PT1737974E - MéTODOS DE IDENTIFICAÆO DE PROTENAS COM ACTIVIDADE ENZIMáTICA DE FOSFORILAÆO DE AMIDO - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS COM ACTIVIDADE ENZIMÁTICA DE FOSFORILAÇÃO DE AMIDO"

Descrição A presente invenção está relacionada com um método para identificar proteínas envolvidas na fosforilação de amido e ácidos nucleícos que codificam tais proteínas. A presente invenção também está relacionada com plantas e células vegetais que apresentam uma actividade elevada duma proteína identificável utilizando o método de acordo com a invenção. Plantas e células vegetais deste tipo sintetizam um amido modificado. A presente invenção também está, por isso, relacionada com o amido sintetizado pelas plantas e células vegetais de acordo com a invenção bem como com os métodos para a produção deste amido e com a produção de amido derivado deste amido modificado.

Em relação à importância cada vez maior actualmente atribuída a constituintes vegetais como fontes de matérias-primas renováveis, uma das tarefas da pesquisa biotecnológica é a tentativa de adaptar estas matérias-primas vegetais de modo a satisfazer os requisitos da indústria transformadora. Além disso, para permitir regenerar as matérias-primas a serem usadas no maior número de áreas de aplicação possível, é necessário obter uma grande variedade de materiais.

Amido polissacarídeo é formado por componentes de base uniformes quimicamente, moléculas de glicose, mas constitui uma mistura complexa de formas de molécula -2- diferentes, que apresentam diferenças em relação ao grau de polimerização e ramificação e, por isso, diferem fortemente umas das outras nas suas caracteristicas físico-químicas. É feita discriminação entre amilose de amido, um polímero essencialmente não ramificado feito de unidades de glicose ligadas glicosidicamente alfa-1,4, e amilopectina de amido, um polímero ramificado, em que as ramificações surgem pela ocorrência de ligações glicosídicas alfa-1,6. Mais uma diferença essencial entre a amilose e a amilopectina é o peso molecular. Enquanto a amilose, dependendo da origem do amido, tem um peso molecular de 5xl05 - 106 Da, o peso da amilopectina fica entre 107 e 108 Da. As duas macromoléculas podem ser diferenciadas pelo seu peso molecular e pelas suas caracteristicas físico-químicas diferentes, as quais podem ser mais facilmente tornadas visíveis pelas suas diferentes caracteristicas de ligação ao iodo. A amilose é desde há muito tempo vista como um polímero linear, consistindo em monómeros alfa-D-glicose ligados por ligações glicosídicas alfa-1,4. No entanto, em estudos recentes, a presença de pontos de ramificação glicosídicos de alfa-1,6 (cerca de 0,1 %) tem sido mostrada (Hizukuri e Takagi, Carbohydr. Res. 134, (1984), 1-10; Takeda et al., Carbohydr. Res. 132, (1984), 83-92).

As propriedades funcionais tais como, por exemplo, a solubilidade, comportamento de retrogradação, capacidade de ligação à água, propriedades de formação de película, viscosidade, propriedades de gelatinização, estabilidade de congelamento-descongelamento, estabilidade ácida, força do gel e a dimensão dos grânulos de amido de amidos são influenciados entre outras coisas pela razão -3- amilose/amilopectina, peso molecular, padrão de distribuição de cadeia lateral, teor de ião, teor de proteína e lípido, média da dimensão do grânulo de amido, morfologia do grânulo de amido, etc. As propriedades funcionais de amido são também influenciadas pelo teor de fosfato, um componente não-carbono de amido. Aqui, a diferenciação é feita entre fosfato, o qual é covalentemente ligado na forma de monoésteres para as moléculas de glicose do amido (descrito a seguir como fosfato de amido), e fosfato na forma de fosfolípidos associados ao amido. Além do teor de fosfato, a influência nas propriedades funcionais do amido está neste caso também dependente da forma (fosfato de amido ou fosfolípido) na qual o fosfato surge no amido (Jane et al., 1996, Cereal Foods World 41 (11), 827-832). 0 teor de fosfato de amido varia de acordo com a espécie vegetal. Por isso, alguns mutantes de milho, por exemplo, sintetizam um amido com teor de fosfato aumentado (milho ceroso 0,002% e milho com um teor elevado de amilose 0,013%), enquanto os tipos convencionais de milho apenas têm vestígios de fosfato de amido. Da mesma forma, pequenas quantidades de fosfato de amido são encontradas em trigo (0,001 %) , mas pelo contrário não se detectou fosfato de amido em aveia e em sorgo. Da mesma forma, em mutantes de arroz foi encontrado menos fosfato de amido (arroz ceroso 0,003%) do que em espécies de arroz convencionais (0,013%). Quantidades significativas de fostato de amido foram detectadas em plantas sintetizadoras de amido com armazenamento na raiz ou tubérculo tais como, por exemplo, tapioca (0, 008%), batata-doce (0,011 %) , araruta (0,021%) ou batata (0,89%). Os valores de percentagem para o teor de -4- fosfato de amido referido acima para o peso seco de amido em cada caso, e foi determinado por Jane et al. (1996, Cereal Foods World 41 (11), 827-832). 0 fosfato de amido pode ser apresentado sob a forma de monoésteres na posição C-2, C-3 ou C-6 de monómeros de glicose polimerizados (Takeda and Hizukuri, 1971, Starch/Stârke 23, 267-272). A distribuição de fosfato do fosfato de amido em amido sintetizado por plantas é geralmente distinguida pelo facto de que cerca de 30% a 40% dos resíduos de fosfato serem ligados covalentemente na posição C-3 e cerca de 60% a 70% do resíduo de fosfato ser ligado covalentemente na posição C-6 da molécula de glicose (Blennow et al., 2000, Int. J. of Biological Macromolecules 27, 211-218). Blennow et al. (2000, Carbohydrate Polymers 41, 163-174) têm determinado um teor de fosfato de amido que está ligado na posição C-6 da molécula de glicose para vários amidos, tais como por exemplo, amido de batata (entre 7,8 e 33,5 nMol por mg de amido, dependendo do tipo), amido de várias espécies de Curcuma (entre 1,8 e 63 nMol por mg), amido de tapioca (2,5 nMol por mg de amido), amido de arroz (1,0 nMol por mg de amido), amido de feijão-mungo (3,5 nMol por mg de amido) e amido de sorgo (0,9 nMol por mg de amido). Estes autores não foram capazes de mostrar qualquer fosfato de amido ligado na posição C-6 em amido de cevada e amidos de diferentes mutantes de milho cerosos. Até ao momento, não foi possível estabelecer uma ligação entre o genótipo de uma planta e o teor de fosfato de amido (Jane et al., 1996, Cereal Foods World 41 (11), 827-832). Assim, actualmente não é possível influenciar o teor de fosfato de amido em plantas através de reprodução.

Em plantas transgénicas a quantidade de fosfato de -5- amido em amidos de armazenamento pode ser variada. Deste modo, amido de armazenamento de batateiras que apresenta uma actividade reduzida de sintase de amido solúvel III (Abel et al., 1996, The Plant Journal 10 (6), 9891-991), enzima de ramificação I (BEI) (Safford et al., 1998,

Carbohydrate Polymers 35, 155-168), enzima de ramificação II (BEII) (Jobling et al., 1999, The Plant Journal 18, 163- 171), BEI e BE11 (Schwall et al., 2000, Nature

Biotechnology 18, 551- 554), uma enzima de desproporcionamento (WO 96 27673) ou uma enzima de desproporcionamento e uma BEI (WO 95 07355), mostram um teor elevado de fosfato de amido comparado com amido de correspondentes plantas de tipo selvagem. No entanto, a alteração no teor de fosfato de amido nestas plantas não se deve às proteínas cuja actividade é reduzida nestas plantas, estando directamente envolvidas na introdução de resíduos de fosfato no amido. O aumento no teor de fosfato de amido nas plantas transgénicas relacionadas não é assim um efeito primário mas um efeito secundário que é causado pela redução das proteínas correspondentes. A razão para o aumento no teor de fosfato de amido como um resultado de modificação de actividades da dita proteína ainda continua por explicar. Deste modo, não é possível modificar especificamente o teor de fosfato de amido modificando as actividades da proteína que apenas influencia o teor de fosfato de amido por um efeito secundário. Além disso, modificar as actividades de proteínas que têm um efeito secundário tem uma influência no teor de fosfato de amido em plantas, ao mesmo tempo também causa mais modificações no amido, tais como, por exemplo: alterações na razão amilose/amilopectina e/ou na extensão das cadeias laterais -6- de amilopectina que constituem o efeito primário das alterações em tais actividades de proteina.

Anteriormente, apenas uma proteina tinha sido descrita, o que medeia a introdução de ligações covalentes de resíduos de fosfato para moléculas de glicose de amido. Esta proteína frequentemente designada como RI na literatura científica, está ligada a grãos de amido do armazenamento de amido em tubérculos de batata (Lorberth et al., 1998, Nature Biotechnology 16, 473-477) e tem a actividade enzimática de uma água-diquinase alfa-glucana (E.C. 02.07.09.4). Na reacção catalisada por RI os eductos alfa-1,4-glucano (amido), adenosina-trifosfato (ATP) e água são convertidos para os produtos fosfato-glucanos (amido fosforilado), monofosfato e adenosina-monofosfato. Neste caso o resíduo de gama-fosfato de ATP é transferido para a água e o resíduo de beta-fosfato de ATP é transferido para o glucano (amido). RI transfere in vitro o resíduo beta fosfato de ATP para a posição C-6 e C-3 das moléculas de glicose de alfa-1,4-glucanos. A razão de fosfato C-6 para fosfato C-3 que é obtida na reacção in vitro corresponde à razão que está presente em amido isolado de plantas (Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171). Como cerca de 70% do fosfato de amido presente no amido de batata está ligado a monómeros de glicose do amido na posição C-6 e cerca de 30% na posição C-3, isto significa que RI de preferência fosforiliza a posição C-6 das moléculas de glicose. Além disso, tem-se mostrado através da utilização de amilopectina de milho que, entre outras coisas, RI pode fosforilar alfa-1,4-glucanos que ainda não contém fosfato ligado covalentemente (Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166- 7171), isto é, Rl é capaz de introduzir fosfato de novo em alfa-1,4-glucanos. A sequência de aminoácido de RI contém um domínio que apresenta um elevado grau de homologia para o conhecido piruvato fosfato diquinase (domínios PPDK) e conhecido piruvato água diquinase (e domínios PPS) e contém um resíduo de histidina conservado nos domínios PPDK e PPS. Durante a transferência de resíduos de fosfato de ATP para alfa-1,4-glucanos (amido) uma proteína RI fosforilada é formada como produto intermediário, com um resíduo de fosfato presente, covalentemente ligado ao resíduo de histidina conservado no domínio PPDK ou PPS (Mikkelsen et al., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532).

Sequências de ácido nucleíco e sequências de aminoácidos correspondendo a estes, que codificam uma proteína Rl, são descritas de várias espécies, tais como por exemplo, batata (WO 97 11188, GenBank Acc.: AY027522, Y09533), trigo (WO 00 77229, US 6,462,256, GenBank Acc.: AAN93923, GenBank Acc.: AR236165) , arroz (GenBank Acc.: AAR61445, GenBank Acc.: AR400814) , milho (GenBank Acc.: AAR61444, GenBank Acc.: AR400813), grão de soja (GenBank

Acc.: AAR61446, GenBank Acc.: AR400815), citros (GenBank Acc.: AY094062) e Arabidopsis (GenBank Acc.: AF312027) .

As plantas de trigo que apresentam uma actividade elevada de uma proteína Rl como um resultado de sobre-expressão de um gene Rl da batata são descritas em WO 02 34923. Comparado com as correspondentes plantas de tipo selvagem, nas quais não poderia ser detectado amido, estas plantas sintetizam um amido tendo quantidades significativas de fosfato de amido na posição C-6 das moléculas de glicose.

Outras proteínas que catalisam uma reacção que -8- introduz grupos de fosfato covalentemente ligados no amido não foram descritas até ao momento. Enzimas, que preferivelmente introduzem grupos de fosfato na posição C-3 e/ou posição C-2 das moléculas de glicose de amido, também não são conhecidas. Deste modo, além de aumentar o teor de fosfato de amido em plantas, não existem formas disponíveis para influenciar especificamente a fosforilação de amido em plantas, modificando a distribuição de fosfato dentro do amido sintetizado por plantas e/ou aumentando mais o teor de fosfato de amido.

Assim, o objecto da presente invenção é fornecer métodos e meios para produzir plantas que sintetizam um amido modificado tendo elevado teor de fosfato e/ou distribuição de fosfato modificado, bem como fornecer células vegetais e/ou plantas que sintetizam tal amido modificado.

Este problema é resolvido pelas formas de realização descritas nas reivindicações. A presente invenção descreve um método para identificar uma proteína que tem uma elevada actividade de ligação em relação a glucanos alfa-1,4 fosforilados, comparado com glucanos alfa-1,4 não fosforilados.

Tal método é descrito abaixo sob "Métodos Gerais", item 8.

Um objecto da presente invenção é um método para identificar uma proteína que apresente actividade enzimática de fosforilação alfa-1,4-glucano e que necessite de alfa-1,4-glucanos como substrato, em que a) extractos de proteína são incubados com alfa-1,4-glucano fosforilados, b) proteínas especificamente ligadas a alfa-1,4- -9- glucanos fosforilados do passo a) são dissolvidas, c) proteínas obtidas de acordo com o passo b) são respectivamente incubadas com i) ATP e alfa-1,4-glucanos fosforilados e ii) ATP e alfa-1,4-glucanos não fosforilados em preparações separadas uma da outra, d) o respectivo alfa-1,4-glucano obtido após a incubação no passo c) i ou passo c) ii é examinado para introdução de mais grupos de fosfato e e) são identificadas proteínas que na preparação da incubação de acordo com c) i introduziram quantidades significativas de grupos de fosfato em alfa-1,4-glucanos e na preparação da incubação de acordo com c) ii não introduziram quantidades significativas de grupos de fosfato em alpha-1,4-glucanos. 0 termo "actividade de ligação elevada" deverá ser compreendido em conjunto com a presente invenção como uma afinidade cada vez maior de uma proteína para um primeiro substrato comparado com um segundo substrato, isto é, que a quantidade de proteína que sob as mesmas condições de incubação liga de forma aumentada a um primeiro substrato comparado com um segundo substrato, apresenta uma elevada actividade de ligação para o primeiro substrato. 0 termo "alfa-1,4-glucano" deverá ser compreendido em conjunto com a presente invenção como um glucano que consiste principalmente em alfa-1,4-ligado a glicose formando blocos mas também pode conter ligações alfa-1,6 como ramificações. Um alfa-1,4-glucano preferivelmente contém até 15%, particularmente de preferência até 10% e especialmente de preferência até 5% de ligações alfa-1,6. O termo "fosfato de amido" deverá ser compreendido -10- em conjunto com a presente invenção como grupos de fosfato covalentemente ligados a moléculas de glicose de um alfa- 1.4- glucano. 0 termo "alfa-1,4-glucano não fosforilado" deverá ser compreendido em conjunto com a presente invenção como um alfa-1,4-glucano que contém quantidades não detectáveis de fosfato de amido. O termo "alfa-1,4-glucano fosforilado" ou "P-alfa- 1.4- glucano" deverá ser compreendido em conjunto com a presente invenção como um alfa-1,4-glucano que contém fosfato de amido.

Basicamente, uma proteína identificável utilizando um método de acordo com a invenção pode vir de qualquer organismo. A proteína vem de preferência de organismos de plantas, de preferência de plantas que armazenam amido (milho, arroz, trigo, centeio, aveia, cevada, mandioca, batata, batata-doce, sagu, feijão-mungo, banana, ervilha, Arabidopsis, Curcuma ou sorgo), particularmente de preferência batateira, plantas de cevada, beterraba,

Arabidopsis ou arroz e especialmente de preferência plantas de Arabidopsis ou arroz.

Numa outra forma de realização do método de acordo com a invenção, os extractos de proteína vêm de células eucarióticas, de preferência de células vegetais, particularmente preferível de células vegetais armazenadoras de amido (milho, arroz, trigo, centeio, aveia, cevada, mandioca, batata, batata-doce, sagu, feijão-mungo, banana, ervilha, arabidopsis, curcuma ou sorgo).

Basicamente todos os alfa-1,4-glucanos não fosforilados são adequados para incubar extractos de proteína com alfa-1,4-glucanos não fosforilados para - 11 - implementar o método de acordo com a invenção. 0 amido vegetal não fosforilado é o preferencialmente usado, amido de trigo é de preferência o particularmente usado e amido foliar granular é o de preferência especialmente usado do mutante sexl-3 de Arabidopsis thaliana (Tien-Shin Yu et al., 2001, Plant Cell 13, 1907-1918). Métodos para isolar amido vegetal, por exemplo, são conhecidos por todos os especialistas na técnica. Todos os métodos conhecidos pelos especialistas na técnica são basicamente adequados para isolar amido não fosforilado de espécies vegetais apropriadas. De preferência, é usado o método para isolar alfa-1,4-glucanos não fosforilados descrito abaixo (veja "Métodos Gerais" Item 2).

Basicamente todos os alfa-1,4-glucanos contendo fosfato de amido são adequados para incubar extractos de proteína com P-alfa-1,4-glucanos para implementar o método de acordo com a invenção. Neste caso também podem ser usados amidos fosforilados quimicamente. De preferência usados para incubação com extractos de proteína são os P-alpha-1,4-glucanos de plantas, de preferência particularmente usado é um amido vegetal subsequentemente fosforilado enzimaticamente, de preferência especialmente usado é um amido vegetal granular fosforilado que foi isolado de um mutante sexl-3 de Arabidopsis thaliana.

Uma fosforilação enzimática subsequente de alfa-1,4-glucanos não fosforilados pode ser efectuada com qualquer enzima que transfira resíduos de fosfato para alfa-1,4-glucanos não fosforilados através da introdução de ligações covalentes. De preferência usada para este fim é uma enzima que tenha a actividade de uma água glucano diquinase (RI Protein, E.C.: 02.07.09.4) (Ritte et al., - 12- 2002, PNAS 99, 7166-7171; Mikkelsen et al., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532). De preferência usada para a fosforilação enzimática subsequente de alfa-1,4-glucanos não fosforilados é uma proteína RI purificada, especialmente uma proteína RI de batata produzida pela expressão heteróloga em E. coli. Métodos para purificar uma proteína RI produzida recombinantemente por expressão em E. coli são descritos em in Ritte et al. (2002, PNAS 99, 7166-7171) e Mikkelsen et al. (2003, Biochemical Journal 377, 525-532).

Quando implementando o método de acordo com a invenção, complexos de P-alfa-1,4-glucano-proteína podem ser formados pela incubação de extractos de proteína com P-alfa-1,4-glucanos e/ou alfa-1,4-glucanos não fosforilados como um resultado da ligação de proteínas a P-alfa-1,4-glucanos e complexos de alfa-1,4-glucanos-proteína não fosforilados podem ser formados como um resultado da ligação de proteínas a alfa-1,4-glucanos não fosforilados.

As proteínas presentes em complexos P-alfa-1,4-glucano-proteína não fosforilados quando implementando o método de acordo com a invenção são dissolvidas, isto é, a ligação das proteínas relacionadas com o respectivo alfa-1,4-glucanos é quebrada. As proteínas de ligação dissolvidas P-alfa-1,4-glucano e/ou proteínas de ligação de alfa-1,4-glucanos não fosforilados são assim obtidas. Basicamente, todas as substâncias que impedem a existência da interacção de proteína-alfa-1,4-glucanos não fosforilados podem ser usadas para quebrar a ligação entre os alfa-1,4-glucanos relacionados e a ligação de proteínas a eles. Preferidas para este fim são as soluções tampão contendo detergentes, particularmente preferíveis são as - 13- soluções contendo lauril sulfato de sódio (LSS), especialmente preferível é a solução tampão descrita mais abaixo (ver "Métodos Gerais" Item 8).

Qualquer método que permita que alfa-1,4-glucanos seja separado das substâncias dissolvidas, tais como proteínas e, por exemplo, ATP da preparação de incubação, pode ser usado para separar alf a-1,4-glucanos de ATP e/ou proteínas. Se forem usados alfa-1,4-glucanos solúveis para a incubação de extractos de proteínas com alfa-1,4-glucanos quando implementar o método de acordo com a invenção, a separação pode, por exemplo, envolver uma precipitação de alpha-1,4-glucanos, de preferência uma precipitação com solventes adequados, particularmente preferível uma precipitação com álcoois. A separação de alfa-1,4-glucanos pela ligação a substâncias que selectivamente ligam alfa-1,4-glucanos (por ex., Concavalina A) também é adequada para separar alfa-1,4-glucanos de substância na solução.

Preferivelmente, é aqui usada a filtragem para a separação de alfa-1,4-glucanos, particularmente preferível é a centrifugação, especialmente preferível é o método descrito mais abaixo (veja "Métodos Gerais" Item 8) .

Quando implementando o método de acordo com a invenção, todos os métodos conhecidos por especialistas na técnica, tais como métodos cromatográficos, por exemplo, precipitação e subsequente centrifugação de alpha-1,4-glucano, digestão enzimática de alfa-1,4-glucanos, filtragem de gel, etc. que levam à separação de proteínas solúveis de alfal,4-glucanos, podem basicamente ser usados para separar proteínas solúveis de alpha-1,4-glucanos. As proteínas de ligação P-alfa-1,4-glucano dissolvidas e/ou proteínas de ligação de alfa-1,4-glucanos não fosforilados - 14- dissolvidas são de preferência separadas de alfa-1,4-glucanos usados no método de acordo com a invenção com o auxilio de centrifugação.

Numa outra forma de realização da presente invenção quando implementando o método de acordo com a invenção, centrifugação usando uma almofada Percoll para separar complexos de P-alfa-1,4-glucano-proteina de proteínas não contidas nos complexos relacionados. 0 método descrito mais abaixo (veja "Métodos Gerais" Item 8) é preferivelmente usado aqui para separar as proteínas não ligadas a alfa-1,4-glucanos. Depois da centrifugação ter sido efectuada usando uma almofada Percoll, as proteínas não ligadas a P-alfa-1,4-glucanos ou não ligadas a alfa-1,4-glucanos não fosforilados encontram-se no sobrenadante do meio de centrifugação enquanto que os complexos de P-alpha-1,4-glucano-proteína ou alfa-1,4-glucano-proteína estão presentes em pellet sedimentado. 0 sobrenadante do meio de centrifugação é descartado e o pellet é de preferência lavado com o tampão usado para a incubação para mais purificação de complexos de P-alpha-1,4-glucano-proteína ou complexos de alfa-1,4-glucano-proteína não fosforilados. 0 pellet é de preferência lavado uma vez, particularmente de preferência duas vezes.

Basicamente qualquer tipo de extracto de proteína pode ser usado para efectuar o método de acordo com a invenção para identificar uma proteína que apresente uma actividade enzimática de fosforilação alfa-1,4-glucano e que necessite da alfa-1,4-glucano de fosforilação como substrato. Tanto os denominados extractos de proteínas em bruto como os extractos de proteínas parcial ou completamente purificados podem ser aqui envolvidos. Assim, -15- por exemplo, é vantajoso utilizar proteínas que foram identificadas utilizando um método de acordo com a invenção para identificar uma proteína que apresente uma actividade de ligação elevada para alfa-1,4-glucanos fosforilados comparado com alfa-1,4-glucanos não fosforilados. As proteínas que foram identificadas utilizando um método de acordo com a invenção para identificar uma proteína que apresente uma actividade de ligação elevada para alfa-1,4-glucanos fosforilados comparado com alfa-1,4-glucanos não fosforilados, podem, por exemplo, ser utilizadas omitindo os passos a) e b) do processo indo directamente para o passo c) do método de acordo com a invenção para identificar uma proteína que apresente actividade enzimática de fosforilação alfa-1,4-glucan e necessite da alfa-1,4-glucanos fosforilados como substrato.

Basicamente, todos os métodos gerais conhecidos por especialistas na técnica, tal como descrito, por exemplo, em Âmbitos (1993, Protein Purification: Principies & Practice, ISSN: 038794072) são adequados para produzir extractos de proteínas para células procarióticas ou eucarióticas para implementar o método de acordo com a invenção. De preferência usado para implementar o método, no entanto, são métodos para o isolamento de proteínas de plantas (por ex., descrito em Bollag et al, 1996, in: "Protein Methods", 2nd Edition, Wiley, ISBN: 0-4.71-11837-0; Dennison, 2003, in: "A Guide to Protein Isolation" 2nd Edition, Kluwer Academic Publishers, ISBN 1-4020-1224-1), particularmente preferível é o método descrito mais abaixo (ver "Métodos Gerais" Item 1). A incubação de extractos de proteínas para implementar o método de acordo com a invenção com P-alfa- -16- glucanos ou alfa-1,4-glucanos não fosforilados ocorre em preparações separadas. As preparações relevantes para P-alfa-1,4-glucanos ou alfa-1,4-glucanos não fosforilados são tratadas separadamente uma da outra durante a implementação de todo o método. Neste caso, respectivamente as mesmas quantidades de extractos de proteínas são para serem incubadas com respectivamente as mesmas quantidades de P-alfa-1,4-glucanos ou alfa-1,4-glucanos não fosforilados. De preferência, respectivamente 1 a 10 mg, particularmente de preferência 3 a 7 mg e especialmente de preferência 4 a 6 mg de extracto de proteína são incubadas com P-alfa-1,4-glucanos ou alfa-1,4-glucanos não fosforilados. A quantidade de P-alfa-1,4-glucanos ou alfa-1,4-glucanos não fosforilados usada é de preferência respectivamente 10 a 100 mg, particularmente de preferência 30 a 70 mg e especialmente de preferência 45 a 55 mg. Vários tampões podem ser usados para a incubação de extractos de proteínas com P-alfa-1,4-glucanos para implementar o método de acordo com a invenção. Basicamente são adequados todos os tampões que permitem a ligação das proteínas a serem identificadas para o substrato em questão. O tampão descrito mais abaixo (ver "Métodos Gerais" Item 1) é o de preferência usado. O termo "proteína que apresente uma actividade enzimática de fosforilação alfa-1,4-glucano e necessite de alfa-1,4-glucanos fosforilados como substrato" deverá ser compreendida junto com a presente invenção como uma proteína que introduz resíduos de fosfato covalentemente em P-alfa-1,4-glucanos, que usa P-alfa-1,4-glucanos como um substrato para a transferência de resíduos de fosfato enquanto que P-alfa-1,4-glucanos não fosforilados não é - 17- fosforilado por uma proteína relacionada, isto é, P-alfa-1,4-glucanos não fosforilado não serve como um substrato para a reacção de fosforilação.

Numa outra forma de realização o método de acordo com a invenção para identificar uma proteína que apresente uma actividade enzimática de fosforilação alfa-1,4-glucano e necessite da alfa-1,4-glucanos fosforilados como substrato está relacionado com um método para identificar uma proteína que use ATP como mais um substrato.

Nesta forma de realização da presente invenção, ATP é usado como mais um substrato (co-substrato) pela proteína que apresenta uma actividade enzimática de fosforilação alfa-1,4-glucano e requer alfa-1,4-glucanos fosforilados como substrato, isto é, a proteína relacionada transfere um resíduo de fosfato de ATP para um P-alfa-1,4-glucano já fosforilado. A actividade duma proteína que usa ATP como co-substrato para a transferência de resíduos de fosfato para P-alfa-1,4-glucanos pode ser demonstrada, isto é, utilizando o ATP que contém um resíduo de fosfato marcado (marcado ATP) . 0 preferido é ATP em que o resíduo de fosfato é especificamente marcado na posição-beta, isto é, em que apenas o resíduo de fosfato na posição-beta tem uma marcação. De preferência é usado ATP marcado radioactivamente, particularmente preferível é usado ATP, em que o resíduo de fosfato é especificamente marcado radioactivamente na posição-beta, e especialmente preferível é usado ATP, em que o resíduo de fosfato é especificamente marcado com 33P na posição-beta. Se uma proteína de fosforilação for incubada com P-alfa-1,4-glucanos na presença de ATP marcado, fosfato marcado - 18- covalentemente ligado a P-alfa-1,4-glucano pode então ser detectado. Neste caso, P-alfa glucanos usado para a reacção de fosforilação pode estar presente tanto na forma de amido vegetal contendo fosfato de amido (amido de batata, amido de Curcuma armada, C. zedoaria, C. longa, arroz, feijões-mungo, tapioca, etc.) e também na forma P-alfa-1,4-glucanos enzimaticamente fosforilados P-alfa-1,4-glucanos quimicamente fosforilados. É usado preferivelmente amido foliar de Arabidopsis thaliana, particularmente preferível mutantes sexl-3 de amido de Arabidopsis thaliana fosforilado enzimaticamente através de uma proteína RI.

Resíduos de fosfato marcado que podem ser incorporados num P-alfa-1,4-glucano por uma proteína, por ex., após a separação dum P-alfa-1,4-glucano marcado (por ex., pela precipitação de alfa-1,4-glucanos através de etanol, filtragem, métodos cromatográficos, centrifugação, etc.) a partir do restante da mistura de reacção e subsequente detecção dos resíduos de fosfato marcados na fracção relevante de P-alfa-1,4-glucano, podem ser demonstrados. Ao mesmo tempo, os resíduos de fosfato marcado ligados na fracção de P-alfa-1,4-glucano podem ser demonstrados, por exemplo, ao determinar a quantidade de radioactividade presente na fracção de P-alfa-1,4-glucano (por ex., através de contadores de cintilação) .

