CN104140467A - 抗csf-1r的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供对CSF-1R特异的抗体、包含该抗体的组合物及使用这类组合物的治疗方法。

Description

抗CSF-1R的抗体
本申请是发明人于2012年2月7日提交的题为“抗CSF-1R的抗体”的中国专利申请201280008872.1的分案申请。
相关申请的交叉参考
本申请是2010年9月13日提交的美国申请号12/922,441的部分继续申请，其是2009年3月11日提交的基于PCT/EP2009/001733的美国国家阶段申请，且其要求2008年3月14提交的欧洲申请号08 36 0005.6的优先权及2008年4月10日提交的美国临时申请号61/043,884的权益。
序列表
本申请包含已通过EFS-Web提交的序列表，且在此完整引入作为参考。2011年3月30日创建的该ASCII拷贝命名为13026944.txt，大小为56,764字节。
发明概述
CSF-1(集落刺激因子-1)是尤其由多种类型的细胞表达的细胞因子。它是表达CSF-1受体(CSF-1R)的单核吞噬细胞系的细胞的分化、生长和存活因子(SHERR.Colony-stimulating factor-1receptor.blood.1990,第75卷,第1期,第1-12页)。CSF-1R是由c-fms原癌基因编码的酪氨酸激酶受体，包含组织在五个免疫球蛋白样亚结构域中的细胞内激酶结构域和配体结合胞外区。对CSF-1的响应导致提高的存活、生长、分化和可逆的功能改变。c-fms基因本身是巨噬细胞分化标志。c-fms表达的程度强于包括溶菌酶和巨噬细胞特异性蛋白质酪氨酸磷酸酶的其他巨噬细胞特异性基因表达的程度(HUME等Regulation of CSF-1receptor expression.Molecular reproduction and development.1997,第46卷,第1期,第46-52页)。
除单核吞噬细胞系的细胞外，CSF-1R还由许多类型的人肿瘤表达。在乳腺癌中，CSF-1R表达与更大的肿瘤大小和降低的存活相关(KLUGER等Macrophage colony-stimulating factor-1receptor expression isassociated with poor outcome in breast cancer by large cohort tissuemicroarray analysis.Clinical cancer research.2004,第10卷,第1期,第173-7页；SCHOLL等Anti-colony-stimulating factor-1antibody stainingin primary breast adenocarcinomas correlates with marked inflammatorycell infiltrates and prognosis.Journal of the National Cancer Institute.1994,第86卷,第2期,第120-6页)。在上皮卵巢癌中，大多数原发性肿瘤和转移灶强烈表达CSF-1R，且转移灶常共表达CSF-1和CSF-1R。CSF-1R还由肿瘤浸润巨噬细胞表达(CHAMBERS等Overexpression of epithelialmacrophage colony-stimulating factor(CSF-1)and CSF-1receptor:a poorprognostic factor in epithelial ovarian cancer,contrasted with a protectiveeffect of stromal CSF-1.Clinical Cancer Research.1997,第3卷,第6期，第999-1007页)。在卵巢和子宫内膜癌中，Northern印迹分析显示，绝大多数肿瘤共表达CSF-1和CSF-1R，而在正常子宫内膜组织样品中仅检测到弱的CSF-1R表达(等Expression of the macrophagecolony-stimulating factor and its receptor in gynecologic malignancies.Cancer.1991,第67卷,第4期，第990-6页)。在宫颈癌中，与正常子宫内膜相比，CSF-1R表达在肿瘤间质中和肿瘤上皮中都上调(KIRMA等Elevated expression of the oncogene c-fms and its ligand,the macrophagecolony-stimulating factor-1,in cervical cancer and the role of transforminggrowth factor-beta1in inducing c-fms expression.Cancer res..2007,第67卷,第5期，第1918-26页)。在肾癌中，表达高水平CSF-1R的肿瘤相关巨噬细胞的浸润与肿瘤进展相关(HEMMERLEIN等Expression of acuteand late-stage inflammatory antigens,c-fms,CSF-1,and human monocyticserine esterase1,in tumor-associated macrophages of renal cell carcinomas.Cancer immunology,immunotherapy.2000，第49卷,第9期，第485-92页)。CSF-1R由接近100％的前列腺上皮内瘤病或癌样品表达(IDE等Expression of colony-stimulating factor1receptor during prostatedevelopment and prostate cancer progression.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A..2002,第99卷,第22期，第14404-9页)。还已在急性成粒细胞白血病和B细胞慢性淋巴细胞白血病中检测到了CSF-1R表达(RAMBALDI等Expression of the macrophage colony-stimulating factor and c-fms genes inhuman acute myeloblastic leukemia cells.Journal of Clinical Investigation.1988,第81卷,第4期，第1030-5页)。
通过免疫组织化学和原位杂交进行的研究已证明CSF-1在侵入性乳腺癌细胞中表达的特异性，而在管内或非侵入性肿瘤细胞中未观察到这种产生(SCHOLL等Anti-colony-stimulating factor-1 antibody staining inprimary breast adenocarcinomas correlates with marked inflammatorycell infiltrates and prognosis.Journal of the National Cancer Institute.1994,第86卷,第2期，第120-6页；TANG等M-CSF(monocyte colonystimulating factor)and M-CSF receptor expression by breast tumor cells:M-CSF mediated recruitment of tumor infiltrating monocytes？.Journal ofcellular biochemistry.1992,第50卷，第4期，第350-6页)。侵入性肿瘤细胞的CSF-1表达与它在患者血浆中浓度的提高相关，其中与正常个体中的低于300pg/ml相比，它可以超过1000pg/ml。高血清浓度与疾病的晚期和不利的长期预后相关((SCHOLL等Circulating levels ofcolony-stimulating factor1as a prognostic indicator in82patients withepithelial ovarian cancer.British journal of cancer.1994,第69卷,第2期，第342-6页；SCHOLL.Circulating levels of the macrophage colonystimulating factor CSF-1in primary and metastatic breast cancer patients.A pilot study.Breast cancer research and treatment.1996,第39卷,第3期，第275-83页)。此外，已证明，CSF-1刺激肿瘤细胞的移动性和侵袭力(DORSCH等Macrophage colony-stimulating factor gene transfer intotumor cells induces macrophage infiltration but not tumor suppression.European journal of immunology.1993,第23卷,第1期，第186-90页；WANG等Induction of monocyte migration by recombinant macrophagecolony-stimulating factor.Journal of immunology.1988,第141卷,第2期，第575-9页；FILDERMAN等Macrophage colony-stimulating factor(CSF-1)enhances invasiveness in CSF-1receptor-positive carcinoma celllines.Cancer res..1992,第52卷,第13期，第3661-6页)。
CSF-1还对髓系祖细胞具有趋化作用，其便于单核细胞在肿瘤中浸润。但是，这些单核细胞的存在不足以观察到免疫系统对肿瘤的破坏(DORSCH等Macrophage colony-stimulating factor gene transfer intotumor cells induces macrophage infiltration but not tumor suppression.European journal of immunology.1993,第23卷,第1期，第186-90页)。在常见于患有乳腺、卵巢或胰腺肿瘤的患者中的高血清含量下，CSF-1似乎使这些单核细胞向巨噬细胞分化，而不向能够呈递肿瘤抗原，从而起始针对肿瘤细胞的有效的细胞毒性免疫反应的树突细胞分化(SCHOLL.Circulating levels of the macrophage colony stimulating factor CSF-1 inprimary and metastatic breast cancer patients.A pilot study.Breast cancerresearch and treatment.1996,第39卷,第3期,第275-83页；BARON等Modulation of MHC class II transport and lysosome distribution bymacrophage-colony stimulating factor in human dendritic cells derivedfrom monocytes.Journal of cell science.2001,第114卷,第pt5期,第999-1010页)。
CSF-1还为破骨细胞的增殖和分化所必需(CECCHINI等Role ofCSF-1 in bone and bone marrow development.Molecular reproduction anddevelopment.1997,第46卷,第1期,第75-83页)。破骨细胞是表达CSF-1R的多核细胞，衍生自在骨发育、稳态和修复过程中主要负责降解矿化骨的造血祖细胞。在诸如骨质疏松、恶性高血钙、类风湿性关节炎、肿瘤转移和佩吉特病(Paget's disease)的骨骼障碍中，破骨细胞的骨吸收超过成骨细胞的骨形成，导致减少的骨质量、骨骼脆性和骨折(BRUZZANITI等Molecular regulation of osteoclast activity.Reviews inendocrine.2006,第7卷,第1-2期,第123-39页)。例如，晚期乳腺癌患者常发展骨转移。由于提高的破骨细胞活性引起的肿瘤驱动的骨丢失(骨质溶解)，骨转移导致难治的疼痛和高骨折风险(CICEK等Breast cancerbone metastasis and current small therapeutics.Cancer metastasis reviews.2006,第25卷,第4期,第635-44页)。已显示，骨质溶解与高水平的循环CSF-1相联系(KITAURA等The journal of clinical investigation.M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis.2005,第115卷,第12期,第3418-27页)。
CSF-1途径还涉及介导诸如炎性肠病的疾病中的肠炎(MARSHALL等Blockade of colony stimulating factor-1(CSF-I)leads to inhibition ofDSS-induced colitis.Inflammatory bowel diseases.2007,第13卷,第2期,第219-24页)，介导急性同种异体移植排斥期间的巨噬细胞增殖(JOSE等Blockade of macrophage colony-stimulating factor reduces macrophageproliferation and accumulation in renal allograft rejection.Americanjournal of transplantation.2003,第3卷,第3期,第294-300页)，及感染的巨噬细胞中的HIV-1复制(KUTZA等Macrophage colony-stimulatingfactor antagonists inhibit replication of HIV-1in human macrophages.Journal of immunology.2000,第164期,第4955-4960页)。
由于这些原因，已提出通过多种化合物抑制CSF-1活性来治疗癌症和骨降解。
背景技术
WO01/30381涉及CSF-1活性的抑制剂在产生用于治疗肿瘤疾病的药物中的用途。所提出的两种用于抑制CSF-1活性的方法是抑制CSF-1活性本身和抑制CSF-1R的活性。优选将抗CSF-1或其受体的中和性抗体作为CSF-1活性的抑制剂。
WO03/059395描述用于治疗癌症的组合产品，其包含能够抑制CSF-1活性的物质和具有细胞毒性活性的物质的。
WO2005/068503公开了通过对个体施用抗CSF-1的抗体来预防和治疗骨质溶解、癌转移及与癌转移相关的骨丢失的方法。
EP1488792A涉及通过有效抑制CSF-1R酪氨酸激酶活性来显示选择性抑制分化、增殖或介质释放的单环和/或二环芳基或杂芳基(heteroaryl)喹唑啉化合物的用途。此申请还涉及这类化合物在制备用于抑制异常细胞增殖的药物中的用途。
US2005059113涉及特异性结合aCSF-1的抗体及其抗原结合部分。该发明还涉及人抗-CSF-1抗体及其抗原结合部分。此发明申请还提供基因疗法，其使用编码包含人抗-CSF-1抗体的重链和/或轻链免疫球蛋白分子的核酸分子。
Roussel和Sherr,1989,PNAS,86,7924-7927及Ashmun等,1989,Blood,73,827-837公开抗人CSF-1受体的单克隆抗体(例如12-3A3和2-4A5)，其特异性阻断CSF-1与人受体的结合，从而抑制配体依赖性生长。已将识别的表位定位在349-512位氨基酸之间。
WO2009/026303提供抗原结合蛋白质，其能够与CSF-1竞争，从而防止CSF-1与它的受体结合，且在某些实施方案中，该蛋白质抑制IL-34和CSF-1R之间的结合。此外，WO2009/026303的实验部分显示，发明人研发的抗体结合这样的表位，该表位主要定位在CSF-1R的SEQ ID NO29的氨基酸20至223之间的N端(对应于WO2009/026303中的Ig样环1和Ig样环2)，且需要存在Ig样环1和Ig样环2两个区域。
发明内容
本发明涉及抗体，该抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R。
除非文中清楚地另有说明，本申请通篇使用的术语“一个”和“该”以这样的含义使用，它们意指“至少一个”、“至少第一个”、“一个或多个”或“多个”所提到的成分或步骤。例如，术语“该细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
无论在本文中的什么地方使用，术语“和/或”包括“和”、“或”及“通过该术语连接的元件的全部或任意其他组合”的含义。
本文所用的术语“约”或“大约”意指给定的值或范围的20％之内，优选10％之内，且更优选5％之内。
本文所用的术语“包含”和“包括”旨在意指部分、产品、组合物和方法的组合包括所提到的成分或步骤，但不排除其他成分或步骤。在用来定义产品、组合物和方法时，“基本上由…组成”将意指排除具有任何必须意义的其他成分或步骤。因此，组合物基本上由所引述的成分组成将不排除痕量污染物和可药用载体。“由…组成”将意指排除痕量元素，及其他成分或步骤。
本文所用的术语“特异性结合”指决定靶蛋白在蛋白质和其他生物制品的异源群体的存在下存在的结合反应。因此，在指定的测定条件下，本发明的抗体优先与CSF-1R的至少部分结合，而不以显著的量与存在于测试样品中的其他成分结合。本发明的抗体和CSF-1R靶标之间的特异性结合意指结合亲和力为至少103M-1，且优选105M-1、106M-1、107M-1、108M-1、109M-1或1010M-1。在尤其有利的实施方案中，结合亲和力为至少109M-1或1010M-1。
本文所用的术语“CSF-1R”指人CSF1受体。人CSF-1受体已测序，且其氨基酸序列显示在SEQ ID NO:29中。
本文所用的“抗体”或“Ab”以最广泛的含义使用。因此，“抗体”或“Ab”可以是天然存在的或人造的，如通过常规杂交瘤技术、重组技术产生的单克隆抗体(mAb)和/或其功能片段。本发明的抗体意在包括以下二者：完整的免疫球蛋白分子，例如多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、单特异性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人抗体、动物抗体(例如骆驼抗体)、嵌合抗体；及其部分、片段、区域、肽和衍生物(通过任意已知的技术提供，如，但不限于酶切割、肽合成或重组技术)，例如，缺乏轻链的免疫球蛋白(见例如US6,005,079)、Fab、Fab’、F(ab')2、Fv、scFv、抗体片段、双抗体、Fd、CDR区，或抗体的能够结合抗原或表位的任意部分或肽序列。如果抗体能够与分子特异性反应，从而使分子结合于抗体，则称该抗体“能够结合”该分子。抗体片段或部分可以缺乏完整抗体的Fc片段、更快地从循环清除，且可以具有比完整抗体少的非特异性组织结合。可以用本领域公知的方法来从完整抗体产生抗体的实例，例如通过诸如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab')2片段)的酶的蛋白酶切割(见例如Wahl等,24J.Nucl.Med.316-25(1983))。抗体的部分可以通过任意以上方法来制备，或者可以通过表达重组分子的部分来制备。例如，可以分离重组抗体的一个或多个CDR区，并亚克隆入适当的表达载体。
