ES2344113T3 - Procedimientos para identificar proteinas con actividad enzimatica fosforilante de almidon. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para identificar una proteína que presenta actividad enzimática fosforilante de alfa-1,4-glucanos y requiere alfa-1,4-glucanos fosforilados como sustrato en el que a) se incuban extractos de proteína con alfa-1,4-glucanos fosforilados, b) se disuelven proteínas específicamente unidas a los alfa-1,4-glucanos fosforilados de la Etapa a), c) las proteínas obtenidas según la Etapa b) se incuban respectivamente con iATP y alfa-1,4-glucanos fosforilados y iiATP y alfa-1,4-glucanos no fosforilados en preparaciones separadas entre sí, d) se examina el alfa-1,4-glucano respectivo obtenido después de la incubación en la Etapa c) i o la Etapa c) ii para comprobar la introducción de otros grupos fosfato y e) se identifican proteínas que en la preparación de la incubación según c) i han introducido grupos fosfato en alfa-1,4-glucanos en una cantidad que es al menos dos veces superior a la cantidad determinada en experimentos de control y en la preparación de la incubación según c) ii no han introducido grupos fosfato en alfa-1,4-glucanos en una cantidad que es al menos dos veces superior a la cantidad determinada en experimentos de control.
Description
Procedimientos para identificar proteínas con
actividad enzimática fosforilante de almidón.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para identificar proteínas que participan en la
fosforilación de almidón y a ácidos nucleicos que codifican tales
proteínas. La invención se refiere además a células vegetales y
plantas que presentan una elevada actividad de una proteína
identificable usando el procedimiento según la invención. Las
células vegetales y las plantas de este tipo sintetizan un almidón
modificado. Por tanto, la presente invención también se refiere al
almidón sintetizado por las células vegetales y plantas según la
invención, además de a procedimientos para la preparación de este
almidón y a la preparación de derivados de almidón de este almidón
modificado.
Con respecto a la creciente importancia
actualmente atribuida a constituyentes vegetales como fuentes de
material de partida renovables, una de las tareas de la
investigación biotecnológica es intentar adaptar estos materiales
de partida vegetales para adaptar los requisitos de la industria de
procesamiento. Además, con el fin de permitir regenerar materiales
de partida que van a usarse en tantas áreas de aplicación como sean
posibles, es necesario lograr una gran variedad de materiales.
El polisacárido almidón está constituido por
componentes base químicamente uniformes, moléculas de glucosa, pero
constituye una mezcla compleja de diferentes formas de moléculas que
presentan diferencias con respecto al grado de polimerización y
ramificación y, por tanto, se diferencia fuertemente entre sí en sus
características físico-químicas.
Se discrimina entre almidón de amilosa, un
polímero esencialmente no ramificado preparado a partir de unidades
de glucosa glicosídicamente unidas por alfa-1,4, y
almidón de amilopectina, un polímero ramificado en el que las ramas
se producen por la aparición de enlaces
alfa-1,6-glicosídicos adicionales.
Otra diferencia adicional entre amilosa y amilopectina radica en el
peso molecular. Mientras que la amilosa, dependiendo del origen del
almidón, tiene un peso molecular de
5x10^{5}-10^{6} Da, el de la amilopectina se
encuentra entre 10^{7} y 10^{8} Da. Las dos macromoléculas
pueden diferenciarse por su peso molecular y sus diferentes
características físico-químicas que pueden mostrarse
fácilmente la mayoría de las veces por sus diferentes
características de unión a yodo.
La amilosa se ha considerado desde hace tiempo
como un polímero lineal que está constituido por monómeros de
alfa-D-glucosa ligados
glicosídicamente por alfa-1,4. Sin embargo, en
estudios más recientes se ha mostrado la presencia de puntos de
ramificación glicosídicos en alfa-1,6
(aproximadamente el 0,1%) (Hizukuri y Takagi, Carbohydr. Res. 134,
(1984), 1-10; Takeda y col., Carbohydr. Res. 132,
(1984), 83-92).
Las propiedades funcionales tales como, por
ejemplo, la solubilidad, comportamiento de retrogradación, capacidad
de unión al agua, propiedades formadoras de películas, viscosidad,
propiedades de gelatinización, estabilidad a la
congelación-descongelación, estabilidad a ácidos,
concentración de gel y el tamaño de gránulos de almidón de los
almidones están influidos, entre otras cosas, por la relación de
amilosa/amilopectina, peso molecular, patrón de distribución de
cadenas laterales, contenido de iones, contenido de lípidos y
proteínas, tamaño promedio de gránulos de almidón, morfología de
gránulos de almidón, etc. Las propiedades funcionales del almidón
también están influidas por el contenido de fosfato, un componente
no carbonado del almidón. Aquí se hace diferencia entre fosfato,
que está unido covalentemente en forma de monoésteres a las
moléculas de glucosa del almidón (descritas a continuación como
fosfato de almidón), y fosfato en forma de fosfolípidos asociados
al almidón. Además del contenido de fosfato, la influencia sobre las
propiedades funcionales del almidón también depende en este caso de
la forma (fosfato o fosfolípido de almidón) en el que el fosfato se
produce en el almidón (Jane y col., 1996, Cereal Foods World 41
(11), 827-832).
El contenido de fosfato de almidón varía según
la especie de planta. Por tanto, ciertos mutantes de maíz, por
ejemplo, sintetizan un almidón con elevado contenido de fosfato de
almidón (0,002% de maíz ceroso y 0,013% de maíz de alta amilosa),
mientras que tipos convencionales de maíz sólo tienen trazas de
fosfato de almidón. Asimismo, pequeñas cantidades de fosfato de
almidón se encuentran en trigo (0,001%), mientras que no pudo
detectarse fosfato de almidón en avena y sorgo. Asimismo, en los
mutantes de arroz se encontró menos fosfato de almidón (0,003% de
arroz ceroso) que en especies convencionales de arroz (0,013%). Se
detectaron cantidades significativas de fosfato de almidón en
plantas sintetizadoras de almidón almacenadoras en tubérculos o
raíces tales como, por ejemplo, tapioca (0,008%), boniato (0,011%),
arrurruz (0,021%) o patata (0,89%). Los valores en porcentaje del
contenido de fosfato de almidón citados anteriormente se refieren al
peso seco de almidón en cada caso y han sido determinados por Jane
y col. (1996, Cereal Foods World 41 (11),
827-832).
El fosfato de almidón puede estar presente en
forma de monoésteres en la posición C-2,
C-3 o C-6 de los monómeros de
glucosa polimerizada (Takeda y Hizukuri, 1971, Starch/Stärke 23,
267-272). La distribución de fosfato del fosfato de
almidón en almidón sintetizado por plantas se distingue generalmente
por el hecho que aproximadamente del 30% al 40% de los residuos de
fosfato están covalentemente unidos en la posición
C-3 y aproximadamente del 60% al 70% del residuo de
fosfato está covalentemente unido en la posición C-6
de la molécula de glucosa (Blennow y col., 2000, Int. J. of
Biological Macromolecules 27, 211-218). Blennow y
col. (2000, Carbohydrate Polymers 41, 163-174) han
determinado un contenido de fosfato de almidón que está unido en la
posición C-6 de la molécula de glucosa para
diversos almidones tales como, por ejemplo, almidón de patata (entre
7,8 y 33,5 nmoles por mg de almidón, dependiendo del tipo), almidón
de diversas especies de Curcuma (entre 1,8 y 63 nmoles por
mg), almidón de tapioca (2,5 nmoles por mg de almidón), almidón de
arroz (1,0 nmoles por mg de almidón), almidón de judía mungo (3,5
nmoles por mg de almidón) y almidón de sorgo (0,9 nmoles por mg de
almidón). Estos autores no han podido mostrar ningún fosfato de
almidón unido en la posición C-6 en almidón de
cebada y almidones de diferentes mutantes cerosos de maíz. Hasta la
fecha no ha sido posible establecer una conexión entre el genotipo
de una planta y el contenido de fosfato de almidón (Jane y col.,
1996, Cereal Foods World 41 (11), 827-832). Por
tanto, actualmente no es posible influir el contenido de fosfato de
almidón en plantas por medio de cultivo.
En plantas transgénicas puede variar la cantidad
de fosfato de almidón en almidones de almacenamiento. Por tanto, el
almidón de almacenamiento de plantas de patata que presentan una
actividad reducida de sintasa III de almidón soluble (Abel y col.,
1996, The Plant Journal 10(6), 9891-991),
enzima I de ramificación (BEI) (Safford y col., 1998, Carbohydrate
Polymers 35, 155-168), enzima II de ramificación
(BEII) (Jobling y col., 1999, The Plant Journal 18,
163-171), BEI y BEII (Schwall y col., 2000, Nature
Biotechnology 18, 551- 554), una enzima de desproporción (documento
WO 96 27673) o una enzima de desproporción y una BEI (documento WO
95 07355) muestran un contenido elevado de fosfato de almidón en
comparación con almidón de plantas naturales correspondientes. Sin
embargo, la alteración en el contenido de fosfato de almidón en
estas plantas no es debida a las proteínas cuya actividad está
reducida en estas plantas, participando directamente en la
introducción de residuos de fosfato en el almidón. Por tanto, el
aumento en el contenido de fosfato de almidón en las plantas
transgénicas en cuestión no es un efecto primario, sino secundario,
que se provoca mediante la reducción de las proteínas
correspondientes. La razón para el aumento en el contenido de
fosfato de almidón como resultado de la modificación de dichas
actividades de proteínas está aún sin explicar. Por tanto, no es
posible modificar específicamente el contenido de fosfato de
almidón modificando las actividades de proteínas que sólo influyen
el contenido de fosfato de almidón por un efecto secundario. Además,
el modificar las actividades de proteínas que como efecto
secundario tienen una influencia sobre el contenido de fosfato de
almidón en plantas también provoca adicionalmente modificaciones en
el almidón tales como, por ejemplo: cambios en la relación de
amilosa/amilopectina y/o la longitud de las cadenas laterales de la
amilopectina que constituye el efecto primario de los cambios en
tales actividades de proteínas.
Previamente sólo se ha descrito una proteína que
media en la introducción de enlaces covalentes de residuos de
fosfato en las moléculas de glucosa de almidón. Esta proteína,
frecuentemente designada R1 en la bibliografía científica, se une a
los gránulos de almidón del almidón de almacenamiento en tubérculos
de patata (Lorberth y col., 1998, Nature Biotechnology 16,
473-477) y tiene la actividad enzimática de una
alfa-glucano agua dicinasa (E.C. 02.07.09.4). En la
reacción catalizada por R1, los eductos
alfa-1,4-glucano (almidón),
adenosina-trifosfato (ATP) y agua se convierten en
los productos glucano-fosfato (almidón fosforilado),
monofosfato y adenosina-monofosfato. En este caso,
el residuo de gamma-fosfato en el ATP se transfiere
al agua y el residuo de beta-fosfato del ATP se
transfiere al glucano (almidón). R1 se transfiere in vitro el
residuo de beta-fosfato del ATP a la posición
C-6 y C-3 de las moléculas de
glucosa de alfa-1,4-glucanos. La
relación de fosfato en C-6 respecto a fosfato en
C-3 que se obtiene en la reacción in vitro se
corresponde con la relación que está presente en almidón aislado de
plantas (Ritte y col., 2002, PNAS 99, 7166-7171).
Como aproximadamente el 70% del fosfato de almidón presente en
almidón de patata está unido a los monómeros de glucosa del almidón
en la posición C-6 y aproximadamente el 30% en la
posición C-3, esto significa que R1 fosforila
preferentemente la posición C-6 de las moléculas de
glucosa. Además, se ha mostrado usando amilopección de maíz que,
entre otras cosas, R1 puede fosforilar
alfa-1,4-glucanos que todavía no
contienen fosfato covalentemente unido (Ritte y col., 2002, PNAS
99, 7166-7171), es decir, R1 puede introducir
fosfato de novo en
alfa-1,4-glucanos.
La secuencia de aminoácidos de R1 contiene un
dominio que presenta un alto grado de homología con piruvato
fosfato dicinasas conocidas (dominios PPDK) y piruvato agua
dicinasas conocidas (dominios PPS) y contiene un residuo de
histidina conservado en dominios PPDK y PPS. Durante la
transferencia de residuos de fosfato del ATP a
alfa-1,4-glucanos (almidón) se forma
un proteína R1 fosforilada como producto intermedio estando
presente un residuo de fosfato unido covalentemente al residuo de
histidina conservado en el dominio PPDK o PPS (Mikkelsen y col.,
2004, Biochemical Journal 377, 525-532).
Las secuencias de ácidos nucleicos y secuencias
de aminoácidos correspondientes a éstos que codifican una proteína
R1 se describen a partir de diversas especies tales como, por
ejemplo, patata (documento WO 97 11188, registro de GenBank:
AY027522, Y09533), trigo (documentos WO 00 77229, US 6.462.256,
registro de GenBank: AAN93923, registro de GenBank: AR236165),
arroz (registro de GenBank: AAR61445, registro de GenBank:
AR400814), maíz (registro de GenBank: AAR61444, registro de
GenBank: AR400813), soja (registro de GenBank: AAR61446, registro
de GenBank: AR400815), cítrico (registro de GenBank: AY094062) y
Arabidopsis (registro de GenBank: AF312027).
Las plantas de trigo que presentan una elevada
actividad de una proteína R1 como resultado de la sobreexpresión de
un gen R1 de patata se describen en el documento WO 02 34923. En
comparación con las plantas naturales correspondientes en las que
no pudo detectarse fosfato de almidón, estas plantas sintetizan un
almidón que tiene cantidades significativas de fosfato de almidón
en la posición C-6 de las moléculas de glucosa.
Hasta la fecha no se han descrito otras
proteínas que catalicen una reacción que introduzca grupos fosfato
unidos covalentemente en el almidón. Tampoco se conocen enzimas que
introduzcan preferentemente grupos fosfato en la posición
C-3 y/o la posición C-2 de las
moléculas de glucosa de almidón. Por tanto, aparte de aumentar el
contenido de fosfato de almidón en las plantas, no hay rutas
disponibles para influir específicamente la fosforilación de
almidón en plantas, modificando la distribución de fosfato dentro
del almidón sintetizado por plantas y/o aumentando adicionalmente el
contenido de fosfato de almidón.
Por tanto, el objeto de la presente invención es
proporcionar procedimientos y medios para producir plantas que
sinteticen un almidón modificado que tenga un contenido elevado de
fosfato y/o distribución de fosfato modificada, además de
proporcionar células vegetales y/o plantas que sinteticen un almidón
modificado tal.
Este problema se resuelve por las realizaciones
descritas en las reivindicaciones.
La presente invención describe un procedimiento
para identificar una proteína que tiene una elevada actividad de
unión hacia alfa-1,4-glucanos
fosforilados, en comparación con
alfa-1,4-glucanos no
fosforilados.
Un procedimiento tal se describe más adelante en
Procedimientos generales, Punto 8.
Un objeto de la presente invención es un
procedimiento para identificar una proteína que presenta actividad
enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos y requiere
alfa-1,4-glucanos fosforilados como
sustrato, en el que
- a)
- se incuban extractos de proteína con alfa-1,4-glucanos fosforilados,
- b)
- se disuelven proteínas específicamente unidas a los alfa-1,4-glucanos fosforilados de la Etapa a),
- c)
- las proteínas obtenidas según la Etapa b) se incuban respectivamente con
- i)
- ATP y alfa-1,4-glucanos fosforilados y
- ii)
- ATP y alfa-1,4-glucanos no fosforilados en preparaciones separadas entre sí,
- d)
- se examina el alfa-1,4-glucano respectivo obtenido después de la incubación en la Etapa c) i o la Etapa c) ii para la introducción de otros grupos fosfato y
- e)
- se identifican proteínas que en la preparación de la incubación según c) i han introducido cantidades significativas de grupos fosfato en alfa-1,4-glucanos y en la preparación de la incubación según c) ii han introducido cantidades no significativas de grupos fosfato en alfa-1,4-glucanos.
\vskip1.000000\baselineskip
El término "actividad de unión elevada"
debe entenderse conjuntamente con la presente invención como un
aumento de la afinidad de una proteína por un primer sustrato en
comparación con un segundo sustrato, es decir, que la cantidad de
proteína que bajo las mismas condiciones de incubación se une cada
vez más a un primer sustrato en comparación con un segundo sustrato
presenta una elevada actividad de unión por el primer sustrato.
El término
"alfa-1,4-glucano" debe
entenderse conjuntamente con la presente invención como un glucano
que está constituido principalmente por bloques de construcción de
glucosa ligados por alfa-1,4, pero también puede
contener enlaces alfa-1,6 como ramas. Un
alfa-1,4-glucano contiene
preferentemente hasta el 15%, particularmente preferentemente hasta
el 10% y especialmente preferentemente hasta el 5% de enlaces
alfa-1,6.
El término "fosfato de almidón" debe
entenderse conjuntamente con la presente invención como grupos
fosfato unidos covalentemente a las moléculas de glucosa de un
alfa-1,4-glucano.
El término
"alfa-1,4-glucano no
fosforilado" debe entenderse conjuntamente con la presente
invención como un alfa-1,4-glucano
que contiene cantidades no detectables de fosfato de almidón.
El término
"alfa-1,4-glucano fosforilado"
o
"P-alfa-1,4-glucano"
debe entenderse conjuntamente con la presente invención como un
alfa-1,4-glucano que contiene
fosfato de almidón.
Básicamente, una proteína identificable usando
un procedimiento según la invención puede proceder de cualquier
organismo. La proteína procede preferentemente de organismos
vegetales, preferentemente de plantas almacenadoras de almidón
(maíz, arroz, trigo, centeno, avena, cebada, mandioca, patata,
boniato, sagú, judía mungo, banana, guisante, Arabidopsis,
Curcuma o sorgo), particularmente preferentemente de plantas de
patata, cebada, remolacha azucarera, Arabidopsis o arroz y
especialmente preferentemente plantas de Arabidopsis o
arroz.
En otra realización del procedimiento según la
invención, los extractos de proteína proceden de células eucariotas,
preferentemente de células vegetales, particularmente
preferentemente de células de plantas almacenadoras de almidón
(maíz, arroz, trigo, centeno, avena, cebada, mandioca, patata,
boniato, sagú, judía mungo, banana, guisante, Arabidopsis,
cúrcuma o sorgo).
Básicamente, todos los
alfa-1,4-glucanos no fosforilados
son adecuados para incubar extractos de proteína con
alfa-1,4-glucanos no fosforilados
para implementar el procedimiento según la invención.
Preferentemente se usa un almidón vegetal no fosforilado,
particularmente preferentemente almidón de trigo y especialmente
preferentemente almidón de hojas granular del mutante
sex1-3 de Arabidopsis thaliana
(Tien-Shin Yu y col., 2001, Plant Cell 13,
1907-1918).
Los procedimientos para aislar almidón, por
ejemplo, de plantas son conocidos para el experto en la materia.
Todos los procedimientos conocidos para el experto en la materia son
básicamente adecuados para aislar almidón no fosforilado de
especies vegetales apropiadas. Preferentemente se usa el
procedimiento para aislar
alfa-1,4-glucanos no fosforilados
descrito más adelante (véase Procedimientos generales, Punto 2).
Básicamente, todos los
alfa-1,4-glucanos que contienen
fosfato de almidón son adecuados para incubar extractos de proteína
con
P-alfa-1,4-glucanos
para implementar el procedimiento según la invención. Los almidones
químicamente fosforilados también pueden usarse en este caso. Para
la incubación con extractos de proteína se usan preferentemente
P-alfa-1,4-glucanos
vegetales, particularmente preferentemente un almidón vegetal
enzimáticamente fosforilado posteriormente, especialmente
preferentemente un almidón granular vegetal enzimáticamente
fosforilado posteriormente que se aisló a partir de un mutante
sex1-3 de Arabidopsis thaliana.
Una fosforilación enzimática posterior de
alfa-1,4-glucanos no fosforilados
pueden llevarse a cabo con cualquier enzima que transfiera residuos
de fosfato a alfa-1,4-glucanos no
fosforilados mediante introducción de enlaces covalentes. Para este
fin se usa preferentemente una enzima que tiene la actividad de una
agua glucano dicinasa (proteína R1, E.C.: 02.07.09.4) (Ritte y
col., 2002, PNAS 99, 7166-7171; Mikkelsen y col.,
2004, Biochemical Journal 377, 525-532). Para la
fosforilación enzimática posterior de
alfa-1,4-glucanos no fosforilados se
usa preferentemente una proteína R1 purificada, especialmente una
proteína R1 de patata producida por expresión heteróloga en E.
coli.
Los procedimientos para purificar una proteína
R1 producida recombinantemente por expresión en E. coli se
describen en Ritte y col. (2002, PNAS 99, 7166-7171)
y Mikkelsen y col. (2003, Biochemical Journal 377,
525-532).
Cuando se implementa el procedimiento según la
invención, los complejos de
P-alfa-1,4-glucano-proteína
pueden formarse por incubación de extractos de proteína con
P-alfa-1,4-glucanos
y/o alfa-1,4-glucanos no
fosforilados como resultado de la unión de proteínas a
P-alfa-1,4-glucanos
y pueden formarse complejos de
alfa-1,4-glucano no
fosforilado-proteína como resultado de la unión de
proteínas a alfa-1,4-glucanos no
fosforilados.
Las proteínas presentes en los complejos de
P-alfa-1,4-glucano-proteína
o complejos de alfa-1,4-glucano no
fosforilado-proteína cuando se implementa el
procedimiento según la invención se disuelven, es decir, se rompe
la unión de las proteínas en cuestión con respecto a los
alfa-1,4-glucanos respectivos. Así
se obtienen las proteínas de unión a
P-alfa-1,4-glucano
disueltas y/o las proteínas de unión a
alfa-1,4-glucano no fosforilado
disueltas. Básicamente pueden usarse todas las sustancias que
previenen la interacción de
proteína-alfa-1,4-glucano
existente para romper la unión entre los
alfa-1,4-glucanos en cuestión y las
proteínas unidas a ellos. Para este fin se prefieren disoluciones
de tampón que contiene detergentes, particularmente preferentemente
disoluciones de tampón que contienen laurilsulfato de sodio (SDS),
especialmente preferentemente la disolución de tampón descrita
adicionalmente más adelante (véase Procedimientos generales, Punto
8).
Puede usarse cualquier procedimiento que permita
separar los alfa-1,4-glucanos de las
sustancias disueltas tales como proteínas y, por ejemplo, ATP de la
preparación de la incubación, para separar
alfa-1,4-glucanos de ATP y/o
proteínas. Si se usan
alfa-1,4-glucanos solubles para la
incubación de extractos de proteína con
alfa-1,4-glucanos cuando se
implementa el procedimiento según la invención, la separación puede
implicar, por ejemplo, una precipitación de los
alfa-1,4-glucanos, preferentemente
una precipitación con disolventes adecuados, particularmente
preferentemente una precipitación con alcoholes. La separación de
alfa-1,4-glucanos mediante unión a
sustancias que unen selectivamente
alfa-1,4-glucanos (por ejemplo,
concavalina A) también es adecuada para separar
alfa-1,4-glucanos de sustancias en
disolución.
Para la separación de
alfa-1,4-glucanos aquí se usa
preferentemente la filtración, particularmente preferentemente
centrifugación, especialmente preferentemente el procedimiento
descrito adicionalmente más adelante (véase Procedimientos
generales, Punto 8).
Cuando se implementa el procedimiento según la
invención, todos los procedimientos conocidos para el experto en la
materia tales como procedimientos cromatográficos, por ejemplo,
precipitación y posterior centrifugación del
alfa-1,4-glucano, digestión
enzimática de los alfa-1,4-glucanos,
filtración en gel, etc. que conducen a la separación de proteínas
solubles de alfa-1,4-glucanos pueden
usarse básicamente para separar proteínas solubles de los
alfa-1,4-glucanos. Las proteínas de
unión a
P-alfa-1,4-glucano
disueltas y/o proteínas de unión a
alfa-1,4-glucano no fosforilado
disueltas se separan preferentemente de los
alfa-1,4-glucanos usados en el
procedimiento según la invención con la ayuda de centrifugación.
En otra realización de la presente invención,
cuando se implementa el procedimiento según la invención, la
centrifugación usando una almohadilla Percoll se usa para separar
complejos de
P-alfa-1,4-glucano-proteína
de proteínas no contenidas en los complejos en cuestión.