Numa outra forma de realização o método de acordo com a invenção para identificar uma proteína que apresente uma actividade enzimática de fosforilação alfa-1,4-glucano e necessite da alfa-1,4-glucanos fosforilados como substrato está relacionado com um método em que a proteína tendo actividade enzimática de fosforilação alfa-1,4-glucano usa P-amido como substrato. É particularmente - 19- preferido amido isolado de um mutante sexl-3 de Arabidopsis thaliana, que foi subsequentemente fosforilado enzimaticamente. Para implementar esta forma de realização preferida do método de acordo com a invenção, um amido fosforilado é correspondentemente usado nos passos c) i do processo e um amido não fosforilado é usado no passo c) ii do processo. É assim possível identificar proteínas que fosforilizam P-amido. Tais proteínas são especialmente adequadas para modificar amido em organismos de plantas através de manipulação genética de plantas apropriadas.

Numa outra forma de realização o método de acordo com a invenção para identificar uma proteína que apresente uma actividade enzimática de fosforilação alfa-1,4-glucano e necessite da alfa-1,4-glucanos fosforilados como substrato está relacionado com um método para identificar uma proteína em que a proteína surge como um produto intermediário fosforilado durante a transferência de um resíduo de fosfato para um P-alfa-1,4-glucano. 0 dito produto intermediário é preferivelmente formado por autofosforilação da proteína relacionada.

Uma proteína fosforilada que surge como um produto intermediário como um resultado de fosforilação mediada por proteínas de P-alfa-1,4-glucanos pode ser demonstrado como descrito em Ritte et al. (2002, PNAS 99, 7166-7171) para uma proteína RI.

Para detectar a presença de um produto intermediário autofosforilado, uma proteína é primeiro incubada na ausência de glucanos com ATP marcado, preferivelmente com um ATP marcado especificamente na posição beta-fosfato, de preferência particularmente -20- marcado com ATP especificamente com 33P na posição beta-fosfato durante 15 a 45 minutos, de preferência particularmente durante 20 a 40 minutos e de preferência especialmente durante 25 a 30 minutos numa preparação de reacção 1. Paralelamente a isto, uma preparação de reacção 2 que contém quantidades correspondentes de ATP não-marcado, é incubada nas mesmas condições. ATP não-marcado é então adicionado à mistura de reacção 1 em excesso e uma mistura de ATP não-marcado e ATP marcado (a mesma quantidade de ATP marcado que a previamente usada na mistura de reacção 1 e a mesma quantidade de ATP não-marcado que a adicionada em excesso à mistura de reacção 1) é adicionada à mistura de reacção 2 e incubada durante mais 1 a 5 minutos, preferivelmente durante 2 a 5 minutos e de preferência especialmente durante 3 minutos antes de P-alfa-1,4-glucanos serem adicionados à Parte A da mistura de reacção 1 (Parte IA) ou à Parte A da mistura de reacção 2 (Parte 2A) . A reacção na restante Parte 1B e Parte 2B da mistura de reacção é parada pela desnaturação da proteína. A Parte B da mistura de reacção pode ser parada pelos métodos conhecidos pelos especialistas na técnica, que leva à desnaturação de proteínas, preferivelmente adicionando lauril sulfato de sódio (LSS) . A Parte IA e Parte 2A das misturas de reacção são incubadas durante pelo menos mais 10 minutos antes destas reacções também serem paradas. Alfa-1,4-glucanos presentes na Parte A ou Parte B das respectivas misturas de reacção são separadas das respectivas restantes misturas de reacção. Por exemplo, se os respectivos alfa-1,4-glucanos forem separados por centrifugação, então, no fim da centrifugação, os alfa-1,4-glucanos da respectiva Parte A ou Parte B da mistura de -21 - reacção são para serem encontrados no pellet sedimentado, e as proteínas nas respectivas misturas de reacção são para serem encontradas no sobrenadante da respectiva centrifugação. 0 sobrenadante de Parte IA ou 2A e de Parte 1B ou 2B da mistura de reacção pode ser analisado, por exemplo, respectivamente numa electroforese de gel de acrilamida desnaturante, seguido pela autoradiografia do gel de acrilamida obtido. Para quantificar a quantidade de proteínas marcadas radioactivamente, que tenham sido separadas através de electroforese de gel de acrilamida, pode ser usado o denominado método "imagem de fósforo", por exemplo, conhecido pelos especialistas na técnica. Se a autoradiografia ou a análise através de "visualizador de imagem de fósforo" de proteínas no sobrenadante de centrifugação de Parte B da mistura de reacção 1 mostrar um sinal significativamente aumentado comparado com o sobrenadante de centrifugação de Parte A da mistura de reacção 1, então isto mostra que uma fosforilação de alfa-glucanos mediada por proteínas ocorre como um produto intermediário autofosforilado. As Partes A e B da mistura de reacção 2 serve como um controlo e não deverá por isso apresentar um sinal significativamente aumentado no sobrenadante de centrifugação na autoradiografia ou na análise através do "visualizador de imagem de fósforo".

Além disso, o alfa-1,4-glucanos da respectiva Parte A de misturas de reacção 1 e 2 restantes no respectivo pellet sedimentado pode ser investigado, se necessário após a subsequente lavagem do respectivo alfa-1,4-glucanos, para verificar a presença de fosfato de amido, que tem uma marca correspondente ao ATP usado. Se alpha-1,4-glucanos de Parte A da mistura de reacção 1 contiver resíduos de fosfato -22- marcados, e se a autoradiografia do sobrenadante da centrifugação de Parte B da mistura de reacção 1 mostrar um sinal significativamente aumentado comparado com o sobrenadante de centrifugação de Parte A da mistura de reacção 1, então isto mostra gue uma fosforilação de alfa-glucanos mediada por proteinas está presente como um produto intermediário autofosforilado. As Partes A e B da mistura de reacção 2 serve como um controlo e não deverá por isso apresentar um sinal significativamente aumentado para alfa-1,4-glucanos marcado com 33P no pellet sedimentado contendo alfa-1,4-glucanos.

Numa outra forma de realização o método de acordo com a invenção para identificar uma proteína que apresente uma actividade enzimática de fosforilação alfa-1,4-glucano e necessite da alfa-1,4-glucanos fosforilados como substrato está relacionado com um método para identificar uma proteína em que a proteína surge como um produto intermediário fosforilado durante a transferência de um resíduo de fosfato para um P-alfa-1,4-glucano .

As posições em que os átomos de carbono (C-2, C-3 or C-6) dos monómeros de glicose na P-alfa-1,4-glucano são preferivelmente fosforilados por uma proteína ou extracto de proteína podem ser determinadas, por exemplo, através da análise de P-alfa-1,4-glucanos fosforilado por uma proteína ou extracto de proteína, como descrito em Ritte et al. (2002, PNAS 99, 7166-7171). Para este fim, P-alfa-1,4-glucanos adicionalmente fosforilados por uma proteína ou extracto de proteína são hidrolisados usando ácido e são então analisados através da cromatografia de troca aniónica.

Os P-alfa-1,4-glucanos fosforilados por uma -23- proteína são preferivelmente analisados através de NMR para determinar em que posições dos átomos de carbono (C-2, C-3 ou C-6) dos monómeros de glicose são fosforilados em P-alfa-1,4-glucano.

Proteinas do método de acordo com a invenção para identificar uma proteína que apresente uma actividade enzimática de fosforilação de alfa-1,4-glucano e necessite de alfa-1,4-glucanos fosforilados como substrato, as quais foram obtidas de acordo com o passo b) do processo são incubadas no passo c) do método de acordo com a invenção em preparações separadas contendo ATP e P-alfa-1,4-glucano ou ATP e alfa-1,4-glucano não fosforilado. Para implementar o método de acordo com a invenção é preferível usar o ATP que contenha um resíduo de fosfato especificamente marcado na posição-beta, especialmente um resíduo de fosfato especificamente radioactivamente marcado na posição-beta. A incubação de proteínas dissolvidas de acordo com a invenção com ATP e P-alfa-1,4-glucanos de acordo com o passo c) i do processo ou de alfa-1,4-glucanos não fosforilado de acordo com o passo c) ii do método de acordo com a invenção para identificar uma proteína que apresente uma actividade enzimática de fosforilação de um alfa-1,4-glucano e necessite da alfa-1,4-glucanos fosforilados como substrato, preferivelmente ocorre a uma temperaura de 20°C a 30°C, particularmente de preferência de 23°C a 27°C e especialmente de preferência de 24°C a 26°C e é efectuada durante uma duração de pelo menos 15 minutos, preferivelmente pelo menos 20 minutos, particularmente de preferência pelo menos 30 minutos. A quantidade de ATPs usados neste caso é preferivelmente pelo menos 0,05 μΜ, particularmente preferível pelo menos 3 μΜ e especialmente -24- preferível pelo menos 5 μΜ. A concentração de P-alfa-1,4-glucano usada ou de alfa-1,4-glucano não fosforilado usada é neste caso preferivelmente pelo menos 1 mg/ml, particularmente preferível pelo menos 10 mg/ml e especialmente preferível pelo menos 25 mg/ml. Após a incubação ter sido completa, as reacções de extractos de proteínas com P-alfa-1,4-glucanos ou alfa-1,4-glucanos não fosforilados podem ser paradas. A respectiva mistura de reacção pode ser parada pelos métodos conhecidos pelos especialistas na técnica, que leva à desnaturação de proteínas, preferivelmente adicionando lauril sulfato de sódio e aquecendo durante 5 minutos a 95°C. Quando implementando o passo c) i ou c ii) do método de acordo com a invenção para identificar uma proteína que apresente uma actividade enzimática de fosforilação e necessite da alfa-1,4-glucanos fosforilados como substrato, respectivamente as mesmas condições de incubação para as respectivas preparações de incubação deverão ser efectuadas durante a incubação de proteínas com P-alfa-1,4-glucanos ou alfa-1,4-glucanos não fosforilados. O P-alfa-1,4-glucano obtido de acordo com o passo c) i do processo ou o alfa-1,4-glucano não fosforilado obtido de acordo com o passo c) ii após a implementação do método de acordo com a invenção para identificar uma proteína que apresente uma actividade enzimática de fosforilação de alfa-1,4-glucano e necessite de alfa-1,4-glucanos fosforilados como substrato, é investigada para a introdução de resíduos de fosfato adicionais. Para determinar se os resíduos de fosfato foram adicionalmente introduzidos nos alfa-1,4-glucanos relacionados pelos passos c) i e/ou c) ii do processo, pode ser usado qualquer -25- método que seja possível para a detecção específica da marcação usada para os ATPs marcados usados nos passos c) i e c) ii do processo. Se, por exemplo, o ATP marcado radioact ivamente for usado nos passos c) i ou c) ii" do processo isto pode ser efectuado utilizando métodos conhecidos pelos especialistas na técnica para detecção de elementos radioactivos, tais como, por exemplo, autoradiografia, medição da radioactividade através de equipamento adequado (por ex., contadores de cintilação, "detectores de fósforo" etc.).

Proteínas usadas no passo b) do processo do método de acordo com a invenção para identificar uma proteína que apresente actividade enzimática de fosforilação da alfa-1,4-glucano e necessite de alfa-1,4-glucanos fosforilados como substrato, que tenham introduzido quantidades significativas de resíduos de fosfato em alfa-1,4-glucanos não fosforilados no passo c) i mas em comparação a isto, não introduziram quantidades significativas de resíduos de fosfato em alfa-1,4-glucanos não fosforilados no passo c) ii, podem ser identificadas por métodos conhecidos pelos especialistas na técnica. 0 termo "quantidades significativas" deverá ser compreendido junto com a presente invenção como uma quantidade que seja pelo menos duas vezes, preferencialmente pelo menos quatro vezes, particularmente preferível pelo menos seis vezes e especialmente preferível pelo menos oito vezes mais elevada do que a quantidade determinada nas experiências de controlo correspondentes.

Neste caso, os preparativos para a incubação que contenham extractos de proteínas completamente inactivos ou nenhuns extractos de proteínas em vez de extractos de -26- proteínas nativas podem ser usados como experiências de controlo. Extractos de proteína em que não possa ser detectada mais actividade enzimática de fosforilação de alfa-1,4-glucano são para serem compreendidos como "completamente inactivos" A identificação de proteínas quando implementando um método para identificação duma proteína que apresente uma actividade de ligação elevada em relação a alfa-1,4-glucanos fosforilados comparado com alfa-1,4-glucanos não fosforilados pode ser feita utilizando métodos conhecidos pelos especialistas na técnica tais como, por exemplo, determinando a sequência de aminoácidos das proteínas relacionadas utilizando métodos que incluem degradação de Edman, análise de massa utilizando MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desorption/lonization-Time Of Flight-Mass Spectroscopy), seguido por comparações com bases de dados contendo perfis de massa de proteínas, sequência de aminoácidos através de análise de Q-TOF ou análise de TOF/TOF, etc. As proteínas relacionadas são preferencialmente identificadas através de análise Q-TOF-MS-MS, especialmente preferível é a identificação das proteínas utilizando o método descrito mais abaixo (veja "Métodos Gerais" Item 10).

Se as proteínas forem determinadas através de MALDI-TOF-MS, seguido por comparações com bases de dados contendo perfis de massas de proteínas, as proteínas relacionadas são primeiro antecipadamente digeridas enzimaticamente antes das massas de fragmentos de proteína (peptídeos) obtidas da digestão serem analisadas através de MALDI-TOF-MS. Um perfil de massa da proteína em questão é obtido. Estes perfis de massa são muito específicos para -27- uma proteína visto que a sequência específica de proteases é usada para a digestão de proteínas que apenas separa uma ligação peptídica quando está contida numa sucessão de sequência de aminoácidos específica. Se a sequência de aminoácidos especial que serve como uma sequência de reconhecimento para uma determinada protease for conhecida, um perfil de massa teorético pode ser criado a partir de qualquer sequência de aminoácidos arbitrária calculando a massa dos peptídeos que poderia ser produzida após a digestão da sequência de aminoácidos com uma protease especifica. Ao comparar perfis de massa de proteínas desconhecidos realmente obtidos utilizando MALDI-TOF-MS com os perfis de massa determinados teoreticamente em bases de dados correspondentes, sequências de aminoácidos também podem assim ser determinadas.

Numa outra forma de realização o método de acordo com a invenção para identificar uma proteína que apresente uma actividade enzimática de fosforilação de alfal,4-glucano e necessite de alfa-1,4-glucanos fosforilada como substrato, os complexos de proteína de P-alfa-1,4-glucano obtidos pela incubação de extractos de proteína com P-alfa-1,4-glucanos de acordo com o passo a) são separados a partir de proteínas não ligadas a alfa-1,4-glucanos em questão.

Numa outra forma de realização do método de acordo com a invenção para identificar uma proteína que apresente uma actividade enzimática de fosforilação de alfa-1,4-glucano e necessite de alfa-1,4-glucanos fosforilados como substrato, as proteínas dissolvidas de acordo com o passo b) do método de acordo com a invenção são separadas de P-alfa-1,4-glucanos usados no passo a). -28-

Numa outra forma de realização, o método de acordo com a invenção para identificar uma proteína que apresente uma actividade enzimática de fosforilação de alfa-1,4-glucano e necessite de alfa-1,4-glucanos fosforilados como substrato, as proteínas de ligação de P-alfa-1,4-glucano dissolvidas, obtidas quando implementando o método de acordo com a invenção e de acordo com o passo b) do processo são separadas umas das outras. Numa outra forma de realização do método de acordo com a invenção para identificar uma proteína que apresente uma actividade enzimática de fosforilação alfa-1,4-glucano e necessite de alfa-1,4-glucanos fosforilados como substrato, os glucanos obtidos pela incubação de extractos de proteína de P-alfa-1,4-glucanos de acordo com o passo c) i ou com alfa-1,4-glucanos não fosforilados de acordo com o passo c) ii são separados das proteínas presentes na mistura de reacção e/ou no ATP marcado presente na mistura de reacção.

De preferência, é aqui usada a filtragem para a separação de alfa-1,4-glucanos, centrifugação é particularmente preferível, especialmente preferível é o método descrito mais abaixo (veja "Métodos Gerais" Item 8). Depois da centrifugação ter sido efectuada utilizando uma almofada Percoll, substâncias solúveis das misturas de reacção estão localizadas no sobrenadante do meio de centrifugação em que alfa-1,4-glucanos está presente no pellet sedimentado.

Numa outra forma de realização do método de acordo com a invenção para identificar uma proteína que apresente uma actividade enzimática de fosforilação de alfa-1,4-glucano e necessite de alfa-1,4-glucanos fosforilados como -29- substrato, relacionado com um método para identificação duma proteína que tenha um peso molecular derivado da sequência de aminoácidos de 120 kDa a 145 kDa, preferencialmente 120 kDa al40 kDa, particularmente preferível 125 kDa a 140 kDa, especialmente preferível 130 kDa a 135 kDa.

Numa outra forma de realização do método de acordo com a invenção para identificar uma proteína, após a identificação de proteínas em questão, as sequências de aminoácidos que codificam estas proteínas são determinadas.

As sequências de aminoácidos podem ser determinadas de acordo com a invenção utilizando quaisquer métodos conhecidos pelos especialistas na técnica. Tais métodos são suficientemente descritos na literatura da especialidade (por ex., em Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry, 2000, John Wiley & Sons Inc, ISBN: 0-471-32249-0; Protein Sequencing Protocols, 2002, Smith (Ed.), Edition: 2nd , Humana Press, ISBN: 0-89603-975-7) e são basicamente adequados para implementar o método de acordo com a invenção. Além disso, a purificação e/ou sequência de proteínas é efectuada como um contrato de prestação de serviços por muitas empresas (por ex., Eurogentec, Searing, Bélgica).

Se necessário, as proteínas que utilizam um método de acordo com a invenção para identificar uma proteína podem estar sujeitas a mais purificação e/ou concentração antes de determinar a sua sequência de aminoácidos. Os métodos para purificação e/ou concentração de proteínas são suficientemente descritos na literatura da especialidade (por ex., em Methods in Enzymology: Guide to Protein Purification, Vol.182 1990, Deutscher, Murray P. (Ed.), -30-

Academic Press, ISBN: 0-12-182083-1; Isolation and Purification of Proteins: Hatti-Kaul, 2003, Rajni (Ed.); Mattiasson, Bo (Edt), Mareei Dekker Inc, ISBN:0-8247-0726-5, Protein Purification Techniques: A Practical Approach. Roe, 2001, Simon (Ed.)· The Practical Approach Series, 244. Edition: 2nd. Oxford Univ Press, ISBN: 0-19-963673-7) e são basicamente adequados para implementar o método de acordo com a invenção.

Numa outra forma de realização do método de acordo com a invenção para identificar uma proteína, são usados os métodos de acordo com a invenção para identificar uma proteína cuja codificação da sequência de aminoácidos tenha um domínio de fosfohistidina (Tien-Shin Yu et al., 2001, Plant Cell 13, 1907-1918). 0 domínio de fosfohistidina tem preferivelmente pelo menos uma identidade de 50% com a sequência de aminoácidos do domínio de fosfohistidina da proteína OKI de Arabidopsis thaliana e Oryza sativa especificada sob a SEQ ID N.° 5, em particular de pelo menos 60%, preferivelmente de pelo menos 70%, particularmente preferível de pelo menos 80% e especialmente preferível de pelo menos 90%.

Numa outra forma de realização do método de acordo com a invenção para identificar uma proteína, são usados os métodos de acordo com a invenção para identificar uma proteína cuja codificação da sequência de aminoácidos tenha um domínio de fosfohistidina (Tien-Shin Yu et al., 2001, Plant Cell 13, 1907-1918) em que o domínio de fosfohistidina contenha duas histidinas.

Usando o método de acordo com a invenção, as proteínas que apresentem uma actividade enzimática de fosforilação de alfa-1,4-glucano e que necessitem de alfa- -31 - 1,4-glucanos de fosforilação como substrato podem ser identificadas.

Deste modo, as proteínas obtidas por métodos de acordo com a invenção para identificar uma proteína também são objecto da presente invenção. A sequência de aminoácidos das proteínas identificadas utilizando um método de acordo com a invenção pode ser determinada utilizando métodos conhecidos pelos especialistas na técnica, como já foi referido acima.

Os ácidos nucleícos que codificam uma proteína com actividade enzimática de fosforilação de alfa-1,4-glucano podem ser identificados, por ex., escrutinando bases de dados que estejam disponíveis, por exemplo por EMBL (http://www.ebi.ac.uk/ Tools/index.htm) ou NCBI (National Center for Biotechnology Information, http:/twww.ncbi.nim.nih.gov/). Neste caso, uma ou uma série de sequências de aminoácidos determinada quando se implementa o método de acordo com a invenção, é predefinida como uma denominada consulta. Esta sequência de consulta é então comparada através de programas de computador estatísticos com sequências, que estejam contidas nas bases de dados seleccionadas. Tais consultas das bases de dados (por ex., pesquisas blast ou fasta) são conhecidas pelos especialistas na técnica e podem ser efectuadas por vários providers.

Se tal consulta da base de dados for efectuada por ex., no NCBI (National Center for Biotechnology Information, http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/) , então deverão ser usadas as definições Standard, que são especificadas para a informação de comparação particular. Para comparações de sequência de proteína (blastp), estas são as -32- definições: Limit entrez = not activated; Filter = low complexity activated; Expect value = 10; word size = 3; Matrix = BLOSUM62; Gap costs: Existence =11, Extension = 1.

Durante tal pesquisa na base de dados, por exemplo, as sequências de aminoácidos determinadas na presente invenção quando implementando o método de acordo com a invenção podem ser usadas como uma sequência de consulta para identificar moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína que apresenta actividade enzimática de fosforilação de alfa-1,4-glucano.

Ao utilizar o método descrito, também é possível identificar moléculas de ácido nucleico e/ou sequências de aminoácidos que têm um elevado grau de identidade para moléculas de ácido nucleico e/ou proteínas que podem ser obtidas utilizando o método de acordo com a invenção e codificando uma proteína que apresente actividade enzimática de fosforilação de alfa-1,4-glucano.

Os métodos são conhecidos pelos especialistas na técnica com os quais, partindo de sequências de aminoácidos, eles podem identificar ácidos nucleícos codificando-os (veja, por exemplo, Sambrok et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition (2001) Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY. ISBN: 0879695773, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5th edition (2002), ISBN: 0471250929). A partir de sequências de aminoácidos que codificam uma proteína que apresenta actividade enzimática de fosforilação de alfa-1,4-glucano, os ácidos nucleícos que codificam as sequências de aminoácidos em questão podem ser derivados de acordo com o código genético. É do conhecimento dos especialistas na técnica -33- que os oligonucleotídeos degenerados obtidos do código genético também podem basicamente ser usados para identificar ácidos nucleicos. Os oligonucleotideos que constituem sequências derivadas de sequências de aminoácidos obtidos quando implementando o método de acordo com a invenção podem então ser sintetizados. Estes oligonucleotideos sintéticos podem ser usados para identificar ácidos nucleicos que codificam proteínas de cujas sequências de aminoácidos as correspondentes sequências de oligonucleotideos foram derivadas. Isto pode ser alcançado, por exemplo, pesquisando bibliotecas de genes, os ditos oligonucleotideos sintéticos usados como sondas marcadas na forma de sondas de hibridização. Uma outra possibilidade de identificação de ácidos nucleicos que codificam um proteína que apresente actividade enzimática de fosforilação de alfa-1,4-glucano, envolve a utilização de oligonucleotideos sintéticos derivados de sequências de aminoácidos obtidos quando implementando o método de acordo com a invenção, pesquisando bibliotecas de genes utilizando métodos à base de PCR, em que o ditos oligonucleotideos sintéticos são usados como denominados "primers". As bibliotecas de genes podem estar presentes, por exemplo, na forma de cosmids, phagmids, plasmids, YACs ou BACs. As bibliotecas de ADN podem conter genómico e também cADN. Para os métodos de pesquisa com base em PCR quando utilizando a denominada RT-PCR (Reacção em Cadeia da Polimerase-Transcriptase Reversa), também é possível usar mARN. Os ácidos nucleicos para a implementação do método de acordo com a invenção para identificar um ácido nucleíco em bibliotecas de genes ou presentes como mARN podem neste caso vir de qualquer organismo, preferivelmente vir de -34- eucarióticas, particularmente preferível de plantas, especialmente preferível de cereais.

Um outro objecto da presente invenção está relacionado com um método para identificar um ácido nucleíco que codifica uma proteína que apresente actividade enzimática de fosforilação de alfa-1,4-glucano, em que a) uma proteína é identificada utilizando um método de acordo com a invenção para identificar uma proteína, b) anticorpos que reagem especificamente com a proteína identificada de acordo com o passo a) são produzidos e c) ácidos nucleícos sao identificados utilizando os anticorpos determinados de acordo com o passo b). Métodos para a produção de anticorpos, que reagem especificamente com uma certa proteína, isto é, que ligam especificamente à dita proteína, são conhecidos pelos especialistas na técnica (veja, por exemplo, Lottspeich and Zorbas (Eds.), 1998, Bioanalytik, Spektrum akad, Verlag, Heidelberg, Berlin, ISBN 3-8274-0041-4). A produção de tais anticorpos é oferecida por algumas empresas (por ex., Eurogentec, Bélgica) como um contrato de prestação de serviços. Métodos para identificar ácidos nucleícos utilizando anticorpos, frequentemente designados como "immunoscreening" na literatura da especialidade (veja, por exemplo Lottspeich und Zorbas (Eds.), 1998, Bioanalytik, Spektrum a kad. Verlag., Heidel-berg, Berlin, ISBN 3-8274-0041-4) são provavelmente conhecidos pelos especialistas na técnica e descritos detalhadamente na literatura. A denominada bibliotecas de genes de expressão, por exemplo, pode ser usada para implementar tais métodos, nos quais os -35- clones obtidos são pesquisados para a expressão de uma determinada proteína com a ajuda de um anticorpo específico direccionado contra esta proteína. Podem ser adquiridos materiais para a produção de bibliotecas de genes de expressão, incluindo também instruções relacionadas com o método para a produção e ainda os métodos para pesquisar tais bancos de genes de expressão (por ex., Stratagene).

Utilizando os métodos de acordo com a invenção, é possível identificar ácidos nucleícos que codificam proteínas que apresentem uma actividade de ligação elevada para alfa-1,4-glucanos comparado com alfa-1,4-glucanos não fosforilados e/ou que apresentem actividade enzimática de fosforilação de alfa-1,4-glucano e necessitem de alfa-1,4-glucanos fosforilados como substrato.

Deste modo, os ácidos nucleícos obtidos por métodos de acordo com a invenção para identificar um ácido nucleíco são também objecto da presente invenção.

Um plasmídeo (A.t.-OKl-pGEM) contendo um cADN que codifica uma proteína de acordo com a invenção (A.t.-OKl) de Arabidopsis thaliana foi depositado em 08.03.2004 sob o número DSM16264 e um plasmídeo (pM150) contendo um cADN que codifica mais uma proteína de acordo com a invenção (O.s.-OK1) de Oryza sativa foi depositado em 24.03.2004 sob o número DSM16302 sob o Tratado de Budapeste em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha.

Foi surpreendentemente descoberto que plantas ou células vegetais geneticamente modificadas que apresentam uma actividade elevada duma proteína de acordo com a invenção, sintetizam um amido modificado que é modificado nas suas propriedades físico-químicas, especialmente o teor -36- de fosfato de amido ou a distribuição de fosfato comparado com amido sintetizado em plantas de tipo selvagem ou em células vegetais de tipo selvagem de modo que isto seja melhor adequado para aplicações especiais.

Deste modo, ainda descritas são as células vegetais geneticamente modificadas ou plantas geneticamente modificadas caracterizado por apresentarem uma elevada actividade enzimática duma proteína de acordo com a invenção comparado com as correspondentes plantas de tipo selvagem ou células vegetais de tipo selvagem não-geneticamente modificadas.

Um outro objecto da presente invenção é uma célula vegetal geneticamente modificada caracterizada por a modificação genética consistir na introdução de pelo menos uma molécula de ácido nucleíco exógena no genoma da planta, em que os códigos da molécula de ácido nucleíco exógena para uma proteína em que a sua sequência de aminoácidos codificadora tem um domínio de fosfohistidina tendo pelo menos uma identidade de 60% para o domínio de f osf ohistidina como identificado sob a SEQ ID N.° 5 e em que a proteína requer alpha-1 ,4-glucano fosforilado como substrato e introduz ligações de monoésteres de fosfato na posição C-3 duma molécula de glicose de alfa-1,4-glucano e em que a célula vegetal geneticamente modificada sintetiza um amido modificado que tem um elevado teor de fosfato de amido e/ou uma distribuição de fosfato modificado comparado com o amido dos tipos de plantas selvagens correspondentes.

Junto com a presente invenção, o termo "célula vegetal de tipo selvagem" significa que as células vegetais em questão foram usadas como material iniciador para a produção de células vegetais de acordo com a invenção, isto -37- é, a sua informação genética, além da modificação genética introduzida, corresponde à de uma célula vegetal de acordo com a invenção.

Junto com a presente invenção, o termo "planta de tipo selvagem" significa que as plantas em questão foram usadas como material iniciador para a produção de células vegetais de acordo com a invenção, isto é, a sua informação genética, além da modificação genética introduzida, corresponde à de uma planta de acordo com a invenção.

