JP2007525986A - デンプンリン酸化酵素活性を有するタンパク質を同定するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)互いに分離された調製物中のタンパク質抽出物を、
i.リン酸化α−1,4−グルカン および
ii.非リン酸化α−1,4−グルカン
とインキュベーションし、
b)i.工程a)iからのリン酸化α−1,4−グルカンに特異的に結合するタンパク質、
および
ii.工程a)iiからの非リン酸化α−1,4−グルカンに特異的に結合するタンパ
ク質、
を、互いに分離された調製物中に溶解し、ならびに
c)工程b)ii 中で用いられる非リン酸化α−1,4−グルカンと比べて、工程b)i中で用いられるリン酸化α−1,4−グルカンに対して高い結合活性を示すタンパク質を同定する、
方法に関する。
a)タンパク質抽出物をリン酸化α−1,4−グルカンとインキュベーションし
b)工程a)から得られたリン酸化α−1,4−グルカンに特異的に結合するタンパク
質を溶解し、
c)工程b)によって得られたタンパク質を、互いに分離された調製物中で、
i) ATPおよびリン酸化α−1,4−グルカン、
ii) ATPおよび非リン酸化α−1,4−グルカン、
と、それぞれインキュベーションし、
d)工程c)iまたは工程c)ii のインキュベーション後に得られたそれぞれのα−1,4−グルカンについて、さらにリン酸基が導入されたかを検査し、そして
e)c)iによるインキュベーション調製物中でα−1,4−グルカンへ有意な量の
リン酸基を導入し、c)iiによるインキュベーション調製物中でα−1,4−グル
カンへ有意な量のリン酸基を導入しなかったタンパク質を同定する、
方法である。
a)タンパク質を同定するための本発明による方法を用いて、タンパク質を同定し、
b)工程a)によって同定されたタンパク質をコードするアミノ酸配列を決定し、
c)工程b)によって決定されたアミノ酸を用いて、工程a)によって同定されたタンパク質をコードする核酸を同定する、
方法もまた本発明の目的である。
a)タンパク質を同定するための本発明による方法を用いてタンパク質を同定し、
b)工程a)によって同定されたタンパク質をコードするアミノ酸配列を決定し、
c)工程b)で決定されたアミノ酸配列からスタートして、オリゴヌクレオチドを合成
し、そして、
d)工程a)によって同定されたタンパク質をコードする核酸を、工程c)によって合
成されたオリゴヌクレオチドを用いて同定する、
方法に関する。
a)タンパク質を同定するための本発明による方法を用いてタンパク質を同定し、
b)工程a)によって同定されたタンパク質と特異的に反応する抗体を生成し、
c)工程bによって決定された抗体を用いて、核酸を同定する、
方法に関する。
配列番号1: Arabidopsis thaliana のA.t.−OK1タンパク質のコード領域を含む核酸配列。この配列を、ベクターOK1−pGEM−T および OK1−pDEST(商標)17に挿入する。
配列番号2: Arabidopsis thaliana のA.t.−OK1タンパク質をコードするアミノ酸配列。この配列は、配列番号1に示された核酸配列から導出することができる。
配列番号3: Oryza sativa のO.s.−OK1タンパク質のコード領域を含む核酸配列。この配列をベクターMI50に挿入する。
配列番号4: Oryza sativa のO.s.−OK1タンパク質をコードするアミノ酸配列。この配列は、配列番号3に示された核酸配列から導出することができる。
配列番号5: Arabidopsis thaliana、Oryza sativa および Sorghum bicolor のOK1タンパク質のホスホヒスチジン領域をコードするペプチド配列。
配列番号6: オオムギのH.v.−OK1タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号7: オオムギのH.v.−OK1タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号8: オオムギのH.v.−OK1タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号9: オオムギのH.v.−OK1タンパク質をコードする部分的核酸配列。この核酸配列は、TIGRデータベースの「Blast検索」機能を用い、配列番号6、配列番号7および配列番号8に示されたペプチド配列を使用して同定した。
配列番号10: オオムギのH.v.−OK1タンパク質をコードする部分的なアミノ酸配列。示されたアミノ酸配列は、配列番号9に示された核酸配列から導出することができる。
配列番号11: ジャガイモのS.t.−OK1タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号12: ジャガイモのS.t.−OK1タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号13: ジャガイモのS.t.−OK1タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号14: ジャガイモのS.t.−OK1タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号15: ジャガイモのS.t.−OK1タンパク質をコードする部分的核酸配列。この核酸配列は、TIGRデータベースで「Blast検索」機能を用い、配列番号11、配列番号12、配列番号13および配列番号14に示されたペプチド配列を使用して同定した。
配列番号16: ジャガイモのS.t.−OK1タンパク質をコードする部分的アミノ酸配列。示されたアミノ酸配列は、配列番号15に示された核酸配列から導出することができる。
配列番号17: キビのS.b.−OK1タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号18: キビのS.b.−OK1タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号19: キビのS.b.−OK1タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号20: キビのS.b.−OK1タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号21: キビのS.b.−OK1タンパク質をコードする部分的核酸配列。この核酸配列は、配列番号17、配列番号18、配列番号19および配列番号20に示されたペプチド配列を使用し、TIGRデータベースで「Blast検索」機能を用いて同定した。
配列番号22: キビのS.b.−OK1タンパク質をコードする部分的アミノ酸配列。示されたアミノ酸配列は、配列番号21に示された核酸配列から導出することができる。
配列番号23: コムギのT.a.−OK1タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号24: コムギのT.a.−OK1タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号25: コムギのT.a.−OK1タンパク質をコードする部分的核酸配列。この核酸配列は、配列番号23および配列番号24に示されたペプチド配列を使用し、TIGRデータベースで「Blast検索」機能を用いて同定した。
配列番号26: コムギのT.a.−OK1タンパク質をコードする部分的アミノ酸配列。示されたアミノ酸配列は、配列番号25に示された核酸配列から導出することができる。
下記に本発明による方法を実施するために用いることができる方法について記述する。これらの方法は、本発明の特別の実施態様を構成するが、本発明はこれらの方法に制限されない。記述された方法を変更することによりおよび/または方法の個々の部分を方法の別の部分に置換することにより、同じように本発明を実施できることは、当業者に知られている。
葉材料を収穫直後に液体窒素で凍結し、続いて液体窒素下乳鉢中で均質化する。細かくした葉材料を約3.5倍の体積(用いる葉材料の重量に対して)の冷却した(4℃)結合用緩衝液と混合し、Ultraturraxを用いて、2×10秒間浸軟した(最高速度)。Ultraturraxによる第1の処理の後、第2の処理を実行する前に縮小させた葉材料を氷上で冷却する。その後、処理した葉材料を、100μmのナイロンメッシュを通し、20分間遠心した(50ml遠心管、20,000×g、4℃)。
工程a)による遠心分離によって得られた上清を取り出し、その体積を測定した。タンパク質を沈殿させるために、硫酸アンモニウムを上清に、30分間かけて氷上で撹拌しながら、75%(重量/体積)の最終濃度になるまで連続的に加える。上清を続いてもう1時間氷上で撹拌しながらインキュベーションする。上清から沈殿させたタンパク質を、20,000×gおよび4℃10分間でペレット化し、続いてペレットを5mlの結合用緩衝液に吸収させる、すなわちペレット中に存在するタンパク質を溶解させる。