El procedimiento descrito adicionalmente más
adelante (véase Procedimientos generales, Punto 8) se usa
preferentemente aquí para separar las proteínas no unidas a los
alfa-1,4-glucanos. Después de
llevarse a cabo la centrifugación usando una almohadilla Percoll,
las proteínas no unidas a
P-alfa-1,4-glucanos
o no unidas a alfa-1,4-glucanos no
fosforilados se localizan en el sobrenadante del medio de
centrifugación, mientras que los complejos de
P-alfa-1,4-glucano-proteína
o complejos de alfa-1,4-glucano no
fosforilado-proteína están presentes en el
sedimento sedimentado. El sobrenadante del medio de centrifugación
se desecha y el sedimento se lava preferentemente con el tampón
usado para la incubación para más purificación de los complejos de
P-alfa-1,4-glucano-proteína
o complejos de
alfa-1,4-glucano
no fosforilado-proteína. El sedimento se lava preferentemente una vez, particularmente preferentemente dos veces.
no fosforilado-proteína. El sedimento se lava preferentemente una vez, particularmente preferentemente dos veces.
Básicamente puede usarse cualquier tipo de
extracto de proteína para llevar a cabo el procedimiento según la
invención para identificar una proteína que presenta una actividad
enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos y requiere
alfa-1,4-glucanos fosforilados como
sustrato. Aquí pueden participar tanto los llamados extractos
brutos de proteína como los extractos de proteína parcialmente o
completamente purificada. Por tanto, por ejemplo, es ventajoso usar
proteínas que se identificaron usando un procedimiento según la
invención para identificar una proteína que presenta una elevada
actividad de unión hacia
alfa-1,4-glucanos fosforilados en
comparación con alfa-1,4-glucanos no
fosforilados. Las proteínas que se identificaron usando un
procedimiento según la invención para identificar una proteína que
presenta una elevada actividad de unión hacia
alfa-1,4-glucanos fosforilados en
comparación con alfa-1,4-glucanos no
fosforilados pueden usarse, por ejemplo, omitiendo las etapas de
procedimiento a) y b) directamente en la Etapa c) del procedimiento
según la invención para identificar una proteína que presenta
actividad enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos y requiere
alfa-1,4-glucanos fosforilados como
sustrato.
Básicamente son adecuados todos los
procedimientos generales conocidos para el experto en la materia tal
como se describen, por ejemplo, en Scopes (1993, Protein
Purification: Principles & Practice, ISSN: 038794072) para
producir extractos de proteína de células procariotas o eucariotas
para implementar el procedimiento según la invención. Sin embargo,
para implementar el procedimiento se usan preferentemente
procedimientos para el aislamiento de proteínas vegetales (por
ejemplo, descritos en Bollag y col., 1996, en: "Protein
Methods", 2ª edición, Wiley, ISBN:
0-4,71-11837-0;
Dennison, 2003, en: "A Guide to Protein Isolation" 2ª edición,
Kluwer Academic Publishers, ISBN
1-4020-1224-1),
particularmente preferentemente el procedimiento descrito
adicionalmente más adelante (véase Procedimientos generales, Punto
1).
La incubación de extractos de proteína para
implementar el procedimiento según la invención con
P-alfa-1,4-glucanos
o alfa-1,4-glucanos no fosforilados
tiene lugar en preparaciones separadas. Las preparaciones relevantes
para
P-alfa-1,4-glucanos
o alfa-1,4-glucanos no fosforilados
se tratan por separado entre sí durante la implementación de todo
el procedimiento. En este caso van a incubarse respectivamente las
mismas cantidades de extracto de proteína con respectivamente las
mismas cantidades de
P-alfa-1,4-glucanos
o alfa-1,4-glucanos no fosforilados.
Preferentemente se incuban respectivamente 1 a 10 mg,
particularmente preferentemente 3 a 7 mg y especialmente
preferentemente 4 a 6 mg de extracto de proteína con
P-alfa-1,4-glucanos
o alfa-1,4-glucanos no fosforilados.
La cantidad de
P-alfa-1,4-glucanos
o alfa-1,4-glucanos no fosforilados
usada es preferentemente respectivamente 10 a 100 mg,
particularmente preferentemente 30 a 70 mg y especialmente
preferentemente 45 a 55 mg.
Pueden usarse diversos tampones para la
incubación de extractos de proteína con
P-alfa-1,4-glucanos
para implementar el procedimiento según la invención. Básicamente
son adecuados todos los tampones que permiten la unión de las
proteínas que van a identificarse al sustrato en cuestión.
Preferentemente se usa el tampón descrito adicionalmente más
adelante (véase Procedimientos generales, Punto 1).
El término "proteína que presenta una
actividad enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos y requiere
alfa-1,4-glucanos fosforilados como
sustrato" debe entenderse conjuntamente con la presente invención
como una proteína que introduce residuos de fosfato covalentemente
en
P-alfa-1,4-glucanos,
es decir, usa
P-alfa-1,4-glucanos
como sustrato para la transferencia de residuos de fosfato,
mientras que los
P-alfa-1,4-glucanos
no fosforilados no se fosforilan por una proteína en cuestión, es
decir, los
P-alfa-1,4-glucanos
no fosforilados no sirven como sustrato para una reacción de
fosforilación.
En otra realización, el procedimiento según la
invención para identificar una proteína que presenta una actividad
enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos y requiere
alfa-1,4-glucanos fosforilados como
sustrato se refiere a un procedimiento para identificar una
proteína que usa ATP como sustrato adicional.
En esta realización de la presente invención, el
ATP se usa como un sustrato adicional (co-sustrato)
por la proteína que presenta una actividad enzimática fosforilante
de alfa-1,4-glucanos y requiere
alfa-1,4-glucanos fosforilados como
sustrato, es decir, la proteína en cuestión transfiere un residuo de
fosfato de ATP a un
P-alfa-1,4-glucano
ya fosforilado.
La actividad de una proteína que usa ATP como
co-sustrato para la transferencia de residuos de
fosfato a
P-alfa-1,4-glucanos
puede demostrarse, es decir, usando ATP que contiene un residuo de
fosfato marcado (ATP marcado). Se prefiere ATP en el que el residuo
de fosfato está específicamente marcado en la posición beta, es
decir, en el que sólo el residuo de fosfato en la posición beta
tiene una marca. Preferentemente se usa ATP radiactivamente
marcado, particularmente preferentemente ATP en el que el residuo de
fosfato está específicamente radiactivamente marcado en la posición
beta, y especialmente preferentemente ATP en el que el residuo de
fosfato está específicamente marcado con ^{33}P en la posición
beta. Si se incuba una proteína fosforilante de
P-alfa-glucano con
P-alfa-1,4-glucanos
en presencia de ATP marcado, entonces puede detectarse el fosfato
marcado unido covalentemente al
P-alfa-1,4-glucano.
En este caso, los P-alfa glucanos usados para la
reacción de fosforilación pueden estar presentes tanto en forma de
almidón vegetal que contiene fosfato de almidón (almidón de patata,
almidón de Curcuma armada, C. zedoaria, C. longa, arroz,
judías mungo, tapioca, etc.) como también en forma de
P-alfa-1,4-glucanos
enzimáticamente fosforilados o
P-alfa-1,4-glucanos
químicamente fosforilados. Preferentemente se usa almidón de hojas
de Arabidopsis thaliana, particularmente preferentemente
almidón de mutantes sex1-3 de Arabidopsis
thaliana enzimáticamente fosforilados por medio de una proteína
R1.
Pueden demostrarse residuos de fosfato marcados
que pueden incorporarse en un
P-alfa-1,4-glucano
por una proteína, por ejemplo, después de la separación del
P-alfa-1,4-glucano
marcado (por ejemplo, mediante precipitación de los
alfa-1,4-glucanos por medio de
etanol, filtración, procedimientos cromatográficos, centrifugación,
etc.) del resto de la mezcla de reacción y posterior detección de
los residuos de fosfato marcados en la fracción de
P-alfa-1,4-glucanos
relevantes. Al mismo tiempo, los residuos de fosfato marcados unidos
en la fracción de
P-alfa-1,4-glucanos
pueden demostrarse, por ejemplo, determinando la cantidad de
radiactividad presente en la fracción de
P-alfa-1,4-glucanos
(por ejemplo, por medio de contadores de centelleo).
En otra realización, el procedimiento según la
invención para identificar una proteína que presenta una actividad
enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos y requiere
alfa-1,4-glucanos fosforilados como
sustrato se refiere a un procedimiento en el que la proteína que
tiene actividad enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos usa
P-almidón como sustrato. Se prefiere particularmente
el almidón aislado de un mutante sex1-3 de
Arabidopsis thaliana, que posteriormente se fosforiló
enzimáticamente. Para implementar esta realización preferida del
procedimiento según la invención, un almidón fosforilado se usa por
consiguiente en las etapas de procedimiento c) i y un almidón no
fosforilado se usa en la etapa de procedimiento c) ii.
Así es posible identificar proteínas que
fosforilan P-almidón. Tales proteínas son
especialmente adecuadas para modificar almidón en organismos
vegetales por medio de manipulación genética de plantas
apropiadas.
En otra realización, el procedimiento según la
invención para identificar una proteína que presenta una actividad
enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos y requiere
alfa-1,4-glucanos fosforilados como
sustrato se refiere a un procedimiento para identificar una
proteína en el que la proteína se produce como un producto
intermedio fosforilado durante la transferencia de un residuo de
fosfato a un
P-alfa-1,4-glucano.
Dicho producto intermedio se forma preferentemente por
autofosforilación de la proteína en cuestión.
Una proteína fosforilada que se produce como un
producto intermedio como resultado de la fosforilación mediada por
proteínas de
P-alfa-1,4-glucanos
puede demostrarse como se describe en Ritte y col. (2002, PNAS 99,
7166-7171) para una proteína R1.
Con el fin de detectar la presencia de un
producto intermedio autofosforilado, una proteína se incuba primero
en ausencia de glucanos con ATP marcado, preferentemente con ATP
marcado específicamente en la posición de
beta-fosfato, particularmente preferentemente con
ATP marcado específicamente con ^{33}P en la posición de
beta-fosfato durante 15 a 45 minutos,
particularmente preferentemente durante 20 a 40 minutos y
especialmente preferentemente durante 25 a 30 minutos en una
preparación de reacción 1. Paralelamente a ésta, una preparación de
reacción 2 que contiene cantidades correspondientes de ATP no
marcado en lugar de ATP marcado se incuba bajo por lo demás las
mismas condiciones. Entonces, el ATP no marcado se añade a la mezcla
de reacción 1 en exceso y una mezcla de ATP no marcado y ATP
marcado (la misma cantidad de ATP marcado que se usa previamente en
la mezcla de reacción 1 y la misma cantidad de ATP no marcado que se
añade en exceso a la mezcla de reacción 1) se añade a la mezcla de
reacción 2 y se incuba durante otros 1 minuto a 5 minutos,
preferentemente durante 2 a 5 minutos y especialmente
preferentemente durante 3 minutos antes de añadirse
P-alfa-1,4-glucanos
a una Parte A de la mezcla de reacción 1 (Parte 1A) o a una Parte A
de la mezcla de reacción 2 (Parte 2A). La reacción en la Parte 1B y
Parte 2B restante de la mezcla de reacción se detiene
desnaturalizando la proteína. La Parte B de la mezcla de reacción
puede detenerse mediante los procedimientos conocidos para el
experto en la materia que conducen a la desnaturalización de
proteínas, preferentemente añadiendo laurilsulfato de sodio (SDS).
La Parte 1A y la Parte 2A de las mezclas de reacción se incuban
durante al menos otros 10 minutos antes de que estas reacciones
también se detengan. Los
alfa-1,4-glucanos presentes en la
Parte A o la Parte B de las mezclas de reacción respectivas se
separan del resto respectivo de las mezclas de reacción. Si los
alfa-1,4-glucanos respectivos se
separan, por ejemplo, por centrifugación, entonces al completarse la
centrifugación los alfa-1,4-glucanos
de la Parte A o la Parte B respectiva de la mezcla de reacción van
a encontrarse en el sedimento sedimentado, y las proteínas en las
mezclas de reacción respectivas van a encontrarse en el sobrenadante
de la centrifugación respectiva. El sobrenadante de la Parte 1A o
2A y de la Parte 1B o 2B de la mezcla de reacción puede entonces
analizarse, por ejemplo, respectivamente en una electroforesis en
gel de acrilamida desnaturalizante, seguida de autorradiografía del
gel de acrilamida obtenido. Para cuantificar la cantidad de
proteínas radiactivamente marcadas que se han separado por medio de
electroforesis en gel de acrilamida puede usarse el llamado
procedimiento de, por ejemplo, "detección y cuantificación de la
radiactividad" conocido para el experto en la materia. Si la
autorradiografía o el análisis por medio del "sistema de detección
y cuantificación de la radiactividad" de proteínas en el
sobrenadante de centrifugación de la Parte B de la mezcla de
reacción 1 muestra una señal significativamente aumentada en
comparación con el sobrenadante de centrifugación de la Parte A de
la mezcla de reacción 1, entonces esto muestra que una proteína que
media en una fosforilación de alfa-glucanos se
produce como producto intermedio autofosforilado. Las Partes A y B
de la mezcla de reacción 2 sirven de control y, por tanto, no deben
presentar una señal significativamente aumentada en el sobrenadante
de centrifugación en la autorradiografía o en el análisis por medio
del "sistema de detección y cuantificación de la
radiactividad".
Además, los
alfa-1,4-glucanos de la Parte A
respectiva de las mezclas de reacción 1 y 2 restantes en el
sedimento sedimentado respectivo pueden investigarse, si es
necesario después del lavado posterior de los
alfa-1,4-glucanos respectivos, para
la presencia de fosfato de almidón que tiene una marca
correspondiente al ATP marcado usado. Si los
alfa-1,4-glucanos de la Parte A de
la mezcla de reacción 1 contienen residuos de fosfato marcados, y
si la autorradiografía del sobrenadante de centrifugación de la
Parte B de la mezcla de reacción 1 muestra una señal
significativamente aumentada en la autorradiografía en comparación
con el sobrenadante de centrifugación de la Parte A de la mezcla de
reacción 1, entonces esto muestra que una proteína que media en una
fosforilación de alfa-glucanos está presente como
producto intermedio autofosforilado. Las Partes A y B de la mezcla
de reacción 2 sirven de control y, por tanto, no deben presentar
una señal significativamente aumentada para
alfa-1,4-glucanos marcados con
^{33}P en el sedimento sedimentado que contiene
alfa-1,4-glucanos.
En otra realización, el procedimiento según la
invención para identificar una proteína que presenta una actividad
enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos y requiere
alfa-1,4-glucanos fosforilados como
sustrato se refiere a un procedimiento para identificar una
proteína que introduce preferentemente enlaces monoéster de fosfato
en la posición C-2 o en la posición
C-3, particularmente preferentemente en la posición
C-3 de una molécula de glucosa de un
P-alfa-1,4-glucano.
Qué posiciones de los átomos de carbono
(C-2, C-3 o C-6) de
los monómeros de glucosa en el
P-alfa-1,4-glucano
están preferentemente fosforiladas por una proteína o extracto de
proteína puede determinarse, por ejemplo, analizando los
P-alfa-1,4-glucanos
fosforilados por una proteína o extracto de proteína como se
describe en Ritte y col. (2002, PNAS 99,
7166-7171). Para este fin, los
P-alfa-1,4-glucanos
adicionalmente fosforilados por una proteína o extracto de proteína
se hidrolizan usando ácido y luego se analizan por medio de
cromatografía de intercambio aniónico.
Los
P-alfa-1,4-glucanos
fosforilados por una proteína se analizan preferentemente por medio
de RMN con el fin de determinar qué posiciones de los átomos de
carbono (C-2, C-3 o
C-6) de los monómeros de glucosa están fosforilados
en
P-alfa-1,4-glucano.
Las proteínas del procedimiento según la
invención para identificar una proteína que presenta una actividad
enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos y requiere
alfa-1,4-glucanos fosforilados como
sustrato que se obtuvieron según la etapa de procedimiento b) se
incuban en la Etapa c) del procedimiento según la invención en
preparaciones separadas que contienen ATP y
P-alfa-1,4-glucano o
ATP y alfa-1,4-glucano no
fosforilado. Para implementar el procedimiento según la invención
es preferible usar ATP que contiene un residuo de fosfato marcado,
particularmente preferentemente un residuo de fosfato
específicamente marcado en la posición beta, especialmente un
residuo de fosfato específicamente radiactivamente marcado en la
posición beta.
La incubación de proteínas disueltas según la
invención con ATP y
P-alfa-1,4-glucanos
según la etapa de procedimiento c) i o
alfa-1,4-glucanos no fosforilados
según la Etapa c) ii del procedimiento según la invención para
identificar una proteína que presenta una actividad enzimática
fosforilante de alfa-1,4-glucanos y
requiere alfa-1,4-glucanos
fosforilados como sustrato tiene lugar preferentemente a una
temperatura de 20ºC a 30ºC, particularmente preferentemente 23ºC a
27ºC y especialmente preferentemente 24ºC a 26ºC y se lleva a cabo
durante una duración de al menos 15 minutos, preferentemente
durante al menos 20 minutos, particularmente preferentemente durante
al menos 30 minutos. La cantidad de ATP usada en este caso es
preferentemente al menos 0,05 \muM, particularmente
preferentemente al menos 3 \muM y especialmente preferentemente al
menos 5 \muM. La concentración del
P-alfa-1,4-glucano
usado o el alfa-1,4-glucano no
fosforilado usado en este caso es preferentemente al menos 1 mg/ml,
particularmente preferentemente al menos 10 mg/ml y especialmente
preferentemente al menos 25 mg/ml. Después de completarse la
incubación pueden detenerse las reacciones de extractos de proteína
con
P-alfa-1,4-glucanos
o alfa-1,4-glucanos no fosforilados.
La mezcla de reacción respectiva puede detenerse mediante
procedimientos conocidos para el experto en la materia que llevan a
desnaturalizar proteínas, preferentemente añadiendo laurilsulfato
de sodio y calentando durante 5 minutos a 95ºC. Cuando se implementa
la Etapa c) i o c ii) del procedimiento según la invención para
identificar una proteína que presenta una actividad enzimática
fosforilante de alfa-1,4-glucanos y
requiere alfa-1,4-glucanos
fosforilados como sustrato, respectivamente las mismas condiciones
de incubación para las preparaciones de incubación respectivas
deben llevarse a cabo durante la incubación de proteínas con
P-alfa-1,4-glucanos
o alfa-1,4-glucanos no
fosforilados.
El
P-alfa-1,4-glucano
obtenido según la etapa de procedimiento c) i o el
alfa-1,4-glucano no fosforilado
obtenido según la etapa de procedimiento c) ii después de
implementar el procedimiento según la invención para identificar
una proteína que presenta una actividad enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos y requiere
alfa-1,4-glucanos fosforilados como
sustrato se investiga para la introducción de residuos de fosfato
adicionales. Con el fin de determinar si los residuos de fosfato se
introdujeron adicionalmente en los
alfa-1,4-glucanos en cuestión
mediante las etapas de procedimiento c) i y/o c) ii puede usarse
cualquier procedimiento que sea posible para la detección
específica del marcado usado para el ATP marcado usado en las etapas
de procedimiento c) i y c) ii. Si, por ejemplo, el ATP
radiactivamente marcado se usa en las etapas de procedimiento c) i o
c) ii, esto puede llevarse a cabo usando procedimientos conocidos
para el experto en la materia para la detección de elementos
radiactivos tales como, por ejemplo, autorradiografía, medición de
la radiactividad por medio de equipos adecuados (por ejemplo,
contadores de centelleo, "sistemas de detección y cuantificación
de la radiactividad", etc.).
Las proteínas usadas en la etapa de
procedimiento b) del procedimiento según la invención para
identificar una proteína que presenta actividad enzimática
fosforilante de alfa-1,4-glucanos y
requiere alfa-1,4-glucanos
fosforilados como sustrato que han introducido cantidades
significativas de residuos de fosfato en
P-alfa-1,4-glucanos
en la Etapa c) i, pero en comparación con esto, han introducido
cantidades no significativas de residuos de fosfato en
alfa-1,4-glucanos no fosforilados en
la Etapa c) ii, pueden identificarse mediante procedimientos
conocidos para el experto en la materia.
\newpage
El término "cantidades significativas" debe
entenderse conjuntamente con la presente invención como una cantidad
que es al menos dos veces, preferentemente al menos cuatro veces,
particularmente preferentemente al menos seis veces y especialmente
preferentemente al menos ocho veces superior a la cantidad
determinada en experimentos de control correspondientes.
En este caso, las preparaciones de incubación
que contienen extractos de proteína completamente inactivados o
extractos de no proteína en lugar de extractos de proteína nativa
pueden usarse como experimentos de control. Los extractos de
proteína en los que no puede detectarse más actividad enzimática
fosforilante de alfa-1,4-glucanos
van a entenderse como "completamente inactivados".
La identificación de proteínas cuando se
implementa un procedimiento para identificar una proteína que
presenta una elevada actividad de unión hacia
alfa-1,4-glucanos fosforilados en
comparación con alfa-1,4-glucanos no
fosforilados puede hacerse usando procedimientos conocidos para el
experto en la materia tales como, por ejemplo, determinando la
secuencia de aminoácidos de las proteínas en cuestión usando
procedimientos que comprenden degradación de Edmann, análisis de
masas usando EM-MALDI-TOF
(espectroscopía de masas-desorción/ionización láser
asistida por matriz-tiempo de vuelo), seguido de
comparaciones con bases de datos que contienen perfiles de masas de
proteínas, secuenciación de aminoácidos por medio de análisis de
Q-TOF o análisis de TOF/TOF, etc. Las proteínas en
cuestión se identifican preferentemente por medio de análisis de
EM-Q-TOF-EM,
especialmente preferentemente las proteínas se identifican usando
el procedimiento descrito adicionalmente más adelante (véase
Procedimientos generales, Punto 10).
Si se determinan proteínas por medio de
EM-MALDI-TOF, seguido de
comparaciones con bases de datos que contienen perfiles de masas de
proteínas, las proteínas en cuestión se digieren primero
enzimáticamente de antemano antes de analizar las masas
individuales de los fragmentos de proteínas (péptidos) obtenidos de
la digestión por medio de
EM-MALDI-TOF. Se obtiene un perfil
de masas de la proteína en cuestión. Estos perfiles de masas son
muy específicos para una proteína ya que las proteasas específicas
de secuencia se usan para la digestión de proteínas que sólo
escinden un enlace de péptido cuando está contenido en una sucesión
de secuencias de aminoácidos específica. Si la secuencia de
aminoácidos especial que sirve de secuencia de reconocimiento para
una cierta proteasa es conocida, puede crearse un perfil de masas
teórico a partir de una secuencia de aminoácidos arbitraria
calculando la masa de los péptidos que se producirían después de la
digestión de la secuencia de aminoácidos con una proteasa
específica. Por tanto, comparando perfiles de masas de proteínas
desconocidas obtenidas en realidad usando
EM-MALDI-TOF con los perfiles de
masas teóricamente determinados en bases de datos correspondientes
también pueden determinarse secuencias de aminoácidos.
En otra realización del procedimiento según la
invención para identificar una proteína que presenta actividad
enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos y requiere
alfa-1,4-glucanos fosforilados como
sustrato, los complejos de
P-alfa-1,4-glucano-proteína
obtenidos incubando extractos de proteína con
P-alfa-1,4-glucanos
según la Etapa a) se separan de las proteínas no unidas a los
alfa-1,4-glucanos en cuestión.
En otra realización del procedimiento según la
invención para identificar una proteína que presenta actividad
enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos y requiere
alfa-1,4-glucanos fosforilados como
sustrato, las proteínas disueltas según la Etapa b) del
procedimiento según la invención se separan de los
P-alfa-1,4-glucanos
usados en la Etapa a).
En otra realización del procedimiento según la
invención para identificar una proteína que presenta actividad
enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos y requiere
alfa-1,4-glucanos fosforilados como
sustrato, las proteínas de unión a
P-alfa-1,4-glucano
disueltas, obtenidas cuando se implementa el procedimiento según la
invención según la etapa de procedimiento b), se separan entre
sí.
En otra realización del procedimiento según la
invención para identificar una proteína que presenta actividad
enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos y requiere
alfa-1,4-glucanos fosforilados como
sustrato, los glucanos obtenidos por incubación de extractos de
proteína con
P-alfa-1,4-glucanos
según la Etapa c) i o con
alfa-1,4-glucanos no fosforilados
según la Etapa c) ii se separan de las proteínas presentes en la
mezcla de reacción y/o el ATP marcado presente en la mezcla de
reacción.
Para la separación de
alfa-1,4-glucanos aquí se usa
preferentemente filtración, particularmente preferentemente
centrifugación, especialmente preferentemente el procedimiento
descrito adicionalmente más adelante (véase Procedimientos
generales, Punto 8). Después de llevarse a cabo la centrifugación
usando una almohadilla Percoll, las sustancias solubles de las
mezclas de reacción se localizan en el sobrenadante del medio de
centrifugación, mientras que los
alfa-1,4-glucanos están presentes en
el sedimento sedimentado.