Junto com a presente invenção, o termo "correspondente" significa que, na comparação de vários objectos, os objectos em questão que são comparados uns com os outros foram mantidos sob as mesmas condições. Junto com a presente invenção, o termo "correspondente" juntamente com células vegetais de tipo selvagem ou plantas de tipo selvagem significa que as células vegetais ou plantas, que são comparadas umas com as outras cresceram sob as mesmas condições de cultivo e que tê a mesma idade (de cultivo). 0 termo "actividade elevada" na estrutura da presente invenção significa neste caso um aumento na expressão de genes endógenos que codificam proteínas de acordo com a invenção e/ou um aumento na quantidade de proteínas de acordo com a invenção nas células e/ou um aumento na actividade enzimática de proteínas de acordo com a invenção nas células. 0 aumento na expressão pode, por exemplo, ser determinado pela medição da quantidade de transcrições que codificam as proteínas de acordo com a invenção, por. ex., utilizando a análise "Northern blot" ou RT-PCR. As moléculas de ácido nucleíco que foram identificadas utilizando métodos de acordo com a invenção para -38- identificar um ácido nucleíco são preferivelmente usadas neste caso para determinar uma expressão elevada de proteínas de acordo com a invenção. Aqui, um aumento preferivelmente significa um aumento na quantidade de transcrições em comparação com as células correspondentes que não foram geneticamente modificadas em pelo menos 50%, em particular em pelo menos 70%, preferivelmente em pelo menos 85% e particularmente de preferência em pelo menos 100%. Um aumento na quantidade de transcrições que codifica uma proteina de acordo com a invenção também significa que as plantas que não têm transcrições detectáveis codificam uma proteina de acordo com a invenção, após modificação genética de acordo com a invenção, têm uma quantidade de transcrições que codificam uma proteina de acordo com a invenção. O aumento na quantidade de proteina duma proteína de acordo com a invenção, que resulta numa actividade aumentada desta proteína nas células da planta em questão, pode, por exemplo, ser determinado por métodos imunológicos tais como a análise "Western Blot", EDTA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) ou RIA (Radio ImmunoAssay). A produção de um anticorpo que pode ser usado para medir o aumento na quantidade de proteína usando métodos imunológicos é descrita mais abaixo como um exemplo (veja o Exemplo 11) . Aqui, um aumento preferivelmente significa um aumento na quantidade duma proteína de acordo com a invenção em comparação com células correspondentes que não foram geneticamente modificadas em pelo menos 50%, em particular em pelo menos 70%, preferivelmente em pelo menos 85% e particularmente de preferência em pelo menos 100%. Um aumento na quantidade duma proteína de acordo com a -39- invenção também significa que as plantas que não têm quantidade detectável duma proteína de acordo com a invenção, após modificação genética de acordo com a invenção, têm uma quantidade de proteína detectável de acordo com a invenção.

Numa outra forma de realização da presente invenção, as células vegetais de acordo com a invenção ou plantas de acordo com a invenção incluem células vegetais de plantas armazenadoras de amido ou plantas armazenadoras de amido. Plantas armazenadoras de amido são, por exemplo, plantas de milho, arroz, trigo, centeio, aveia, cevada, mandioca, batata, batata-doce, sagu, feijão-mungo, banana, ervilha, Arabidopsis, curcuma ou sorgo. Particularmente preferidas são as plantas de arroz, especialmente preferidas são as plantas de trigo.

Descrito como uma célula vegetal modificada geneticamente de acordo com a invenção ou uma planta modificada geneticamente de acordo com a invenção, em que a modificação genética consiste na introdução de pelo menos uma molécula de ácido nucleíco exógena no genoma da planta.

Neste contexto, o termo "modificação genética" significa a introdução de moléculas de ácido nucleíco exógenas homólogas e/ou heterólogas no genoma duma célula vegetal ou no genoma duma planta, em que a dita introdução destas moléculas leva a um aumento ou redução na actividade duma proteína de acordo com a invenção.

As células vegetais de acordo com a invenção ou plantas de acordo com a invenção são modificadas em relação à sua informação genética pela introdução duma molécula de ácido nucleíco exógena. A presença ou a expressão de moléculas de ácido nucleíco exógenas leva a uma alteração -40- fenotípica. Alteração "Fenotípica" preferivelmente significa neste caso uma alteração mensurável numa ou numa série de funções das células. Por exemplo, as células vegetais modificadas geneticamente de acordo com a invenção ou plantas modificadas geneticamente de acordo com a invenção apresentam um aumento ou redução na actividade duma proteína de acordo com a invenção devido à presença ou na expressão da molécula de ácido nucleíco introduzida.

Junto com a presente invenção, o termo "molécula de ácido nucleíco exógena" é entendido significar que tal molécula ou não ocorre naturalmente nas correspondentes células vegetais de tipo selvagem, ou não ocorre naturalmente na ordenação espacial específica em células vegetais de tipo selvagem, ou que está localizada num local no genoma da célula vegetal de tipo selvagem no qual não ocorre naturalmente. Preferivelmente, a molécula de ácido nucleíco exógena é uma molécula recombinante, a qual é composta por diferentes elementos, a combinação ou ordenação espacial específica da qual não ocorre naturalmente em células vegetais.

Em princípio, a molécula de ácido nucleíco exógena pode ser qualquer molécula de ácido nucleíco, que proporcione um aumento na actividade duma proteína de acordo com a invenção na célula vegetal ou planta.

Junto com a presente invenção, o termo "genoma" é para ser compreendido significar a totalidade de material genético presente numa célula vegetal. É do conhecimento dos especialistas na técnica, bem como o núcleo celular, outros compartimentos (por ex., plástidos, mitocôndria) também contêm material genético.

Descreve-se uma célula vegetal modificada -41 - geneticamente de acordo com a invenção ou uma planta modificada geneticamente de acordo com a invenção, em que a modificação genética consiste na introdução de pelo menos uma molécula de ácido nucleico exógena no genoma da planta e a molécula de ácido nucleico exógena codifica uma proteína de acordo com a invenção.

Descreve-se uma célula vegetal modificada geneticamente de acordo com a invenção ou uma planta modificada geneticamente de acordo com a invenção, em que a modificação genética consiste na introdução de pelo menos uma molécula de ácido nucleico exógena no genoma da planta e em que a molécula de ácido nucleico exógena inclui uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção, preferivelmente uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção, isolada de Arabidopsis thaliana, particularmente preferível isolada de arroz.

Um grande número de técnicas está disponível para a introdução de ADN numa célula hospedeira duma planta. Estas técnicas incluem a transformação de células vegetais com T-ADN usando Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes como o meio de transformação, a fusão de protoplastos, injecção, a electroporação de ADN, a introdução de ADN através duma aproximação biolística bem como outras possibilidades. 0 uso de transformação mediada por agrobactérias de células vegetais tem sido intensivamente investigado e adequadamente descrito em EP 120516; Hoekema, em: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sei. 4, 1-46 e por An et al. EMBO J. 4, (1985), 277-287. Para a transformação de batata, veja por exemplo, -42-

Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8, (1989), 29-33. A transformação de plantas monocotiledóneas através de vectores baseados em transformação por Agrobacterium tem também sido descrita (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22, (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6, (1994) 271-282;

Deng et al, Science in China 33, (1990) , 28-34; Wilmink et al., Plant Cell Reports 11, (1992), 76-80; May et al.,

Bio/Technoiogy 13, (1995), 486-492; Conner and Domisse, Int. J. Plant Sei. 153 (1992), 550-555; Ritchie et al,

Transgenic Res. 2, (1993), 252-265). 153 (1992), 550-555; Ritchie et al, Transgenic Res. 2, (1993), 252-265). Um sistema alternativo para a transformação de plantas monocotiledóneas é a transformação através da abordagem biolistica (Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994), 37- 48; Vasil et al., Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala et al., Plant Mol. Biol. 24, (1994) , 317-325; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79, (1990) , 625-631), transformação protoplástica, electroporação de células parcialmente permeabilizadas e a introdução de ADN através de fibras de vidro. Em particular, a transformação de milho tem sido descrita na literatura muitas vezes (cf. e.g. WO95/06128, EP0513849, EP0465875, EP0292435; Fromm et al. , Biotechnology 8, (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al., Plant

Cell 2, (1990) , 603-618; Koziel et al., Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc et al., Theor. Appl. Genet. 80, (1990), 721-726) . A transformação com sucesso de outros tipos de cereais também já tem sido descrita, por exemplo, para cevada (Wan and Lemaux, ver acima; Ritala et al., ver acima; Krens et al., Nature 296, (1982), 72-74) e para trigo (Nehra et al., Plant J. 5, (1994), 285-297). Todos os -43- métodos acima são adequados dentro da estrutura da presente invenção.

Entre outras coisas, as células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção podem ser diferenciadas de células vegetais de tipo selvagem e de plantas de tipo selvagem respectivamente porque contêm uma molécula de ácido nucleico exógena, a qual não ocorre naturalmente em células vegetais de tipo selvagem ou em plantas de tipo selvagem, ou porque tal molécula está presente integrada num local no genoma da célula vegetal de acordo com a invenção ou no genoma da planta de acordo com a invenção em que não ocorre em células vegetais de tipo selvagem ou plantas de tipo selvagem, isto é, numa ambiente genómico diferente. Além disso, células vegetais de acordo com a invenção e plantas de acordo com a invenção deste tipo diferem de células vegetais de tipo selvagem e plantas de tipo selvagem respectivamente visto que contêm pelo menos uma cópia da molécula de ácido nucleico exógena estavelmente integrada dentro do seu genoma, possivelmente além das cópias que ocorrem naturalmente de tal molécula nas células vegetais de tipo selvagem ou plantas de tipo selvagem. Se a(s) molécula(s) de ácido nucleico exógena(s) introduzidas nas células vegetais de acordo com a invenção ou nas plantas de tipo selvagem de acordo com a invenção for (forem) cópias adicionais de moléculas que já ocorreram naturalmente nas células vegetais de tipo selvagem ou plantas de tipo selvagem respectivamente, então as células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de tipo selvagem de acordo com a invenção podem ser diferenciadas de células vegetais de tipo selvagem ou plantas de tipo selvagem respectivamente em particular visto que esta (s) -44- cópia(s) adicional (ais) está (estão) localizada(s) em locais no genoma em que esta não ocorre (ou elas não ocorrem) em células vegetais de tipo selvagem ou plantas de tipo selvagem. Isto pode ser verificado, por exemplo, ao utilizar uma análise "Southern blot".

Além disso, as células vegetais de acordo com a invenção e plantas de acordo com a invenção podem ser diferenciadas de células vegetais de tipo selvagem ou plantas de tipo selvagem respectivamente de preferência por pelo menos uma das seguintes caracteristicas: Se a molécula de ácido nucleico exógena que tiver sido introduzida for heteróloga em relação à célula vegetal ou planta, então as células vegetais de acordo com a invenção ou plantas de acordo com a invenção têm transcrições das moléculas de ácido nucleico introduzidas. Estas podem ser verificadas, por exemplo, por análise "Northern blot" ou por RT-PCR (Reacção em Cadeia da Polimerase-Transcriptase Reversa).

Preferivelmente, as células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção que apresentam uma actividade elevada duma proteína de acordo com a invenção, contêm uma proteína, que é codificada por uma molécula de ácido nucleico introduzida. Isto pode ser demonstrado por métodos imunológicos, por exemplo, em particular por uma análise "Western blot". Células vegetais de acordo com a invenção e plantas de acordo com a invenção que apresentam uma actividade reduzida duma proteína de acordo com a invenção, mostram uma quantidade reduzida da proteína relevante comparado com as células vegetais de tipo selvagem ou plantas de tipo selvagem correspondentes que não tenham sido geneticamente modificadas, quando investigado utilizando os ditos métodos imunológicos. -45-

Se a molécula de ácido nucleíco exógena que tiver sido introduzida for homóloga em relação à célula vegetal ou planta, as células vegetais de acordo com a invenção ou plantas de acordo com a invenção podem ser diferenciadas de células vegetais de tipo selvagem ou plantas de tipo selvagem respectivamente devido à expressão adicional da molécula de ácido nucleíco introduzida, por exemplo. As células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção preferivelmente contêm transcrições da molécula de ácido nucleíco exógenas. Isto pode ser demonstrado por análise "Northern blot", por exemplo, ou usando o denominado PCR quantitativo.

Numa forma de realização especial, as células vegetais de acordo com a invenção e plantas de acordo com a invenção são células vegetais de plantas transgénicas ou plantas transgénicas respectivamente.

As células vegetais de acordo com a invenção e plantas de acordo com a invenção sintetizam um amido modificado comparado a amido isolado de células vegetais de tipo selvagem ou plantas de tipo selvagem que tinham sido geneticamente modificadas.

Junto com a presente invenção, o termo "amido modificado" significa que o amido tem caracteristicas físico-químicas modificadas comparado com o amido não-modificado que pode ser obtido de células vegetais de tipo selvagem ou plantas de tipo selvagem correspondentes.

As células vegetais de acordo com a invenção ou as plantas de acordo com a invenção sintetizam um amido modificado que tem um elevado teor de fosfato de amido e/ou uma distribuição de fosfato modificado comparado com amido isolado de células vegetais de tipo selvagem ou plantas de -46- tipo selvagem correspondentes.

Numa outra forma de realização do método de acordo com a presente invenção, as células vegetais de acordo com a invenção ou as plantas de acordo com a invenção sintetizam um amido modificado que tem uma razão de C-3/C-6 modificada do fosfato de amido comparado com as correspondentes células vegetais de tipo selvagem que não tinham sido geneticamente modificadas ou plantas que não tinham sido geneticamente modificadas. Especialmente preferido neste caso são os amidos que apresentam uma fracção elevada de fosfato de amido ligado na posição C-3 comparado com fosfato de amido ligado na posição C-6, em comparação com os amidos correspondentes isolados de células vegetais de tipo selvagem que não tinham sido geneticamente modificadas ou plantas que não tinham sido geneticamente modificadas.

Junto com a presente invenção, o termo "distribuição de fosfato" deverá ser compreendido como a fracção do fosfato de amido ligado na posição C-2, posição C-3 ou posição C-6 de uma molécula de glicose relativa ao teor de fosfato de amido total de alfa-1,4-glucanos.

Junto com a presente invenção, o termo "razão C-2/C-3/C-6" deverá ser compreendido como a fracção do fosfato de amido na qual o fosfato de amido de um alfa-1,4-glucano ligado respectivamente na posição C-2, posição C-3 ou posição C-6 contribui para o teor de fosfato de amido total do alfa-1,4-glucano em questão (posição C-2 + posição C-3 + posição C-6).

Junto com a presente invenção, o termo "razão C-3/C-6" deverá ser compreendido como a fracção do fosfato de amido na qual o fosfato de amido de um alf a-1,4-glucano -47- ligado respectivamente na posição C-3 e na posição C-6 contribui para a soma do fosfato de amido ligado na posição C-3 e na posição C-6 (posição C-3 + posição C-6) do alfa-1,4-glucano em questão.

Um outro objecto da presente invenção é células vegetais de acordo com a invenção ou plantas de acordo com a invenção que sintetizam um amido modificado, em que o amido modificado é caracterizado por ter um elevado teor de fosfato covalentemente ligado ao amido na posição C-3 da molécula de glicose comparado com amido de células vegetais de tipo selvagem ou plantas de tipo selvagem correspondentes.

Um outro objecto da presente invenção é plantas contendo células vegetais de acordo com a invenção.

Descrição de sequências SEQ ID N.° 1: Sequência de ácido nucleíco contendo a região de codificação da proteina A.t.-OKl de Arabidopsis thaliana. Esta sequência é inserida nos vectores OKl-pGEM-T e 0Kl-pDEST™17. SEQ ID N.° 2: Sequência de aminoácidos que codifica a proteina A.t.-OKl de Arabidopsis thaliana. Esta sequência pode ser derivada da sequência de ácido nucleíco mostrada sob SEQ ID N.° 1. SEQ ID N.° 3: Sequência de ácido nucleíco contendo a região de codificação da proteína O.s.-OKl de Oryza sativa. Esta sequência é inserida no vector M150. SEQ ID N.° 4: Sequência de aminoácidos que codifica a proteína O.s.-OKl de Oryza sativa. Esta sequência pode ser derivada da sequência de ácido nucleíco mostrada sob -48- SEQ ID N.0 3. SEQ ID N.° 5: Sequência de peptídeos que codifica o domínio de fosfohistidina das proteínas OKI de Arabidopsis thaliana, Oryza sativa e Sorgo bicolor. SEQ ID N.° 6: Sequência de peptídeos contida na sequência de aminoácidos que codifica a proteína H.v.-OKl de cevada. SEQ ID N.° 7: Sequência de peptídeos contida na sequência de aminoácidos que codifica a proteína H.v.-OKl de cevada. SEQ ID N.° 8: Sequência de peptídeos contida na sequência de aminoácidos que codifica a proteína H.v.-OKl de cevada. SEQ ID N.° 9: Sequência de ácido nucleíco parcial que codifica uma proteína H.v.-OKl de cevada. Esta sequência de ácido nucleíco tem sido identificada através das sequências de peptídeos mostradas sob SEQ ID N.° 6, SEQ ID N.° 7 e SEQ ID N.° 8 utilizando a ferramenta "Blast search" na base de dados TIGR. SEQ ID N.° 10: Sequência de aminoácidos parcial que codifica uma proteína H.v.-OKl de cevada. Esta sequência de aminoácidos mostrada pode ser derivada da sequência de ácido nucleíco mostrada sob SEQ ID N.° 9. SEQ ID N.° 11: Sequência de peptídeos contida na sequência de aminoácidos que codifica uma proteína S.t.-OKl de batata. SEQ ID N.° 12: Sequência de peptídeos contida na sequência de aminoácidos que codifica uma proteína S.t.-OKl de batata. -49- SEQ ID N.° 13: Sequência de peptídeos contida na sequência de aminoácidos que codifica uma proteína S.t.-OKl de batata. SEQ ID N.° 14: Sequência de peptídeos contida na sequência de aminoácidos que codifica a proteína S.t.-OKl de batata. SEQ ID N.° 15: Sequência de ácido nucleíco parcial que codifica uma proteína S.t.-OKl da batata. Esta sequência de ácido nucleíco tem sido identificada através das sequências de peptídeos mostradas sob SEQ ID N.° 11, SEQ ID N.° 12 e SEQ ID N.° 13 e SEQ ID N.° 14 utilizando a ferramenta "Blast Search" na base de dados TIGR. SEQ ID N.° 16: Sequência de aminoácidos parcial que codifica uma proteína S.t.-OKl de batata. A sequência de aminoácidos mostrada pode ser derivada da sequência de ácido nucleíco mostrada sob SEQ ID N.° 15. SEQ ID N.° 17: Sequência de peptídeos contida na sequência de aminoácidos que codifica uma proteína S.b.-OKl de milho painço. SEQ ID N.° 18: Sequência de peptídeos contida na sequência de aminoácidos que codifica uma proteína S.b.-OKl de milho painço. SEQ ID N.° 19: Sequência de peptídeos contida na sequência de aminoácidos que codifica uma proteína S.b.-OKl de milho painço. SEQ ID N.° 20: Sequência de peptídeos contida na sequência de aminoácidos que codifica uma proteína S.b.-OKl de milho painço. SEQ ID N.° 21: Sequência de ácido nucleíco parcial que codifica uma proteína S.b.-OKl de milho painço. Esta sequência de ácido nucleíco tem sido identificada através -50- das sequências de peptídeos mostradas sob SEQ ID N.° 17, SEQ ID N.° 18 e SEQ ID N.° 19 e SEQ ID N.° 20 utilizando a ferramenta "Blast Search" na base de dados TIGR. SEQ ID N.° 22: Sequência de aminoácidos parcial que codifica uma proteína S.b.-OKl de milho painço. A sequência de aminoácidos mostrada pode ser derivada da sequência de ácido nucleíco mostrada sob SEX ID N.° 21. SEQ ID N.° 23: Sequência de peptídeos contida na sequência de aminoácidos que codifica a proteína T.a.-OKl de trigo. SEQ ID N.° 24: Sequência de peptídeos contendo a sequência de aminoácidos que codifica a proteína T.a.-OKl de trigo. SEQ ID N.° 25: Sequência de ácido nucleíco parcial que codifica uma proteína T.a.-OKl de trigo. Esta sequência de ácido nucleíco tem sido identificada através das sequências de peptídeos mostradas sob SEQ ID N.° 23 e SEQ ID N.° 24 utilizando a ferramenta "Blast Search" na base de dados TIGR. SEQ ID N.° 26: Sequência de aminoácidos parcial que codifica uma proteína T.a.-OKl de trigo. Esta sequência de aminoácidos mostrada pode ser derivada da sequência de ácido nucleíco mostrada sob SEQ ID N.° 25.

Descrição das Figuras

Fig.l: Gel de acrilamida desnaturante para identificação de proteínas de Arabidopsis thaliana, que preferencialmente se liga a amido não fosforilado em comparação com amido fosforilado. Um marcador de peso molecular de proteínas Standard é mostrado na marca "M". -51 -

Proteínas obtidas após incubação da preparação de controlo C do Exemplo - 1 d) são mostradas na marca Extractos de proteína de Arabidopsis thaliana, obtidos após incubação com amido não fosforilado, isolado de folhas de um mutante sexl-3 de Arabidopsis thaliana (Preparação B, Exemplo 1 d) ) , são mostrados na marca "K". Extractos de proteína de Arabidopsis thaliana, obtidos após incubação com amido, isolado de folhas duma Arabidopsis thaliana sexl-3 que foi fosforilada retrospectivamente in vitro com uma proteína RI (Preparação A, Exemplo 1 d), são mostrados na marca "P". Quando a electroforese terminou, o gel de acrilamida foi corado com Coomassie Blue.

Fig. 2: Demonstração da actividade de autofosforilação da proteína OKI. Fig. 2A) mostra um gel de acrilamida (SDS) desnaturante corado com Coomassie Blue na completação da electroforese. Figure 2 B) mostra a autoradiografia de um gel de acrilamida (SDS) desnaturante. As mesmas quantidades das mesmas amostras foram aplicadas a cada um dos dois géis. M: Marcador de peso molecular de proteína Standard; RI: Amostra de recipiente de reacção 1 de acordo com o Exemplo 7 (após incubar uma proteína OKI com ATP) ; R2: Amostra de recipiente de reacção 2 de acordo com o Exemplo 7 (após incubar uma proteína OKI com ATP a proteína foi aquecida a 95°C); R3: Amostra de recipiente de reacção 3 de acordo com o Exemplo 7 (após incubar uma proteína OKI com ATP a proteína foi incubada em 0,5 M HCI); R4: Amostra de recipiente de reacção 4 de acordo com o Exemplo 7 (após incubar uma proteína OKI com ATP a proteína foi incubada em 0,5 M NaOH).

Fig. 3: Demonstração da actividade de fosforilação de amido duma proteína OKI (ver Exemplo 6). A proteína OKI -52- foi incubada com amido não fosforilado isolado de folhas de um mutante sexl-3 de Arabidopsis thaliana (Preparação A,) e amido isolado de folhas de um mutante sexl-3 de Arabidopsis thaliana, que foi fosforilada retrospectivamente in vitro com uma proteína Rl (Preparação B) . A preparação C é a mesma que a Preparação B, com a excepção de que esta Preparação C foi incubada sem a proteína OKI. Dois testes independentes foram efectuados para cada preparação (A, B, C) (Teste 1 e Teste 2) . As respectivas quantidades foram mostradas, medidas em cpm (contagens por minuto), em fosfato marcado 33P, que foi introduzido no amido não fosforilado (Preparação A) e amido fosforilado (Preparação B) .

Fig. 4: Comparação das posições do átomo-C de moléculas de glicose do amido, que foi fosforilado duma proteína Rl e duma proteína OKI respectivamente (ver Exemplo 9) . A proteína OKI (Preparação A) foi incubada na presença de ATP marcado com 33P com amido isolado de folhas de um mutante sexl-3 de Arabidopsis thaliana, que foi fosforilada retrospectivamente in vitro com uma proteína Rl.). A proteína Rl (preparação B) foi incubada na presença de ATP marcado com 33P com amido isolado de folhas de um mutante sexl-3 de Arabidopsis thaliana. Após a incubação ter sido concluída, uma hidrólise total do amido foi efectuada e os produtos da hidrólise obtidos foram separados utilizando cromatografia HPAE. Como Standard, glicose-6-fosfato e glicose-3-fosfato foram adicionados aos produtos da hidrólise antes da separação. Os produtos da hidrólise separados através de cromatografia HPAE foram recolhidos em fracções individuais. 0 glicose-6-fosfato adicionado eluído com fracção 15 e o glicose-3-fosfato -53- adicionado com fracção 17. As fracções obtidas foram subsequentemente investigadas em relação à presença de fosfato marcado radioactivamente. A quantidade de fosfato marcado com 33P medido nas fracções individuais, medido em cpm (contagens por minuto), que foi introduzida nos produtos de hidrólise do amido fosforilado pela proteína OKI ou proteína Rl, é mostrada graficamente.

Fig. 5 Demonstração da autofosforilação da proteína OKI. Figura 5 (A) mostra uma "Western Blot". Figure 5 B) mostra a autoradiograf ia de um gel de acrilamida (SDS) desnaturante. As mesmas quantidades das mesmas amostras foram aplicadas a cada um dos dois géis. A proteína OKI foi incubada tanto com o ATP marcado radioactivamente de forma aleatória como com o ATP marcado radioactivamente especificamente na posição gama. Quando a incubação terminou, as proteínas foram aquecidas a 30°C ou 95°C, ou incubadas em 0,5 M NaOH ou 0,5 M HCI respectivamente.

Fig. 6 Demonstração da transferência de resíduo de beta-fosfato de ATP para amido numa reacção catalisada por uma proteína OKI. Tanto o ATP especificamente marcado com 33P na posição gama como o 33P ATP de forma aleatória foi usado para fosforilar amido, que tinha sido fosforilado in vitro através de uma proteína Rl e isolada de folhas de um mutante sexl-3 de Arabidopsis thaliana, através de uma proteína OKI. Não foi adicionada nenhuma proteína OKI em qualquer das experiências designadas como "controlo". Cada preparação foi testada duas vezes, independentemente uma da outra. Os resultados de ambos os testes são mostrados.