溶解したタンパク質を、セファデックスG25(Amersham Bioscience, Freiburg, Prod. No. columns: 17-0851-01, Prod. No. Sephadex G25-M: 17-0033-01)を詰めたPD10カラムを用いて温度4℃で脱塩する、すなわち工程b)の沈澱に用いられた硫酸アンモニウムを溶解したタンパク質から分離する。工程b)に従って溶解されたタンパク質を加える前に、PD10カラムを結合用緩衝液と平衡にする。この目的のために、各5mlの結合用緩衝液をカラム上に散布する。続いて、工程b)に従って得られたタンパク質溶液の2.5mlを各カラムへ加え、次に3.5mlの結合用緩衝液によりカラムからタンパク質を溶出させる。
タンパク質濃度を、ブラッドフォード分析(Biorad, Munich, Prod. No.500-0006(Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72, 248-254))により決定する。
結合用緩衝液: 50mM HEPES/NaOH(またはKOH)、pH7.2
1mM EDTA、
2mM ジチオエリトリトール(DTE)、
2mM ベンズアミジン、
2mM ε−アミノカプロン酸、
0.5mM PMSF、
0.02% トリトンX−100。
葉材料を収穫直後に液体窒素中で凍結する。葉材料を小分けして乳鉢中で液体窒素下均質化し、全体で約2.5倍の体積(重量/体積)のデンプン緩衝液中に吸収させる。さらにこの懸濁液を、ワーリングブレンダー中最高速度で20秒間再び均質化する。ホモジネートをナイロンメッシュ(メッシュ幅100μm)に通し、5分間1,000×gで遠心する。可溶性タンパク質を含む上清を捨てる。
デンプンの上にある緑の物質を、デンプン緩衝液で緑の物質をすすぎ落とすことによって除去した後、工程a)から得られたデンプンを含むペレットをデンプン緩衝液に吸収させ、種々のメッシュ幅(60μm、30μm、20μmの順に)のナイロンメッシュに次々と通す。濾液を、10mlのパーコール・クッション(95%(v/v)パーコール(Pharmacia, Uppsala, Sweden)、5%(v/v)0.5M HEPES−KOH pH7.2)(Correxチューブ、15min、2,000×g)を用いて、遠心分離する。この遠心分離後に得られた沈殿物をデンプン緩衝液に一度再懸濁し、再び遠心分離する(5min、1,000×g)。
工程b)に従って、デンプンに結合したタンパク質を含むデンプン粒を得る。デンプン粒の表面に結合したタンパク質を4回、各回に0.5%SDS(ラウリル硫酸ナトリウム)と10〜15分間室温で攪拌下インキュベーションすることにより、除去する。各洗浄工程の次に、洗浄緩衝液からデンプン粒を分離するために遠心分離(5min、5,000×g)を行う。
工程c)から得た、表面へ結合したタンパク質を除いたデンプンを、続いて洗浄緩衝液と4回、各場合に室温で攪拌下10〜15分インキュベーションすることにより除く。各洗浄工程に続いて、それぞれの洗浄緩衝液からデンプン粒を分離するために遠心分離(5分、1,000×g)を行う。これらの精製工程は、主として工程c)でインキュベーション中に用いられるSDSを除去する役割を果たす。
工程d)で分離されたデンプンの量を光度計で決定する。適当な希釈の後、デンプン懸濁液の光学密度を検量線に対して600nmの波長で測定する。検量線が直線状である範囲は、0〜0.3吸光単位の間に存在する。
デンプンをそれ以上貯蔵しないでさらなるテストに直接用いてもよいし、または1.5mlエッペンドルフ管に分注して−20℃で貯蔵してもよい。冷凍デンプンおよび非貯蔵の新鮮に分離されたデンプンの両方を、もし必要なら、例えばインビトロのリン酸化および/または結合テストに関する本発明に記述された方法に用いることができる。
1×デンプン緩衝液: 20mMHEPES−KOH、pH8.0、
0.2mMEDTA、
0.5% トリトンX−100
洗浄緩衝液: 50mMHEPES/KOH、pH7.2
デンプンリン酸化タンパク質をコードするcDNAを、例えば「鋳型」として植物組織のmRNAまたはポリA−プラス−mRNAを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅することができる。この目的のために、先ず、逆転写酵素を用いてデンプンリン酸化タンパク質をコードするmRNAに相補的なcDNA鎖を作製し、その後当該cDNA鎖をDNAポリメラーゼにより増幅する。PCR反応を実施するための物質、酵素および指示を含むいわゆる「キット」を、購入することができる(例えば、SuperScript(商標) One-Step RT-PCR System, Invitrogen, Prod. No.: 10928-034)。デンプンリン酸化タンパク質をコードする増幅されたcDNAを、その後、バクテリアの発現ベクター、例えばpDEST(商標)17(lnvitrogen)中にクローニングすることができる。pDEST(商標)17は、T7RNAポリメラーゼの転写を開始するために用いられるT7プロモーターを含む。更に、発現ベクターpDEST(商標)17は、T7プロモーターの5’方向にシャイン・ダルガルノ配列を含み、その後に開始コドン(ATG)および、いわゆるHisタグが続く。このHisタグは直接連続する6つのコドンから成り、各々はアミノ酸ヒスチジンをコードし、また前記開始コドンの読枠中に位置する。デンプンリン酸化タンパク質をコードするcDNAのpDEST(商標)17中へのクローニングを、翻訳の融合が、開始コドン、Hisタグ、およびデンプンリン酸化タンパク質をコードするcDNAのコドン間に生じるように行なう。この結果として、T7プロモーター上で開始される転写およびその後の翻訳に続いて、そのN末端にHisタグを含む追加のアミノ酸を含むデンプンリン酸化タンパク質が得られる。
まず第一に、T7RNAポリメラーゼを染色体的にコードする適切な形質転換受容性E.coli 菌株を工程a)で作製された発現プラスミドにより形質転換し、続いて寒天で固めた培地上一晩30℃でインキュベーションする。適切な発現菌株は、例えば、BL21菌株(Invitrogen Prod. No.: C6010-03)であり、これは、IPTG誘導が可能なプロモーター(lacZ)の制御下にあるT7RNAポリメラーゼを染色体的にコードする。
まず第一に、予備培養を生成する。このために、工程b)に従って得られた発現クローンを、発現プラスミドの存在を選択するための抗生物質を含む30mlのTerrific Broth培地(TB培地)に播種し、一晩30℃で攪拌下(250rpm)インキュベーションする。
一般的方法項目3の工程c)で得た細胞を、溶解緩衝液中に再懸濁する。その際、約4mlの溶解緩衝液を約1gの細胞へ加える。次に再懸濁した細胞を氷上で30分間インキュベーションし、その後、超音波プローブ(Baudelin Sonoplus UW 2070, Baudelin electronic, Berlin、設定:サイクル6、70%、1分間)を用いて、氷による連続冷却下で破砕する。ここで、細胞懸濁液を超音波処理の間に熱しすぎないことを確実にするように注意しなければならない。超音波処理の結果得られた懸濁液を遠心し(12分20,000×g、4℃)、遠心分離の後に得られた上清を、45μmのポアサイズを有するフィルターを用いて濾過する。
もし E.coli 細胞中に発現したデンプンリン酸化タンパク質がHisタグとの融合タンパク質である場合は、Hisタグが非常に大きな親和性で結合するニッケルイオンを用いて精製することができる。これを行うために、工程d)で得られた25mlの濾液を1mlのNi−アガローススラリー(Qiagen, Prod. No.: 30210)と混合し、氷上で1時間インキュベーションする。Ni−アガローススラリーと濾液の混合物を、続いてポリスチレンカラム(Pierce, Prod. No.:29920)上で展開する。カラムを通過する生成物を捨てる。次に8mlの溶解緩衝液を加えることによりカラムを洗浄し、カラムを通過する生成物を再び捨てる。デンプンリン酸化タンパク質の溶出は、次に、1mlのE1緩衝液を2回、続いて1mlのE2緩衝液を1回、また続いて1mlE3緩衝液を5回、カラムへ区分けして加えることにより起こる。カラムへ適切な溶出緩衝液(El、E2、E3緩衝液)の個々の分画を加えることにより生成される、カラムを通過する生成物を、別々の分画に集める。これらの分画の小部分を、次に変性SDSアクリルアミドゲル電気泳動とそれに続くクーマシーブルー染色により分析する。十分な量および満足すべき純度のデンプンリン酸化タンパク質を含む分画を、加圧濾過を用いて4℃で精製し濃縮する。加圧濾過を、例えばAmiconセル(Amicon Ultrafiltration Cell, Model 8010, Prod. No.: 5121)を用いて、DiafloPM30膜(Millipore, Prod. No.: 13212)を使用して4℃で実施することができる。しかし、当業者に公知の他の方法も濃縮に用いることができる。
溶解緩衝液: 50mM HEPES、
300mM NaCl、
10mM イミダゾール、
pH8.0(NaOHで調節する)、
1mg/mlリゾチーム(緩衝液を用いる直前に加える)
10ml当たり1/4錠の完全EDTAフリープロテアーゼ阻害剤(Roche Product No.:1873580)(緩衝液を用いる直前に加える)。
