ES2635250T3 - Plantas con actividad aumentada de una enzima fosforilante de almidón - Google Patents

Abstract

Célula vegetal modificada genéticamente, caracterizada porque presenta actividad aumentada en una proteína P-glucan-agua-diquinasa, en comparación con las correspondientes células vegetales de tipo silvestre que no se han modificado genéticamente, en la que la modificación genética consiste en la introducción de al menos una molécula de ácido nucleico extraña en el genoma de la planta y en la que la molécula de ácido nucleico extraña se elige del grupo que consiste en: a) Moléculas de ácido nucleico, que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos dada en la SEQ ID NO 2 o en la SEQ ID NO 4; b) Moléculas de ácido nucleico, que codifican una proteína, que incluye la secuencia de aminoácidos, que está codifica mediante la inserción en el plásmido DSM16264 o la inserción en el plásmido DSM16302; c) Moléculas de ácido nucleico, que codifican una proteína, cuya secuencia tiene una identidad de al menos el 60 % con la secuencia de aminoácidos dada en la SEQ ID NO 2 o en la SEQ ID NO 4; d) Moléculas de ácido nucleico, que codifican una proteína, cuya secuencia tiene una identidad de al menos el 60 % con la secuencia de aminoácidos, que está codificada por la región codificante de la inserción en el plásmido DSM16264 o mediante la región codificante de la inserción en el plásmido DSM16302; e) Moléculas de ácido nucleico, que incluyen la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 1 o en la SEQ ID NO 3 o una secuencia complementaria; f) Moléculas de ácido nucleico, que incluyen la secuencia de nucleótidos de la inserción contenida en el plásmido DSM16264 o en el plásmido DSM16302; g) Moléculas de ácido nucleico, que tienen una identidad de al menos el 60 % con las secuencias de ácido nucleico descritas en a), b), e) o f); h) Moléculas de ácido nucleico, que hibridan con al menos una hebra de las moléculas de ácido nucleico descritas en a), b), d), e) o f) bajo condiciones rigurosarigurosas; i) Moléculas de ácido nucleico, cuya secuencia de nucleótidos se desvía de la secuencia de moléculas de ácido nucleico identificada en a), b), e) o f) debido a la degeneración del código genético; y j) Moléculas de ácido nucleico, que representan fragmentos, variantes alélicas y/o derivados de las moléculas de ácido nucleico identificadas en a), b), c), d), e), f), g), h) o i).

Description

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reacción 1, entonces esto demuestra que está presente una fosforilación de una proteína que facilita almidón como un producto intermediario autofosforilado. Las partes A y B de la mezcla de reacción 2 sirven como un control y no deben, por tanto, presentar un aumento significativo de la señal para los alfa-1,4-glucanos marcados con 33P en el sedimento sedimentado que contiene alfa-1,4-glucanos. Los procedimientos posibles para demostrar la existencia de un producto intermediario de la proteína OK1 fosforilado se describen a continuación en Procedimientos generales, parte 12 y en el Ejemplo 7.

Se puede demostrar que una proteína OK1 tiene una actividad aumentada de unión a un almidón-P en comparación con el almidón no fosforilado, mediante la incubación de la proteína OK1 con almidón-P y con almidón no fosforilado en preparaciones separadas. Todos los almidones no fosforilados son básicamente adecuados para incubar proteínas OK1 con almidón no fosforilado. Preferentemente, un almidón de planta no fosforilado, particular y preferentemente, se usa almidón de trigo,y especial y preferentemente almidón de hoja granular de un mutante sex1-3 de Arabidopsis thaliana.

Los procedimientos para aislar el almidón a partir de las plantas, por ejemplo, son conocidos por el experto en la materia. Todos los procedimientos conocidos por ele experto en la materia son básicamente adecuados para aislar almidón no fosforilado a partir de las especies vegetales apropiadas. Preferentemente, se usan los procedimientos para aislar alfa-1,4-glucanos no fosforilados descritos a continuación (véase Procedimientos generales, parte 2).

Todos los almidones, que contienen fosfato de almidón, son básicamente adecuados para incubar proteínas OK1 con almidón-P. Los almidones fosforilados de manera química también se pueden usar para este fin. Preferentemente, los almidones-P se usan para la incubación con proteínas OK1, particular y preferentemente, un almidón de planta fosforilado de manera enzimática retrospectivamente, especial y preferentemente, un almidón granular de planta fosforilado de manera enzimática retrospectivamente, que se ha aislado de un mutante sex-1 de Arabidopsis thaliana.

Para demostrar una actividad aumentada de unión de proteínas OK1 al almidón-P en comparación con el almidón no fosforilado, las proteínas OK1 se incuban en preparaciones separadas con almidón-P (preparación A) y con almidón no fosforilado (preparación B). Tras una exitosa incubación, las proteínas, que no están unidas a los almidones correspondientes de las preparaciones A y B, se separan de los almidones y las proteínas que están unidos. La unión entre las proteínas y el almidón-P en la preparación A y la unión entre las proteínas y el almidón no fosforilado en la preparación B se retiran posteriormente, es decir, las respectivas proteínas se disuelven. Las proteínas disueltas de la preparación A y la preparación B se pueden separar entonces de los almidones en cuestión, que están presentes en las respectivas preparaciones. Tras esto, las proteínas de unión a almidón-P aisladas de la preparación A y las proteínas de unión a almidón no fosforilado aisladas de la preparación B se pueden separar con la ayuda de procedimientos conocidos por el experto en la materia, tales como, por ejemplo, filtración en gel, procedimientos cromatográficos, electroforesis, electroforesis en gel de acrilamida con SDS comparando las cantidades de proteínas separadas de la preparación A con las cantidades de las correspondientes proteínas separadas de la preparación B, se puede determinar si una proteína tiene una actividad aumentada de unión con respecto al almidón-P en comparación con el almidón no fosforilado. Los procedimientos, que se pueden usar para demostrar una unión preferente de las proteínas por el almidón-P en comparación con el almidón no fosforilado, se describen a continuación en (Procedimientos generales, parte 8 y en el Ejemplo 1).

La secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO 2 codifica una proteína OK1 de Arabidopsis thaliana y la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO 4 codifica una proteína OK1 de Oryza sativa.

En una realización adicional de la presente invención, las secuencias de aminoácidos que codifican una proteína OK1 tienen una identidad de al menos el 60 % con la secuencia especificada en la SEQ ID NO 2 o en la SEQ ID NO 4, en particular de al menos el 70 %, preferentemente de al menos el 80 % y particular y preferentemente de al menos el 90 % y especial y preferentemente de al menos el 95 %.

En una realización adicional de la presente invención, la proteína OK1 presenta un dominio de fosfohistidina (Tien-Shin Yu y col., 2001, Plant Cell 13, 1907-1918). Las secuencias de aminoácidos que codifican proteínas OK1 contienen un dominio de fosfohistidina, que presenta una identidad preferentemente de al menos el 70 %, particular y preferentemente de al menos el 80 % y más particular y preferentemente de al menos el 90 % de la secuencia de aminoácidos del dominio de fosfohistidina de la proteína OK1 de Arabidopsis thaliana y Oryza sativa, especificada en la SEQ ID NO 5. El dominio de fosfohistidina preferentemente contiene dos restos de histidinas.

La presente invención describe una célula vegetal modificada genéticamente o una planta modificada genéticamente en la que la modificación genética consiste en la introducción de al menos una molécula de ácido nucleico extraña en el genoma de la planta.

En este contexto, la expresión "modificación genética" significa la introducción de moléculas de ácido nucleico homólogas y/o heterólogas en el genoma de una célula vegetal o en el genoma de una planta, en la que dicha introducción de estas moléculas lleva a un aumento en la actividad de una proteína OK1. Las células vegetales de acuerdo con la invención o las plantas de acuerdo con la invención se modifican con relación a su información genética mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico extraña. La presencia

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o la expresión de la molécula de ácido nucleico extraña lleva a un cambio fenotípico. En el presente documento, cambio "fenotípico" significa preferentemente un cambio medible de una o más funciones de las células. Por ejemplo, las células vegetales modificadas genéticamente de acurdo con la invención y las plantas genéticamente modificadas de acuerdo con la invención presentan un aumento en la actividad de una proteína OK1 debido a la presencia de o en la expresión de la molécula de ácido nucleico introducida.

En relación con la presente invención, la expresión "molécula de ácido nucleico extraña" se entiende que significa una molécula tal que no se da de manera natural en las correspondientes células vegetales de tipo silvestre o que no se da de manera natural en la disposición espacial concreta en células vegetales de tipo silvestre o que se localiza en un lugar del genoma de la célula vegetal en el que no se da de manera natural en las células vegetales de tipo silvestre. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico extraña es una molécula recombinante, que consiste en diferentes elementos, la combinación o la disposición espacial específica que no se dan de manera natural en las células vegetales. En principio, la molécula de ácido nucleico extraña puede ser cualquier molécula de ácido nucleico, que provoca un aumento en la actividad de una proteína OK1 en la célula vegetal o planta.