本文所用的术语“可变区”指轻链(VL)或重链(VH)的可变区或结构域，其包含用于结合识别特异性的决定子。可变结构域涉及抗原识别，并形成抗原结合部位。本文所用的术语“构架区”指在同一物种的不同抗体之间至少85％同源的轻链和重链可变区的部分(即除CDR外)。本文所用的术语“同源”指两条多肽的氨基酸的比较，其在用Smith-Waterman算法(SMITH等Identification of common molecular subsequences.Journal of Molecular Biology.1981,第147期,第195-7页)比对时，大致具有指定百分比的相同氨基酸。例如，“85％同源”指两条多肽的氨基酸的比较，其在最佳比对时具有85％氨基酸同一性。如Kabat数据库(Kabat等,o第页cit.)中所定义，重链和轻链的可变区都分为包含被三段高变区序列或互补决定区(CDR)打断的四个构架亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)的区段，CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2在FR2和FR3之间，CDR3在FR3和FR4之间。不将具体的亚区指定为FR1、FR2、FR3或FR4，通过其他方式提到的构架区代表单条天然存在的免疫球蛋白链可变区内组合的FR。本文所用的单数形式的FR代表四个亚区之一，复数形式的FR代表构成构架区的四个亚区中的两个或多个。不同轻链或重链的构架区的序列在物种内相对保守。抗体的构架区是组成的轻链和重链的组合构架区，且用来定位和排列CDR。CDR主要负责形成赋予对抗原表位的结合特异性和亲和力的抗体结合部位。提供抗原结合区的H或L链的可变区内是由于其在不同特异性的抗体之间的极端变异性而称为“高变”的更小序列。这类高变区还称为“互补决定区”或“CDR”区。这些CDR区负责抗体对具体的抗原决定簇结构的基本特异性。CDR代表可变区内的非连续氨基酸序列，但不考虑物种，已发现这些关键氨基酸序列在可变重链和轻链区内的位置定位在可变链的氨基酸序列内具有相似的定位。所有抗体的可变重链和轻链各具有3个CDR区，对于各轻(L)链和重(H)链，每个CDR区与其他CDR区不连续(称为L1、L2、L3、H1、H2、H3)。Kabat等,252J.Biol.Chem.6609-16(1977)已描述了公认的CDR区，且可以通过在检查线性氨基酸序列期间应用这些规则来鉴定CDR环。但是，用于定义CDR-H3环的规则可以不同(见Chapter4,Antibody Engineering:Methods&Protocols,(Lo,ed.Humana Press,Totowa,NJ,2004))，且一些CDR-H3环的实际边界在无诸如圆二色性、核磁共振或X射线晶体分析法的实验技术的情况下不可鉴定。在所有哺乳动物物种中，抗体肽包含恒定(即高度保守)区和可变区，且在后者中，存在CDR及由处于重链或轻链的可变区之内但在CDR之外的氨基酸序列组成的所谓“构架区”。还可以用Chothia命名(CHOTHIA和LESK.Canonical structures for thehypervariable regions of immunoglobulins(1987)J Mol Biol.1987年8月20日；196(4):901-17)来定义CDR区。因此，在某些实施方案中，CDR是Kabat定义的CDR，在其他实施方案中，CDR是Chothia定义的CDR。关于抗体的CDR区识别的抗原决定簇，这还称为“表位”。换言之，表位指能够被抗体识别和结合的任意分子的部分(对应的抗体结合区可以称为互补位)。通常，表位由分子的具有化学活性的表面分组(例如氨基酸或糖侧链)组成，且具有特异的三维结构特征以及特异的电荷特征。
本文所用的术语“单克隆抗体”或“mAb”指衍生自单克隆的抗体。可以用杂交瘤技术来制备单克隆抗体，如HARLOW.Antibodies:ALaboratory manual.第二版.Cold Spring Harbor:Laboratory印制,1988和HAMMERLING等Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas.New York:Elsevier,1981.第563-681页中公开的那些。
本文所用的术语“人抗体”指具有衍生自或密切匹配人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包含并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。因此，本文所用的术语“人抗体”指其中蛋白质的基本上每个部分都基本上类似于人种系抗体的抗体。“基本上类似”指抗体具有与人种系抗体的核酸序列至少80％、优选85％、更优选90％和甚至更优选95％同源的核酸序列。
本文所用的术语“Fab”指抗体分子的区域，其包含重链和轻链的可变区，且其显示结合活性。“Fab”包含一条重链和一条轻链的聚集(常称为Fab)，以上任一种共价或非共价聚集，只要该聚集能够选择性地与具体的抗原或抗原家族反应。Fab片段是包含VL和第二多肽的异二聚体，该第二多肽包含VH和CH1结构域。在优选实施方案中，该抗体是Fab'片段。Fab'片段与Fab片段的不同在于，Fab'片段在重链CH1结构域的羧基端包含几个残基，包括来自抗体“铰链区”的一个或多个半胱氨酸。
“F(ab')2”指通过胃蛋白酶处理抗体获得的抗体片段，或指通过其他诸如重组技术的技术获得的等同蛋白质。F(ab')2具有两个抗原结合部位，且仍能够交联抗原。
“Fv”是包含完整的抗原识别和结合部位的最小抗体片段。此区域由紧密非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。每个可变结构域的三个CDR正是在此构象中相互作用来定义VH VL二聚体表面上的抗原结合部位。概括而言，六个CDR赋予抗体抗原结合特异性。但是，甚至单个可变结构域(或仅包含对抗原特异的三个CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，虽然亲和力比整个结合部位低。
“单链Fv”或“scFv”包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。优选地，scFv进一步包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成希望的用于抗原结合的结构(LENNARD.Standard protocols for the construction of scFv libraries.Methods in molecular biology.2002,第178期,第59-71页)。
本文所用的术语“抗体片段”指抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合CSF-1R的能力。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合部位的小的抗体片段，该片段包含在同一多肽链(VH VL)中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许同一条链上的两个结构域之间配对的接头，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合部位。双抗体可以结合一个或一个以上表位。双抗体更充分地描述于POLJAK.Production and structure of diabodies.Structure.1994,第2卷,第12期,第1121-3页；HUDSON等High avidity scFv multimers；diabodies and triabodies.Journal of immunological methods.1999,第231卷,第1-2期,第177-89页；及KIPRIYANOV.Generation of bispecific andtandem diabodies.Methods in molecular biology.2002,第178期,第317-31页中。
已研发了多种技术来产生抗体片段。通常，通过完整抗体的蛋白水解消化来衍生这些片段。但是，这些片段现在可以直接通过重组宿主细胞来产生。Fab、Fv和scFv抗体片段全都可以在大肠杆菌(E.coli)中表达并从大肠杆菌分泌，从而允许这些片段的大量产生。用于产生抗体片段的技术对本领域技术人员而言将显而易见。在其他实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。
本文所用的“结构域抗体”(dAb)存在于抗体的最小功能结合单位中，对应于抗体的重链(VH)或轻链(VL)的可变区。结构域抗体具有大约13kDa的分子量，或不到全抗体大小的十分之一。
本文所用的“Fd”指由VH和CH1结构域组成的抗体片段。
术语“抗体”或“Ab”还指本领域技术人员公知的其他抗体片段，例如描述于HOLLIGER等Engineered antibody fragments and the rise ofsingle domains.Nature biotechnology.2005,第23卷,第9期,第1126-36页和HOOGENBOOM等Natural and designer binding sites made byphage display technology.Immunology today.2000,第21卷,第8期,第371-8页中的那些。
根据一个实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含：
(i)至少一个CDR，其中该CDR包含SEQ ID NO:2中起始于45位并结束于54位的序列、SEQ ID NO:2中起始于66位并结束于87位的序列或SEQ ID NO:2中起始于117位并结束于126位的序列中的至少五个连续氨基酸；
或
(ii)至少一个CDR，其中该CDR包含SEQ ID NO:4中起始于44位并结束于56位的序列、SEQ ID NO:4中起始于66位并结束于76位的序列或SEQ ID NO:4中起始于109位并结束于117位的序列中的至少五个连续氨基酸。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含至少一个CDR，其中该CDR相互独立地在包含如下至少五个连续氨基酸的CDR中选择：
-SEQ ID NO:2中起始于45位并结束于54位的序列；
-SEQ ID NO:2中起始于66位并结束于87位的序列；
-SEQ ID NO:2中起始于117位并结束于126位的序列；
-SEQ ID NO:4中起始于44位并结束于56位的序列；
-SEQ ID NO:4中起始于66位并结束于76位的序列；
-SEQ ID NO:4中起始于109位并结束于117位的序列。
根据优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含2、3、4或5个，甚至更优选6个CDR，其中该CDR相互独立地在包含如下至少五个连续氨基酸的CDR中选择：
-SEQ ID NO:2中起始于45位并结束于54位的序列；
-SEQ ID NO:2中起始于66位并结束于87位的序列；
-SEQ ID NO:2中起始于117位并结束于126位的序列；
-SEQ ID NO:4中起始于44位并结束于56位的序列；
-SEQ ID NO:4中起始于66位并结束于76位的序列；
-SEQ ID NO:4中起始于109位并结束于117位的序列。
根据另一优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含：
(i)2个，且甚至更优选3个CDR，其中该CDR相互独立地在包含如下至少五个连续氨基酸的CDR中选择：
-SEQ ID NO:2中起始于45位并结束于54位的序列；
-SEQ ID NO:2中起始于66位并结束于87位的序列；
-SEQ ID NO:2中起始于117位并结束于126位的序列；
或
(ii)2个，且甚至更优选3个CDR，其中该CDR相互独立地在包含如下至少五个连续氨基酸的CDR中选择：
-SEQ ID NO:4中起始于44位并结束于56位的序列；
-SEQ ID NO:4中起始于66位并结束于76位的序列；
-SEQ ID NO:4中起始于109位并结束于117位的序列。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含：
(i)相互独立地在以下所示的CDR中选择的至少一个CDR：
-SEQ ID NO:2中起始于45位并结束于54位的序列；
-SEQ ID NO:2中起始于66位并结束于87位的序列；和
-SEQ ID NO:2中起始于117位并结束于126位的序列；
或
(ii)相互独立地在以下所示的CDR中选择的至少一个CDR：
-SEQ ID NO:4中起始于44位并结束于56位的序列；
-SEQ ID NO:4中起始于66位并结束于76位的序列；
-SEQ ID NO:4中起始于109位并结束于117位的序列。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含相互独立地在以下所示的CDR中选择的至少一个CDR：
-SEQ ID NO:2中起始于45位并结束于54位的序列；
-SEQ ID NO:2中起始于66位并结束于87位的序列；
-SEQ ID NO:2中起始于117位并结束于126位的序列；
-SEQ ID NO:4中起始于44位并结束于56位的序列；
-SEQ ID NO:4中起始于66位并结束于76位的序列；
-SEQ ID NO:4中起始于109位并结束于117位的序列。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含相互独立地在以下所示的CDR中选择的2、3、4或5个，甚至更优选6个CDR：
-SEQ ID NO:2中起始于45位并结束于54位的序列；
-SEQ ID NO:2中起始于66位并结束于87位的序列；
-SEQ ID NO:2中起始于117位并结束于126位的序列；
-SEQ ID NO:4中起始于44位并结束于56位的序列；
-SEQ ID NO:4中起始于66位并结束于76位的序列；
-SEQ ID NO:4中起始于109位并结束于117位的序列。
根据另一优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含：
(i)2个，且甚至更优选3个CDR，其中该CDR相互独立地在以下所示的CDR中选择：
-SEQ ID NO:2中起始于45位并结束于54位的序列；
-SEQ ID NO:2中起始于66位并结束于87位的序列；
-SEQ ID NO:2中起始于117位并结束于126位的序列；
或
(ii)2个，且甚至更优选3个CDR，其中该CDR相互独立地在以下所示的CDR中选择：
-SEQ ID NO:4中起始于44位并结束于56位的序列；
-SEQ ID NO:4中起始于66位并结束于76位的序列；
-SEQ ID NO:4中起始于109位并结束于117位的序列。
根据一个实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含：(i)至少一个含有SEQ ID NO:11、12或13中任一个所示的氨基酸序列的CDR；或(ii)至少一个含有SEQ ID NO:14、15或16中任一个所示的氨基酸序列的CDR。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含至少一个含有SEQ ID NO:11、12、13、14、15或16中任一个所示的氨基酸序列的CDR。
根据优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含2、3、4、5个和甚至更优选6个含有SEQ ID NO:11、12、13、14、15或16中任一个所示的氨基酸序列的CDR。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含(i)至少一个SEQ ID NO:11、12或13中任一个所示的CDR；或(ii)至少一个SEQ ID NO:14、15或16中任一个所示的CDR。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含至少一个SEQ ID NO:11、12、13、14、15或16中任一个所示的CDR。
根据一个优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含2、3、4、5个和甚至更优选6个SEQ ID NO:11、12、13、14、15或16中任一个所示的CDR。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含(i)至少一个含有SEQ ID NO:17、18或19中任一个所示的氨基酸序列的CDR；或(ii)至少一个含有SEQ ID NO:20、21或22中任一个所示的氨基酸序列的CDR。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含至少一个含有SEQ ID NO:17、18、19、20、21或22中任一个所示的氨基酸序列的CDR。
根据一个优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含2、3、4、5个和甚至更优选6个含有SEQID NO:17、18、19、20、21或22中任一个所示的氨基酸序列的CDR。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含(i)至少一个SEQ ID NO:17、18或19中任一个所示的CDR；或(ii)至少一个SEQ ID NO:20、21或22中任一个所示的CDR。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含至少一个SEQ ID NO:17、18、19、20、21或22中任一个所示的CDR。
根据一个优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含2、3、4、5个和甚至更优选6个SEQ ID NO:17、18、19、20、21或22中任一个所示的CDR。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含(i)至少一个含有SEQ ID NO:23、24或25中任一个所示的氨基酸序列的CDR；或(ii)至少一个含有SEQ ID NO:26、27或28中任一个所示的氨基酸序列的CDR。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含至少一个含有SEQ ID NO:23、24、25、26、27或28中任一个所示的氨基酸序列的CDR。
根据一个优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含2、3、4、5个和甚至更优选6个含有SEQID NO:23、24、25、26、27或28中任一个所示的氨基酸序列的CDR。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含(i)至少一个SEQ ID NO:23、24或25中任一个所示的CDR；或(ii)至少一个SEQ ID NO:26、27或28中任一个所示的CDR。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含至少一个SEQ ID NO:23、24、25、26、27或28中任一个所示的CDR。
根据一个优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含2、3、4、5个和甚至更优选6个SEQ ID NO:23、24、25、26、27或28中任一个所示的CDR。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含可变区，其中该可变区含有以下所示的CDR：
-SEQ ID NO:2中起始于45位并结束于54位的序列；
-SEQ ID NO:2中起始于66位并结束于87位的序列；和
-SEQ ID NO:2中起始于117位并结束于126位的序列。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含可变区，其中该可变区含有以下所示的CDR：
-SEQ ID NO:4中起始于44位并结束于56位的序列；
-SEQ ID NO:4中起始于66位并结束于76位的序列；和
-SEQ ID NO:4中起始于109位并结束于117位的序列。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含可变区，其中该可变区含有SEQ ID NO:11、12和13所示的三个CDR。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含可变区，其中该可变区含有SEQ ID NO:14、15和16所示的三个CDR。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含可变区，其中该可变区含有SEQ ID NO:17、18和19所示的三个CDR。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含可变区，其中该可变区含有SEQ ID NO:20、21和22所示的三个CDR。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含可变区，其中该可变区含有SEQ ID NO:23、24和25所示的三个CDR。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，更具体而言，结合人CSF-1R，且包含可变区，其中该可变区含有SEQ ID NO:26、27和28所示的三个CDR。
在优选实施方案中，该可变区进一步包含一个，更优选两个，甚至更优选三个，且明确优选四个构架区，且更优选人FR。本文所用的“人FR”是与天然存在的人抗体的构架区至少75％同源的构架区。
根据一个优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且包含可变区，其中该可变区含有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且包含可变区，其中该可变区如SEQ ID NO:6所示。