溶出緩衝液E1: 50mM HEPES、
300mM NaCl、
50mM イミダゾール、
pH8.0(NaOHで調節する)
溶出緩衝液E2: 50mM HEPES、
300mM NaCl、
75mM イミダゾール、
pH8.0(NaOHで調節する)
溶出緩衝液E3: 50mM HEPES、
300mM NaCl、
250mM イミダゾール、
pH8.0(NaOHで調節する)
R1タンパク質の組換え発現については、文献(Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171; Mikkelsen et al., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532) に記載されているが、しかしまた、一般的方法項目3の下に上に記述されたデンプンリン酸化タンパク質の組換え発現に関する方法に従って実施することもできる。
R1タンパク質の精製については、文献(Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171; Mikkelsen et al., Mikkelsen et al., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532) に記述されているが、しかし、E. coli 細胞のR1の発現によってHisタグを含むR1融合タンパク質が生成される場合は、一般的方法項目4の下に上に記述された、デンプンリン酸化タンパク質の精製に関する方法に従って実施することもできる。
1ml当たり25mgのデンプン含量を生成するために、デンプンリン酸を含まないデンプン(例えば、一般的方法項目2、の下で上に記述された方法を用いて、Arabidopsis thaliana sex1-3 突然変異体の葉から単離された)を、R1緩衝液および精製されたR1タンパク質(1mgデンプン当たり約0.25μgのR1タンパク質)と混合する。この反応調製物を、一晩(約15h)攪拌下室温でインキュベーションする。反応調製物中に存在するデンプンに結合しているR1を、反応の完了時に4回、各回約800μlの0.5%SDSで洗浄することにより除去する。続いてインビトロでリン酸化されたデンプン中にまだ存在するSDSを5回、各回1mlの洗浄緩衝液で洗うことにより、除去する。すべての洗浄工程を室温で10〜15分間攪拌下行なう。各洗浄工程に続けて、それぞれのSDS緩衝液または洗浄緩衝液からデンプン粒を分離するために、遠心分離(2分間、10,000×g)を行う。
R1緩衝液: 50mM HEPES/KOH、pH7.5、
1mM EDTA、
6mM MgCl2、
0.5mM ATP
洗浄緩衝液: 50mM HEPES/KOH、pH7.2
約50mgのP−デンプンまたは約50mgの非リン酸化デンプンを、個別の調製物中の各タンパク質抽出物約800μlに再懸濁する。タンパク質抽出物のタンパク質濃度は、各々1ml当たり約4mg〜5mgとするべきである。P−デンプンまたは非リン酸化デンプンとタンパク質抽出物のインキュベーションを攪拌下室温15分間4℃で実施する。インキュベーションの完了時に、反応調製物をパーコールクッション(4ml)を用いて遠心する(15分、3,500rpm、4℃)。遠心分離の後、リン酸化デンプン即ちP−デンプンに結合していないタンパク質は上清で見つかり、パスツールピペットで除去ことができる。上清を捨てる。遠心分離後に得られたP−デンプンおよび非リン酸化デンプンを含み、またそれぞれのデンプンに結合したタンパク質(それぞれ、P−デンプンタンパク質複合体または非リン酸化デンプンタンパク質複合体)を含む沈殿したペレットを2回、各回1mlの洗浄緩衝液で(上記、一般的方法項目7.b)を参照のこと)、3分間4℃攪拌下でインキュベーションすることにより、洗浄した。洗浄工程の次に、洗浄緩衝液からP−デンプンまたは非リン酸化デンプンをそれぞれ分離するために、遠心分離(5分、8000rpm、4℃で卓上遠心機 Hettich EBA 12Rで)を行った。
工程a)で得られたP−デンプンタンパク質複合体または非リン酸化デンプンタンパク質複合体をそれぞれ約150μlSDSテスト緩衝液中に再懸濁し、室温15分間攪拌下でインキュベーションする。続いてP−デンプンまたは非リン酸化デンプンを、それぞれ溶解されたタンパク質から遠心分離により(1分、13,000rpm、室温、Eppendorf 卓上遠心機)、取り除く。P−デンプンまたは非リン酸化デンプンの残りをそれぞれすべて除去するために、遠心分離後に得られた上清を再び遠心し(1分、13,000rpm、室温、Eppendorf 卓上遠心機)、除去する。その結果、P−デンプンまたは非リン酸化デンプンにそれぞれ結合する溶解されたタンパク質が得られる。
SDSテスト緩衝液: 187.5mM トリス/HCl、pH6.8、
6% SDS、
30% グリセリン、
〜0.015% ブロモフェノールブルー、
60mM DTE(新たに添加)
パーコール: パーコールを、および25mMHEPES/KOH(pH7.0)から構成される溶液に対して一晩透析する。
タンパク質のそれぞれP−デンプンまたは非リン酸化デンプンへの結合に関する一般的方法項目8工程c)で得られた溶解されたタンパク質を、各々5分間95℃でインキュベーションし、続いて変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて分離する。その際、P−デンプンに結合することにより得られた溶解されたタンパク質および非リン酸化デンプンに結合することにより得られた溶解されたタンパク質の等しい体積を、各々アクリルアミドゲルに加える。電気泳動の完了時に得られたゲルを少なくとも一晩コロイド状クーマシーで染色し(Roth, Karlsruhe, Roti-Blue Rod. No.: A152.1)、続いて30%メタノール、5%酢酸、または25%メタノール中で脱色する。
アクリルアミドゲル電気泳動による分離およびそれに続く染色による可視化(上記一般的方法項目9を参照のこと)の後に、非リン酸化デンプンに結合した後の対応する信号と比較して、P−デンプンに結合した後に増加した信号を示すタンパク質は、非リン酸化デンプンと比較してP−デンプンに対して増大した結合活性を有する。この手段によって、非リン酸化デンプンと比較してP−デンプンに対して増大した結合活性を有するタンパク質を同定することができる。非リン酸化デンプンと比較してP−デンプンに対して増大した結合活性を有するタンパク質を、アクリルアミドゲルから切り出す。
工程a)に従って同定されたタンパク質をトリプシンにより消化し、得られたペプチドをMALDI−TOFによって分析して、得られたペプチドの質量を決定する。トリプシンは配列特異的なプロテアーゼである、即ちトリプシンは、タンパク質があるアミノ酸配列を含んでいる場合に、特異的位置でのみ当該タンパク質を分割する。N末端からスタートして、アミノ酸アルギニンおよびリジンが互いに続く場合トリプシンは常にペプチド結合を分割する。したがって、アミノ酸配列のトリプシン消化後に生成されることになるペプチドをすべて理論的に決定することが可能である。理論的に決定されたペプチドをコードするアミノ酸についての知識から、理論的なトリプシン消化後に得られるペプチドの質量を決定することができる。したがって、理論的なトリプシン消化後のペプチドの質量に関する情報を含むデータベース(例えば、NCBInr http:// prospector. ucsf.edu/ucsfhtml4.0/msfit.htm; Swissprot http://cbrg.inf.ethz.ch/Server/ MassSearch.html)を、MALDI−TOF−MSによって得られた未知のタンパク質のペプチドの実際の質量と比較することができる。理論的および/または現実のトリプシン消化の後に同じペプチド質量を有するアミノ酸配列は、同一であると見なされる。当該データベースは、既にその機能が示されているタンパク質のペプチド質量、および配列決定計画により得られた核酸配列から出発したアミノ酸配列から導出された、今までのところ単に仮説的に存在するタンパク質のペプチド質量の両方を含む。そのような仮説タンパク質の実際の存在および機能が示されたことは希であり、また何らかの機能が存在するとしても、これは通常予測のみに基づいていて、実際の機能の実証には基づいていない。
タンパク質がデンプンリン酸化活性を有するかどうかを実証するために、調べるべきタンパク質をデンプンおよび放射性ラベルされたATPとインキュベーションすることができる。これを行うために、約5mgのP−デンプンまたは約5mgの非リン酸化デンプンを、調べるタンパク質(用いるデンプン1mg当たり0.01μg〜5.0μg)と500μlリン酸化緩衝液中で10分〜30分間室温で攪拌下インキュベーションする。続いて反応を、SDSの2%(重量/体積)濃度までの添加によって止める。それぞれの反応混合物中のデンプン粒を遠心(1分間、13,000×g)し、900μlの2%SDS溶液で1回および各々900μlの2mMATP溶液で4回洗浄する。各洗浄工程を、15分間室温で撹拌下行なう。各洗浄工程の後、デンプン粒をそれぞれの洗浄緩衝液から遠心分離(1分間、13,000×g)により分離する。