Fig. 7 Análise "Western Blot" de extractos de proteínas de plantas usando um anticorpo contra a proteína OKI de Arabidopsis thaliana. Extractos de proteínas de -54- folhas das seguintes plantas são mostrados: Ara, Arabidosis thaliana; 51, 54, 55, 67, 72, 73, 79, 62, 63, 64, 65, 69,

66, 68 são linhas independentes da transformação 385JH; D tipo selvagem Solanum tuberosum cv Désirée. Métodos Gerais A seguir são descritos métodos que podem ser usados para realizar o método de acordo com a invenção. Estes métodos constituem formas de realização especificas da presente invenção mas não restringem a presente invenção a estes métodos . Os especialistas na técnica sabem que podem implementar a invenção da mesma forma modificando os métodos descritos e/ou substituindo partes individuais dos métodos por partes alternativas dos métodos. 1. Produção de extractos de proteínas a partir de tecido de plantas a) Produção de extractos de proteínas a partir de tecidos de plantas 0 material foliar é congelado em nitrogénio líquido imediatamente após a colheita e seguidamente é homogeneizado no almofariz em nitrogénio líquido. 0 material foliar reduzido é misturado com cerca de 3,5 vezes o volume (relativo ao peso do material foliar usado) de tampão de ligação frio (4°C) e macerado durante 2x10 s utilizando um Ultraturrax (velocidade máxima). Após o primeiro tratamento com um Ultraturrax, o material foliar reduzido é arrefecido em gelo antes do segundo tratamento ser efectuado. O material foliar reduzido é então passado -55- por uma rede de nylon de 100 pm e centrifugado durante 2 0 min (recipiente de centrifugação de 50 ml, 20.000xg, 4°C). b) Precipitação das proteínas contidas nos extractos de proteínas 0 sobrenadante obtido a seguir à centrifugação de acordo com o Passo a) é removido e o seu volume determinado. Para precipitar proteínas, sulfato de amónio é adicionado continuamente ao sobrenadante durante um período de 30 minutos enquanto é agitado em gelo para uma concentração final de 75% (peso/volume). 0 sobrenadante é subsequentemente incubado durante uma hora em gelo enquanto é agitado. As proteínas precipitadas do sobrenadante são peletizadas a 20.000xg e 4°C durante 10 min e o pellet é subsequentemente absorvido em 5 ml de tampão de ligação, isto é, as proteínas presentes no pellet são dissolvidas. c) Dessalinização das proteínas precipitadas

As proteínas dissolvidas são dessalinizadas utilizando uma coluna de PD10 cheia com Sephadex G25 (Amersham Bioscience, Freiburg, Prod. N.° colunas: 17-0851-01, Prod. No. Sephadex G25-M: 17-0033-01) a uma temperatura de 4°C, isto é, o sulfato de amónio usado para a precipitação sob o passo b) é separado das proteínas dissolvidas. A coluna PD10 é equilibrada com tampão de ligação antes das proteínas dissolvidas de acordo com o Passo b) serem aplicadas. Para este fim, 5 ml de tampão de ligação são distribuídos pela coluna em cada caso. Subsequentemente, 2,5 ml da solução de proteína obtida de acordo com o Passo b) são adicionados a cada coluna antes das proteínas serem eluídas da coluna com 3,5 ml de tampão de ligação. -56- d) Determinação da concentração de proteínas A concentração de proteínas é determinada com um "Bradford assay" (Biorad, Munich, Prod. No. 500-0006 (Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72, 248-254)). e) Composição do tampão de ligação

Tampão de ligação: 50 mM HEPES/NaOH (ou KOH), pH 7.2

1 mM EDTA 2 mM Ditioeritritol (DTE) 2 mM Benzamidina 2 mM ácido ε-aminocapróico

0,5 mM PMSF 0,02 % Triton X-100 2. Isolamento de amido de folhas a) Isolamento de grânulos de amido a partir de tecidos de plantas O material foliar é congelado em nitrogénio líquido imediatamente após a colheita. O material foliar é homogeneizado em partes no almofariz sob nitrogénio líquido e absorvido num total de aproximadamente 2,5 vezes o volume (peso/volume) de tampão de amido. Além disso, esta suspensão é novamente homogeneizada num misturador "Waring Blender" durante 20 s à velocidade máxima: O homogeneizado é passado por uma rede de nylon (largura de rede 100 pm) e centrifugado durante 5 minutos a l.OOOxg. O sobrenadante com as proteínas solúveis é descartado. b) Purificar o amido isolado de tecidos de plantas

Depois de remover o material verde que fica no topo do amido enxaguando o material verde com tampão de amido, o pellet que contém o amido obtido do Passo a) é absorvido no tampão de amido e a seguir passado por redes de nylon com larguras diferentes (pela ordem 60 pm, 30 pm, 20 pm) . O filtrato é centrifugado utilizando uma almofada Percoll de -57- 10 ml (95% (v/v) (Pharmacia, Uppsala, Suécia), 5% (v/v) 0.5M HEPES-KOH pH7.2) (Tubo Correx, 15 min, 2.000xg). O sedimento obtido após esta centrifugação é re-suspenso uma vez em tampão de amido e de novo centrifugado (5 min, 1.OOOxg). c) Remoção de proteínas ligadas ao amido

Seguindo o Passo b), são obtidos grânulos de amido, que contêm proteínas ligadas ao amido. As proteínas ligadas à superfície de grânulos de amido são removidas incubando quatro vezes com 0,5 % de SDS (lauril sulfato de sódio) durante 10-15 minutos em cada caso à temperatura ambiente sob agitação. Cada passo de lavagem é seguido por uma centrifugação (5 min, 5.OOOxg), para separar os grânulos de amido do respectivo tampão de lavagem. d) Purificar o amido gue tenha sido liberto de proteínas O amido obtido do Passo c), que tenha sido liberto de proteínas ligadas à sua superfície, é subsequentemente removido incubando quatro vezes com tampão de lavagem durante 10-15 minutos em cada caso à temperatura ambiente sob agitação. Cada passo de lavagem é seguido por uma centrifugação (5 min, 1.OOOxg), para separar os grânulos de amido do respectivo tampão de lavagem. Estes passos de purificação servem principalmente para remover o SDS usado nas incubações no Passo c). A quantidade de amido isolado no Passo d) é determinada fotometricamente. Após diluição adequada, a densidade óptica da suspensão de amido é medida contra uma curva de calibração no comprimento de onda de 600 nm. O alcance linear da curva de calibração encontra-se entre 0 e 0,3 unidades de extinção. -58-

Para produzir curvas de calibração, amido, por exemplo isolado de folhas de um mutante sexl-3 de Arabidopsis thaliana, é seco sob vácuo, pesado e absorvido num volume definido de água. A suspensão assim obtida é diluída com água em vários passos numa razão de 1 para 1 em cada caso até uma suspensão de cerca de 5 pg de amido por ml de água ser obtida. As suspensões obtidas por passos de diluição individuais são medidas no fotómetro num comprimento de onda de 600 nm. Os valores de absorção obtidos para cada suspensão são projectados contra a concentração de amido na respectiva suspensão. A curva de calibração obtida deverá seguir uma função matemática linear num alcance de 0 pg de amido por ml de água a 0,3 pg de amido por ml de água. f) Armazenameto de amido isolado 0 amido tanto pode ser usado directamente sem posterior armazenamento para futuros testes, como armazenado em alíquotas em recipientes Eppendorf de 1,5 mL a -20°C. Tanto o amido congelado como o amido não armazenado, acabado de isolar pode ser usado, se necessário, para os métodos descritos na presente invenção relacionados, por exemplo, com teste de ligação e/ou fosforilação in vitro. g) Composição de tampões utilizados 1 x tampão de amido: 20 mM HEPES-KOH, pH 8,0

0,2 mM EDTA 0,5 % Triton X-100

Tampão de lavagem: 50 mM HEPES/KOH, pH 7,2 3. Expressão recombinante de uma proteína de fosforilação de amido identificada -59- a) Produção de um vector de expressão bacteriano contendo um cADN, que codifica uma proteína de fosforilação de amido 0 cADN que codifica uma proteína de fosforilação de amido pode ser amplificado, por exemplo, utilizando mARN ou poli-A-e-mARN de tecidos de plantas como um "molde", através de uma reacção em cadeia da polimerase (PCR). Para este fim, foi primeiro usada uma transcriptase reversa para a produção de uma cadeia de cADN, que é complementar a um mARN, que codifica uma proteína de fosforilação de amido, antes da cadeia de cADN em questão ser amplificada através da ADN polimerase. Os denominados "kits" contendo substâncias, enzimas e instruções para efectuar reacções de PCR estão disponíveis para aquisição (por ex., SuperScript™ One-Step RT-PCR System, Invitrogen, Prod. N.°: 10928-034. O cADN amplificado que codifica uma proteína de fosforilação de amido pode então ser clonado num vector de expressão bacteriano por ex., pDEST™17(Invitrogen). pDEST™17 contém o promotor T7 que é usado para iniciar a transcrição da ARN polimerase T7. Além disso, o vector de expressão pDEST™17 contém uma sequência Shine Dalgarno na direcção 5' do promotor T7 seguido por um codão de iniciação (ATG) e por uma denominada cauda de histidina. Esta cauda de histidina consiste em seis codões directamente uns a seguir aos outros, em que cada um codifica o aminoácido histidina e estão localizados na grelha de leitura do dito codão de iniciação. A clonagem de um cADN que codifica uma proteína de fosforilação de amido em pDEST™17 é efectuada de tal forma que ocorre uma fusão traducional entre os codões para o codão de iniciação, a cauda de histidina e o cADN que codifica a proteína de fosforilação de amido. Como -60- resultado disto, após a transcrição iniciada no promotor T7, e subsequente tradução, é obtida uma proteína de fosforilação de amido, que contém aminoácidos adicionais contendo a cauda de histidina no seu N-terminal.

No entanto, outros vectores, que são adequados para expressão em microrganismos, também podem ser usados para a expressão de uma proteína de fosforilação de amido. Vectores de expressão e estirpes de expressão associadas conhecidos pelos especialistas na técnica também estão disponíveis para aquisição num revendedor adequado em combinações adequadas. b) Produção de clones de expressão em Escherichia coli

Primeiro que tudo, uma estirpe de E. coli competente para transformação adequada, a qual cromossomaticamente codifica uma ARN polimerase T7, é transformada com plasmídeo de expressão produzido sob o Passo a), e subsequentemente incubada durante a noite a 30°C em meio de cultura solidificado com ágar. As estirpes de expressão adequadas são, por exemplo, estirpes BL21 (Invitrogen Prod. N.°: C6010-03) , as quais cromossomaticamente codificam uma ARN polimerase T7 sob o controlo de um promotor induzível por IPTG (lacZ).

Colónias de bactérias resultando duma transformação podem ser investigadas usando métodos conhecidos pelos especialistas na técnica para ver se elas contêm o plasmídeo de expressão necessário contendo um cADN que codifica a proteína de fosforilação de amido. Ao mesmo tempo, são obtidos os clones de expressão. c) Expressão de uma proteína de fosforilação de amido em Escherichia coli -61 -

Primeiro que tudo, é produzida uma cultura preliminar. Para fazer isto, um clone de expressão obtido de acordo com o Passo b) é semeado em 30 ml de caldo nutritivo Terrific Broth (meio TB) contendo um antibiótico para selecção da presença do plasmideo de expressão, e incubado durante a noite a 30°C sob agitação (250 rpm). A cultura principal para a expressão de uma proteína de fosforilação de amido é então produzida Para fazer isto, em cada caso, balões de Erlenmeyer de 1 litro, cada um contendo 300 ml de meio TB, pré-aquecidos a 30°C, e um antibiótico para selecção na presença do plasmideo de expressão são cada um semeados com 10 ml de uma pré-cultura apropriada e incubada a 30°C sob agitação (250 rpm) até que uma densidade óptica (medida a um comprimento de onda de 600 nm (OD600) de aproximadamente 0,8 seja alcançada.

Se, para a expressão de uma proteína de fosforilação de amido, for usado um plasmideo de expressão, em que a expressão da proteína de fosforilação de amido é iniciada através de um sistema induzível (por ex., o vector de expressão pDEST™17 em estirpes E. coli BL21, induzível através de IPTG) , então ao alcançar um OD6oo de aprox. 0,8, o indutor relacionado (por ex., IPTG) é adicionado à cultura principal. Após a adição do indutor, a cultura principal é incubada a 30°C sob agitação (250 rpm) até um OD6oo de cerca de 1,8 ser alcançado. A cultura principal é então arrefecida durante 30 minutos em gelo antes das células da cultura principal serem separadas do meio da cultura por centrifugação (10 minutos a 4.000xg e 4°C). 4. Purificação de uma proteína de fosforilação de amido -62- a) Quebra de células expressando uma proteína de fosforilação de amido

As células obtidas no Passo c) , Item 3, "Métodos Gerais" são re-suspensas em tampão de lise. Ao fazer isto, cerca de 4 ml de tampão de lise é adicionado a cerca de 1 g de células. AS células re-suspensas são então incubadas durante 30 minutos em gelo antes de serem partidas utilizando uma sonda de ultra-som (Baudelin Sonoplus UW 2070, Baudelin electronic, Berlin, definições: Ciclo 6, 70%, 1 minuto) sob condições de arrefecimento contínuas através do gelo. Aqui deve-se ter cuidado para assegurar que a suspensão da célula não é demasiado aquecida durante o tratamento com ultra-som. A suspensão obtida após o tratamento com ultra-som é centrifugada (12 minutos a 20.000xg, 4°C) e o sobrenadante obtido após a centrifugação é filtrado utilizando um filtro com um tamanho de poro de 4 5 ym. b) Purificação de uma proteína de fosforilação de amido

Se a proteína de fosforilação de amido expressa em células de E. coli for uma proteína de fusão com uma "cauda de His", então a purificação pode dar-se usando iões níquel, aos quais a "cauda de His" se liga com grande afinidade. Para fazer isto, 25 ml do filtrato obtido no Passo d) é misturado com 1 ml de suspensão de Ni-agarose (Qiagen, Prod. N.°: 30210) e incubado durante 1 hora em gelo. A mistura de suspensão de Ni-agarose e filtrato é subsequentemente distribuída por uma coluna de polistireno (Pierce, Prod. N.°: 29920). O produto, que corre pela coluna, é retirado. A coluna é a seguir lavada adicionando 8 ml de tampão de lise, o produto, que corre pela coluna, é -63- novamente retirado. Então dá-se a eluição da proteína de fosforilação de amido por adição fraccionada à coluna de 1 ml de tampão EI duas vezes, seguido por 1 ml de tampão E2 uma vez e subsequentemente 1 ml de tampão E3 cinco vezes. 0 produto, que corre pela coluna, o qual é produzido ao adicionar a fracção individual do tampão de eluição apropriado (tampão El, E2, E3) para a coluna, é recolhido em fracções separadas. Alíquotas destas fracções são subsequentemente analisadas através de electroforese de gel de acrilamida SDS desnaturante seguido por coramento de Coomassie Blue. Estas fracções, que contêm a proteína de fosforilação de amido em quantidade insuficiente e pureza satisfatória, são purificadas e concentradas utilizando filtragem pressurizada a 4°C. A filtragem pressurizada pode ser efectuada, por exemplo, usando uma célula Amicon (Amicon Ultrafiltration Cell, Model 8010, Prod. N.°: 5121) usando uma membrana Diaflo PM30 (Millipore, Prod. N.°: 13212) a 4°C. Outros métodos conhecidos pelos especialistas na técnica também podem, no entanto, ser usados para a concentração. c) Composição de tampões utilizados

Tampão de lise: 50 mM HEPES 300 mM NaCl 10 mM Imidazole pH 8,0 (ajustar com NaOH) 1 mg/ml Lisozima (adicionar imediatamente após utilização do tampão)

Tampão de eluição El: 50 mM HEPES 300 mM NaCl 50 mM Imidazole pH 8,0 (ajustar com NaOH)

Tampão de eluição E2: 50 mM HEPES 300 mM NaCl -64- 75 mM Imidazole pH 8,0 (ajustar com NaOH)

Tampão de eluição E3: 50 mM HEPES 300 mM NaCl 250 mM Imidazole pH 8,0 (ajustar com NaOH) 1/4 pastilha por 10 ml de inibidores de protease

Complete sem EDTA, (Roche Product No.: 1873580) (adicionar imediatamente antes de utilizar o tampão) 5. Expressão recombinante de uma proteína Rl A expressão recombinante de uma proteína Rl é descrita na literatura (Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171; Mikkelsen et al., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532), mas também pode ser efectuada de acordo com os métodos relacionados com a expressão recombinante de uma proteína de fosforilação de amido descritos acima sob o Item 3, "Métodos Gerais". 6. Purificação de uma proteína Rl A expressão recombinante de uma proteína Rl é descrita na literatura (Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166- 7171; Mikkelsen et al.,Mikkelsen et al., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532), mas também pode ser efectuada de acordo com os métodos relacionados com a purificação de uma proteína de fosforilação de amido descritos acima sob o Item 4, "Métodos Gerais" se uma proteína de fusão, que contém uma cauda de Histidina, for produzida pela expressão de Rl em células E. coli. 7. Produção in vitro de amido fosforilado a partir de amido não fosforilado a) Fosforilação in vitro de amido não fosforilado -65-

Amido, que não contém fosfato de amido (por ex., . isolado de folhas de Arabidopsis thaliana mutantes sexl-3 utilizando os métodos descritos acima sob o Item 2, "Métodos Gerais"), é misturado com tampão RI e com a proteína RI purificada (cerca de 0,25 pg da proteína RI por mg de amido) para produzir um teor de amido de 25 mg por ml. Esta preparção de reacção é incubada durante a noite

(cerca de 15 h) à temperatura ambiente sob agitação. A ligação de RI ao amido presente na preparção de reacção é removida na conclusão da reacção lavando quatro vezes com cerca de 800 μΐ 0,5 % SDS em cada caso. Subsequentemente, o SDS continua presente em amido fosforilado in vitro é removido lavando cinco vezes com 1 ml de tampão de lavagem em cada caso. Todos os passos de lavagem são efectuados à temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos sob agitação.

Cada passo de lavagem é seguido por uma centrifugação (2 min, lO.OOOxg), para separar os grânulos de amido do respectivo tampão de SDS ou tampão de lavagem.

Tampão RI: 50 mM HEPES/KOH, pH 7,5

1 mM EDTA 6 mM MgC12

0,5 mM ATP

Tampão de lavagem: 50 mM HEPES/KOH, pH 7,2 8. Ligação de proteínas a amido fosforilado ou amido não fosforilado a) Isolamento de complexos de proteínas de P-amido ou complexos de proteínas de amido não fosforilado

Cerca de 50 mg de P-amido ou cerca de 50 mg de amido não fosforilado é re-suspenso em preparado de cerca de 800 μΐ de extracto de proteína em cada caso. A concentração de extracto de proteína deve ser cerca de 4 mg -66- a 5 mg por ml em cada caso. A incubação de P-amido ou amido não fosforilado com extractos de proteína é efectuada à temperatura ambiente durante 15 minutos a 4°C sob agitação Quando a incubação terminar, as preparações de reacção são centrifugadas utilizando uma almofada Percoll (4 ml) (15 minutos, 3500 rpm, 4°C). Depois da centrifugação, as proteínas que não estão ligadas ao amido fosforilado ou P-amido serão encontradas no sobrenadante e podem ser removidas com uma pipeta Pasteur. O sobrenadante é descartado. O pellet sedimentado que contém o P-amido e amido não fosforilado, incluindo as proteínas ligadas aos respectivos amidos (complexos de proteínas de P-amido ou respectivamente complexos de proteínas de amido não fosforilado), obtido após a centrifugação é lavado duas vezes com 1 ml de tampão de lavagem em cada caso (ver acima, "Métodos Gerais" sob item 7.b) incubando durante 3 minutos a 4°C em cada caso sob agitação. O passo de lavagem é seguido por uma centrifugação (5 minutos, 8000 rpm, 4°C numa centrífuga de mesa, Hettich EBA 12R) para separar o P-amido ou respectivamente amido não fosforilado do tampão de lavagem. b) Dissolvendo as proteínas ligadas nos complexos de proteínas de P-amido ou respectivamente complexos de proteína de amido não fosforilado

Os complexos de proteínas de P-amido ou respectivamente complexos de proteína de amido não fosforilado obtidos no Passo a) são re-suspensos em cerca de 150 μΐ SDS de tampão de teste e incubados à temperatura ambiente durante 15 minutos sob agitação. O P-amido ou respectivamente amido não fosforilado é subsequentemente removido das proteínas dissolvidas por centrifugação (1 -67- minuto, 13.000 rpm, temperatura ambiente, centrífuga de mesa Eppendorf). O sobrenadante obtido após a centrifugação é centrifugado novamente para remover qualquer resíduo de P-amido ou respectivamente amido não fosforilado (1 minuto, 13.000 rpm, temperatura ambiente, centrífuga de mesa Eppendorf) e removido. Como resultado, são obtidas as proteínas dissolvidas, que ligam ao P-amido ou respectivamente amido não fosforilado. c) Composição de tampões utilizados

Tampão de teste SDS: 187,5 mM Tris/HCl pH 6,8

6 % SDS 30% Glicerina -0,015% Bromofenol azul 60 mM DTE (adicionar fresco)

Percoll: Percoll é dialisado durante a noite contra uma solução composta de e 25 mM HEPES / KOH, pH 7.0 9. Separação de proteínas, que ligam a P-amido e/ou amido não fosforilado

As proteínas dissolvidas obtidas no Passo c) sob item 8. "Métodos Gerais" relacionadas com a ligação de proteínas a P-amido ou respectivamente amido não fosforilado são incubadas durante 5 minutes a 95°C em cada caso e subsequentemente separadas utilizando electroforese de gel de poliacrilamida desnaturante. Ao fazê-lo, é aplicado um volume igual ao gel de acrilamida em cada caso para as proteínas dissolvidas obtidas na ligação ao P-amido e para as obtidas na ligação ao amido não fosforilado. 0 gel obtido quando a electroforese terminou é corado pelo menos durante a noite com o coloído Coomassie (Roth, Karlsruhe, Roti-Blue Rod. No.: A152.1) e subsequentemente descorado em 30 % metanol, 5 % ácido acético, ou em 25% metanol. -68- 10. Identificação e isolamento de proteínas que ligam a P-amido e/ou amido não fosforilado a) Identificação de proteínas com actividade de ligação aumentada em relação a P-amido em comparação com amido não fosforilado

Proteínas, que, após separação através de electroforese de gel de acrilamida e subsequente visualização através de coramento (ver acima, Item 9, "Métodos Gerais"), apresentam um sinal aumentado após a ligação a P-amido em comparação com o sinal correspondente após a ligação a amido não fosforilado, têm uma ligação aumentada em relação a P-amido em comparação com amido não fosforilado. Através deste meio, é possível identificar as proteínas, que têm uma actividade de ligação aumentada em relação a P-amido em comparação com amido não fosforilado. Proteínas, que têm uma actividade de ligação aumentada em relação a P-amido em comparação com amido não fosforilado, são excisadas do gel de acrilamida. b) Identificação de proteínas, que têm uma actividade de ligação aumentada em relação a P-amido em comparação com amido não fosforilado

Proteínas identificadas conforme o Passo a) são digeridas com tripsina e os peptídeos obtidos são analisados através de MALDI-TOF para determinar as massas de peptídeos obtidas. Tripsina é uma protease sequencial-específica, isto é, a tripsina apenas separa proteínas numa posição específica quando as proteínas em questão contêm certas sequências de aminoácidos. Tripsina separa sempre as ligações de peptídeos quando os aminoácidos arginina e lisina seguem um ao outro a partir de N-terminal. Deste -69- modo, é possível determinar teoreticamente todos os peptídeos que seriam produzidos seguindo a digestão de tripsina duma sequência de aminoácidos. A partir do conhecimento da codificação de aminoácidos para teoreticamente determinar peptídeos, as massas de peptídeos obtidas após a digestão teorética de tripsina, também podem ser determinadas. Bases de dados (por exemplo, NCBInr http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml4.0/msfit.htm; Swissprot http://cbrg.inf.ethz.ch/Server/Mass-Search.html), que contêm informação referente às massas de peptídeos após a digestão teorética de tripsina, podem por isso ser comparadas com as massas de peptídeos de proteínas desconhecidas obtidas com MALDI-TOF-MS. Sequências de aminoácidos que têm as mesmas massas de peptídeo após teoreticamente e/ou real digestão de tripsina, são para serem observadas como sendo idênticas. As bases de dados em questão contêm ambas as massas de peptídeos de proteínas, a sua função já foi mostrada, e também massas de peptídeos de proteínas, que até agora apenas existiam hipoteticamente na derivação de sequências de aminoácidos partindo de sequências ácidas nucleícas obtidas em projectos sequenciais. A real existência e a função de tais proteínas hipotéticas tem, por isso, sido raramente mostrada e se tiver alguma função, então esta é normalmente baseada em meras previsões e não numa real demonstração da função.

Bandas que contenham proteínas obtidas conforme o Passo a) são excisadas do gel de acrilamida; a parte de acrilamida excisada é reduzida e descoorada na incubação durante cerca de meia hora a 37°C em cerca de 1 ml 60% 50mM NH4HCO3, 40% acetonitrilo. A solução descorante é subsequentemente removida e o restante gel é seco sob vácuo -70- (por exemplo, Speedvac). Após secagem, é adicionada uma solução de tripsina para digerir as proteínas contidas na peça de gel em questão. A digestão é feita durante a noite a 37°C. Após a digestão, é adicionado um pouco de acetonitrilo (até que o gel de acrilamida obtenha cor branca) e a preparação seca sob vácuo (por exemplo, Speedvac). Quando a secagem estiver completa, junta-se o suficiente ácido fórmico de 5% para cobrir os constituintes secos e incuba durante alguns minutos a 37°C. O tratamento de acetonitrilo seguido por secagem é mais uma vez repetido. Os constituintes secos são subsequentemente absorvidos em 0,1% TFA (ácido trifluoroacético, 5 μΐ a 10 μΐ) e gotejados para um veículo em partes de cerca de 0,5 μΐ. Quantidades iguais de matriz (ácido s-Ciano-4-hidroxicinâmico) são também aplicadas no veículo. Após a cristalização da matriz, as massas de peptídeos são determinadas através de MALDI-TOF-MS-MS (por exemplo, Burker ReflexTM II, Bruker Daltonic, Bremen). Com as massas obtidas, as bases de dados são consultadas procurando as sequências de aminoácidos, o que dá as mesmas massas após digestão teorética de tripsina. Deste modo, as sequências de aminoácidos podem ser identificadas, as que codificam proteínas, que de preferência ligam alfa-1,4-glucanos fosforilados e/ou necessitam de P-alfa-1,4-glucanos como um substrato. 11. Método para demonstrar actividade de fosforllação de amido duma proteína a) Incubação das proteínas com P-amido e/ou amido não fosforilado

Para demonstrar se a proteína tem actividade de -71 - fosforilação de amido, as proteínas a serem investigadas podem ser incubadas com amido e ATP radioactivamente marcado. Para fazer isto, cerca de 5 mg de P-amido ou cerca de 5 mg de amido não fosforilado são incubados com a proteína a ser investigada (0,1 pg a 5,0 pg por mg de amido utilizado) em tampão de fosforilação de 500 pl durante 10 minutos a 30 minutos à temperatura ambiente sob agitação. A reacção é subsequentemente parada adicionando SDS até uma concentração de 2% (peso/volume). Os grânulos de amido na respectiva mistura de reacção são tirados centrifugados (1 minuto, 13.000xg), e lavados uma vez com 900 pl de solução de SDS de 2 % e quatro vezes cada com 900 pl duma solução de ATP de 2 mM. Cada passo de lavagem é efectuado durante 15 minutos à temperatura ambiente sob agitação. Após cada passo de lavagem, os grânulos de amido são separados do respectivo tampão de lavagem por centrifugação (1 min, 13. OOOx) .

Adicionalmente, quando efectuar uma experiência para demonstrar a actividade de fosforilação de amido duma proteína, outras preparações de reacção, que não contenham proteína ou contenham proteína inactiva, mas que doutro modo tratadas da mesma maneira como as preparações de reacção descritas, devem ser processadas como denominados controlos.

Os grânulos de amido obtidos conforme o Passo a) podem ser investigados quanto à presença de resíduos de fosfato marcados radioactivamente. Para fazer isto, o respectivo amido é re-suspenso em água e misturado com 3 ml de cocktail de cintilação em cada caso (por exemplo, Ready Safe™, BECKMANN Coulter) e subsequentemente analisado utilizando um contador de cintilação (por exemplo, LS 6500 -72-

Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN COULTER™). c) Identificação de proteínas, que usam preferencialmente P-amido como um substrato

Se uma proteína é incubada em preparações separadas, uma vez com P-amido e uma vez com amido não fosforilado, conforme método descrito em a), então, comparando os valores para a presença de fosfato de amido obtido conforme o Passo b) , pode ser determinado se a proteína em questão tiver incorporado mais fosfato em P- amido em comparação com amido não fosforilado. Assim, proteínas podem introduzir fosfato no P-amido mas não no amido não fosforilado que pode também ser identificado, isto é, proteínas que já requereram amido fosforilado como substrato para uma seguinte reacção de fosforilação podem ser identificadas. c) Composição de tampões utilizados

Tampão de fosforilação: 50 mM EPES/KOH, pH 7,5

1 mM EDTA 6 mM MgCl2

0,01 a 0,5 mM ATP 0,2 a 2 pCi por ml aleatoriamente 33P-ATP (alternativamente, também pode ser utilizado, ATP, que contém um resíduo de fosfato, que é especificamente roltulado na posição gama)

Em conjunto com a presente invenção, o termo "ATP aleatório" deve ser entendido como ATP, que contém resíduos de fosfato, marcados tanto na posição gama como na posição beta (Ritte et al. 2002, PNAS 99, 7166-7171). ATP aleatório também é descrito na literatura científica como ATP beta/gama. Um método para a produção de ATP aleatório é descrito no seguinte. i) Produção de ATP aleatório -73- 0 método aqui descrito para produção de ATP aleatório utilizando reacções catalisadas de enzima baseia-se nos seguintes mecanismos de reacção: 1. passo de reacção 1

γ33Ρ-ΑΤΡ + AMP +mioquinase -»· p33P-ADP + ADP (Adenosina-P-P-33P +Adenosina-P -> AdenosinaP-P Adenosma-P-33P) 2. passo de reacção 2 33P-ADP + ADP + 2 PEP +Quínase de piruvato-» β33Ρ-ΑΤΡ + ATP + 2 Piruvato (Adenosina-P-P +Adenosina-P-33P + 2 PEP -» Adenosina-P-P-P + Adenosina-P-33P-P + 2 Piruvato) 0 equilíbrio de reacção está no lado do produto mas, mesmo assim, esta reacção produz uma mistura composta principalmente por β33Ρ-ΑΤΡ e algum γ33Ρ-ΑΤΡ. ii) Realizar o Io passo de reacção ATP (100 pCi, 3000 Ci por mmol) , que contém um resíduo de fosfato marcado com 33P na posição gama (Hartmann Analytic, 10 pCi/pl), é incubado com 2 μΐ mioquinase (AMP-fosfotransferase, de músculo de coelho; SIGMA, Prod. No.: M3003 3,8 mg/ml, 1.626 unidades/mg) em tampão aleatório de 90 μΐ durante 1 hora a 37°C. A reacção é subsequentemente parada incubando durante 12 minutos a 95°C antes da preparação de reacção ser purificada através de filtragem centrífuga utilizando um filtro Microcon YM 10 (Amicon, Millipore Prod. No. 42407) a 14.000xg durante pelo menos 10 minutos.

ii) Realizar o 2o passo de reacção 2 μΐ piruvato de quinase (ver abaixo como produzir uma solução apropriada) e 3 μΐ 50 mM PEP -74- (fosfoenolpiruvato) são adicionados ao filtrato obtido no Passo ii) . Esta mistura de reacção é incubada durante 45 minutos a 30°C antes da reacção ser parada incubando a 95°C durante 12 minutos. Subsequentemente é centrifugada a mistura de reacção (2 minutos, 12.000 rpm numa centrífuga de mesa Eppendorf). O sobrenadante com ATP aleatório obtido após a centrifugação é removido, aliquotado e pode ser armazenado a -20°C.