根据另一优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且包含可变区，其中该可变区含有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在另一更优选的实施方案中，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且包含可变区，其中该可变区如SEQ ID NO:9所示。
在另一实施方案中，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且包含两个可变区，其中该可变区相互独立地在以下中选择：
(i)含有以下所示的CDR的可变区：
-SEQ ID NO:2中起始于45位并结束于54位的序列；
-SEQ ID NO:2中起始于66位并结束于87位的序列；和
-SEQ ID NO:2中起始于117位并结束于126位的序列；
(ii)含有以下所示的CDR的可变区：
-SEQ ID NO:4中起始于44位并结束于56位的序列；
-SEQ ID NO:4中起始于66位并结束于76位的序列；和
-SEQ ID NO:4中起始于109位并结束于117位的序列；
(iii)含有SEQ ID NO:11、12和13所示的三个CDR的可变区；
(iv)含有SEQ ID NO:14、15和16所示的三个CDR的可变区；
(v)含有SEQ ID NO:17、18和19所示的三个CDR的可变区；
(vi)含有SEQ ID NO:20、21和22所示的三个CDR的可变区；
(vii)含有SEQ ID NO:23、24和25所示的三个CDR的可变区；
和
(viii)含有SEQ ID NO:26、27和28所示的三个CDR的可变区。
根据优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且包含：
(i)第一可变区，其中该第一可变区含有：
-SEQ ID NO:2中起始于45位并结束于54位的序列所示的CDR；
-SEQ ID NO:2中起始于66位并结束于87位的序列所示的CDR；和
-SEQ ID NO:2中起始于117位并结束于126位的序列所示的CDR；
和
(ii)第二可变区，其中该第二可变区含有：
-SEQ ID NO:4中起始于44位并结束于56位的序列所示的CDR；
-SEQ ID NO:4中起始于66位并结束于76位的序列所示的CDR；和
-SEQ ID NO:4中起始于109位并结束于117位的序列所示的CDR。
根据优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且包含：
-含有SEQ ID NO:11、12和13所示的三个CDR的可变区；和
-含有SEQ ID NO:14、15和16所示的三个CDR的可变区。
根据优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且包含：
-含有SEQ ID NO:17、18和19所示的三个CDR的可变区；和
-含有SEQ ID NO:20、21和22所示的三个CDR的可变区。
根据优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且包含：
-含有SEQ ID NO:23、24和25所示的三个CDR的可变区；和
-含有SEQ ID NO:26、27和28所示的三个CDR的可变区。
根据优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且包含：
-SEQ ID NO:6所示的可变区；和
-SEQ ID NO:9所示的可变区。
根据优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且包含：
(i)含有以下的重链可变区：
-SEQ ID NO:2中起始于45位并结束于54位的序列所示的CDR；
-SEQ ID NO:2中起始于66位并结束于87位的序列所示的CDR；和
-SEQ ID NO:2中起始于117位并结束于126位的序列所示的CDR；
和
(ii)含有以下的轻链可变区：
-SEQ ID NO:4中起始于44位并结束于56位的序列所示的CDR；
-SEQ ID NO:4中起始于66位并结束于76位的序列所示的CDR；和
-SEQ ID NO:4中起始于109位并结束于117位的序列所示的CDR。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且包含(i)含有SEQ ID NO:11、12和13所示的三个CDR的重链可变区；和(ii)含有SEQ ID NO:14、15和16所示的三个CDR的轻链可变区。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且包含(i)含有SEQ ID NO:17、18和19所示的三个CDR的重链可变区；和(ii)含有SEQ ID NO:20、21和22所示的三个CDR的轻链可变区。
根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且包含(i)含有SEQ ID NO:23、24和25所示的三个CDR的重链可变区；和(ii)含有SEQ ID NO:26、27和28所示的三个CDR的轻链可变区。
根据优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且包含(i)SEQ ID NO:6所示的重链可变区；和(ii)SEQ ID NO:9所示的轻链可变区。
根据另一优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且是scFv，其中该scFv包含：
(i)含有以下的可变区：
-SEQ ID NO:2中起始于45位并结束于54位的序列所示的CDR；
-SEQ ID NO:2中起始于66位并结束于87位的序列所示的CDR；和
-SEQ ID NO:2中起始于117位并结束于126位的序列所示的CDR；
和
(ii)含有以下的可变区：
-SEQ ID NO:4中起始于44位并结束于56位的序列所示的CDR；
-SEQ ID NO:4中起始于66位并结束于76位的序列所示的CDR；和
-SEQ ID NO:4中起始于109位并结束于117位的序列所示的CDR。
根据另一优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且是scFv，其中该scFv包含：
-含有SEQ ID NO:11、12和13所示的三个CDR的可变区；和
-含有SEQ ID NO:14、15和16所示的三个CDR的可变区。
根据另一优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且是scFv，其中该scFv包含：
-含有SEQ ID NO:17、18和19所示的三个CDR的可变区；和
-含有SEQ ID NO:20、21和22所示的三个CDR的可变区。
根据另一优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且是scFv，其中该scFv包含：
-含有SEQ ID NO:23、24和25所示的三个CDR的可变区；和
-含有SEQ ID NO:26、27和28所示的三个CDR的可变区。
根据更优选的实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且是scFv，其中该scFv包含：
-SEQ ID NO:6所示的可变区；和
-SEQ ID NO:9所示的可变区。
根据另一优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且是scFv，其中该scFv包含：
(i)含有以下的重链可变区：
-SEQ ID NO:2中起始于45位并结束于54位的序列所示的CDR；
-SEQ ID NO:2中起始于66位并结束于87位的序列所示的CDR；和
-SEQ ID NO:2中起始于117位并结束于126位的序列所示的CDR；
和
(ii)含有以下的轻链可变区：
-SEQ ID NO:4中起始于44位并结束于56位的序列所示的CDR；
-SEQ ID NO:4中起始于66位并结束于76位的序列所示的CDR；和
-SEQ ID NO:4中起始于109位并结束于117位的序列所示的CDR。
根据另一优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且是scFv，其中该scFv包含：
-含有SEQ ID NO:11、12和13所示的三个CDR的重链可变区；和
-含有SEQ ID NO:14、15和16所示的三个CDR的轻链可变区。
根据另一优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且是scFv，其中该scFv包含：
-含有SEQ ID NO:17、18和19所示的三个CDR的重链可变区；和
-含有SEQ ID NO:20、21和22所示的三个CDR的轻链可变区。
根据另一优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且是scFv，其中该scFv包含：
-含有SEQ ID NO:23、24和25所示的三个CDR的重链可变区；和
-含有SEQ ID NO:26、27和28所示的三个CDR的轻链可变区。
根据更优选的实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且是scFv，其中该scFv包含：
-SEQ ID NO:6所示的重链可变区；和
-SEQ ID NO:9所示的轻链可变区。
在甚至更优选的实施方案中，提供scFv，其中在SEQ ID NO6和9所示的氨基酸序列内取代(按照表1和表2)至少一个氨基酸。在明确优选的实施方案中，提供人抗体，其中在SEQ ID NO6和9所示的氨基酸序列内取代(按照表1和表2)表1和表2中所示的所有氨基酸。
根据另一优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且包含SEQ ID NO:2所示的重链。
根据另一优选实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且包含SEQ ID NO:4所示的轻链。
根据更优选的实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且包含SEQ ID NO:2所示的重链和SEQ ID NO:4所示的轻链。
根据甚至更优选的实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且包含两条SEQ ID NO:2所示的重链和两条SEQ ID NO:4所示的轻链。此具体的抗体将在本申请通篇中命名为CXIIG6。
根据另一优选实施方案，本发明涉及特异性结合CSF-1R的人抗体，其包含：
(i)含有以下的重链可变区：
-SEQ ID NO:2中起始于45位并结束于54位的序列所示的CDR；
-SEQ ID NO:2中起始于66位并结束于87位的序列所示的CDR；和
-SEQ ID NO:2中起始于117位并结束于126位的序列所示的CDR；
和
(ii)含有以下的轻链可变区：
-SEQ ID NO:4中起始于44位并结束于56位的序列所示的CDR；
-SEQ ID NO:4中起始于66位并结束于76位的序列所示的CDR；和
-SEQ ID NO:4中起始于109位并结束于117位的序列所示的CDR。
根据另一实施方案，本发明涉及特异性结合CSF-1R的人抗体，其包含：
-含有SEQ ID NO:11、12和13所示的三个CDR的重链可变区；和
-含有SEQ ID NO:14、15和16所示的三个CDR的轻链可变区。
根据另一实施方案，本发明涉及特异性结合CSF-1R的人抗体，其包含：
-含有SEQ ID NO:17、18和19所示的三个CDR的重链可变区；和
-含有SEQ ID NO:20、21和22所示的三个CDR的轻链可变区。
根据另一实施方案，本发明涉及特异性结合CSF-1R的人抗体，其包含：
-含有SEQ ID NO:23、24和25所示的三个CDR的重链可变区；和
-含有SEQ ID NO:26、27和28所示的三个CDR的轻链可变区。
根据优选实施方案，本发明涉及特异性结合CSF-1R的人抗体，其包含：
-SEQ ID NO:6所示的重链可变区；和
-SEQ ID NO:9所示的轻链可变区。
在更优选的实施方案中，提供人抗体，其中在SEQ ID NO:6和9所示的氨基酸序列内取代(按照表1和表2)至少一个氨基酸。在甚至更优选的实施方案中，提供人抗体，其中在SEQ ID NO:6和9所示的氨基酸序列内取代(按照表1和表2)表1和表2中所示的所有氨基酸。
表1
表2
根据另一实施方案，本发明涉及特异性结合CSF-1R、更优选特异性结合人CSF-1R的分离的、重组的或纯化的抗体，其包含：
(a)通过下式定义的第一可变区
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中：
FR1、FR2、FR3和FR4各为构架区；
CDR1、CDR2和CDR3各为互补决定区；
其中：
CDR1具有SEQ ID NO:2中起始于45位并结束于54位的序列中的至少五个连续氨基酸；
CDR2具有SEQ ID NO:2中起始于66位并结束于87位的序列中的至少五个连续氨基酸；和
CDR3具有SEQ ID NO:2中起始于117位并结束于126位的序列中的至少五个连续氨基酸；
和
(b)通过下式定义的第二可变区
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中：
FR1、FR2、FR3和FR4各为构架区；
CDR1、CDR2和CDR3各为互补决定区；
其中：
CDR1具有SEQ ID NO:4中起始于44位并结束于56位的序列中的至少五个连续氨基酸；
CDR2具有SEQ ID NO:4中起始于66位并结束于76位的序列中的至少五个连续氨基酸；和
CDR3具有SEQ ID NO:4中起始于109位并结束于117位的序列中的至少五个连续氨基酸。
根据另一实施方案，本发明涉及特异性结合CSF-1R的分离的、重组的或纯化的抗体，其包含：
(a)通过下式定义的第一可变区
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中：
FR1、FR2、FR3和FR4各为构架区；
CDR1、CDR2和CDR3各为互补决定区；
其中：
CDR1具有选自SEQ ID NO:11、17和23的氨基酸序列；
CDR2具有选自SEQ ID NO:12、18和24的氨基酸序列；和
CDR3具有选自SEQ ID NO:13、19和25的氨基酸序列；
和
(b)通过下式定义的第二可变区
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中：
FR1、FR2、FR3和FR4各为构架区；
CDR1、CDR2和CDR3各为互补决定区；
其中：
CDR1具有选自SEQ ID NO:14、20和26的氨基酸序列；
CDR2具有选自SEQ ID NO:15、21和27的氨基酸序列；和
CDR3具有选自SEQ ID NO:16、22和28的氨基酸序列。
根据另一实施方案，本发明涉及特异性结合CSF-1R、更优选特异性结合人CSF-1R的分离的、重组的或纯化的抗体，其包含以下(i)、(ii)或(iii)中的任一个：
(i)(a)通过下式定义的第一可变区
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中：
FR1、FR2、FR3和FR4各为构架区；
CDR1、CDR2和CDR3各为互补决定区；
其中：
CDR1如SEQ ID NO:11所示；
CDR2如SEQ ID NO:12所示；和
CDR3如SEQ ID NO:13所示；
和
(b)通过下式定义的第二可变区
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中：
FR1、FR2、FR3和FR4各为构架区；
CDR1、CDR2和CDR3各为互补决定区；
其中：
CDR1如SEQ ID NO:14所示；
CDR2如SEQ ID NO:15所示；和
CDR3如SEQ ID NO:16所示；
或
(ii)(a)通过下式定义的第一可变区
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中：
FR1、FR2、FR3和FR4各为构架区；
CDR1、CDR2和CDR3各为互补决定区；
其中：
CDR1如SEQ ID NO:17所示；
CDR2如SEQ ID NO:18所示；和
CDR3如SEQ ID NO:19所示；
和
(b)通过下式定义的第二可变区
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中：
FR1、FR2、FR3和FR4各为构架区；
CDR1、CDR2和CDR3各为互补决定区；
其中：
CDR1如SEQ ID NO:20所示；
CDR2如SEQ ID NO:21所示；和
CDR3如SEQ ID NO:22所示；
或
(iii)(a)通过下式定义的第一可变区
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中：
FR1、FR2、FR3和FR4各为构架区；
CDR1、CDR2和CDR3各为互补决定区；
其中：
CDR1如SEQ ID NO:23所示；
CDR2如SEQ ID NO:24所示；和
CDR3如SEQ ID NO:25所示；
和
(b)通过下式定义的第二可变区
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中：
FR1、FR2、FR3和FR4各为构架区；
CDR1、CDR2和CDR3各为互补决定区；
其中：
CDR1如SEQ ID NO:26所示；
CDR2如SEQ ID NO:27所示；和
CDR3如SEQ ID NO:28所示。
根据另一实施方案，本发明涉及特异性结合CSF-1R、更优选特异性结合人CSF-1R的分离的、重组的或纯化的抗体，其包含：
-含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的第一可变区；和
-含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的第二可变区。
根据另一实施方案，本发明涉及特异性结合CSF-1R、更优选特异性结合人CSF-1R的分离的、重组的或纯化的抗体，其包含：
-含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的第一可变区；和
-含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的第二可变区。
根据另一实施方案，本发明涉及特异性结合CSF-1R、更优选特异性结合人CSF-1R的分离的、重组的或纯化的抗体，其包含：
-选自SEQ ID NO:37(见图32)和SEQ ID NO:38的重链；和
-选自SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41的轻链。
根据另一实施方案，本发明涉及特异性结合CSF-1R、更优选特异性结合人CSF-1R的分离的、重组的或纯化的抗体，其包含：
-选自SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43的第一可变区；和
-选自SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的第二可变区。
根据一个优选实施方案，本发明涉及特异性结合CSF-1R、更优选特异性结合人CSF-1R的分离的、重组的或纯化的抗体，其包含(a)存在于SEQ ID NO:37中的重链和(b)存在于SEQ ID NO:39中的轻链。
根据另一优选实施方案，本发明涉及特异性结合CSF-1R、更优选特异性结合人CSF-1R的分离的、重组的或纯化的抗体，其包含(a)存在于SEQ ID NO:38中的重链和(b)存在于SEQ ID NO:40中的轻链。
根据一个有利的实施方案，本发明涉及特异性结合CSF-1R、更优选特异性结合人CSF-1R的分离的、重组的或纯化的抗体，其包含(a)存在于SEQ ID NO:37中的重链和(b)存在于SEQ ID NO:41中的轻链。
根据一个优选实施方案，本发明涉及特异性结合CSF-1R、更优选特异性结合人CSF-1R的分离的、重组的或纯化的抗体，其包含(a)存在于SEQ ID NO:42中的第一可变区和(b)存在于SEQ ID NO:44中的第二可变区。
根据另一优选实施方案，本发明涉及特异性结合CSF-1R、更优选特异性结合人CSF-1R的分离的、重组的或纯化的抗体，其包含(a)存在于SEQ ID NO:43中的第一可变区和(b)存在于SEQ ID NO:45中的第二可变区。
根据一个有利的实施方案，本发明涉及特异性结合CSF-1R、更优选特异性结合人CSF-1R的分离的、重组的或纯化的抗体，其包含(a)存在于SEQ ID NO:42中的第一可变区和(b)存在于SEQ ID NO:46中的第二可变区。