Otra realización del procedimiento según la
invención para identificar una proteína que presenta actividad
enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos y requiere
alfa-1,4-glucanos fosforilados como
sustrato se refiere a un procedimiento para identificar una
proteína que tiene un peso molecular derivado de la secuencia de
aminoácidos de 120 kDa a 145 kDa, preferentemente 120 kDa a kDa,
particularmente preferentemente 125 kDa a 140 kDa, especialmente
preferentemente 130 kDa a 135 kDa.
En otra realización del procedimiento según la
invención para identificar una proteína, después de la
identificación de las proteínas en cuestión se determinan secuencias
de aminoácidos que codifican estas proteínas.
Las secuencias de aminoácidos pueden
determinarse según la invención usando cualquier procedimiento
conocido para el experto en la materia. Tales procedimientos se
describen suficientemente en la bibliografía especializada (por
ejemplo, en Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass
Spectrometry, 2000, John Wiley & Sons Inc, ISBN:
0-471-32249-0;
Protein Sequencing Protocols, 2002, Smith (Ed.), edición: 2ª, Humana
Press, ISBN:
0-89603-975-7) y son
básicamente adecuados para implementar el procedimiento según la
invención. Por tanto, la purificación y/o la secuenciación de
proteínas se llevan a cabo como un servicio por contrato por muchas
empresas (por ejemplo, Eurogentec, Searing, Bélgica).
Si es necesario, las proteínas usando un
procedimiento según la invención para identificar una proteína
pueden someterse a purificación y/o concentración adicional antes
de determinar su secuencia de aminoácidos. Los procedimientos para
la purificación y/o concentración de proteínas se describen
suficientemente en la bibliografía especializada (por ejemplo, en
Methods in Enzymology: Guide to Protein Purification, vol,182 1990,
Deutscher, Murray P. (Ed.), Academic Press, ISBN:
0-12-182083-1;
Isolation and Purification of Proteins: Hatti-Kaul,
2003, Rajni (Ed.); Mattiasson, Bo (Edt), Marcel Dekker Inc,
ISBN:0-8247-0726-5,
Protein Purification Techniques: A Practical Approach. Roe, 2001,
Simon (Ed.). The Practical Approach Series, 244ª edición: 2ª Oxford
Univ Press, ISBN:
0-19-963673-7) y son
básicamente adecuados para implementar el procedimiento según la
invención.
En otra realización del procedimiento según la
invención para identificar una proteína se usan procedimientos
según la invención para identificar una proteína cuya secuencia de
aminoácidos codificante tiene un dominio de fosfohistidina
(Tien-Shin Yu y col., 2001, Plant Cell 13,
1907-1918). El dominio de fosfohistidina tiene
preferentemente una identidad de al menos el 50% con la secuencia de
aminoácidos del dominio de fosfohistidina de la proteína OK1 de
Arabidopsis thaliana y Oryza sativa especificada en la
SEQ ID NO 5, en particular de al menos el 60%, preferentemente de
al menos el 70% y particularmente preferentemente de al menos el 80%
y especialmente preferentemente de al menos el 90%.
En otra realización del procedimiento según la
invención para identificar una proteína se usan procedimientos
según la invención para identificar una proteína cuya secuencia de
aminoácidos codificante tiene un dominio de fosfohistidina
(Tien-Shin Yu y col., 2001, Plant Cell 13,
1907-1918) en el que el dominio de fosfohistidina
contiene dos histidinas.
Usando el procedimiento según la invención
pueden identificarse proteínas que presentan actividad enzimática
fosforilante de alfa-1,4-glucanos y
requieren alfa-1,4-glucanos
fosforilados como sustrato.
Por tanto, las proteínas obtenidas mediante
procedimientos según la invención para identificar una proteína
también son el objeto de la presente invención.
La secuencia de aminoácidos de las proteínas
identificadas usando un procedimiento según la invención puede
determinarse usando procedimientos conocidos para el experto en la
materia, como ya se ha establecido anteriormente.
Los ácidos nucleicos que codifican una proteína
que presenta actividad enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucano pueden
identificarse, por ejemplo, examinando bases de datos tales como
aquellas puestas a disposición, por ejemplo por EMBL
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/index.htm) o NCBI (Centro nacional para
información biotecnológica, "National Center for
Biotechnology Information",
http:/twww.ncbi.nim.nih.gov/). En este caso, una o una pluralidad
de secuencias de aminoácidos determinadas cuando se implementa el
procedimiento según la invención se predefine como una llamada
consulta. Esta secuencia de consulta se compara entonces por medio
de programas informáticos estadísticos con secuencias que están
contenidas en las bases de datos seleccionadas. Tales consultas de
bases de datos (por ejemplo, búsquedas en Blast o Fasta) son
conocidas para el experto en la materia y pueden llevarse a cabo por
diversos proveedores.
Si se lleva a cabo una consulta de bases de
datos tal, por ejemplo en el NCBI (National Center for
Biotechnology Information,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), entonces deberán usarse los
parámetros estándar que se especifican para la averiguación de
comparaciones particulares. Para las comparaciones de secuencias de
proteínas (blastp), éstos son los siguientes parámetros: Entrada
límite = no activado; filtro = baja complejidad activada; valor
esperado = 10; tamaño de palabra = 3; matriz = BLOSUM62; costes de
huecos: existencia =11, extensión = 1.
Durante una búsqueda de bases de datos tal, por
ejemplo, las secuencias de aminoácidos determinadas en la presente
invención cuando se implementa el procedimiento según la invención
pueden usarse como una secuencia de consulta con el fin de
identificar moléculas de ácidos nucleicos que codifican una proteína
que presenta actividad enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos.
Usando el procedimiento descrito también es
posible identificar moléculas de ácidos nucleicos y/o secuencias de
aminoácidos que tienen un alto grado de identidad con moléculas de
ácidos nucleicos y/o proteínas que pueden obtenerse usando el
procedimiento según la invención y que codifican una proteína que
presenta actividad enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos.
Los procedimientos son conocidos para el experto
en la materia con los que, a partir de las secuencias de
aminoácidos, puede identificar ácidos nucleicos que codifican éstas
(véanse, por ejemplo, Sambrok y col., Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 3ª edición (2001) Cold Spring Harbour Laboratory
Press, Cold Spring Harbour, NY. ISBN: 0879695773, Ausubel y col.,
Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5ª
edición (2002), ISBN: 0471250929). A partir de las secuencias de
aminoácidos que codifican una proteína que presenta actividad
enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos, los ácidos
nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos en cuestión
pueden derivarse según el código genético. El experto en la materia
sabe que los oligonucleótidos degenerados obtenidos a partir del
código genético también pueden usarse básicamente para identificar
ácidos nucleicos. Entonces pueden sintetizarse los oligonucleótidos
que constituyen secuencias derivadas de las secuencias de
aminoácidos obtenidas cuando se implementa el procedimiento según la
invención. Estos oligonucleótidos sintéticos pueden usarse para
identificar ácidos nucleicos que codifican las proteínas a partir
de cuya secuencia de aminoácidos se derivaron las secuencias de
oligonucleótidos correspondientes. Esto puede lograrse, por
ejemplo, buscando en bibliotecas génicas, usándose dichos
oligonucleótidos sintéticos como sondas marcadas en forma de sondas
de hibridación. Una posibilidad adicional para identificar ácidos
nucleicos que codifican una proteína que presenta actividad
enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos implica usar los
oligonucleótidos sintéticos derivados de secuencias de aminoácidos
obtenidas cuando se implementa el procedimiento según la invención
buscando en bibliotecas génicas usando procedimientos basados en PCR
en los que dichos oligonucleótidos sintéticos se usan como llamados
"cebadores". Las bibliotecas génicas pueden estar presentes,
por ejemplo, en forma de cósmidos, fagémidos, plásmidos, YAC o BAC.
Las bibliotecas de ADN pueden contener tanto ADN genómico como
también ADNc. Para los procedimientos de búsqueda basados en PCR
cuando se usa la llamada RT (transcripción inversa) PCR también es
posible usar ARNm. Los ácidos nucleicos para la implementación del
procedimiento según la invención para identificar un ácido nucleico
en bibliotecas génicas o presente como ARNm pueden proceder en este
caso de cualquier organismo, preferentemente proceden de eucariotas,
particularmente preferentemente de plantas, especialmente
preferentemente de cereales.
Otro objeto de la presente invención se refiere
a un procedimiento para identificar un ácido nucleico que codifica
una proteína que presenta actividad enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucano, en el que
- a)
- se identifica una proteína usando un procedimiento según la invención para identificar una proteína,
- b)
- se producen anticuerpos que reaccionan específicamente con la proteína identificada según la Etapa a) y
- c)
- se identifican ácidos nucleicos usando los anticuerpos determinados según la Etapa b).
\vskip1.000000\baselineskip
Los procedimientos para preparar anticuerpos que
reaccionan específicamente con una cierta proteína, es decir, que
se unen específicamente a dicha proteína, son conocidos para el
experto en la materia (véase, por ejemplo, Lottspeich y Zorbas
(Eds.), 1998, Bioanalytik, Spektrum Akad. Verlag, Heidelberg,
Berlín, ISBN
3-8274-0041-4). La
preparación de tales anticuerpos es ofrecida por algunas compañías
(por ejemplo, Eurogentec, Bélgica) como un servicio por
contrato.
Los procedimientos para identificar ácidos
nucleicos usando anticuerpos, frecuentemente designados
"inmunocribado" en la bibliografía especializada (véase, por
ejemplo Lottspeich y Zorbas (Eds.), 1998, Bioanalytik, Spektrum
Akad. Verlag., Heidelberg, Berlín, ISBN
3-8274-0041-4) son
asimismo conocidos para el experto en la materia y se describen en
detalle en la bibliografía. Las llamadas bibliotecas génicas de
expresión pueden usarse, por ejemplo, para implementar tales
procedimientos en los que los clones obtenidos se buscan para la
expresión de una cierta proteína con la ayuda de un anticuerpo
específico dirigido contra esta proteína. Pueden comprarse los
materiales para preparar tales bibliotecas génicas de expresión, que
también contienen instrucciones referentes al procedimiento para la
preparación, y también procedimientos para buscar tales bancos de
genes de expresión (por ejemplo, Stratagene).
Usando procedimientos según la invención es
posible identificar ácidos nucleicos que codifican proteínas que
presentan elevada actividad de unión hacia
P-alfa-1,4-glucanos
en comparación con alfa-1,4-glucanos
no fosforilados y/o que presentan actividad enzimática fosforilante
de alfa-1,4-glucanos y requieren
alfa-1,4-glucanos fosforilados como
sustrato.
Por tanto, los ácidos nucleicos obtenidos
mediante procedimientos según la invención para identificar un ácido
nucleico también son el objeto de la presente invención.
Un plásmido (A.t.-OK1-pGEM) que
contiene un ADNc que codifica una proteína según la invención
(A.t.-OK1) de Arabidopsis thaliana se depositó el 08/03/2004
bajo el número DSM16264 y un plásmido (pM150) que contiene un ADNc
que codifica adicionalmente proteína según la invención (O.s.-OK1)
de Oryza sativa se depositó el 24/03/2004 bajo el número
DSM16302 bajo el Tratado de Budapest en la Colección alemana de
microorganismos y cultivos celulares GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124
Braunschweig, Alemania.
Se encontró sorprendentemente que las células
vegetales o plantas genéticamente modificadas que presentan una
elevada actividad de una proteína según la invención sintetizan un
almidón modificado que está modificado en sus propiedades
físico-químicas, especialmente el contenido de
fosfato de almidón o la distribución de fosfato en comparación con
almidón sintetizado en células vegetales naturales o plantas
naturales de manera que éste es más apto para aplicaciones
especiales.
Por tanto, adicionalmente se describen células
vegetales genéticamente modificadas o plantas genéticamente
modificadas caracterizadas porque presentan una elevada actividad
enzimática de una proteína según la invención en comparación con
células vegetales naturales o plantas naturales no genéticamente
modificadas correspondientes.
Otro objeto de la presente invención es una
célula vegetal genéticamente modificada caracterizada porque la
modificación genética consiste en la introducción de al menos una
molécula de ácido nucleico extraña en el genoma de la planta, en la
que la molécula de ácido nucleico extraña codifica una proteína cuya
secuencia de aminoácidos codificante tiene un dominio de
fosfohistidina que tiene al menos el 60% de identidad con el
dominio de fosfohistidina como se identifica por SEQ ID No. 5 y en
la que la proteína requiere
alfa-1,4-glucanos fosforilados como
sustrato e introduce enlaces monoéster de fosfato en la posición
C-3 de una molécula de glucosa del
alfa-1,4-glucano y en la que la
célula vegetal genéticamente modificada sintetiza un almidón
modificado que tiene un elevado contenido de fosfato de almidón y/o
una distribución de fosfato modificada en comparación con almidón de
plantas naturales correspondientes.
Conjuntamente con la presente invención, el
término "célula vegetal natural" significa que las células
vegetales en cuestión se usaron como material de partida para la
preparación de las células vegetales según la invención, es decir,
su información genética, aparte de la modificación genética
introducida, se corresponde con la de una célula vegetal según la
invención.
Conjuntamente con la presente invención, el
término "planta natural" significa que las plantas en cuestión
se usaron como material de partida para la preparación de las
plantas según la invención, es decir, su información genética,
aparte de la modificación genética introducida, se corresponde con
la de una planta según la invención.
Conjuntamente con la presente invención, el
término "correspondiente" significa que, en la comparación de
varios objetos, los objetos en cuestión que se comparan entre sí se
han mantenido bajo las mismas condiciones. Conjuntamente con la
presente invención, el término "correspondiente" conjuntamente
con la célula vegetal natural o planta natural significa que las
células vegetales o plantas, que se comparan entre sí se han
producido bajo las mismas condiciones de cultivo y que tienen la
misma edad (de cultivo).
El término "actividad elevada" en el marco
de la presente invención significa en este caso un aumento en la
expresión de genes endógenos que codifican proteínas según la
invención y/o un aumento en la cantidad de proteínas según la
invención en las células y/o un aumento en la actividad enzimática
de proteínas según la invención en las células.
El aumento en la expresión puede determinarse,
por ejemplo, midiendo la cantidad de transcritos que codifican
proteínas según la invención, por ejemplo, usando análisis de
transferencia de Northern o RT-PCR. Las moléculas
de ácidos nucleicos que se identificaron usando procedimientos según
la invención para identificar un ácido nucleico se usan
preferentemente en este caso para determinar una expresión elevada
de proteínas según la invención. Aquí, un aumento significa
preferentemente un aumento en la cantidad de transcritos en
comparación con células correspondientes que no han sido
genéticamente modificadas de al menos el 50%, en particular de al
menos el 70%, preferentemente de al menos el 85% y particularmente
preferentemente de al menos el 100%. Un aumento en la cantidad de
transcritos que codifican una proteína según la invención también
significa que plantas que no tienen transcritos detectables que
codifican una proteína según la invención, después de la
modificación genética según la invención, tienen una cantidad
detectable de transcritos que codifican una proteína según la
invención.
El aumento en la cantidad de proteína de una
proteína según la invención, que da como resultado un aumento de la
actividad de esta proteína en las células vegetales en cuestión,
puede determinarse, por ejemplo, por procedimientos inmunológicos
tales como análisis de transferencia de Western, EDTA (ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas) o RIA (RadioInmunoEnsayo). La
preparación de un anticuerpo que puede usarse para medir el aumento
en la cantidad de proteína usando procedimientos inmunológicos se
describe adicionalmente más adelante como un ejemplo (véase el
Ejemplo 11). Aquí, un aumento significa preferentemente un aumento
en la cantidad de una proteína según la invención en comparación
con células correspondientes que no han sido genéticamente
modificadas de al menos el 50%, en particular de al menos el 70%,
preferentemente de al menos el 85% y particularmente
preferentemente de al menos el 100%. Un aumento en la cantidad de
una proteína según la invención también significa que plantas que
no tienen cantidad detectable de una proteína según la invención,
después de la modificación genética según la invención, tienen una
cantidad detectable de proteína según la invención:
En otra realización de la presente invención,
las células vegetales según la invención o las plantas según la
invención comprenden células vegetales de plantas almacenadoras de
almidón o plantas almacenadoras de almidón. Plantas almacenadoras
de almidón son, por ejemplo, plantas de maíz, arroz, trigo, centeno,
avena, cebada, mandioca, patata, boniato, sagú, judía mungo,
banana, guisante, Arabidopsis, cúrcuma o sorgo.
Particularmente se prefieren plantas de arroz, especialmente se
prefieren de trigo.
Se describe una célula vegetal genéticamente
modificada según la invención o una planta genéticamente modificada
según la invención en la que la modificación genética consiste en la
introducción de al menos una molécula de ácido nucleico extraña en
el genoma de la planta.
En este contexto, el término "modificación
genética" significa la introducción de moléculas de ácidos
nucleicos extrañas homólogas y/o heterólogas en el genoma de una
célula vegetal o en el genoma de una planta, en la que dicha
introducción de estas moléculas conduce a un aumento o reducción en
la actividad de una proteína según la invención.
\newpage
Las células vegetales según la invención o las
plantas según la invención se modifican con respecto a su
información genética por la introducción de una molécula de ácido
nucleico extraña. La presencia o la expresión de la molécula de
ácido nucleico extraña conduce a un cambio fenotípico. Cambio
"fenotípico" significa preferentemente en este caso un cambio
medible en una o una pluralidad de funciones de las células. Por
ejemplo, las células vegetales genéticamente modificadas según la
invención y las plantas genéticamente modificadas según la invención
presentan un aumento o reducción en la actividad de una proteína
según la invención debido a la presencia o a la expresión de la
molécula de ácido nucleico introducida.
Conjuntamente con la presente invención, el
término "molécula de ácido nucleico extraña" se entiende que
significa una molécula que o bien no se produce naturalmente en las
células vegetales naturales correspondientes o que no se produce
naturalmente en la disposición espacial específica en células
vegetales naturales, o que está localizada en un lugar en el genoma
de la célula vegetal natural en el que no se produce naturalmente.
Preferentemente, la molécula de ácido nucleico extraña es una
molécula recombinante que está constituida por diferentes elementos,
no produciéndose la combinación o disposición espacial específica
naturalmente en células vegetales.
En principio, la molécula de ácido nucleico
extraña puede ser cualquier molécula de ácido nucleico que efectúa
un aumento en la actividad de una proteína según la invención en la
célula vegetal o planta.
Conjuntamente con la presente invención, el
término "genoma" debe entenderse que significa la totalidad del
material genético presente en una célula vegetal. El experto en la
materia sabe que, además del núcleo de la célula, otros
compartimentos (por ejemplo, plastos, mitocondrias) también
contienen material genético.
Se describe una célula vegetal genéticamente
modificada según la invención o una planta genéticamente modificada
según la invención en la que la modificación genética consiste en la
introducción de al menos una molécula de ácido nucleico extraña en
el genoma de la planta y la molécula de ácido nucleico extraña
codifica una proteína según la invención.
Se describe una célula vegetal genéticamente
modificada según la invención o una planta genéticamente modificada
según la invención en la que la modificación genética consiste en la
introducción de al menos una molécula de ácido nucleico extraña en
el genoma de la planta y en la que la molécula de ácido nucleico
extraña comprende una molécula de ácido nucleico según la
invención, preferentemente una molécula de ácido nucleico según la
invención, aislada de Arabidopsis thaliana, particularmente
preferentemente aislada de arroz.
Están disponibles un gran número de técnicas
para la introducción de ADN en una célula vegetal huésped. Estas
técnicas incluyen la transformación de células vegetales con
ADN-T usando Agrobacterium tumefaciens o
Agrobacterium rhizogenes como medio de transformación, la
fusión de protoplastos, inyección, la electroporación de ADN, la
introducción de ADN por medio de la solución biolística, además de
otras posibilidades.
El uso de la transformación mediada por
agrobacterias de células vegetales se ha investigado intensamente y
se ha descrito adecuadamente en el documento EP 120516; Hoekema, en:
The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V.,
Alblasserdam (1985), capítulo V; Fraley y col., Crit. Rev. Plant
Sci. 4, 1-46 y por An y col. EMBO J. 4, (1985),
277-287. Para la transformación de patata véase, por
ejemplo, Rocha-Sosa y col., EMBO J. 8, (1989),
29-33.
También se ha descrito la transformación de
plantas monocotiledóneas por medio de vectores basados en la
transformación de Agrobacterium (Chan y col., Plant Mol.
Biol. 22, (1993), 491-506; Hiei y col., Plant J. 6,
(1994) 271-282; Deng y col., Science in China 33,
(1990), 28-34; Wilmink y col., Plant Cell Reports
11, (1992), 76-80; May y col., Bio/Technology 13,
(1995), 486-492; Conner y Domisse, Int. J. Plant
Sci. 153 (1992), 550-555; Ritchie y col.,
Transgenic Res. 2, (1993), 252-265), 153 (1992),
550-555; Ritchie y col., Transgenic Res. 2, (1993),
252-265). Un sistema alternativo a la transformación
de plantas monocotiledóneas es la transformación por medio de la
solución biolística (Wan y Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994),
37-48; Vasil y col., Bio/Technology 11 (1993),
1553-1558; Ritala y col., Plant Mol. Biol. 24,
(1994), 317-325; Spencer y col., Theor. Appl. Genet.
79, (1990), 625-631), transformación de
protoplastos, electroporación de células parcialmente
permeabilizadas y la introducción de ADN por medio de fibras de
vidrio. En particular, la transformación de maíz se ha descrito
muchas veces en la bibliografía (véanse, por ejemplo, los documentos
WO95/06128, EP0513849, EP0465875, EP0292435; Fromm y col.,
Biotechnology 8, (1990), 833-844;
Gordon-Kamm y col., Plant Cell 2, (1990),
603-618; Koziel y col., Biotechnology 11 (1993),
194-200; Moroc y col., Theor. Appl. Genet. 80,
(1990), 721-726).
La transformación satisfactoria de otros tipos
de cereal ya ha sido descrita, por ejemplo, para cebada (Wan y
Lemaux, véase anteriormente; Ritala y col., véase anteriormente;
Krens y col., Nature 296, (1982), 72-74) y para
trigo (Nehra y col., Plant J. 5, (1994), 285-297).
Todos los procedimientos anteriores son adecuados dentro del marco
de la presente invención.
Entre otras cosas, las células vegetales según
la invención y las plantas según la invención pueden diferenciarse
de células vegetales naturales y plantas naturales, respectivamente,
en que contienen una molécula de ácido nucleico extraña que no se
produce naturalmente en células vegetales naturales o plantas
naturales, o en que una molécula tal está presente integrada en un
lugar en el genoma de la célula vegetal según la invención o en el
genoma de la planta según la invención en el que no se produce en
células vegetales naturales o plantas naturales, es decir, en un
entorno genómico diferente. Además, las células vegetales según la
invención y las plantas según la invención de este tipo se
diferencian de células vegetales naturales y plantas naturales,
respectivamente, en que contienen al menos un copia de la molécula
de ácido nucleico extraña establemente integrada dentro de su
genoma, posiblemente además de copias que se producen naturalmente
de una molécula tal en las células vegetales naturales o plantas
naturales. Si la(s) molécula(s) de ácidos nucleicos
extraña(s) introducida(s) en las células vegetales
según la invención o en las plantas según la invención es (son)
copias adicionales de moléculas que ya se producen naturalmente en
las células vegetales naturales o plantas naturales
respectivamente, entonces las células vegetales según la invención y
las plantas según la invención pueden diferenciarse de células
vegetales naturales o plantas naturales, respectivamente, en
particular en que esta copia adicional o estas copias adicionales
está (están) localizada(s) en sitios en el genoma en los que
no se produce (o no se producen) en células vegetales naturales o
plantas naturales. Esto puede verificarse, por ejemplo, usando un
análisis de transferencia de Southern.
Además, las células vegetales según la invención
y las plantas según la invención pueden diferenciarse de las
células vegetales naturales o plantas naturales, respectivamente,
preferentemente por al menos una de las siguiente características:
si la molécula de ácido nucleico extraña que se ha introducido es
heteróloga con respecto a la célula vegetal o planta, entonces las
células vegetales según la invención o plantas según la invención
tienen transcritos de las moléculas de ácidos nucleicos
introducidas. Esto puede verificarse, por ejemplo, por análisis de
transferencia de Northern o por RT-PCR (reacción en
cadena de la polimerasa de transcripción inversa). Preferentemente,
las células vegetales según la invención y las plantas según la
invención que presentan una actividad elevada de una proteína según
la invención contienen una proteína que se codifica por una
molécula de ácido nucleico introducida. Esto puede demostrarse por
procedimientos inmunológicos, por ejemplo, en particular por un
análisis de transferencia de Western. Las células vegetales según la
invención y las plantas según la invención que presentan una
actividad reducida de una proteína según la invención muestran una
cantidad reducida de la proteína relevante en comparación con
células vegetales naturales o plantas naturales correspondientes
que no han sido genéticamente modificadas cuando se investigaron
usando dichos procedimientos inmunológicos.