Produção de solução de piruvato de quinase 15 μΐ piruvato de quinase (de músculo de coelho, Roche, Prod. N.° 12815, 10 mg/ml, 200 unidades/mg a 25 °C) é centrifugado, o sobrenadante é descartado e o pellet absorvido no tampão de 27 μΐ de piruvato de quinase. iv) Tampões utilizados

Tampão piruvato-quinase: 50 mM HEPES/KOH, pH 7,5

1 mM EDTA

Tampão aleatório: 100 mM HEPES/KOH, pH 7,5

1 mM EDTA 10 % Glicerol 5 mM MgCl2

5 mM KCI

0,1 mM ATP 0,3 mM AMP 12. Demonstração de autofosforilação duma proteína

Para demonstrar se a proteína tem actividade de autofosforilação, as proteínas a serem investigadas podem ser incubadas com ATP radioactivamente marcado. Para fazer isto, as proteínas a serem investigadas (50 pg a 100 pg) são incubadas num tampão de fosforilação de 220 μΐ (ver acima, Item 12 d) , "Métodos Gerais") durante 30 minutos a 90 minutos à temperatura ambiente sob agitação. A reacção é então parada adicionando EDTA até uma concentração final de -75- 0,11 M. Cerca de 2 pg a 4 pg de proteína é então separada utilizando electroforese poliacrillamida desnaturante (7,5% gel de acrilamida). O gel obtido após electroforese de gel de poliacrilamida é sujeito a autoradiografia. Proteínas que apresentam um sinal de autoradiografia, contêm um resíduo de fosfato radioactivo. 13. Identificação das posições de átomos-C das moléculas de glicose dum alfa-1,4-glucano, em que foram introduzidos resíduos de fosfato por uma proteína de fosforilação de amido

As posições do átomo-C das moléculas de glicose dum alfa-1,4-glucano que são fosforiladas por uma proteína podem ser demonstradas de modo controlado através de hidrólise dos glucanos fosforilados obtidos através duma proteína apropriada in vitro, a subsequente separação dos monómeros de glicose é obtida após hidrólise, seguido pela medição do fosfato incorporado por uma proteína apropriada em certas fracções das moléculas de glicose. a) Total de hidrólise de alfa-1,4-glucanos

Suspensões de água contendo alfa-1,4-glucano são centrifugadas, o pellet sedimentado é subsequentemente re-suspenso em 0,7 M HC1 (Baker, para análise) e incubado durante 2 horas a 95°C sob agitação. Após a incubação, as amostras são brevemente arrefecidas e centrifugadas (por exemplo, 2 minutos lO.OOOxg). O sobrenadante obtido é transferido para um novo recipiente de reacção e neutralizado pela adição de 2 M NaOH (Baker, para análise). Se permanecer um pellet, ele é re-suspenso em 100 μΐ de água e a quantidade de fosfato marcado nele presente é determinada como um controlo. -76- 0 sobrenadante neutralizado é subsequentemente centrifugado através dum filtro de 10 kDa. Ao medir uma aliquota do filtrato obtido, a quantidade de fosfato marcado no filtrato é determinada utilizando um contador de cintilação, por exemplo. b) Fraccionamento dos produtos de hidrólise e determinação das posições do átomo-C fosforilado

Os filtratos neutralizados dos produtos de hidrólise obtidos através do Passo a) podem ser separados (quando se usa ATP radioactivamente marcado de cerca de 3000 cpm) utilizando cromotografia de troca aniónica de alta pressão (HPAE), por exemplo. O filtrato neutralizado pode ser diluído com H20 para obter o volume requerido para HPAE. Adicionalmente, glicose-6-fosfato (cerca de 0,15 mM) e glicose-3-fosfato (cerca de 0,3 mM) são adicionados aos filtratos apropriados em cada caso como um controlo interno. Separação através de HPAE pode ser efectuada, por exemplo, utilizando um sistema de Dionex DX 600 Bio Lc utilizando uma coluna de CarboPac PA 100 (com pré-coluna apropriada) e um detector amperométrico pulsado (ED 50). Ao fazê-lo, antes de injectar a amostra, a coluna é primeiro enxaguada durante 10 minutos com 99% de eluente C e 1% de eluente D. Um volume de amostra de 60 μΐ é então injectado. A elução da amostra é feita sob as condições seguintes:

Eluente C Eluente D 0 minutos 99% 1% 30 minutos 0% 100% 35 minutos 0% 100%

Processo terminado

Os produtos de hidrólise eluídos da coluna são recolhidos em fracções individuais de 1 ml cada. Como, em cada caso, glicose-3-fosfato não marcado (Ritte et al. 2002, PNAS 99, 7166-7171) e glicose-6-fosfato não marcado -77 - (Sigma, Prod. No.: G7879) foram adicionados em amostras injectadas de produtos de hidrólise como normas internas, as fracções que contêm tanto glicose-3-fosfato ou glicose-6-fosfato, podem ser determinadas através da detecção amperométrica pulsada. Ao medir a quantidade de fosfatos marcados em fracções individuais e subsequentemente comparar com as fracções, que contém glicose-3-fosfato ou glicose-6-fosfato, isto pode ser utilizado para determinar essas fracções, contendo glicose-6-fosfato marcado ou glicose-3-fosfato marcado. É determinada a quantidade de fosfato marcado na fracção em questão. Dos valores das quantidades de glicose-3-fosfato a glicose-6-fosfato medidas de fosfato marcado em produtos de hidrólise individual, agora pode ser determinado qual a posição de átomo-C que é preferivelmente fosforilada por uma enzima de fosforilação alfa-1,4-glucano. c) Tampões utilizados

Eluente C: 100 mM NaOH Eluente D: 100 mM NaOH 500 mM acetato de sódio 14. Preparação das amostras para a sequência

utilizando Q-TOF-MS-MS a)Observações Gerais

Proteinas isoladas que podem estar presentes na forma de bandas excisadas de géis de poliacrilamida, são primeiro cortadas em fragmentos mais pequenos através duma digestão de tripsina. Os peptideos formados são introduzidos num espectómetro de massa hibrida em que um espectrómetro de massa "time-of-flight" (TOF) é acoplado a um espectrómetro de massa quadrupólo. Na primeira fase da medição o primeiro espectrómetro de massa (o quadrupólo) é -78- "desligado" e as massas dos peptídeos formadas na digestão podem ser determinadas no espectrómetro de massa TOF. Na segunda fase um peptídeo selectivo é "filtrado" no quadrupólo, isto é, apenas este peptideo consegue passar pelo quadrupólo, todos os outros são deflectidos. 0 peptideo é então quebrado na colisão com as moléculas de gás carregado na "célula de colisão". Neste caso as "quebras" ocorrem principalmente nas ligações de peptideo. Como resultado, são formados mais ou menos fragmentos de peptideo distribuídos estatisticamente que diferem em massa. A sequência de aminoácidos dos peptídeos pode então ser determinada "separando" estes fragmentos. Se forem obtidos peptídeos que se sobrepõem, a sequência de aminoácidos duma proteína pode assim ser obtida. 0 uso da espectroscopia de massa para identificação e sequenciamento é do conhecimento dos especialistas na técnica e é suficientemente descrito na literatura da especialidade [por exemplo, P. Michael Conn (Ed.), 2003, Humana Press, New Jersey, ISBN: 1-58829-340-8]; J.R. Chapman (Ed.), 2000, Humana Press, SBN: 089603609X]. b) Redução e alquilação de resíduos de cisteína de proteínas

Os resíduos de cisteína com sequências de aminoácidos das proteínas a serem analisadas podem ser reduzidos/alquilados através de electroforese de gel antes da separação das proteínas. Para este fim, as proteínas que podem ser separadas através de electrof orese de gel são misturadas com tampão de amostra de SDS (não podem conter qualquer DTT ou beta-mercaptoetanol). DTT acabado de preparar é então adicionado a estas amostras até uma concentração final de 10 mM e a amostra é incubada durante -79- 3 minutos a 95°C. Após arrefecimento da amostra para a temperatura ambiente, é adicionada iodacetamida acabada de preparar até à concentração final de 20 mM. A amostra é incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente no escuro. As proteínas presentes na amostra são então separadas através de electroforese de gel de acrilamida. c) Isolamento de proteínas do gel de acrilamida

Bandas de proteínas contendo proteínas cujas sequências não podem ser determinadas são excisadas utilizando um bisturi limpo o mais "sem ponta" possível e reduzido (cerca de 1 mm3-cubo). Os pedaços de gel reduzidos são colocados num recipiente de reacção de 0,5 ml ou 1,5 ml e sedimentados por centrifugação momentânea. d) Descoloração de pedaços de gel excisados

Se forem utilizados géis corados com iões de prata, os pedaços de gel obtidos conforme o passo c) são completamente tapados com uma solução com 30 mM K-ferricianeto e 100 mM Na-tiosulfato na razão 1:1 e agitado (Vortex) até os pedaços de gel estarem completamente descoloridos. A solução descolorida é então removida e os pedaços de gel são lavados três vezes com 200 μΐ de água de alta pureza em cada caso (condutividade de cerca de 18 MOhm).

Se forem utilizados géis corados com Coomassie Blue, os pedaços de gel obtidos conforme o passo c) são incubados com uma solução com água de alta pureza e acetonitrilo (grau de pureza: pelo menos de pureza HPLC) numa razão de 1:1 duas vezes durante 15 minutos em cada caso sob agitação. O volume da solução de descoloração deve corresponder a cerca de duas vezes o volume do gel. A solução de lavagem é removida após cada passo de lavagem. - 80-

Após a descoloração te sido completada, os pedaços de gel são misturados com um volume (relativamente aos pedaços de gel) de acetonitrilo e incubados durante 15 minutos à temperatura ambiente sob agitação. O acetonitrilo é removido e os pedaços de gel misturados com um volume de 100 mM de bicarbonato de amónio, misturados e incubados durante 5 minutos à temperatura ambiente. Acetonitrilo é então adicionado para obter uma razão de 1:1 relativamente à quantidade de bicarbonato de amónio e acetonitrilo. A incubação é feita durante mais 15 minutos à temperatura ambiente antes da solução ser removida e os restantes pedaços de gel serem secos sob vácuo (por exemplo, Speedvac). e) A digestão de tripsina das proteínas em pedaços de gel

Solução de tripsina (10 ng de tripsina por μΐ de 50 mM bicarbonato de amónio) é adicionada em porções de 10 μΐ aos pedaços de gel secos conforme o passo d) . Após cada adição da solução de tripsina, a incubação em gelo é feita durante 10 minutos em cada caso. A solução de tripsina é adicionada em porções até os pedaços de gel não incharem mais e estarem completamente cobertos pela solução de tripsina. A solução de tripsina é então removida e os pedaços de gel são incubados durante a noite a 37°C. c) Isolamento de peptídeos do gel de acrilamida As amostras obtidas conforme o passo e) são momentaneamente centrifugadas para recolher o liquido contido no recipiente de reacção, o liquido é removido e transferido para um novo recipiente de reacção. Os pedaços de gel são tratados durante 2 minutos com ultra-som (banho de água de ultra-som) . Os restantes pedaços de gel são - 81 - então misturados com uma vez o seu volume de 25 mM de solução de bicarbonato de amónio e incubados durante 20 minutos sob agitação. Acetonitrilo é então adicionado para que a razão de bicarbonato de amónio para acetonitrilo de 1:1 seja ajustada e a incubação seja efectuada à temperatura ambiente durante mais 15 minutos sob agitação. Após a incubação ter sido completada, as amostras são novamente tratadas com ultra-som durante 2 minutos antes do líquido ser removido e combinado com o líquido que foi anteriormente removido. Os pedaços de gel restantes são misturados com uma vez o seu volume duma solução de 5% de ácido fórmico e acetonitrilo numa razão de 1:1 e incubados durante 15 minutos à temperatura ambiente sob agitação. O líquido é removido e combinado com o liquido que foi removido anteriormente. A incubação dos pedaços de gel de 5% de ácido fórmico / acetonitrilo (razão de 1:1) é repetida e o líquido obtido é de igual modo adicionado aos líquidos anteriormente recolhidos. Os sobrenadantes combinados contêm os peptídeos a serem sequenciados e concentrados até cerca de 15 μΐ em centrífuga de vácuo (Speedvac) a 60°C. Os peptídeos assim obtidos podem ser guardados a 20°C até serem analisados utilizando Q-TOF. Antes das proteínas poderem ser sequenciadas na análise de massa, estas podem ser dessalinadas utilizando métodos conhecidos por especialistas na técnica. 15. Transformação de plantas de arroz

As plantas de arroz foram transformadas conforme os métodos descritos por Hiei et al. (1994, Plant Journal 6 (2), 271-282). -82- 16. Transformação de batateiras

Batateiras foram transformadas utilizando agro-bactérias como descrito por Rocha-Sosa et al. (EMBO J. 8, (1989) , 23-29) . 17. Determinação do teor de fosfato de amido

Determinação do teor de fosfato de C-6

No amido as posições C2, C3 e C6 das unidades de glicose podem ser fosforiladas. 50 mg de amido foi hidrólisado em 500 μΐ de 0,7 M HC1 para 4 h a 95°C para determinar o teor de C6-P do amido. As preparações foram então centrifugadas durante 10 min a 15.500 g e os sobrenadantes removidos. Dos sobrenadantes 7 μΐ é misturado com 193 μΐ do tampão imidazole (100 mM imidazole, pH 7,4; 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA e 0,4 mM NAD) . A medição foi feita utilizando fotometria a 340 mm. Após a absorção da base ter sido feita, foi iniciada a reacção de enzima adicionando 2 unidades de glicose-6-fosfato desidrogenase (de Leuconostoc mesenteroides, Boehringer Mannheim). A alteração de absorção é directamente proporcional à concentração do teor de G-6-P do amido. b) Determinação do teor total de fosfato 0 teor total de fosfato foi determinado utilizando o método de Ames (Methods in Enzymology VIII, (1966), 115- 118)

Cerca de 50 mg de amido é misturado com 30 μΐ de solução de nitrato de magnésio de etanol e transformado em cinza durante três horas a 500°C num forno abafador. O resíduo é misturado com 300 μΐ de 0,5 M ácido hidroclórico e incubado durante 30 min a 60 °C. Uma aliquota é então feita de 300 μΐ de 0,5 M ácido hidroclórico, adicionado a -83- uma mistura de 100 μΐ de 10% ácido ascórbico e 600 μΐ de 0,42% molibdato de amónio em 2 M ácido sulfúrico e incubado durante 20 min. a 45°C. c) Determinação do teor de fosfato C-6 e fosfato C-3

Para determinar o teor da ligação de fosfato na posição C-6 e na posição C-3 das moléculas de glicose de um alfa-1,4-glucano, os glucanos em questão podem ser separados utilizando HPAE após a total hidrólise utilizando o método especifico nos "Métodos Gerais" Item 13. As quantidades de glicose-6-fosfato e glicose-3-fosfato podem ser determinadas integrando as áreas de pico obtidas após a separação de HPEA. A quantidade de glicose-6-fosfato e glicose-3-fosfato nas amostras a ser estudada pode ser determinada comparando a área de pico para glicose-6-fosfato e glicose-3-fosfato obtidas em amostras desconhecidas, com áreas de pico obtidas após a utilização de HPAE com quantidades conhecidas de glicose-6-fosfato e glicose-3-fosfato.

Exemplos 1. Isolamento da proteína de Arabidopsis thaliana, que tem uma actividade de ligação aumentada em relação a P-amido em comparação com amido não fosforilado a) Produção de extractos de proteína de Arabidopsis thaliana

Extractos de proteína são produzidos de cerca de 7 g de folhas (peso em fresco) de Arabidopsis thaliana (Õkotyp Columbia, Col-O) conforme o método descrito em Item 1, "Métodos Gerais". b) Isolamento de grânulos de amido de folhas de mutantes sexl-3 de Arabidopsis thaliana - 84-

Os grânulos de amido foram isolados de cerca de 20 g (peso em fresco) de folhas de mutantes sexl-3 de Arabidopsis thaliana conforme o método descrito em Item 2, "Métodos Gerais". c) Na fosforilação in vitro de amido isolado de um mutante sexl-3 de Arabidopsis thaliana com proteína Rl purificada.

Cerca de 30 mg de amido não fosforilado isolado de um mutante sexl-3 de Arabidopsis thaliana foi fosforilado conforme o método descrito em Item 7, "Métodos Gerais", através de uma proteína Rl recombinantemente expressa em E. coli e purificada. Os métodos descritos em Ritte et al. (2002, PNAS 99, 7166-7171) foram utilizados na expressão da proteína Rl em E. coli na subsequente purificação. d) Isolamento de proteínas que ligam a P-amido e/ou amido não fosforilado

Extractos de proteína de Arabidopsis thaliana, obtidos conforme o Passo a), foram incubados e lavados numa Preparação A com 50 mg do amido fosforilado in vitro produzido conforme o Passo c) utilizando o método descrito sob o Item 8 a), "Métodos Gerais".

Numa segunda Preparação B, extractos de proteína de Arabidopsis thaliana, obtidos conforme o Passo a) , foram incubados e lavados com 50 mg do amido não fosforilado produzido conforme o Passo c) utilizando o método descrito sob o Item 8 a), "Métodos Gerais".

Subsequentemente, as proteínas ligadas a P-amido da Preparação A e a amido não fosforilado da Preparação B foram dissolvidas conforme o método descrito em Item 8 b), "Métodos Gerais".

Numa terceira Preparação C, 50 mg do amido -85- fosforilado in vitro produzido conforme o Passo c) foi incubado e lavado utilizando o método descrito no Item 8 a), "Métodos Gerais", a preparação C não continha nenhum extracto de proteina. e) Separação de proteínas obtidas conforme o Passo d) através de electroforese de gel de acrilamida

As proteínas das Preparações A, B e C obtidas no Passo d) foram separadas através de 9% gel de acrilamida sob condições desnaturantes (SDS) utilizando o método descrito sob o Item 9, "Métodos Gerais", e subsequentemente corado com Coomassie Blue. 0 gel corado é mostrado na Fig. 1. Pode ser claramente visto que uma proteína, que tem um peso molecular de cerca de 130 kDa em gel de acrilamida desnaturante que se refere a um marcador Standard de proteína (Marca M), preferivelmente liga a amido fosforilado (Marca P) em comparação com amido não fosforilado (K). f) Identificação da proteína, que preferivelmente liga a P-amido em comparação com amido não fosforilado A banda da proteína com um peso molecular de cerca de 130 kDa identificada no Passo e) foi excisada do gel. A proteína foi subsequentemente libertada da acrilamida como descrito sob "Métodos Gerais" 10 b), digerida com tripsina e as massas de peptídeos obtidas determinadas através de MALD-TOF-MS. A designada "impressão digital" obtida através de MALDI-TOF-MS foi comparada com impressões digitais da digestão teorética de moléculas de aminoácido em bases de dados (Mascot: http://www.matrixscience.com/search_form_select.html;

ProF ound: http://129.85.19.192/profound_bin/WebPro-

Found.exe; PepSea: http://195.41.108.38/PepSealntro.html). -86-

Como tal impressão digital é muito especifica duma proteína, foi possível identificar uma molécula de aminoácido. Utilizando a sequência desta molécula de aminoácido, foi possível isolar um sequência de ácido nucleíco de Arabidopsis thaliana que codifica uma proteína OKI. A proteína identificada utilizando este método foi designada como A.t.-OKl. Após análise da sequência de aminoácido da Arabidopsis thaliana, foi detectado que esta se desvia da sequência presente na base de dados (NP 198009, NCBI). A sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID N.° 2 codifica a proteína A.t.-OKl. A SEQ ID N.° 2 contém desvios quando comparado com as sequências na base de dados (Acc.: NP 198009.1, NCBI). Os aminoácidos de 519 a 523 (WRLCE) e de 762 a 766 (VRARQ) contidos na SEQ ID N.° 2 não estão na sequência, que está presente na base de dados (ACC.: NP 198009.1). NP 198009.1). Comparado à versão 2 da sequência da base de dados (Acc.: NP 198009.2) a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID N.° 2 contém os aminoácidos adicionais 519 a 523 (WRLCE). 2. Clonagem de vim cADN, que codifica uma proteína OKI identificada A A.t.-OKl cADN foi isolada utilizando PCR invertida utilizando mARN isolado das folhas de Arabidopsis thaliana. Para fazer isto, uma Cadeia cADN foi sintetizada através de TM , transcriptase reversa (SuperScript First-Strand Synthesis System for RT PCR, Invitrogen Prod. N.°: 11904-018), que

então foi amplificada utilizando polimerase de ADN (Expand High Fidelity PCR Systems, Roche Prod. N.°: 1732641). O

produto amplificado obtido desta reacção de PCR foi clonado para o vector pGEM®(-T (Invitrogen Prod. N.°: A3600). O -87- plasmídeo obtido é designado A.t.-OKl-pGEM®-T, a sequência de cADN que codifica a proteína A.t.-OKl foi determinada e mostrada sob SEQ ID N.° 1.® A sequência mostrada sob SEQ ID N.° 1 não é a mesma que a sequência que consta na base de dados. Isto já foi abordado na sequência de aminoácido que codifica uma proteína A.t.-OKl.

Condições utilizadas na amplificação de cADN que codifica a proteína A.t.-OKl Síntese da primeira cadeia:

Foram utilizadas as condições e tampão especificadas pelo fabricante. Além disso, a preparação de reacção para a síntese da primeira cadeia contém as seguintes substâncias:

3 pg Total ARN 5 μΜ 3'-primer (OKI revi:5'- GACTCAACCACATAACACACAAAGATC) 0,83 μΜ dNTP Mix A preparação de reacção foi incubada durante 5 minutos a 75°C e subsequentemente arrefecida para a temperatura ambiente. 0 tampão da 1a cadeia, RNase inibidor e DTT foram então adicionados e incubados durante 2 minutos a 42°C antes de 1 μΐ Superscript RT ADN polimerase ser adicionada e a preparação de reacção incubada durante 50 minutos a 42 °C.

Condições da amplificação da primeira cadeia através de PCR: 1 pL da preparação de reacção da síntese da primeira cadeia 0,25 μΜ 3'Primer (OKI rev2:5'- TGGTAACGAGGCAAATGCAGA) 0,25 μΜ 5'Primer (OKlfwd2:5'- ATCTCTTATCACACCACCTCCAATG)

Condições de reacção:

Passo 1 95°C 2 min Passo 2 94°C 20 seg -88-

Passo 3 62°C 30 seg Passo 4 68°C 4 minutos Passo 5 94°C 20 seg Passo 6 56°C 30 seg Passo 7 68°C 4 minutos Passo 8 68°C 10 minutos A reacção foi primeiro efectuada conforme os Passos 1 a 4. Dez repetições (ciclos) foram efectuadas entre o Passo 4 e o Passo 2, a temperatura do Passo 3 foi reduzida em 0,67°C após cada ciclo. Isto foi subsequentemente seguido pela reacção conforme as condições especificadas nos Passos 5 a 8. Vinte e cinco repetições (ciclos) foram efectuadas entre o Passo 7 e o Passo 5, o tempo do Passo 7 foi aumentado em 5 seg. em cada ciclo. Na conclusão da reacção, a reacção foi arrefecida para 4°C.

3. Produção de um vector para a expressão recombinante de cADN da proteína OKI A seguir à amplificação por PCR utilizando o plasmídeo A.t.-OKl-pGEM® como molde utilizando Gateway Technology (Invitrogen), a sequência que codifica a proteína OKI de Arabidopsis thaliana foi primeiro clonada no vector pDONOR™ 201 (Invitrogen Prod. N.°: 11798-014). Subsequentemente, a região de codificação da proteína OKI do vector obtido foi clonada por recombinação de sequência-específica para o vector de expressão pDEST™17 (Invitrogen Prod. N.°: 11803-014). O vector de expressão obtido é designado como A.t.-OKl-pDEST™l. A clonagem resultou numa fusão de tradução de cADN que codifica a proteína A.t-OKl com os nucleótidos presentes no vector de expressão pDEST™7. Os nucleótidos originados do vector pDEST17™17, que são traducionalmente fundidos com o cADN que codifica a proteína A.t.-OKl, codificam 21 aminoácidos. Estes 21 -89- aminoácidos incluem, entre outros, o codão de início (ATG) e a chamada cauda de Histidina (6 resíduos de histidina directamente um após o outro). Após a tradução destas sequências fundidas traducionalmente, isto resulta numa proteína A.t.-OKl, que tem os adicionais 21 aminoácidos codificados por nucleótidos originados do vector no seu N-terminal. A proteína A.t.-OKl recombinante resultante deste vector contém, por isso, 21 aminoácidos adicionais originados do vector pDEST™17 no seu N-terminal. 4. Expressão heteróloga da proteína OKI em E. coli 0 vector de expressão A.t.-0Kl-pDEST™17 obtido conforme o Exemplo 3 foi transformado na estirpe de E. coli BL21 Star™ (DE3) (Invitrogen, Prod. No. C6010-03). A descrição deste sistema de expressão já foi dada acima (ver Item 3, "Métodos Gerais"). Clones de bactérias, que contenham o vector A.t.-0Kl-pDEST™17, resultante da transformação foram primeiro utilizados para produzir uma cultura preliminar que foi subsequentemente utilizada para inocular uma cultura principal (ver Item 3.c, "Métodos Gerais"). A cultura preliminar e a cultura principal foram cada uma incubada a 30°C sob agitação (250 rpm) . Quando a cultura principal alcançou um OD6oo de cerca de 0,8, a expressão da recombinante proteína A.t.-OKl foi induzida pela adição de IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranosida) até a concentração final de 1 mM ter sido alcançada. Após a adição de IPTG, a cultura principal foi incubada a 30°C sob agitação (250 rpm) até um OD60o de cerca de 1,8 ter sido alcançado. A cultura principal foi então arrefecida durante 30 minutos em gelo antes das células da cultura principal serem separadas do meio da cultura por centrifugação (10 -90- minutos a 4.000xg e 4°C). 5. Purificação da proteína OKI expressa re combinantemente A purificação e concentração da proteína A.t.-OKl de células obtidas conforme o Exemplo 4 foi efectuada utilizando o método descrito sob o Item 4, "Métodos Gerais".

6. Demonstração de actividade de fosforilação de amido da proteína OKI A actividade de fosforilação de amido da proteína A.t.-OKl foi demonstrada conforme o método descrito em Item 11, "Métodos Gerais". Ao fazer isto, 5 pg de proteína A.t.-OKl purificada produzida de acordo com o Exemplo 5 foi em cada caso incubada numa Preparação A com 5 mg de amido isolado de um mutante sexl-3 de Arabidopsis thaliana de acordo com o Exemplo 1 b) e numa Preparação B com 5 mg de amido obtido por fosforilação enzimática de acordo com o Exemplo 1 c), em cada caso 500 μΐ de tampão de fosforilação contendo 0,05 mM de (33P) marcado radioactivamente, ATP aleatório (num total de 1.130.00 cpm, cerca de 0,55 pCi) durante 30 minutos à temperatura ambiente sob agitação. Como controlo foi utilizada uma Preparação C que corresponde à Preparação B mas não continha nenhuma proteína OKI mas que foi de outro modo tratada da mesma forma que as Preparações A e B. Para todas as preparações (A, B, C) foram efectuados, em cada caso, dois testes independentes um do outro.

Utilizando um contador de cintilação, os amidos das Preparações A, B e C foram investigados quanto à presença -91 - de fosfato radioactivamente marcado (ver Item 11 b)," Métodos Gerais") . Os resultados são mostrados no Quadro 1 e na Fig. 3.

Quadro 1: Demonstração de actividade de fosforilação de amido da proteína OKI

Medição de radioactividade [cpm] Teste 1 Teste 2 Preparação A (amido não fosforilado + OKI) 42 47 Preparação B (amido fosforilado + OKI) 7921 8226 Preparação C (amido fosforilado sem proteína) 56 53

Dos resultados obtidos, pode ser visto que a proteína OKI não transfere grupos de fosfato de ATP ao amido quando o amido não fosforilado é fornecido como um substrato, visto que a quota de grupos de fosfato transferidos ao amido não fosforilado através de uma proteína OKI, medida em cpm, não excede a quota de grupos de fosfato radioactivamente marcados na Preparação C (controlo). Se, por outro lado, P-amido for introduzido como um substrato, a quota de grupos de fosfato radioactivo, medida em cpm, que foi transferida do ATP ao P-amido, é significativamente superior. Disto, pode ser observado que a proteína OKI requer P-amido como um substrato e que amido não fosforilado não é aceite como um substrato da proteína OKI.

Se o teste acima descrito for efectuado com ATP especificamente marcado na posição gama com 33P, então não é possível estabelecer qualquer incorporação de fosfato radioactivamente marcado no amido. Disto, pode ser observado que o resíduo de beta-fosfato de ATP é -92- transferido duma proteína OKI ao amido. Os resultados de tal teste são mostrados na Fig. 6. 7. Demonstração de autofosforilação

Autofosforilação da proteína A.t.-OKl foi demonstrada através dos métodos descritos acima (ver Item 12, "Métodos Gerais"). Aqui, 50 pg de proteína A.t.-OKl purificada foram incubados com radioactivamente marcado, ATP aleatório em 220 μΐ de tampão de fosforilação (ver acima, Item 12 d), "Métodos Gerais") à temperatura ambiente durante 60 minutos sob agitação. Subsequentemente, 100 μΐ em cada caso foi removido das preparações de incubação e transferido para quatro recipientes de reacção novos. Num recipiente de reacção 1, a reacção foi parada pela adição de 40 μΐ 0,11M EDTA. Recipiente de reacção 2 foi incubado a 95°C durante 5 minutos. HCI foi adicionado ao recipiente de reacção 3 até à concentração final de 0,5 M, e NaOH foi adicionado ao recipiente de reacção 4 até à concentração final de 0,5 M. Recipientes de reacção 3 e 4 foram cada um incubados durante 25 minutos a 30°C. Subsequentemente, 50 μΐ em cada caso foram removidos dos recipientes de reacção 1, 2, 3 e 4, misturados com tampão de teste SDS e separados através de SDS electroforese de gel de acrilamida (7,5% gel de acrilamida). Para este fim, foram aplicadas amostras dos recipientes de reacção em cada um dos dois géis de acrilamida idênticos. Um dos géis obtidos na completação de electroforese foi sujeito a autoradiografia, enquanto o segundo gel foi corado com Coomassie Blue.

No gel corado com Coomassie Blue (ver Fig. 2A), pode ser observado que o tratamento com 0,5 M NaOH leva à degradação da proteína OKI. A proteína OKI deve, por isso, -93- ser descrita como instável em relação a NaOH. Incubações a 30 °C, 95°C e com 0,5 M HC1 mostram que a proteína OKI é relativamente estável sob as condições de incubação referidas. Isto pode ser concluído do facto de que sob estas condições de incubação, em cada caso aproximadamente as mesmas quantidades da proteína OKI podem ser demonstradas no gel em questão após coramento com Coomassie Blue.