En relación con la presente invención, el término "genoma" se entiende que significa la totalidad del material genético presente en una célula vegetal. Es sabido por el experto en la materia que, además del núcleo celular, otros orgánulos (por ejemplo, plástidos, mitocondria) también contienen material genético.

Las células vegetales de acuerdo con la invención y las plantas de acuerdo con la invención se caracterizan porque la molécula de ácido nucleico extraña codifica una proteína OK1, preferentemente una proteína OK1 de Arabidopsis thaliana o una proteína OK1 de Oryza sativa.

En una realización adicional, la molécula de ácido nucleico extraña codifica una proteína OK1 con la secuencia de aminoácidos especificada en la SEQ ID NO 2 o en la SEQ ID NO 4.

Están disponibles un gran número de técnicas para la introducción de ADN en una célula vegetal hospedadora. Estas técnicas incluyen la transformación de células vegetales con ADN-T usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como el medio de transformación, la fusión de protoplastos, la inyección, la electroporación de ADN, la introducción de ADN por medio del enfoque biolístico así como otras posibilidades. El uso de la transformación de células vegetales mediada por agrobacterias se ha investigado de manera exhaustiva y se ha descrito de manera adecuada en el documento EP 120516; Hoekema, EN: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Capítulo V; Fraley y col., Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46 y en An y col. EMBO J. 4, (1985), 277-287. Para la transformación de la patata, véase Rocha-Sosa y col., EMBO J. 8, (1989), 29-33, por ejemplo.

La transformación de plantas monocotiledóneas por medio de vectores basados en la transformación de Agrobacterium también se ha descrito (Chan y col., Plant Mol. Biol. 22, (1993), 491-506; Hiei y col., Plant J. 6, (1994) 271-282; Deng y col., Science in China 33, (1990), 28-34; Wilmink y col., Plant Cell Reports 11, (1992), 76-80; May y col., Bio/Technology 13, (1995), 486-492; Conner y Domisse, Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550-555; Ritchie y col., Transgenic Res. 2, (1993), 252-265). Un sistema alternativo para la transformación de plantas monocotiledóneas es la transformación por medio del enfoque biolístico (Wan y Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994), 37-48; Vasil y col., Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala y col., Plant Mol. Biol. 24, (1994), 317-325; Spencer y col., Theor. Appl. Genet. 79, (1990), 625-631), transformación de protoplasto, electroporación de células parcialmente permeabilizadas y la introducción de ADN por medio de fibras de vidrio. En particular, la transformación del maíz se ha descrito muchas veces en la bibliografía (véase, por ejemplo, los documentos WO95/06128, EP0513849, EP0465875, EP0292435; Fromm y col., Biotechnology 8, (1990), 833-844; Gordon-Kamm y col., Plant Cell 2, (1990), 603-618; Koziel y col., Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc y col., Theor. Appl. Genet. 80, (1990), 721-726). La transformación exitosa de otros tipos de cereales también se ha descrito, por ejemplo, para la cebada (Wan y Lemaux, véase anteriormente; Ritala y col., véase anteriormente; Krens y col., Nature 296, (1982), 72-74) y para el trigo (Nehra y col., Plant J. 5, (1994), 285-297; Becker y col., 1994, Plant Journal 5, 299-307). Todos los procedimientos anteriores son adecuados en el marco de la presente invención.

Entre otras cosas, las células vegetales y las plantas, que se han modificado genéticamente mediante la introducción de una proteína OK1, se pueden diferenciar delas células vegetales de tipo silvestre y de las plantas de tipo silvestre, respectivamente, en que contienen una molécula de ácido nucleico extraña, que no se da de manera natural en las células vegetales de tipo silvestre o en las plantas de tipo silvestre, o en que tal molécula está presente integrada en un lugar del genoma de la célula vegetal de acuerdo con la invención o en el genoma de la planta de acuerdo con la invención en el que no se da en células vegetales de tipo silvestre o plantas de tipo silvestre, es decir, en un ambiente genómico diferente. Además, las células vegetales de acuerdo con la invención y las plantas de acuerdo con la invención de este tipo difieren de las células vegetales de tipo silvestre y las plantas de tipo silvestre, respectivamente, en que contienen al menos una copia de la molécula de ácido nucleico extraña integrada de manera estable en su genoma, posiblemente, además de las copias de tal molécula que se dan de manera natural en las células vegetales de tipo silvestre o en las plantas de tipo silvestre. Si la(s) molécula(s) de ácido nucleico externa introducida en las células vegetales de acuerdo con la invención o en las plantas de acuerdo con la invención es(son) copias adicionales de moléculas que ya se dan de manera natural en las células vegetales

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preferentemente en el intervalo de 120 kDa a 140 kDa, particular y preferentemente, desde 125 kDa hasta 140 kDa y especial y preferentemente, desde 130 kDa hasta 135 kDa. Las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO 2 y en la SEQ ID NO 4 que codifican proteínas OK1 de Arabidopsis thaliana y Oryza sativa, respectivamente, contienen cada una un dominio de fosfohistidina. Preferentemente, una proteína OK1 de acuerdo con la invención, por tanto, contiene un dominio de fosfohistidina, que tiene una identidad de al menos el 50 %, preferentemente de al menos el 60 %, particular y preferentemente, de al menos el 80 % y especial y preferentemente del 90 % con el dominio de fosfohistidina mostrado en la SEQ ID NO

5.

La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico, que codifican una proteína con la actividad enzimática de acuerdo con la invención de una proteína OK1, en la que la proteína OK1 codificada tiene una identidad de al menos el 70 %, preferentemente de al menos el 80%, particular y preferentemente, de al menos el 90 % y especial y preferentemente del 95 % con la secuencia de aminoácidos especificada en la SEQ ID NO 2 o en la SEQ ID NO 4.

Un plásmido (A.t.-OK1-pGEM) que contiene un ADNc que codifica una proteína de acuerdo con la invención (A.t.-OK1) de Arabidopsis thaliana se depositó el 8 de marzo de 2004 con el número DSM16264 y un plásmido (pM150) que contiene un ADNc que codifica proteína adicional de acuerdo con la invención (O.s.-OK1) de Oryza sativa se depositó el 24 de marzo de 2004 con el número DSM16302 bajo el Tratado de Budapest en la Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares, GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Alemania. La secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO 2 puede derivar de la región codificante de la secuencia de ADNc integrada en el plásmido A.t.-OK1-pGEM y codifica una proteína OK1 de Arabidopsis thaliana. La secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO 4 puede derivar de la región codificante de la secuencia de ADNc integrada en el plásmido pM150 y codifica una proteína OK1 de Oryza sativa. La presente invención, por tanto, desvela moléculas de ácido nucleico, que codifican una proteína con la actividad enzimática de una proteína OK1, que incluye la secuencia de aminoácidos, que se codifica mediante la inserción en el plásmido A.t.-OK1-pGEM o mediante la inserción en el plásmido pM150, en el que la proteína codificada tiene una identidad de al menos el 70 %, preferentemente de al menos el 80%, particular y preferentemente, de al menos el 90 % y especial y preferentemente del 95 % con la secuencia de aminoácidos, que puede derivar de la inserción en A.t.-OK1-pGEM o pM150.

La secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO 1 es una secuencia de ADNc, que incluye la región codificante para una proteína OK1 de Arabidopsis thaliana y la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO 3 es una secuencia de ADNc, que incluye la región codificante para una proteína OK1 de Oryza sativa. La presente invención, por tanto, se refiere a moléculas de ácido nucleico, que codifican una proteína OK1 y a la región codificante de las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID NO 1 o en la SEQ ID NO 3 o secuencias, que son complementarias a estas, moléculas de ácido nucleico, que incluyen la región codificante de la secuencia de nucleótidos de la inserción contenida en el plásmido A.t.-OK1-pGEM o en el plásmido pM150 y las moléculas de ácido nucleico, que tiene una identidad de al menos el 70 %, preferentemente de al menos el 80 %, particular y preferentemente, de al menos el 90 % y especial y preferentemente de al menos el 95 % con dichas moléculas de ácido nucleico. Con la ayuda de la información de la secuencia de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención o con la ayuda de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, es posible para el experto en la materia aislar secuencias homólogas de otras especies vegetales, preferentemente de plantas que almacenan almidón, preferentemente de especies vegetales del género Oryza, en particular, Oryza sativa o de Arabidopsis thaliana. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, con la ayuda de procedimientos convencionales tales como el examen de ADNc o bibliotecas genómicas con muestras de hibridación adecuadas. El experto en la materia sabe que las secuencias homólogas también se pueden aislar con la ayuda de oligonucleótidos (degenerados) y el uso de procedimientos basados en PCR. El examen de bases de datos, tales como los que están disponibles, por ejemplo, mediante EMBL (http://www.ebi.ac.uk/Tools/index.htm) o NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), también se puede usar para identificar secuencias homólogas, que codifican para una proteína OK1. En este caso, se especifican una o más secuencias como una, así llamada, secuencia de entrada. Esta secuencia de entrada se compara después por medio de programas de ordenador estadísticos con las secuencias, que están contenidas en las bases de datos seleccionadas. Tales consultas de base de datos (por ejemplo, búsquedas en blast o fasta) son conocidas por el experto en la materia y se pueden llevar a cabo mediante diversos proveedores. Si se lleva a cabo tal consulta de bases de datos, por ejemplo en el NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), entonces, se deben usar las configuraciones por defecto, que se especifican para una consulta de comparación particular. Para las comparaciones de la secuencia de la proteína (blastp), estas son las siguientes configuraciones: Limit entrez = not activated; Filter = low complexity activated; Expect value = 10; word size = 3; Matrix = BLOSUM62; Gap costs: Existence = 11, Extension = 1. Para las comparaciones de secuencia de ácido nucleico (blastn), se deben establecer los siguientes parámetros: Limit entrez = not activated; Filter = low complexity activated; Expect value = 10; word size = 11. Con tal búsqueda en las bases de datos, las secuencias descritas en la presente invención se pueden usar como una secuencia de entrada con el fin de identificar moléculas de ácido nucleico adicionales y/o proteínas, que