本发明的抗体，更具体而言，本发明的人抗体可以属于不同的同种型，如IgG、IgA、IgM或IgE。在优选实施方案中，本发明的抗体，更具体而言，本发明的人抗体是IgG。
在相关实施方案中，该人抗体包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的修饰或未修饰的恒定区。在优选实施方案中，该恒定区是可以可选地修饰来增强或减弱某些特性的人IgG1或IgG4。
在IgG1的情况下，对恒定区，尤其是铰链区或CH2区的修饰可以增加或减少效应子功能，包括ADCC和/或CDC活性。在其他实施方案中，修饰IgG2恒定区来减少抗体-抗原聚集体形成。在IgG4的情况下，对恒定区，尤其是铰链区的修饰可以减少半抗体的形成。
即使突变抗体中的一个或多个氨基酸，也可以保留希望的结合亲和力。这些变体的至少一个抗体中的氨基酸被不同的残基取代。根据另一实施方案，本发明提供上述特异性结合CSF1的抗体，其中保守取代至少一个包含在一个或多个CDR中的氨基酸。表3中显示保守取代。
表3
本发明还涉及通过亲和力成熟来修饰本发明的抗体的方法。
本文所用的“亲和力成熟”指取代包含在一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸，与不具有那些取代的亲本抗体相比，该取代导致抗体对CSF-1R的亲和力的改善。亲和力成熟方法为本领域已知。见例如公开于MARKS等By-passing immunization:building high affinity humanantibodies by chain shuffling.Biotechnology.1992,第10卷,第7期,第779-83页；BARBAS等In vitro evolution of a neutralizing human antibodyto human immunodeficiency virus type1to enhance affinity and broadenstrain cross-reactivity.Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America.1994,第91卷,第9期,第3809-13页；SCHIER.Identification of functional and structural amino-acid residuesby parsimonious mutagenesis.Gene.1996,第169卷,第2期,第147-55页；YELTON.Affinity maturation of the BR96anti-carcinoma antibody bycodon-based mutagenesis.J.immunol..1995,第155卷,第4期,第1994-2004页；JACKSON等In vitro antibody maturation.Improvement ofa high affinity,neutralizing antibody against IL-1beta.J.immunol..1995,第154卷,第7期,第3310-9页；及HAWKINS等Selection of phageantibodies by binding affinity.Mimicking affinity maturation.Journal ofmolecular biology.1992,第226卷,第3期,第889-96页中的方法。
本发明还涉及通过前述亲和力成熟获得的特异性结合CSF-1R的抗体。
在另一实施方案中，本发明提供前述抗体的变体，其具有与前述抗体的氨基酸序列至少80％、优选至少85％、更优选至少90％和甚至更优选至少98％同源的氨基酸序列。
在另一实施方案中，本发明的抗体特异性结合一个以上表位。例如，本发明的抗体可以结合CSF-1R的两个不同表位。备选地，本发明的抗体可以能够结合CSF-1R和另一分子。本文所用的特异性结合一个以上表位的抗体可以是交联的抗体。例如，一种抗体可以与抗生物素蛋白偶联，另一种抗体与生物素偶联。可以用本领域公知的任意方便的交联方法来制备交联的抗体。还已描述了用于从抗体片段产生双特异性抗体的技术，见例如BRENNAN等Preparation of bispecific antibodies by chemicalrecombination of monoclonal immunoglobulin G1fragments.Science.1985,第229卷,第4708期,第81-3页；SHALABY等Development ofhumanized bispecific antibodies reactive with cytotoxic lymphocytes andtumor cells overexpressing the HER2protooncogene.The Journal ofexperimental medicine.1992,第175卷,第1期,第217-25页；KOSTELNY等Formation of a bispecific antibo dy by the use of leucine zippers.J.immunol..1992,第148卷,第5期,第1547-33页。
根据优选实施方案，本发明的特异性结合一个以上表位的抗体是双抗体。
根据另一优选实施方案，本发明的特异性结合一个以上表位的抗体是ZAPATA等Engineering linear F(ab')2fragments for efficient productionin Escherichia coli and enhanced antiproliferative activity.Proteinengineering.1995,第8卷,第10期,第1057-62页中所述的线性抗体。
在优选实施方案中，本发明的抗体特异性结合定位在SEQ ID N0:29的20至41位氨基酸之间(即人结构域D1的N端部分)的至少一个表位。在优选实施方案中，本发明的抗体结合定位在SEQ ID N0:29的20至41位氨基酸之间(即人结构域D1的N端部分)的一个表位，且不结合定位在SEQ ID N0:29的42至90位氨基酸之间和/或91至104位氨基酸之间和/或105至199位氨基酸之间和/或200至298位氨基酸之间的任意表位。根据优选实施方案，本发明的抗体能够识别定位在SEQ ID N0:29的20至41位氨基酸之间(即人结构域D1的N端部分)的最小表位。根据有利的实施方案，本发明的抗体能够识别和结合构建体pTG18016(见图19和相关实施例)。
在优选实施方案中，本发明的抗体不与IL-34配体竞争结合CSF-1R受体。本文所用的术语“不与IL-34配体竞争”指IL34配体与它的受体CSF-1R结合无抑制。
在优选实施方案中，本发明的抗体与CSF-1配体部分竞争结合CSF-1R受体。本文所用的术语“与CSF-1配体部分竞争”指CSF-1配体与它的受体CSF-1R结合的抑制，其小于100％，优选小于50％，且甚至更优选小于20％，且有利地小于10％。此部分抑制剂只减少但不完全排除配体结合，该抑制称为部分抑制。
在优选实施方案中，本发明的抗体能够部分阻止CSF1与它的受体CSF-1R的结合，且不能完全抑制该结合。更具体而言，本发明的抗体能够使CSF-1与CSF-1R的结合减少约5％至10％。根据特殊实施方案，通过测量具有从SEQ ID NO:29的Ile20延伸至Glu512的氨基酸序列的受体CSF-1R上的CSF-1(具有从SEQ ID:47的1位延伸至444位的氨基酸序列——见图21)结合，按本实验部分中所述测量该结合减少。
在优选实施方案中，本发明的抗体表征为与CSF1-R的高亲和力结合。更具体而言，本发明的抗体具有小于1nM、优选小于0.8nM和更优选小于0.6nM的Ki。由于这种意外的高亲和力，可以以更小的量施用本发明的抗体，从而消除可能的副作用。
在具体实施方案中，本发明的抗体是拮抗剂抗体，其部分或完全阻断或抑制它特异性结合或优选结合的多肽或细胞(即表达CSF1-R的细胞，更优选表达CSF1-R的人细胞，且有利地是表达CSF1-R的人癌细胞)的生物学活性。
根据本发明的具体实施方案，本发明的抗体具有至少一种以下有利特性：
-体外测试：本发明的抗体不与IL-34配体竞争结合CSF-1R受体；
-体外测试：本发明的抗体与CSF-1配体部分竞争结合CSF-1R受体；
-ADCC测试：在正常人外周血单核细胞的存在下，本发明的抗体对表达CSF1-R的人细胞，尤其是表达CSF1-R的人癌细胞发挥抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)；
-体内测试：本发明的抗体对具有表达CSF1-R的人癌细胞的非人动物发挥抗肿瘤作用；
-体内测试：本发明的抗体对具有表达CSF1-R的人癌细胞的动物(包括人)发挥抗肿瘤作用；
-体内测试：本发明的抗体抑制AML5细胞的CSF-1依赖性增殖；
-体内测试：本发明的抗体部分抑制CSF-1R的CSF-1依赖性磷酸化；
-体内测试：本发明的抗体对CSF-1R无直接的激动活性。
本发明的抗体可以是糖基化的或非糖基化的。
本文所用的术语“糖基化”指共价附着于抗体的糖类单位的存在。
在另一实施方案中，本发明的抗体与辐射敏化剂、受体和/或细胞毒剂缀合。
本文所用的术语“辐射敏化剂”指使细胞对放射治疗更敏感的分子。辐射敏化剂包括但不限于甲硝唑、醚醇硝唑、去甲基醚醇硝唑、哌莫硝唑、依他硝唑、尼莫唑、丝裂霉素C、RSU1069、SR4233、E09、RB6145、烟酰胺、5-溴脱氧尿苷(BUdR)、5-碘脱氧尿苷(IUdR)、溴代脱氧胞苷、氟代脱氧尿苷(FUdR)、羟基脲和顺铂。
本文所用的术语“受体”指能够特异性结合配体的化合物。根据本发明的优选实施方案，该受体是生物素。
本文所用的术语细胞毒剂指直接对细胞具有毒性，阻止其增殖或生长的化合物。根据优选实施方案，在本发明的背景中使用的细胞毒剂选自癌治疗剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的具有酶活性的毒素，或其片段)或放射性同位素。
在另一实施方案中，本发明的抗体与标记剂缀合。
本文所用“标记剂”指可检测的化合物。标记剂可以是本身可检测(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物的化学修饰。
本文所用的术语“缀合”意指本发明的抗体和标记剂共价或非共价连接。
“共价连接”指通过反应官能团偶联，可选地中间使用交联剂或其他活化剂(见例如HERMANSON.Bioconjugate techniques.Academic印制,1996)。可以修饰本发明的抗体和/或缀合剂，以允许通过例如活化的羰基(包括原位活化的那些)上或亚氨酸酯上的取代；通过不饱和羰基上的加成；通过饱和碳原子上或杂原子上的还原性氨基化、亲核取代；通过芳环上的反应来偶联它们。具体而言，可以用同双功能或异双功能交联剂进行偶联。可以用包括戊二醛、琥珀酸及如DMS(二甲基辛二亚氨酸酯)的双亚氨酸酯的同双功能交联剂来偶联可以存在于多种部分上的胺基。许多实例在本领域技术人员公知的HERMANSON.Bioconjugate techniques.Academic印制,1996.第118-228页中给出。异双功能交联剂包括具有胺反应基和巯基反应基、羰基反应基和巯基反应基及巯基反应基和光反应接头的那些。适宜的异双功能交联剂例如描述于HERMANSON.Bioconjugatetechniques.Academic印制,1996.第229-285页中。实例是例如SPDP(3-(2-吡啶二硫基)丙酸-N-琥珀酰亚胺酯)、SMBP(4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸-琥珀酰亚胺酯)、SMPT(琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶二硫基)甲苯)、MBS(间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、SIAB((4-碘乙酰)氨基苯甲酸-N-琥珀酰亚胺酯)、GMBS(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯)、SIAX(6-碘乙酰氨基己糖酸-琥珀酰亚胺酯)、SIAC(琥珀酰亚胺基-4-碘乙酰氨基甲基)、NPIA(对-硝基苯基碘乙酸酯)。其他实例用于将含有糖类的分子(例如env糖蛋白、抗体)与巯基反应基偶联。实例包括MPBH(4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼)和PDPH(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-酰肼(M2C2H和3-2(2-吡啶二硫基)proprionyl酰肼)。
根据另一实施方案，本发明涉及编码本发明的抗体的核酸序列。
术语“核酸序列”指核苷酸的线性序列。核苷酸是多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸的线性序列，或二者的混合物。在本发明的背景中，多核苷酸的实例包括单链和双链DNA、单链和双链RNA及具有单链和双链DNA和RNA的混合物二者的杂合分子。此外，本发明的多核苷酸可以具有一个或多个修饰核苷酸。
根据本发明的优选实施方案，本发明的核酸序列包含在载体中。
载体可以具有质粒或病毒来源，且可以根据需要与改善载体的转染效率和/或稳定性的一种或多种物质组合。这些物质广泛记载在技术人员可获得的文献中(见例如FELGNER等Cationic liposome mediatedtransfection.Proceedings of the Western Pharmacology Society.1989,第32卷,第115-21页.；HODGSON等Virosomes:cationic liposomes enhanceretroviral transduction.Nature biotechnology.1996,第14卷,第3期,第339-42页.；REMY等Gene transfer with a series of lipophilicDNA-binding molecules.Bioconjugate chemistry.1994,第5卷,第6期,第647-54页.)。作为非限制性说明，该物质可以是聚合物、脂质、尤其是阳离子脂质、脂质体、核蛋白或中性脂质。这些物质可以单独或组合使用。可以设想的组合是与阳离子脂质(DOGS、DC-CHOL、精胺-chol、亚精胺-chol等)、溶血磷脂(例如十六烷基磷酸胆碱)和中性脂质(DOPE)组合的重组质粒载体。
根据优选实施方案，可以用于本发明的阳离子脂质是描述于EP901463中的阳离子脂质，且更优选pcTG90。
可以在本发明的背景内使用的质粒的选择巨大。它们可以是克隆载体和/或表达载体。通常，它们为技术人员已知，虽然它们中的许多可购得，但还可能用遗传操作的技术来构建它们或修饰它们。可以提到的实例是衍生自pBR322(Gibco BRL)、pUC(Gibco BRL)、pBluescript(Stratagene)、pREP4、pCEP4(Invitrogen)或p Poly(LATHE等Plasmid andbacteriophage vectors for excision of intact inserts.Gene.1987,第57卷,第2-3期,第193-201页)的质粒。优选地，在本发明的背景中使用的质粒包含确保在生产细胞和/或宿主细胞中起始复制的复制起点(例如，对于旨在在大肠杆菌中产生的质粒，将选择ColE1起点，如果希望质粒可以在哺乳动物宿主细胞中自复制，则将选择oriP/EBNA1系统；LUPTON等Mapping genetic elements of Epstein-Barr virus that facilitateextrachromosomal persistence of Epstein-Barr virus-derived plasmids inhuman cells.Molecular and cellular biology.1985,第5卷,第10期,第2533-42页；YATES等Stable replication of plasmids derived fromEpstein-Barr virus in various mammalian cells.Nature.1985,第313卷,第6005期,第812-5页)。质粒还可以包含使得能够选择或鉴定转染的细胞的选择基因(营养缺陷型突变的互补、编码对抗生素的抗性的基因等)。当然，质粒可以包含改善其在给定细胞中的保持和/或其稳定性的附加元件(促进质粒以单体形式保持的cer序列(SUMMERS等Multimerization of highcopy number plasmids causes instability:CoIE1encodes a determinantessential for plasmid monomerization and stability.Cell.1984,第36卷,第4期,第1097-103页)、用于整合入细胞基因组的序列)。
就病毒载体而言，可能设想衍生自痘病毒(痘苗病毒，尤其是MVA，金丝雀痘病毒等)、衍生自腺病毒、衍生自反转录病毒、衍生自疱疹病毒、衍生自甲病毒属、衍生自泡沫病毒或衍生自腺病毒相关病毒的载体。可能使用复制型载体或复制缺陷型病毒载体。优选使用不整合的载体。在这方面，腺病毒载体及衍生自痘病毒且优选痘苗病毒和MVA的载体极其适合用于实施本发明。
根据优选实施方案，本发明的病毒载体衍生自修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)。MVA载体及产生这类载体的方法充分描述于欧洲专利EP83286和EP206920以及SUTTER等Nonreplicating vaccinia vector efficientlyexpresses recombinant genes.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A..1992,第89卷,第22期,第10847-51页.中。根据更优选的实施方案，本发明的核酸序列可以插入MVA载体的缺失I、II、III、IV、V和VI中，甚至更优选插入缺失III中(MEYER等Mapping of deletions in the genome of the highlyattenuated vaccinia virus MVA and their influence on virulence.TheJournal of general virology.1991,第72卷,第Pt5期,第1031-8页.；SUTTER等A recombinant vector derived from the host range-restrictedand highly attenuated MVA strain of vaccinia virus stimulates protectiveimmunity in mice to influenza virus.Vaccine.1994,第12卷,第11期,第1032-40页.)。
反转录病毒具有感染并在大多数情况下整合入正在分裂的细胞的特性，这方面尤其适合于与癌症相关的用途。本发明的重组反转录病毒通常包含LTR序列、壳体化区和本发明的核苷酸序列，该核苷酸序列放置在反转录病毒LTR或诸如下文描述的那些的内部启动子的控制之下。重组反转录病毒可以衍生自任意来源(鼠、灵长类、猫、人等)的反转录病毒，尤其是衍生自MoMuLV(莫洛尼鼠白血病病毒)、MVS(鼠肉瘤病毒)或Friend鼠反转录病毒(Fb29)。它在壳体化细胞系中繁殖，该细胞系能够反式提供组成病毒颗粒所需的病毒多肽gag、pol和/或env。这类细胞系描述与文献中(PA317、Psi CRIP GP+Am-12等)。本发明的反转录病毒尤其可以在LTR(用真核启动子取代启动子区)或壳体化区(用异源壳体化区(例如VL3O型)取代)中包含修饰(见US5747323)。
还优选使用腺病毒载体，该腺病毒载体缺乏复制必需且选自E1、E2、E4和L1-L5的至少一个区域的全部或部分，以避免载体在宿主生物或环境内繁殖。优选E1区的缺失。但是，它可以与一个或多个其他修饰/缺失组合，该修饰/缺失尤其是以利用互补细胞系和/或辅助病毒反式互补缺陷的必需功能的程度影响E2、E4和/或L1-L5区的全部或部分。在这方面，可能使用现有技术的第二代载体(见例如国际申请WO94/28152和WO97/04119)。作为说明，E1区和E4转录单位的主要部分的缺失极其有利。为了提高克隆容量的目的，腺病毒载体还可以缺失非必需的E3区的全部或部分。根据另一备选，可能利用最小腺病毒载体，其保留壳体化所必需的序列，即5’和3’ITR(反向末端重复)及壳体化区。已知多种腺病毒载体和用于制备它们的技术(见例如GRAHAM等Methods in molecularbiology.Edited by MURREY.The human press inc,1991.第109-128页.)。