Na autoradiografia (ver Fig. 2B), pode ser observado por comparação com a proteína OKI fosforilada incubada a 30°C que uma incubação da proteína OKI fosforilada a 95°C leva a uma redução significativa no fosfato que foi ligado à proteína OKI. A ligação entre o resíduo de fosfato e um aminoácido da proteína OKI deve, por isso, ser descrita como instável sob calor. Além disso, uma pequena redução do fosfato ligado à proteína OKI também pode ser observada na incubação com 0,5 M HC1 e 0,5 M NaOH em comparação com a proteína OKI fosforilada incubada a 30°C. Se for tido em conta o facto de que a quantidade de proteína OKI na autoradiograf ia após tratamento com 0,5 M NaOH é significativamente inferior do que nas amostras tratadas com calor e ácido tendo em conta a instabilidade da proteína OKI em ralação a NaOH, então pode ser concluído que a ligação entre resíduo de fosfato e um aminoácido da proteína OKI será relativamente estável em relação à base. Como a amostra tratada com ácido contém cerca das mesmas quantidades de proteína que as amostras incubadas a 30°C e a 95°C, e mesmo assim tem um sinal de significativamente inferior na autoradiografia do que na amostra tratada a 30°C, deve-se assumir que, até um certo ponto, as condições de incubação ácida também separam as ligações entre um -94- resíduo de fosfato e um aminoácido da proteína OKI. Uma instabilidade da ligação entre um resíduo de fosfato e um amoniácido da proteína OKI pode, por isso, ser estabelecida nos testes efectuados. Ao mesmo tempo, a instabilidade relacionada com ácidos é significativamente menos marcada do que a instabilidade relacionada com calor. A ligação entre o aminoácido histidina e fosfato é que são instavéis sob calor, ácido-instáveis mas base-estável (Rosenberg, 1996, Protein Analysis and Purification, Birkhâuser, Boston, 242-244). Os resultados descritos acima são, por isso, uma indicação de que uma fosfohistidina é produzida por autofosforilação duma proteína OKI.

Se a proteína OKI expressa recombinantemente for incubada como descrito acima com ATP especificamente marcado com 33P na posição gama, não pode ser estabelecida autofosforilação. A fig. 5 A) mostra a quantidade de proteína que pode ser detectada na respectiva preparação de reacção através da análise de "Western Blot" após os passos de incubação relevantes. A fig. 5 B) mostra uma autoradiografia da proteína de preparações de reacção individuais. Pode ser observado que, quando é utilizado ATP especificamente marcado na posição gama, não pode ser demonstrada autofosforilação da proteína OKI, enquanto que, quando é utilizado ATP aleatório, pode ser demonstrada autofosforilação. Isto significa que quando uma proteína OKI é autofosforilada, o resíduo de fosfato da posição beta do ATP é ligado covalentemente a um aminoácido da proteína OKI. 8. Demonstração das posições do átomo-C, que foram -95- fosforiladas por uma proteína OKI, das moléculas de glicose de amido a) Produção de amido fosforilado

Amido fosforilado foi produzido de acordo com o Item 7, "Métodos Gerais". Para fazer isto, 5 mg de amido não fosforilado, isolado de folhas de mutante sexl-3 de Arabidopsis thaliana foi utilizado numa Preparação A com 25 pg de proteína A.t.-OKl purificada e numa segunda

Preparação B, 5 mg de amido fosforilado in vitro originalmente isolado de folhas de mutante sexl-3 de

Arabidopsis thaliana foi utilizado com 5 pg de proteína RI purificada. A reacção foi, em cada caso, efectuada em 500 pl de tampão de fosforilação que, em cada caso, continha 33P marcado ATP (cerca de 2,5 x 105 cpm) , incubando à temperatura ambiente durante 1 hora sob agitação. Além disso, foi utilizada uma preparação, gue continha 5 mg de amido isolado de folhas de mutante sexl-3 de Arabidopsis thaliana e o dito tampão de fosforilação, mas nenhuma proteína. A preparação de controlo foi tratada exactamente do mesmo modo que as preparações A e B. As reacções individuais foram paradas adicionando 125 pl de 10% SDS em cada caso e a lavagem foi mais uma vez efectuada com 2% SDS, cinco vezes com 2 mM ATP e duas vezes com H20, utilizando 900 pl em cada caso. A centrifugação foi efectuada após cada passo de lavagem (2 minutos numa centrífuga de mesa Eppendorf a 13.000 rpm, em cada caso). Os pellets de amido obtidos foram re-suspensos 1 ml H20 em cada caso e 100 pl de cada preparação foi misturado após adição de 3 ml do cocktail cintilação (Ready Safe™, BECKMANN) e subsequentemente medidos utilizando um contador de cintilação (LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, -96- BECKMANN COULTER™) . A medição deu os seguintes resultados:

Controlo: 63 cpm/100 yL 630 cpm/1000 μΐ

Preparação A (OKI): 1351 cpm/100 μΐ 3512 cpm/1000 μΐ

Preparação B (Rl): 3853 cpm/100 μΐ 38526 cpm/1000 μΐ b) Total de hidrólise do P-amido

As suspensões de Preparações A, B e C obtidas conforme o Passo a) foram novamente centrifugadas (5 minutos numa centrífuga de mesa Eppendorf a 13.000 rpm), os pellets obtidos re-suspensos em 90 μΐ 0,7 M HC1 (Baker, para análise) e subsequentemente incubados durante 2 horas a 95°C. As preparações A, B e C foram então novamente centrifugadas (5 minutos numa centrífuga de mesa Eppendorf a 13.000 rpm), e o sobrenadante transferido para um novo recipiente de reacção. Os resíduos sedimentados das preparações foram em cada caso re-suspensos em 100 ml H20 e após a adição de 3 ml de cocktail cintilação (Ready Safe™, BECKMANN) foram medidos utilizando um contador de cintilação (LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN COULTER™) . Não foram demonstradas grandes quantidades de radioactividade em nenhum dos resíduos, o que significa que todos os produtos de hidrólise marcados com fosfato radioactivo se encontravam no sobrenadante.

Isto foi seguido pela neutralização dos sobrenadantes individuais que continham os produtos de hidrólise através da adição, em cada caso de 30 μΐ 2 M NaOH (a quantidade de NaOH necessária para a neutralização foi testada antes em amostras em branco). Os produtos de hidrólise neutralizados foram colocados num Filtro Microncon 10 kDa, que antes tinha sido enxaguado duas vezes com 200 μΐ H20, em cada caso, e centrifugado durante cerca de 25 minutos a 12.000 rpm numa centrífuga de mesa -97-

Eppendorf. 10 μΐ foi tirado do filtrato obtido (cerca de 120 μΐ em cada caso) e, após adição de 3 ml do cocktail de cintilação (Ready SafeTM, BECKMANN), foram medidos utilizando um contador de cintilação (LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN COULTERTM). A determinação da actividade presente nas preparações individuais deu os seguintes resultados:

Preparação A (OKI): 934 cpm/10 μΐ 11.208 cpm/120 μΐ 93 cpm/μΐ

Preparação B (Rl): 2518 cpm/10 μΐ 30.216 cpm/120 μΐ 252 cpm/μΐ c)Separação dos produtos de hidrólise Os produtos de hidrólise obtidos conforme o Passo b) foram separados através de HPAE utilizando um sistema Dionex sob condições descritas acima (ver "Métodos Gerais", Item 13 c) ) . As amostras de separação dos sobrenadantes filtrados das Preparações A e B obtidas conforme o Passo b) eram compostas do seguinte modo:

Preparação A (OKI) : 43 μΐ do sobrenadante da

Preparação A obtida conforme o Passo b) (equivalente a cerca de 4.000 cpm) , 32 μΐ H20, 2,5 μΐ 2,5 mM glicose-6- fosfato e 2,5 μΐ 5 mM glicose-3-fosfato (Σ Volume = 80 μΐ).

Preparação B (Rl) : 16 μΐ do sobrenadante da

Preparação B obtida conforme o Passo b) (equivalente a cerca de 4.000 cpm), 59 μΐ H20, 2,5 μΐ 2,5 mM glicose-6- fosfato e 2,5 μΐ 5 mM glicose-3-fosfato (Σ Volume = 80 μΐ).

Em cada caso 60 μΐ, contendo cerca de 3.000 cpm, das amostras correspondentes foi injectado para separação utilizando HPAE. O HPAE foi efectuado de acordo com as condições especificadas no Ponto 23 c). Após passar através da coluna de HPAE, o tampão de eluição foi recolhido em fracções, cada uma de 1 ml. A recolha de fracções iniciou 10 minutos após injectar a amostra. Baseado no sinal -98- recebido do detector PAD utilizado, a eluição de glicose-6-fosfato foi atribuída à fracção 15 e a eluição de glicose-e-fosfato à fracção 17. Em cada caso, 500 μΐ das fracções individuais foi misturado com 3 ml do cocktail de cintilação (Ready SafeTM, BECKMANN) e subsequentemente medido utilizando um contador de cintilação (LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN COULTERTM). As seguintes medições foram obtidas para as fracções individuais: -99-

Quadro 4: Quantidades medidas de radioactividade [cpm] em fracções individuais dos produtos de hidrólise obtidos por hidrólise de amido fosforilado através duma proteína OKI ou proteína RI.

Total cpm por fracção Preparaçao A (OKI) Preparaçao B (Rl) Fr 13 8,7 3, 3 Fr 14 13, 1 32,2 Fr 15 (G6P) 207,3 1952,8 Fr 16 3998 112,3 Fr 17 (G3P) 1749, 2 801, 6 Fr 18 196, 7 17,3 Fr 19 6,7 18, 9 Total 2581,5 2938,3 Depósito 3000,0 3000,0 Recuperação 86, 0% 97, 9%

Os resultados são também mostrados graficamente na

Fig. 5. 9. Identificação duma proteína OKI no arroz

Utilizando os métodos descritos nos Itens 1 a 13, "Métodos Gerais", foi possível identificar uma proteína de Oryza sativa (variedade M202), que transfere um resíduo de fosfato de ATP ao P-amido. A proteína foi designada como O.s.-OKl. Amido não fosforilado não é utilizado pela proteína O.s.-OKl como substrato, isto é, a proteína O.s.-OKl também necessita de P-amido como substrato. A sequência de ácido nucleíco que define a proteína O.s.-OKl identificada é mostrada em SEQ ID N.° 3 e a sequência de aminoácido que codifica a proteína O.s.-OKl é mostrada em SEQ ID N.°. 4. A sequência de aminoácido que codifica a proteína O.s.-OKl mostrada em SEQ ID N.° 4 tem uma

identidade de 57% com a sequência de aminoácido que codifica a proteína A.t.-OKl mostrada em SEQ ID N.° 2. A sequência de ácido nucleíco que codifica a proteína O.s.- -100 - OKI mostrada em SEQ ID N.° 3 tem uma identidade de 61% com a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína A.t.-OK1 mostrado em SEQ ID N.° 1.

Produção de plasmídeo pMI50 contendo a sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína OKI de Oryza sativa O vector pMI50 contém um fragmento de ADN, que codifica a completa proteína OKI de arroz da variedade M202 . A amplificação do ADN de arroz foi efectuada em cinco sub-passos. A parte da grelha de leitura aberta desde a posição -11 à posição 288 da sequência especificada sob SEQ DIE N.° 3 foi amplificada utilizando transcriptase reversa e reacção de cadeia de polimerase utilizando oligonucleotídeos sintéticos Os_ okl-R9 (GGAACCGATAATGCCTACATGCTC) e Os_okl-F6 (AAAACTCGAGGAGGATCAATGACGTCGCTGCGGCCCCTC) como um "primer" no ARN das sementes de arroz imaturo. O fragmento de ADN amplificado foi clonado para o vector pCR2.1 (Invitrogen catalogue number K2020-20). O plasmídeo obtido foi designado como pML123. A parte da grelha de leitura aberta desde a posição 250 à posição 949 da sequência especificada sob SEQ DIE N.° 3 foi amplificada utilizando transcriptase reversa e reacção de cadeia de polimerase utilizando oligonucleotídeos sintéticos Os_okl-F4 (CCAGGTTAAGTTTGGTGAGCA) e Os_okl-R6 (CAAAGCACGATATCTGACCTGT) como um "primer" no ARN das sementes de arroz imaturo. O fragmento de ADN amplificado foi clonado para o vector pCR2.1 (Invitrogen catalogue -101 - number K2020-20). O plasmídeo obtido foi designado como pML12 0. A parte da grelha de leitura aberta desde a posição 839 à posição 1761 da sequência especificada sob SEQ DIE N.° 3 foi amplificada utilizando transcriptase reversa e reacção de cadeia de polimerase utilizando oligonucleotideos sintéticos 0s_okl-F7 (TTGTTCGCGGGATATTGTCAGA) e Os_okl-R7 (GACAAGGGCATCAAGAGTAGTATC) como um "primer" no ARN das sementes de arroz imaturo. O fragmento de ADN amplificado foi clonado para o vector pCR2.1 (Invitrogen catalogue number K2020-20). O plasmídeo obtido foi designado como pML121. A parte da grelha de leitura aberta desde a posição 1571 à posição 3241 da sequência especificada sob SEQ DIE N.° 3 foi amplificada utilizando transcriptase reversa e reacção de cadeia de polimerase utilizando oligonucleotideos sintéticos 0s_okl-F8 (ATGATGCGCCTGATAATGCT) e 0s_okl-R4 (GGCAAACAGTATGAAGCACGA) como um "primer" no ARN das sementes de arroz imaturo. 0 fragmento de ADN amplificado foi clonado para o vector pCR2.1 (Invitrogen catalogue number K2020-20). 0 plasmídeo obtido foi designado como pML119. A parte da grelha de leitura aberta desde a posição 2777 à posição 3621 foi amplificada utilizando reacção de cadeia de polimerase utilizando oligonucleotideos sintéticos Os_okl-F3 (CATTTGGATCAATGGAGGATG) e 0s_okl-R2 (CTATGGCTGTGGCCTGCTTTGCA) como um "primer" no ADN genómico de arroz. O fragmento de ADN amplificado foi clonado para o vector pCR2.1 (Invitrogen catalogue number K2020-20). O plasmídeo obtido foi designado como pML122. -102 - A clonagem das sub-partes da grelha de leitura aberta da OKI foi efectuada do seguinte modo.

Um fragmento Apal par longo base 700 de pML120, contendo parte da grelha de leitura aberta de OKI, foi clonado no local Apal de pMLl21. O plasmideo obtido foi designado como pMI47.

Um fragmento par longo base 960 contendo as regiões dos vectores de pML120 e pML123 que codificam OKI foi amplificado através da reacção de cadeia de polimerase. Ao fazê-lo, foram utilizados, os "primers" Os_okl-F4 (ver acima) e Os_okl-R9 (ver acima), cada um numa concentração de 50 nm, e os primers Os_okl-F6 e Os_okl-R6, cada um numa concentração de 500 nm. O fragmento de ADN amplificado foi clonado para o vector pCR2.1 (Invitrogen catalogue number K2020-20). O plasmideo obtido foi designado como pMI44.

Um fragmento par longo 845 base de pML122 foi re-amplificado para introduzir um local Xhol após o codão de terminação com os "primers" 0s_okl-F3 (ver acima) e Os_okl-R2Xho (AAAACTCGAGCTATGGCTGTGGCCTGCTTTGCA) e clonado para o vector pCR2.1 (Invitrogen catálogo número K2020-20). O plasmideo obtido foi designado como pMI45.

Um fragmento par longo base 1671 da parte da grelha de leitura aberta de OKI, foi obtido de pML119 por digestão com enzimas Spel e Pst I. O fragmento foi clonado para pBluescript II SK+ (Genbank Acc.: X52328). O plasmideo obtido foi designado como pMI46.

Um fragmento par longo base 1706 com parte da grelha de leitura aberta de OKI, foi excisado com enzimas de restrição Spel e Xhol de pMI46 e clonado para o vector pMI45, que tinha sido excisado com as mesmas enzimas de restrição. O plasmideo obtido foi designado como pMI47. -103-

Um fragmento par longo base 146 com parte da grelha de leitura aberta de OKI, foi excisado com enzimas de restrição Af/II/Notl de pMI43 e clonado para o vector pMI44, que tinha sido excisado com as mesmas enzimas de restrição. 0 plasmideo obtido foi designado como pMI49.

Um fragmento par longo base 1657 com parte da grelha de leitura aberta de OKI, foi excisado com enzimas de restrição Notl e NarI do vector pMI49 e clonado para o vector pMI47, que tinha sido excisado com as mesmas enzimas de restrição. O plasmideo obtido foi designado como pMI50 e contém toda a região de codificação da proteína OKI identificada no arroz. 10. Identificação de outras proteínas OKI de várias espécies vegetais

Utilizando os métodos descritos nos Itens 1 a 13, "Métodos Gerais", proteínas que transferem resíduos de fosfato de ATP para P-amido também foram identificados em cevada (Hordeum vulgare), batateira (Solanum tuberosum), trigo (Triticum aestivum) e milho painço (Sorghum bicolor). Amido não fosforilado não é utilizado como substrato nestas proteínas, isto é, estas proteínas requerem P-amido como substrato.

As proteínas foram isoladas utilizando o método sob o Item 14, "Métodos Gerais", digeridas com tripsina, dissolvidas do gel e sequenciadas utilizando Q-TOF-MS-MS. Utilizando sequências de peptídeos obtidas, foi possível determinar as sequências de ácido nucleíco EST que codificam proteínas OKI relevantes de cevada, batata, trigo ou milho painço através de comparações de bases de dados (blast searches). - 104 - A sequência de ácido nucleico mostrada em SEQ ID N.° 9 codifica uma parte duma proteína OKI de cevada e foi assinalado em "Accession" N.°: TC117610 na TIGR (http://tigrblast.tigr.org/tgi/) base de dados através duma comparação de base de dados (blast search). Estes peptídeos que foram obtidos na sequenciação da proteína OKI isolada de cevada utilizando Q-TOF-MS-MS e que foram utilizados para identificar a sequência de ácido nucleico EST mostrada sob SEQ ID N.° 9, são especificados em SEQ ID N.° 6, SEQ ID N.° 7 e SEQ ID N.° 8. A sequência aminoácida mostrada nos códigos SEQ ID N.° 10 de parte duma proteína OKI da cevada e que pode ser derivado da sequência de ácido nucleico mostrado em SEQ ID N.° 10. A sequência de ácido nucleico mostrada em SEQ ID N.° 15 que codifica uma parte duma proteína OKI da batateira e foi encontrada sob "Accession" N.°: BF054632 na TIGR (http://tigrblast.tigr.org/tgi/) base de dados através duma comparação de base de dados (blast search). Esses peptídeos que foram obtidos na sequenciação da proteína OKI isolada da batateira utilizando Q-TOF-MS-MS e que foram utilizados para identificar a sequência de ácido nucleico EST mostrado sob SEQ ID N.° 15, são especificados em SEQ ID N.° 11, SEQ ID N.° 12, SEQ ID N.° 13 e SEQ ID N.° 14. A sequência aminoácida mostrada SEQ ID N.° 16 codifica uma parte duma proteína OKI da batateira e que pode ser derivada da sequência de ácido nucleico mostrada em SEQ ID N.° 15. A sequência de ácido nucleído mostrada em SEQ ID N.° 21 codifica uma parte duma proteína OKI do milho painço e foi encontrada em "Accession" N.°: TC77219 na TIGR (http://tigrblast.tigr.org/tgi/) base de dados através duma comparação de base de dados (blast search). Esses peptídeos -105- foram obtidos na sequenciação da proteína OKI isolada de milho painço utilizando Q-TOF-MS-MS e que foram utilizados para identificar a sequência de ácido nucleíco EST mostrada sob SEQ ID N.° 21, são especificados em SEQ ID N.° 17, SEQ ID N.° 18, SEQ ID N.° 19 e SEQ ID N.° 20. A sequência aminoácida mostrada em SEQ ID N.° 22 codifica parte duma proteína OKI de milho painço e que pode ser derivada da sequência de ácido nucleíco mostrada em SEQ ID N.° 21. A sequência aminoácida mostrada em SEQ ID N.° 25

codifica uma parte duma proteína OKI de triqo e foi encontrada sob "Accession" N.°: CA74319 na TIGR (http://tigrblast.tigr.org/tgi/) base de dados através duma comparação de base de dados (blast search). Esses peptídeos foram obtidos na sequenciação da proteína OKI isolada de trigo utilizando Q-TOF-MS-MS e utilizados para identificar a sequência de ácido nucleíco EST mostrado sob SEQ ID N.° 25, são especificados em SEQ ID N.° 23 e SEQ ID N.° 24. A sequência aminoácida mostrada em SEQ ID N.° 26 codifica uma parte duma proteína OKI de trigo e pode ser derivada da sequência de ácido nucleíco mostrada em SEQ ID N.° 25.

As seguintes definições foram seleccionadas efectuando comparações de base de dados:

Program: tblastn Matrix: blosum62 Expect: 100 Echofilter: disabled Descriptions: 20

Todas as outras definições estavam predefinidas "default".

11. Produção de um anticorpo, que especialmente reconhece uma proteína OKI -106 -

Como um antigénio, cerca de 100 pg de proteína A.t.-OK1 purificada foi separada através de electroforese de gel SDS, as bandas de proteína contendo a proteína A.t.-OKl foram excisadas e enviadas para a empresa EUROGENTEC S.A. (Bélgica), que efectuou a produção do anticorpo sob contrato. Primeiro, o soro pré-imune de coelhos foi investigado para ver se já reconheciam uma proteína de A. t. de extracto total antes da imunização com o recombinante OKI. O soro pré-imune de dois coelhos não reconheceu nenhuma proteína no alcance de 100-150 kDa e foi assim escolhido para imunização. Quatro injecções de 100 pg de proteína (dia 0, 14, 28, 56) foram dadas a cada coelho. Foram tiradas quatro amostras de sangue de cada coelho: (dia 38, dia 66, dia 87 e no sangramento final) . O sérum obtido após o primeiro sangramento, já mostrava uma reacção específica com antigénio OKI na "Western blot". No entanto, em todos os testes seguintes, foi utilizado o sangramento final do coelho.

12. Produção de plantas de arroz transgénicas que têm uma actividade elevada ou reduzida duma proteína OKI

a) Produção de plasmídeo pGlo-A.t.-OKI O plasmídeo pIR94 foi obtido amplificando o promotor do gene globulina de arroz através duma reacção de cadeia polimerase (30 x 20 seg 94 °C, 20 seg 62 °C, 1 min 68 °C, 4 mM Mg2S04) com os "primers" glbl-F2 (AAAACAAT TGGCGCCTGGAGGGAGGAGA) e glbl-Rl AAAACAAT T GAT GAT CAAT CAGACAAT CAC TAGAA) no ADN genómico de arroz da variedade M202 com High Fidelity Taq Polymerase (Invitrogen, catalogue number 11304-011) e clonado para pCR2.1 (Invitrogen catalogue number K2020-20). - 107 - O plasmídeo pIR115 foi obtido clonando uma peça sintética de ADN composto por doisoligonucleotideos XI (TGCAGGCTGCAGAGCTCCTAGGCTCGAGTTAACACTAGTAAGCTTAATTAAGAT ATCATTTAC) e X2 (AATTGTAAATGATATCTTAATTAAGCTTACTAGTGTTAACTCGAGCCTAGGAGCT CTGCAGCCTGCA) para o vector pGSV71 excisado com Sdal e Muni. O plasmídeo pIR115 obtido foi excisado com Sdal, as 3'-terminações salientes suavizadas com T4 ADN polimerase e um fragmento 197-base-par HindIII / Sphl da pBinAR (Hõfgen and Willmitzer, 1990, Plant Science 66, 221-230), suavizado através de T4 ADN polimerase e contendo o sinal de terminação do gene de síntase octopina de Agrobacterium tumefaciens, foi inserido. O plasmídeo obtido foi designado como pIR96. O plasmídeo pIR103 foi obtido clonando um fragmento de ADN par longo base 986 de pIR94, contendo o promotor do gene globulina de arroz, para o plasmídeo pIR96. pGSV71 é um derivado do plasmídeo pGSV7, que deriva do vector pGSVl intermediário. pGSVl é um derivado de pGSC1700 cuja construção foi descrita por Cornelissen e Vanderwiele (Nucleic Acid Research 17, (1989), 19-25). pGSVl foi obtido de pGSC1700 pela eliminação do gene de resistência carbenicilina, como a eliminação das sequências de T-ADN da região TL-ADN do plasmídeo pTiB6S3. pGSV7 contém a origem da replicação do plasmídeo pBR322 (Bolívar et al., Gene 2, (1977), 95-113) bem como a origem da replicação do Pseudomonas plasmídeo pVSl (Itoh et al., plasmídeo 11, (1984), 206). pGSV7 que também contém o aos gene marcador seleccionável aadA, do transposon Tnl331 de Klebsiella pneumoniae, que transmite resistência -108 - antibióticos espectinomicina e estreptomicina (Tolmasky, Plasmid 24 (3), (1990), 218-226; Tolmasky and Crosa,

Plasmid 29(1), (1993), 31-40) 0 plasmideo pGSV71 foi obtido clonando o gene de barra quimérico entre as regiões delimitadoras de pGSV7. O gene de barra quimérico contém a sequência de promotor do vírus de mosaico de couve-flor para iniciação da transcrição (Odell et al., Nature 313, (1985), 180), o gene de barra de Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al., Embo J. 6, (1987), 2519-2523) e a região 3'-não-tradução do gene de síntase nopaline de T-ADN de pTiT37 para terminação da transcrição e poliadenilação. O gene de barra fornece tolerância contra herbicida de glufosinato de amónio.

Um fragmento de ADN que contém a grelha de leitura aberta completa da proteína OKI para Arabidopsis foi excisado do vector A.t.-okl-pGEM-T e clonado para o vector pIR103. Para este fim o plasmideo A.t.-OKl-pGEM-T foi excisado com a enzima de restrição Bspl20l, as terminações suavizadas com T4-ADN polimerase e subsequentemente excisado com Sall. O fragmento de ADN que codifica a proteína OKI da Arabidopsis thaliana foi clonado para o vector pIR103 excisado com Ecll36ll e Xhol. O plasmideo obtido foi designado como pGlo-A.t.-OKI. b) Produção duma construção para inibir a proteína OKI em arroz através da tecnologia de RNAi O plasmideo pML125, que foi utilizado para a transformação de plantas de arroz, foi obtido pela recombinação específica dos plasmídeos pMLl24 e pIRH5 utilizando o sistema de clonagem Gateway™ (Invitrogen). pML124 foi obtido clonando um fragmento de ADN par longo base 359 de pML119 (ver acima, Exemplo 9), contendo -109 - parte da grelha de leitura aberta que codifica a proteína OKI para arroz, para dentro do vector pENTR-ΙΑ (Invitrogen, product number 11813-011) excisado com EcoRI. O plasmídeo pIR87 foi obtido amplificando o intrão 1 da codificação para hidrogenase de álcool de milho com os "primers" Adh(i)-1 (TTTTCTCGAGGTCCGCCTTGTTTCTCCT) e Adh(i)-2 (TTTTCTCGAGCTGCACGGGTCCAGGA) no ADN genómico de milho. 0 produto da reacção de cadeia de polimerase (30 x 30 seg 94 °C, 30 seg 59 °C, 1 min 72 °C, 2,5 mM MgCI2) foi digerido com a enzima de restrição Xho I e clonado para o vector pBluescript II SK+ (Genbank Acc.: X52328), que tinha sido excisado com a mesma enzima.

Um fragmento de ADN par longo base 986 de pIR94, que continha o promotor do gene globulina de arroz, foi clonado para o vector pIR96. O plasmídeo obtido foi designado como pIRl0 3. O plasmídeo pIR107 foi obtido clonando a "RfA cassette" (ver acima) para dentro do plasmídeo pIR103 excisado com a enzima de restrição EcoRV.

Um fragmento par longo base 540 com o intrão 1 da codificação de gene para dehidrogenase álcool de milho foi excisado do plasmídeo pIR87 com a enzima de restrição XhoI e clonado para o plasmídeo pIR107 igualmente excisado com Xhol. O plasmídeo obtido foi designado como pIR114. O plasmídeo pIRH5 foi obtido clonando a "RfA cassette" (ver acima) para dentro do plasmídeo pIR114 excisado com EC1136II. c) Transformação de plantas de arroz

Plantas de arroz (variedade M202) foram transformadas utilizando Agrobacterium (contendo ou o plasmídeo pGlo-A.t.-OKI ou o plasmídeo pML125) utilizando o -110 - método descrito em Hiei et al. (1994, Plant Journal 6 (2), 271-282). d) Análise das plantas de arroz transgénicas que expressa a proteína A.t.-OKl e o amido sintetizado destas plantas

Plantas transformadas com o plasmídeo pGlo-A.t.-OKI que apresentaram uma expressão da proteína A.t.-OKl heteróloga foram identificadas através duma análise de "Northern Blot"

Plantas que apresentaram uma quantidade de mARN detectável que codificam a proteína A.t.-OKl foram cultivadas em estufa. Os grãos destas plantas foram colhidos. O amido destes grãos mostrou um elevado teor de fosfato covalentemente ligado ao amido em questão. e) Análise das plantas de arroz transgénicas em que a expressão da proteína OKI endógena foi recalcada através de tecnologia RNAi e o amido sintetizado destas plantas

As plantas de arroz que foram transformadas com o plasmídeo pML125 e apresentaram uma expressão reduzida de mARN endógeno que codifica a proteína OKI, foram identificadas através da análise de "Northern Blot".