Si la molécula de ácido nucleico extraña que se
ha introducido es homóloga con respecto a la célula vegetal o
planta, las células vegetales según la invención o las plantas según
la invención pueden diferenciarse de células vegetales naturales o
plantas naturales, respectivamente, por ejemplo, debido a la
expresión adicional de la molécula de ácido nucleico extraña
introducida. Las células vegetales según la invención y las plantas
según la invención contienen preferentemente transcritos de las
moléculas de ácidos nucleicos extrañas. Esto puede demostrarse, por
ejemplo, por análisis de transferencia de Northern o usando la
llamada PCR cuantitativa.
En una realización especial, las células
vegetales según la invención y las plantas según la invención son
células vegetales transgénicas o plantas transgénicas,
respectivamente.
Las células vegetales según la invención y las
plantas según la invención sintetizan un almidón modificado en
comparación con almidón aislado de células vegetales naturales o
plantas naturales que no han sido genéticamente modificadas.
Conjuntamente con la presente invención, el
término "almidón modificado" significa que el almidón ha
cambiado características físico-químicos en
comparación con almidón no modificado que puede obtenerse a partir
de células vegetales naturales o plantas naturales
correspondientes.
Las células vegetales según la invención o las
plantas según la invención sintetizan un almidón modificado que
tiene un contenido elevado de fosfato de almidón y/o una
distribución de fosfato modificada en comparación con el almidón
aislado de células vegetales naturales o plantas naturales
correspondientes.
En otra realización del procedimiento según la
presente invención, las células vegetales según la invención o las
plantas según la invención sintetizan un almidón modificado que
tiene una relación de C-3/C-6
modificada del fosfato de almidón en comparación con células
vegetales naturales correspondientes que no han sido genéticamente
modificadas o plantas que no han sido genéticamente modificadas. En
este caso son especialmente preferidos almidones que presentan una
fracción elevada de fosfato de almidón unido en la posición
C-3 en comparación con fosfato de almidón unido en
la posición C-6, en comparación con almidones
correspondientes aislados de células vegetales naturales que no han
sido genéticamente modificadas o plantas que no han sido
genéticamente modificadas.
Conjuntamente con la presente invención, el
término "distribución de fosfato" debe entenderse como la
fracción del fosfato de almidón unida en la posición
C-2, posición C-3 o posición
C-6 de una molécula de glucosa con respecto al
contenido de fosfato de almidón total de
alfa-1,4-glucanos.
Conjuntamente con la presente invención, el
término "relación
C-2/C-3/C-6" debe
entenderse como la fracción del fosfato de almidón en la que el
fosfato de almidón de un
alfa-1,4-glucano unido
respectivamente en la posición C-2, posición
C-3 o posición C-6 contribuye al
contenido de fosfato de almidón total del
alfa-1,4-glucano en cuestión
(posición C-2 + posición C-3 +
posición C-6).
Conjuntamente con la presente invención, el
término "relación C-3/C-6" debe
entenderse como la fracción del fosfato de almidón en la que el
fosfato de almidón de un
alfa-1,4-glucano unido
respectivamente en la posición C-3 y en la posición
C-6 contribuye a la suma del fosfato de almidón
unido en la posición C-3 y en la posición
C-6 (posición C-3 + posición
C-6) del
alfa-1,4-glucano en cuestión.
Otro objeto de la presente invención son células
vegetales según la invención o plantas según la invención que
sintetizan un almidón modificado en las que el almidón modificado se
caracteriza porque tiene un contenido elevado de fosfato unido
covalentemente al almidón en la posición C-3 de la
molécula de glucosa en comparación con el almidón de células
vegetales naturales o plantas naturales correspondientes.
Otro objeto de la presente invención son plantas
que contienen células vegetales según la invención.
SEQ ID NO 1: Secuencia de ácidos nucleicos que
contiene la región codificante de la proteína A.t.-OK1 de
Arabidopsis thaliana. Esta secuencia se inserta en los vectores OK1-pGEM-T y OK1-pDEST^{TM}17.
Arabidopsis thaliana. Esta secuencia se inserta en los vectores OK1-pGEM-T y OK1-pDEST^{TM}17.
SEQ ID NO 2: Secuencia de aminoácidos que
codifica la proteína A.t.-OK1 de Arabidopsis thaliana. Esta
secuencia puede derivarse de la secuencia de ácidos nucleicos
mostrada en SEQ ID NO 1.
SEQ ID NO 3: Secuencia de ácidos nucleicos que
contiene la región codificante de la proteína O.s.-OK1 de Oryza
sativa. Esta secuencia se inserta en el vector M150.
SEQ ID NO 4: Secuencia de aminoácidos que
codifica la proteína O.s.-OK1 de Oryza sativa. Esta secuencia
puede derivarse de la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en SEQ
ID NO 3.
SEQ ID NO 5: Secuencia de péptidos que codifica
el dominio de fosfohistidina de las proteínas OK1 de Arabidopsis
thaliana, Oryza sativa y Sorghum bicolor.
SEQ ID NO 6: Secuencia de péptidos contenida en
la secuencia de aminoácidos que codifica una proteína H.v.-OK1 de
cebada.
SEQ ID NO 7: Secuencia de péptidos contenida en
la secuencia de aminoácidos que codifica una proteína H.v.-OK1 de
cebada.
SEQ ID NO 8: Secuencia de péptidos contenida en
la secuencia de aminoácidos que codifica una proteína H.v.-OK1 de
cebada.
SEQ ID NO 9: Secuencia parcial de ácidos
nucleicos que codifica una proteína H.v.-OK1 de cebada. Esta
secuencia de ácidos nucleicos se ha identificado por medio de las
secuencias de péptidos mostrada en SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 y SEQ ID
NO 8 usando la herramienta "Búsqueda con Blast" en la base de
datos TIGR.
SEQ ID NO 10: Secuencia parcial de aminoácidos
que codifica una proteína H.v.-OK1 de cebada. La secuencia de
aminoácidos mostrada puede derivarse de la secuencia de ácidos
nucleicos mostrada en SEQ ID NO 9.
SEQ ID NO 11: Secuencia de péptidos contenida en
la secuencia de aminoácidos que codifica una proteína S.t.-OK1 de
patata.
SEQ ID NO 12: Secuencia de péptidos contenida en
la secuencia de aminoácidos que codifica una proteína S.t.-OK1 de
patata.
SEQ ID NO 13: Secuencia de péptidos contenida en
la secuencia de aminoácidos que codifica una proteína S.t.-OK1 de
patata.
SEQ ID NO 14: Secuencia de péptidos contenida en
la secuencia de aminoácidos que codifica una proteína S.t.-OK1 de
patata.
SEQ ID NO 15: Secuencia parcial de ácidos
nucleicos que codifica una proteína S.t.-OK1 de patata. Esta
secuencia de ácidos nucleicos se ha identificado por medio de las
secuencias de péptidos mostrada en SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ
ID NO 13 y SEQ ID NO 14 usando la herramienta "Búsqueda con
Blast" en la base de datos TIGR.
SEQ ID NO 16: Secuencia parcial de aminoácidos
que codifica una proteína S.t.-OK1 de patata. La secuencia de
aminoácidos mostrada puede derivarse de la secuencia de ácidos
nucleicos mostrada en SEQ ID NO 15.
SEQ ID NO 17: Secuencia de péptidos contenida en
la secuencia de aminoácidos que codifica una proteína
S.b.-OK1 de mijo.
S.b.-OK1 de mijo.
SEQ ID NO 18: Secuencia de péptidos contenida en
la secuencia de aminoácidos que codifica una proteína
S.b.-OK1 de mijo.
S.b.-OK1 de mijo.
SEQ ID NO 19: Secuencia de péptidos contenida en
la secuencia de aminoácidos que codifica una proteína
S.b.-OK1 de mijo.
S.b.-OK1 de mijo.
SEQ ID NO 20: Secuencia de péptidos contenida en
la secuencia de aminoácidos que codifica una proteína
S.b.-OK1 de mijo.
S.b.-OK1 de mijo.
SEQ ID NO 21: Secuencia parcial de ácidos
nucleicos que codifica una proteína S.b.-OK1 de mijo. Esta secuencia
de ácidos nucleicos se ha identificado por medio de las secuencias
de péptidos mostrada en SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19 y
SEQ ID NO 20 usando la herramienta "Búsqueda con Blast" en la
base de datos TIGR.
SEQ ID NO 22: Secuencia parcial de aminoácidos
que codifica una proteína S.b.-OK1 de mijo. La secuencia de
aminoácidos mostrada puede derivarse de la secuencia de ácidos
nucleicos mostrada en SEQ ID NO 21.
SEQ ID NO 23: Secuencia de péptidos contenida en
la secuencia de aminoácidos que codifica una proteína
T.a.-OK1 de trigo.
T.a.-OK1 de trigo.
SEQ ID NO 24: Secuencia de péptidos que contiene
la secuencia de aminoácidos que codifica una proteína
T.a.-OK1 de trigo.
T.a.-OK1 de trigo.
SEQ ID NO 25: Secuencia parcial de ácidos
nucleicos que codifica una proteína T.a.-OK1 de trigo. Esta
secuencia de ácidos nucleicos se ha identificado por medio de las
secuencias de péptidos mostrada en SEQ ID NO 23 y SEQ ID NO 24
usando la herramienta "Búsqueda con Blast" en la base de datos
TIGR.
SEQ ID NO 26: Secuencia parcial de aminoácidos
que codifica una proteína T.a.-OK1 de trigo. La secuencia de
aminoácidos mostrada puede derivarse de la secuencia de ácidos
nucleicos mostrada en SEQ ID NO 25.
Fig. 1: Gel de acrilamida desnaturalizante para
identificar proteínas de Arabidopsis thaliana que se une
preferentemente a almidón no fosforilado en comparación con almidón
fosforilado. Un marcador de peso molecular de proteínas patrón se
muestra en la pista "M". Las proteínas obtenidas después de
incubar la preparación de control C del Ejemplo - 1 d) se muestran
en la pista "-". Los extractos de proteína de Arabidopsis
thaliana, obtenidos después de la incubación con almidón no
fosforilado, aislados de hojas de un mutante
sex1-3 de Arabidopsis thaliana
(Preparación B, Ejemplo 1 d)), se muestran en la pista "K". Los
extractos de proteína de Arabidopsis thaliana, obtenidos
después de la incubación con almidón, aislados de hojas de un
sex1-3 de Arabidopsis thaliana que se
fosforiló retrospectivamente in vitro con una proteína R1
(Preparación A, Ejemplo 1 d) se muestran en la pista "P". Al
completarse la electroforesis, el gel de acrilamida se tiñó con azul
de Coomassie.
Fig. 2: Demostración de la actividad
autofosforilante de la proteína OK1. La Fig. 2A) muestra un gel de
acrilamida desnaturalizante (SDS) teñido con azul de Coomassie al
completarse la electroforesis. La Figura 2 B) muestra la
autorradiografía de un gel de acilamida desnaturalizante (SDS). Las
mismas cantidades de las mismas muestras se aplicaron a cada uno de
los dos geles. M: Marcador de peso molecular de proteínas patrón;
R1: Muestra del recipiente de reacción 1 según el Ejemplo 7 (después
de incubar una proteína OK1 con ATP); R2: Muestra del recipiente de
reacción 2 según el Ejemplo 7 (después de incubar una proteína OK1
con ATP la proteína se calentó hasta 95ºC); R3: Muestra del
recipiente de reacción 3 según el Ejemplo 7 (después de incubar una
proteína OK1 con ATP la proteína se incubó en HCl 0,5 M); R4:
Muestra del recipiente de reacción 4 según el Ejemplo 7 (después de
incubar una proteína OK1 con ATP la proteína se incubó en NaOH 0,5
M).
Fig. 3: Demostración de la actividad
fosforilante de almidón de una proteína OK1 (véase el Ejemplo 6). La
proteína OK1 se incubó con almidón no fosforilado aislado de hojas
de un mutante sex1-3 de Arabidopsis
thaliana (Preparación A) y almidón aislado de hojas de un
mutante sex1-3 de Arabidopsis thaliana
que se fosforiló retrospectivamente in vitro con una proteína
R1 (Preparación B). La Preparación C es la misma que la Preparación
B, excepto que esta Preparación C se incubó sin proteína OK1. Se
llevaron a cabo dos pruebas independientes para cada Preparación (A,
B, C) (Prueba 1 y Prueba 2). Las cantidades respectivas se muestran,
medidas en cpm (cuentas por minuto), en fosfato marcado con
^{33}P, que se introdujo en almidón no fosforilado (Preparación A)
y almidón fosforilado (Preparación B).
Fig. 4: Comparación de las posiciones de átomos
de C de moléculas de glucosa del almidón que se fosforiló a partir
de una proteína R1 y una proteína OK1, respectivamente (véase el
Ejemplo 9). La proteína OK1 (Preparación A) se incubó en presencia
de ATP marcado con ^{33}P con almidón aislado de hojas de un
mutante sex1-3 de Arabidopsis thaliana
que se fosforiló retrospectivamente in vitro con una proteína
R1. La proteína R1 (Preparación B) se incubó en presencia de ATP
marcado con ^{33}P con almidón aislado de hojas de un mutante
sex1-3 de Arabidopsis thaliana.
Después de completarse la incubación se llevó a cabo una hidrólisis
total del almidón y los productos de hidrólisis obtenidos se
separaron usando cromatografía HPAE. Como patrón se añadieron
glucosa-6-fosfato y
glucosa-3-fosfato a los productos de
hidrólisis antes de la separación. Los productos de hidrólisis
separados por medio de cromatografía HPAE se recogieron en
fracciones individuales. La
glucosa-6-fosfato añadida se eluyó
con la fracción 15 y la
glucosa-3-fosfato añadida con la
fracción 17. Las fracciones obtenidas se investigaron posteriormente
para la presencia de fosfato radiactivamente marcado. Se muestra
gráficamente la cantidad de fosfato marcado con ^{33}P medida en
las fracciones individuales, medida en cpm (cuentas por minuto), que
se introdujo en los productos de hidrólisis del almidón fosforilado
por la proteína OK1 o la proteína R1.
\newpage
Fig. 5: Demostración de la autofosforilación de
la proteína OK1. La Figura 5 A) muestra una transferencia de
Western. La Figura 5 B) muestra la autorradiografía de un gel de
acrilamida desnaturalizante (SDS). Las mismas cantidades de las
mismas muestras se aplicaron a cada uno de los dos geles. La
proteína OK1 se incubó tanto con ATP radiactivamente marcado
aleatorizado como con ATP específicamente radiactivamente marcado en
la posición gamma. Al completarse la incubación, las proteínas o se
calentaron hasta 30ºC o 95ºC o se incubaron en NaOH 0,5 M o HCl 0,5
M, respectivamente.
Fig. 6: Demostración de la transferencia del
residuo de beta-fosfato de ATP a almidón en una
reacción catalizada por una proteína OK1. Tanto el ATP
específicamente marcado con ^{33}P en la posición gamma como el
^{33}P ATP aleatorizado se usaron para fosforilar almidón, que
había sido fosforilado in vitro por medio de una proteína R1
y aislado de hojas de un mutante sex1-3 de
Arabidopsis thaliana por medio de una proteína OK1. No se
añadió proteína OK1 en ninguno de los experimentos designados como
"control". Cada preparación se probó dos veces,
independientemente entre sí. Se muestran los resultados de ambas
pruebas.
Fig. 7: Análisis de transferencia de Western de
extractos de proteína de plantas usando un anticuerpo contra la
proteína OK1 de Arabidopsis thaliana. Se muestran los
extractos de proteína de hojas de las siguiente plantas: Ara,
Arabidopsis thaliana; 51, 54, 55, 67, 72, 73, 79, 62, 63, 64,
65, 69, 66, 68 son líneas independientes de la transformación 385JH;
D Solanum tuberosum cv Désirée natural.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se describen procedimientos que
pueden usarse para llevar a cabo el procedimiento según la
invención. Estos procedimientos constituyen realizaciones
específicas de la presente invención, pero no restringen la
presente invención a estos procedimientos. El experto en la materia
sabe que él puede implementar la invención en la misma forma
modificando los procedimientos descritos y/o reemplazando partes
individuales de los procedimientos por partes alternativas de los
procedimientos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se congela material de hojas en nitrógeno
líquido inmediatamente después de recolectarlo y posteriormente se
homogeneíza en el mortero bajo nitrógeno líquido. El material de
hojas reducido se mezcla con aproximadamente 3,5 veces el volumen
(respecto al peso del material de hojas usado) de tampón de unión
frío (4ºC) y se macera durante 2x10 s usando una Ultraturrax
(velocidad máxima). Después del primer tratamiento con una
Ultraturrax, el material de hojas reducido se enfría sobre hielo
antes de llevar a cabo el segundo tratamiento. Entonces, el
material de hojas tratado se pasa a través de una malla de nailon de
100 \mum y se centrifuga durante 20 min (recipiente de centrífuga
de 50 ml, 20.000xg, 4ºC).
\vskip1.000000\baselineskip
El sobrenadante obtenido tras la centrifugación
según la Etapa a) se elimina y se determina su volumen. Para
precipitar proteínas se añade continuamente sulfato de amonio al
sobrenadante durante un periodo de 30 minutos a la vez que se agita
sobre hielo hasta una concentración final del 75% (peso/volumen). El
sobrenadante se incuba posteriormente durante otra hora sobre hielo
mientras se agita. Las proteínas precipitadas del sobrenadante se
sedimentan a 20.000xg y 4ºC durante 10 min y el sedimento se absorbe
posteriormente en 5 ml de tampón de unión, es decir, las proteínas
presentes en el sedimento se disuelven.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas disueltas se desalan usando una
columna PD10 rellena de Sephadex G25 (Amersham Bioscience, Friburgo,
nº de prod. de las columnas:
17-0851-01, nº de prod. de Sephadex
G25-M: 17-0033-01) a
una temperatura de 4ºC, es decir, el sulfato de amonio usado para
la precipitación en la Etapa b) se separa de las proteínas
disueltas. La columna PD10 se equilibra con tampón de unión antes
de aplicarse las proteínas disueltas según la Etapa b). Para este
fin, 5 ml de tampón de unión se extienden sobre la columna en cada
caso. Posteriormente, a cada columna se añaden 2,5 ml de la
disolución de proteínas obtenida según la Etapa b) antes de eluir
las proteínas de la columna con 3,5 ml de tampón de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración de proteína se determina con un
ensayo de Bradford (Biorad, Munich, nº de prod.
500-0006 (Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72,
248-254)).
\vskip1.000000\baselineskip
El material de hojas se congela inmediatamente
después de recolectarlo en nitrógeno líquido. El material de hojas
se homogeneíza en porciones en el mortero bajo nitrógeno líquido y
se absorbe en un total de aproximadamente 2,5 veces el volumen
(peso/volumen) de tampón de almidón. Además, esta suspensión se
homogeneíza de nuevo en una mezcladora Waring durante 20 s a
velocidad máxima: el homogeneizado se pasa a través de una malla de
nailon (ancho de malla de 100 \mum) y se centrifuga durante 5
minutos a 1.000xg. Se desecha el sobrenadante con las proteínas
solubles.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de eliminar el material verde depositado
sobre la parte superior del almidón aclarando el material verde con
tampón de almidón, el sedimento que contiene el almidón obtenido de
la Etapa a) se absorbe en tampón de almidón y se pasa sucesivamente
a través de mallas de nailon con diferentes anchos de malla (del
orden de 60 \mum, 30 \mum, 20 \mum). El filtrado se
centrifuga usando 10 ml de almohadilla Percoll (95% (v/v) Percoll
(Pharmacia, Uppsala, Suecia), 5% (v/v) de HEPES 0,5
M-KOH, pH 7,2) (Correx tube, 15 min, 2.000xg). El
sedimento obtenido después de esta centrifugación se resuspende una
vez en tampón de almidón y se centrifuga de nuevo (5 min,
1.000xg).
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la Etapa b) se obtienen gránulos de almidón
que contienen proteínas unidas al almidón. Las proteínas unidas a
la superficie de los gránulos de almidón se eliminan incubando
cuatro veces con SDS al 0,5% (laurilsulfato de sodio) durante
10-15 minutos en cada caso a temperatura ambiente
con agitación. Cada etapa de lavado va seguida de una
centrifugación (5 min, 5.000xg) con el fin de separar los gránulos
de almidón del tampón de lavado respectivo.
\vskip1.000000\baselineskip
El almidón obtenido de la Etapa c) que ha sido
liberado de las proteínas unidas a su superficie se elimina
posteriormente incubando cuatro veces con tampón de lavado durante
10-15 minutos en cada caso a temperatura ambiente
con agitación. Cada etapa de lavado va seguida de una centrifugación
(5 min, 1.000xg) con el fin de separar los gránulos de almidón del
tampón de lavado respectivo. Estas etapas de purificación sirven
principalmente para eliminar el SDS usado en las incubaciones en la
Etapa c).
\vskip1.000000\baselineskip
La cantidad de almidón aislado en la Etapa d) se
determina fotométricamente. Después de la dilución adecuada, la
densidad óptica de la suspensión de almidón se mide frente a una
curva de calibrado a una longitud de onda de 600 nm. El intervalo
lineal de la curva de calibrado se localiza entre 0 y 0,3 unidades
de extinción.
Para producir las curvas de calibrado, el
almidón, por ejemplo aislado de hojas de un mutante
sex1-3 de Arabidopsis thaliana, se
seca a vacío, se pesa y se absorbe en un volumen definido de agua.
La suspensión así obtenida se diluye con agua en varias etapas en
una relación de 1 a 1 en cada caso hasta que se obtiene una
suspensión de aproximadamente 5 \mug de almidón por ml de agua.
Las suspensiones obtenidas por las etapas de dilución individuales
se miden en el fotómetro a una longitud de onda de 600 nm. Los
valores de absorción obtenidos para cada suspensión se representan
frente a la concentración de almidón en la suspensión respectiva.
La curva de calibrado obtenida debe seguir una función matemática
lineal en el intervalo de 0 \mug de almidón por ml de agua a 0,3
\mug de almidón por ml de agua.
\vskip1.000000\baselineskip
El almidón puede o usarse directamente sin más
almacenamiento para pruebas adicionales o guardarse en alícuotas en
recipientes Eppendorf de 1,5 ml a -20ºC. Tanto el almidón congelado
como el almidón recientemente aislado no guardado pueden usarse, si
se requiere, para los procedimientos descritos en la presente
invención con referencia a, por ejemplo, la fosforilación in
vitro y/o ensayo de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El ADNc que codifica una proteína fosforilante
de almidón puede amplificarse, por ejemplo, usando ARNm o ARNm
poli-A+ de tejidos vegetales como "molde" por
medio de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para este
fin, una transcriptasa inversa se usa primero para la preparación de
una hebra de ADNc que es complementaria a un ARNm que codifica una
proteína fosforilante de almidón antes de amplificar la hebra de
ADNc en cuestión por medio de ADN polimerasa. Los llamados
"kits" que contienen sustancias, enzimas e instrucciones para
llevar a cabo reacciones de PCR están disponibles para su compra
(por ejemplo, SuperScript^{TM} One-Step
RT-PCR System, Invitrogen, nº de prod.:
10928-034). El ADNc amplificado que codifica una
proteína fosforilante de almidón puede entonces clonarse en un
vector de expresión bacteriano, por ejemplo, pDEST^{TM}17
(Invitrogen). pDEST^{TM}17 contiene el promotor T7 que se usa
parar iniciar la transcripción de la T7-ARN
polimerasa. Además, el vector de expresión pDEST^{TM}17 contiene
una secuencia Shine Dalgarno en la dirección 5' del promotor T7
seguida de un codón de iniciación (ATG) y de una llamada marca His.
Esta marca His está constituida por seis codones directamente
sucesivos cada uno de los cuales codifica el aminoácido histidina y
se localizan en el marco de lectura de dicho codón de iniciación.
La clonación de un ADNc que codifica una proteína fosforilante de
almidón en pDEST^{TM}17 se lleva a cabo de tal forma que se
produce una fusión traduccional entre los codones para el codón de
iniciación, la marca His y el ADNc que codifica una proteína
fosforilante de almidón. Como resultado de esto, tras la
transcripción iniciada en el promotor T7 y la posterior traducción
se obtiene una proteína fosforilante de almidón que contiene
aminoácidos adicionales que contienen la marca His en su extremo
N.
Sin embargo, también puede usarse otros vectores
que son adecuados para la expresión en microorganismos para la
expresión de una proteína fosforilante de almidón. El experto en la
materia conoce vectores de expresión y cepas de expresión asociadas
y también están disponibles para su compra a partir del proveedor
apropiado en combinaciones adecuadas.