工程a)に従って得られたデンプン粒を、放射性ラベルされたリン酸残基の存在について調べることができる。これを行うために、それぞれのデンプンを100μlの水に再懸濁し、それぞれ3mlのシンチレーションカクテル(例えば Ready Safe(商標), BECKMANN Coulter)と混合し、次にシンチレーションカウンター(例えば、LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN COULTER(商標))を用いて分析する。
もしタンパク質をP−デンプンと共に一度、および非リン酸化デンプンと共に一度、別々の調製物中でa)に記述した方法に従いインキュベーションするならば、工程b)によって得られたデンプンリン酸の存在量を比較することよって、当該タンパク質が非リン酸化デンプンと比較してP−デンプンにより多くのリン酸を取込んだかどうかを決定することができる。したがって、P−デンプンへリン酸を導入することができるが、非リン酸化デンプンへはできないタンパク質を同定することが出来る、即ちさらなるリン酸化反応用基質として既にリン酸化されているデンプンを要求するタンパク質を同定することができる。
リン酸化緩衝液: 50mM HEPES/KOH pH7.5、
1mM EDTA、
6mM MgCl2、
0.01〜0.5mM ATP、
1ml当たり0.2〜2 pCi の無作為化33P−ATP(あるいは、γ位置に特異的にラベルされたリン酸残基を含むATPを用いることもできる)。
ここで記述する、酵素触媒反応を用いる無作為化ATPの作製のための方法は、次の反応機構に基づく:
1. 反応工程1
γ33P−ATP + AMP + ミオキナーゼ → β33P−ADP + ADP
(アデノシン−P−P−33P + アデノシン−P →
アデノシン−P−P + アデノシン−P−33P)
2. 反応工程2
33P−ADP + ADP + 2 PEP + ピルビン酸キナーゼ →
β33P−ATP + ATP + 2 ピルビン酸
(アデノシン−P−P + アデノシン−P−33P + 2 PEP →
アデノシン−P−P−P + アデノシン−P−33P−P + 2 ピルビン酸)
反応平衡が生成物側に存在するにもかかわらず、この反応は、主としてβ33P−ATPおよびいくらかのγ33P−ATPからなる混合物を生成する。
33Pでラベルされたリン酸残基をγ位置に含むATP(Hartmann Analytic,10μCi/μl)(100μCi、3000Ci/mmol)を、2μlミオキナーゼ(ウサギ筋肉のAMPホスホトランスフェラーゼ;SIGMA, Prod. No.: M3003、3.8mg/ml、1,626単位/mg)と90μlの無作為化緩衝液中1時間37℃でインキュベーションする。12分間95℃でインキュベーションすることにより反応を停止し、その後、反応調製物をMicrocon YM10フィルタ(Amicon, Millipore Prod. No. 42407)を用い、14,000×gで少なくとも10分間遠心濾過することにより精製した。
2μlのピルビン酸キナーゼ(適切な溶液を作製する方法については下を参照)および3μlの50mMPEP(ホスホエノールピルビン酸)を工程ii)で得られた濾液に加える。この反応混合物を45分間30℃でインキュベーションしてから、95℃で12分間インキュベーションすることにより反応を止める。続いて反応混合物を遠心する(Eppendorf卓上遠心機で2分間、12,000rpm)。遠心分離後に得られた無作為化ATPを含む上清を取り出して、小分けにし、−20℃で貯蔵することができる。
15μlピルビン酸キナーゼ(ウサギ筋肉由来、Roche, Prod. No.12815, 10mg/ml, 200単位/mg,25℃で) を遠心し、上清を捨て、またペレットを27μlピルビン酸キナーゼ緩衝液に吸収した。
ピルビン酸キナーゼ緩衝液: 50mM HEPES/KOH、pH7.5、
1mM EDTA
無作為化緩衝液: 100mM HEPES/KOH pH7.5、
1mM EDTA、
10% グリセリン、
5mM MgCl2、
5mM KCl、
0.1mM ATP、
0.3mM AMP
タンパク質が自己リン酸化活性を有するかどうかを実証するために、調べたいタンパク質を放射性ラベルされたATPとインキュベーションすることができる。これを行うために、調べたいタンパク質(50μg〜100μg)を、220μlリン酸化緩衝液(上記の一般的方法、項目12d)を参照のこと)の中で30分〜90分間室温で撹拌下インキュベーションする。その後、反応を最終濃度0.11MまでのEDTAを加えることによって止める。その後、約2μg〜4μgのタンパク質を、変性ポリアクリルアミド電気泳動(7.5%アクリルアミドゲル)を用いて分離する。ポリアクリルアミドゲル電気泳動法後に得られたゲルをオートラジオグラフィーに付す。オートラジオグラフィーで信号を示すタンパク質は放射性リン酸残基を保持している。
α−1,4−グルカンのグルコース分子のどのC−原子位置がタンパク質によりリン酸化されるかを、制御された様式で、適切なタンパク質を用いて得られたリン酸化グルカンのインビトロの加水分解、それに続く加水分解後に得られたグルコースモノマーの分離、およびそれに続く、適切なタンパク質によりグルコース分子の一定の分画に組み入れられたリン酸の測定、により実証することができる
α−1,4−グルカンを含む水懸濁物を遠心し、続いて沈殿したペレットを0.7MのHCl(Baker、解析用)に再懸濁して、撹拌下2時間95℃でインキュベーションする。インキュベーションの完了後、試料を短時間冷却し、遠心する(例えば2分間、10,000×g)。得られた上清を新しい反応容器に移し、2M NaOH(Baker、解析用)を添加して中和する。ペレットが残っている場合は、それを100μlの水に再懸濁し、そこに存在するラベルされたリン酸の量を対照として測定する。
工程a)によって得られた加水分解生成物の中和された濾液を、例えば高圧陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAE)を用いて、分離することができる(約3000cpmの放射性ラベルATPを用いる場合)。HPAEに必要な体積を得るために中和された濾液をH2Oで薄めることができる。さらに、グルコース−6−リン酸(約0.15mM)およびグルコース−3−リン酸(約0.3mM)を、適切な濾液に各々内部対照として加える。HPAEによる分離を例えば、CarboPac PA 100カラム(適切なプレカラムを備えた)およびパルスアンペロメトリック検出器(ED 50)を用いるDionex DX 600 BioLcシステムを用いて、行なうことができる。そうする際に、試料を注入する前に、カラムをまず10分間99%溶出液Cおよび1%溶出液Dで濯ぐ。その後、60μlの試料体積を注入する。試料の溶出は下記条件下で起こる:
流量:1ml/分
勾配:0分〜30分まで直線的に増加する
溶出液C 溶出液D
0分 99% 1%
30分 0% 100%
35分 0% 100%
溶出終了。
溶出液C:100 mM NaOH
溶出液D:100 mM NaOH、
500 mM 酢酸ナトリウム
ポリアクリルアミドゲルから切り出されたバンドの形で存在することもできる単離したタンパク質を、最初により小さな断片へ、トリプシン消化により分割する。形成されたペプチドを、飛行時間(TOF)質量分析計が四重極質量分析計と結合されたハイブリッド質量分析計中へ導入する。測定の第1段階において、第1の質量分析計(四重極)の「スイッチを切り」、消化により形成されたペプチドの質量をTOF質量分析計中で決定することができる。第2段階では、選択されたペプチドが四極子中へ「濾過される」、即ちこのペプチドのみが四極子を通ることができ、他のものはすべて逸らされる。次に、ペプチドが「衝突セル」の荷電ガス分子と衝突することにより、破壊される。この場合、「破壊」は主としてペプチド結合で生じる。その結果、質量が異なる多かれ少なかれ統計的に分布したペプチド断片が形成される。その後、これらの断片を「ソートする」ことによりペプチドのアミノ酸配列を決定することができる。重複するペプチドが得られる場合は、このようにしてタンパク質のアミノ酸配列を得ることができる。同定と配列決定のための質量分析計の使用は、当業者に公知であり、専門家文献に十分に記述されている[例えば、P. Michael Conn(Ed.), 2003, Humana Press, New Jersey, ISBN: 1-58829-340-8]; J.R. Chapman(Ed.), 2000, Humana Press, SBN: 089603609X] 。
分析するタンパク質のアミノ酸配列を含むシステイン残基を、タンパク質の分離の前にゲル電気泳動によって還元/アルキル化することができる。この目的のために、ゲル電気泳動によって分離するべきタンパク質をSDS試料緩衝液(DTTまたはβメルカプトエタノールを少しも含んではならない)と混合する。その後、新たに調整したDTTをこれらの試料に10mMの最終濃度まで加え、そして試料を3分間95℃でインキュベーションする。試料を室温へ冷却した後に、新たに調整したヨ−ドアセトアミドを20mMの最終濃度まで加える。試料を20分間室温暗黒下でインキュベーションする。その後、試料中に存在するタンパク質をアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。