此外，从物种的观点和血清型的观点看，本发明的腺病毒载体的来源可以不同。载体可以衍生自人或动物(犬、鸟类、牛、鼠、绵羊、猪、猿等)来源的腺病毒的基因组，或衍生自包含至少两种不同来源的腺病毒基因组片段的杂种。可以更具体地提到犬来源的CAV-l或CAV-2腺病毒、鸟类来源的DAV腺病毒或牛来源的Bad3型腺病毒(ZAKHARCHUK等Physical mapping and homology studies of egg drop syndrome(EDS-76)adenovirus DNA.Archives of virology.1993,第128卷,第1-2期,第171-6页；SPIBEY等Molecular cloning and restriction endonuclease mapping oftwo strains of canine adenovirus type2.The Journal of general virology.1989,第70卷,第Pt1期,第165-72页.；JOUVENNE等Cloning,physicalmapping and cross-hybridization of the canine adenovirus types 1 and 2genomes.Gene.1987,第60卷,第1期,第21-8页.；MITTAL等Development of a bovine adenovirus type3-based expression vector.TheJournal of general virology.1995,第76卷,第Pt1期,第93-102页.)。但是，将优选人来源的腺病毒载体，其优选衍生自血清型C腺病毒，尤其是2或5型血清型C腺病毒。
本文所用的术语“复制型”指病毒载体能够在缺乏任意反式互补的情况下在宿主细胞中复制。
根据本发明的优选实施方案，该复制型载体是复制型腺病毒载体。这些复制型腺病毒载体为本领域技术人员公知。在这些中，尤其优选缺失如ONYX-015病毒中的编码55kD P53抑制剂的E1b区的腺病毒载体(BISCHOFF等An adenovirus mutant that replicates selectively inp53-deficient human tumor cells.Science.1996,第274卷,第5286期,第373-6页.；He HEISE等An adenovirus E1A mutant that demonstratespotent and selective systemic anti-tumoral efficacy.Nature Medicine.2000,第6卷,第10期,第1134-9页.；WO94/18992)。因此，可以用此病毒来选择性地感染和杀死p53缺陷的赘生性细胞。本领域普通技术人员还可以按照已建立的技术来突变和破坏腺病毒5或其他病毒中的p53抑制剂基因。缺失E1A Rb结合区的腺病毒载体也可以用于本发明。例如，Delta24病毒，其是在E1A区中携带24个碱基对缺失的突变体腺病毒(FUEYO等A mutant oncolytic adenovirus targeting the Rb pathway producesanti-glioma effect in vivo.Oncogene.2000,第19卷,第1期,第2-12页.)。Delta24在Rb结合区中具有缺失，且不结合Rb。因此，在正常细胞中，Rb抑制突变体病毒的复制。但是，如果Rb失活，且细胞成为赘生性的，则Delta24不再受抑制。相反，突变体病毒有效复制，并裂解Rb缺陷的细胞。
本发明的腺病毒载体可以通过连接或同源重组(见例如国际申请WO96/17070)在大肠杆菌中体外产生或通过在互补细胞系中的重组产生。
根据本发明的优选实施方案，该载体进一步包含表达本发明的抗体所必需的元件。
表达所必需的元件由使得核酸序列能够转录为RNA和mRNA能够翻译为多肽的所有元件组成。这些元件尤其包括启动子，其可以是可调性启动子或组成性启动子。当然，启动子适于所选择的载体和宿主细胞。可以提到的实例是PGK(磷酸甘油酸激酶)、MT(金属硫蛋白；MCIVOR.Human purine nucleoside phosphorylase and adenosine deaminase:genetransfer into cultured cells and murine hematopoietic stem cells by usingrecombinant amphotropic retroviruses.Molecular and cellular biology.1987,第7卷,第2期,第838-46页.)、α-1抗胰蛋白酶、CFTR、表面活性剂、免疫球蛋白、肌动蛋白(TABIN等Adaptation of a retrovirus as aeukaryotic vector transmitting the herpes simplex virus thymidine kinasegene.Molecular and cellular biology.1982,第2卷,第4期,第426-36页.)和SRα(TAKEBE等SR alpha promoter:an efficient and versatilemammalian cDNA expression system composed of the simian virus 40 earlypromoter and the R-U5segment of human T-cell leukemia virus type 1long terminal repeat.Molecular and cellular biology.1988,第8卷,第1期,第466-72页.)基因的真核启动子；SV40病毒(猿猴病毒)的早期启动子；RSV(劳斯肉瘤病毒)的LTR；HSV-l TK启动子；CMV病毒(巨细胞病毒)的早期启动子；痘苗病毒的p7.5K pH5R、pK1L、p28和p11启动子；嵌合启动子，如p11K7.5；及E1A和MLP腺病毒启动子。启动子还可以是在肿瘤或癌细胞中刺激表达的启动子。尤其可以提到在乳腺癌和前列腺癌中过量表达的MUC-1基因(CHEN等Breast cancer selective geneexpression and therapy mediated by recombinant adenoviruses containingthe DF3/MUC1promoter.The Journal of clinical investigation.1995,第96卷,第6期,第2775-82页.)、在结肠癌中过量表达的CEA(代表癌胚抗原)基因(SCHREWE等Cloning of the complete gene for carcinoembryonicantigen:analysis of its promoter indicates a region conveying celltype-specific expression.Molecular and cellular biology.1990,第10卷,第6期,第2738-48页.)、在黑素瘤中过量表达的酪氨酸酶基因(VILE等Useof tissue-specific expression of the herpes simplex virus thymidine kinasegene to inhibit growth of established murine melanomas following directintratumoral injection of DNA.Cancer res..1993,第53卷,第17期,第3860-4页.)、在乳腺癌和胰腺癌中过量表达的ERBB-2基因(HARRIS等Gene therapy for cancer using tumor-specific prodrug activation.Genetherapy.1994,第1卷,第3期,第170-5页.)及在肝癌中过量表达的α-甲胎蛋白基因(KANAI等In vivo gene therapy foralpha-fetoprotein-producing hepatocellular carcinoma byadenovirus-mediated transfer of cytosine deaminase gene.Cancer res..1997,第57卷,第3期,第461-5页.)的启动子。极其优选巨细胞病毒(CMV)早期启动子。
但是，在使用衍生自痘苗病毒的载体(例如MVA载体)时，尤其优选胸苷激酶7.5K基因的启动子和pH5R启动子。
此外，必需元件还可以包括改善本发明的核酸序列在宿主细胞中的表达或其保持的附加元件。尤其可以提到内含子序列、分泌信号序列、核定位序列、IRES型的用于翻译再起始的内部位点、转录终止poly A序列、三联前导序列和复制起点。这些元件为技术人员已知。在分泌信号序列中，尤其优选编码SEQ ID NO5和/或8所示的多肽的序列。
本发明的重组载体还可以包含一个或多个其他目的基因，可能将这些基因放置在相同的调节元件(多顺反子盒)或独立的元件的控制之下。尤其可以提到的基因是编码白细胞介素IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18；趋化因子，如CCL19、CCL20、CCL21、CXCL-14；干扰素；肿瘤坏死因子(TNF)及作用于先天免疫和血管发生的因子(例如PAl-1，其代表纤溶酶原激活物抑制剂)的基因。在一个具体实施方案中，本发明的重组载体包含编码IL-2的目的基因。
本发明还涉及包含本发明的核酸序列的细胞。在优选实施方案中，本发明的细胞是真核细胞，更优选哺乳动物细胞。可用作表达宿主的哺乳动物细胞为本领域公知，且包括许多无限增殖化细胞系，如，但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞等。适宜的其他真核细胞包括酵母和其他真菌。
本发明还涉及用于产生本发明的抗体的方法，其包括在允许表达抗体的条件下培养本发明的细胞，并从细胞或细胞周围的培养基纯化抗体。
在另一实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含本发明抗体、核酸序列或载体中的任一种和可药用载体。在优选实施方案中，该药物组合物进一步包含目的化合物。
可药用载体优选等渗、低渗或弱高渗，且具有相对低的离子强度，例如蔗糖溶液。此外，这种载体可以包含任意溶剂，或水性或部分水性的液体，如无热原无菌水。此外，调节并缓冲药物组合物的pH，以满足体内使用的需要。药物组合物还可以包含可药用稀释剂、佐剂或赋形剂，以及增溶剂、稳定剂和防腐剂。对于注射施用，优选水性、非水性或等渗溶液中的制剂。它可以以液体或干燥(粉末、冻干物等)的形式提供在单剂量中或多剂量中，该干燥形式可以在使用时用适当的稀释剂重构。
本发明还涉及试剂盒，其包含(i)本发明的药物组合物、抗体、核酸序列或载体；及(ii)目的化合物。
本文所用的术语“目的化合物”涉及治疗性化合物，且优选涉及癌治疗剂或用于治疗骨质减少的化合物。
根据优选实施方案，该癌治疗剂选自Abraxane(紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂)、阿霉素(盐酸多柔比星)、阿米色尔(氟尿嘧啶)、艾达乐(咪喹莫特)、阿妥单抗、Alimta(培美曲塞二钠)、氨基乙酰丙酸、阿那司唑、阿瑞吡坦、瑞宁得(阿那司唑)、阿诺新(依西美坦)、Arranon(奈拉滨)、三氧化二砷、阿伐他汀(贝伐单抗)、阿扎胞苷、贝伐单抗、贝沙罗汀、硼替佐米、Campath(阿仑单抗)、伊立替康(盐酸伊立替康)、卡培他滨、卡铂、西妥昔单抗、顺铂、安道生(环磷酰胺)、克罗拉滨、Clofarex(克罗拉滨)、Clolar(克罗拉滨)、环磷酰胺、阿糖胞苷、Cytosar-U(阿糖胞苷)、Cytoxan(环磷酰胺)、Dacogen(地西他滨)、达沙替尼、地西他滨、DepoCyt(脂质体阿糖胞苷)、DepoFoam(脂质体阿糖胞苷)、盐酸右雷佐生、多西紫杉醇、Doxil(盐酸多柔比星脂质体)、盐酸多柔比星、盐酸多柔比星脂质体、Dox-SL(盐酸多柔比星脂质体)、Efudex(氟尿嘧啶)、Ellence(盐酸表柔比星)、Eloxatin(奥沙利铂)、Emend(阿瑞吡坦)、盐酸表柔比星、Erbitux(西妥昔单抗)、盐酸厄洛替尼、Evacet(盐酸多柔比星脂质体)、Evista(盐酸雷洛昔芬)、依西美坦、Faslodex(氟维司群)、Femara(来曲唑)、Fluoroplex(氟尿嘧啶)、氟尿嘧啶、氟维司群、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉妥珠单抗奥唑米星、Gemzar(盐酸吉西他滨)、Gleevec(甲磺酸伊马替尼)、Herceptin(曲妥珠单抗)、Hycamtin(盐酸拓扑替康)、甲磺酸伊马替尼、咪唑莫特、Iressa(吉非替尼)、盐酸伊立替康、伊沙匹隆、Ixempra(伊沙匹隆)、Keoxifene(盐酸雷洛昔芬)、Kepivance(帕立非明)、二甲苯磺酸拉帕替尼、来那度胺、来曲唑、Levulan(氨基乙酰丙酸)、LipoDox(盐酸多柔比星脂质体)、脂质体阿糖胞苷、Methazolastone(替莫唑胺)、氨甲喋呤、Mylosar(阿扎胞苷)、Mylotarg(吉妥珠单抗奥唑米星)、纳米颗粒紫杉醇(紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂)、奈拉滨、Neosar(环磷酰胺)、Nexavar(甲苯磺酸索拉非尼)、尼洛替尼、Nolvadex(柠檬酸他莫昔芬)、Oncaspar(培加帕加司)、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂、帕立非明、帕尼单抗、Paraplat(卡铂)、Paraplatin(卡铂)、培加帕加司、培美曲塞二钠、Platinol-AQ(顺铂)、Platinol(顺铂)、盐酸雷洛昔芬、Revlimid(来那度胺)、Rituxan(利妥昔单抗)、利妥昔单抗、Sclerosol Intrapleural Aerosol(滑石)、甲苯磺酸索拉非尼、Sprycel(达沙替尼)、无菌滑石粉(滑石)、Steritalc(滑石)、苹果酸舒尼替尼、Sutent(苹果酸舒尼替尼)、Synovir(沙立度胺)、滑石、柠檬酸他莫昔芬、Tarabine PFS(阿糖胞苷)、Tarceva(盐酸厄洛替尼)、Targretin(贝沙罗汀)、Tasigna(尼洛替尼)、Taxol(紫杉醇)、Taxotere(多西紫杉醇)、Temodar(替莫唑胺)、替莫唑胺、替西罗莫司、Thalomid(沙立度胺)、沙立度胺、Totect(盐酸右雷佐生)、盐酸拓扑替康、Torisel(替西罗莫司)、曲妥珠单抗、Trisenox(三氧化二砷)、Tykerb(二甲苯磺酸拉帕替尼)、Vectibix(帕尼单抗)、Velcade(硼替佐米)、Vidaza(阿扎胞苷)、Vorinostat、Xeloda(卡培他滨)、Zinecard(盐酸右雷佐生)、佐来膦酸、Zolinza(Vorinostat)和Zometa(佐来膦酸)。
根据本发明的优选实施方案，用于治疗骨质减少的化合物是二膦酸酯、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、甲状旁腺激素(PTH)(例如甲状旁腺激素肽(Forteo))、雷尼酸锶、Denosumab或降钙素或其组合。根据更优选的实施方案，该二膦酸酯选自阿仑膦酸酯(Fosamax、Fosamax PlusD)、依替膦酸酯(Didronel)、伊班膦酸酯(Boniva)、帕米膦酸酯(Aredia)、利塞膦酸酯(Actonel、Actonel W/钙)、替鲁膦酸酯(Skelid)和佐来膦酸(Reclast、Zometa)。根据更优选的实施方案，该SERM选自雷洛昔芬(Evista)、巴多昔芬/结合雌激素(Aprelal)和他莫昔芬。
根据另一实施方案，本发明涉及本发明的抗体、核酸序列、载体、药物组合物或药盒(kit of parts)在治疗与提高的破骨细胞活性相关的疾病中的用途。这种疾病包括但不限于内分泌病(肾上腺皮质功能亢进、性腺机能减退、原发性或继发性甲状旁腺功能亢进、甲状腺功能亢进)、高血钙、营养缺乏状态(佝偻病/骨软化症、维生素C缺乏病、营养不良)、慢性疾病(吸收障碍综合症、慢性肾衰竭(肾性骨营养不良)、慢性肝病(肝性骨营养不良)、药物(糖皮质激素(糖皮质激素诱发的骨质疏松)、雄激素剥夺疗法、芳化酶抑制剂疗法、肝素、醇)和遗传病(成骨不全、高胱氨酸尿))、骨质疏松、骨硬化病、与关节炎和类风湿性关节炎相关的骨炎症、牙周病、纤维性发育不良和/或佩吉特病。
根据另一实施方案，本发明涉及本发明的抗体、核酸序列、载体、药物组合物或药盒在治疗与炎症和/或自身免疫相关的疾病中的用途。这类疾病包括但不限于血清阴性脊椎关节炎(银屑病关节炎、强直性脊柱炎、Reiter综合症、与炎性肠病相关的脊椎关节病)、人工关节松动、结缔组织疾病(幼年型类风湿性关节炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)和狼疮肾炎、硬皮病、Sjogren综合症、混合性结缔组织病、多肌炎、皮肌炎)、炎性肠病(例如局限性肠炎、溃疡性结肠炎)、惠普尔病、与肉芽肿性回肠结肠炎相关的关节炎、炎性皮肤病症(自身免疫性大疱性类天疱疮、自身免疫性寻常性天疱疮、湿疹、皮炎)、炎性肺病(肺泡炎、肺纤维化、结节病、哮喘、支气管炎、梗阻性细支气管炎)、炎性肾病(肾小球肾炎、肾移植排斥、肾小管炎症)、动脉粥样硬化、系统性血管炎(颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、大动脉炎、结节性多动脉炎、川崎病、韦格纳肉芽肿、变应性肉芽肿性血管炎、多发性微小脉管炎、坏死性肾小球肾炎、Henoch-Schonlein紫癜、特发性冷球蛋白血症血管炎和其他小血管血管炎、Behcet病)、巨噬细胞活化疾病(巨噬细胞活化综合症(MAS)、成年型斯蒂尔病、haemophagocytic syndrome)、风湿性多肌痛、原发性胆硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、1型糖尿病、桥本甲状腺炎、突眼性甲状腺肿、多发性硬化(MS)、Guillain-Barre综合症、艾迪生病和/或雷诺现象、肺出血肾炎综合征。
根据另一实施方案，本发明涉及本发明的抗体、核酸序列、载体、药物组合物或试剂盒在治疗癌症中的用途。
本文所用的术语“癌症”指但不限于腺癌、腺泡细胞腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡细胞癌、退行性癌、基底细胞样癌、基底细胞癌、细支气管癌、支气管癌、renaladinol carcinoma、胚胎癌、anometroid carcinoma、fibrolamolar肝细胞癌、滤泡癌、巨细胞癌、肝细胞癌、表皮内癌、上皮内癌、leptomanigio carcinoma、髓样癌、黑素癌、menigual carcinoma、mesometonephric carcinoma、燕麦细胞癌、鳞状细胞癌、汗腺癌、移行细胞癌、管状细胞癌、成釉质细胞肉瘤、血管结石性肉瘤、葡萄状肉瘤、子宫内膜基质肉瘤、尤因肉瘤、梭细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞性肉瘤、成免疫细胞性肉瘤、juxaccordial osteogenic sarcoma、coppices sarcoma、白血病性肉瘤(白血病)、淋巴性肉瘤(淋巴肉瘤)、髓样肉瘤、髓系肉瘤(granulocitic sarcoma)、austiogenci sarcoma、骨膜肉瘤、网状细胞肉瘤(组织细胞型淋巴瘤)、圆细胞肉瘤、梭形细胞肉瘤、滑膜肉瘤、telangiectatic audiogenic sarcoma、伯基特淋巴瘤、NPDL、NML、NH和弥漫性淋巴瘤。根据优选实施方案，本发明的方法针对至骨骼的转移性癌症的治疗，其中该转移性癌症是乳腺癌、肺癌、肾癌、多发性骨髓瘤、甲状腺癌、前列腺癌、腺癌、恶性血细胞癌，包括白血病和淋巴瘤；头颈癌；胃肠癌，包括食管癌、胃癌、结肠癌、肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胰腺癌、肝癌、胆管或胆囊的癌症；雌性生殖道的恶性肿瘤，包括卵巢癌、子宫内膜癌、阴道癌和宫颈癌；膀胱癌；脑癌，包括成神经细胞瘤；肉瘤、骨肉瘤；及皮肤癌，包括恶性黑色素瘤或鳞状细胞癌。
本发明还涉及用于改善正在用癌治疗剂进行化学疗法治疗的癌症患者的治疗的方法，其包括与上文公开的方法一起共同治疗该患者。
本发明还涉及改善细胞毒性药物或放射疗法的细胞毒效果的方法，其包括与上文公开的方法一起共同治疗需要这种治疗的患者。
本发明还涉及用于改善正在用二膦酸酯、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、甲状旁腺激素(PTH)(例如甲状旁腺激素肽(Forteo))、雷尼酸锶、Denosumab或降钙素或其组合治疗的患有与提高的破骨细胞活性相关的疾病的患者的治疗的方法，其包括与上文公开的方法一起共同治疗该患者。
在另一实施方案中，考虑本发明的抗体在制备用于在患有转移性癌症的患者中预防或治疗至骨骼的转移性癌症的药物中的用途。在相关实施方案中，该转移性癌症是乳腺癌、肺癌、肾癌、多发性骨髓瘤、甲状腺癌、前列腺癌、腺癌、恶性血细胞癌，包括白血病和淋巴瘤；头颈癌；胃肠癌，包括食管癌、胃癌、结肠癌、肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胰腺癌、肝癌、胆管或胆囊的癌症；雌性生殖道的恶性肿瘤，包括卵巢癌、子宫内膜癌、阴道癌和宫颈癌；膀胱癌；脑癌，包括成神经细胞瘤；肉瘤、骨肉瘤；及皮肤癌，包括恶性黑色素瘤或鳞状细胞癌。