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cerca de un gen que codifica una proteína OK1, por lo cual, como resultado de esto, aumenta la actividad de una proteína OK1 en la célula en cuestión. Los transposones pueden ser tanto aquellos que se dan de manera natural en la célula (transposones endógenos) como aquellos que no se dan de manera natural en dicha célula pero que se introducen en la célula (transposones heterólogos) por medio de procedimientos de ingeniería genética, tales como la transformación de la célula, por ejemplo. El cambio de la expresión de genes por medio de transposones es conocido por el experto en la materia. Una visión global del uso de transposones endógenos y heterólogos como herramientas en biotecnología de plantas se presenta en Ramachandran y Sundaresan (2001, Plant Physiology and Biochemistry 39, 234-252). La mutagénesis de inserción de ADNT se basa en el hecho de que ciertas secciones (ADN-T) de los plásmidos Ti de Agrobacterium se pueden integrar en el genoma de las células vegetales. El lugar de integración en el cromosoma de la planta no está definido, pero puede tener lugar en cualquier punto. Si el ADN-T se integra en una parte del cromosoma o cerca de una parte del cromosoma, que constituye una función génica, entonces esto puede llevar a un aumento en la expresión del gen y, por tanto, también a un cambio en la actividad de una proteína codificada mediante el gen en cuestión. En el presente documento, las secuencias insertadas en el genoma (en particular, transposones o ADN-T) se distinguen por el hecho de que contienen secuencias, que llevan a una activación de las secuencias reguladoras de un gen OK1 ("marcado de activación").

Las células vegetales y las plantas de acuerdo con la invención se pueden producir por medio del, así llamado, procedimiento de "marcado de activación" (véase, por ejemplo, Walden y col., Plant J. (1991). 281-288; Walden y col., Plant Mol. Biol. 26 (1994), 1521-1528). Estos procedimientos se basan en la activación de promotores endógenos por medio de secuencias "potenciadoras", tales como el potenciador del promotor de ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor, o el potenciador de la octopina sintasa.

En relación con la presente invención, la expresión "marcado de activación de ADN-T" se entiende que significa un fragmento de ADN-T, que contiene secuencias "potenciadoras" y que lleva a un aumento en la actividad de al menos una proteína OK1 mediante la integración en el genoma de una célula vegetal.

En relación con la presente invención, la expresión "marcado de activación de transposón" se entiende que significa un transposón, que contiene secuencias "potenciadoras" y que lleva a un aumento en la actividad de al menos una proteína OK1 mediante la integración en el genoma de una célula vegetal.

En otra realización, las moléculas de ADN de acuerdo con la invención, que codifican una proteína OK1, se enlazan con secuencias reguladoras, que inician la transcripción en células vegetales (promotores) y que llevan a un aumento en la actividad de la proteína OK1 en la célula. En este caso, las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención están presentes en la orientación "en sentido" a las secuencias reguladoras.

Para expresar las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención, que codifican una proteína OK1, estas se enlazan preferentemente con secuencias de ADN reguladoras, que garantizan la transcripción en células vegetales. En particular, éstas incluyen promotores. En general, cualquier promotor que está activo en las células vegetales es elegible para la expresión. El promotor se puede elegir de manera que la expresión tenga lugar de manera constitutiva o solo en un tejido determinado, en una etapa determinada del desarrollo de la planta o en un momento determinado por influencias externas. El promotor puede ser homólogo o heterólogo, tanto con respecto a la planta con respecto a la molécula de ácido nucleico. Los promotores adecuados son, por ejemplo, el promotor de ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor y el promotor de ubiquitina del maíz para la expresión constitutiva, el promotor B33 de la patatina (Rocha-Sosa y col., EMBO J. 8 (1989), 23-29) para la expresión específica de tubérculos en patatas o un promotor, que solo asegura la expresión en tejidos fotosintéticamente activos, por ejemplo, el promotor ST-LS1 (Stockhaus y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus y col., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451) o, para la expresión específica del endospermo del promotor HMG del trigo, el promotor USP, el promotor de faseolina, los promotores de genes de zeína del maíz (Pedersen y col., Cell 29 (1982), 1015-1026; Quatroccio y col., Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93), el promotor de la glutelina (Leisy y col., Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng y col., Plant J. 4 (1993), 357-366; Yoshihara y col., FEBS Lett. 383 (1996), 213-218) o el promotor shrunken-1 (Werr y col., EMBO J. 4 (1985), 13731380). Sin embargo, también se pueden usar promotores, que solo se activan en un momento determinado mediante influencias externas (véase, por ejemplo, el documento WO 9307279). Los promotores de proteína de choque térmico, que permiten inducción simple, pueden ser de interés particular en el presente documento. Además, se pueden usar los promotores específicos de semillas, tales como el promotor USP de Vicia faba, que garantiza una expresión específica de semilla en Vicia faba y otras plantas (Fiedler y col., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Bäumlein y col., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467).

Además, puede estar presente una secuencia de terminación (señal de poliadenilación), que se usa para añadir una cola de poli(A) al transcrito. A la cola de poli(A) se le atribuye una función en la estabilización de los transcritos. Los elementos de este tipo se describen en la bibliografía (véase Gielen y col., EMBO J. 8 (1989), 23-29) y se pueden intercambiar a voluntad.

Las secuencias de intrones también pueden estar presentes entre el promotor y la región codificante. Tales

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Además, la presente invención también se refiere a un procedimiento para la producción de una planta modificada genéticamente en la que

a) una molécula de ácido nucleico extraña se introduce en el genoma de una célula vegetal, en la que la molécula de ácido nucleico extraña codifica una proteína P-glucan-agua-diquinasa, que significa una proteína 5 que requiere almidón ya fosforilado como sustrato, en la que la molécula de ácido nucleico extraña se elige del grupo que consiste en:

i) Moléculas de ácido nucleico, que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos dada en la SEQ ID NO 2 o en la SEQ ID NO 4; ii) Moléculas de ácido nucleico, que codifican una proteína, que incluye la secuencia de aminoácidos, que se

10 codifica mediante la inserción en el plásmido DSM16264 o la inserción en el plásmido DSM16302; iii) Moléculas de ácido nucleico, que codifican una proteína, cuya secuencia tiene una identidad de al menos el 60 % con la secuencia de aminoácidos dada en la SEQ ID NO 2 o en la SEQ ID NO 4; iv) Moléculas de ácido nucleico, que codifican una proteína, cuya secuencia tiene una identidad de al menos el 60 % con la secuencia de aminoácidos, que está codificada por la región codificante de la inserción en el

15 plásmido DSM16264 o mediante la región codificante de la inserción en el plásmido DSM16302; v) Moléculas de ácido nucleico, que incluyen la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 1 o en la SEQ ID NO 3 o una secuencia complementaria; vi) Moléculas de ácido nucleico, que incluyen la secuencia de nucleótidos de la inserción contenida en el plásmido DSM16264 o en el plásmido DSM16302;

20 vii) Moléculas de ácido nucleico, que tienen una identidad de al menos el 60 % con las secuencias de ácido nucleico descritas en i), ii), v) o vi); viii) Moléculas de ácido nucleico, que hibridan con al menos una hebra de las moléculas de ácido nucleico descritas en i), ii), iv), v) o vi) bajo condiciones rigurosas; ix) Moléculas de ácido nucleico, cuya secuencia de nucleótidos se desvía de la secuencia de moléculas de

25 ácido nucleico identificada en i), ii), v) o vi) debido a la degeneración del código genético; y x) Moléculas de ácido nucleico, que representan fragmentos, variantes alélicas y/o derivados de las moléculas de ácido nucleico identificadas en i), ii), iii), iv), v), vi), vii), viii) o ix).

b) una planta se regenera a partir de células vegetales de la etapa a) y c) en caso necesario, las plantas adicionales se producen con la ayuda de las plantas de acuerdo con la etapa 30 b).

La regeneración de las plantas de acuerdo con la etapa (b) se puede llevar a cabo usando procedimientos conocidos por el experto en la materia (por ejemplo, los descritos en "Plant Cell Culture Protocols", 1999, edt. por R.D. Hall, Humana Press, ISBN 0-89603-549-2).