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar, una cepa de E. coli
competente de transformación apropiada que codifica cromosómicamente
una T7-ARN polimerasa se transforma con el plásmido
expresión preparado en la Etapa a) y posteriormente se incuba
durante la noche a 30ºC en medio de cultivo solidificado con agar.
Cepas de expresión adecuadas son, por ejemplo, las cepas BL21 (nº
de prod. de Invitrogen: C6010-03) que codifican
cromosómicamente una T7-ARN polimerasa bajo el
control de un promotor inducible de IPTG (lacZ).
Las colonias de bacterias resultantes de la
transformación pueden investigarse usando procedimientos conocidos
para el experto en la materia para ver si contienen el plásmido de
expresión requerido que contiene un ADNc que codifica la proteína
fosforilante de almidón. Al mismo tiempo se obtienen clones de
expresión.
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar se produce un cultivo
preliminar. Para hacer esto, un clon de expresión obtenido según la
Etapa b) se siembra en 30 ml de caldo Terrific (medio TB) que
contiene un antibiótico para la selección en la presencia del
plásmido de expresión y se incuba durante la noche a 30ºC con
agitación (250 rpm).
Entonces se produce un cultivo principal para la
expresión de una proteína fosforilante de almidón. Para hacer esto,
en cada caso, matraces Erlenmeyer de 1 litro conteniendo cada uno
300 ml de medio TB se precalientan a 30ºC y un antibiótico para la
selección en la presencia del plásmido de expresión se siembra en
cada uno con 10 ml de un pre-cultivo apropiado y se
incuban a 30ºC con agitación (250 rpm) hasta que se logra una
densidad óptica (medida a una longitud de onda de 600 nm
(DO_{600}) de aproximadamente 0,8.
Si para la expresión de una proteína
fosforilante de almidón se usa un plásmido de expresión en el que la
expresión de la proteína fosforilante de almidón se inicia por
medio de un sistema inducible (por ejemplo, el vector de expresión
pDEST^{TM}17 en cepas BL21 de E. coli, inducible por medio
de IPTG), entonces al alcanzar una DO_{600} de aproximadamente
0,8, el inductor en cuestión (por ejemplo IPTG) se añade al cultivo
principal. Después de añadir el inductor, el cultivo principal se
incuba a 30ºC con agitación (250 rpm) hasta que se logra una
DO_{600} de aproximadamente 1,8. Entonces, el cultivo principal se
enfría durante 30 minutos sobre hielo antes se separarse las
células del cultivo principal del medio de cultivo por
centrifugación (10 minutos a 4.000xg y 4ºC).
\vskip1.000000\baselineskip
Las células obtenidas en la Etapa c), Punto 3,
Procedimientos generales se resuspenden en tampón de lisis. Como
resultado, aproximadamente 4 ml de tampón de lisis se añaden a
aproximadamente 1 g de células. Entonces, las células resuspendidas
se incuban durante 30 minutos sobre hielo antes de descomponerse
usando una sonda ultrasónica (Baudelin Sonoplus UW 2070, Baudelin
electronic, Berlín, parámetros: ciclo 6, 70%, 1 minuto) con
enfriamiento continuo por medio de hielo. Aquí debe tenerse cuidado
para garantizar que la suspensión de células no se calienta
demasiado durante el tratamiento ultrasónico. La suspensión obtenida
después del tratamiento ultrasónico se centrifuga (12 minutos a
20.000xg, 4ºC) y el sobrenadante obtenido después de la
centrifugación se filtra usando un filtro con un tamaño de poro de
45 \mum.
\vskip1.000000\baselineskip
Si la proteína fosforilante de almidón expresada
en células de E. coli es una proteína de fusión con una
marca His, entonces la purificación puede tener lugar usando iones
níquel a los que se une la marca His con mayor afinidad. Para hacer
esto, 25 ml del filtrado obtenido en la Etapa d) se mezclan con 1 ml
de suspensión de Ni-agarosa (Qiagen, nº de prod.:
30210) y se incuban durante 1 hora sobre hielo. La mezcla de
suspensión de Ni-agarosa y el filtrado se extienden
posteriormente sobre una columna de poliestireno (Pierce, nº de
prod.: 29920). El producto que corre por la columna se desecha. La
columna se lava a continuación añadiendo 8 ml de tampón de lisis,
el producto que corre por la columna se desecha de nuevo. La elución
de la proteína fosforilante de almidón tiene lugar entonces
mediante adición fraccionada a la columna de 1 ml de tampón E1 dos
veces, seguido de 1 ml de tampón E2 una vez y posteriormente 1 ml
de tampón E3 cinco veces. El producto que corre por la columna que
se produce añadiendo la fracción individual del tampón de elución
apropiado (tampón E1, E2, E3) a la columna se recoge en fracciones
separadas. Las alícuotas de estas fracciones se analizan
posteriormente por medio de electroforesis en gel de acrilamida
desnaturalizante SDS seguida de tinción con azul de Coomassie. Las
fracciones que contienen la proteína fosforilante de almidón en
suficiente cantidad y pureza satisfactoria se purifican y se
concentran usando filtración presurizada a 4ºC. La filtración
presurizada puede llevarse a cabo, por ejemplo, usando una celda
Amicon (celda de ultrafiltración Amicon, modelo 8010, nº de prod.:
5121) usando una membrana Diaflo PM30 (Millipore, nº de prod.:
13212) a 4ºC. Sin embargo, para la concentración también pueden
usarse otros procedimientos conocidos para el experto en la
materia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión recombinante de una proteína R1 se
describe en la bibliografía (Ritte y col., 2002, PNAS 99,
7166-7171; Mikkelsen y col., 2004, Biochemical
Journal 377, 525-532), pero también puede llevarse a
cabo según los procedimientos referentes a la expresión recombinante
de una proteína fosforilante de almidón descritos anteriormente en
el Punto 3, Procedimientos generales.
\vskip1.000000\baselineskip
La purificación de una proteína R1 se describe
en la bibliografía (Ritte y col., 2002, PNAS 99,
7166-7171;
Mikkelsen y col., Mikkelsen y col., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532), pero también puede llevarse a cabo según los procedimientos referentes a la purificación de una proteína fosforilante de almidón descritos anteriormente en el Punto 4, Procedimientos generales si una proteína de fusión R1, que contiene una marca His se produce por expresión de R1 en células de E. coli.
Mikkelsen y col., Mikkelsen y col., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532), pero también puede llevarse a cabo según los procedimientos referentes a la purificación de una proteína fosforilante de almidón descritos anteriormente en el Punto 4, Procedimientos generales si una proteína de fusión R1, que contiene una marca His se produce por expresión de R1 en células de E. coli.
\vskip1.000000\baselineskip
El almidón que no contiene fosfato de almidón
(por ejemplo, aislado de hojas del mutante
sex1-3 de Arabidopsis thaliana usando
los procedimientos descritos anteriormente en el Punto 2,
Procedimientos generales) se mezcla con el tampón de R1 y con
proteína R1 purificada (aproximadamente 0,25 \mug de proteína R1
por mg de almidón) con el fin de producir un contenido de almidón
de 25 mg por ml. Esta preparación de reacción se incuba durante la
noche (aproximadamente 15 h) a temperatura ambiente con agitación.
La R1 unida al almidón presente en la preparación de reacción se
elimina al completarse la reacción lavando cuatro veces con
aproximadamente 800 \mul de SDS al 0,5% en cada caso.
Posteriormente, el SDS todavía presente en el almidón fosforilado
in vitro se elimina lavando cinco veces con 1 ml de tampón
de lavado en cada caso. Todas las etapas de lavado se llevan a cabo
a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos con agitación. Cada
etapa de lavado va seguida de una centrifugación (2 min, 10.000xg),
con el fin de separar los gránulos de almidón del tampón de SDS o
tampón de lavado respectivo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se resuspenden aproximadamente 50 mg de
P-almidón o aproximadamente 50 mg de almidón no
fosforilado en preparaciones separadas en aproximadamente 800
\mul de extracto de proteína en cada caso. La concentración de
proteína de los extractos de proteína debe ser aproximadamente 4 mg
a 5 mg por ml en cada caso. La incubación del
P-almidón o almidón no fosforilado con extractos de
proteína se lleva a cabo a temperatura ambiente durante 15 minutos
a 4ºC con agitación. Al completarse la incubación, las preparaciones
de reacción se centrifugan usando una almohadilla Percoll (4 ml)
(15 minutos, 3500 rpm, 4ºC). Después de la centrifugación, las
proteínas que no están unidas al almidón fosforilado o
P-almidón se encontrarán en el sobrenadante y podrán
eliminarse con una pipeta Pasteur. El sobrenadante se desecha. El
sedimento sedimentado que contiene P-almidón y
almidón no fosforilado, que incluye las proteínas unidas a los
almidones respectivos (complejos de
P-almidón-proteína o complejos de
almidón no fosforilado-proteína, respectivamente),
obtenido después de la centrifugación se lava dos veces con 1 ml de
tampón de lavado en cada caso (véase anteriormente, Procedimientos
generales en el Punto 7.b) incubando durante 3 minutos a 4ºC en
cada caso con agitación. La etapa de lavado va seguida de una
centrifugación (5 minutos, 8000 rpm, 4ºC en una centrífuga de mesa,
Hettich EBA 12R) con el fin de separar el P-almidón
o el almidón no fosforilado respectivamente del tampón de
lavado.
\vskip1.000000\baselineskip
Los complejos de
P-almidón-proteína o los complejos
de almidón no fosforilado-proteína, respectivamente,
obtenidos en la Etapa a) se resuspenden en aproximadamente 150
\mul de tampón de prueba de SDS y se incuban a temperatura
ambiente durante 15 minutos con agitación. El
P-almidón o el almidón no fosforilado,
respectivamente, se eliminan posteriormente de las proteínas
disueltas por centrifugación (1 minuto, 13.000 rpm, temperatura
ambiente, centrífuga de mesa Eppendorf). El sobrenadante obtenido
después de la centrifugación se centrifuga de nuevo con el fin de
eliminar cualquier residuo de P-almidón o almidón no
fosforilado, respectivamente (1 minuto, 13.000 rpm, temperatura
ambiente, centrífuga de mesa Eppendorf) y se elimina. Como resultado
se obtienen las proteínas disueltas, que se unen al
P-almidón o almidón no fosforilado,
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Percoll: Percoll se dializa durante la noche
contra una disolución constituida por y HEPES 25 mM/KOH, pH 7,0.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas disueltas obtenidas en la Etapa c)
en el Punto 8, Procedimientos generales, referente a la unión de
proteínas a P-almidón o almidón no fosforilado,
respectivamente, se incuban durante 5 minutos a 95ºC en cada caso y
posteriormente se separan usando electroforesis en gel de
poliacrilamida desnaturalizante. Como resultado, un volumen igual
se aplica al gel de acrilamida en cada caso para las proteínas
disueltas obtenidas mediante unión a P-almidón y
para las obtenidas mediante unión al almidón no fosforilado. El gel
obtenido al completarse la electroforesis se tiñe al menos durante
la noche con Coomassie coloidal (Roth, Karlsruhe,
Roti-Blue Rod. No.: A152.1) y posteriormente se
decolora en metanol al 30%, ácido acético al 5% o en metanol al
25%.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas que después de la separación por
medio de electroforesis en gel de acrilamida y posterior
visualización por tinción (véase anteriormente, Punto 9,
Procedimientos generales) presentan un señal aumentada después de
la unión a P-almidón en comparación con una señal
correspondiente después de la unión a almidón no fosforilado tienen
actividad de unión aumentada hacia P-almidón en
comparación con almidón no fosforilado. Mediante estos medios es
posible identificar proteínas que tienen actividad de unión
aumentada hacia P-almidón en comparación con
almidón no fosforilado. Las proteínas que tienen actividad de unión
aumentada hacia P-almidón en comparación con almidón
no fosforilado se escinden del gel de acrilamida.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas identificadas según la Etapa a) se
digieren con tripsina y los péptidos obtenidos se analizan por
medio de MALDI-TOF para determinar las masas de los
péptidos obtenidos. La tripsina es una proteasa específica de
secuencia, es decir, la tripsina sólo divide proteínas en una
posición especificada cuando las proteínas en cuestión contienen
ciertas secuencias de aminoácidos. Las tripsina siempre divide
enlaces peptídicos cuando los aminoácidos arginina y lisina siguen
el uno al otro empezando en el extremo N. De esta forma es posible
determinar teóricamente todos los péptidos que se producirían tras
la digestión con tripsina de una secuencia de aminoácidos. A partir
del conocimiento de los aminoácidos que codifican los péptidos
teóricamente determinados también pueden determinarse las masas de
los péptidos que se obtienen después de la digestión con tripsina
teórica. Las bases de datos (por ejemplo, NCBInr
http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml4.0/msfit.htm; Swissprot
http://cbrg.inf.ethz.ch/Server/MassSearch.html) que contienen
información referente a las masas de péptidos después de la
digestión con tripsina teórica pueden compararse por tanto con las
masas reales de péptidos de proteínas desconocidas obtenidas con
EM-MALDI-TOF. Las secuencias de
aminoácidos que tienen las mismas masas de péptidos después de la
digestión con tripsina teórica y/o real van a considerarse como que
son idénticas. Las bases de datos en cuestión contienen tanto masas
de péptidos de proteínas cuya función ya se ha mostrado como
también masas de proteínas que hasta la fecha sólo existían
hipotéticamente mediante derivación de secuencias de aminoácidos a
partir de secuencias de ácidos nucleicos obtenidas en proyectos de
secuenciación. Por tanto, la existencia real y la función de tales
proteínas hipotéticas se han mostrado raramente y, si hay una
función en absoluto, entonces esto se basa normalmente en
predicciones y no en la demostración real de la función.
Las bandas que contienen proteínas obtenidas
según la Etapa a) se escinden del gel de acrilamida; el trozo de
acrilamida escindido se reduce y se decolora incubando durante
aproximadamente media hora a 37ºC en aproximadamente 1 ml de
NH_{4}HCO_{3} al 60% 50 mM, acetonitrilo al 40%. La disolución
decolorante se elimina posteriormente y el gel restante se seca a
vacío (por ejemplo, Speedvac). Después del secado se añade la
disolución de tripsina para digerir las proteínas contenidas en el
trozo de gel en cuestión. La digestión tiene lugar durante la noche
a 37ºC. Después de la digestión se añade un poco de acetonitrilo
(hasta que el gel de acrilamida se tiñe de blanco) y la preparación
se seca a vacío (por ejemplo, Speedvac). Cuando se completa el
secado se añade exactamente ácido fórmico al 5% suficiente para
cubrir los constituyentes secos y se incuba durante unos pocos
minutos a 37ºC. El tratamiento con acetonitrilo seguido del secado
se repite una vez más. Los constituyentes secos se absorben
posteriormente en 0,1% de TFA (ácido trifluoroacético, 5 \mul a 10
\mul) y se añaden gota a gota sobre un soporte en porciones de
aproximadamente 0,5 \mul. También se aplican cantidades iguales
de matriz (ácido
\varepsilon-ciano-4-hidroxicinámico)
al soporte. Después de cristalizar fuera de la matriz, las masas de
péptidos se determinan por medio de
EM-MALDI-TOF-EM (por
ejemplo, Burker Reflex^{TM} II, Bruker Daltonic, Bremen). Con las
masas obtenidas, las bases de datos se buscan para secuencias de
aminoácidos que den las mismas masas después de la digestión con
tripsina teórica. De esta forma pueden identificarse las secuencias
de aminoácidos que codifican proteínas que preferentemente se unen a
alfa-1,4-glucanos fosforilados y/o
que necesitan
P-alfa-1,4-glucanos
como sustrato.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de demostrar si una proteína tiene
actividad fosforilante de almidón, las proteínas que van a
investigarse pueden incubarse con almidón y ATP radiactivamente
marcado. Para hacer esto, aproximadamente 5 mg de
P-almidón o aproximadamente 5 mg de almidón no
fosforilado se incuban con la proteína que va a investigarse (0,01
\mug a 5,0 \mug por mg de almidón usado) en 500 \mul de
tampón de fosforilación durante 10 minutos a 30 minutos a
temperatura ambiente con agitación. La reacción se detiene
posteriormente mediante la adición de SDS hasta una concentración
del 2% (peso/volumen). Los gránulos de almidón en la mezcla de
reacción respectiva se centrifugan (1 minuto, 13.000xg) y se lavan
una vez con 900 \mul de una disolución de SDS al 2% y cuatro veces
cada una con 900 \mul de una disolución de ATP 2 mM. Cada etapa
de lavado se lleva a cabo durante 15 minutos a temperatura ambiente
con agitación. Después de cada etapa de lavado, los gránulos de
almidón se separan del tampón de lavado respectivo por
centrifugación (1 min, 13.000x).
Además, cuando se lleva a cabo un experimento
para demostrar la actividad fosforilante de almidón de una proteína,
adicionalmente deben procesarse preparaciones de reacción que no
contienen proteína o contienen proteína inactivada, pero que por lo
demás se han tratado de la misma forma que las preparaciones de
reacción descritas, como los llamados controles.
\vskip1.000000\baselineskip
Los gránulos de almidón obtenidos según la Etapa
a) pueden investigarse para la presencia de residuos de fosfato
radiactivamente marcados. Para hacer esto, el almidón respectivo se
resuspende en 100 \mul de agua y se mezcla con 3 ml de mezcla de
centelleo en cada caso (por ejemplo, Ready Safe^{TM}, BECKMANN
Coulter) y posteriormente se analiza usando un contador de
centelleo (por ejemplo, contador de centelleo LS 6500
Multi-Purpose, BECKMANN COULTER^{TM}).
\vskip1.000000\baselineskip
Si una proteína se incuba en preparaciones
separadas, una vez con P-almidón y una vez con
almidón no fosforilado, según el procedimiento descrito en a),
entonces, comparando los valores para la presencia de fosfato de
almidón obtenido según la Etapa b) puede determinarse si la
proteína en cuestión ha incorporado más fosfato en
P-almidón en comparación con almidón no
fosforilado. Por tanto, también pueden identificarse las proteínas
que pueden introducir fosfato en P-almidón, pero no
en almidón no fosforilado, es decir, pueden identificarse proteínas
que ya requieren almidón fosforilado como sustrato para una reacción
de fosforilación adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
0,2 a 2 \muCi por ml de
^{33}P-ATP aleatorizado (alternativamente también
puede usarse ATP que contiene un residuo de fosfato que está
específicamente marcado en la posición gamma).
Conjuntamente con la presente invención, el
término "ATP aleatorizado" debe entenderse que significa ATP
que contiene residuos de fosfato marcados tanto en la posición gamma
como en la posición beta (Ritte y col. 2002, PNAS 99,
7166-7171). El ATP aleatorizado también se describe
en la bibliografía científica como ATP beta/gamma. Un procedimiento
para preparar ATP aleatorizado se describe a continuación.
\newpage
El procedimiento descrito aquí para preparar ATP
aleatorizado usando reacciones catalizadas por enzimas se basa en
los siguientes mecanismos de reacción:
1. Etapa de reacción 1
\vskip1.000000\baselineskip
2. Etapa de reacción 2
\vskip1.000000\baselineskip
Los equilibrios de reacción se encuentran en el
lado del producto, a pesar de esto, esta reacción produce una mezcla
constituida principalmente por \beta^{33}P-ATP y
algo de \gamma^{33}P-ATP.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incuba ATP (100 \muCi, 3000 Ci por mmol)
que contiene un residuo de fosfato marcado con ^{33}P en la
posición gamma (Hartmann Analytic, 10 \muCi/\mul) con 2 \mul
de miocinasa (AMP-fosfotransferasa, de músculo de
conejo; SIGMA, nº de prod.: M3003 3,8 mg/ml, 1.626 unidades/mg) en
90 \mul de tampón aleatorizante durante 1 hora a 37ºC. La
reacción se detiene posteriormente incubando durante 12 minutos a
95ºC antes de purificarse la preparación de reacción por medio de
filtración centrífuga usando un filtro Microcon YM 10 (Amicon, nº de
prod. de Millipore 42407) a 14.000xg durante al menos 10
minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añaden 2 \mul de piruvato cinasa (véase más
adelante para cómo preparar una disolución apropiada) y 3 \mul de
PEP 50 mM (fosfoenolpiruvato) al filtrado obtenido en la Etapa ii).
Esta mezcla de reacción se incuba durante 45 minutos a 30ºC antes
de detenerse la reacción incubando a 95ºC durante 12 minutos. La
mezcla de reacción se centrifuga posteriormente (2 minutos, 12.000
rpm en una centrífuga de mesa Eppendorf). El sobrenadante que
contiene ATP aleatorizado obtenido después de la centrifugación se
elimina, se separa en alícuotas y puede almacenarse a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se centrifugan 15 \mul de piruvato cinasa (de
músculo de conejo, Roche, nº de prod. 12815, 10 mg/ml, 200
unidades/mg a 25ºC), el sobrenadante se desecha y el sedimento se
absorbe en 27 \mul de tampón piruvato cinasa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de demostrar si una proteína tiene
actividad autofosforilante, las proteínas que van a investigarse
pueden incubarse con ATP radiactivamente marcado. Para hacer esto,
las proteínas que van a investigarse (50 \mug a 100 \mug) se
incuban en 220 \mul de tampón de fosforilación (véase
anteriormente, Punto 12 d), Procedimientos generales) durante 30
minutos a 90 minutos a temperatura ambiente con agitación. La
reacción se detiene entonces añadiendo EDTA hasta una concentración
final de 0,11 M. Entonces se separan aproximadamente 2 \mug a 4
\mug de proteína usando electroforesis en poliacrilamida
desnaturalizante (gel de acrilamida al 7,5%). El gel obtenido
después de la electroforesis en gel de poliacrilamida se somete a
autorradiografía. Las proteínas que presentan una señal en la
autorradiografía llevan un residuo de fosfato radiactivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Qué posiciones de átomos de C de las moléculas
de glucosa de un alfa-1,4-glucano
están fosforiladas por una proteína puede demostrarse de una forma
controlada mediante hidrólisis de los glucanos fosforilados
obtenidos por medio de una proteína apropiada in vitro,
posterior separación de los monómeros de glucosa obtenidos después
de la hidrólisis, seguido de medición del fosfato incorporado por
una proteína apropiada en ciertas fracciones de las moléculas de
glucosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones en agua que contienen
alfa-1,4-glucano se centrifugan, el
sedimento sedimentado se resuspende posteriormente en HCl 0,7 M
(Baker, para análisis) y se incuba durante 2 horas a 95ºC con
agitación. Al completarse la incubación, las muestras se enfrían
brevemente y se centrifugan (por ejemplo, 2 minutos 10.000xg). El
sobrenadante obtenido se transfiere a un nuevo recipiente de
reacción y se neutraliza mediante la adición de NaOH 2 M (Baker,
para análisis). Si queda un sedimento, se resuspende en 100 \mul
de agua y la cantidad de fosfato marcado presente en él se determina
como control.
El sobrenadante neutralizado se centrifuga
posteriormente sobre un filtro de 10 kDa. La cantidad de fosfato
marcado en el filtrado se determina usando, por ejemplo, un contador
de centelleo midiendo una alícuota del filtrado obtenido.
\vskip1.000000\baselineskip
Los filtrados neutralizados de los productos de
hidrólisis obtenidos por medio de la Etapa a) puede separarse
(cuando se usa ATP radiactivamente marcado aproximadamente 3000 cpm)
usando, por ejemplo, cromatografía de intercambio aniónico a alta
presión (HPAE). El filtrado neutralizado puede diluirse con H_{2}O
para obtener el volumen requerido para la HPAE. Además, se añaden
glucosa-6-fosfato (aproximadamente
0,15 mM) y glucosa-3-fosfato
(aproximadamente 0,3 mM) a los filtrados apropiados en cada caso
como control interno. La separación por medio de HPAE puede
llevarse a cabo, por ejemplo, usando un sistema Dionex DX 600 Bio Lc
usando una columna CarboPac PA 100 (con precolumna apropiada) y un
detector amperométrico pulsado (ED 50). Como resultado, antes de
inyectar la muestra, la columna se aclara primero durante 10
minutos con 99% de eluyente C y 1% de eluyente D. Entonces se
inyecta un volumen de muestra de 60 \mul. La elución de la muestra
tiene lugar bajo las siguientes condiciones:
Caudal: 1 ml por minuto
Gradiente: aumentando linealmente de 0 minutos a
30 minutos
Los productos de hidrólisis eluídos de la
columna se recogen en fracciones individuales de 1 ml cada una.