13. Produção de batateiras transgénicas que têm uma actividade elevada ou reduzida duma proteina OKI a) Produção de plasmídeo pBinB33-Hyg

Partindo do plasmídeo pBinB33, o fragmento EcoRI-HindlIII incluindo o promotor B33, uma parte do polylinker, e o terminador ocs foram excisados e ligados no correspondente vector excisado pBIB-Hyg (Becker, 1990, Nucl. Acids Res. 18, 203). Acids Res. 18, 203). O plasmídeo pBinB33 foi obtido ligando o promotor do -111 - gene da batata B33 da Solanum tuberosum (Rocha-Sosa et al., 1989) como um fragmento Dral (nucleótido - 1512 - +14) para o vector pUC19 excisado com SstI, as terminações do gual tinha sido suavizada utilizando T4 ADN polimerase. Isto resultou no plasmideo pUC19-B33. 0 promotor B33 foi excisado deste plasmideo com EcoRI e SmaI e ligados para o correspondentemente excisado vector pBinAR (Hõfgen and Willmitzer, 1990, Plant Science 66, 221-230). Isto resultou no vector de planta de expressão pBinB33. b) Produção de vector A.t.-OKl-pBinB33-Hyg A sequência de código da proteína A.t.-OKl foi excisada com a restrição endonucleases Bspl20l e Sall do plasmideo OKl-pGEM e ligado para o vector pBinB33-Hyg excisado com Smal e Sall. O plasmideo obtido foi designado como A.t.-OKl-pBinB33-Hyg. c) Transformação de batateiras

Agrobacterium tumefaciens (estirpe GV2260) foi transformado com o plasmideo A.t.-OKl-pBinB33-Hyg. Batateiras da variedade Désirée foram então transformadas utilizando agrobactérias com plasmideo A.t.-OKl-pBinB33-Hyg utilizando o método descrito em Rocha-Sosa et al. (EMBO J. 8, (1989), 23-29) e plantas regeneradas. As plantas obtidas desta ocorrência de transformação foram designadas 385JH. d) Análise de batateiras transgénicas e amido sintetizado por estas

Plantas que apresentam uma elevada actividade de proteína A.t.-OKl expressa heterologamente e também plantas em que a actividade da proteína OKI endógena foi reduzida por um efeito de co-supressão identificado através duma análise "Western Blot". A análise "Western Blot" foi efectuada utilizando um anticorpo descrito sob o Exemplo 11 -112 - A Fig. 7 mostra exemplarmente a detecção da proteína A.t.-OKI em plantas individuais da ocorrência de transformação 385JH através da análise "Western Blot". Para indução do Promotor B33 em tecido de folha de linhas individuais da ocorrência de transformação 385JH foram cultivados em meio Musharige Skoog solidificado contendo 100 mM de sucrose em cultura de tecido durante dois dias. Após a colheita, extractos de proteína foram produzidos de tecido de folhas destas plantas conforme o método descrito em "Métodos Gerais", Item la). Após separação das proteínas através da desnaturação de electroforese de gel de poli-acrilamida 40 pg, o extracto de proteína de cada linha foi analisado através da análise "Western Blot" utilizando o anticorpo descrito em Exemplos, Item 10. Como amostras de controlo, extractos de proteína das plantas Arabidopsis e da batateira selvagem (cv Désirée) foram também analisados.

As plantas que apresentaram uma elevada guantidade de proteína A.t.-OKl comparado com as plantas de tipo selvagem correspondentes foram cultivadas em estufa. Amido que foi isolado dos tubérculos destas plantas mostrou um elevado teor de fosfato covalentemente ligado ao amido comparado com amido isolado de plantas selvagens não-transformadas. 14. Análise de plantas Arabidopsis thalliana que apresentam uma actividade reduzida duma proteína de acordo com a invenção T-ADN inserção de mutantes de Arabidopsis thaliana (disponível do Salk Institute Genomic Analysis Laboratory, 10010 N. Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, http://signal.salk.edu/ under ACC. No.: Salk_110814, Alias -113- Ν610814), que eram homozigóticos em relação à inserção do gene OKI, cresceram sob as seguintes condições:

Fase luminosa: 16 horas, 20°C

Fase escura: 8 horas, 16°C

Pouco antes de se desenvolverem flores, as plantas eram cultivadas numa fase luminosa de 12 horas a 20°C e numa fase escura de 12 horas a 17°C.

Plantas da linha mutante obtidas (Salk_110814) foram cultivadas de 3 sementes diferentes do material de semente original (Salk_110814-1, Salk_110814-2, Salk_110814-3) para análise.

No fim da fase escura, foram removidas 10 folhas em cada caso das 6 plantas de tipo selvagem (Õkotyp Columbia) e descoloridas em 70% etanol a 50°C. Além disso, 6 folhas foram removidas em cada caso das respectivamente 4 plantas diferentes das linhas mutantes Salk_110814-1, Salk_110814-2 ou Salk_110814-3 que eram em cada caso homozigóticas no que se refere à inserção de T-ADN num gene de OKI, e estas foram descoloridas em 70% etanol a 50°C. As folhas foram então incubadas durante 10 minutos numa solução Lugol antes da solução Lugol em excesso ser enxaguada das folhas com água da torneira. Todas as folhas das plantas selvagens não mostraram qualquer coramento com a solução Lugol. Por outro um lado, todas folhas das linhas mutantes Salk_110814-1, Salk_110814-2 ou Salk_110814-3 mostraram um coramento castanho ou preto (ver Fig. 7) . As linhas mutantes mostraram por isso um excesso de fenótipo de amido comparado com as plantas selvagens. Durante o cultivo não se conseguiu estabelecer nenhuma diferença relacionada com o crescimento entre as linhas mutantes e as plantas selvagens. - 114 -

Plantas Arabidopsis thaliana geneticamente modificadas que foram transformadas com uma construção RNAi com "repetições invertidas" da região de codificação dum gene de OKI sob o controlo do promotor 35S, foram analisadas com a ajuda da análise "Western blot" utilizando o anticorpo descrito no Exemplo 10. Foram identificadas várias linhas independentes que apresentaram uma quantidade reduzida da proteína OKI em comparação com as plantas selvagens. Estas linhas foram cultivadas sob condições de cultura especificadas acima. Em cada caso, 5 folhas das linhas individuais foram removidas no fim da fase escura (12 horas a 17°C), descoloridas em etanol e coradas com a solução Lugol. Todas as plantas mostram um excesso de fenótipo de amido em relação às correspondentes plantas selvagens. Durante o cultivo não se conseguiu estabelecer nenhuma diferença relacionada com o crescimento entre plantas geneticamente modificadas e plantas selvagens. As plantas geneticamente modificadas através de tecnologia ARNi mostraram as mesmas propriedades que as linhas mutantes Saik_110814-1, Salk_110814-2 ou Salk_110814-3.

Em cada caso quatro plantas Arabidopsis thaliana das linhas A.t.-alpha-OKl-1, A.t.-alpha-OKl-2, A.t.-alpha-OKl-3, A.t.-alpha-OKl-4, A.t.-alpha-OKl-5, resultantes das ocorrências de transformação independente, em que a quantidade de proteína OKI é reduzida através de tecnologia RNAi, foram investigadas quanto ao seu teor de amido em momentos diferentes. A redução na quantidade de proteína OKI nas respectivas linhas foi demonstrada através da análise "Western blot" (ver Fig. 8) . O teor de amido da folha das linhas individuais foi determinado utilizando kits de amido da Boehringer Mannheim (Produto N.°: -115 - 0207748) . Para esta finalidade, em cada caso todas as folhas das quatro plantas das linhas individuais foram colhidas e as folhas foram homogeneizadas utilizando almofarizes. 40 mg a 60 mg do material de folha homogeneizado foi duas vezes lavado com 80% de etanol em cada caso e o sobrenadante foi descartado. O material restante que não era solúvel em etanol, foi congelado-seco após ser lavado uma vez num 1 ml de água, depois dissolvido em 0,5 ml de 0,2M KOH a 95°C durante 1 h e a solução obtida foi ajustada para pH 7 utilizando 88 μΐ de 1M ácido acético. 25 μΐ da respectiva solução obtida foi misturada com 50 μΐ duma solução amiloglucosidase (Starch-Kit da Boehringer Mannheim, Produto N.°: 0207748), a que foi adicionada 1 unidade de alfa-amilase (de Bacillus amyloliquefaciens, Boehringer, Prod-No. 161764) e incubado durante 1 h a 55 °C. 20 μΐ da solução tratada com amiloglucosidase e alfa-amilase foi então utilizado para determinar a glicose utilizando um teste fotométrico ligado enzimático (ver a folha de informação do produto para a determinação do amido nativo da Boehringer Inmgelheim, Produto N.°: 0207748) Ao mesmo tempo que as linhas transgénicas, o conteúdo de amido foi também determinado nas folhas da Arabidopsis thaliana plantas tipo selvagem (Ecotipo Columbia). As plantas de tipo selvagem e as plantas transgénicas foram cultivadas sob as mesmas condições: 12 horas de fase luminosa seguidas por 12 horas de fase escura.

Folhas das respectivas linhas de plantas transgénicas e plantas selvagens foram colhidas em cada caso cerca de 4,5 semanas após a germinação da semente após o fim da fase escura, após o fim da fase luminosa e após o -116 - fim duma segunda fase escura que directamente seguiu à fase luminosa. Para cada linha de planta transgénica, dois extractos independentes foram produzidos em cada caso, dos quais em cada caso foram feitas duas medições do teor de amido. Para as plantas de tipo selvagem, quatro extractos foram produzidos em cada caso, dos quais em cada caso foram feitas duas medições do teor de amido. A determinação do conteúdo de amido na folha produziu os seguintes resultados:

Quadro 4: Quantidade de amido na folha das plantas

Arabidopsis thaliana em que a quantidade de proteína OKI foi reduzida utilizando a tecnologia ARNi.

Teor de amido

Linha (mg/g FW)

Fim fase escura 1 A. t.-alpha-OKl-1 A. t.-alpha-OKl-2 A. t.-alpha-OKl-3 A. t.-alpha-OKl-4 A. t.-alpha-OKl-5 Tipo selvagem

Desvio Padrão 4, 09 0,55 4, 93 0, 94 5, 59 0,52 6, 36 0,87 1,49 0, 99 0,78 0,14

Fim fase luminosa

Fim fase escura 2 A. t. - alpha-OKl-1 A. t. -alpha-OKl-2 A. t. - alpha-OKl-3 A. t. - alpha-OKl-4 A. t.-alpha-OKl-5 Tipo selvagem , 30 0, 96 9, 86 1,45 11, 68 1, 60 9, 53 1,25 6,61 0,71 5, 61 0,72 3, 92 0,83 4,35 1,07 6, 00 0, 63 5,34 1,35 1,46 0,56 0, 62 0,18 fórmula geral: raiz *Desvio A. t.-alpha-OKl-1 A. t. - alpha-OKl-2 A. t.-alpha-OKl-3 A. t. - alpha-OKl-4 A. t. - alpha-OKl-5 Tipo selvagem padrão utilizando a [ (ηΣχ2 - (Σχ)2) / η (n-1) ] - 117 -

15. Análise de amido isolado das plantas que apresentam uma actividade reduzida duma proteína OKI

Amido foi isolado das folhas das plantas descritas no Exemplo 14 e hidrolisado utilizando o método descrito em "Métodos Gerais", Item 13 e depois separado através da análise HPAE. As áreas dos sinais separados obtidos através da análise HPAE para fosfato C-3 e fosfato C-6 foram calculadas (Software: Chromeli-on 6.20 da Dionex, USA) e os valores obtidos foram dados como a razão um do outro. A razão de fosfato C-6 para fosfato C-3 em plantas selvagens foi de 2,1. Nas plantas descritas no Exemplo 14 em que a actividade da proteína OKI foi reduzida através de tecnologia RNAi, por outro lado, a razão média de fosfato C-6 para fosfato C-3 determinado analisando o amido isolado das linhas A.t.-alpha-OKl-1, A.t.-alpha-OKl-2, A.t.-alpha-OK1-3, A.t.-alpha-OKl-4 e A.t.-alpha-OKl-5 foi 2,5. A análise de amido da linha de A.t.-alpha-OKl-5 produziu a razão mais baixa de fosfato C-6 para fosfato C-3 (razão de 2,2), amido da linha A.t.-alpha-OKl-1 produziu a razão mais elevada (razão de 2,7).

Amido isolado das folhas dos mutantes descrito no Exemplo 13 que apresenta uma actividade reduzida duma proteína OKI mostrou um aumento na razão de fosfato C-6 para fosfato C-3 no amido em questão.

[0292] -118 -

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> Bayer Cropscience GmbH <120> Métodos para identificar proteínas com actividade enzimática de fosforilação de amido

<130> BCS 04-5001-PCT <150> EP04090483.1 <151> 2004-12-15 <150> EP04090121.7 <151> 2004-03-29 <150> EP04090087.0 <151> 2004-03-05 <150> US60/549,980 provisório <151> 2004-03-05 <160> 26 <170> Patentln versão 3.1

<210> 1 <211> 3591 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <22 0> <221> CDS <222> (1)..(3591) <223> <4 0 0> 1 -119- atg gag age att ggc age cat tgt tgc age tet cct ttc acc ttc ate 48 Met Glu ser ile Gly Ser His cys cys ser ser pro Phe Thr Phe ile 1 5 10 15 act aga aac tea tea tea tea ctt cct aga ctc gtt aac ate act cac 96 Thr Arg Asn Ser Ser Ser Ser Leu Pro Arg Leu val Asn ile Thr His 20 25 30 aga gtt aat ctc age cac caa tet cac cga ctc aga aac tcc aat tet '144 Arg val Asn Leu Ser His Gin ser His Arg Leu Arg Asn Ser Asn Ser 35 40 45 cgt ctc act tgc act gçt act tet tet tcc acc att gag gaa caa cgg 192 Arg Leu Thr Cys Thr Ala Thr Ser Ser ser Thr ile Glu Glu Gin Arg 50 55 60 aag aag aaa gat gga tea 99a acg aaa gtg agg ttg aat gtg agg tta 240 Lys Lys Lys Asp Gly Ser Gly Thr Lys vaT Arg Leu Asn val Arg Leu 65 70 75 80 gat cat caa gtt aat ttt ggt gac cat gtg gçt atg ttt gga tea gçt 288 Asp His Gin val Acn Phe Gly Acn kí s val Ala Mn-*- nw k Phe Gly Ser Ala 85" 90 95 aaa gag att ggt tea tgg aaa aag aaa teg cct ttg aat tgg agt gag 336 Lys Glu Ile Gly Ser Trp Lys Lys Lys Ser Pro Leu Asn Trp Ser Glu 100 105 110 aat gga tgg gtt tgt gag ttg gaa ctt gac ggt ggt cag gtt ttg gag 384 Asn Gly Trp val Cys Glu Leu Glu Leu Asp Gly Gly Gin val Leu Glu 115 120 125 tat aag ttt gtc att gtt aag aat gat ggt tea ctt tea tgg gaa tet 432 Tyr Lys 130 Phe val Ile val Lys 135 Asn Asp Gly Ser Leu 140 Ser Trp Glu Ser gqt gat aat cgt gtç ctt aag gtt cca aat tet ggg aat ttt tet gtt 480 Gly Asp Asn Arg Val Leu Lys Val Pro Asn ser Gly Asn Phe ser val 145 150 155 160 gtt tgt cat tgg gat gct act aga gaa acc ctt gat ttg cct cag gag 528 vai cys His Trp Asp Ala Thr Arg GlU Thr Leu Asp Leu Pro Gin Glu 165 170 175 gtt gat aat gat gat gat gtt ggt gat ggt ggg cat gag agg gat aat 576 vai Gly Asn Asp 180 Asp Asp val Gly Asp 185 Gly Gly His Glu Arg 190 Asp Asn cat gat gtt ggt gat gat aga gta gtg gga agt gaa aat ggt gçg cag 624 His Asp Val 195 Gly Asp Asp Arg Val 200 val Gly ser Glu Asn 205 Gly Ala Gin ctt cag aag agt aca ttg ggt ggg caa tgg caa ggt aaa gat gçg tcc 672 Leu Gin 210 Lys Ser Thr Leu Gly 215 Gly Gin Trp Gin Gly 220 Lys Asp Ala Ser ttt atg cgt tet aat gat cat ggt aac aga gaa gtt ggt aga aat tgg 720 Phe Met Arg Ser Asn Asp His Gly Asn Arg Glu Val Gly Arg Asn Trp 225 230 235 240 gat act agt ggt ctt gaa ggc aca gçt ctt aag atg gtt gag ggt gat 768 Asp Thr Ser Gly Leu Glu Gly Thr Ala Leu Lys Met val Glu Gly Asp 245 250 255 cgc aac tet aag aac tgg tgg aga aag ctt gaa atg gta cgc gag gtt 816 Arg Asn Ser Lys Asn Trp Trp Arg Lys Leu Glu Met Val Arg Glu Val 270 - 120- 260 265 ata gtt ggg agt gtt gag agg gag gaa ile vai Gly ser vai Glu Arg Glu Glu 275 280 tct gca att tat ttg aag tgg ata aac Ser Ala 290 Ile Tyr Leu Lys Trp 295 Ile Asn gaa gat gga ggg cat cac cgt cca aac Glu Asp Gly Gly HÍS His Arg Pro Asn 305 310 ctt ata ttc cgt gag ttg gag cac att Leu He Phe Arg Glu 325 Leu Glu His ile cca gag gaa gtg ctt gtt gçt cgg aaa Pro Glu Glu vai Leu Vai Ala Arg Lys 340 345 ttc aaa gca gag ttt act gca gct gtc Phe Lys Ala Glu Phe Thr Ala Ala vai 355 360 ata gcc cat cgg aat gat att cct cat He Ala His Arg Asn Asp Ile Pro His 370 375 cat acg ata caa aat aag ctt cac cgg HÍS Thr Ile Gin Asn Lys Leu His Arg 385 390 att gça aca gaa gca atg ctt caa cga ile Ala Thr Glu Ala 405 Met Leu Gin Arg tat agt gga gac ttt gtg gag cag ttt Tyr ser Gly Asp 420 Phe vai Glu Gin Phe 425 aaa Lys gat Asp ttc Phe ttt Phe aat Asn gct Ala gga Gly agt Ser ctc Leu 435 440 aaa att tct atg gat gat aga ggt ctt Lys ile Ser Met Asp Asp Arg Gly Leu 450 455 gaa tgt aaa aag cgc ctt gac aca tea Glu cys Lys Lys Arg Leu Asp Thr Ser 465 470 gag ttg att aaa acc atg cat tct cta Glu Leu Ile Lys Thr Met His ser Leu 485 ata aag gaa ctt aat age ggc ttg cga ile Lys Glu Leu Asn ser Gly Leu Arg 500 505 att gca atg cgc cag aag tgg cgc ctt Ile Ala Met Arg Gin Lys Trp Arg Leu 515 520 tac ttt ttt gtt cta cta age aga ttc Tyr Phe Phe vai Leu Leu Ser Arg Phe cga Arg ttg Leu aag Lys gçg Ala 285 ctc Leu ata ile tac Tyr 864 aca Thr ggt Gly cag Gin 300 att Ile cct Pro tgt cys ttt Phe 912 agg Arg cat His 315 gçc Ala gag Glu att Ile tcc Ser aga Arg 320 <960 tgc Cys 330 agt ser aag Lys aaa Lys gat Asp gçt Ala 335 act Thr 1008 ate ile cat His ceg Pro tgt Cys tta Leu 350 cct Pro tct Ser 1056 cct Pro cta Leu act Thr cgg Arg 365 att ile agg Arg gac Asp 1104 gat Asp ctc Leu aag Lys 380 caa Gin gaa Glu ate Ile aag Lys 1152 aat Asn gct Ala 395 ggt Gly cca Pro gaa Glu gat Asp cta Leu 400 1200 att ile 410 acc Thr gag Glu acc Thr cca Pro gga Gly 415 aaa Lys 1248 aaa Lys ata ile ttc Phe cat His aat Asn 430 gag Glu ctt Leu 1296 act Thr gaa Glu cag Gin ctt Leu 445 gat Asp tct Ser atg Met 1344 tct Ser gçg Ala ctc Leu 460 aat Asn ttg Leu ttt Phe ttt Phe 1392 gga Gly gaa Glu 475 tea ser age Ser aat Asn gtt vai ttg Leu 480 1440 gçt Ala 490 tct Ser tta Leu aga Arg gaa Glu aca Thr 495 att ile 1488 aat Asn gat Asp gçt Ala cct pro gat Asp 510 act Thr gçc Ala 1536 tgt cys gag Glu ate ile ggc Gly 525 ctc Leu gag Glu gac Asp 1584 ctc Leu aat Asn gçt Ala ctt Leu gaa Glu act Thr atg Met 1632 -121 - 530 535 540 gga gga gçt gat caa ctg gca aaa gat gtg gga tca aga aac gtt gee 1680 Gly Gly Ala Asp Gin Leu Ala Lys Asp val Gly Ser Arg Asn val Ala 545 550 555 560 tca tgg aat gat cca cta gat gçt ttg gtg ttg ggt gtt cac caa gta 1728 ser Trp Asn Asp Pro Leu Asp Ala Leu val Leu Gly val His Gin Val 565 570 575 ggt cta tct ggt tgg aag caa gaa gaa tgt tta gee att gga aat gaa 1776 Gly Leu Ser Gly Trp Lys Gin Glu Glu cys Leu Ala Ile Gly Asn Glu 580 585 590 ctc ctt gct tgg cga gaa agg gac cta ctt gaa aaa gaa ggg gaa gag 1824 Leu Leu Ala 595 Trp Arg Glu Arg Asp 600 Leu Leu Glu Lys Glu 605 Gly Glu GlU gat gga aaa aca att tgg gçc atg agg ctg aaa gca act ctt gat cga 1872 Asp Gly Lys Thr ile Trp Ala Met Arg Leu Lys Ala Thr Leu Asp Arg 610 615 620 gca cgc aga tta aca gca gaa tat tct gat ttg ctt ctt caa ata ttt 1920 Ala Arg Arg Leu Thr Ala Glu Tyr Ser Asp Leu Leu Leu Gin ile Phe 625 630 635 640 cct pro cct pro aat Asn gtg vai gag Glu att ile tta Leu gga Gly aaa Lys gçt Ala cta Leu gga Gly att ile cca Pro gag Glu aat Asn 1968 645 650 655 agt gtc aag acc tat aca gaa gca gag att cgt gct gga att att ttc 2016 ser vai Lys Thr Tyr Thr Glu Ala Glu ile Arg Ala Gly ile ile Phe 660 665 670 cag ate tca aag ctc tgc act gtt ctt cta aaa gçt gta aga aat tca 2064 Gin Ile Ser Lys Leu cys Thr val Leu Leu Lys Ala Val Arg Asn Ser 675 680 685 ctt ggt tct gag ggc tgg gat gtc gtt gta cct gga teg acg tct 999 2112 Leu Gly 690 Ser Glu Gly Trp Asp 695 val val val pro Gly 700 Ser Thr ser Gly aca tta gtt cag gtt gag age att gtt ceg gga tca ttg cca gça act 2160 Thr Leu vai Gin val Glu ser Ile Val Pro Gly ser Leu Pro Ala Thr 705 710 715 720 tct ggt ggt cct att att ctc ttg gtç aat aaa gct gat ggc gat gaa 2208 Ser Gly Gly pro Ile ile Leu Leu val Asn Lys Ala Asp Gly Asp Glu 725 730 735 gag gta agt gct gct aat ggg aac ata gçt gga gtç atg ctt ctg cag 2256 Glu vai Ser Ala Ala Asn Gly Asn ile Ala Gly val Met Leu Leu Gin 740 745 750 gag ctg cct cac ttg tct cac ctt ggc gtt aga gçg cgg cag gag aaa 2304 Glu Leu Pro His Leu ser His Leu Gly val Arg Ala Arg Gin Glu Lys 755 760 765 att gtc ttt gtg aca tgt gat gat gat gac aag gtt gçt gat ata cga 2352 Π e Vai 770 Phe val Thr cys 85 Asp Asp Asp Lys val 780 Ala Asp ile Arg cga ctt gtg gga aaa ttt gtg agg ttg gaa gca tct cca agt cat gtg 2400 Arg Leu Val Gly Lys Phe val Arg Leu Glu Ala Ser Pro ser His val 785 790 795 800 aat ctg ata ctt tca àct gag ggt agg agt cgc act tcc aaa tcc agt 2448 Asn Leu He Leu ser Thr Glu Gly Arg ser Arg Thr Ser Lys Ser Ser -122- 805 810 815 gcg acc aaa aaa acg gat aag aac age tta tet aag aaa aaa aca gat 2496 Ala Thr Lys Lys 820 Thr Asp Lys Asn Ser 825 Leu Ser Lys Lys Lys 830 Thr Asp aag aag age tta tet ate gat gat gaa gaa tca aag cct ggt tcc tca 2544 Lys Lys Ser Leu Ser Ile Asp Asp Glu Glu Ser Lys Pro Gly Ser Ser 835 840 845 tet tcc aat age ctc ctt tac tet tcc aag gat ate cct agt gga gga 2592 Ser Ser 850 Asn ser Leu Leu Tyr 855 ser ser Lys Asp ile 860 Pro ser Gly Gly ate ata gça ctt gct gat gca gat gta cca act tet ggt tca aaa tet 2640 ile Ile Ala Leu Ala Asp Ala Asp val pro Thr ser Gly Ser Lys Ser 865 870 875 880 gct gça tgt ggt ctt ctt gça tet tta gça gaa gçc tet agt aaa gtg 2688 Ala Ala cys Gly Leu Leu Ala Ser Leu Ala Glu Ala Ser Ser Lys Val 885 890 895 cac age gaa cac gga gtt ccg gca tca ttt aag g« cca act gga gtt 2736 His ser Glu His Gly Val Pro Ala ser Phe Lys val Pro Thr Gly val 900 905 910 gtc ata cct ttt gga teg atg gaa tta gçt tta aag caa aat aat teg 2784 vai Ile Pro Phe Gly Ser Met Glu Leu Ala Leu Lys Gin Asn Asn Ser 915 920 925 gaa gaa aag ttt gcg tet ttg cta gaa aaa cta gaa acc gçc aga cct 2832 Glu Glu Lys Phe Ala ser Leu Leu Glu Lys Leu Glu Thr Ala Arg Pro 930 935 940 gag ggt ggt gag cta gac gac ata tgt gac cag ate cat gaa gtg atg 2880 Glu Gly Gly Glu Leu Asp Asp Ile Cys Asp Gin Ile His Glu Val Met 945 950 955 960 aaa acg ttg caa gtg cct aaa gaa aca ate aac age ata age aaa gçg 2928 Lys Thr Leu Gin vai pro Lys Glu Thr ile Asn ser ile ser Lys Ala 965 970 975 ttt ctc aaa gat gct cgt ctc att gtt cgt tca agt gçt aac gtç gag 2976 Phe Leu Lys Asp Ala Arg Leu ile val Arg Ser Ser Ala Asn val Glu 980 985 990 gac tta gcc gga atg tca gct gca gga etc tat gaa tea ate cct aac 3024

Asp Leu Ala Gly Met ser Ala Ala Gly Leu Tyr Glu ser lie pro Asn 995 1000 1005 gtg agt ccc teg gat cct ttg gtg ttt tca gat teg gtt tgc caa 3069

Vai Ser Pro Ser Asp Pro Leu Vai Phe ser Asp Ser vai cys Gin 1010 1015 1020 gtt tgg gct tet etc tac aca aga aga gct gtt cta age cgt aga 3114 vai Trp Ala ser Leu Tyr Thr Arg Arg Ala vai Leu ser Arg Arg 1025 1030 1035 gct gct ggt gtc tet caa aga gaa gct tca atg gct gtt etc gtt 3159

Ala Ala Gly Vai Ser Gin Arg Glu Ala Ser Met Ala vai Leu vai 1040 1045 1050 caa gaa atg ctt teg ccg gac tta tca ttc gtt ctg cac aca gtg 3204

Gin Glu Met Leu Ser Pro Asp Leu Ser Phe vai Leu His Thr vai 1055 1060 1065 agt cca gct gat ccg gac agt aac ctt gtg gaa gcc gag ate gct 3249

Ser Pro Ala Asp Pro Asp ser Asn Leu vai Glu Ala Glu lie Ala -123 - 1070 1075 1080 cct Pro ggt Gly 1085 tta Leu ggt Gly gag act Glu Thr tta Leu 1090 gçt Ala tca Ser gga Gly aca Thr aga Arg 1095 gga Gly aca Thr cca Pro. 3294 tgg Trp aga Arg 1100 ctc Leu gçt Ala tcg ggt ser Gly aag Lys 1105 ctc Leu gac Asp ggg Gly att ile gta val 1110 caa Gin acc Thr tta Leu 3339 gct Ala ttc Phe 1115 gca Ala aac Asn ttc age Phe ser gaa Glu 1120 gag Glu ctt Leu ctt Leu «a tca ser 1125 gga Gly aca Thr ggt Gly ,3384 cct pro gct Ala 1130 gat Asp gga Gly aaa tac Lys Tyr gtt Val 1135 cgg Arg ttg Leu acc Thr gtg val gac Asp 1140 tat Tyr age ser aaa Lys 3429 aaa Lys cgt Arg 1145 tta Leu act Thr gtt gac val Asp tcg ser 1150 gtg val ttt Phe aga Arg cag Gin cag Gin 1155 ctc Leu ggt Gly cag Gin 3474 aga Arg ctc Leu 1160 ggt Gly tcg gtt ggt ser vai Gly ttc phe 1165 ttc phe ttg Leu gaa Glu aga Arg aac Asn 1170 ttt phe ggc tgt Gly cys 3519 gct Ala caa Gin 1175 gac Asp gtt gaa ggt Val ,,<jl.úGly tgt cys 1180 ttg Leu gtt val ggt Gly gaa Glu gat Asp 1185 gtt val tac att Tyr ile 3564 gtt cag tca agg cca caa cct ctg tag 3591

Vai Gin Ser Arg Pro Gin Pro Leu 1190 1195

210> 2 <211> 1196 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 -124- Met Glu Ser lie Gly ser His cys 1 5 Thr Arg Asn ser Ser ser ser Leu 20 Arg vai Asn Leu Ser His Gin ser 35 40 Arg Leu Thr cys Thr Ala Thr ser 50 55 Lys Lys Lys Asp Gly Ser Gly Thr 65 70 Asp His Gin Vai Asn Phe Gly Asp