La producción de plantas adicionales de acuerdo con la etapa (c) del procedimiento de acuerdo con la invención se 35 puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante propagación vegetativa (por ejemplo, usando esquejes, tubérculos o por medio de cultivos de callos y regeneración de plantas completas).

En una realización adicional, el procedimiento de acuerdo con la invención se usa para crear una planta modificada genéticamente de acuerdo con la invención para la producción de plantas que almacenan almidón.

En una realización adicional, el procedimiento de acuerdo con la invención se usa para producir plantas de maíz o 40 de trigo de acuerdo con la invención.

En una realización adicional del procedimiento de acuerdo con la invención, la molécula de ácido nucleico extraña se elige del grupo que consiste en

a) Moléculas de ácido nucleico, que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos especificada en la SEQ ID NO 2 o en la SEQ ID NO 4;

45 b) Moléculas de ácido nucleico, que codifican una proteína que incluye la secuencia de aminoácidos, que está codificada mediante la inserción en el plásmido A.t.-OK1-pGE o la inserción en el plásmido pM150; c) Moléculas de ácido nucleico, que codifican una proteína, cuya secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 60 % con la secuencia de aminoácidos especificada en la SEQ ID NO 2 o en la SEQ ID NO 4; d) Moléculas de ácido nucleico, que codifican una proteína, cuya secuencia tiene una identidad de al menos el 60

50 % de la secuencia de aminoácidos que está codificada por la inserción en el plásmido A.t.-OK1-pGEM o la inserción en el plásmido pM150; e) Moléculas de ácido nucleico, que incluyen la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 1 o en la SEQ ID NO 3 o una secuencia complementaria; f) Moléculas de ácido nucleico, que incluyen la secuencia de nucleótidos de la inserción contenida en el plásmido

55 A.t.-OK1-pGEM o en el plásmido pMI50; g) Moléculas de ácido nucleico, cuya secuencia de ácido nucleico tiene una identidad de al menos el 70% con las secuencias de ácido nucleico descritas en a), b), e) o f); h) Moléculas de ácido nucleico, que hibridan con al menos una hebra de las moléculas de ácido nucleico

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descritas en a), b), e), o f) bajo condiciones rigurosas; i) Moléculas de ácido nucleico, cuya secuencia de nucleótidos se desvía de la secuencia de moléculas de ácido nucleico identificada en a), b), o f) debido a la degeneración del código genético, y j) Moléculas de ácido nucleico, que representan fragmentos, variantes alélicas y/o derivados de las moléculas de ácido nucleico identificadas en a), b), c), d), e), f), g), h) o i).

En el procedimiento descrito en el presente documento, la molécula de ácido nucleico extraña también se puede elegir del grupo que consiste en

a) moléculas de ADN-T, que llevan a un aumento en la expresión de un gen OK1 a través de la integración en el genoma de la planta (marcado de activación de ADN-T); b) moléculas de ADN, que contienen transposones que llevan a un aumento en la expresión de un gen OK1 a través de la integración en el genoma de la planta (marcado de activación de transposón); c) moléculas de ADN, que codifican una proteína OK1 y están enlazadas con secuencias reguladoras que garantizan (inician) las transcripciones en las células vegetales, y que llevan a un aumento en la actividad de una proteína OK1 en la célula; d) moléculas de ácido nucleico introducidas por medio de mutagénesis in vivo, que llevan a una mutación o a una inserción en una secuencia heteróloga en al menos un gen OK1 endógeno, en las que la mutación o inserción provoca un aumento en la expresión de un gen OK1.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a un procedimiento de acuerdo con la invención, en el que la planta modificada genéticamente sintetiza un almidón modificado en comparación con el almidón de las plantas de tipo silvestre que no se han modificado genéticamente.

En una realización adicional del procedimiento de acuerdo con la invención, las plantas de acuerdo con la invención sintetizan un almidón modificado, que tiene un mayor contenido en fosfato de almidón y/o una distribución de fosfato modificada en comparación con el almidón aislado de las correspondientes plantas de tipo silvestre.

En una realización adicional del procedimiento de acuerdo con la invención, las plantas de acuerdo con la invención sintetizan un almidón modificado, que tiene una proporción modificada de fosfato en C-3 frente al fosfato en C-6 en comparación con el almidón de plantas de tipo silvestre que no se han modificado genéticamente. Lo particularmente preferido en el presente documento son almidones, que tienen una proporción aumentada de fosfato de almidón unida en la posición C-3 en comparación con el fosfato de almidón unido en la posición C-6 en comparación con los almidones de plantas de tipo silvestre que no se han modificado genéticamente.

La presente invención también se refiere a las plantas que se pueden obtener mediante el procedimiento de acuerdo con la invención.

De manera sorprendente, se ha descubierto que el almidón aislado a partir de células vegetales de acuerdo con la invención y las plantas de acuerdo con la invención, que tienen una actividad aumentada de una proteína OK1, sintetizan un almidón modificado. En particular, las elevadas cantidades de fosfato de almidón en los almidones de acuerdo con la invención proporcionan los almidones con propiedades sorprendentes y ventajosas. Los almidones de acuerdo con la invención tienen una elevada proporción de grupos cargados debido a la elevada proporción de fosfato de almidón, que afecta de manera considerable a las propiedades funcionales. El almidón que contiene grupos funcionales cargados se puede usar de manera particular en la industria del papel, en la que se utiliza para el recubrimiento del papel. El papel, que está recubierto con moléculas cargadas que también presentan buenas propiedades adhesivas, es particularmente adecuado para la absorción de pigmentos, tales como colorante, tintas de impresión, etc., por ejemplo.

La presente invención también describe almidones modificados que se pueden obtener a partir de células vegetales de acuerdo con la invención o plantas de acuerdo con la invención, a partir del material de propagación de acuerdo con la invención o de partes de la planta que se pueden cosechar de acuerdo con la invención.

La presente invención describe almidón modificado de plantas que almacenan almidón, preferentemente de plantas que almacenan almidón de la familia (sistemática) Poaceae, particular y preferentemente, de plantas de maíz o trigo.

Además, la presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de un almidón modificado que incluye la etapa de extracción del almidón de una célula vegetal de acuerdo con la invención o de una planta de acuerdo con la invención, a partir del material de propagación de acuerdo con la invención de tal planta y/o de partes de la planta que se pueden cosechar de acuerdo con la invención, preferentemente de plantas que almacenan almidón de acuerdo con la invención de tal planta. Preferentemente, tal procedimiento también incluye la etapa de cosechar las plantas cultivadas o las partes de la planta y/o el material de propagación de estas plantas antes de la extracción del almidón y, además, particular y preferentemente la etapa de cultivar plantas de acuerdo con la invención antes de la cosecha.

Los procedimientos para extraer almidones de plantas o de partes de almacenamiento de almidón de las plantas son conocidos por el experto en la materia. Además, los procedimientos para extraer almidón de diferentes plantas que

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% con la secuencia de aminoácidos, que está codificada mediante la inserción en el plásmido A.t.-OK1-pGEM o la inserción en el plásmido DSM pMI50; e) Moléculas de ácido nucleico, que incluyen la secuencia de nucleótidos especificada en la SEQ ID NO 1 o en la SEQ ID NO 3 o una secuencia complementaria; f) Moléculas de ácido nucleico, que incluyen la secuencia de nucleótidos de la inserción contenida en el plásmido A.t.-OK1-pGEM o en el plásmido pMI50; g) Moléculas de ácido nucleico, que tienen una identidad de al menos el 70% con las secuencias de ácido nucleico descritas en a), b), e) o f); i) Moléculas de ácido nucleico, que hibridan con al menos una hebra de las moléculas de ácido nucleico descritas en a), b), e), o f) bajo condiciones rigurosas; h) Moléculas de ácido nucleico, cuya secuencia de nucleótidos se desvía de la secuencia de moléculas de ácido nucleico especificada en a), b), e) o f) debido a la degeneración del código genético; y j) Moléculas de ácido nucleico, que representan fragmentos, variantes alélicas y/o derivados de las moléculas de ácido nucleico especificadas en a), b), c), d), e), f), g), h) o i).

Básicamente, las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención, se pueden originar a partir de cualquier planta, preferentemente se originan de plantas que almacenan almidón, preferentemente de plantas de patata, cebada, sorgo, trigo o arroz, particular y preferentemente,de plantas de Arabidopsis o de plantas del arroz, y más particular y preferentemente de Oryza sativa.

Además, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico de al menos 21, preferentemente más de 50 y particular y preferentemente, más de 200 nucleótidos de longitud, que hibridan de manera específica con al menos una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. En el presente documento, que hibrida de manera específica significa que estas moléculas hibridan con moléculas de ácido nucleico, que codifican una proteína de acuerdo con la invención, pero no con moléculas de ácido nucleico, que codifican otras proteínas. En particular, la invención se refiere a tales moléculas de ácido nucleico, que hibridan con transcritos de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención y, como resultado, pueden obstaculizar su traducción. Tales moléculas de ácido nucleico, que hibridan de manera específica con las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención, pueden, por ejemplo, ser constituyentes de ARNi antisentido o construcciones de co-supresión o ribozimas o se pueden usar como cebadores para la amplificación por PCR.