Como, en cada caso, la
glucosa-3-fosfato no marcada (Ritte
y col. 2002, PNAS 99, 7166-7171) y la
glucosa-6-fosfato no marcada
(Sigma, nº de prod.: G7879) se han añadido a las muestras inyectadas
de productos de hidrólisis como patrones internos, las fracciones
que contienen o glucosa-3-fosfato o
glucosa-6-fosfato pueden
determinarse por medio de detección amperométrica pulsada. Midiendo
la cantidad de fosfatos marcados en las fracciones individuales y
posteriormente comparando con las fracciones que contienen
glucosa-3-fosfato o
glucosa-6-fosfato, esto puede
usarse para determinar aquellas fracciones que contienen
glucosa-6-fosfato marcada o
glucosa-3-fosfato marcada. Se
determina la cantidad de fosfato marcado en la fracción en cuestión.
De las relaciones de las cantidades de
glucosa-3-fosfato respecto a
glucosa-6-fosfato medidas para el
fosfato marcado en los productos de hidrólisis individuales puede
determinarse ahora qué posición de átomo de C está preferentemente
fosforilada por una enzima fosforilante de
alfa-1,4-glucanos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas aisladas que también pueden estar
presentes en forma de bandas escindidas de geles de poliacrilamida
se disocian primero en fragmentos más pequeños por medio de una
digestión con tripsina. Los péptidos formados se introducen en un
espectrómetro de masas híbrido en el que un espectrómetro de masas
de tiempo de vuelo (TOF) se acopla a un espectrómetro de masas de
cuadrupolo. En la primera fase de la medición, el primer
espectrómetro de masas (el cuadrupolo) se "desconecta" y las
masas de los péptidos formadas en la digestión pueden determinarse
en el espectrómetro de masas de TOF. En la segunda fase se
"filtra" un péptido seleccionado en el cuadrupolo, es decir,
sólo este péptido puede pasar al cuadrupolo, todos los otros son
desviados. Entonces, el péptido se rompe chocando con moléculas de
gas cargadas en la "celda de colisión". En este caso, las
"roturas" se producen principalmente en los enlaces
peptídicos. Como resultado se forman fragmentos de péptidos
distribuidos más o menos estadísticamente que se diferencian en la
masa. La secuencia de aminoácidos de los péptidos puede
determinarse entonces "clasificando" estos fragmentos. Por
tanto, si se obtienen péptidos superpuestos puede obtenerse la
secuencia de aminoácidos de una proteína. El uso de espectroscopía
de masas para la identificación y secuenciación es conocido para el
experto en la materia y se describe suficientemente en la
bibliografía especializada [por ejemplo P. Michael Conn (Ed.),
2003, Humana Press, New Jersey, ISBN:
1-58829-340-8]; J.R.
Chapman (Ed.), 2000, Humana Press, SBN: 089603609X].
\vskip1.000000\baselineskip
Los residuos de cisteína que contienen las
secuencias de aminoácidos de las proteínas que van a analizarse
pueden reducirse/alquilarse por medio de electroforesis en gel antes
de la separación de las proteínas. Para este fin, las proteínas que
van a separarse por medio de electroforesis en gel se mezclan con
tampón de muestra de SDS (no debe contener ningún DTT o
beta-mercaptoetanol). El DTT recientemente preparado
se añade entonces a esas muestras hasta una concentración final de
10 mM y la muestra se incuba durante 3 minutos a 95ºC. Después de
enfriarse la muestra hasta temperatura ambiente se añade
yodoacetamida recientemente preparada hasta una concentración final
de 20 mM. La muestra se incuba durante 20 minutos a temperatura
ambiente en la oscuridad. Entonces, las proteínas presentes en las
muestras se separan por medio de electroforesis en gel de
acrilamida.
\vskip1.000000\baselineskip
Las bandas de proteínas cuyas secuencias van a
determinarse se escinden usando un escalpelo limpio tan "sin
filo" como sea posible y se reducen (aproximadamente 1
mm^{3}-cubo). Los trozos de gel reducidos se
colocan en un recipiente de reacción de 0,5 ml o 1,5 ml y se
sedimentan durante una centrifugación corta.
\vskip1.000000\baselineskip
Si se usaron geles teñidos usando iones plata,
los trozos de gel obtenidos según la Etapa c) se cubren
completamente con una disolución que contiene ferricianuro de K 30
mM y tiosulfato de Na 100 mM en la relación 1:1 y se agitan (con
vórtex) hasta que los trozos de gel se decoloren completamente.
Entonces se elimina la disolución decolorante y los trozos de gel
se lavan tres veces con 200 \mul de agua de alta pureza en cada
caso (conductividad de aproximadamente 18 MOhm).
Si se usaron geles teñidos con azul de
Coomassie, los trozos de gel obtenidos según la Etapa c) se incuban
con una disolución que contiene agua de alta pureza y acetonitrilo
(grado de pureza: al menos puro para HPLC) en la relación 1:1 dos
veces durante 15 minutos en cada caso con agitación. El volumen de
la disolución decolorante deberá corresponderse con aproximadamente
dos veces el volumen del gel. La disolución de lavado se elimina
después de cada etapa de lavado.
Después de completarse la decoloración, los
trozos de gel se mezclan con un volumen (respecto a los trozos de
gel) de acetonitrilo y se incuban durante 15 minutos a temperatura
ambiente con agitación. El acetonitrilo se elimina y los trozos de
gel se mezclan con un volumen de bicarbonato de amonio 100 mM, se
mezclan y se incuban durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Entonces se añade acetonitrilo para dar una relación de 1:1
respecto a la cantidad de bicarbonato de amonio y acetonitrilo. La
incubación se lleva a cabo durante 15 minutos adicionales a
temperatura ambiente antes de eliminar la disolución y los trozos de
gel restantes se secan a vacío (por ejemplo, Speedvac).
\vskip1.000000\baselineskip
La disolución de tripsina (10 ng de tripsina por
\mul de bicarbonato de amonio 50 mM) se añade en porciones de 10
\mul a los trozos de gel secos obtenidos según la Etapa d).
Después de cada adición de disolución de tripsina se lleva a cabo
la incubación sobre hielo durante 10 minutos en cada caso. La
disolución de tripsina se añade en porciones hasta que los trozos
de gel no se hinchen más y se cubran completamente por la disolución
de tripsina. Entonces, la disolución de tripsina se elimina y los
trozos de gel se incuban durante la noche a 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras obtenidas según la Etapa e) se
centrifugan brevemente con el fin de recoger el líquido contenido
en el recipiente de reacción, el líquido se elimina y se transfiere
a un nuevo recipiente de reacción. Los trozos de gel se tratan
durante 2 minutos con ultrasonidos (baño de agua ultrasónico).
Entonces, los trozos de gel restantes se mezclan una vez con su
volumen de disolución de bicarbonato de amonio 25 mM y se incuban
durante 20 minutos con agitación. Entonces se añade acetonitrilo de
manera que se ajusta una relación de bicarbonato de amonio respecto
a acetonitrilo de 1:1 y la incubación se lleva a cabo a temperatura
ambiente durante 15 minutos adicionales con agitación. Después de
completarse la incubación, las muestras se tratan de nuevo con
ultrasonidos durante 2 minutos antes de eliminarse el líquido y se
combinan con el líquido que había sido eliminado previamente. Los
trozos de gel restantes se mezclan una vez con su volumen de una
disolución que contiene ácido fórmico al 5% y acetonitrilo en la
relación 1:1 y se incuban durante 15 minutos a temperatura ambiente
con agitación. El líquido se elimina y se combina con el líquido que
había sido eliminado previamente. Se repite la incubación de los
trozos de gel en ácido fórmico al 5% / acetonitrilo (relación 1:1) y
el líquido obtenido se añade asimismo a los líquidos previamente
recogidos. Los sobrenadantes combinados contienen los péptidos que
van a secuenciarse y se concentran a aproximadamente 15 \mul en la
centrífuga de vacío (Speedvac) a 60ºC Los péptidos así obtenidos
pueden almacenarse a 20ºC hasta que se analicen usando
Q-TOF. Antes de que las proteínas puedan
secuenciarse en el análisis de masas, pueden desalarse usando
procedimientos conocidos para el experto en la materia.
\vskip1.000000\baselineskip
Las plantas de arroz se transformaron según los
procedimientos descritos por Hiei y col. (1994, Plant Journal
6(2), 271-282).
\vskip1.000000\baselineskip
Las plantas de patata se transformaron usando
Agrobacterium como se describe por Rocha-Sosa
y col. (EMBO J. 8, (1989), 23-29).
\vskip1.000000\baselineskip
En el almidón, las posiciones C2, C3 y C6 de las
unidades de glucosa pueden fosforilarse. Se hidrolizaron 50 mg de
almidón en 500 \mul de HCl 0,7 M durante 4 h a 95ºC para
determinar el contenido de P en C6 del almidón. Entonces, las
preparaciones se centrifugaron durante 10 min a 15.500 g y los
sobrenadantes se eliminaron. De los sobrenadantes, 7 \mul se
mezclan con 193 \mul de tampón de imidazol (imidazol 100 mM, pH
7,4; MgCl_{2} 5 mM, EDTA 1 mM y NAD 0,4 mM). La medición se hizo
usando un fotómetro a 340 mm. Después de haberse establecido una
absorción base, la reacción de la enzima se empezó añadiendo 2
unidades de glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa (de Leuconostoc mesenteroides, Boehringer Mannheim).
El cambio en la absorción es directamente proporcional a la
concentración del contenido de P en C6 del almidón.
\vskip1.000000\baselineskip
El contenido de fosfato total se determinó
usando el procedimiento de Ames (Methods in Enzymology VIII, (1966),
115-118).
Se mezclan aproximadamente 50 mg de almidón con
30 \mul de disolución de nitrato de magnesio en etanol y se
reduce a cenizas durante tres horas a 500ºC en un horno de mufla. El
residuo se mezcla con 300 \mul de ácido clorhídrico 0,5 M y se
incuba durante 30 min a 60ºC. Entonces, una alícuota se completa
hasta 300 \mul de ácido clorhídrico 0,5 M, se añade a una mezcla
de 100 \mul de ácido ascórbico al 10% y 600 \mul de molibdato de
amonio al 0,42% en ácido sulfúrico 2 M y se incuba durante 20 min a
45ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar el contenido de fosfato unido en
la posición C-6 y en la posición C-3
de las moléculas de glucosa de un
alfa-1,4-glucano, los glucanos en
cuestión pueden separarse usando HPAE después de la hidrólisis
total usando el procedimiento especificado en los Procedimientos
generales, Punto 13. Las cantidades de
glucosa-6-fosfato y
glucosa-3-fosfato pueden
determinarse integrando las áreas pico individuales obtenidas
después de la separación por HPEA. La cantidad de
glucosa-6-fosfato y
glucosa-3-fosfato en las muestras
que van a estudiarse puede determinarse comparando el área pico
para la glucosa-6-fosfato y la
glucosa-3-fosfato obtenidas en las
muestras desconocidas con las áreas pico obtenidas después de la
separación usando HPAE con cantidades conocidas de
glucosa-6-fosfato y
glucosa-3-fosfato.
\vskip1.000000\baselineskip
Los extractos de proteína se prepararon a partir
de aproximadamente 7 g de hojas (peso fresco) de Arabidopsis
thaliana (ecotipo Columbia, Col-O) según el
procedimiento descrito en el Punto 1, Procedimientos generales.
\vskip1.000000\baselineskip
Los gránulos de almidón se aislaron de
aproximadamente 20 g (peso fresco) de hojas de un mutante
sex1-3 de Arabidopsis thaliana según
el procedimiento descrito en el Punto 2, Procedimientos
generales.
\vskip1.000000\baselineskip
Se fosforilaron aproximadamente 30 mg de almidón
no fosforilado aislado de un mutante sex1-3
de Arabidopsis thaliana según el procedimiento descrito en
el Punto 7, Procedimientos generales, por medio de una proteína R1
recombinantemente expresada en E. coli y se purificaron. Los
procedimientos descritos en Ritte y col. (2002, PNAS 99,
7166-7171) se usaron para la expresión de la
proteína R1 en E. coli y para la posterior purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Los extractos de proteína de Arabidopsis
thaliana obtenidos según la Etapa a) se incubaron y se lavaron
en una Preparación A con 50 mg del almidón fosforilado in
vitro preparado según la Etapa c) usando el procedimiento
descrito en el Punto 8 a), Procedimientos generales.
En una segunda Preparación B, los extractos de
proteína de Arabidopsis thaliana obtenidos según la Etapa a)
se incubaron y se lavaron con 50 mg del almidón no fosforilado
preparado según la Etapa b) usando el procedimiento descrito en el
Punto 8 a), Procedimientos generales.
Posteriormente, las proteínas unidas al
P-almidón de la Preparación A y al almidón no
fosforilado de la Preparación B se disolvieron según el
procedimiento descrito en el Punto 8 b), Procedimientos
generales.
En una tercera Preparación C, 50 mg del almidón
fosforilado in vitro preparado según la Etapa c) se incubaron
y se lavaron usando el procedimiento descrito en el Punto 8 a),
Procedimientos generales. Sin embargo, la Preparación C no contuvo
extractos de proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas de las Preparaciones A, B y C
obtenidas en la Etapa d) se separaron por medio de un gel de
acrilamida al 9% bajo condiciones desnaturalizantes (SDS) usando el
procedimiento descrito en el Punto 9, Procedimientos generales, y
posteriormente se tiñeron con azul de Coomassie. El gel teñido se
muestra en la Fig. 1. Puede verse claramente que una proteína que
tiene un peso molecular de aproximadamente 130 kDa en gel de
acrilamida desnaturalizante referido a un marcador patrón de
proteínas (Pista M) se une preferentemente a almidón fosforilado
(Pista P) en comparación con almidón no fosforilado (K).
\vskip1.000000\baselineskip
La banda de la proteína con un peso molecular de
aproximadamente 130 kDa identificada en la Etapa e) se escindió del
gel. La proteína se liberó posteriormente de la acrilamida como se
describe en Procedimientos generales 10 b), se digirió con tripsina
y las masas de péptidos obtenidas se determinaron por medio de
EM-MALDI-TOF. La llamada "huella
dactilar" obtenida por
EM-MALDI-TOF se comparó con huellas
dactilares de moléculas de aminoácidos teóricamente digeridas en
bases de datos (Mascot:
\underbar{http://www.matrixscience.com/search\_form\_select.html};
ProFound:http://129.85.19.192/profound_bin/WebProFound.exe;
PepSea:http://195.41.108.38/PepSealntro.html).
Como una huella dactilar tal es muy específica
para una proteína, fue posible identificar una molécula de
aminoácidos. Usando la secuencia de esta molécula de aminoácidos fue
posible aislar una secuencia de ácidos nucleicos de Arabidopsis
thaliana que codificaba una proteína OK1. La proteína
identificada usando este procedimiento se designó A.t.-OK1. Después
de analizar la secuencia de aminoácidos de Arabidopsis
thaliana se encontró que ésta se desvía de la secuencia
presente en la base de datos (NP 198009, NCBI). La secuencia de
aminoácidos mostrada en SEQ ID No 2 codifica la proteína A.t.-OK1.
La SEQ ID No 2 contiene desviaciones cuando se compara con la
secuencia en la base de datos (registro: NP 198009.1, NCBI). Los
aminoácidos 519 a 523 (WRLCE) y 762 a 766 (VRARQ) contenidos en SEQ
ID No 2 no están en la secuencia que está presente en la base de
datos (registro: NP 198009.1). NP 198009.1). En comparación con la
versión 2 de la secuencia de la base de datos (registro: NP
198009.2), la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO 2
contiene los aminoácidos adicionales 519 a 523 (WRLCE).
\vskip1.000000\baselineskip
El ADNc de A.t.-OK1 se aisló usando PCR inversa
usando ARNm aislado de hojas de Arabidopsis thaliana. Para
hacer esto, una hebra de ADNc se sintetizó por medio de
transcriptasa inversa (sistema de síntesis de la primera hebra
SuperScript^{TM} para RT-PCR, nº de prod. de
Invitrogen: 11904-018), que luego se amplificó
usando ADN polimerasa (Expand High Fidelity PCR Systems, nº de prod.
de Roche: 1732641). El producto amplificado obtenido de esta
reacción de PCR se clonó en el vector pGEM® -T (nº de prod. de
Invitrogen: A3600). El plásmido obtenido se designa
A.t.-OK1-pGEM®-T, se determinó la secuencia de ADNc
que codifica la proteína A.t.-OK1 y se muestra en SEQ ID NO. 1.
La secuencia mostrada en SEQ ID NO 1 no es la
misma que la secuencia que está contenida en la base de datos. Esto
ya se ha tratado para la secuencia de aminoácidos que codifica una
proteína A.t.-OK1.
Condiciones usadas para la amplificación del
ADNc que codifica la síntesis de la primera hebra de la proteína
A.t.-OK1:
Se usaron las condiciones y el tampón
especificados por el fabricante. Además, la preparación de reacción
para la síntesis de la primera hebra contuvo las siguientes
sustancias:
- 3 \mug
- ARN total
- 5 \muM
- cebador de 3' (OK1 rev1:5'-GACTCAACCACATAACACACAAAGATC)
- 0,83 \muM
- mezcla dNTP
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de reacción se incubó durante 5
minutos a 75ºC y posteriormente se enfrió hasta temperatura
ambiente.
Entonces se añadieron el tampón de la 1ª hebra,
inhibidor de RNasa y DTT y se incubaron durante 2 minutos a 42ºC
antes de añadir 1 \mul de ADN polimerasa Superscript RT y la
preparación de reacción se incubó durante 50 minutos a 42ºC.
Condiciones para la amplificación de la primera
hebra por medio de PCR:
- 1 \mul
- de la preparación de reacción de la síntesis de la primera hebra
- 0,25 \muM
- cebador de 3' (OK1 rev2:5'- TGGTAACGAGGCAAATGCAGA)
- 0,25 \muM
- cebador de 5' (OK1fwd2:5'- ATCTCTTATCACACCACCTCCAATG)
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones de reacción:
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción se llevó a cabo primero según las
Etapas 1 a 4. Se llevaron a cabo diez repeticiones (ciclos) entre
la Etapa 4 y la Etapa 2, reduciéndose la temperatura de la Etapa 3
0,67ºC después de cada ciclo. Esto fue seguido posteriormente por
la reacción según las condiciones especificadas en la Etapa 5 a 8.
Se llevaron a cabo veinticinco repeticiones (ciclos) entre la Etapa
7 y Etapa 5, disminuyéndose el tiempo de la Etapa 7 5 s en cada
ciclo. Al completarse la reacción, la reacción se enfrió hasta
4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la amplificación por medio de PCR usando el
plásmido A.t.-OK1-pGEM® como molde usando Gateway
Technology (Invitrogen), la secuencia que codifica la proteína OK1
de Arabidopsis thaliana se clonó primero en el vector
pDONOR^{TM} 201 (nº de prod. de Invitrogen:
11798-014). Posteriormente, la región codificante
de la proteína OK1 del vector obtenido se clonó por recombinación
específica de secuencia en el vector de expresión pDEST^{TM}17
(nº de prod. de Invitrogen: 11803-014). El vector de
expresión obtenido se designa
A.t.-OK1-pDEST^{TM}1. La clonación dio como
resultado una fusión traduccional del ADNc que codifica la proteína
A.t-OK1 con los nucleótidos presentes en el vector
de expresión pDEST^{TM}7. Los nucleótidos que se originan a
partir del vector pDEST17^{TM}17, que se fusionan
traduccionalmente con el ADNc que codifica la proteína A.t.-OK1,
codifican 21 aminoácidos. Estos 21 aminoácidos incluyen, entre
otros, el codón de iniciación (ATG) y una llamada marca His (6
residuos de histidina directamente sucesivos). Después de la
traducción de estas secuencias traduccionalmente fusionadas, esto
da como resultado una proteína A.t.-OK1 que tiene los 21 aminoácidos
adicionales codificados por nucleótidos que se originan a partir
del vector en su extremo N. Por tanto, la proteína A.t.-OK1
recombinante resultante de este vector contiene 21 aminoácidos
adicionales que se originan a partir del vector pDEST^{TM}17 en su
extremo N.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector de expresión
A.t.-OK1-pDEST^{TM}17 obtenido según el Ejemplo 3
se transformó en la cepa BL21 Star^{TM} (DE3) de E. coli
(Invitrogen, nº de prod. C6010-03). Una descripción
de este sistema de expresión ya se ha facilitado anteriormente
(véase el Punto 3, Procedimientos generales). Los clones de
bacterias que contienen el vector
A.t.-OK1-pDEST^{TM}17 resultante de la
transformación se usaron primero para preparar un cultivo
preliminar que posteriormente se usó para inocular un cultivo
principal (véase el Punto 3.c, Procedimientos generales). El
cultivo preliminar y el cultivo principal se incubaron cada uno a
30ºC con agitación (250 rpm). Cuando el cultivo principal hacía
alcanzado una DO_{600} de aproximadamente 0,8, la expresión de la
proteína A.t.-OK1 recombinante se indujo mediante la adición de
IPTG
(isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido)
hasta que se logró una concentración final de 1 mM. Después de la
adición de IPTG, el cultivo principal se incubó a 30ºC con
agitación (250 rpm) hasta que se logró una DO_{600} de
aproximadamente 1,8. Entonces, el cultivo principal se enfrió
durante 30 minutos sobre hielo antes de separarse las células del
cultivo principal del medio de cultivo por centrifugación (10
minutos a 4.000xg y 4ºC).
\vskip1.000000\baselineskip
La purificación y la concentración de la
proteína A.t.-OK1 a partir de células obtenidas según el Ejemplo 4
se llevó a cabo usando el procedimiento descrito en el Punto 4,
Procedimientos generales.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad fosforilante de almidón de la
proteína A.t.-OK1 se demostró según el procedimiento descrito en el
Punto 11, Procedimientos generales. Como resultado, 5 \mug de
proteína A.t.-OK1 purificada preparada según el Ejemplo 5 se
incubaron en cada caso en una Preparación A con 5 mg de almidón
aislado de un mutante sex1-3 de
Arabidopsis thaliana según el Ejemplo 1 b) y en una
Preparación B con 5 mg de almidón obtenido por fosforilación
enzimática según el Ejemplo 1 c), en cada caso en 500 \mul de
tampón de fosforilación que contenía ATP aleatorizado
radiactivamente marcado (^{33}P) 0,05 mM (en total 1.130,00 cpm,
aproximadamente 0,55 \muCi) durante 30 minutos a temperatura
ambiente con agitación. Como control se usó una Preparación C que
se corresponde con la Preparación B, pero que no contenía proteína
OK1, pero que por lo demás se trató del mismo modo que las
Preparaciones A y B. Para todas las Preparaciones (A, B, C) se
llevaron a cabo dos pruebas independientemente entre sí en cada
caso.
Usando un contador de centelleo, los almidones
de las Preparaciones A, B, y C se investigaron para la presencia de
fosfato radiactivamente marcado (véase el Punto 11 b),
Procedimientos generales). Los resultados se muestran en la Tabla 1
y en la Fig. 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de los resultados obtenidos puede verse
que la proteína OK1 no transfiere grupos fosfato del ATP al almidón
cuando el almidón no fosforilado se proporciona como sustrato ya que
el cupo de grupos fosfato transferidos al almidón no fosforilado
por medio de una proteína OK1, medidos en cpm, no supera el cupo de
grupos fosfato radiactivamente marcados en la Preparación C
(control). Si, por otra parte, el P-almidón se
proporciona como sustrato, el cupo de grupos fosfato radiactivos,
medidos en cpm, que se transfieren del ATP al
P-almidón es significativamente superior. De esto
puede verse que la proteína OK1 requiere P-almidón
como sustrato y que el almidón no fosforilado no es aceptado como
sustrato por la proteína OK1.
Si la prueba descrita anteriormente se lleva a
cabo con ATP específicamente marcado en la posición gamma con
^{33}P, entonces no es posible establecer ninguna incorporación de
fosfato radiactivamente marcado en el almidón. A partir de esto
puede verse que el residuo de fosfato beta ATP se transfiere de una
proteína OK1 al almidón. Los resultados de un prueba tal se muestran
en la Fig. 6.
\vskip1.000000\baselineskip
La autofosforilación de la proteína A.t.-OK1 se
demostró por medio de los procedimientos descritos anteriormente
(véase el Punto 12, Procedimientos generales). Aquí, 50 \mug de
proteína A.t.-OK1 purificada se incubaron con ATP aleatorizado
radiactivamente marcado en 220 \mul de tampón de fosforilación
(véase antes, Punto 12 d), Procedimientos generales) a temperatura
ambiente durante 60 minutos con agitación. Posteriormente, en cada
caso se eliminaron 100 \mul de las preparaciones de incubación y
se transfirieron a cuatro recipientes de reacción frescos. En el
recipiente de reacción 1, la reacción se detuvo mediante la adición
de 40 \mul de EDTA 0,11M. El recipiente de reacción 2 se incubó a
95ºC durante 5 minutos. Se añadió HCl al recipiente de reacción 3
hasta una concentración final de 0,5 M y se añadió NaOH al
recipiente de reacción 4 hasta una concentración final de 0,5 M.