配列決定するべきタンパク質を含むタンパク質のバンドを清潔なメスを用いてできるだけ「縁なし」の状態で切り出し(約1mm3 の立方体)、還元する。還元されたゲル片を、0.5mlまたは1.5mlの反応容器に入れ、短い遠心によって沈殿させる。
銀イオンを用いて染色したゲルを用いた場合は、工程c)によって得られたゲル片を、30mMフェリシアン化カリウムおよび100mMチオ硫酸ナトリウムを1:1の比率で含む溶液で完全に覆い、そして完全にゲル片が脱色されるまで攪拌する(Vortexで)。その後、脱色溶液を除去し、ゲル片を3回、各回高純度水(伝導性約18MOhm)200μlで洗浄する。
トリプシン溶液(50mM炭酸水素アンモニウムμl当たり10ngのトリプシン)を10μlずつ工程d)によって得られた乾燥ゲル片に加える。トリプシン溶液の添加後、毎回10分間氷上でインキュベーションを実施する。ゲル片がそれ以上膨張せず、トリプシン溶液によって完全に被われるまで、トリプシン溶液を小分けして加える。その後トリプシン溶液を除去し、ゲル片を一晩37℃でインキュベーションする。
工程e)で得られた試料を、反応容器に含まれる液体を集めるために短時間遠心し、液体を取出して新しい反応容器へ移す。ゲル片を超音波で(超音波水浴で)2分間処理する。残ったゲル片を、次に、ゲル片の体積と同じ25mM炭酸水素アンモニウム溶液と混合し、また20分間撹拌下でインキュベーションする。その後アセトニトリルを加えて、アセトニトリルに対する重炭酸アンモニウムの比率を1:1に調節し、室温でさらに15分間撹拌下インキュベーションを実施する。インキュベーションが完了した後、2分間超音波で試料を再び処理し、その後液体を取り出して、以前に取り出した液体と合わせる。残ったゲル片を、それらと同体積の5%ギ酸およびアセトニトリルを比率1:1で含む溶液と混合し、撹拌下15分間室温でインキュベーションする。液体を取り出し、以前に取り出した液体と合わせる。ゲル片の5%ギ酸/アセトニトリル(比率1:1)中でのインキュベーションを繰り返し、得られた液体を同様に、以前に集めた液体に加える。合わせた上清が、配列決定するべきペプチドを含んでおり、60℃で真空遠心(Speedvac)により約15μlに濃縮する。このようにして得られたペプチドを、Q−TOFを用いて分析するまで、20℃で貯蔵することができる。質量分析によりタンパク質を配列決定する前に、それらを当業者に公知の方法を用いて脱塩することができる。
イネ植物を、Hiei et al.(1994, Plant Journal 6(2), 271-282)によって記述された方法に従って形質転換した。
ジャガイモ植物を、アグロバクテリウムを用いて、Rocha-Sosa et al.(EMBO J. 8,(1989), 23-29)によって記述されているように形質転換した。
C−6リン酸含量の決定
デンプンにおいては、グルコース単位のC2、C3およびC6位置がリン酸化されることができる。デンプンのC6−P含量を決定するために、50mgのデンプンを、500μlの0.7 MのHCl中、4時間95℃で加水分解した。その後、調製物を10分間15,500gで遠心し、上清を取り出した。上清からの7μlを193μlのイミダゾール緩衝液(100mMイミダゾール、pH7.4;5mMMgCl2、1mMEDTA、および0.4mMNAD)と混合した。光度計を用いて、340mmで測定を行った。基礎吸収を確立した後、2単位のグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(Leuconostoc mesenteroides, Boehringer Mannheim の)を加えることにより、酵素反応を開始した。吸収の変化は、デンプンのG−6−P含量の濃度に正比例する。
全リン酸含量を、エームズ法(Methods in Enzymology VIII,(1966), 115-118)を用いて決定した。約50mgのデンプンをエタノール硝酸マグネシウム溶液30μlと混合し、マッフル炉中3時間500℃で灰化する。残渣を0.5M 塩酸300μlと混合し、30分間60℃でインキュベーションする。次に、一部分を0.5M 塩酸300μlとして、100μlの10%アスコルビン酸および600μlの2M 硫酸中の0.42%モリブデン酸アンモニウム混合物に加えて、20分間45℃でインキュベーションする。
α−1,4−グルカンのグルコース分子のC−6位置およびC−3位置に結合したリン酸の含量を決定するために、当該グルカンを、一般的方法項目13に指定された方法を用いて全加水分解後に、HPAEを使用して分離することができる。グルコース−6−リン酸およびグルコース−3−リン酸の量を、HPEA分離の後、得られる個々のピーク面積の積分により決定することができる。調査する試料中のグルコース−6−リン酸およびグルコース−3−リン酸の量を、未知の試料で得られたグルコース−6−リン酸およびグルコース−3−リン酸に対するピーク面積を、既知量のグルコース−6−リン酸およびグルコース−3−リン酸をHPAEを用いて分離した後に得られたピーク面積と比較することにより、決定することができる。
タンパク質抽出物を、Arabidopsis thaliana(Oekotyp Columbia, Col-O)の約7gの葉(生体重量)から、一般的方法項目1に記述された方法に従って作製した。
デンプン粒を、Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の約20gの葉(生体重量)から、一般的方法項目2に記述された方法に従って単離した。
Arabidopsis thaliana sexl-3突然変異体から単離された約30mgの非リン酸化デンプンを、一般的方法項目7に記述された方法に従って、E. coli 中で組換え発現され精製されたR1タンパク質によってリン酸化した。Ritte et al.(2002, PNAS 99, 7166- 7171)に記述された方法を、E. coli 中のR1タンパク質の発現、およびそれに続く精製に用いた。
工程a)に従って得られた Arabidopsis thaliana のタンパク質抽出物を、50mgの工程c)に従って作製されたインビトロでリン酸化されたデンプンと、一般的方法項目8a)に記述された方法を用いて、調製物A中でインキュベーションし洗浄した。
工程d)中で得られた調製物A、B、およびCのタンパク質を、一般的方法項目9に記述された方法を用いて、変性条件(SDS)下の9%アクリルアミドゲルによって分離し、続いてクーマシーブルーで染色した。染色されたゲルを図1に示す。変性アクリルアミドゲル中で、タンパク質標準マーカー(トレースM)と照合して約130kDaの分子量を有するタンパク質が、非リン酸化デンプン(K)と比較して好んでリン酸化デンプン(トレースP)に結合することを、はっきり見ることができる。
工程e)で同定された約130kDa の分子量を有するタンパク質のバンドをゲルから切り出した。一般的方法10b)に記述したように、続いてタンパク質をアクリルアミドから放出させ、トリプシンで消化し、得られたペプチドの質量をMALD−TOF−MSによって決定した。MALDI−TOF−MSによって得られたいわゆる「フィンガープリント」を、データベース(Mascot: http://www.matrixscience. com/search form_select.html; ProFound: http://129.85.19.192/profound_bin/ WebProFound.exe; PepSea: http://195.41.108.38/PepSeaIntro.html)中の理論的に消化されたアミノ酸分子のフィンガープリントと比較した。このようなフィンガープリントはタンパク質に非常に特異的であるため、アミノ酸分子を同定することができた。このアミノ酸分子の配列を用いて、OK1タンパク質をコードする核酸配列を、Arabidopsis thaliana から特定することができた。この方法を用いて同定したタンパク質をA.t.−OK1と名付けた。Arabidopsis thaliana からのアミノ酸配列を分析した後に、これがデータベース中に存在する配列(NP 198009、NCBI)と相違することが判明した。配列番号2に示されるアミノ酸配列が、A.t.−OK1タンパク質をコードする。配列番号2には、データベース中の配列(Acc.:NP 198009.1,NCBI)と比較すると、差異が含まれる。配列番号2に含まれるアミノ酸519〜523(WRLCE)および762〜766(VRARQ)は、データベースに存在する配列(ACC.: NP 198009.1).NP 198009.1)中にはない。データベース配列のバージョン2(Acc.: NP 198009.2)と比較して、配列番号2中に示されるアミノ酸配列は追加のアミノ酸519〜523(WRLCE)を含む。