Además, la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico recombinante que contienen una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

En relación con la presente invención, la expresión "molécula de ácido nucleico recombinante" se entiende que significa una molécula de ácido nucleico, que contiene secuencias adicionales ademas de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención, que no se dan de manera natural en la combinación en la que se dan en los ácidos nucleicos recombinantes de acuerdo con la invención. En el presente documento, las secuencias adicionales mencionadas anteriormente pueden ser cualquier secuencia, preferentemente son secuencias reguladoras (promotores, señales de terminación, potenciadores), particular y preferentemente son secuencias reguladoras que están activas en el tejido vegetal y de manera especial, particular y preferentemente, son secuencias reguladoras que están activas en el tejido vegetal, en el que se sintetiza el almidón de almacenamiento. Los procedimientos para la producción de moléculas de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención son conocidos por el experto en la materia e incluyen procedimientos genéticos tales como la unión de moléculas de ácido nucleico por medio de ligadura, recombinación genética o nuevas síntesis de moléculas de ácido nucleico, por ejemplo (véase, por ejemplo Sambrok y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3ª edición (2001) Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY. ISBN: 0879695773, Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5ª edición (2002), ISBN: 0471250929).

Una realización adicional de moléculas de ácido nucleico recombinante de la presente invención son vectores, en particular, plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores habituales en la tecnología genética, que contienen las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención descrita anteriormente.

En una realización adicional, las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención contenidas en los vectores están enlazadas con secuencias reguladoras, que inician la expresión en células procariotas o eucariotas. En el presente documento, el término "expresión" puede significar tanto transcripción como traducción. Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención pueden tener una orientación en "sentido" y/o una orientación en "antisentido" con respecto a las secuencias reguladoras.

Las secuencias reguladoras para la expresión en organismos procariotas, por ejemplo, E. coli, y en organismos eucariotas están suficientemente descritas en la bibliografía, en particular, se han descrito aquellas para la expresión en levaduras, tales como por ejemplo Saccharomyces cerevisiae. Una visión global de diversos sistemas para la expresión de proteínas en diversos organismos hospedadores se puede encontrar, por ejemplo, en Methods in Enzymology 153 (1987), 383-516 y en Bitter y col. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544).

Un aspecto adicional de la presente invención es una célula hospedadora, particularmente, una célula procariota o eucariota, que está modificada genéticamente con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o

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con un vector de acuerdo con la invención, así como células que se originan a partir de estos tipos de células hospedadoras y que contienen la modificación genética de acuerdo con la invención.

En una realización adicional, la invención se refiere a células hospedadoras, particularmente, células procariotas o eucariotas, que se transformaron con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención o con un vector de acuerdo con la invención, así como células hospedadoras, que se originan a partir de estos tipos de células hospedadoras y que contienen las moléculas de ácido nucleico descritas de acuerdo con la invención o vectores.

Las células hospedadoras pueden ser células de bacterias (por ejemplo, E. coli, bacterias del género Agrobacterium, particularmente Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes) o células fúngicas (por ejemplo, levaduras, particularmente, S. cerevisiae, Agaricus, en particular Agaricus bisporus, Aspergillus, Trichoderma), así como células vegetales o animales. En el presente documento, la expresión "se transforma" significa que las células de acuerdo con la invención están modificadas genéticamente con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, en la medida en que contienen al menos una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención además de su genoma natural. Esto puede darse libremente en la célula, posiblemente como una molécula que se replica a sí misma, o puede integrada de manera estable en el genoma de la célula hospedadora. Las células hospedadoras de los microorganismos son preferibles. En el marco de la presente solicitud de patente, se entiende que esto incluye a todas las bacterias y todos los protistas (por ejemplo, hongos, en particular, levaduras, y algas), tal como se definen en Schlegel "General Microbiology " (Georg Thieme Publishing House (1985), 1-2), por ejemplo.

Las células hospedadoras adicionales de acuerdo con la invención son células vegetales. En principio, éstas pueden ser células vegetales de cualquier especie vegetal, es decir, tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Éstas son preferentemente células vegetales de plantas con utilidad agrícola, es decir, de plantas, que se cultivan por los seres humanos con fines nutricionales, técnicos o particularmente industriales. La invención se refiere preferentemente a células vegetales y plantas a partir de plantas que almacenan almidón (maíz, arroz, trigo, centeno, avena, cebada, mandioca, patata, sagú, frijol mungo, guisante o sorgo); en particular, células vegetales de plantas de la familia (sistemática) Poacea, particular y preferentemente, de células vegetales de plantas del maíz y del trigo.

Las composiciones que contienen una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención, o un vector de acuerdo con la invención, también son la materia objeto de la presente invención. Las composiciones que contienen una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención, o un vector de acuerdo con la invención, y una célula hospedadora son preferidas. Particular y preferentemente, la célula hospedadora es una célula vegetal, más particular y preferentemente, una célula de plantas de maíz o trigo.

Un aspecto adicional de las composiciones de acuerdo con la invención se refiere a composiciones, que se pueden usar para producir células hospedadoras de acuerdo con la invención, preferentemente para producir células vegetales de acuerdo con la invención. Preferentemente, esto es una composición que contiene una moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención, una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención, o un vector de acuerdo con la invención, y un vehículo biolístico, que es adecuado para la introducción de una moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención en una célula hospedadora. Los vehículos biolísticos preferidos son partículas de tungsteno, oro o materiales sintéticos.

Una realización adicional de composiciones de acuerdo con la invención se refiere a composiciones que contienen una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención, o un vector de acuerdo con la invención, y una célula vegetal y un medio de cultivo sintético. Preferentemente, tales composiciones también contienen polietilenglicol (PEG) además de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención, células vegetales y un medio de cultivo sintético. En el caso de estas composiciones, la molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención se da fuera de la célula vegetal, es decir, está localizada fuera del interior celular de la célula vegetal, que está encerrado mediante una membrana citoplasmática. Los medios de cultivo sintéticos, que son adecuados para el cultivo y/o la transformación de células vegetales, son conocidos por el experto en la materia y están suficientemente descritos en la bibliografía, por ejemplo. Muchos medios de cultivo sintéticos también están disponibles para la compra en el comercio especializado (por ejemplo, DUCHEFA Biochemie B.V., Bélgica).

Una realización adicional de las composiciones de acuerdo con la invención se refiere a composiciones, que se usan para la identificación de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. Preferentemente, tales composiciones contienen moléculas de ácido nucleico adicionales, además de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención, o un vector de acuerdo con la invención, particularmente, las moléculas de ácido nucleico de origen vegetal, que se pueden dar en la forma de ADN genómico, ARNm o como clones en las, así llamadas, bibliotecas de ADN. Las bibliotecas de ADN, que se dan como cósmidos, fagémidos, plásmidos, YAC o BAC son preferidos. Las bibliotecas de ADN pueden contener tanto ADN genómico como ADNc. Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención, moléculas de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención, o un vector de acuerdo con la invención se usan en estas

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composiciones, preferentemente como una muestra de hibridación.

En el presente documento se desvela una proteína, que presenta actividad fosforilante de almidón y que requiere almidón fosforilado como un sustrato. Preferentemente, ésta es una proteína, que presenta actividad fosforilante de almidón fosforilado y que requiere almidón fosforilado como un sustrato.

Una realización adicional de la invención se refiere a una proteína, que presenta actividad fosforilante de almidón y requiere almidón fosforilado como un sustrato, en el que la proteína presenta un dominio de fosfohistidina que tiene una identidad de al menos el 70 % con la secuencia de aminoácidos especificada en la SEQ ID NO 5.

Una realización adicional de la presente invención se refiere a una proteína de acuerdo con la invención, que requiere almidón fosforilado como un sustrato y transfiere un fosfato residual de ATP al almidón fosforilado. Preferentemente, una proteína de acuerdo con la invención transfiere el fosfato beta residual de ATP al almidón fosforilado. Particular y preferentemente, una proteína de acuerdo con la invención transfiere el fosfato beta residual del ATP al almidón fosforilado y el fosfato gamma residual de ATP al agua y por tanto, posee la actividad de una [fosforilado-alfa-1,4-glucan]-agua-diquinasa o una [fosforilado-almidón]-agua-diquinasa.

Una realización adicional de la presente invención se refiere a una proteína de acuerdo con la invención, que se acumula como un producto intermediario fosforilado cuando se transfiere fosfato residual al almidón fosforilado.

Una realización adicional de la presente invención se refiere a una proteína de acuerdo con la invención, que presenta una actividad aumentada de unión a almidón fosforilado en comparación con el almidón no fosforilado.

Una realización adicional de la presente invención se refiere a una proteína de acuerdo con la invención, que introduce más uniones de monoéster de fosfato adicionales en la posición C-3 en comparación con las uniones de monoéster de fosfato en la posición C-6 de las moléculas de glucosa de un almidón fosforilado. Preferentemente, al menos el 30 %, más preferentemente al menos el 60 %, particular y preferentemente al menos el 90 % y lo más preferentemente al menos el 120 % más de uniones de monoéster de fosfato en la posición C-3 de las moléculas de glucosa de un almidón fosforilado se introducen en comparación con las uniones de monoéster de fosfato en la posición C-6 de las moléculas de glucosa de un almidón fosforilado.