Los recipientes de reacción 3 y 4 se incubaron cada uno durante 25
minutos a 30ºC. Posteriormente, en cada caso se eliminaron 50
\mul de los recipientes de reacción 1, 2, 3 y 4, se mezclaron con
tampón de prueba de SDS y se separaron por medio de electroforesis
en gel de acrilamida SDS (gel de acrilamida al 7,5%). Para este
fin, las muestras de los recipientes de reacción se aplicaron a cada
uno de los dos geles de acrilamida idénticos. Uno de los geles
obtenidos al completarse la electroforesis se sometió a
autorradiografía, mientras que el segundo gel se tiñó con azul de
Coomassie.
En el gel teñido con azul de Coomassie (véase
Fig. 2A)) puede verse claramente que el tratamiento con NaOH 0,5 M
conduce a la degradación de la proteína OK1. Por tanto, la proteína
OK1 debe describirse como inestable hacia NaOH. Las incubaciones a
30ºC, 95ºC y con HCl 0,5 M muestran que la proteína OK1 es
relativamente estable bajo las condiciones de incubación expuestas.
Esto puede concluirse del hecho que, bajo estas condiciones de
incubación, en cada caso pueden demostrarse aproximadamente las
mismas cantidades de proteína OK1 en el gel en cuestión después de
teñir con azul de Coomassie.
En la autorradiografía (véase Fig. 2B)) puede
verse en comparación con la proteína OK1 fosforilada incubada a
30ºC que una incubación de la proteína OK1 fosforilada a 95ºC
conduce a una reducción significativa en el fosfato que se ha unido
a la proteína OK1. Por tanto, la unión entre el residuo de fosfato y
un aminoácido de la proteína OK1 puede describirse como inestable
al calor. Además, una ligera reducción del fosfato unido a la
proteína OK1 también puede verse para la incubación con HCl 0,5 M y
NaOH 0,5 M en comparación con proteína OK1 fosforilada incubada a
30ºC. Si el hecho tiene en cuenta que la cantidad de proteína OK1 en
la autorradiografía después del tratamiento con NaOH 0,5 M es
significativamente menos que en las muestras tratadas con calor y
ácido debido a la inestabilidad de la proteína OK1 hacia NaOH,
entonces puede concluirse que la unión entre el residuo de fosfato
y un aminoácido de la proteína OK1 será relativamente estable con
respecto a las bases. Como la muestra tratada con ácido contiene
aproximadamente las mismas cantidades de proteína que las muestras
incubadas a 30ºC y a 95ºC, y tiene todavía una señal
significativamente inferior en la autorradiografía que la muestra
tratada a 30ºC, debe asumirse que las condiciones de incubación en
ácido también dividen el enlace entre un residuo de fosfato y un
aminoácido de la proteína OK1 hasta un cierto grado. Por tanto,
también podría establecerse una inestabilidad de la unión entre un
residuo de fosfato y un aminoácido de la proteína OK1 en las
pruebas llevadas a cabo. Al mismo tiempo, la inestabilidad con
respecto a ácidos es significativamente menos marcada que la
inestabilidad con respecto al calor.
La unión entre el aminoácido histidina y fosfato
es inestable al calor, inestable a ácidos, pero estable a bases
(Rosenberg, 1996, Protein Analysis and Purification, Birkhäuser,
Boston, 242-244). Por tanto, los resultados
descritos anteriormente son una indicación de que se produce una
fosfohistidina por la autofosforilación de una proteína OK1.
Si la proteína OK1 recombinantemente expresada
se incuba como se describe anteriormente con ATP específicamente
marcado con ^{33}P en la posición gamma, no puede establecerse
autofosforilación. La Fig. 5 A) muestra la cantidad de proteína que
puede detectarse en la preparación de reacción respectiva por medio
de análisis de transferencia de Western después de las etapas de
incubación relevantes. La Fig. 5 B) muestra una autorradiografía de
proteína de las preparaciones de reacción individuales. Puede verse
que, cuando se usa ATP específicamente marcado en la posición
gamma, no puede demostrarse autofosforilación de la proteína OK1,
mientras que cuando se usa ATP aleatorizado puede demostrarse
autofosforilación. Esto significa que cuando se autofosforila una
proteína OK1, el residuo de fosfato de la posición beta del ATP está
unido covalentemente a un aminoácido de la proteína OK1.
\vskip1.000000\baselineskip
El almidón fosforilado se preparó según el Punto
7, Procedimientos generales. Para hacer esto, 5 mg de almidón no
fosforilado aislado de hojas de un mutante
sex1-3 de Arabidopsis thaliana se
usaron en una Preparación A con 25 \mug de proteína A.t.-OK1
purificada y, en una segunda Preparación B, 5 mg de almidón
fosforilado in vitro originalmente aislado de hojas de un
mutante sex1-3 de Arabidopsis thaliana
se usaron con 5 \mug de proteína R1 purificada. La reacción se
llevó a cabo en 500 \mul de tampón de fosforilación en cada caso
que en cada caso contuvo ATP marcado con ^{33}P (aproximadamente
2,5 x 10^{6} cpm), incubando a temperatura ambiente durante 1
hora con agitación. Además, se usó una preparación de control que
contenía 5 mg de almidón aislado de hojas de un mutante
sex1-3 de Arabidopsis thaliana y dicho
tampón de fosforilación, pero no proteína. La preparación de
control se trató de exactamente la misma forma que las Preparaciones
A y B. Las reacciones individuales se detuvieron añadiendo 125
\mul de SDS al 10% en cada caso y el lavado se llevó a cabo una
vez con SDS al 2%, cinco veces con ATP 2 mM y dos veces con
H_{2}O, usando 900 \mul en cada caso. La centrifugación se
llevó a cabo después de cada etapa de lavado (2 minutos en una
centrífuga de mesa Eppendorf a 13.000 rpm en cada caso). Los
sedimentos de almidón obtenidos se resuspendieron en 1 ml de
H_{2}O en cada caso y se mezclaron 100 \mul de cada preparación
después de la adición de 3 ml de mezcla de centelleo (Ready
Safe^{TM}, BECKMANN) y posteriormente se midieron usando un
contador de centelleo (contador de centelleo LS 6500
Multi-Purpose, BECKMANN COULTER^{TM}).
\newpage
La medición dio los siguientes resultados:
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones de las Preparaciones A, B y C
obtenidas según la Etapa a) se centrifugaron de nuevo (5 minutos en
una centrífuga de mesa Eppendorf a 13.000 rpm), los sedimentos
obtenidos se resuspendieron en 90 \mul de HCl 0,7 M (Baker, para
análisis) y posteriormente se incubaron durante 2 horas a 95ºC.
Entonces, las Preparaciones A, B y C se centrifugaron de nuevo (5
minutos en una centrífuga de mesa Eppendorf a 13.000 rpm) y el
sobrenadante se transfirió a un nuevo recipiente de reacción. Los
residuos sedimentados de las preparaciones se resuspendieron en 100
ml de H_{2}O en cada caso y después de la adición de 3 ml de
mezcla de centelleo (Ready Safe^{TM}, BECKMANN) se midieron
usando un contador de centelleo (contador de centelleo LS 6500
Multi-Purpose, BECKMANN COULTER^{TM}). No
pudieron demostrarse cantidades significativas de radiactividad en
ninguno de los residuos, que significa que todos los productos de
hidrólisis marcados con fosfato radiactivo se localizan en el
sobrenadante.
Esto se siguió de neutralización de los
sobrenadantes individuales que contenían los productos de hidrólisis
mediante la adición en cada caso de 30 \mul de NaOH 2 M (la
cantidad de NaOH requerida para la neutralización se probó por
adelantado en muestras blancas). Los productos de hidrólisis
neutralizados se colocaron en un filtro Microcon de 10 kDa que
había sido previamente aclarado dos veces con 200 \mul de H_{2}O
en cada caso, y se centrifugaron durante aproximadamente 25 minutos
a 12.000 rpm en una centrífuga de mesa Eppendorf. Se tomaron 10
\mul del filtrado obtenido (aproximadamente 120 \mul en cada
caso) y, después de la adición de 3 ml de mezcla de centelleo
(Ready Safe^{TM}, BECKMANN), se midieron usando un contador de
centelleo (contador de centelleo LS 6500
Multi-Purpose, BECKMANN COULTER^{TM}). La
determinación de la actividad presente en las preparaciones
individuales dio los siguientes resultados:
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de hidrólisis obtenidos según la
Etapa b) se separaron por medio de HPAE usando un sistema Dionex en
las condiciones explicadas anteriormente (véase Procedimientos
generales, Punto 13 c)). Las muestras para separar los sobrenadantes
filtrados de las Preparaciones A y B obtenidas según la Etapa b) se
compusieron del siguiente modo:
Preparación A (OK1): 43 \mul del sobrenadante
de la Preparación A obtenido según la Etapa b) (equivalente a
aproximadamente 4.000 cpm), 32 \mul de H_{2}O, 2,5 \mul de
glucosa-6-fosfato 2,5 mM y 2,5
\mul de glucosa-3-fosfato 5 mM
(\Sigma volumen = 80 \mul).
Preparación B (R1): 16 \mul del sobrenadante
de la Preparación B obtenido según la Etapa b) (equivalente a
aproximadamente 4.000 cpm), 59 \mul de H_{2}O, 2,5 \mul de
glucosa-6-fosfato 2,5 mM y 2,5
\mul de glucosa-3-fosfato 5 mM
(\Sigma volumen = 80 \mul).
En cada caso se inyectaron 60 \mul que
contenían aproximadamente 3.000 cpm de las muestras correspondientes
para la separación usando HPAE. La HPAE se llevó a cabo según las
condiciones especificadas en el Punto 23 c). Después de pasar a
través de la columna de HPAE, el tampón de elución se recogió en
fracciones, cada una de 1 ml. La recogida de las fracciones empezó
10 minutos después de inyectar la muestra. Basándose en la señal
recibida del detector PAD usado, la elución de
glucosa-6-fosfato se asignó a la
fracción 15 y la elución de
glucosa-3-fosfato a la fracción 17.
En cada caso, 500 \mul de las fracciones individuales se mezclaron
con 3 ml de mezcla de centelleo (Ready Safe^{TM}, BECKMANN) y
posteriormente se midieron usando un contador de centelleo
(contador de centelleo LS 6500 Multi-Purpose,
BECKMANN COULTER^{TM}). Se obtuvieron las siguientes mediciones
para las fracciones individuales:
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados también se muestran gráficamente
en la Fig. 5.
Después de la fosforilación de almidón
catalizada por la proteína R1, aproximadamente el 66% del fosfato
radiactivamente marcado, referido al fosfato radiactivo medido
total en las fracciones analizadas, se eluyó después de hidrolizar
el almidón con la fracción que contenía
glucosa-6-fosfato como patrón, y
aproximadamente el 27% con la fracción que contenía
glucosa-3-fosfato como patrón.
Después de la fosforilación de almidón catalizada por la proteína
OK1, aproximadamente el 67% del fosfato radiactivamente marcado,
referido al fosfato radiactivo medido total en las fracciones
analizadas, se eluyó después de hidrolizar el almidón con la
fracción que contenía
glucosa-3-fosfato como patrón, y
aproximadamente el 8% con la fracción que contenía
glucosa-6-fosfato como patrón. A
partir de esto puede concluirse que las moléculas de glucosa del
almidón de las proteínas R1 están preferentemente fosforiladas en
la posición C-6, mientras que las moléculas de
glucosa de las proteínas OK1 del almidón están preferentemente
fosforiladas en la posición C-3.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando los procedimientos descritos en los
Puntos 1 a 13, Procedimientos generales, también fue posible
identificar una proteína de Oryza sativa (variedad M202) que
transfiere un residuo de fosfato de ATP a P-almidón.
La proteína se designó O.s.-OK1. El almidón no fosforilado no es
usado por la proteína O.s.-OK1 como sustrato, es decir, la proteína
O.s.-OK1 tampoco necesita P-almidón como sustrato.
La secuencia de ácidos nucleicos que define la proteína O.s.-OK1
identificada se muestra en SEQ ID NO 3 y la secuencia de aminoácidos
que codifica la proteína O.s.-OK1 se muestra en SEQ ID NO 4. La
secuencia de aminoácidos que codifica la proteína O.s.-OK1 mostrada
en SEQ ID NO 4 tiene una identidad del 57% con la secuencia de
aminoácidos que codifica la proteína A.t.-OK1 mostrada en SEQ ID NO
2. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína
O.s.-OK1 mostrada en SEQ ID NO 3 tiene una identidad del 61% con la
secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína A.t.-OK1
mostrada en SEQ ID NO 1.
El vector pMI50 contiene un fragmento de ADN que
codifica la proteína OK1 completa de arroz de la variedad M202.
La amplificación del ADN de arroz se llevó a
cabo en cinco subetapas.
La parte del marco de lectura abierto de la
posición -11 a la posición 288 de la secuencia especificada en SEQ
ID NO 3 se amplificó usando transcriptasa inversa y reacción en
cadena de la polimerasa usando los oligonucleótidos sintéticos
Os_ok1-R9 (GGAACCGATAATGCCTACATGCTC) y
Os_ok1-F6
(AAAACTCGAGGAGGATCAAT
GACGTCGCTGCGGCCCCTC) como cebador en ARN de semillas de arroz inmaduras. El fragmento de ADN amplificado se clonó en el vector pCR2.1 (número de catálogo de Invitrogen K2020-20). El plásmido obtenido se designó pML123.
GACGTCGCTGCGGCCCCTC) como cebador en ARN de semillas de arroz inmaduras. El fragmento de ADN amplificado se clonó en el vector pCR2.1 (número de catálogo de Invitrogen K2020-20). El plásmido obtenido se designó pML123.
La parte del marco de lectura abierto de la
posición 250 a la posición 949 de la secuencia especificada en SEQ
ID NO 3 se amplificó usando transcriptasa inversa y reacción en
cadena de la polimerasa usando los oligonucleótidos sintéticos
Os_ok1-F4 (CCAGGTTAAGTTTGGTGAGCA) y
Os_ok1-R6 (CAAAGCACGATATCTGACCTGT) como cebador en
ARN de semillas de arroz inmaduras. El fragmento de ADN amplificado
se clonó en el vector pCR2.1 (número de catálogo de Invitrogen
K2020-20). El plásmido obtenido se designó
pML120.
La parte del marco de lectura abierto de la
posición 839 a la posición 1761 de la secuencia especificada en SEQ
ID NO 3 se amplificó usando transcriptasa inversa y reacción en
cadena de la polimerasa usando los oligonucleótidos sintéticos
Os_ok1-F7 (TTGTTCGCGGGATATTGTCAGA) y
Os_ok1-R7 (GACAAGGGCATCAAGAGTAGTATC) como cebador en
ARN de semillas de arroz inmaduras. El fragmento de ADN amplificado
se clonó en el vector pCR2.1 (número de catálogo de Invitrogen
K2020-20). El plásmido obtenido se designó
pML121.
La parte del marco de lectura abierto de la
posición 1571 a la posición 3241 de la secuencia especificada en SEQ
ID NO 3 se amplificó usando transcriptasa inversa y reacción en
cadena de la polimerasa usando los oligonucleótidos sintéticos
Os_ok1-F8 (ATGATGCGCCTGATAATGCT) y
Os_ok1-R4 (GGCAAACAGTATGAAGCACGA) como cebador en
ARN de semillas de arroz inmaduras. El fragmento de ADN amplificado
se clonó en el vector pCR2.1 (número de catálogo de Invitrogen
K2020-20). El plásmido obtenido se designó
pML119.
La parte del marco de lectura abierto de la
posición 2777 a la posición 3621 se amplificó usando reacción en
cadena de la polimerasa usando los oligonucleótidos sintéticos
Os_ok1-F3 (CATTTGGATCAATGGAGGATG) y
Os_ok1-R2 (CTATGGCTGTGGCCTGCTTTGCA) como cebador en
ADN genómico de arroz. El fragmento de ADN amplificado se clonó en
el vector pCR2.1 (número de catálogo de Invitrogen
K2020-20). El plásmido obtenido se designó
pML122.
pML122.
El clonar juntas las subpartes del marco de
lectura abierto de OK1 se llevó a cabo del siguiente modo.
Un fragmento ApaI de 700 pares de bases de
longitud de pML120 que contenía parte del marco de lectura abierto
de OK1 se clonó en el sitio ApaI de pML121. El plásmido obtenido se
designó pMI47.
Un fragmento de 960 pares de bases de longitud
que contenía la región de los vectores a partir de pML120 y pML123
que codifican OK1 se amplificó por medio de reacción en cadena de la
polimerasa. Como resultado se usaron los cebadores
Os_ok1-F4 (véase anteriormente) y
Os_ok1-R9 (véase anteriormente), cada uno en una
concentración de 50 nm, y los cebadores Os_ok1-F6 y
Os_ok1-R6, cada uno en una concentración de 500 nm.
El fragmento de ADN amplificado se clonó en el vector pCR2.1
(número de catálogo de Invitrogen K2020-20). El
plásmido obtenido se designó pMI44.
Un fragmento de 845 pares de bases de longitud
de pML122 se reamplificó para introducir un sitio XhoI
después del codón de terminación con los cebadores
Os_ok1-F3 (véase anteriormente) y
Os_ok1-R2Xho
(AAAACTCGAGC
TATGGCTGTGGCCTGCTTTGCA) y se clonó en el vector pCR2.1 (número de catálogo de Invitrogen K2020-20). El plásmido obtenido se designó t pMI45.
TATGGCTGTGGCCTGCTTTGCA) y se clonó en el vector pCR2.1 (número de catálogo de Invitrogen K2020-20). El plásmido obtenido se designó t pMI45.
Un fragmento de 1671 pares de bases de longitud
que contenía parte del marco de lectura abierto de OK1 se obtuvo a
partir de pML119 digiriendo con las enzimas de restricción SpeI y
PstI. El fragmento se clonó en pBluescript II SK+ (registro
de Genbank: X52328). El plásmido obtenido se designó pMI46.
Un fragmento de 1706 pares de bases de longitud
que contenía parte del marco de lectura abierto de OK1 se escindió
con las enzimas de restricción SpeI y XhoI a partir de pMI46 y se
clonó en el vector pMI45 que había sido escindido con las mismas
enzimas de restricción. El plásmido obtenido se designó pMI47.
Un fragmento de 146 pares de bases de longitud
que contenía parte del marco de lectura abierto de OK1 se escindió
con las enzimas de restricción AflII/NotI a partir de
pMI43 y se clonó en el vector pMI44 que había sido escindido con
las mismas enzimas de restricción. El plásmido obtenido se designó
pMI49.
Un fragmento de 1657 pares de bases de longitud
que contenía parte del marco de lectura abierto de OK1 se escindió
con las enzimas de restricción NotI y NarI a partir
del vector pMI49 y se clonó en el vector pMI47 que había sido
escindido con las mismas enzimas de restricción. El plásmido
obtenido se designó pMI50 y contiene la región codificante completa
de la proteína OK1 identificada en arroz.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando los procedimientos descritos en los
Puntos 1 a 13, Procedimientos generales, las proteínas que
transfieren un residuo de fosfato de ATP a
P-almidón también se identificaron en cebada
(Hordeum vulgare), patata (Solanum tuberosum), trigo
(Triticum aestivum) y mijo (Sorghum bicolor). El
almidón no fosforilado no es usado como sustrato por estas
proteínas, es decir, estas proteínas requieren
P-almidón como sustrato.
Las proteínas se aislaron usando el
procedimiento descrito en el Punto 14, Procedimientos generales, se
digirieron con tripsina, se disolvieron del gel y se secuenciaron
usando EM-Q-TOF-EM.
Usando las secuencias de péptidos obtenidos fue posible determinar
secuencias de ácidos nucleicos EST que codificaban las proteínas OK1
relevantes de cebada, patata, trigo o mijo por medio de
comparaciones de bases de datos (búsquedas con Blast).
La secuencia de ácidos nucleicos mostrada en SEQ
ID NO 9 codifica una parte de una proteína OK1 de cebada y se
rastreó bajo el nº de "registro": TC117610 en la base de datos
TIGR (http://tigrblast.tigr.org/tgi/) por medio de una comparación
de bases de datos (búsqueda con Blast). Aquellos péptidos que se
obtuvieron secuenciando la proteína OK1 aislada de cebada usando
EM-Q-TOF-EM y se
usaron para identificar la secuencia de ácidos nucleicos EST
mostrada en SEQ ID NO 9 se especifican en SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 y
SEQ ID NO 8. La secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO 10
codifica una parte de una proteína OK1 de cebada y puede derivarse
de la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en SEQ ID NO 10.
La secuencia de ácidos nucleicos mostrada en SEQ
ID NO 15 codifica una parte de una proteína OK1 de patata y se
encontró bajo el nº de "registro": BFO54632 en la base de datos
TIGR (http://tigrblast.tigr.org/tgi/) por medio de una comparación
de bases de datos (búsqueda con Blast). Aquellos péptidos que se
obtuvieron secuenciando la proteína OK1 aislada de patata usando
EM-Q-TOF-EM y se
usaron para identificar la secuencia de ácidos nucleicos EST
mostrada en SEQ ID NO 15 se especifican en SEQ ID NO 11, SEQ ID NO
12, SEQ ID NO 13 y SEQ ID NO 14. La secuencia de aminoácidos
mostrada en SEQ ID NO 16 codifica una parte de una proteína OK1 de
patata y puede derivarse de la secuencia de ácidos nucleicos
mostrada en SEQ ID NO 15.
La secuencia de ácidos nucleicos mostrada en SEQ
ID NO 21 codifica una parte de una proteína OK1 de mijo y se
encontró bajo el nº de "registro": TC77219 en la base de datos
TIGR (http://tigrblast.tigr.org/tgi/) por medio de una comparación
de bases de datos (búsqueda con Blast). Aquellos péptidos que se
obtuvieron secuenciando la proteína OK1 aislada de mijo usando
EM-Q-TOF-EM y se
usaron para identificar la secuencia de ácidos nucleicos EST
mostrada en SEQ ID NO 21 se especifican en SEQ ID NO 17, SEQ ID NO
18, SEQ ID NO 19 y SEQ ID NO 20. La secuencia de aminoácidos
mostrada en SEQ ID NO 22 codifica una parte de una proteína OK1 de
mijo y puede derivarse de la secuencia de ácidos nucleicos mostrada
en SEQ ID NO 21.
La secuencia de ácidos nucleicos mostrada en SEQ
ID NO 25 codifica una parte de una proteína OK1 de trigo y se
encontró bajo el nº de "registro": CA74319 en la base de datos
TIGR (http://tigrblast.tigr.org/tgi/) por medio de una comparación
de bases de datos (búsqueda con Blast). Aquellos péptidos que se
obtuvieron secuenciando la proteína OK1 aislada de trigo usando
EM-Q-TOF-EM y se
usaron para identificar la secuencia de ácidos nucleicos EST
mostrada en SEQ ID NO 25 se especifican en SEQ ID NO 23 y SEQ ID NO
24. La secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO 26 codifica
una parte de una proteína OK1 de trigo y puede derivarse de la
secuencia de ácidos nucleicos mostrada en SEQ ID NO 25.
Los siguientes parámetros se seleccionaron para
llevar a cabo las comparaciones de bases de datos:
Todos los otros parámetros marcan "por
defecto".
\vskip1.000000\baselineskip
Como antígeno, aproximadamente 100 \mug de
proteína A.t.-OK1 purificada se separaron por medio de
electroforesis en gel de SDS, las bandas de proteína que contenían
la proteína A.t.-OK1 se escindieron y se enviaron a la empresa
EUROGENTEC S.A. (Bélgica) que llevó a cabo por contrato la
preparación del anticuerpo. Primero, los sueros preinmunes de
conejos se investigaron para ver si ya reconocerían una proteína de
un extracto total de A. t. antes de la inmunización con OK1
recombinante. Los sueros preinmunes de dos conejos no reconocieron
proteínas en el intervalo 100-150 kDa y, por tanto,
se eligieron para la inmunización. A cada conejo se le
administraron cuatro inyecciones de 100 \mug de proteína (día 0,
14, 28, 56). De cada conejo se tomaron cuatro muestras de sangre:
(día 38, día 66, día 87 y el sangrado final). El suero obtenido
después del primer sangrado ya mostró una reacción específica con
antígeno de OK1 en transferencia de Western. Sin embargo, en todas
las otras pruebas se usó el sangrado final de un conejo.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pIR94 se obtuvo amplificando el
promotor del gen de globulina de arroz por medio de una reacción en
cadena de la polimerasa (30 x 20 s 94ºC, 20 s 62ºC, 1 min 68ºC,
Mg_{2}SO_{4} 4 mM) con los cebadores glb1-F2
(AAAA
CAATTGGCGCCTGGAGGGAGGAGA) y glb1-R1 (AAAACAATTGATGATCAATCAGACAATCACTAGAA) en el ADN genómico de arroz de la variedad M202 con Taq polimerasa High Fidelity (Invitrogen, número de catálogo 11304-011) y se clonó en pCR2.1 (número de catálogo de Invitrogen K2020-20).