A.t.−OK1cDNAを、Arabidopsis thaliana の葉から単離したmRNAを用い、逆PCR法を使用して単離した。これを行うために、逆転写酵素(SuperScript(商標) First-Strand Synthesis System for RT PCR, Invitrogen Prod. No.: 11904-018)によってcDNA鎖を合成し、その後DNAポリメラーゼ(Expand High Fidelity PCR Systems, Roche Prod. No.: 1732641)を用いてこれを増幅した。このPCR反応から得られて増幅された生成物を、ベクターpGEM(登録商標)−T(Invitrogen Prod.No.: A3600)へクローニングした。得られたプラスミドをA.t.−OK1−pGEM(登録商標)−Tと名付け、A.t.−OK1タンパク質をコードするcDNA配列を決定し、配列番号1(登録商標)に示す。
メーカーによって指定された条件および緩衝液を用いた。さらに、第1鎖合成用の反応調製物は次の物質を含んでいた:
3μg 全RNA、
5μM 3'−プライマー(OK1逆方向1: 5'−GACTCAACCACATAACACACAAAGATC)
0.83μM dNTP混合物。
反応調製物を5分間75℃でインキュベーションし、続いて室温に冷却した。その後第1鎖緩衝液、RNase阻害剤およびDTTを加えて2分間42℃でインキュベーションし、その後1μlの SuperScript RT DNAポリメラーゼを加え、反応調製物を50分間42℃でインキュベーションした。
1μl 第1鎖合成の反応調製物
0.25μM 3’プライマー(OK1逆方向2: 5'−TGGTAACGAGGCAAATGCAGA)
0.25μM 5’プライマー(OK1順方向2: 5'−ATCTCTTATCACACCACCTCCAATG)
工程1 95℃ 2分間
工程2 94℃ 20秒間
工程3 62℃ 30秒間
工程4 68℃ 4分間
工程5 94℃ 20秒間
工程6 56℃ 30秒間
工程7 68℃ 4分間
工程8 68℃ 10分間
まず反応を工程1〜4に従って行なった。工程4と工程2の間で10回の繰返し(サイクル)を実施し、工程3の温度を各サイクルの後に0.67℃だけ低下させた。次に、これに続けて工程5〜8で指定された条件に従う反応を行った。工程7と工程5の間で25回の繰返し(サイクル)を実施し、工程7の時間を各サイクルで5秒ずつ増加させた。反応完了後すぐに、反応物を4℃に冷却した。
鋳型としてプラスミドA.t.−OK1−pGEM(登録商標)を用い、ゲートウェイ技術(Invitrogen)を用いるPCRによる増幅に続いて、Arabidopsis thaliana のOK1タンパク質をコードする配列を先ずベクターpDONOR(商標)201(Invitrogen Prod. No.: 11798-014)へクローニングした。続いて、得られたベクターのOK1タンパク質のコード領域を、配列特異的組換えによって発現ベクターpDEST(商標)17(Invitrogen Prod. No.: 11803-014)中へクローニングした。得られた発現ベクターをA.t.−OK1−pDEST(商標)1と名付ける。クローニングは、その結果として、A.t.−OK1タンパク質をコードするcDNAの、発現ベクターpDEST(商標)17中に存在するヌクレオチドとの翻訳的融合を引き起こした。ベクターpDEST17(商標)17起源のヌクレオチドはA.t.−OK1タンパク質をコードするcDNAと翻訳的に融合され、21個のアミノ酸をコードする。これらの21個のアミノ酸は、とりわけ、開始コドン(ATG)およびいわゆるHisタグ(直接連続する6個のヒスチジン残基)を含む。翻訳的に融合した配列の翻訳の後、これは、N末端にベクター起源のヌクレオチドによりコードされる追加の21個のアミノ酸を有するA,t.−OK1タンパク質をもたらす。したがって、このベクターに起因する組換えA.t.−OK1タンパク質は、そのN末端にベクターpDEST(商標)17起源の21個の追加のアミノ酸を含む。
実施例3に従って得た発現ベクターA.t.−OK1−pDEST(商標)17を、E.coli 菌株BL21 Star(商標)(DE3)(Invitrogen, Prod. No. C6010-03)中に形質転換した。この発現系の記述は既に上に与えた(一般的方法項目3を参照)。形質転換の結果得られたベクターA.t.−OK1−pDEST(商標)17を含むバクテリアのクローンを、まず予備培養の作製に使用し、それを、続いて本培養(一般的方法項目3c)を参照のこと)へ接種するために用いた。予備培養および本培養を各々30℃で撹拌下(250rpm)インキュベーションした。本培養が約0.8のOD600に達した時、組換えA.t.−OK1タンパク質の発現を、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)を最終濃度1mMに達するまで加えることにより誘導した。IPTGの添加後、本培養を30℃撹拌下(250rpm)でOD600 が約1.8に達するまでインキュベーションした。本培養をその後30分間氷上で冷却し、次に本培養の細胞を遠心分離(10分間4,000×g、4℃)により培地から分離した。
実施例4に従って得られた細胞のA.t.−OK1タンパク質の精製および濃縮を、一般的方法項目4に記述された方法を用いて実施した。
A.t.−OK1タンパク質のデンプンリン酸化活性を、一般的方法項目11に記述された方法に従って実証した。その際に、実施例5に従って作製された精製A.t.−OK1タンパク質5μgを各々調製物Aでは実施例1b)に従って Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体から単離された5mgのデンプンと、および調製物Bでは実施例1c)に従って酵素的リン酸化によって得られた5 mgのデンプンと、それぞれ0.05mM放射性(33P)ラベル無作為化ATP(全体で1,130,00cpm、約0.55μCi)を含むリン酸化緩衝液500μl中で、30分間室温で撹拌下インキュベーションした。調製物Bに対応し、OK1タンパク質を含んでいないがそれ以外は標品AおよびBと同じ方法で処理された調製物Cを、対照として用いた。すべての調製物(A、B、C)について、各々互いに独立に2つのテストを行なった。
A.t.−OK1タンパク質の自己リン酸化が上記の方法により実証された(一般的方法項目12を参照のこと)。ここで、50μgの精製されたA.t.−OK1タンパク質を放射性ラベルされた無作為化ATPと、220μlのリン酸化緩衝液(上記一般的方法項目12d)を参照のこと)中で、室温60分撹拌下でインキュベーションした。続いて、インキュベーション調製物から各々100μlを取り出し、4つの新鮮な反応容器に移した。反応容器1では、40μlの0.11M EDTAの添加により反応を停止した。反応容器2を95℃で5分間インキュベートした。反応容器3にHClを最終濃度0.5M まで加え、反応容器4にNaOHを最終濃度0.5M まで加えた。反応容器3および4を各々25分間30℃でインキュベーションした。続いて、反応容器1、2、3および4から各々50μlを取り出し、SDSテスト緩衝液と混合して、SDSアクリルアミドゲル電気泳動(7.5%アクリルアミドゲル)によって分離した。この目的のために、反応容器からの試料を各々2つの同一のアクリルアミドゲルのそれぞれに添加した。電気泳動を完了して得られたゲルのうちの1つをオートラジオグラフィーに付し、もう1つのゲルをクーマシーブルーで染色した。
リン酸化デンプンを一般的方法項目7に従って作製した。これを行うために、Arabidopsis thaliana sex1-3 突然変異体の葉から単離された5mgの非リン酸化デンプンを、調製物A中で25μgの精製されたA.t.−OK1タンパク質と共に用い、また別の調製物B中で、元はArabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の葉から分離され、インビトロでリン酸化されたデンプン5mgを5μgの精製されたR1タンパク質と共に用いた。各反応を、33PラベルATP(約2.5×106cpm)を各々含む500μlのリン酸化緩衝液中で、室温で1時間撹拌下インキュベーションすることにより、行なった。さらに、Arabidopsis thaliana sex1-3の突然変異体の葉から単離された5mgのデンプンおよび前記リン酸化緩衝液を含み、しかしタンパク質を含まない対照調製物を用いた。対照調製物を正確に調製物AおよびBと同じ方法で処理した。個々の反応を、各々125μlの10%SDSを加えることにより止め、2%SDSで1回、2mMATPで5回、およびH2Oで2回、各回に900μlを用いて、洗浄を実施した。各洗浄工程の後に遠心分離(各回2分間Eppendorf 卓上遠心機で13,000rpm)を実施した。各調製物について、得られたデンプンペレットを1ml のH2Oに再懸濁し、100μlの各調製物を3mlのシンチレーションカクテル(Ready Safer(商標), BECKMANN)を加えた後に混合し、続いて、シンチレーションカウンター(LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN COULTER(商標))を用いて測定した。
対照: 63cpm/100μl 630cpm/1000μl
調製物A(OK1): 1351cpm/100μl 13512cpm/1000μl
調製物B(R1): 3853cpm/100μl 38526cpm/1000μl