Un tema adicional de la presente invención se refiere a una proteína de acuerdo con la invención, que presenta un peso molecular derivado de la secuencia de aminoácidos de 120 kDa a 145 kDa, preferentemente de 120 kDa a 140 kDa, particular y preferentemente, de 125 kDa a 140 kDa y lo más especial y preferentemente, de 130 kDa a 135 kDa.

Una realización adicional de la presente invención se refiere a una proteína de acuerdo con la invención, que presenta un dominio de fosfohistidina. El dominio de fosfohistidina preferentemente contiene dos histidinas residuales.

Un aspecto adicional de la presente invención son proteínas de acuerdo con la invención elegidas del grupo que consiste en

a) Proteínas, que incluyen la secuencia de aminoácidos especificada en la SEQ ID NO 2 o en la SEQ ID NO 4; b) Proteínas, que están codificadas por la región codificante del ADN insertado en el plásmido A.t.-OK1-pGEM o pMI50; o c) Proteínas, que presentan una identidad de al menos el 60 % con la secuencia de aminoácidos de las proteínas especificadas en a) o b).

En una realización adicional, la presente invención se refiere a proteínas de acuerdo con la invención con actividad fosforilante de almidón fosforilado, en la que la proteína codificada presenta una identidad de al menos el 70 %, preferentemente al menos el 80 %, particular y preferentemente al menos el 90 % y más particular y preferentemente al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos especificada en la SEQ ID NO 2 o en la SEQ ID NO 4 o con la secuencia de aminoácidos de una proteína OK1 codificada por la inserción en el plásmido A.t.-OK1pGEM o en el plásmido pMI50.

Una realización adicional de la presente invención se refiere a una proteína de acuerdo con la invención, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos que codifica la proteína presenta un dominio de fosfohistidina. Preferentemente, la proteína de acuerdo con la invención presenta un dominio de fosfohistidina, que tiene una identidad de preferentemente al menos el 70 %, particular y preferentemente de al menos el 80 % y más particular y preferentemente, de al menos el 90 % con la secuencia de aminoácidos especificada en la SEQ ID NO 5.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a un proteína de acuerdo con la invención, en la que la proteína se origina a partir de una planta de Arabidopsis o de arroz.

Una realización adicional de la presente invención se refiere a una proteína de acuerdo con la invención, que presenta una actividad aumentada de unión a almidón fosforilado en comparación con el almidón no fosforilado, en la que la actividad de unión a almidón fosforilado se aumenta por al menos tres veces, preferentemente al menos

cuatro veces, particular y preferentemente, al menos cinco veces y más particular y preferentemente al menos seis veces, en comparación con la actividad de unión de un almidón no fosforilado.

En una realización adicional, la invención también se refiere a proteínas, que están codificadas por moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

5 Descripción de secuencias

SEQ ID NO 1: Secuencia de ácido nucleico que comprende la región codificante de las proteínas A.t.-OK1 de Arabidopsis thaliana. Esta secuencia se inserta en los vectores A.t.-OK1-pGEM y OK1-pDEST17. SEQ ID NO 2: secuencia de aminoácidos que codifica la proteína A.t.-OK1 de Arabidopsis thaliana. Esta secuencia puede derivar de la secuencia de ácido nucleico especificada en la SEQ ID NO 1.

10 SEQ ID NO 3: Secuencia de ácido nucleico que comprende la región codificante de la proteína O.s.-OK1 de Oryza sativa. Esta secuencia se inserta en el vector pMI50. SEQ ID NO 4: Secuencia de aminoácidos que codifica la proteína O.s.-OK1 de Oryza sativa. Esta secuencia puede derivar de la secuencia de ácido nucleico especificada en la SEQ ID NO 3. SEQ ID NO 5: Secuencia de péptidos que codifica el dominio de fosfohistidina de las proteínas OK1 de

15 Arabidopsis thaliana y Oryza sativa.

Descripción de las figuras

Fig. 1: Gel de acrilamida desnaturalizante para la identificación de proteínas de Arabidopsis thaliana, que preferentemente se unen a almidón no fosforilado en comparación con el almidón fosforilado. Un marcador de peso molecular de proteína convencional se muestra en la traza "M". Las proteínas obtenidas tras la incubación de la preparación control C del Ejemplo 1 d) se muestran en la traza "-". Los extractos de proteína de Arabidopsis thaliana, obtenidos tras la incubación con almidón no fosforilado, aislado a partir de hojas de un mutante Arabidopsis thaliana sex1-3 (Preparación B, ejemplo 1 d) se muestran en la traza "K". Los extractos de proteína de Arabidopsis thaliana, obtenidos tras la incubación con almidón, aislado a partir de hojas de un mutante Arabidopsis thaliana sex1-3, que se fosforiló de manera retrospectiva in vitro con una proteína R1 (Preparación A, Ejemplo 1 d) se muestran en la traza "P". Al finalizar la electroforesis, el gel de acrilamida se tiñó con azul de Coomassie.

Fig. 2: Demostración de la autofosforilación de la proteína OK1. La Fig. 2 A) muestra un gel de acrilamida desnaturalizante (SDS) en la finalización de la electroforesis teñido con azul de Coomassie. La Fig. 2 B) muestra la autorradiografía de un gel de acrilamida desnaturalizante (SDS). Se aplicaron las mismas cantidades de las mismas muestras en cada uno de los dos geles. M: marcador de peso molecular de proteína convencional; R1: Muestra del recipiente de reacción 1 de acuerdo con el Ejemplo 7 (tras la incubación de una proteína OK1 con ATP); R2: Muestra del recipiente de reacción 2 de acuerdo con el Ejemplo 7 (tras la incubación de una proteína OK1 con ATP, la proteína se calentó a 95 °C); R3: Muestra del recipiente de reacción 3 de acuerdo con el Ejemplo 7 (tras la incubación de una proteína OK1 con ATP, la proteína se incubó en HCl 0,5 M); R4: Muestra del recipiente de reacción 4 de acuerdo con el Ejemplo 7 (tras la incubación de una proteína OK1 con ATP, la proteína se incubó en NaOH 0,5 M).

Fig. 3: Demostración de la actividad fosforilante de almidón de una proteína OK1 (véase el Ejemplo 6). La proteína OK1 se incubó con almidón no fosforilado aislado de hojas del mutante Arabidopsis thaliana sex1-3 (preparación A) y el almidón aislado de hojas de un mutante Arabidopsis thaliana sex1-3, que se fosforiló de manera retrospectiva in vitro con una proteína R1 (preparación B). La preparación C es la misma que la preparación B, salvo que esta preparación C se incubó sin la proteína OK1. Se llevaron a cabo dos ensayos independientes para cada una de las preparaciones (A, B, C) (Ensayo 1 y Ensayo 2). Las respectivas cantidades se muestran de manera gráfica, medidas en cpm (cuentas por minuto), en fosfato marcado con 33P, que se introdujeron en almidón no fosforilado (preparación A) y almidón fosforilado (preparación B) mediante la proteína OK1.

Fig. 4: Comparación de las posiciones del átomo de C de las moléculas de glucosa del almidón, que se fosforiló a partir de una proteína R1 y de una proteína OK1, respectivamente (véase Ejemplo 9). La proteína OK1 (preparación A) se incubó en presencia de ATP marcado con 33P con almidón aislado a partir de hojas de un mutante Arabidopsis thaliana sex1-3, que se fosforiló de manera retrospectiva in vitro con una proteína R1. La proteína R1 (preparación B) se incubó en presencia de ATP marcado con 33P con almidón aislado a partir de hojas de un mutante Arabidopsis thaliana sex1-3. Al finalizar la incubación, se llevó a cabo la hidrólisis total del almidón y los productos de la hidrólisis se separaron por medio de cromatografía HPAE. Como patrón, se añadió glucosa-6-fosfato y glucosa-3-fosfato a los productos de hidrólisis antes de la separación. Los productos de hidrólisis separados por medio de cromatografía HPAE se recolectaron en fracciones individuales. La glucosa-6-fosfato eludida con la fracción 15 y la glucosa-3-fosfato añadida, con la fracción 17. Las fracciones obtenidas se investigaron posteriormente para la presencia de fosfato marcado de manera radiactiva. La cantidad de fosfato marcado con 33P medida en las fracciones individuales, medidas en cpm (cuentas por minuto), que se introdujo en los productos de hidrólisis del

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almidón fosforilado mediante la proteína OK1 o la proteína R1, se muestra de manera gráfica.

Fig. 5 Demostración de la autofosforilación de la proteína OK1. La Fig 5 A) muestra un análisis de transferencia de Western. La Fig. 5 B) muestra la autorradiografía de un gel de acrilamida desnaturalizante (SDS). Se aplicaron las mismas cantidades de las mismas muestras en cada uno de los dos geles. La proteína OK1 se incubó bien con ATP marcado de manera radiactiva al azar o con ATP marcado de manera radiactiva específicamente en la posición gamma. Al finalizar la incubación, las proteínas se calentaron bien a 30 °C p a 95 °C o se incubaron en NaOH 0,5 M o en HCl 0,5 M, respectivamente.