根据另一实施方案，本发明涉及本发明的抗体、核酸序列、载体、药物组合物或药盒在制备药物中的用途。
根据另一实施方案，本发明涉及本发明的抗体、核酸序列、载体、药物组合物或药盒在制备用于治疗患有癌症的患者的药物中的用途。
根据另一实施方案，本发明涉及本发明的抗体、核酸序列、载体、药物组合物或药盒在制备用于治疗患有与提高的破骨细胞活性相关的疾病的患者的药物中的用途。
根据另一实施方案，本发明涉及本发明的抗体、核酸序列、载体、药物组合物或药盒在制备用于治疗患有炎性疾病、更具体而言患有炎性肠病的患者的药物中的用途。
根据另一实施方案，本发明涉及本发明的抗体、核酸序列、载体、药物组合物或药盒在制备用于治疗患有类风湿性关节炎的患者的药物中的用途。
可以通过技术人员已知的任意手段来达到施用本发明的抗体、核酸序列、载体、药物组合物或药盒。优选的给药途径包括但不限于真皮内、皮下、口服、肠胃外、肌内、鼻内、舌下、气管内、吸入、眼睛、阴道和直肠。根据优选实施方案，全身递送本发明的抗体、核酸序列、载体、药物组合物或药盒。
可以以单剂量或在一定的时间间隔后重复一次至几次的剂量进行施用。优选地，按一周的间隔施用本发明的抗体、核酸序列、载体、药物组合物或药盒1至10次。
对于一般指导，适宜的抗体剂量为约2mg/kg至30mg/kg、0.1mg/kg至30mg/kg或0.1mg/kg至10mg/kg体重。本发明的载体的适宜剂量在约104至1010pfu(蚀斑形成单位)之间，对于MVA，优选从约105至108pfu，而对于基于腺病毒的载体，它从约105至1013iu(感染单位)，优选从约107至1012iu。可以按在10μg和20mg之间，有利地在100μg和2mg之间的剂量施用基于载体质粒的组合物。
在本发明的用途或方法用于治疗癌症时，本发明的方法或用途可以与一种或多种常规治疗模式(例如辐射、化疗和/或手术)结合进行。多种治疗方法的使用为患者提供基础更宽的干预。在一个实施方案中，本发明的方法先于或后于手术干预。在另一实施方案中，它可以先于或后于放疗(例如γ辐射)。本领域技术人员可以容易地制订适当的放射治疗方案及可以使用的参数(见例如PEREZ.Principles and practice of radiation oncology.第二版.LIPPINCOTT,1992)。
附图简述
图1显示mAb CXIIG6特异性染色CSF-1R转染的NIH/3T3细胞。
图2显示在mAb CXIIG6的存在下，CSF-1与细胞表面CSF-1R结合的抑制。
图3显示mAb CXIIG6特异性阻断可溶性人CSF-1R(“ctrl”意指对照；“neg SN”意指阴性对照杂交瘤上清)。
图4显示在mAb CXIIG6的存在下，人破骨细胞分化和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)分泌的抑制(“ctrl”意指对照；“CXIIG6SN”意指CXIIG6杂交瘤上清；“neg SN”意指阴性对照杂交瘤上清)。
图5显示mAb CXIIG6与和CSF-1R具有同源性的其他酪氨酸激酶受体无交叉反应性(“SN”意指杂交瘤上清)。
图6显示CXIIG6重链的核酸序列(SEQ ID NO:1)及推断的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。包括加至核苷酸序列的用于克隆的限制位点的引物序列下划线。限制位点以下划线的斜体字显示。V结构域的氨基酸序列以黑体字突出显示。
图7显示CXIIG6轻链的核酸序列(SEQ ID NO:3)及推断的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。包括加至核苷酸序列的用于克隆的限制位点的引物序列下划线。限制位点以下划线的斜体字显示。V结构域的氨基酸序列以黑体字突出显示。
图8显示质粒构建体pTG17753。
图9显示质粒构建体pTG17727。
图10显示质粒构建体pOptiVECTM。
图11显示质粒构建体pTG17895。
图12显示质粒构建体pTG17812。
图13显示质粒构建体pTG17868。
图14显示质粒构建体pTG17869。
图15显示人源化CXIIG6轻链变体。
图16显示人源化CXIIG6IgG1重链变体。
图17显示重组鼠CXIIG6和嵌合CXIIG6IgG1特异性阻断可溶性人CSF-1R。
图18显示在重组鼠CXIIG6和嵌合CXIIG6IgG1的存在下，人破骨细胞分化和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)分泌的抑制。
图19显示用来定位本发明的单克隆抗体对市售抗-CSF-1R抗体的表位的不同CSF-1R构建体。人序列表示为空心条，鼠序列表示为实心条。名称上划叉的抗体表示它们不结合构建体。
图20显示用来定位表位的不同CSF-1R构建体的Ig样结构域的极限。
图21：EL4-CSF-1R上的125I-H27K15抗体和未标记的H27K15之间的竞争曲线。
图22：EL4-CSF-1R上的125I-H27K15抗体和多种抗体之间的竞争曲线。
图23：后孵育竞争曲线：CSF-1/mAb。
图24：预孵育竞争曲线：mAb/CSF-1。
图25：共孵育竞争曲线：mAB+CSF-1。
图26：共孵育竞争曲线：mAB+CSF-1R。
图27：mAB变体缺乏交叉反应性。
图28：可溶性CSF-1R的阻断。三种hCXIIG6变体和chCXIIG6阻断可溶性人CD115，并恢复M-NFS-60细胞的CSF-1依赖性生长。结果表示为四个重复孔的平均值+/-SEM。用GraphPadPrism五参数逻辑斯谛方程计算ND50值。
图29：A/B/C/D：AML3细胞的CSF-1依赖性增殖的抑制。对于图29A，用抗-人CD115mAN3291(左图)或用chCXIIG6(右图)染色AML5细胞。对于各图，左侧直方图对应于用同位素对照(分别为鼠IgG1和利妥昔单抗)染色的AML5细胞。图29B显示CSF-1以剂量依赖性方式刺激AML5细胞生长。图29C显示hCXIIG6变体和chCXIIG6抑制AML5细胞的CSF-1依赖性增殖，显示来自三次独立实验的结果。图29D包括通过GraphPad Prism从图29C中所示的结果计算的EC50和R2值。
图30A/B：对EL4-CSF-R靶细胞的ADCC活性。在30A中，按25的E:T比用来自血液供体#1的PBMC作为效应细胞来测量H27K5、H27K15和H19K12对EL4-CD115靶细胞的细胞毒活性。在30B中，按所示E:T比在与图30A相同的测定中测试来自供体#2的PBMC。星号(*)表示与利妥昔单抗相比p<0.05，而Φ符号(Φ)表示与chCXIIG6相比p<0.05。
图31A/B：在BeWo绒毛膜癌肿瘤模型中的疗效。
图32：序列SEQ ID NO:37至SEQ ID NO:47的列表。
实施例
mAb CXIIG6特异性染色CSF-1R转染的NIH/3T3细胞
通过用编码全长人CSF-1R的表达质粒稳定转染NIH/3T3细胞来产生B4-800-5细胞系。通过用抗-人CSF-1R mAb61701(小鼠IgG1，R&DSystems)或2-4A5-4(大鼠IgG1,k，GeneTex)间接免疫染色来验证B4-800-5细胞上的细胞表面CSF-1R表达，与同种型对照比较(图1，上图和中图)。用来自杂交瘤CXIIG6或来自阴性对照杂交瘤的培养物上清免疫染色B4-800-5细胞或亲本NIH/3T3细胞(图1，下图)。
流式细胞术分析显示，来自杂交瘤CXIIG6的培养物上清选择性染色B4-800-5细胞，证明mAb对细胞表面CSF-1R的特异性。
CSF-1与细胞表面CSF-1R结合的部分抑制
在存在杂交瘤培养物上清、来自首次用于实验或抗-CSF-1R免疫的小鼠的血清(1:1000稀释)、mAb抗-CSF-1R2-4A5-4(GeneTex)或对照大鼠IgG1(10μg/ml)或无试剂的情况下4℃孵育3x105THP-1细胞(人CSF-1R阳性单核细胞白血病细胞系)30分钟。用冷PBS洗涤两次后，用1μg/ml生物素化重组人CSF-1孵育细胞30分钟。洗涤细胞两次，进一步用10μg/ml链霉抗生物素蛋白-Alexa Fluor488(Invitrogen)4℃孵育30分钟。用PBS洗涤并用4％多聚甲醛固定后，通过流式细胞术来分析细胞染色。
与对照样品相比降低的荧光强度反映CSF-1与细胞表面CSF-1R结合的抑制。来自CSF-1R免疫的小鼠的血清阻断CSF-1与THP-1细胞的结合(图2)。阴性对照杂交瘤上清或不相关的mAb显示无作用，但来自杂交瘤CXIIG6的培养物上清似乎至少部分抑制CSF-1与THP-1细胞的结合(图2，右下图)。
mAb CXIIG6结合部位的首次定位
为了鉴定CSF-1R上的mAb CXIIG6结合部位，用可溶性形式的人CSF-1R进行了Western印迹，该可溶性形式的人CSF-1R包含五个胞外免疫球蛋白样结构域(Met1至Glu512，R&D Systems)，或仅包含CSF-1R胞外区的三个N端免疫球蛋白样结构域(Met1至Ser290)，二者都在其C端与人IgG1的Fc区融合。用可溶性形式的与人IgG1Fc融合的EGFR(R&D Systems)作为阴性对照。
在天然条件下对几百纳克的各可溶性受体进行电泳，然后转移至硝酸纤维素片，并用杂交瘤上清、兔pAb c-fms/CSF-1R H300(Santa CruzBiotechnology)、小鼠mAb61701(R&D Systems)或来自首次用于实验或CSF-1R免疫的小鼠的血清探测。
在用pAb c-fms/CSF-1R H300、mAb61701或来自免疫小鼠的血清探测时，两种可溶性形式的CSF-1R都作为宽条带被检测到。用首次用于实验的小鼠血清或阴性对照杂交瘤上清未观察到可检测的信号。CXIIG6杂交瘤上清识别CSF-1R1-290:Fc以及CSF-1R1-512:Fc，但不识别EGFR:Fc，表明CXIIG6特异性结合处于人CSF-1R的三个N端免疫球蛋白样结构域(残基1至290之间)内的表位。
mAb CXIIG6特异性阻断可溶性人CSF-1R
用CSF-1依赖性鼠髓细胞白血病M-NFS-60细胞系(#CRL-1838，ATCC)来评估CXIIG6杂交瘤上清对人和鼠CSF-1R的阻断活性。用杂交瘤上清、mAb61701(R&D Systems)或鼠同种型对照mAb的系列稀释在白色96孔微量培养板中预孵育五纳克可溶性人CSF-1R(来自R&DSystems的CSF-1R1-512:Fc)。然后将在缺乏CSF-1的情况下过夜培养的10E4M-NFS-60细胞在100μl的最终测定体积中与0.1ng人CSF-1一起加入培养物孔。37℃孵育培养物48小时，通过使用Cell Proliferation ELISA(Roche)的BrdU掺入来定量增殖。
可溶性人CSF-1R完全抑制了人CSF-1介导的M-NFS-60细胞增殖，如包含或不包含阴性对照IgG1的阴性杂交瘤上清的存在所示(图3；3个孔的平均值+/-SEM)。相反，CXIIG6杂交瘤上清和阳性对照mAb61701都能够以剂量依赖性方式恢复细胞增殖，显示它们能够中和可溶性人CSF-1R。
在此测定中，低稀释度CXIIG6杂交瘤上清存在下的活性M-NFS-60细胞增殖显示，mAb CXIIG6不能阻断M-NFS-60细胞表达的鼠CSF-1R。此外，在缺乏可溶性CSF-1R的情况下进行的鼠CSF-1支持的M-NFS-60增殖测定中，用mAb AFS98抗-小鼠CSF-1R(eBioscience)处理导致细胞生长的显著的浓度依赖性减少(数据未显示)。与阴性对照抗体和阴性杂交瘤上清一样，CXIIG6杂交瘤上清未导致细胞增殖的减少。这些结果证明mAb CXIIG6特异性靶向人CSF-1R。
人破骨细胞分化和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)分泌的抑制
破骨细胞产生自通过淘析来自健康血液供体的PMBC获得的人单核细胞。简言之，将单核细胞按每孔2x10E4细胞接种在96孔板中，并用稀释在杂交瘤培养基中的杂交瘤培养物上清、mAb抗-人CSF-1R61701(R&D Systems)或2-4A5-4(GeneTex)、mAb抗-人CSF-126730(R&DSystems)、鼠或大鼠同种型对照、或来自首次用于实验的小鼠及CSF-1R免疫的小鼠的血清处理45分钟。向培养物孔中加入含或不含人CSF-1和RANKL(PeproTech，分别为25和40ng/ml)的完全a-MEM培养基。9天内每3天补充杂交瘤上清、mAb或/和含或不含细胞因子的培养基。在第9天收集条件培养物上清，并用ELISA测定(R&D Systems)测定总的人MMP-9。通过用来自Sigma-Aldrich的白细胞酸性磷酸酶试剂盒染色酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRAP)来评价破骨细胞形成。
CSF-1+RANKL诱导单核细胞分化为定义为巨大的多核TRAP阳性细胞的破骨细胞，而在缺乏细胞因子的情况下未获得TRAP阳性破骨细胞。如MMP-9分泌的缺乏所示，0.5μg/ml抗-CSF-1mAb26730的加入完全废止了破骨细胞分化。相同浓度的抗-CSF-1R mAb61701或2-4A5-4和免疫小鼠血清(1:1000稀释)仅部分抑制破骨细胞形成(图4；含(+)或不含(-)细胞因子；3个孔的平均值+/-SEM；*：2个孔的平均值)。与两种阴性对照杂交瘤上清(A、B)相比，用1:20或1:100稀释的CXIIG6杂交瘤培养物上清处理显著降低MMP-9的产生水平。这些结果证明，mAbCXIIG6通过阻断细胞表面CSF-1R的功能来抑制从人单核细胞分化破骨细胞。
CSF-1R的CSF-1依赖性磷酸化的抑制
用通过用表达人CSF-1R的质粒稳定转染NIH/3T3细胞获得的B4-800-5细胞系来考查CXIIG6杂交瘤上清对CSF-1依赖性CSF-1R磷酸化的作用。按每个60mm Petri平皿2x10E5个细胞接种细胞，并培养48至72小时。37℃血清剥夺1小时后，用含CXIIG6杂交瘤上清、mAb2-4A5-4(NeoMarkers))或同种型对照mAb(稀释在阴性杂交瘤上清中)的培养基37℃处理细胞1小时，然后在37℃用100ng/ml hCSF-1刺激5分钟或保持不刺激。然后裂解细胞层，并提取总蛋白质。通过用兔pAbc-fms/CSF-1R H300或兔pAb p-c-fms/CSF-1R(Tyr708)-R(Santa CruzBiotechnology)，然后用山羊抗-兔免疫球蛋白HRP探测Western印迹来分析10μg蛋白质。
如用对708位磷酸化的CSF-1R特异的抗体所观察到，在缺乏CSF-1的情况下，CXIIG6杂交瘤上清和mAb2-4A5-4都不诱导受体磷酸化，显示mAb CXIIG6单独不发挥激动作用。用CSF-1刺激时，CSF-1R在Tyr708上磷酸化，且与未刺激的细胞相比，同种型对照处理的细胞中CSF-1R的量减少，反映了受体降解(数据未显示)。用CXIIG6杂交瘤上清或用mAb2-4A5-4预处理未增强CSF-1R消失。用CXIIG6杂交瘤上清或用mAb2-4A5-4处理后，CSF-1R的磷酸化减少。这些结果显示，mAb CXIIG6能够阻断CSF-1R的CSF-1依赖性磷酸化。
mAb CXIIG6的交叉反应性
通过ELISA在一系列纯化的可溶性受体上测试了mAb CXIIG6的交叉反应性，该受体隶属于酪氨酸激酶受体的III型亚家族，且在其胞外Ig样结构域中显示与CSF-1R的同源性：可溶性VEGFR-1、VEGFR-2、Flt-3和PDGFR(全部四种都作为Fc融合蛋白质表达)以及PDGFR和SCFR(c-kit)获自R&D Systems，并用于包被ELISA平板。用来自酪氨酸激酶受体的EGFR亚家族的可溶性EGFR(R&D Systems)作为阴性对照。
按500ng/ml的抗体浓度在包被的ELISA平板上孵育来自杂交瘤CXIIG6(CXIIG6SN)或阴性对照杂交瘤的培养物上清或抗-CSF-1R小鼠IgG161701(R&D Systems)。洗涤ELISA平板后，用过氧化物酶缀合的山羊抗-小鼠Ig(Sigma)显示结合的抗体，并测量OD(450–540nm)。图5中所示的结果显示，与mAb61701一样，CXIIG6强烈结合CSF-1R，而在任意其他酪氨酸激酶受体上未检测到特异性信号。这显示，在所测试的多种III型酪氨酸激酶受体中，CXIIG6对CSF-1R特异。
mAb CXIIG6的表达载体的构建
为了在DG44哺乳动物细胞系中产生mAb CXIIG6，用OptiCHOTM抗体表达试剂盒(Invitrogen，目录号12762-019)来克隆编码CXIIG6重链和轻链的基因。OptiCHOTM抗体表达试剂盒包括：(1)pOptiVECTM载体，其是允许将目的基因克隆在CMV启动子下游的双顺反子质粒。目的基因的转录通过内部核糖体进入位点(IRES)从二氢叶酸还原酶(DHFR)营养缺陷型选择标记分开，使目的基因和选择标记转录在同一mRNA上；(2)允许将目的基因克隆在CMV启动子下游的pcDNATM3.3载体。pcDNATM3.3包含允许用选择的新霉素抗性基因。pOptiVECTM和pcDNATM3.3载体包含指导目的基因mRNA的3'端的正确加工的TKpoly-A序列。
合成特异性引物(见表4)，并用于整个CXIIG6重链和轻链基因(分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3；分别见图6和图7)的PCR扩增和克隆。反向引物包含用于有效的真核翻译的Kozak共有序列(KOZAK M.An analysis of5'-noncoding sequences from699vertebrate messengerRNAs.Nucleic Acids Res.1987,15(20):8125–8148.)。
表4
以质粒pTG17753(图8)为模板，用OTG18929和OTG18930PCR扩增CXIIG6重链，并克隆入载体pOptiVECTM-(pOptiVECTM-TAKit,Invitrogen,目录号12744-017-01)和pcDNATM3.3-载体(pcDNATM3.3-TAKit,Invitrogen,目录号K8300-01)来分别获得pTG17786和pTG17789。
以质粒pTG17727(图9)为模板，用OTG18931和OTG18932PCR扩增CXIIG6轻链，并克隆入载体pOptiVECTM-(pOptiVECTM-TAKit,Invitrogen,目录号12744-017-01)和pcDNATM3.3-载体(pcDNATM3.3-TAKit,Invitrogen,目录号K8300-01)来分别获得pTG17788和pTG17787。
对pTG17786、pTG17787、pTG17788和pTG17789的整个表达盒(包括CMV启动子和TK polyA信号)的核苷酸序列进行了测序，并发现与它们的理论序列相符。
从mAb CXIIG6产生嵌合抗体
将mAb CXIIG6的可变结构域与人恒定区组合。
为了产生嵌合轻链(命名为嵌合CXIIG6Igκ链)，通过将编码CXIIG6VK Domain的序列(来自SEQ ID NO:3)连接至编码人IGKC区的序列(GenBank检索号：J00241)来设计理论序列。此XbaI NotI DNA片段保持与用于鼠形式中(如上述pTG17787和pTG17788中)的5’端非翻译序列(包括Kozak序列)相同的5’端非翻译序列(包括Kozak序列)。针对CHO中的表达优化嵌合CXIIG6轻链序列的密码子，从合成的寡核苷酸组装，并由GeneArt AG通过XbaI NotI亚克隆入pOptiVECTM(图10)。获得的嵌合CXIIG6轻链(可变区和恒定区)密码子优化核酸序列如SEQID NO:34所示。获得的质粒命名为pTG17895(图11)。
为了产生嵌合IgG1和IgG4重链(分别命名为嵌合CXIIG6IgG1链和嵌合CXIIG6IgG4链)，通过将编码CXIIG6VH Domain的序列(来自SEQ ID NO:1)连接至编码人IGHG1C区(GenBank检索号：J00228)或人IGHG4C区(GenBank检索号：K01316)的序列来设计理论序列。这些XbaI NotI DNA片段保持与用于鼠形式中(如上述pTG17786和pTG17789中)的5’端非翻译序列(包括Kozak序列)相同的5’端非翻译序列(包括Kozak序列)。然后针对CHO中的表达优化所获得的嵌合CXIIG6重链的密码子，合成，并由GeneArt AG通过XbaI NotI克隆入pTG17812(图12)。获得的嵌合CXIIG6IgG1重链(可变区和恒定区)密码子优化核酸序列如SEQ ID NO:35所示，获得的质粒命名为pTG17868(图13)。获得的嵌合CXIIG6IgG4重链(可变区和恒定区)密码子优化核酸序列如SEQ ID NO:36所示，获得的质粒命名为pTG17869(图14)。
从mAb CXIIG6产生人源化抗体
为了产生人源化轻链变体，在SEQ ID NO:9所示的轻链可变区内进行表2的氨基酸取代。