工程a)に従って得られた調製物A、B、およびCの懸濁液を再び遠心(5分間Eppendorf 卓上遠心機で13,000rpm)して、得られたペレットを90μlの0.7M HCl(Baker、解析用)に再懸濁し、続いて2時間95℃でインキュベーションした。調製物A、B、およびCを再び遠心(5分間Eppendorf 卓上遠心機で13,000rpm)して、上清を新しい反応容器に移した。調製物の沈殿残渣を各々100mlのH2O中に再懸濁し、3mlのシンチレーションカクテル(Ready Safe(商標), BECKMANN)を加えた後にシンチレーションカウンター(LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN COULTER(商標))を用いて測定した。残渣の何れにも有意な量の放射活性は証明できなかったが、これは放射性リン酸でラベルされた加水分解生成物はすべて上清に存在することを意味する。
調製物A(OK1): 934cpm/10μl 11,208cpm/120μl、
93cpm/μl
調製物B(R1): 2518cpm/10μl 30,216cpm/120μl、
252cpm/μl
工程b)に従って得られた加水分解生成物を、上述の条件下で(一般的方法項目13c)を参照のこと)Dionexシステムを用いてHPAEにより、分離した。工程b)に従って得られた調製物AおよびBのろ過された上清を分離するための試料は以下の構成であった:
調製物A(OK1): 工程b)に従って得られた43μlの調製物Aの上清(約4,000cpmに等価)、32μlのH20、2.5μlの2.5mMグルコース−6−リン酸および2.5μlの5mMグルコース−3−リン酸(合計体積=80μl)。
調製物B(R1): 工程b)に従って得られた調製物Bの上清16μl(約4,000cpm に等価)、59μlのH20、2.5μlの2.5mMグルコース−6−リン酸および2.5μlの5mMグルコース−3−リン酸(合計体積=80μl)。
表4:OK1タンパク質またはR1タンパク質によってリン酸化されたデンプンの加水分解によって得られた加水分解生成物の、個々の分画中の測定された放射活性量[cpm]。
結果を図5にグラフでも示す。
一般的方法項目1〜13に記述された方法を用いて、Oryza sativa(品種M202)から、ATPからP−デンプンへリン酸残基を転移するタンパク質を同定することができた。そのタンパク質をO.s.−OK1と名付けた。非リン酸化デンプンは、基質としてO.s.−OK1タンパク質に使用されない、即ちO.s.−OK1タンパク質もまたP−デンプンを基質として必要とする。同定されたO.s.−OK1タンパク質を規定する核酸配列を配列番号3に示し、O.s.−OK1タンパク質をコードするアミノ酸配列を配列番号4に示す。配列番号4に示すO.s.−OK1タンパク質をコードするアミノ酸配列は、配列番号2に示すA.t.−OK1タンパク質をコードするアミノ酸配列と57%の同一性を有する。配列番号3に示すO.s.−OK1タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号1に示すA.t.−OK1タンパク質をコードする核酸配列と61%の同一性を有する。
ベクターpMI50はイネの品種M202の完全なOK1タンパク質をコードするDNA断片を含む。イネからのDNAの増幅を、5つの副工程により実施した。配列番号3に指定された配列の位置 −11から位置288までの読取枠の部分を、合成オリゴヌクレオチド
を、未熟な種もみのRNA上のプライマーとして用いる逆転写酵素およびポリメラーゼ連鎖反応を使用して、増幅した。増幅されたDNA断片をベクターpCR2.1(Invitrogen catalogue number K2020-20)へクローニングした。得られたプラスミドをpML123と名付けた。
を、未熟な種もみのRNA上のプライマーとして用いる、逆転写酵素およびポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅した。増幅されたDNA断片をベクターpCR2.1(Invitrogen catalogue number K2020-20)へクローニングした。得られたプラスミドをpML120と名付けた。
を、未熟な種もみのRNA上のプライマーとして用いる、逆転写酵素およびポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅した。増幅されたDNA断片をベクターpCR2.1(Invitrogen catalogue number K2020-20)へクローニングした。得られたプラスミドをpML121と名付けた。
を、未熟な種もみのRNA上のプライマーとして用いる、逆転写酵素およびポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅した。増幅されたDNA断片をベクターpCR2.1(Invitrogen catalogue number K2020-20)へクローニングした。得られたプラスミドをpML119と名付けた。
をイネのゲノムDNA上のプライマーとして用いる、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅した。増幅されたDNA断片をベクターpCR2.1(Invitrogen catalogue number K2020-20)へクローニングした。得られたプラスミドをpML122と名付けた。
によって再増幅し、ベクターpCR2.1(Invitrogen catalogue number K2020-20)へクローニングした。得られたプラスミドをpMI45と名付けた。
一般的方法項目1〜13に記述された方法を用いて、ATPからP−デンプンへリン酸残基を転移するタンパク質を、オオムギ(Hordeum vulgare)、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、コムギ(Triticum aestivum)およびキビ(Sorghum bicolor)で同定した。これらのタンパク質は基質として非リン酸化デンプンを用いない、即ちこれらのタンパク質は基質としてP−デンプンを要求する。
Program: tblastn
Matrix: blosum62
Expect: 100
Echofilter: disabled
Descriptions: 20
他のすべての設定は「default」を読んだ。
抗原として、約100μgの精製されたA.t.−OK1タンパク質をSDSゲル電気泳動によって分離し、A.t.−OK1タンパク質を含むタンパク質バンドを切り取って、EUROGENTEC S.A.社(ベルギー)へ送り、同社が請負により抗体の作製を行なった。第1に、ウサギの未免疫血清を検査して、組換えOK1で免疫化する前に既にA.t.全抽出物から得たタンパク質を認識するかどうかを確かめた。2匹のウサギの未免疫血清が、100〜150 kDa の範囲のタンパク質を認識しなかったので、免疫化のために選択した。各ウサギにタンパク質の100μgを4回(0、14、28、56日目)注射した。各ウサギから4つの血液サンプルを採取した:(38日、66日、87日目、および最後の採血)。第1の採血後に得られた血漿は、既に特異的な反応をOK1抗原に対してウエスタンブロットで示した。しかしながら、それ以上のすべてのテストでは、ウサギの最終採血を用いた。
イネの品種M202のゲノムDNAに対してプライマー
ならびに高忠実度Taqポリメラーゼ(Invitrogen, catalogue number 11304-011)によるポリメラーゼ連鎖反応(30 × 20秒94℃、20秒62℃、1分68℃、4mMMg2SO4)を用いて、イネ由来のグロブリン遺伝子プロモーターを増幅し、それをpCR2.1(Invitrogen catalogue number K2020-20)中へクローニングすることにより、プラスミドpIR94を得た。2つのオリゴヌクレオチド
から成る合成DNA片を、SdaIおよびMunIで切ったベクターpGSV71へクローニングすることにより、プラスミドpIR115を得た。
イネ植物の形質転換に用いたプラスミドpML125を、Gateway(商標)クローニングシステム(Invitrogen)を用いたプラスミドpML124およびpIR115の特異的組換えにより得た。
をトウモロコシのゲノムDNAに用いて、トウモロコシのアルコールヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のイントロン1を増幅することにより得た。ポリメラーゼ連鎖反応(30 × 30秒94℃、30秒59℃、1分72℃、2.5mMMgCl2)の生成物を、制限酵素XhoIで消化して、同じ酵素で切開しておいたベクターpBluescript II SK+(Genbank Acc.: X52328)へクローニングした。
イネ植物(品種M202)を、Agrobacterium(プラスミドpGlo−A.t.−OK1またはプラスミドpML125のいずれかを含む)を用い、Hiei et al.(1994, Plant Journal 6(2), 271-282)に記述された方法を使用して、形質転換した。