Fig. 6 Demostración de la transferencia del resto de fosfato beta del ATP al almidón en una reacción catalizada por una proteína OK1. Bien el ATP marcado de manera específica con 33P en la posición gama o bien el ATP con 33P al azar se usó para fosforilar el almidón, que se ha fosforilado in vitro por medio de una proteína R1 y aislado a partir de hijas de un mutante Arabidopsis thaliana sex1-3, por medio de una proteína OK1. No se añadió proteína OK1 en ninguno de los experimentos denominados como "control". Cada preparación se ensayó dos veces, independientemente entre sí. Se muestran los resultados de ambos ensayos.

Fig. 7 Análisis por transferencia de Western de extractos de proteína de plantas que usan un anticuerpo frente a la proteína OK1 de Arabidopsis thaliana. Se muestran los extractos de proteína de hojas de las siguientes plantas: Ara Arabidosis thaliana; 51, 54, 55, 67, 72, 73, 79, 62, 63, 64, 65, 69, 66, 68 son líneas independientes de la transformación 385JH; Tipo silvestre D Solanum tuberosum cv Désirée.

Procedimientos generales

En lo sucesivo, se describen procedimientos, que se pueden usar para llevar a cabo procedimientos descritos en la invención. Estos procedimientos constituyen realizaciones específicas de la presente invención pero no restringen la presente invención a estos procedimientos. El experto en la materia sabe que puede implementar la invención del mismo modo mediante modificación de los procedimientos descritos y/o mediante sustitución de partes individuales de los procedimientos mediante partes alternativas de los procedimientos.

1. Producción de extractos de proteína a partir de tejido vegetal

a) Producción de extractos de proteína a partir de tejido vegetal

El material de la hoja se congela en nitrógeno líquido inmediatamente después de su cosechado, y posteriormente se homogeneiza en el mortero en nitrógeno líquido. El material de la hoja reducido se mezcla con aproximadamente 3,5 veces el volumen (con respecto al peso del material de la hoja usado) de tampón de unión frío (4 °C) y se descompone durante 2 x 10 s con un Ultraturrax (velocidad máxima). Tras el primer tratamiento con un Ultraturrax, el material de hoja reducido se enfría en hielo antes de que se lleve a cabo el segundo tratamiento. El material de hoja tratado se pasa después a través de una malla de nylon de 100 µm y se centrifuga durante 20 min (recipiente de centrifugación de 50 ml, 20.000xg, 4°C).

b) Precipitación de las proteínas contenidas en los extractos de proteína

El sobrenadante obtenido tras la centrifugación de acuerdo con la etapa a) se retira y se determina su volumen. Para precipitar proteínas, se añade sulfato de amonio de manera continua al sobrenadante durante un período de 30 minutos mientras se agita en hielo hasta una concentración final del 75 % (peso/volumen). El sobrenadante se incuba posteriormente durante una hora adicional en hielo mientras se agita. Las proteínas precipitadas a partir del sobrenadante se sedimentan a 20.000xg y 4 °C durante 10 min y los sedimentos se absorben posteriormente en 5 ml de tampón de unión, es decir, se disuelven las proteínas presentes en el sedimento.

c) Desalación de las proteínas precipitadas

Las proteínas disueltas se desalan por medio de una columna PD10 rellena con Sephadex G25 (Amersham Bioscience, Freiburg, N.º de prod. de las columnas: 17, -0851-01, N.º de prod. de Sephadex G25-M: 17-0033-01) a una temperatura de 4 °C, es decir, el sulfato de amonio usado en la etapa b) para la precipitación también se separa de la proteína disuelta. La columna PD10 se equilibra con tampón de unión antes de aplicar las proteínas disueltas de acuerdo con la etapa b). A tal fin, se distribuyen 5 ml de tampón de unión en la columna en cada caso. Posteriormente, se añaden 2,5 ml de la solución de proteína obtenida de acuerdo con la etapa b) en cada columna antes de que se eludan las proteínas de la columna con 3,5 ml de tampón de unión.

d) Determinación de la concentración de proteína

La concentración de proteína se determina con un ensayo Bradford (Biorad, Munich, N.º de prod. 500-0006 (Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72, 248-254)).

e) Composición del tampón de unión [

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una densidad óptica (medida a una longitud de onda de 600 nm; DO600) de aproximadamente 0,8. Si, para la expresión de una proteína fosforilante de almidón, se usa un plásmido de expresión, en el que la expresión de la proteína fosforilante de almidón se inicia por medio de un sistema inducible (por ejemplo, el vector de expresión pDEST™17 en cepas BL21 de E. coli, inducibles por medio de IPTG), entonces, para alcanzar una DO600 de aproximadamente 0,8, el inductor en cuestión (por ejemplo, IPTG) se añade al cultivo principal. Tras añadir el inductor, el cultivo principal se incuba a 30 °C en agitación (250 rpm) hasta que se alcanza una DO600 de aproximadamente 1,8. El cultivo principal se enfría después durante 30 minutos en hielo antes de que las células del medio de cultivo se separen del medio de cultivo mediante centrifugación (10 minutos a 4.000xg y 4 °C).

4. Purificación de una proteína fosforilante de almidón

a) Descomposición de células que expresan una proteína fosforilante de almidón

Las células obtenidas en la etapa c), Procedimientos generales, parte 3, se resuspenden en tampón de lisis. Al hacerlo, se añaden aproximadamente 4 ml de tampón de lisis a aproximadamente 1 g de células. Las células resuspendidas se incuban después durante 30 minutos en hielo antes de que se descompongan con la ayuda de una sonda de ultrasonido (Baudelin Sonoplus UW 2070, Baudelin electronic, Berlín, configuraciones: Ciclo 6, 70 %, 1 minuto) a enfriamiento continuo por medio del hielo. Se debe tener cuidado aquí para asegurar que la suspensión celular no se calienta demasiado durante el tratamiento con ultrasonido. La suspensión obtenida tras el tratamiento con ultrasonido se centrifuga (12 minutos a 20.000xg, 4 °C) y el sobrenadante obtenido tras la centrifugación se filtra usando un filtro con un tamaño de poro de 45 µm.

b) Purificación de la proteína fosforilante de almidón

Si la proteína fosforilante de almidón expresada en células de E. coli es una proteína de fusión con un marcador His, entonces la limpieza puede tener lugar con ayuda de iones de níquel, a los que el marcador His se une con mayor afinidad. Para hacer esto, se mezclan 25 ml del filtrado obtenido en la etapa d) con 1 ml de mezcla Ni-agarosa (Qiagen, N.º de prod.: 30210) y se incuba durante 1 hora en hielo. El combinado de la mezcla de Ni-agarosa con el filtrado se distribuye posteriormente en una columna de poliestireno (Pierce, N.º de prod.: 29920). El producto, que corre a través de la columna, se descarta. A continuación, se lava la columna añadiendo 8 ml de tampón de lisis, el producto, que corre a través de la columna, se descarta de nuevo. La elución de la proteína fosforilante de almidón entonces tiene lugar mediante adición fraccionada a la columna de 1 ml de tampón E1 dos veces, seguido de la adición de 1 ml de tampón E2 una vez y posteriormente, 1 ml de tampón E3 cinco veces. El producto, que corre a través de la columna, que se produce mediante la adición de la fracción individual del tampón de elución apropiado (tampón E1, E2, E3) a la columna, se recoge en fracciones separadas. Las alícuotas de estas fracciones se analizan posteriormente por medio de electroforesis en gel de acrilamida SDS desnaturalizante seguid de una coloración en azul de Coomassie. Las fracciones, que contienen la proteína fosforilante de almidón en cantidad suficiente y pureza satisfactoria, se limpian y se concentran con la ayuda de una filtración presurizada a 4 °C. La filtración presurizada se puede llevar a cabo, por ejemplo, con la ayuda de una célula Amicon (célula de ultrafiltración Amicon, Modelo 8010, N.º de prod.: 5121) usando una membrana Diaflo PM30 (Millipore, N.º de prod.: 13212) a 4 °C. Otros procedimientos conocidos por el experto en la materia también se pueden usar, sin embargo, para la concentración.

g) Composición de los tampones usados

Tampón de lisis: 50 mM HEPES

300 mM NaCl

10 mM Imidazol

pH 8,0 (ajuste con NaOH)

1 mg/ml Lisozima (añadir inmediatamente antes de usar el tampón)

¼ de comprimido por 10 ml de inhibidores de proteasa completamente libres de EDTA, (Roche N.º de producto: 1873580, añadir inmediatamente antes de usar el tampón)

Tampón de elución E1: 50 mM HEPES

300 mM NaCl

50 mM Imidazol

pH 8,0 (ajuste con NaOH)

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Tampón de elución E2: 50 mM HEPES 300 mM NaCl 75 mM Imidazol pH 8,0 (ajuste con NaOH)

Tampón de elución E3: 50 mM HEPES 300 mM NaCl 250 mM Imidazol pH 8,0 (ajuste con NaOH)

5. Expresión recombinante de una proteína R1

La expresión recombinante de una proteína R1 se describe en la bibliografía (Ritte y col., 2002, PNAS 99, 71667171; Mikkelsen y col., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532), pero también se puede llevar a cabo de acuerdo con los procedimientos relacionados con la expresión recombinante de una proteína fosforilante de almidón descrita anteriormente en Procedimientos generales, parte 3.