通过将CXIIG6VK Domain(来自SEQ ID NO:3)的具有取代的修饰序列连接至编码人IGKC区(GenBank检索号：J00241)的序列来设计DNA序列。此XbaI NotI DNA片段保持与用于鼠形式中(如上述pTG17787和pTG17788中)的5’端非翻译序列(包括Kozak序列)相同的5’端非翻译序列(包括Kozak序列)。然后针对CHO中的表达优化人源化CXIIG6轻链序列的密码子，从合成的寡核苷酸组装，并由GeneArt AG通过XbaINotI克隆入pOptiVECTM(图10)。获得的人源化CXIIG6轻链变体和质粒在图15中列出。
为了产生人源化重链变体，在SEQ ID NO:6所示的重链可变区内进行表1的氨基酸取代。
通过将CXIIG6VH Domain(来自SEQ ID NO:1)的具有取代的修饰序列连接至编码人IGHG1C区(GenBank检索号：J00228)的序列来设计DNA序列。此XbaI ApaI DNA片段保持与用于鼠形式中(如上述pTG17786和pTG17789中)的5’端非翻译序列(包括Kozak序列)相同的5’端非翻译序列(包括Kozak序列)。然后针对CHO中的表达优化DNA序列的密码子，合成，并由GeneArt AG通过XbaI ApaI克隆入pTG17812(图12)。获得的人源化CXIIG6IgG1重链变体和质粒在图16中列出。
重组鼠CXIIG6和嵌合CXIIG6IgG1的体外抑制活性
为了确定纯化的重组鼠CXIIG6(如之前所述)及其嵌合IgG1变体(前述嵌合CXIIG6IgG1)是否能够阻断可溶性人CSF-1R，在M-NFS-60细胞增殖和破骨细胞分化模型(如之前所述)中进行了剂量反应研究。平行测试了来自Rockland(Rockland,010-0141)的纯化的多克隆鼠IgG2a和申请人产生的嵌合IgG1作为对照抗体。通过将细胞暴露于在SPR生物传感器测定中通过抗原结合测量的活性抗-CSF-1R的浓度范围来评价阻断作用。通过上样等量的总抗体(通过Fc结合的SPR生物传感器测定)来进行mAb CXIIG6和它们各自的对照mAb之间的比较。
M-NFS-60生物测定：在M-NFS-60生物测定中，在50ng/ml人可溶性CSF-1R和1ng/ml人CSF-1的存在下用0.23ng/ml至0.5μg/ml活性mAb CXIIG6(重组鼠CXIIG6；嵌合CXIIG6IgG1)或对应浓度的对照mAb处理细胞48小时。图17中所示的结果显示，M-NFS-60细胞生长响应两种mAb CXIIG(重组鼠CXIIG6；嵌合CXIIG6IgG1)的逐步提高的浓度而提高，证明它们拮抗可溶性CSF-1R与CSF-1的结合(三个平行孔的平均值+/-SEM)。嵌合CXIIG6IgG1在恢复细胞增殖中与重组鼠CXIIG6一样有效。对照鼠IgG2a和嵌合IgG1在它们各自的浓度范围内对可溶性CSF-1R之于CSF-1的中和无作用。这些结果显示，纯化的重组鼠CXIIG6和嵌合CXIIG6IgG1抑制可溶性人CSF-1R。
破骨细胞生物测定：在破骨细胞生物测定中，在25ng/ml CSF-1(ImmunoTools)和40ng/ml RANKL的存在下用0.85ng/ml至0.62μg/ml活性mAb CXIIG6(重组鼠CXIIG6；嵌合CXIIG6IgG1)孵育淘析的人单核细胞8天。在第4和6天补充培养基和所有添加剂，并测量第6至8天的条件培养基中的总MMP-9。图18中所示的结果显示，与对照抗体相比，重组鼠CXIIG6及其嵌合变体(嵌合CXIIG6IgG1)各显著减少与破骨细胞分化平行的MMP-9产生，表明发生了生长阻滞(图18；三个平行孔的平均值+/-SEM)。
这些结果进一步证明，纯化的重组鼠CXIIG6和嵌合CXIIG6IgG1抑制细胞表面CSF-1R的功能。
本发明的抗体对市售抗体的表位定位
设计这些实验来测定本发明的抗体的表位定位，更确切而言，测定它们是否与许多市售抗-CSF-1R抗体结合相同或不同的表位。
本发明的嵌合CXIIG6(chCXIIG6)、mAb3291(鼠IgG1，克隆61701，R&D Systems MAB3291)和mAb JF14(鼠IgG1,Santa Cruz sc-80174)结合人CSF-1R而不结合鼠CSF-1R。由于它们针对人CSF-1R的N端部分产生而选择了单克隆抗体3291和JF14。为了定位CSF-1R上的mAb结合部位，构建了与组氨酸标记融合的人CSF-1R截短突变体及人和鼠D1-D3CSF-1R之间的嵌合体(详细情况见图19和20)。用CHO细胞将这些构建体表达为分泌性蛋白质。用抗-His标记抗体进行检测，通过免疫印迹分析来检验构建体的表达。通过在抗-His标记抗体包被的孔中孵育CHO培养物上清来将所有构建体捕获在ELISA平板上。用Biotin-NHS(Sigma ref B3295-10MG)生物素化抗体。向各孔中加入生物素化的抗体，并用链霉抗生物素蛋白-HRP检测结合。用生物素化的利妥昔单抗(Du等,2007,J.Biol.Chem.282(20),15073-15080,NCBI检索号2OSL_H&2OSL_L)作为阴性同种型对照(不结合CSF-1R)。结果总结在图19中。
结果：如预期，利妥昔单抗不结合任何测试构建体。嵌合CXIIG6、mAb3291和mAb JF14能够结合人CSF-1R的分离的结构域1(D1)(见构建体pTG18038；图19)。此外，用鼠D1取代人D1完全废止了三种mAb的结合(见构建体pTG18003；图19)。用组合了人和鼠D1亚结构域的构建体pTG18015和pTG18000获得的结果显示，mAb3291和JF14的结合需要人CSF-1R D1结构域的N端和中央部分二者，而本发明的单克隆抗体的结合只需要人结构域D1的N端部分(见构建体pTG18016；图19)。
这些数据显示，本发明的单克隆抗体在与单克隆抗体3291和JF14不同的表位上结合人CSF-1R。有趣地，人和鼠CSF-1R的N端部分仅4个残基不同：I20A、V27G、K33E和A36E(起始甲硫氨酸为残基1)。
单克隆抗体H19K12、H27K5和H27K15
上文已描述了产生对人CSF-1R功能具有阻断活性的小鼠IgG2a的杂交瘤CXIIG6的产生。克隆并测序了CXIIG6IgG2a的重链和轻链(见图6和7)。将mAb CXIIG6的可变结构域VH和VL与人IgG1恒定区组合(见上文)，构建了嵌合形式的单克隆抗体(chCXIIG6)。为了提高与人抗体序列的同源性并降低单克隆抗体的可能的免疫原性，通过在VH和VL结构域中引入突变来产生人源化变体(见图15和16)。
在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中瞬时表达了本发明的262种形式的人源化单克隆抗体，并测试它们的CSF-1R结合能力。在此第一筛选中，根据(i)对人CSF-1R的亲和力、(ii)与人种系序列的最高同源性(优选地，该同源性为至少76％、更优选至少85％)和(iii)计算机分析的最低的免疫原性选择了31种人源化CXIIG6变体(hCXIIG6)。使用石英晶体微天平(Attana)技术的亲和力研究显示，所有选择的hCXIIG6变体都具有相似的对重组人CSF-1R的亲和力，与亲本mAb chCXIIG6一样，在10-9至10-10M的范围内。选择了表征为对CSF-1R的高亲和力、最高程度的人同源性和计算机分析的最低的免疫原性的30种人源化变体中的三种进行进一步研究：H19K12、H27K5和H27K15。
本发明的单克隆抗体H27K15的生物化学表征
A-用碘-125放射性标记H27K15抗体
材料
本发明的单克隆抗体H27K15作为浓度为2.1mg/mL的水溶液(PBSpH7.5)提供。
碘-125放射性核素作为10-5N氢氧化钠中的碘化钠购自Perkin Elmer(比活性：643.8GBq/mg——放射性核素纯度：99.95％)。
氯胺-T(N-氯-对-甲苯磺酰胺，PM：227.6g.mol-1)、焦亚硫酸钠(PM＝190.1g.mol-1)、牛血清白蛋白(BSA)和三氯乙酸购自Sigma。
磷酸缓冲盐溶液0.1M、pH7.2在我们的实验室配制。
方法
向100μg抗体中加入1.2mCi Na125I溶液(44.4MBq)和7.6μL新鲜配制的氯胺-T溶液(1mg/mL于磷酸盐缓冲液中)。室温2分钟后，通过加入12.7μL的焦亚硫酸钠(1mg/mL于磷酸盐缓冲液中)来终止反应。
通过之前用洗脱缓冲液(磷酸盐缓冲液0.1M pH7.2/0.5％BSA)饱和的Sephadex G-25柱(PD-10,Pharmacia)上的凝胶过滤来去除未掺入的碘-125。以40个0.5mL的整分试样洗脱柱。在针对碘-125放射性核素校准的自动γ计数器(针对碘-125放射性核素校准的Wallace Wizard2470自动γ计数器——Perkin Elmer)中测量各级分中的放射性活性，并混合含有希望的放射性碘化产物的级分。
通过用10％TCA作为洗脱液在Gelman Sciences预包被硅胶板上进行的ITLC分析来估计放射性标记化合物的放射化学纯度。
放射性标记的抗体溶液的结果和特征
纯化前，通过ITLC测定的放射化学产率为97.8％。
放射性标记的抗体溶液的特征总结如下：
通过还原和非还原条件下的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来评估放射性标记抗体的纯度和完整性。用由从10至250kDa的10个分子量标记组成的宽范围分子量标准(Biorad Laboratories)来校准凝胶。用考马斯蓝染色凝胶。在第二步中，干燥凝胶，并暴露在屏上用PhosphorImager445SI(Amersham Biosciences)进行放射自显影。用ImageJ软件(Molecular Dynamics)进行数据分析。
考马斯蓝染色后获得的电泳谱和放射自显影相同。在非还原条件下，在150kDa处可见对应于整个IgG分子的一条主带。在还原条件下，检测到分别对应于抗体的重链和轻链的50kDa和25kDa的条带。这些电泳结果确认，氯胺-T法不影响抗体的完整性。
B-放射性标记的H27K15抗体在EL4-CSF-1R细胞上的结合测定
b1 125I-H27K15的结合亲和力的测量
用平衡解离常数(KD)作为结合亲和力的测量。通过饱和测定来测定125I-H27K15抗体的KD，其中向恒定数目的细胞中加入浓度逐步提高的放射性标记抗体。
材料
含0.5％BSA的PBS中的放射性抗体溶液
含100倍摩尔过量的未标记抗体(非特异性结合)的放射性标记抗体的溶液：制备含45μg/mL未标记抗体和0.45μg/mL放射性标记抗体的溶液，然后在PBS/BSA0.5％中进行4倍系列稀释。
细胞：在含0.5％BSA的PBS中按40x106细胞/mL制备EL4-CSF-1R细胞的悬液。
方法
在150μL终体积中用浓度逐渐提高的放射性标记抗体冰上搅拌孵育EL4-CSF-1R细胞(2x106于50μL PBS/BSA0.5％中)1小时。
通过共孵育过量的未标记抗体(100倍摩尔过量)来测定非特异性结合。
孵育后，将反应混合物覆盖在200μL邻苯二甲酸二丁酯油垫上，并在微量离心管中12000转/分钟离心3分钟。在液氮中冷冻管，并切下包含细胞沉淀的管尖，用针对碘-125放射性核素校准的Wizard2470自动γ计数器进行放射性测定(效率：63％)。
通过测量含100倍摩尔过量的未标记抗体的放射性标记抗体的四点浓度的结合放射性来测定非特异性结合。用结合级分对游离级分作图，并用线性回归来确定直线的斜率。通过从缺乏过量未标记抗体的情况下观察到的结合(总结合)减去存在过量未标记抗体的情况下观察到的结合(非特异性结合)来定义特异性结合。
结果
通过Prism软件来测定人源化125I-H27K15抗体对EL4-CSF-1R细胞的亲和力常数和每个细胞的最大结合部位。
125I-H27K15抗体对EL4-CSF-1R细胞的结合特征总结如下：
b2 未标记的H27K15的抑制常数的测量
此研究的目的是确定免疫反应性放射性标记抗体的亲和力是否与未标记的抗体相同。用恒定浓度的放射性标记抗体和系列稀释的未标记抗体进行了放射性标记的取代结合测定。
材料
未标记抗体的溶液：配制450nM(67.5μg/mL)的溶液，然后在PBS/BSA0.5％中进行2.5倍系列稀释。浓度范围：450nM至7.56pM。
细胞：在含0.5％BSA的PBS中按40x106细胞/mL制备EL4-CSF-1R细胞的悬液。
方法：在缺乏(总结合：对照孔)和存在50μL可变浓度(上文所述)的未标记抗体的情况下用50μL1.5nM的放射性标记抗体冰上搅拌孵育细胞(2x106于50μL PBS/BSA0.5％中)1小时。
孵育后，将反应混合物覆盖在200μL邻苯二甲酸二丁酯油垫上，并在微量离心管中12000转/分钟离心3分钟。在液氮中冷冻管，并切下包含细胞沉淀的管尖，用γ计数器进行放射性测定。
按以下计算放射性标记抗体的相对结合的百分比：
对照孔中的放射性
测试孔中的放射性×100
(对照孔是不存在未标记抗体的孔)
结果
图21中提供结合数据。
通过Prism软件来测定从竞争曲线获得的IC50值，并用Cheng-Prusoff方程(Biochem.Pharmacol.,22,3099-3108,1973)转化为绝对抑制常数Ki：
Ki = IC 50 1 + ( [ L ] / K D ) .
[L]是用于测定的放射性标记抗体的浓度
IC50是达到放射性标记抗体的50％抑制所需的未标记抗体的浓度
IC50值和抑制常数总结如下：
b3 125I-H27K15和多种抗体之间的竞争研究
材料
含0.5％BSA的PBS中的放射性标记H27K15抗体的溶液：如上文。
未标记抗体的溶液。
下表中提供不同的抗体：
对于各抗体，配制450nM(67.5μg/mL)的溶液，然后在PBS/BSA0.5％中进行2.5倍系列稀释。浓度范围：450nM至7.56pM。
细胞：在含0.5％BSA的PBS中按40x106细胞/mL制备EL4-CSF-1R细胞的悬液。
方法
在缺乏(总结合：对照孔)和存在50μL可变浓度(上文所述)的未标记竞争剂的情况下用50μL1.5nM的125I-H27K15抗体冰上搅拌孵育细胞(2x106于50μL PBS/BSA0.5％中)1小时。
孵育后，将反应混合物覆盖在200μL邻苯二甲酸二丁酯油垫上，并在微量离心管中12000转/分钟离心3分钟。在液氮中冷冻管，并切下包含细胞沉淀的管尖，用γ计数器进行放射性测定。
按以下计算放射性标记抗体的相对结合的百分比：
测试孔中的放射性×100
对照孔中的放射性
对照孔是不存在竞争剂的孔
结果
图22中提供结合数据。
通过Prism软件来测定从竞争曲线获得的IC50值，并用Cheng-Prusoff方程转化为绝对抑制常数Ki：
Ki = IC 50 1 + ( [ L ] / K D )
[L]是用于测定的125I-H27K15抗体的浓度
IC50是达到125I-H27K15抗体的50％抑制所需的竞争剂的浓度
KD是125I-H27K15抗体的亲和力常数
对于各竞争剂，IC50值和Ki常数总结如下：
本发明的单克隆抗体(H27K15、chCXIIG6、H19K12和H27K5)的亲和力非常相似，Ki值从0.5至0.8nM。
市售单克隆抗体3291和JF14的Ki值高于1nM。因此，这些抗体具有比本发明的单克隆抗体低的对CSF-1R抗原的亲和力。
C-人CSF-1与D1-D5人CSF-1R的竞争性结合测定
用Biotin-NHS(Sigma ref.B3295-10MG)生物素化CSF-1(1-444)。向FC-D1-D5人CSF-1R(100μL/孔，1μg/mL)(R&D systems ref.329-MR-100)包被的孔中加入生物素化CSF-1(100μl/孔，0.012μg/ml)，并用链霉抗生物素蛋白-HRP检测结合的分子。对于竞争实验，在生物素化CSF-1之前、与其一起或在其后孵育逐渐增加量的单克隆抗体(100μl/孔，从0.030μg/ml至200μg/ml)。
我们测试了市售单克隆抗体3191(R&D Systems ref.MAB3291)、本发明的一种单克隆抗体H27K15，单克隆抗体X(WO2009/026303)作为阳性对照，因为已知它与CSF-1竞争结合其受体，利妥昔单抗作为阴性对照。
在预孵育的情况下，在加入生物素化CSF-1前一小时用包被的人CSF-1R孵育单克隆抗体。
在后孵育的情况下，在加入单克隆抗体前一小时用包被的人CSF-1R孵育生物素化CSF-1。
在共孵育的情况下，将生物素化CSF-1和单克隆抗体一起与包被的人CSF-1R孵育。
结果：之前已显示(见上文)，3291和H27K15抗体都识别一个表位(即：Ig样结构域1)，该表位不同于已知与CSF-1结合相同的结合部位的阳性对照抗体X所识别的表位(即：在Ig样结构域2-3中)。在此，我们显示，与阳性对照不同，3291和H27K15抗体甚至在高抗体剂量(即IC50的～100倍)下也都是CSF-1结合的部分竞争剂。在所有背景(预孵育、共孵育或后孵育)中且在饱和剂量下，H27K15能够使CSF-1与CSF-1R的结合减少约10％至20％(见图23、24和25)，而取决于实验设定，抗体3291能够使相同的结合减少约30％至40％。
因此，本发明的单克隆抗体能够部分阻止CSF1与它的受体CSF-1R的结合。
这在以下实验中得到确认。
用0.1μg(即100μL，1μg/ml)人CSF11-444(Geneart-见SEQ IDNO:47，图32)包被ELISA微量培养板。在存在逐渐提高浓度的抗体的情况下共孵育100μL0.125μg/mL的Fc-D1-D5人CSF-1R(R&D systemsref329-MR-100)。用抗-IgG-Fc-人-HRP(Bethyl A80-204P)检测结合CSF1的Fc-D1-D5人CSF-1R。由于用于检测的抗体结合人Fc，用鼠抗体CXIIG6代替抗体H27K15进行竞争。用竞争剂mAb X(WO2009/026303)作为阳性对照，因为已知它在与人CSF-1相同的部位结合人CSF-1R。用大鼠IgG2a作为阴性对照(不结合hCD115的不相关同种型抗体)。
结果：如对竞争性抗体的预期，WO2009/026303中所示的mAb X完全抑制CSF1(1-444)与Fc-D1-D5人CSF-1R的结合。甚至在高抗体剂量(即100μg/mL)下，3291和mCXIIG6也只部分减少Fc-D1-D5人CSF-1R与CSF1的结合。mCXIIG6和3291分别使CSF1与Fc-hCD115的结合减少约5-10％和10-20％(见图26)。这些结果与上文所述的那些一致，证明H27K15或mAb3291对CSF1与Fc-D1-D5人CSF-1R的结合的部分抑制。
图26显示多种mAb部分减少重组人Fc-人D1-D5CD115与人CSF1的结合(共孵育实验)。将人CSF1(0.1μg/mL)包被在96孔板上，并用重组Fc-D1-D5人CSF-1R(0.125μg/mL)和逐渐提高浓度的mAb的混合物(共孵育实验)孵育1小时45分钟。用缀合HRP的抗-人Fc-IgG检测与hCSF-1结合的CD115。
D-125I-H27K15和IL-34(CSF-1R受体的一种已知的天然配体)之间的竞争研究
材料
含0.5％BSA的PBS中的放射性标记抗体125I-H27K15的溶液(如上文)。
配体的溶液：从R&D Systems购买浓度为0.422mg/mL的重组人IL-34(26.1kDa)。配制450nM的溶液，然后在PBS/BSA0.5％中进行2.5倍系列稀释。浓度范围：450nM至7.56pM。
细胞：在含0.5％BSA的PBS中按40x106细胞/mL制备EL4-CSF-1R细胞的悬液。
方法
在与天然配体的此竞争研究过程中，进行两种不同的方案。
在第一方案中，在缺乏(总结合：对照孔)和存在50μL可变浓度(上文提到)的未标记竞争剂的情况下用50μL1.5nM的125I-H27K15抗体冰上搅拌共孵育细胞(2x106于50μL PBS/BSA0.5％中)1小时。
第二方案是在加入放射性标记的H27K15抗体之前，用逐渐提高浓度的配体冰上孵育EL4-CSF-1R细胞30分钟。然后，第二孵育也在冰上搅拌进行1小时。
对于两个实验，将反应混合物覆盖在200μL邻苯二甲酸二丁酯油垫上，并在微量离心管中12000转/分钟离心3分钟。在液氮中冷冻管，并切下包含细胞沉淀的管尖，用γ计数器进行放射性测定。
按以下计算放射性标记抗体的相对结合的百分比：
测试孔中的放射性×100
对照孔中的放射性
(对照孔是不存在配体的孔)
结果：未观察到125I-H27K15抗体结合的取代。因此，H27K15抗体和IL-34配体识别CSF-1R抗原的不同表位。
此外，进行了125I-IL-34和人源化H27K15抗体之间的竞争结合研究，其显示，逐渐提高浓度的H27K15抗体未取代125I-IL-34结合，此处说明本发明的抗体不与IL-34竞争结合CSF-1R受体。
hCXIIG6变体H27K5、H27K15和H19K12的生物学表征
A.单克隆抗体的表达和纯化
通过贴壁CHO-K1或CHO-DG44细胞的瞬时转染或通过稳定CHO-DG44转染子的多克隆库(pool)来表达嵌合CXIIG6，hCXIIG6变体H19K12、H27K5、H27K15及利妥昔单抗。
B.H27K5、H27K15和H19K12对其他酪氨酸激酶受体中的CSF-1R的特异性
方法