プラスミドpGlo−A.t.−OK1で形質転換されて非相同のA.t.−OK1タンパク質発現を示した植物を、ノーザンブロット解析によって同定した。
プラスミドpML125で形質転換され、OK1タンパクをコードする内因性mRNAの発現が低下したイネ植物をノーザンブロット解析によって同定した。
プラスミドpBinB33からスタートして、B33プロモーターを含むEcoRI−HindIII断片、ポリリンカーの一部、およびocs終止コドンを切り取り、対応して切開したたベクターpBIB−Hyg(Becker, 1990, Nucl. Acids Res. 18, 203)へライゲーションした。
A.t.−OK1タンパク質のコード配列を制限酵素Bsp120IおよびSalIでプラスミドOK1−pGEMから切り取り、SmaIおよびSalIで切開したベクターpBinB33−Hygにライゲーションした。得られたプラスミドをA.t.−OK1−pBinB33−Hygと名付けた。
Agrobacterium tumefaciens(菌株 GV2260)をプラスミドA.t.−OK1−pBinB33−Hygにより形質転換した。デジレ品種のジャガイモ植物を、次にプラスミドA.t.−OK1−pBinB33−Hygを含む Agrobacterium を用い、Rocha-Sosa et al.(EMBO J. 8,(1989), 23-29) に記述された方法を使用して形質転換し、植物を再生させた。この形質転換事象から得られた植物を385JHと名付けた。
非相同発現されたA.t.−OK1タンパク質の高い活性を示した植物、および共抑制効果により内因性OK1タンパク質の活性が低下した植物を、ウエスタンブロット解析により同定した。ウエスタンブロット解析を、実施例11に記述された抗体を用いて行なった。
Arabidopsis thalianaのT−DNA挿入突然変異体(Salk Institute Genomic Analysis Laboratory, 10010 N. Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, http://signal.salk.edu/ under ACC. No.: Salk_110814, Alias N610814 から入手可能)(OK1遺伝子中の挿入に関して同型接合体の)を、下記条件下で生育させた:
明期:16時間、20℃
暗期: 8時間、16℃
花の発生の少し前に、12時間20℃の明期および12時間17℃の暗期で植物を栽培した。
表4 RNAi技術を用いてOK1タンパク質の量を低下させた Arabidopsis thaliana 植物の葉のデンプン量。
* 次の一般式を用いる標準偏差:
平方根[(nΣx2 −(Σx)2)/n(n−1)]
実施例14に記述した植物の葉からデンプンを単離し、一般的方法項目13に記述した方法を用いて加水分解し、次にHPAE分析によって分離した。HPAE解析によって得た分離された信号のC−3リン酸およびC−6リン酸に対する面積を計算し(ソフトウェア: Chromelion 6.20 from Dionex, USA)、得られた値を、互いの間の比率として示した。野生型植物中のC−6リン酸のC−3リン酸に対する比率は2.1であった。一方実施例14に記述された、OK1タンパク質活性がRNAi技術によって低下した植物中においては、系統A.t.−α−OK1−1、A.t.−α−OK1−2、A.t.−α−OK1−3、A.t.−α−OK1−4、およびA.t.−α−OK1−5から分離されたデンプンの分析により決定された、C−6リン酸のC−3リン酸に対する平均比率は2.5であった。系統A.t.−α−OK1−5からのデンプンの解析がC−6リン酸のC−3リン酸に対する最低の比率(比率2.2)を、系統A.t.−α−OK1−1からのデンプンが最高の比率(比率2.7)を、与えた。実施例13に記述された低下したOK1タンパク質活性を示す突然変異体の葉から単離されたデンプンは、当該デンプン中でC−6リン酸のC−3リン酸に対する比率の増加を示した。
Claims (18)
- 非リン酸化α−1,4グルカンと比較して、リン酸化α−1,4−グルカンに対して高い結合活性を有するタンパク質を同定するための方法であって、
a)互いに分離された調製物中のタンパク質抽出物を
i リン酸化α−1,4−グルカン、および
ii 非リン酸化α−1,4−グルカン、
とインキュベーションし、
b)i 工程a)iのリン酸化α−1,4−グルカンに特異的に結合したタンパク質、
および
ii 工程a)iiの非リン酸化α−1,4−グルカンに特異的に結合したタンパク質、
を、互いに分離された調製物中に溶解し、そして
c)工程b)iiで用いられる非リン酸化α−1,4−グルカンと比較して、工程b)iで用いられるリン酸化α−1,4−グルカンに対して高い結合活性を示すタンパク質を同定する、
方法。 - α−1,4−グルカンリン酸化酵素活性を示し、かつ基質としてリン酸化α−1,4−グルカンを要求するタンパク質を同定するための方法であって、
a)タンパク質抽出物をリン酸化α−1,4−グルカンとインキュベーションし、
b)工程a)から得られたリン酸化α−1,4−グルカンに特異的に結合したタンパク質を溶解し、
c)工程b)によって得られたタンパク質をそれぞれ、
i ATPおよびリン酸化α−1,4−グルカン、ならびに
ii ATPおよび非リン酸化α−1,4−グルカン
と共に、互いに分離した調製物中でインキュベーションし、
d)工程c)iまたは工程c)ii におけるインキュベーションの後に得られたそれぞれのα−1,4−グルカンを、さらなるリン酸基の導入について検査し、そして
e)c)iによるインキュベーション調製物において有意な量のリン酸基をα−1,4−
グルカンへ導入し、かつc)iiによるインキュベーション調製物において有意な量のリン酸基をα−1,4−グルカンへ導入しなかったタンパク質を同定する、
方法。 - α−1,4−グルカンリン酸化酵素活性を有するタンパク質が、基質としてリン酸化デンプンを用いる、請求項2記載の方法。
- α−1,4−グルカンリン酸化酵素活性を有するタンパク質が植物起源である、請求項3記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項記載の方法によって得ることができるタンパク質。
- α−1,4−グルカンリン酸化酵素活性を示すタンパク質をコードする核酸分子を同定するための方法であって、
a)請求項1〜4のいずれか1項記載の方法によりタンパク質を同定し、
b)工程a)によって同定されたタンパク質をコードするアミノ酸配列を決定し、
および
c)工程b)によって決定されたアミノ酸を用いて核酸分子を同定する、
方法。 - 工程b)によって決定されたアミノ酸配列に基づいた核酸オリゴヌクレオチドを作製し、工程c)によって前記核酸分子を同定する、請求項6記載の方法。
- α−1,4−グルカンリン酸化酵素活性を示すタンパク質をコードする核酸分子を同定するための方法であって、
a)請求項1〜4のいずれか1項記載の方法によりタンパク質を同定し、
b)工程a)によって同定されたタンパク質と特異的に反応する抗体を生成し、
そして
c)工程b)によって生成された抗体を用いて、核酸分子を同定する、
方法。 - 請求項6、7、または8のいずれか1項記載の方法によって得ることができる核酸分子。
- 遺伝的に修飾されていない対応する野生型植物細胞と比較して、請求項5記載のタンパク質、即ち請求項1〜4のいずれか1項記載の方法によって得ることができるタンパク質の、高い酵素活性を示すことを特徴とする遺伝的に修飾された植物細胞。
- トウモロコシ、イネ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、キャッサバ、ジャガイモ、サツマイモ、サゴ、リョクトウ、バナナ、エンドウ、アラビドプシス、ウコン、またはモロコシの植物である、請求項10記載の遺伝的に修飾された植物細胞。
- 遺伝的修飾が、請求項9記載の外来性核酸分子、即ち請求項6、7または8のいずれか1項記載の方法により得ることができる外来性核酸分子、の少なくとも1つの植物ゲノム中への導入であることを特徴とする、遺伝的に修飾された植物。
- 対応する野生型植物細胞由来のデンプンに比較して修飾されたデンプンを合成する、請求項12記載の遺伝的に修飾された植物細胞。
- 対応する野生型植物由来のデンプンに比較して、高い含量のデンプンリン酸および/または修飾されたリン酸分布を有する修飾デンプンを合成する、請求項13記載の遺伝的に修飾された植物細胞。
- 修飾デンプンが、対応する野生型植物細胞由来のデンプンと比較して、デンプンのグルコース分子のC−3位置に共有結合で結合したリン酸の高い含量を示すことを特徴とする、請求項14記載の植物細胞。
- 請求項10〜15のいずれか1項記載の遺伝的に修飾された植物細胞を含む植物。
- トウモロコシ、イネ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、キャッサバ、ジャガイモ、サゴ、リョクトウ、エンドウ、またはモロコシの植物である、請求項16記載の植物。
- トウモロコシまたはコムギの植物である、請求項17記載の植物。
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