6. Purificación de una proteína R1

La purificación de una proteína R1 se describe en la bibliografía (Ritte y col., 2002, PNAS 99, 7166-7171; Mikkelsen y col., Mikkelsen y col., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532), pero también se puede llevar a cabo de acuerdo con los procedimientos relacionados con la limpieza de una proteína fosforilante de almidón descrita anteriormente en Procedimientos generales, parte 4 si se produce una proteína de fusión R1 que contiene un marcardor His mediante la expresión de R1 en células de E. coli.

7. Producción in vitro de almidón fosforilado sobre la base de almidón no fosforilado

a) Fosforilación in vitro de almidón no fosforilado

El almidón, que no contiene fosfato de almidón (por ejemplo, aislado de hojas de mutantes Arabidopsis thaliana sex1-3 con la ayuda de procedimientos descritos anteriormente en Procedimientos generales, parte 2) se mezcla con tampón R1 y con proteína R1 purificada (aproximadamente 0,25 µg de proteína R1 por mg de almidón) con el fin de producir un contenido en almidón de 25 mg por ml. Esta preparación de la reacción se incuba durante toda la noche (aproximadamente 15 horas) a temperatura ambiente en agitación. La R1 unida al almidón presente en la preparación de la reacción se retira al completarse la reacción mediante lavado de cuatro veces con aproximadamente 800 µl de SDS al 0,5 % en cada caso. Posteriormente, el SDS aún presente en el almidón fosforilado in vitro se retira mediante el lavado de cinco veces con 1 ml de tampón de lavado en cada caso. Todas las etapas de lavado tienen lugar a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos en agitación. Cada una de las etapas de lavado va seguida de una centrifugación (2 min, 10.000xg) con el fin de separar los gránulos de almidón del respectivo tampón SDS o tampón de lavado.

b) Composición de los tampones usados

Tampón de R1: 50 mM HEPES/KOH, pH 7,5

1 mM EDTA

6 mM MgCl2

0,5 mM ATP

Tampón de lavado: 50 mM HEPES/KOH, pH 7,2

8. Unión de las proteínas a almidón fosforilado y a almidón no fosforilado a) Aislamiento de complejos de proteína almidón-P o de complejos proteína almidón no fosforilado

Aproximadamente 50 mg de almidón-P o aproximadamente 50 mg de almidón no fosforilado respectivamente se resuspenden en preparaciones separadas en aproximadamente 800 µl de extracto de proteína en cada caso. La concentración de proteína de los extractos de proteína debería ser de aproximadamente 4 mg a 5 mg por ml en cada

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se producirían tras la digestión con tripsina de una secuencia de aminoácidos. A partir del conocimiento de los aminoácidos que codifican los péptidos determinados de manera teórica, las masas de los péptidos, que se obtienen tras la teórica digestión con tripsina, también se pueden determinar. Las bases de datos (por ejemplo, NCBInr http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml4.0/msfit.htm; Swissprot http://cbrg.inf.ethz.ch/Server/MassSearch.html), que contienen información referente a las masas de péptidos tras la teórica digestión con tripsina, se pueden comparar, por tanto, con las masas reales de péptidos de proteínas desconocidas obtenidas con MALDI-TOF-MS. Las secuencias de aminoácidos, que tienen las mismas masas de péptidos tras la digestión teórica y/o real con tripsina, deben considerarse como idénticas. Las bases de datos en cuestión contienen ambas masas de péptidos de proteínas, cuya función ya se ha demostrado, y también masas de péptidos de proteínas, que hasta ahora solo existen hipotéticamente por derivación de secuencias de aminoácidos a partir de secuencias de ácido nucleico obtenidas en proyectos de secuenciación. La existencia real y la función de tales proteínas hipotéticas, por tanto, raramente se ha demostrado y, si realmente existe una función, entonces esta se basa solo normalmente en predicciones y no en una demostración real de la función. Las bandas que contiene proteínas identificadas de acuerdo con la etapa a) se retiran del gel de acrilamida; la parte de acrilamida retirada se reduce y se destiñe mediante incubación durante aproximadamente media hora a 37 °C en aproximadamente 1 ml de NH4 50 mM al 60 %, acetonitrilo al 40 %. La solución decolorante se retira posteriormente y el gel restante se seca al vacío (por ejemplo, Speedvac). Tras el secado, se añade la solución de tripsina para digerir las proteínas contenidas en la parte del gel en cuestión. La digestión tiene lugar durante toda la noche a 37 °C. Tras la digestión, se añade un poco de acetonitrilo (hasta que el gel de acrilamida se tiñe de blanco) y la preparación se seca al vacío (por ejemplo, Speedvac). Cuando se ha completado el secado, se añade suficiente ácido fórmico al 5 % como para cubrir los componentes secos y se incuban durante unos pocos minutos a 37 °C. El tratamiento con acetonitrilo seguido del secado se repite una vez más. Los constituyentes secos se absorben posteriormente en TFA al 0,1 % (ácido trifluoroacético, 5 µl a 10 µl) y se administran por goteo en un vehículo en porciones de aproximadamente 0,5 µl. También se aplican cantidades iguales de matriz (ácido ε-ciano-4-hidroxicinámico) al vehículo. Después de que la matriz cristalice, las masas de los péptidos se determinan por medio de MALDI-TOF-MS-MS (por ejemplo, Burker Reflex™ II, Bruker Daltonic, Bremen). Con las masas obtenidas, se busca en las bases de datos secuencias de aminoácidos, que dan las mismas masas tras la digestión teórica con tripsina. De esta forma, se pueden identificar secuencias de aminoácidos, que codifican proteínas, que preferentemente se unen a alfa-1,4-glucanos fosforilados y/o que necesitan P-alfa-1,4-glucanos como sustrato.

11. Procedimiento para demostrar la actividad fosforilante de almidón de una proteína

a) Incubación de proteínas con almidón-P y/o almidón no fosforilado

Con el fin de demostrar si una proteína tiene actividad fosforilante de almidón, las proteínas a investigar se pueden incubar con almidón y ATP marcado de manera radiactiva. Para hacer esto, se incuban aproximadamente 5 mg de almidón-P o aproximadamente 5 mg de almidón no fosforilado con la proteína a investigar (de 0,01 µg a 5,0 µg por mg de almidón usado) en 500 µl de tampón de fosforilación durante 10 minutos a 30 minutos a temperatura ambiente en agitación. La reacción posteriormente se detiene mediante la adición de SDS hasta una concentración del 2 % (peso/volumen). Los gránulos de almidón en la respectiva mezcla de reacción se centrifugan (1 minuto, 13.000xg) y se lavan una vez con 900 µl de una solución de SDS del 2 % y cuatro veces cada uno con 900 µl de una solución de ATP 2 mM. Todas las etapas de lavado se llevaron a cabo durante 15 minutos a temperatura ambiente en agitación. Tras cada etapa de lavado, los gránulos de almidón se separaron del respectivo tampón de lavado mediante centrifugación (1 min, 13.000xg). Además, cuando se llevó a cabo un experimento para demostrar la actividad fosforilante de una proteína, las preparaciones de reacción adicionales, que no contienen proteína o contienen proteína inactiva, pero que de otro modo se tratan de la misma manera que las preparaciones de la reacción descritas, se deben procesar como los, así llamados, controles.

b) Determinación de la cantidad de restos fosfato incorporados en el almidón-P y/o almidón no fosforilado debido a la actividad enzimática

Los gránulos de almidón obtenidos de acuerdo con la etapa a) se pueden investigar para la presencia de restos de fosfato marcados de manera radiactiva. Para hacer esto, el respectivo almidón se resuspende en 100 µl de agua y se mezcla con 3 ml de mezcla de centelleo en cada caso (por ejemplo, Ready Safe™, BECKMANN Coulter) y posteriormente se analiza con la ayuda de un contador de centelleo (por ejemplo Contador de Centelleo Multifunción LS 6500, BECKMANN COULTER™).

c) Identificación de proteínas, que preferentemente usan almidón-P como un sustrato

Si una proteína se incuba en preparaciones separadas, una vez con almidón-P y una vez con almidón no fosforilado, de acuerdo con el procedimiento descrito en a), entonces, mediante la comparación de los valores de a presencia de fosfato de almidón obtenidos de acuerdo con la etapa b), se puede determinar si la proteína en cuestión ha incorporado más fosfato en almidón-P en comparación con el almidón no fosforilado. De esta forma, también se pueden identificar proteínas, que pueden introducir fosfato en almidón-P pero no en almidón no fosforilado. Esto significa que se pueden identificar proteínas, que requieren almidón ya fosforilado como sustrato para una reacción de fosforilación adicional.

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