CAATTGGCGCCTGGAGGGAGGAGA) y glb1-R1 (AAAACAATTGATGATCAATCAGACAATCACTAGAA) en el ADN genómico de arroz de la variedad M202 con Taq polimerasa High Fidelity (Invitrogen, número de catálogo 11304-011) y se clonó en pCR2.1 (número de catálogo de Invitrogen K2020-20).
El plásmido pIR115 se obtuvo clonando un trozo
sintético de ADN constituido por los dos oligonucleótidos X1
(TGCAGGCTGCAGAGCTCCTAGGCTCGAGTTAACACTAGTAAGCTTAATTAAGAT ATCATTTAC) y
X2
(AATTGTAAATGATATCTTAATTAAGCTTACTAGTGTTAACTCGAGCCTAGGAGCT CTGCAGCCTGCA) en el vector pGSV71 escindido con SdaI y MunI.
(AATTGTAAATGATATCTTAATTAAGCTTACTAGTGTTAACTCGAGCCTAGGAGCT CTGCAGCCTGCA) en el vector pGSV71 escindido con SdaI y MunI.
El plásmido pIR115 obtenido se escindió con
SdaI, los extremos de 3' protuberantes se suavizaron con T4 ADN
polimerasa y se insertó un fragmento HindIII/SphI de 197
pares de bases a partir de pBinAR (Höfgen y Willmitzer, 1990, Plant
Science 66, 221-230), suavizado por medio de T4 ADN
polimerasa y conteniendo la señal de terminación del gel de la
octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens. El plásmido
obtenido se designó pIR96.
El plásmido pIR103 se obtuvo clonando un
fragmento de ADN de 986 pares de bases de longitud a partir de pIR94
que contenía el promotor del gen de globulina de arroz en el
plásmido pIR96.
pGSV71 es un derivado del plásmido pGSV7 que se
deriva del vector intermedio pGSV1. pGSV1 es un derivado de pGSC1700
cuya construcción ha sido descrita por Cornelissen y Vanderwiele
(Nucleic Acid Research 17, (1989), 19-25). pGSV1 se
obtuvo a partir pGSC1700 por deleción del gen de resistencia a
carbenicilina, además de la deleción de las secuencias de
ADN-T de la región de ADN TL del plásmido
pTiB6S3.
pGSV7 contiene el origen de replicación del
plásmido pBR322 (Bolivar y col., Gene 2, (1977),
95-113), además del origen de replicación del
plásmido de Pseudomonas pVS1 (Itoh y col., Plasmid 11,
(1984), 206). pGSV7 también contiene el gen del marcador de
selección aadA, a partir del transposón Tn1331 de
Klebsiella pneumoniae, que confiere resistencia a los
antibióticos espectinomicina y estreptomicina (Tolmasky, Plasmid 24
(3), (1990), 218-226; Tolmasky y Crosa, Plasmid
29(1), (1993), 31-40).
El plásmido pGSV71 se obtuvo clonando un gen
bar quimérico entre la región fronteriza pGSV7. El gen
bar quimérico contiene la secuencia de promotor del virus
del mosaico de la coliflor para la iniciación de la transcripción
(Odell y col., Nature 313, (1985), 180), el gen bar de
Streptomyces hygroscopicus (Thompson y col., Embo J. 6,
(1987), 2519-2523) y la región sin traducir de 3'
del gen de la nopalina sintasa del ADN-T de pTiT37
para la terminación de la transcripción y poliadenilación. El gen
bar proporciona tolerancia contra el herbicida glufosinato de
amonio.
Un fragmento de ADN que contiene el marco de
lectura abierto completo de la proteína OK1 de Arabidopsis
se escindió del vector
A.t.-ok1-pGEM-T y se clonó en el
vector pIR103. Para este fin, el plásmido
A.t.-OK1-pGEM-T se escindió con la
enzima de restricción Bsp120I, los extremos se suavizaron con
T4-ADN polimerasa y posteriormente se escindieron
con SalI. El fragmento de ADN que codifica la proteína OK1 de
Arabidopsis thaliana se clonó en el vector pIR103 escindido
con Ecl136II y XhoI. El plásmido obtenido se designó
pGlo-A.t.-OK1.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pML125 que se usó para la
transformación de plantas de arroz se obtuvo mediante recombinación
específica de los plásmidos pML124 y pIR115 usando el sistema de
clonación Gateway^{TM} (Invitrogen).
pML124 se obtuvo clonando un fragmento de ADN de
359 pares de bases de longitud de pML119 (véase anteriormente,
Ejemplo 9) que contenía parte del marco de lectura abierto que
codifica la proteína OK1 de arroz en el vector
pENTR-1A (Invitrogen, número de producto
11813-011) escindido con EcoRI.
El plásmido pIR87 se obtuvo amplificando el
intrón 1 del gen que codifica la alcohol hidrogenasa de maíz con
los cebadores Adh(i)-1
(TTTTCTCGAGGTCCGCCTTGTTTCTCCT) y Adh(i)-2
(TTTTCTCGAGCTGCACGGGTC
CAGGA) en el ADN genómico de maíz. El producto de la reacción en cadena de la polimerasa (30 x 30 s 94ºC, 30 s 59ºC, 1 min 72ºC, MgCl_{2} 2,5 mM) se digirió con la enzima de restricción XhoI y se clonó en el vector pBluescript II SK+ (registro de Genbank: X52328), que había sido escindido con la misma enzima.
CAGGA) en el ADN genómico de maíz. El producto de la reacción en cadena de la polimerasa (30 x 30 s 94ºC, 30 s 59ºC, 1 min 72ºC, MgCl_{2} 2,5 mM) se digirió con la enzima de restricción XhoI y se clonó en el vector pBluescript II SK+ (registro de Genbank: X52328), que había sido escindido con la misma enzima.
Un fragmento de ADN de 986 pares de bases de
longitud a partir de pIR94 que contenía el promotor del gen de
globulina de arroz se clonó en el vector pIR96. El plásmido obtenido
se designó pIR103.
El plásmido pIR107 se obtuvo clonando el
"casete Rfa" (véase anteriormente) en el plásmido pIR103
escindido con la enzima de restricción EcoRV.
Un fragmento de 540 pares de bases de longitud
que contenía el intrón 1 del gen que codificaba la alcohol
deshidrogenasa de maíz se escindió del plásmido pIR87 con la enzima
de restricción XhoI y se clonó en el plásmido pIR107, asimismo
escindido con XhoI. El plásmido obtenido se designó pIR114. El
plásmido pIR115 se obtuvo clonando el "casete Rfa" (véase
anteriormente) en el plásmido pIR114 escindido con
Ecl136II.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transformaron plantas de arroz (variedad
M202) usando Agrobacterium (que contiene tanto el plásmido
pGlo-A.t.-OK1 como el plásmido pML125) usando el
procedimiento descrito en Hiei y col. (1994, Plant Journal
6(2), 271-282).
\vskip1.000000\baselineskip
Las plantas transformadas con el plásmido
pGlo-A.t.-OK1 que presentaron una expresión de la
proteína A.t.-OK1 heteróloga se identificaron por medio de un
análisis de transferencia de Northern.
Las plantas que presentaron una cantidad
detectable de ARNm que codifica la proteína A.t.-OK1 se cultivaron
en el invernadero. Los granos de estas plantas se recogieron. El
almidón de estos granos mostró un contenido elevado de fosfato unido
covalentemente al almidón en cuestión.
\vskip1.000000\baselineskip
Plantas de arroz que se transformaron con el
plásmido pML125 y presentaron una expresión reducida del ARNm
endógeno que codifica la proteína OK1 se identificaron por medio de
análisis de transferencia de Northern.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir del plásmido pBinB33, el fragmento
EcoRI-HindIIII que incluye el promotor B33, una parte
del poliligador y el terminador ocs se escindieron y se ligaron en
el vector correspondientemente escindido pBIB-Hyg
(Becker, 1990, Nucl. Acids Res. 18, 203). Acids Res. 18, 203).
El plásmido pBinB33 se obtuvo ligando el
promotor del gen de la patatina B33 a partir de Solanum
tuberosum (Rocha-Sosa y col., 1989) como un
fragmento Dral (nucleótido - 1512 - +14) en el vector pUC19
escindido con SstI cuyos extremos habían sido suavizados
usando T4 ADN polimerasa. Esto dio como resultado el plásmido
pUC19-B33. El promotor B33 se escindió de este
plásmido con EcoRI y SmaI y se ligó en el vector
correspondientemente escindido pBinAR (Höfgen y Willmitzer, 1990,
Plant Science 66, 221-230). Esto dio como resultado
el vector de expresión vegetal pBinB33.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia codificante de la proteína A.t.-OK1
se escindió con las endonucleasas de restricción Bsp120I y
SalI a partir del plásmido OK1-pGEM y se ligó
en el vector pBinB33-Hyg escindido con SmaI y
SalI. El plásmido obtenido se designó
A.t.-OK1-pBinB33-Hyg.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transformó Agrobacterium tumefaciens
(cepa GV2260) con el plásmido
A.t.-OK1-pBinB33-Hyg. Entonces, las
plantas de patata de la variedad Désirée se transformaron usando
agrobacterias que contenían el plásmido
A.t.-OK1-pBinB33-Hyg usando el
procedimiento descrito en Rocha-Sosa y col. (EMBO J.
8, (1989), 23-29) y se regeneraron las plantas. Las
plantas obtenidas de este acontecimiento de transformación se
designaron 385JH.
\vskip1.000000\baselineskip
Las plantas que presentaron una elevada
actividad de la proteína A.t.-OK1 heterólogamente expresada y
también plantas en las que la actividad de la proteína OK1 endógena
se redujo por un efecto de cosupresión se identificaron por medio
de un análisis de transferencia de Western. El análisis de
transferencia de Western se llevó a cabo usando el anticuerpo
descrito en el Ejemplo 11.
La Fig. 7 muestra a modo de ejemplo la detección
de la proteína A.t.-OK1 en plantas individuales a partir del
acontecimiento de transformación 385JH por medio de análisis de
transferencia de Western. Para la inducción del promotor B33 en
tejido de hojas, líneas individuales del acontecimiento de
transformación 385JH se cultivaron sobre medio Murashige Skoog
solidificado que contenía sacarosa 100 mM en cultivo de tejido
durante dos días. Después de la recogida, los extractos de proteína
se produjeron a partir de tejido de hojas de estas plantas según el
procedimiento descrito en Procedimientos generales, Punto 1a).
Después de la separación de las proteínas por medio de
electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante se
analizaron 40 \mug de extracto de proteína de cada línea por
medio de análisis de transferencia de Western usando el anticuerpo
descrito en los Ejemplos, Punto 10. Como muestras de control
también se analizaron extractos de proteína de plantas de
Arabidopsis y de plantas naturales de patata (cv
Désirée).
Las plantas que presentaron una elevada cantidad
de la proteína A.t.-OK1 en comparación con las plantas naturales
correspondientes se cultivaron en el invernadero. El almidón que se
aisló de tubérculos de estas plantas mostró un contenido elevado de
fosfato unido covalentemente al almidón en comparación con el
almidón aislado de plantas naturales no transformadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los mutantes de inserción de
ADN-T de Arabidopsis thaliana (disponible del
Laboratorio de análisis genómicos del Instituto Salk, 10010 N.
Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, http://signal.salk.edu/ bajo
el número de registro: Salk_110814, Alias N610814) que eran
homocigóticos con respecto a la inserción en el gen de OK1 se
cultivaron bajo las siguientes condiciones:
\vskip1.000000\baselineskip
Poco antes de desarrollarse las flores, las
plantas se cultivaron en una fase de luz de 12 horas a 20ºC y una
fase de oscuridad de 12 horas a 17ºC.
Las plantas de la línea mutante obtenida
(Salk_110814) se cultivaron a partir de 3 semillas diferentes del
material de semilla original (Salk_110814-1,
Salk_110814-2, Salk_110814-3) para
análisis.
Al final de la fase de oscuridad, 10 hojas se
eliminaron en cada caso de 6 plantas naturales (ecotipo Columbia) y
se decoloraron en etanol al 70% a 50ºC. Además, 6 hojas se
eliminaron en cada caso de respectivamente 4 plantas diferentes de
las líneas mutantes Salk_110814-1,
Salk_110814-2 o Salk_110814-3 que
eran en cada caso homocigóticas con respecto a la inserción de
ADN-T en un gen de OK1, y éstas se decoloraron en
etanol al 70% a 50ºC. Entonces, las hojas se incubaron durante 10
minutos en disolución de Lugol antes de aclararse el exceso de
disolución de Lugol de las hojas con agua de grifo. No todas las
hojas de plantas naturales mostraron tinción con la disolución de
Lugol. Por otra parte, todas las hojas de las líneas mutantes
Salk_110814-1, Salk_110814-2 o
Salk_110814-3 mostraron una coloración marrón oscura
o negra (véase Fig. 7). Por tanto, las líneas mutantes mostraron un
fenotipo de exceso de almidón en comparación con las plantas
naturales. Durante el cultivo no pudieron establecerse diferencias
referentes al crecimiento entre las líneas mutantes y las plantas
naturales.
Las plantas de Arabidopsis thaliana
genéticamente modificadas que se transformaron con un constructo de
ARNi que contenía "repeticiones invertidas" de la región
codificante de un gen de OK1 bajo el control del promotor 35S se
analizaron con la ayuda de análisis de transferencia de Western
usando el anticuerpo descrito en el Ejemplo 10. Se identificaron
varias líneas independientes que presentaron una cantidad reducida
de proteína OK1 en comparación con plantas naturales. Estas líneas
se cultivaron bajo las condiciones de cultivo especificadas
anteriormente. En cada caso, 5 hojas de las líneas individuales se
eliminaron al final de la fase de oscuridad (12 horas a 17ºC), se
decoloraron en etanol y se tiñeron con disolución de Lugol. Todas
las plantas mostraron un fenotipo de exceso de almidón en
comparación con plantas naturales correspondientes. Durante el
cultivo no pudieron establecerse diferencias referentes al
crecimiento entre las plantas genéticamente modificadas y las
plantas naturales. Por tanto, las plantas genéticamente modificadas
por medio de tecnología de ARNi mostraron las mismas propiedades que
las líneas mutantes Saik_110814-1,
Salk_110814-2 o Salk_110814-3.
En cada caso, cuatro plantas de Arabidopsis
thaliana de las líneas
A.t.-alfa-OK1-1,
A.t.-alfa-OK1-2,
A.t.-alfa-OK1-3,
A.t.-alfa-OK1-4,
A.t.-alfa-OK1-5, resultantes de
acontecimientos de transformaciones independientes en los que la
cantidad de proteína OK1 se reduce por medio de tecnología de ARNi,
se investigaron para su contenido de almidón a diferentes veces. La
reducción en la cantidad de proteína OK1 en las líneas respectivas
se demostró por medio de análisis de transferencia de Western
(véase la Fig. 8). El contenido de almidón en hojas de las líneas
individuales se determinó usando los kits de almidón de Boehringer
Mannheim (nº de producto: 0207748). Para este fin, en cada caso,
todas las hojas de cuatro plantas de las líneas individuales se
recogieron y las hojas se homogeneizaron usando morteros. Se
lavaron 40 mg a 60 mg del material de hojas homogeneizado dos veces
con etanol al 80% en cada caso y el sobrenadante se desechó. El
material restante, que no es soluble en etanol, se liofilizó
después de lavarse una vez en 1 ml de agua, luego se disolvió en 0,5
ml de KOH 0,2M a 95ºC durante 1 h y la disolución obtenida se
ajustó a pH 7 usando 88 \mul de ácido acético 1 M. Se mezclaron
25 \mul de la disolución respectiva obtenida con 50 \mul de
disolución de amiloglucosidasa (kit de almidón de Boehringer
Mannheim, nº de producto: 0207748) a la que se había añadido 1
unidad de alfa-amilasa (de Bacillus
amyloliquefaciens, Boehringer, nº de producto 161764) y se
incubó durante 1 h a 55ºC. Luego se usaron 20 \mul de la
disolución tratada con amiloglucosidasa y
alfa-amilasa para determinar la glucosa usando una
prueba fotométrica acoplada a enzimática (véase la hoja de
información del producto para la determinación de almidón nativo de
Boehringer Ingelheim, nº de producto: 0207748). Al mismo tiempo que
las líneas transgénicas, el almidón contenido también se determinó
en hojas de plantas naturales de Arabidopsis thaliana
(ecotipo Columbia). Las plantas naturales y las plantas
transgénicas se cultivaron bajo las mismas condiciones: 12 horas de
fase de luz seguidas de 12 horas fase de oscuridad.
Las hojas de las líneas de plantas transgénicas
respectivas y las plantas naturales se recogieron en cada caso
aproximadamente 4,5 semanas después de la germinación de semillas
después del final de la fase de oscuridad, después del final de una
fase de luz y después del final de una segunda fase de oscuridad que
siguió directamente a la fase de luz. Para cada línea de plantas
transgénicas se produjeron en cada caso dos extractos independientes
a partir de los cuales se hicieron dos mediciones del contenido de
almidón en cada caso. Para plantas naturales se produjeron cuatro
extractos en cada caso a partir de los cuales se hicieron dos
mediciones del contenido de almidón en cada caso. La determinación
de los contenidos de almidón en hojas dio los siguientes
resultados:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El almidón se aisló a partir de hojas de las
plantas descritas en el Ejemplo 14 y se hidrolizó usando el
procedimiento descrito en Procedimientos generales, Punto 13 y luego
se separó por medio de análisis de HPAE. Se calcularon las áreas de
las señales separadas obtenidas por medio de análisis de HPAE para
fosfato en C-3 y fosfato en C-6
(software: Chromelion 6.20 de Dionex, EE.UU.) y los valores
obtenidos se dieron como la relación entre sí. La relación de
fosfato en C-6 respecto a fosfato en
C-3 en plantas naturales fue 2,1. En las plantas
descritas en el Ejemplo 14 en las que la actividad de la proteína
OK1 se redujo por medio de tecnología de ARNi, por otra parte, la
relación promedio de fosfato en C-6 respecto a
fosfato en C-3 determinada analizando el almidón
aislado de las líneas
A.t.-alfa-OK1-1,
A.t.-alfa-OK1-2, A.t.-alfa-OK1-3, A.t.-alfa-OK1-4 y A.t.-alfa-OK1-5 era 2,5. El análisis de almidón de la línea
A.t.-alfa-OK1-5 dio la relación más baja de fosfato en C-6 respecto a fosfato en C-3 (relación de 2,2), el almidón de la línea A.t.-alfa-OK1-1 dio la relación más alta (relación de 2,7).
A.t.-alfa-OK1-2, A.t.-alfa-OK1-3, A.t.-alfa-OK1-4 y A.t.-alfa-OK1-5 era 2,5. El análisis de almidón de la línea
A.t.-alfa-OK1-5 dio la relación más baja de fosfato en C-6 respecto a fosfato en C-3 (relación de 2,2), el almidón de la línea A.t.-alfa-OK1-1 dio la relación más alta (relación de 2,7).
El almidón aislado de hojas de los mutantes
descritos en el Ejemplo 13 que presentan una actividad reducida de
una proteína OK1 mostró un aumento en la relación de fosfato en
C-6 respecto a fosfato en C-3 en el
almidón en cuestión.
<110> Bayer Cropscience GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimientos para identificar
proteínas con actividad enzimática fosforilante de almidón
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BCS
04-5001-PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP04090483.1
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
15-12-2004
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP04090121.7
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
29-03-2004
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP04090087.0
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
05-03-2004
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US60/549.980 provisional
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
05-03-2004
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3591
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(3591)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1196
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3644
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)..(3633)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1206
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa, Arabidopsis
thaliana, Sorghum bicolor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hordeum vulgare
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hordeum vulgare
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hordeum vulgare
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 807
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hordeum vulgare
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(590)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 195
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hordeum vulgare
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 403
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(402)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sorghum bicolor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sorghum bicolor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sorghum bicolor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sorghum bicolor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1526
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sorghum bicolor
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(1525)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 508
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sorghum bicolor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum aestivum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum aestivum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 509
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum aestivum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(507)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 169
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum aestivum
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (12)
1. Un procedimiento para identificar una
proteína que presenta actividad enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos y requiere
alfa-1,4-glucanos fosforilados como
sustrato en el que
- a)
- se incuban extractos de proteína con alfa-1,4-glucanos fosforilados,
- b)
- se disuelven proteínas específicamente unidas a los alfa-1,4-glucanos fosforilados de la Etapa a),
- c)
- las proteínas obtenidas según la Etapa b) se incuban respectivamente con
- i
- ATP y alfa-1,4-glucanos fosforilados y
- ii
- ATP y alfa-1,4-glucanos no fosforilados en preparaciones separadas entre sí,
- d)
- se examina el alfa-1,4-glucano respectivo obtenido después de la incubación en la Etapa c) i o la Etapa c) ii para comprobar la introducción de otros grupos fosfato y
- e)
- se identifican proteínas que en la preparación de la incubación según c) i han introducido grupos fosfato en alfa-1,4-glucanos en una cantidad que es al menos dos veces superior a la cantidad determinada en experimentos de control y en la preparación de la incubación según c) ii no han introducido grupos fosfato en alfa-1,4-glucanos en una cantidad que es al menos dos veces superior a la cantidad determinada en experimentos de control.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la proteína con actividad enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos usa almidón
fosforilado como sustrato.
3. El procedimiento según la reivindicación 2,
en el que la proteína con actividad enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos procede de una
planta.
4. Una proteína que requiere
alfa-1,4-glucanos fosforilados como
sustrato e introduce enlaces monoéster de fosfato en la posición
C-3 de una molécula de glucosa del
alfa-1,4-glucano,
caracterizada porque su secuencia de aminoácidos codificante
tiene un dominio de fosfohistidina que tiene al menos el 60% de
identidad con el dominio de fosfohistidina como se identifica en SEQ
ID No. 5.
5. Un procedimiento para identificar una
molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que presenta
actividad enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos en el que
- a)
- se identifica una proteína mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3,
- b)
- se determinan secuencias de aminoácidos que codifican la proteína identificada según la Etapa a) y
- c)
- se identifican moléculas de ácidos nucleicos usando los aminoácidos determinados según la Etapa b).
\vskip1.000000\baselineskip
6. El procedimiento según la reivindicación 5,
en el que oligonucleótidos de ácidos nucleicos basados en la
secuencia de aminoácidos determinada según la Etapa b) se preparan
para identificar dicha molécula de ácido nucleico según la Etapa
c).
7. Un procedimiento para identificar una
molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que presenta
actividad enzimática fosforilante de
alfa-1,4-glucanos en el que
- a)
- se identifica una proteína mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3,
- b)
- se producen anticuerpos que reaccionan específicamente con la proteína identificada según la Etapa a) y
- c)
- se identifican moléculas de ácidos nucleicos a modo de inmunocribado usando los anticuerpos producidos según la Etapa b).
\vskip1.000000\baselineskip
8. Una célula vegetal genéticamente modificada
caracterizada porque la modificación genética consiste en la
introducción de al menos una molécula de ácido nucleico extraña en
el genoma de la planta, en la que la molécula de ácido nucleico
extraña codifica una proteína según la reivindicación 4, en la que
la célula vegetal genéticamente modificada sintetiza un almidón
modificado que tiene un contenido elevado de fosfato de almidón y/o
una distribución de fosfato modificada en comparación con almidón de
plantas naturales correspondientes.
9. La célula vegetal según la reivindicación 8,
en la que el almidón modificado se caracteriza porque
presenta un contenido elevado de fosfato unido covalentemente al
almidón en la posición C-3 de la molécula de glucosa
en comparación con almidón de células vegetales naturales
correspondientes.
10. Una planta que contiene células vegetales
genéticamente modificadas según una de las reivindicaciones 8 ó
9.
11. La planta según la reivindicación 10, que es
una planta de maíz, arroz, trigo, centeno, avena, cebada, mandioca,
patata, sagú, judía mungo, guisante o sorgo.
12. La planta según la reivindicación 11, que es
una planta de maíz o trigo.
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|---|---|---|---|
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| EP04090087 | 2004-03-05 | ||
| US549980P | 2004-03-05 | ||
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| EP04090121 | 2004-03-29 | ||
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