用以下购自R&D Systems的可溶性受体中的每一种按每孔300ng包被微量滴定板(Maxisorp,Nunc)：CSF-1R20-512-Fc(目录号329-MR/CF)、(EGFR)2-Fc-6xhis(目录号1129-ER)、Flt-3-Fc-6xhis(目录号368-ST/CF)、PDGFR-Fc-6xhis(目录号385-PR/CF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)2-Fc-6xhis(目录号357-KD/CF)、VEGFR1-Fc-6xhis(目录号321-FL-050)、人SCFR(目录号332-SR/CF)和PDGFRαECD(目录号322-PR/CF)。向孔中加入50μl H27K5、H27K15、H19K12mAb或利妥昔单抗(500ng/ml于PBS中)，并在37℃孵育平板1小时。为了控制孔的有效包被，还用抗-人IgG(山羊抗-人IgG，Sigma目录号I3382)孵育受体-人Fc融合蛋白质Flt-3-Fc-、PDGFRβ-Fc、VEGFR2-Fc、VEGFR1-Fc包被的孔，而分别用抗-PDGF-Rα(小鼠IgG1，R&Dsystems目录号MAB322)和抗-SCF-R山羊IgG(R&DSystems目录号AF332)孵育PDGFRα和SCFR包被的孔。用抗人Igκ轻链(Bethyl Laboratories，目录号A80-115P)、山羊IgG(Santa Cruz目录号sc2033)或小鼠Ig(Sigma目录号A0412)的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的Ab来检测抗体结合。用四甲基联苯胺(Sigma，目录号T8665)(0.1mg/ml于0.05M乙酸钠、0.05M柠檬酸、H2O21/7000中)显色后，用分光光度计(Berthold,TristarLB941)在450nm测量吸光度，并通过减去540nm吸光度来校正。
结果
与chCXIIG6一样，虽然它们强烈结合固定化的CSF-1R ECD，但没有一种人源化变体对任意其他受体ECD显示免疫反应性(图27)。此结果显示，人源化未改变mAb H19K12、H27K5和H27K15对其他酪氨酸激酶受体中的CSF-1R的特异性。
C.hCXIIG6变体的CSF-1R阻断活性
C.1在M-NFS-60细胞增殖测定中阻断所测试的可溶性CSF-1R-Fc
方法
用不含CSF-1的完全RPMI-1640培养基洗涤M-NFS-60细胞两次，并在相同培养基中过夜孵育来进行CSF-1剥夺。为了测定可溶性人CSF-1R的中和，用系列稀释在完全RPMI-1640培养基中的抗体(H27K5、H27K15、H19K12mAb、chCXIIG6或利妥昔单抗)在白色96孔微量培养板(ViewPlateTM-96,Packard)中孵育5ng人CSF-1R20-512-Fc30分钟。然后在100μl的最终测定体积中与0.1ng人CSF-1一起向培养物孔中加入104CSF-1剥夺的细胞。37℃孵育细胞48小时，在掺入5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)2小时后按厂家的流程用来自Roche的Cell ProliferationELISA(目录号11647223001)定量增殖。在分光光度计(Berthold TristarLB941)中测量OD。
结果
小鼠髓细胞白血病细胞系M-NFS-60的生长依赖于CSF-1，之前已用来证明鼠mAb CXIIG6的CSF-1R阻断活性。在此测定中，用人CSF-1和人可溶性同二聚体二硫键连接的CSF-1R20-512-Fc培养M-NFS-60细胞。通过可溶性CSF-1R捕获CSF-1导致细胞增殖的抑制。中和人CSF-1R的抗体的加入阻止了可溶性CSF-1R捕获CSF-1，并恢复细胞生长。在存在阴性对照利妥昔单抗的情况下，可溶性CSF-1R完全抑制CSF-1介导的M-NFS-60细胞增殖(图28)。与chCXIIG6一样，H19K12、H27K5和H27K15产生可溶性CSF-1R20-512-Fc的剂量依赖性中和，并恢复细胞增殖。对于所测试的3个hCXIIG6变体，用GraphPad Prism软件用5参数逻辑斯谛方程计算的ND50(产生最大CSF-1R阻断作用的50％的中和剂量)相似(H19K12、H27K5和H27K15分别为29.8、30.7和29.1ng/ml)，未显示显著不同于亲本mAb chCXIIG6的ND50(18.1ng/ml)。
C.2在基于AML5细胞的测定中阻断所测试的细胞表面CSF-1R
方法
AML5细胞的免疫细胞化学和流式细胞术分析
通过免疫细胞化学和流式细胞术分析了AML5细胞(OCI-AML5，DSMZ目录号ACC-247)。用100μl PBS中的抗-人CSF-1R mAb3291(鼠IgG1，克隆61701，10μg/ml)(R&D Systems目录号MAB3291)、鼠IgG1同种型对照(R&D Systems目录号MAB002，10μg/ml)、chCXIIG6(10μg/m)或利妥昔单抗在冰上孵育5x105细胞30分钟。然后用藻红蛋白缀合的山羊抗-小鼠Ig(BD Pharmingen目录号550589)或异硫氰酸荧光素缀合的抗-人IgG F(ab’)2(Millipore目录号AQ112F)在冰上标记细胞30至45分钟。
CSF-1对AML5细胞增殖的作用
按2.5E4细胞/100μl/孔将AML5细胞接种在平底(在实验1和2中，TPP目录号92096)或圆底(在实验3中，Falcon目录号3077)96孔板中。每孔加入100μl含有人CSF-1的培养基。培养细胞48小时，并在4小时的BrdU掺入后按厂家的流程用来自Roche的Cell Proliferation ELISA(目录号11647223001)测量它们的增殖。在分光光度计(Berthold,TristarLB941)中测量OD。从四个重复孔计算平均OD+/-sem，并用GraphPadPrism对log[CSF-1](ng/ml)作图来用3参数方程拟合非线性回归曲线。
hCXIIG5变体对AML5细胞增殖的作用
按上文所述培养细胞并接种在96孔板中。在50μl培养基中加入分级量的chCXIIG6、H27K15、H27K5、H19K12或阴性对照利妥昔单抗。37℃孵育30分钟后，每孔加入50μl含40ng/ml hCSF-1的培养基。每个实验在4块相同的96孔板上进行，各包含每个mAb浓度的两个重复。培养细胞48小时，4小时的BrdU掺入后，按上文测量它们的增殖。首先用GraphPad Prism分析来自每块平板的结果来用5参数方程拟合非线性回归曲线。选择针对4种测试mAb中的至少3种给出通过GraphPad Prism拟合的结果的平板来计算平均值+/-sem。因此，根据来自4块平板中的2块的结果分析了实验1和2(从四个重复的OD值计算平均值)，根据来自4块平板中的3块的结果分析了实验3(从6个OD值计算平均值)。通过GraphPad Prism来计算所测试的每种mAb的EC50和R2。
结果
已报道集落刺激因子-1刺激人急性髓细胞白血病细胞系OCI-AML5(AML5)的生长(Drexler HG,Zaborski M,Quentmeier H.,2007.Cytokineresponse profile of human myeloid factor-dependent leukaemia cell lines.Leukemia11:701-8)。通过免疫细胞化学和流式细胞术分析了AML5细胞。市售抗-hCSF-1R小鼠IgG13291(与小鼠IgG1同种型对照相比)和chCXIIG6(与利妥昔单抗相比)染色为阳性，显示AML5细胞表达表面CSF-1R(图29A)。
为了建立用于研究CSF-1R阻断的作用的模型，有必要首先验证CSF-1诱导AML5细胞增殖的剂量依赖性增加。图29B显示，虽然AML5能够在缺乏外源CSF-1的情况下生长，但在培养基中加入生长因子以剂量依赖性方式增加细胞增殖。因此，AML5细胞的生长并非严格依赖于CSF-1，但它们响应CSF-1。
然后在用10ng/ml CSF-1(诱导近乎最大增殖的浓度)培养的AML5细胞上测试了hCXIIG6变体和chCXIIG6的作用(图29B)。图29C显示来自3次独立实验的结果。人源化变体H27K5、H27K15和H19K12以及chCXIIG6诱导AML5细胞增殖的剂量依赖性减少。在实验之间观察到变异性，其反映为各mAb的EC50的差异，及用GraphPad Prism计算的非常低的R2，尤其是在实验1中(图29D)。因此，不能根据它们在此测定中的EC50来可靠地排序hCXIIG6变体。全部3种hCXIIG6变体似乎在抑制AML5细胞的CSF-1依赖性增殖中同等有效。
C.3对CSF-1R信号发放的非激动作用和对CSF-1依赖性磷酸化的抑制作用
方法
B4-800-5是通过用编码人CSF-1R的表达质粒pTG17366稳定转染鼠NIH/3T3细胞获得的重组细胞系。将B4-800-5细胞按每个60mm Petri平皿2x105个细胞接种，并培养72小时。实验前，通过在1ml含1％FCS的DMEM培养基中37℃培养1小时来对细胞进行血清剥夺。
为了在缺乏交联的情况下研究CSF-1R阻断或抗体的作用，用1ml含mAb chCXIIG6、H19K12、H27K5、H27K15或人IgG1同种型对照利妥昔单抗的DMEM-1％FCS37℃处理细胞1小时。向细胞培养物中加入100ng/ml hCSF-1(ImmunoTools目录号11343115)37℃5分钟，或不刺激细胞。
在抗体交联实验中，用1ml含mAb chCXIIG6、H19K12、H27K5、H27K15、人IgG1同种型对照利妥昔单抗、重组小鼠IgG2a CXIIG6或小鼠IgG2a同种型对照(R&D Systems目录号MAB003)的DMEM-1％FCS冰上处理细胞1小时。用冰冷的PBS洗涤细胞。向细胞中加入20μg/ml多克隆山羊抗-小鼠IgG(R&D Systems目录号AF007)、20μg/ml多克隆山羊抗-人IgG FcHRP(Jackson目录号109-035-098)或100ng/ml hCSF-137℃10分钟，或不处理细胞。去除培养基，并通过在Petri平皿中加入提取缓冲液(62mM Tris、10％甘油、2％SDS、100mM DTT、pH6.8)来裂解细胞层。在Western印迹上分析细胞提取物，用以下抗体探测：分别用于检测酪氨酸708磷酸化的CSF-1R、总CSF-1R和β-肌动蛋白的多克隆兔抗-磷酸-CSF-1RTyr708(Santa Cruz Biotechnology目录号sc-33358-R)、多克隆兔抗-CSF-1R(H300,Santa Cruz Biotechnology目录号sc-13949，1/200稀释)和单克隆小鼠抗-β-肌动蛋白(Sigma-Aldrich目录号A2228，1/2000稀释)。分别用多克隆山羊抗-兔或兔抗-小鼠IgHRP(DakoCytomation目录号P0448、P0260)检测兔和小鼠一抗。
结果
我们考查了hCXIIG6变体H19K12、H27K5和H27K15及chCXIIG6对酪氨酸708的CSF-1依赖性磷酸化的作用，及它们的激动作用的缺乏。如用对酪氨酸708上磷酸化的CSF-1R特异的抗体所观察到，在缺乏CSF-1的情况下，在0.1、1或10μg/ml下测试时，没有一种mAb诱导受体磷酸化。这显示，在单独应用于B4-800-5细胞时，嵌合或人源化形式的所有CXIIG6-mAb衍生物都不发挥任何激动作用。
在用利妥昔单抗同种型对照或不用抗体培养的细胞中，CSF-1刺激时，对应于全长CSF-1R的～150kDa的条带磷酸化，而总的细胞CSF-1R减少。用抗-磷酸-CSF-1RTyr708抗体检测到了另外三个低分子量的条带。在CSF-1刺激前用chCXIIG6或hCXIIG6变体37℃孵育B4-800-5细胞时，与在利妥昔单抗处理的细胞中观察到的那些相比，抗-磷酸-CSF-1RTyr708mAb识别的4个条带的强度降低。150kDa条带的强度降低与之前在相似的条件下用杂交瘤衍生的CXIIG6观察到的降低相当。两个较低条带的强度降低似乎更显著。在0.1、1和10μg/ml下观察到了chCXIIG6和hCXIIG6变体对CSF-1R Tyr708磷酸化的抑制作用。
为了预期mAb治疗的患者中对hCXIIG6的体液反应(人抗-人抗体反应)的可能发展，我们随后考查了第二抗-IgG Ab的mAb交联对CSF-1R受体磷酸化的作用。小鼠CXIIG6的交联仅产生之前用杂交瘤衍生的CXIIG6观察到的用抗-磷酸-CSF-1RTyr708抗体检测到的150kDa的微弱条带，且可检测到总CSF-1R的轻微下调，可能反映了CSF-1R的弱激活。交联时，hCXIIG6变体和chCXIIG6还产生低强度的150kDa条带。与用100ng/ml CSF-1刺激后观察到的条带相比，150kDa磷酸化CSF-1R条带的强度极其弱。交联任意抗-CSF-1R mAb衍生物(chCXIIG6或hCXIIG6变体)后，抗-CSF-1RTyr708抗体未检测到CSF-1诱导的低分子量条带。
这些实验证明，与chCXIIG6一样，hCXIIG6变体H19K12、H27K5和H27K15能够部分抑制CSF-1R的CSF-1依赖性磷酸化，且对CSF-1R没有直接的激动活性。mAb在细胞表面的交联对CSF-1R磷酸化仅具有很小的作用。
D-对EL4-CSF-1R靶细胞的细胞毒性
方法
通过用编码人全长CSF-1R的慢病毒载体稳定转染鼠淋巴瘤衍生的T细胞系EL4(ATCC目录号TIB-39)产生了EL4-CSF-1R重组细胞系。通过mAb CXIIG6(小鼠IgG2a)或3291的免疫染色和流式细胞术分析验证了表面CSF-1R表达(数据未显示)。
在DMEM完全培养基中洗涤EL4-CSF-1R细胞，重悬在相同的培养基中，并按每孔2x104细胞在50μl中接种在96孔板中。用50μl稀释在培养基中的抗体冰上调理细胞45-60分钟。然后按多种效应细胞-靶细胞(E:T)比值加入50μl人外周血单核细胞(PBMC)。按10ng/ml、0.3和10μg/ml测试人源化CXIIG6变体、chCXIIG6和阴性对照利妥昔单抗。平行运行含150μl培养基、靶细胞或PBMC单独的对照孔来测量：(i)培养基(CM)背景；(ii)培养基+裂解溶液背景；(iii)靶细胞自发释放(SR)；(iv)各PBMC浓度下的效应细胞自发释放；和(v)存在裂解溶液的情况下的靶细胞最大释放(MR)。250x g离心平板4分钟，并在37℃过夜孵育。第二天，向含培养基或靶细胞的对照孔中加入15μl裂解溶液10X(Promega目录号G182A)，并进一步在37℃孵育平板45分钟。按厂家的说明用CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega目录号G1780)定量培养物上清中的乳酸脱氢酶(LDH)。用来自Berthold Technologies的TriStar LB941酶标仪和MikroWin2000软件在490nm记录吸光度。
从实验值、靶细胞SR值和效应细胞SR值减去平均CM背景。从靶细胞MR值减去平均CM+裂解溶液背景。用GraphPad Prism软件对减去平均CM和SR对照后的OD值进行统计学分析，使用非参数Mann-Whitney单尾t检验(用于将chCXIIG6或各hCXIIG6变体与利妥昔单抗比较)或双尾t检验(用于将各hCXIIG6变体与chCXIIG6比较)。用以下公式计算百分比裂解：
结果
用来自不同血液供体的PBMC在靶EL4-CSF-1R细胞上测试了chCXIIG6和hCXIIG6变体(人IgG1)的ADCC活性。
按25:1的E:T比使用来自供体#1的效应细胞(图30A)。在此实验中，在缺乏mAb的情况下观察到了10％以上的直接裂解，其反映了包含在PBMC中的NK细胞的活性。用阴性对照利妥昔单抗获得的值在相同的范围内。已通过流式细胞术分析验证，EL4-CSF-1R细胞不结合利妥昔单抗(数据未显示)。在10ng/ml mAb下，用抗-CSF-1R mAb未发现特异性裂解(存在利妥昔单抗的情况下观察到的非特异性裂解以上)。在0.3μg/mlmAb下，chCXIIG6诱导20％以上的细胞毒性。3种hCXIIG6变体的裂解在相同的数量级。在高mAb浓度(10μg/ml)下，全部3种hCXIIG6变体都产生接近35％的细胞毒性，而chCXIIG6的裂解仍在20％以下。
按25:1、50:1或100:1的E:T比用来自供体#2的效应细胞进行了另一实验(图30B)。与第一实验不同，未检测到直接裂解。利妥昔单抗的背景细胞毒性在测试的所有E:T比下都低于10％。结果与来自前一实验的那些良好相关：在低mAb浓度(10ng/ml)下未观察到裂解，但在0.3和10μg/ml下，chCXIIG6和3种hCXIIG6变体诱导EL4-CSF-1R细胞的显著的特异性裂解。在这些mAb浓度和测试的所有E:T比下，H27K5、H27K15和H19K12的靶细胞裂解同样高于chCXIIG6(p＝0.02)。
这些结果证明，chCXIIG6和hCXIIG6变体具有杀死表达表面CSF-1R的靶细胞的潜能。
嵌合和人源化抗-CSF-1R mAb在BeWo肿瘤模型中的疗效
由于chCXIIG6和hCXIIG6变体对人CSF-1R特异，而不识别它的鼠同源物，只能用人CSF-1R阳性肿瘤在小鼠模型中考查它们的体内作用。但是，在缺乏人CSF-1的情况下，人CSF-1R保持无活性，不能研究其功能的阻断。此外，CSF-1R阳性宿主细胞(肿瘤相关巨噬细胞、破骨细胞)的阻断(预期其提供治疗益处)在此模型系统中不可行。在以下使用人CSF-1R阳性BeWo肿瘤的实验中，只有mAb对肿瘤细胞的细胞毒性作用可以产生治疗功效。
BeWo人绒毛膜癌细胞表达表面CSF-1R
用mAb H27K15(最好的人源化抗-CSF-1R)免疫染色体外培养的BeWo细胞，并通过共焦显微术分析荧光。与阴性对照利妥昔单抗相比，用H27K15观察到的特异性荧光显示BeWo细胞在其表面表达人CSF-1R。如通过培养物上清的ELISA滴定所发现，BeWo细胞不分泌CSF-1(结果未显示)。
将NMR1裸鼠中衍生自皮下植入的BeWo细胞的实体瘤包含在OCT中用于通过免疫组织化学来分析。用鼠形式的CXIIG6或同种型对照染色冷冻的组织切片。在整个肿瘤内观察到强烈的特异性染色，反映了hCSF-1R在体内BeWo肿瘤细胞中的细胞表面表达和胞质表达。
实验1：嵌合CXIIG6在BeWo绒毛膜癌肿瘤模型中的疗效
在NMR1裸鼠的侧面皮下植入四百万个BeWo细胞。11只小鼠的组用嵌合CXIIG6的3次注射处理(chCXIIG6，50mg/kg于PBS中，IP，在第1、3和7天施用)，而另一11只小鼠的组根据相同的方案用利妥昔单抗同种型对照处理。在chCXIIG6处理的小鼠中观察到了肿瘤生长的抑制(图31A)和小鼠存活的延长(图31B)，显示用此mAb靶向人CSF-1R阳性BeWo肿瘤具有疗效。
实验2：嵌合CXIIG6和人源化H27K15在BeWo绒毛膜癌肿瘤模型中的疗效
进行2处修改，重复以上流程：
-测试chCXIIG6或人源化H27K15mAb(10只小鼠/组)，并与同种型对照利妥昔单抗比较
-mAb每周注射3次，注射3周，而不是仅注射一周
与第一实验相比，就肿瘤生长抑制或小鼠存活而言，延长chCXIIG6或H27K15的处理未改善结果。但是，与利妥昔单抗同种型对照组相比，两种mAb都抑制肿瘤生长。在H27K15的情况下，使用Mann-Whitney检验，第14天的肿瘤体积减小在统计上显著，且在后面的时间点(第17和21天)接近显著。对于chCXIIG6，肿瘤体积的减小接近统计上显著。
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Claims (16)

1.分离的、重组的或纯化的抗体，其特异性结合CSF-1R，更优选特异性结合人CSF-1R，其特征在于所述抗体包含(a)由SEQ ID NO:42组成的第一可变区，和(b)由SEQ ID NO:46组成的第二可变区。
2.权利要求1的抗体，其包含(a)由SEQ ID NO:37组成的重链，和(b)由SEQ ID NO:41组成的轻链。
3.权利要求1的抗体，其是多克隆抗体、单克隆抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、抗体片段或双抗体。
4.编码权利要求1-3中任一项的抗体的核酸序列。
5.包含权利要求4的核酸序列的载体。
6.权利要求5的载体，其具有质粒或病毒来源。
7.权利要求6的载体，其是病毒来源，且衍生自痘病毒、腺病毒、反转录病毒、疱疹病毒、甲病毒属、泡沫病毒或腺病毒相关病毒。
8.权利要求7的载体，其中所述痘病毒是痘苗病毒或金丝雀痘病毒。
9.权利要求8的载体，其中所述痘苗病毒是MVA。
10.包含权利要求4的核酸序列的细胞。
11.权利要求10的细胞，其是真核细胞。
12.权利要求11的细胞，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞，优选是CHO细胞或BHK细胞。
13.用于产生权利要求1-3中任一项的抗体的方法，其包括在允许表达抗体的条件下培养权利要求10-12中任一项的细胞，并从细胞或细胞周围的培养基纯化抗体
14.药物组合物，其包含权利要求1-3中任一项的抗体、权利要求4的核酸序列，或权利要求5-9中任一项的载体；以及可药用载体。
15.权利要求1-3中任一项的抗体、权利要求4的核酸序列、权利要求5-9中任一项的载体或权利要求14的药物组合物，其用作药物。
16.权利要求1-3中任一项的抗体、权利要求4的核酸序列、权利要求5-9中任一项的载体或权利要求14的药物组合物，其用于治疗选自癌症、与提高的破骨细胞活性相关的疾病、炎症和类风湿性关节炎的疾病。
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