항에 따른 접합체 또는 융합 단백질, 제10항에 따른 핵산 분자, 제11항에 따른 벡터, 제12항에 따른 숙주 세포 및/또는 제13항에 따른 약제학적 조성물;
    (2) 다른 면역강화제(immunopotetiator) 또는 면역강화 수단, 예컨대 소분자 화학물질 약물, 표적화된 제제, 재조합 단백질 약물, 예컨대 항체, 백신, ADC, 종양용해성 바이러스, 유전자 및 핵산 요법용 약물, 및 방사선요법
    을 포함하는 약제학적 조합물.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편, 제9항에 따른 접합체 또는 융합 단백질, 제10항에 따른 핵산 분자, 제11항에 따른 벡터, 제12항에 따른 숙주 세포 및/또는 제13항에 따른 약제학적 조성물을 포함하는 키트(kit).
  17. 종양 또는 암의 예방 또는 치료 방법으로서, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편, 제9항에 따른 접합체 또는 융합 단백질, 제10항에 따른 핵산 분자, 제11항에 따른 벡터, 제12항에 따른 숙주 세포 및/또는 제13항에 따른 약제학적 조성물, 및 선택적으로 다른 약물 또는 수단을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.




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