Cys ser ser Pro Phe Thr Phe ile 10 15

Pro Arg Leu vai Asn ile Thr His 25 30

His Arg Leu Arg Asn Ser Asn Ser

Ser ser Thr ile Glu Glu Gin Arg 60

Lys vai Arg Leu Asn vai Arg Leu 75 «O

His Vai Ala Met Phe Gly Ser Ala -125 - 85 90 95 Lys Glu ile Gly ser Trp Lys Lys Lys Ser Pro Leu Asn Trp Ser Glu 100 105 110 Asn Gly Trp val cys Glu Leu Glu Leu Asp Gly Gly Gin val Leu Glu 115 120 125 Tyr Lys Phe val ile val Lys Asn Asp Gly ser Leu ser Trp Glu ser 130 135 140 Gly ASP Asn Arg val Leu Lys val Pro Asn Ser Gly Asn Phe Ser val 145 150 155 160 Vai Cys His Trp Asp Ala Thr Arg Glu Thr Leu Asp Leu pro Gin Glu 165 170 175 Vai Gly Asn Asp. 180 Asp Asp val Gly Asp 185 Gly Gly His Glu Arg 190 Asp Asn His Asp val Gly Asp Asp Arg val val Gly ser Glu Asn Gly Ala Gin 195 200 205 Leu Gin 210 Lys ser Thr Leu u? Gly Gin Trp Gin Gly 220 Lys Asp Ala Ser Phe Met Arg Ser Asn Asp HÍS Gly Asn Arg Glu val Gly Arg Asn Trp 225 230 235 240 ASP Thr ser Gly Leu 245 Glu Gly Thr Ala Leu 250 Lys Met Val Glu Gly 255 Asp Arg Asn Ser Lys Asn Trp Trp Arg Lys Leu Glu Met Val Arg Glu val 260 265 270 lie val Gly Ser val Glu Arg Glu Glu Arg Leu Lys Ala Leu Ile Tyr 275 280 285 Ser Ala lie Tyr Leu Lys Trp lie Asn Thr Gly Gin Ile Pro Cys Phe 290 295 300 Glu Asp Gly Gly His His Arg pro Asn Arg HiS Ala Glu Ile ser Arg 305 310 315 320 Leu He phe Arg Glu 325 Leu Glu His Ile Cys 330 Ser Lys Lys Asp Ala 335 Thr pro Glu Glu val Leu val Ala Arg Lys Ile His Pro cys Leu Pro Ser 340 345 350 Phe Lys Ala Glu Phe Thr Ala Ala Val Pro Leu Thr Arg Ile Arg Asp -126 - 355 360 365 He Ala His Arg Asn Asp ile pro His Asp Leu Lys Gl n Glu ile Lys 370 375 380 His Thr ile Gin Asn Lys Leu His Arg Asn Ala Gly Pro Glu Asp Leu 385 390 395 400 lie Ala Thr Glu Ala Met Leu Gin Arg ile Thr Glu Thr Pro Gly Lys 405 410 415 Tyr Ser Gly Asp Phe Vai Glu Gin Phe Lys Ile Phe Hi s Asn Glu Leu 420 425 430 Lys Asp Phe phe Asn Ala Gly Ser Leu Thr Glu Gin Leu ASp Ser Met 435 440 445 Lys ile Ser Met Asp Asp Arg Gly Leu ser Ala Leu Asn Leu Phe phe 450 455 460 Glu Cys Lys Lys Arg Leu Asp Thr Ser Gly Glu ser Ser Asn vai Leu 465 470 475 480 Glu Leu Ile Lys Thr Met HÍS Ser Leu Ala Ser Leu Arg Glu Thr ile 485 490 495 Ile Lys Glu Leu Asn ser Gly Leu Arg Asn Asp Ala Pro ASp Thr Ala 500 505 510 lie Ala Met 515 Arg Gin Lys Trp Arg 520 Leu Cys Glu ile Gly 525 Leu Glu Asp Tyr Phe Phe vai Leu Leu Ser Arg Phe Leu Asn Ala Leu Glu Thr Met 530 535 540 Gly 545 Gly Ala Asp Gin Leu 550 Ala Lys Asp Vai Hl Ser Arg Asn Vai Ala 560 ser Trp Asn Asp Pro 565 Leu Asp Ala Leu vai 570 Leu Gly vai His Gin 575 val Gly Leu Ser Gly Trp Lys Gin Glu Glu Cys Leu Ala ile Gly Asn Glu 580 585 590 Leu Leu Ala Trp Arg Glu Arg Asp Leu Leu Glu Lys Gl U Gly Glu Glu 595 600 605 Asp Gly Lys Thr ile Trp Ala Met Arg Leu Lys Ala Thr Leu Asp Arg 610 615 620

Ala Arg Arg Leu Thr Ala Glu Tyr ser Asp Leu Leu Leu Gin lie Phe -127- 625 630 635 640 Pro pro Asn val Glu Ile Leu Gly Lys Ala Leu Gly ile Pro Glu Asn 645 650 655 ser vai Lys Thr 660 Tyr Thr Glu Ala Glu 665 Ile Arg Ala Gly Ile 670 Ile phe Gin ile Ser Lys Leu cys Thr val Leu Leu Lys Ala val Arg Asn. ser 675 680 685 Leu Gly 690 Ser Glu Gly Trp Asp 695 Val val val Pro Gly 700 Ser Thr Ser Gly Thr Leu Val Gin val Glu ser Ile Val Pro Gly Ser Leu Pro Ala Thr 705 710 715 720 ser Gly Gly pro ile ile Leu Leu val Asn Lys Ala Asp Gly Asp Glu 725 730 735 Glu Val Ser Ala Ala Asn Gly Asn ile Ala Gly val Met Leu Leu Gin 740 745 750 Glu Leu Pro HiS Leu Ser His Leu Gly val Arg Ala Arg Gin Glu Lys 755 760 765 ile val Phe Val Thr cys Asp Asp Asp Asp Lys Val Ala Asp Ile Arg 770 775 780 Arg Leu val Gly Lys Phe Val Arg Leu Glu Ala ser pro ser HiS val 785 790 795 800 Asn Leu ile Leu ser Thr Glu Gly Arg ser Arg Thr ser Lys Ser Ser 805 810 815 Ala Thr Lys Lys Thr Asp Lys Asn Ser Leu Ser Lys Lys Lys Thr Asp 820 825 830 Lys Lys Ser Leu Ser Ile Asp Asp Glu Glu Ser Lys Pro Gly ser Ser 835 840 845 ser Ser Asn Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Lys Asp Ile Pro Ser Gly Gly 850 855 860 ile Ile Ala Leu Ala Asp Ala Asp val Pro Thr Ser Gly Ser Lys Ser 865 870 875 880 Ala Ala cys Gly Leu Leu Ala ser Leu Ala Glu Ala Ser Ser Lys Val 885 890 895

His ser Glu His Gly val Pro Ala Ser Phe Lys vai Pro Thr Gly vai -128 - 900 905 910 val ile Pro Phe Gly ser Met Glu Leu Ala Leu Lys Gin Asn Asn ser 915 920 925

Glu Glu Lys Phe Ala Ser Leu Leu Glu Lys Leu Glu Thr Ala Arg Pro 930 935 940

Glu Gly Gly Glu Leu Asp Asp lie Cys Asp Gin lie His Glu Val Met 945 950 955 960

Lys Thr Leu Gin Val Pro Lys Glu Thr Ile Asn Ser lie Ser Lys Ala 965 970 975

Phe Leu Lys Asp Ala Arg Leu ile val Arg ser ser Ala Asn val Glu 980 985 990

Asp Leu Ala Gly Met ser Ala Ala Gly Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Asn 995 1000 1005 val Ser Pro Ser Asp Pro Leu val Phe Ser Asp ser val cys Gin 1010 1015 1020 val Trp Ala Ser Leu Tyr Thr Arg Arg Ala val Leu Ser Arg Arg 1025 1030 1035

Ala Ala Gly Val Ser Gin Arg Glu Ala Ser Met Ala Val Leu val 1040 1045 1050

Gin Glu Met Leu Ser Pro Asp Leu Ser Phe val Leu His Thr val 1055 1060 1065

Ser Pro Ala Asp Pro Asp Ser Asn Leu val Glu Ala Glu ile Ala 1070 1075 1080

Pro Gly Leu Gly Glu Thr Leu Ala Ser Gly Thr Arg Gly Thr Pro 1085 1090 1095

Trp Arg Leu Ala Ser Gly Lys Leu Asp Gly Ile Val Gin Thr Leu 1100 1105 mo

Ala Phe Ala Asn Phe Ser Glu Glu Leu Leu Val Ser Gly Thr Gly 1115 1120 1125 Pro Ala Asp Gly Lys Tyr val Arg Leu Thr Val ASp Tyr Ser Lys 1130 1135 1140 Lys Arg Leu Thr val Asp ser val Phe Arg Gin Gin Leu Gly Gin 1145 1150 1155

Arg Leu Gly ser val Gly phe Phe Leu Glu Arg Asn Phe Gly cys - 129- 1160 1165 1170

Ala Gin Asp vai Glu Gly cys Leu vai Gly Glu Asp vai Tyr lie 1175 1180 1185 val Gin Ser Arg Pro Gin Pro Leu 1190 1195 <210> 3 <211> 3644 <212> PRT <213> Oryza s ativa <220> <221> CDS <222> (13) . . (3633) <223> <400> 3 -130 - cgaggaggat ca atg acg tcg ctg cgg ccc ctc gaa acc tcg ctc tcc ata 51

Met Thr ser Leu Arg pro Leu Glu Thr ser Leu Ser lie 1 5 10 ggc ggc agg ccg cgc cgt ggt ctc gtc ctc ccg ccg ccc gga gtc ggt 99

Gly Gly Arg Pro Arg Arg Gly Leu vai Leu Pro Pro Pro Gly vai Gly 15 20 25 gcg ggt gtg ctg ctc cgc cgg gga gcg atg gcg ctc cct ggg cgg cgc 147

Ala Gly VaT Leu Leu Arg Arg Gly Ala Met Ala Leu Pro Gly Arg Arg 30 35 40 45 ggc ttc gcg tgc cgc ggg aga tcc gcg gcc tcg gcg gca gag aga aca 195

Gly Phe Ala Cys Arg Gly Arg ser Ala Ala Ser Ala Ala Glu Arg Thr 50 55 60 aag gag aaa aag aga aga gat tct tca aag cag cca ttg gtg cat ctc 243

Lys Glu Lys Lys Arg Arg Asp ser ser Lys Gin Pro Leu Vai His Leu 65 70 75 cag gtt tgt cta gag cac cag gtt aag ttt ggt gag cat gta ggc att 291

Gin vai cys Leu Glu His Gin vai Lys Phe Gly Glu His vai Gly ile 80 85 90 ate ggt tcc aca aag gag ctt ggt tca tgg gag gag cag gtt gaa ctg 339 lie Gly ser Thr Lys Glu Leu Gly ser Trp Glu Glu Gin vai Glu Leu 95 100 105 gaa tgg act aca aat ggt tgg gtc tgc cag ctt aag ctc cct gga gaa 387

Glu Trp Thr Thr Asn Gly Trp Vai cys Gin Leu Lys Leu Pro Gly Glu 110 Í15 120 125 aca ctt gtg gag ttt aaa ttt gtt ata ttt ttg gtg gga gga aaa gat

Thr Leu vai Glu Phe Lys Phe Vai ile Phe Leu vai Gly Gly Lys Asp 130 135 140 435 -131 - aaa ata tgg gaa gat ggt aat aac cgt gtt gtt gag ctg ccg aag gat 483

Lys lie Trp Glu Asp Gly Asn Asn Arg vai vai Glu Leu Pro Lys Asp 145 150 155 ggt aag ttt gat ata gta tgc cac tgg aat aga aca gaa gag cca tta 531

Gly Lys Phe Asp ile Vai Cys His Trp Asn Arg Thr Glu Glu Pro Leu 160 165 170 gaa ctt tta gga aca cca aag ttt gag ttg gtc gga gaa gct gaa aag 579

Glu Leu Leu Gly Thr Pro Lys Phe Glu Leu vai Gly Glu Ala Glu Lys 175 180 185 aat act ggc gag gat gct tca gca tct gta act ttt gca cct gaa aaa 627

Asn Thr Gly Glu Asp Ala ser Ala ser vai Thr Phe Ala Pro Glu Lys 190 195 200 205 gtt caa gat att tca gtt gtt gag aat ggt gat cca gca cca gag gcc 675

Vai Gin Asp Ile Ser vai Vai Glu Asn Gly Asp Pro Ala Pro Glu Ala 210 215 220 gag tca age aaa ttt ggt ggg caa tgg caa gga agt aaa act gtt ttc 723

Glu ser ser Lys Phe Gly Gly Gin Trp Gin Gly Ser Lys Thr vai Phe 225 230 235 atg aga tca aat gag cat ctg aat aag gag gct gat agg atg tgg gat 771

Met Arg Ser Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Ala Asp Arg Met Trp Asp 240 245 250 aca act ggg ctt gat gga ata gca ctg aaa ctg gtg gag ggc gat aaa 819

Thr Thr Gly Leu Asp Gly ile Ala Leu Lys Leu vai Glu Gly Asp Lys 255 260 265 gca tcc agg aac tgg tgg cgg aag tta gag gtt gtt ege ggg ata ttg 867

Ala Ser Arg Asn Trp Trp Arg Lys Leu Glu vai vai Arg Gly ile Leu 270 275 280 285 tca gaa tct ttt gat gac cag agt cgt ctg ggg gcc ctt gta tac tca 915

Ser Glu Ser Phe Asp Asp Gin ser Arg Leu Gly Ala Leu Vai Tyr Ser 290 295 300 gct att tat ctg aag tgg att tat aca ggt cag ata teg tgc ttt gaa 963

Ala ile Tyr Leu Lys Trp Ile Tyr Thr Gly Gin ile ser cys Phe Glu 305 310 315 gat ggt ggc cac cat cgg cct aac aaa cat gct gag ata teg agg caa 1011

Asp Gly Gly His His Arg Pro Asn Lys His Ala Glu ile Ser Arg Gin 320 325 330 ata ttc cgt gaa ctt gaa atg atg tat tat ggg aaa acc aca tca gcc 1059

Ile Phe Arg Glu Leu Glu Met Met Tyr Tyr Gly Lys Thr Thr Ser Ala 335 340 345 aag gat gtt ctc gtg att ege aaa att cat ccc ttt tta cct tca ttt 1107

Lys Asp vai Leu vai ile Arg Lys ile His pro Phe Leu pro Ser Phe 350 355 360 365 aag tca gag ttt aca gcc tct gtc cct cta aca cga att cgt gat att 1155

Lys ser Glu Phe Thr Ala ser vai Pro Leu Thr Arg ile Arg Asp Ile 370 375 380 gct cac cgg aat gac ate cca cat gat ctc aag caa gaa ate aag cat 1203

Ala His Arg Asn Asp ile Pro His Asp Leu Lys Gin Glu ile Lys His 385 390 395 act ata caa aac aaa ctt cat cgt aat gct gga cct gag gat ctt att Thr ile Gin Asn Lys Leu His Arg Asn Ala Gly Pro Glu Asp Leu Ile 400 405 410 1251 1299 -132 - gct aca gaa gtc atg ctt gct agg att act aag acc cct gga gaa tac:

Ala Thr Glu vai Met Leu Ala Arg Ile Thr Lys Thr Pro Gly Glu Tyr- 415 420 425 agt gaa aca ttt gtt gaa caa ttc acg ata ttt tat age gaa cta aaa ser Glu Thr Phe vai Glu Gin Phe Thr ile Phe Tyr ser Glu Leu Lys 430 435 440 445 gat ttc ttc aat gct ggc age cta ttt gag caa ctg gag tcc ate aag

Asp Phe Phe Asn Ala Gly Ser Leu Phe Glu Gin Leu Glu Ser ile Lys 450 455 460 gaa tet ctg aac gag tea ggc tta gaa gtt ctc tea tcc ttt gtg gaa

Glu ser Leu Asn Glu Ser Gly Leu Glu vai Leu ser ser Phe vai Glu 465 470 475 acc aaa agg agt ttg gac caa gtg gat cat gea gaa gat ttg gat aaa

Thr Lys Arg ser Leu Asp Gin vai Asp His Ala Glu Asp Leu Asp Lys 480 485 490 aat gat acc att caa att ttg atg act acc ttg caa tea tta tet tet

Asn Asp Thr ile Gin ile Leu Met Thr Thr Leu Gin ser Leu ser ser~ 495 500 505 cta aga teg gtt cta atg aag ggc ctt gaa agt ggc ctt aga aat gat

Leu Arg Ser Vai Leu Met Lys Gly Leu Glu Ser Gly Leu Arg Asn Asp 510 515 520 525 gcg cct gat aat gct ata gea atg cga caa aag tgg ege ctt tgt gaa

Ala Pro Asp Asn Ala Ile Ala Met Arg Gin Lys Trp Arg Leu cys Glu 530 535 540 att agt ctt gag gat tat tea ttt gtt ctg tta age aga ttc ate aat ile ser Leu Glu Asp Tyr ser Phe vai Leu Leu ser Arg phe ile Asn 545 550 555 act ctt gaa gee tta ggt gga tea gct tea ctt gea aag gat gta gct

Thr Leu Glu Ala Leu Gly Gly ser Ala ser Leu Ala Lys Asp vai Ala 560 565 570 aga aat act act cta tgg gat act act ctt gat gee ctt gtc att ggc

Arg Asn Thr Thr Leu Trp Asp Thr Thr Leu Asp Ala Leu vai Ile Glv* 575 580 585 ate aat caa gtt age ttt tea ggt tgg aaa aca gat gaa tgt att gee

Ile Asn Gin Vai Ser Phe ser Gly Trp Lys Thr Asp Glu cys Ile Ala 590 595 600 605 ata ggg aat gag att ctt tcc tgg aag caa aaa ggt cta tet gaa agt ile Gly Asn Glu ile Leu ser Trp Lys Gin Lys Gly Leu ser Glu sen 610 615 620 gaa ggt tgt gaa gat ggg aaa tat att tgg tea cta aga ctt aaa gct

Glu Gly cys Glu Asp Gly Lys Tyr ile Trp ser Leu Arg Leu Lys Ala 625 630 635 aca ctg gac aga gea cgg aga tta acg gaa gag tac tet gaa gea ctt

Thr Leu Asp Arg Ala Arg Arg Leu Thr Glu Glu Tyr ser Glu Ala Leu 640 645 650 ctt tet ata ttc cct gaa aaa gta atg gtt att ggg aaa gee ctt gga

Leu ser ile Phe Pro Glu Lys vai Met vai ile Gly Lys Ala Leu Gly' 655 660 665 ata cca gat aac agt gtg aga act tac aca gag gea gaa att cgt gct

Ile Pro Asp Asn ser Vai Arg Thr Tyr Thr Glu Ala Glu Ile Arg Ala 670 675 680 685 1347 1395 1443 1491 1539 1587 1635 1683 1731 1779 1827 1875 1923 1971 2019 2067 -133- ggc att gtt ttt cag gta tct aaa cta tgc aca gta ctt cag aaa gça 2115 Giy ile vai phe Gin val ser Lys Leu cys Thr val Leu Gin Lys Ala 690 695 700 att cga gaa gta ctt gga tea act ggc tgg gat gtt ctt gtt cct gga 2163 He Arg Glu Vai Leu Gly ser Thr Gly Trp Asp val Leu Val Pro Gly 705 710 715 gtg gcc cat gga act ctg atg cgg gtg gaa aga att ctt cct gga tea 2211 vai Ala His Gly Thr Leu Met Arg val Glu Arg ile Leu Pro Gly Ser 720 725 730 tta cct tea tct gtç aaa gaa cct gtg gtt cta att gta gat aag gçt 2259 Leu Pro Ser Ser Val Lys Glu Pro vaT Val Leu ile val Asp Lys Ala 735 740 745 gat gga gat gaa gag gtc aaa gçt gçt ggg gat aat ata gtt ggt gtt 2307 Asp Gly Asp Glu Glu val Lys Ala Ala Gly Asp Asn ile val Gly Val 750 755 760 765 att ctt ctt cag gaa cta cct cac ctt tea cat ctt ggt gtt aga gçt 2355 lie Leu Leu Gin Glu 770 Leu Pro His Leu Ser 775 His Leu Gly val Arg 780 Ala cgt caa gag aat gtt gta ttt gta act tgt gaa tat gat gac aca gtt 2403 Arg Gin Glu Asn val Val Phe val Thr cys Glu Tyr Asp Asp Thr val 785 790 795 aca gat gtg tat ttg ctt gag gga aaa tat ate aga tta gaa gça tea 2451 Thr Asp vai Tyr Leu Leu Glu Gly Lys Tyr ile Arg Leu Glu Ala Ser 800 805 810 tcc ate aat gtc aat ctc tea ata gtt tea gaa aaa aat gac aat gçt 2499 Ser ile Asn vai Asn Leu ser ile val ser Glu Lys Asn Asp Asn Ala 815 820 825 gtc tct aca gaa cca aat agt aca ggg aat cca ttt caa cag aaa ctc 2547 vai ser Thr Glu pro Asn Ser Thr Gly Asn Pro Phe Gin Gin Lys Leu 830 835 840 845 caa aat gaa ttc tct cta cca teg gat ate gag atg cca ctg caa atg 2595 Gin Asn Glu Phe ser Leu Pro Ser Asp Ile Glu Met Pro Leu Gin Met 850 855 860 tct aag caa aaa age aaa tea gga gtg aat ggt agt ttt gçt gçt ctt 2643 Ser Lys Gin Lys ser Lys ser Gly val Asn Gly ser Phe Ala Ala Leu 865 870 875 gag ctt tea gaa gçt tea gtg gaa tea gçt ggt gça aaa gçt gçt gça 2691 Glu Leu Ser Glu Ala ser vai Glu Ser Ala Gly Ala Lys Ala Ala Ala 880 885 890 tgc aga act ctt tct gtt ctt gçt tea ttg tct aat aaa gtç tat agt 2739 Cys Arg Thr Leu Ser Val Leu Ala Ser Leu Ser Asn Lys Val Tyr ser 895 900 905 gat caa gga gtt cca gea gcc ttt aga gtç cct tct ggt gçt gtg ata 2787 Asp Gin Gly vai Pro Ala Ala Phe Arg Val Pro ser Gly Ala Val ile 910 915 920 925 cca ttt gga tea atg gag gat gçg ctc aag aaa agt gga tea ctg gaa 2835 Pro phe Gly ser Met Glu Asp Ala Leu Lys Lys Ser Gly Ser Leu Glu 930 935 940 tcc ttt aca age ctt cta gaa aag att gaa aca gcc aaa gtc gaa aat 2883 ser Phe Thr Ser Leu Leu Glu Lys lie Glu Thr Ala Lys Val Glu Asn 945 950 955 -134 - ggt gaa gxx gax age ccg gcg ttg gag cta caa gea ata att tea cat 2931

Gly Glu vai Asp ser Leu Ala Leu Glu Leu Gin Ala lie ile Ser His 960 965 970 ctt tcc cca ccg gag gag act att ata ttt etc aaa aga ate ttc cca 2979

Leu ser Pro Pro Glu Glu Thr ile ile Phe Leu Lys Arg ile Phe Pro 975 980 985 cag gat gtc cgg ttg att gtt aga tet agt gct aat gtg gag gat ttg 3027

Gin Asp val Arg Leu Ile Vai Arg ser ser Ala Asn VaT Glu Asp Leu 990 995 1000 1005 gçt Ala ggt atg tea gct Gly Met ser Ala 1010 gçt Ala ggt Gly ctc Leu tat Tyr gat Asp 1015 tea Ser att Ile ccc Pro aat Asn gtç Val 1020 3072 agt Ser ctc atg gac Leu Met Asp cca Pro 1025 tgt cys gee Ala ttt Phe gga Gly gct Ala 1030 gçg Ala gtt val ggg Gly aag Lys gtt val 1035 3117 tgg gct tet Trp Ala Ser tta Leu tac Tyr 1040 aca Thr agg Arg aga Arg gçc Ala ate ile 1045 cta Leu age ser cgt Arg cga Arg gee Ala 1050 3162 gçt gat gtt Ala Gly Val tat cag Tyr Gin 1055 aga Arg gac Asp gçg Ala aca Thr atg Met 1060 gct Ala gtt val ctt Leu gtc val caa Gin 1065 3207 gaa Glu ata ctg ile Leu cag Gin cca pro 1070 gat Asp ctc Leu tcc ser ttc phe «a 1075 ctt Leu cat His act Thr gtt Val tgc Cys 1080 3252 ccc gct gac Pro Ala Asp cat His gac ASp 1085 ccc Pro aag Lys vai etç Vai cag Gin 1090 gct Ala gag QIU etc vai gee Ala cct Pro 1095 3297 ggg Gly ctg ggt gaa acg Leu Gly Glu Thr 1100 ctt Leu gct Ala tea Ser gga Gly acc Thr 1105 cgt Arg ggc Gly acc Thr ccg Pro tgg Trp 1110 3342 agg Arg ctg tea tgt Leu ser cys aac Asn 1115 aaa Lys ttc Phe gat Asp gga Gly aaa Lys 1120 gtt val gee Ala act Thr ctt Leu gçc Ala 1125 3387 ttt Phe tea aat Ser Asn ttc Phe agt ser 1130 gag Glu gag Glu atg Met gtg val gtg Val 1135 cac His aac Asn tet ser ggt Gly cct Pro 1140 3432 gee Ala aat gga Asn Gly gaa gta Glu Val 1145 att Ile cgt Arg ctt Leu act Thr gtt Val 1150 gat Asp tac Tyr age Ser aag Lys aag Lys 1155 3477 cca ttg teg gtt Pro Leu ser val gat Asp 1160 aca Thr acc Thr ttt Phe agg Arg aag Lys 1165 cag Gin ttt phe ggt Gly cag Gin cga Arg 1170 3522 ctg Leu gct gçg Ala Ala att Ile ggc Gly 1175 cag Gin tat Tyr ctg Leu gag Glu cag Gin 1180 aag Lys ttc Phe ggg Gly agt Ser gea Ala 1185 3567 cag gat gtg Gin Asp val gaa Glu ggt Gly 1190 tgc cys ctg Leu gtt val ggg Gly aaa Lys 1195 gat Asp att Ile ttt Phe ata Ile gtg val 1200 3612 caa Gin age agg ser Arg cca pro cag Gin 1205 cca Pro tag aagccgaatt c 3644 -135 - <210> 4 <211> 1206

<212> PRT <213> Oryza sativa

Met Thr Ser Leu Arg Pro Leu Glu Thr ser Leu ser lie Gly Gly Arg 1 5 10 15 Pro Arg Arg Gly 20 Leu val Leu Pro Pro 25 Pro Gly val Gly Ala 30 Gly val Leu Leu Arg 35 Arg Gly Ala Met Ala 40 Leu Pro Gly Arg Arg 45 Gly Phe Ala Cys Arg Gly Arg; ser Ala Ala Ser Ala Ala Glu Arg Thr Lys Glu Lys 50 55 60 Lys Arg Arg Asp sér Ser Lys Gin Pro Leu Val His Leu Gin val çys 65 70 75 80 Leu Glu His Gin Val Lys Phe Gly Glu His val Gly He ile Gly Ser 85 90 95 Thr Lys Glu Leu Gly Ser Trp Glu Glu Gin val Glu Leu Glu Trp Thr 100 105 110 Thr Asn Gly Trp val Cys Gin Leu Lys Leu pro Gly Glu Thr Leu val 115 120 125 Glu phe Lys Phe val lie Phe Leu val Gly Gly Lys Asp Lys lie Trp 130 135 140 Glu ASP Gly Asn Asn Arg Val val Glu Leu Pro Lys ASP Gly Lys Phe 145 150 155 160 ASP ile Vai cys His Trp Asn Arg Thr Glu Glu pro Leu Glu Leu Leu 165 170 175 Giy Thr pro Lys Phe Glu Leu val Gly Glu Ala Glu Lys Asn Thr Gly 180 185 190 GlU Asp Alá Ser Ala ser val Thr Phe Ala pro Glu Lys val Gin Asp 195 200 205 rle ser Vai val Glu Asn Gly Asp Pro Ala pro Glu Ala Glu Ser ser 210 215 220 -136 -

Lys Phe Gly Gly Gin Trp Gin Gly ser Lys Thr vai Phe Met Arg ser 225 230 235 240

Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Ala Asp Arg Met Trp Asp Thr Thr Gly 245 250 255

Leu Asp Gly ile Ala Leu Lys Leu Vai Glu Gly Asp Lys Ala ser Arg 260 265 270

Asn Trp Trp Arg Lys Leu Glu Vai Vai Arg Glv ile Leu Ser Glu Ser 275 280 285

Phe Asp Asp Gin Ser Arg Leu Gly Ala Leu Vai Tyr Ser Ala ile Tyr 29b 295 300

Leu Lys Trp lie Tyr Thr Gly Gin lie ser cys Phe Glu Asp Gly Gly 305 310 315 320

His His Arg Pro Asn Lys His Ala Glu ile ser Arg Gin ile Phe Arg 325 330 335

Glu Leu Glu Met Met Tyr Tyr Gly Lys Thr Thr ser Ala Lys Asp vai 340 345 350

Leu vai Ile Arg Lys ile His Pro Phe Leu Pro ser Phe Lys Ser Glu 355 360 365

Phe Thr Ala Ser vai Pro Leu Thr Arg ile Arg Asp Ile Ala His Arg 370 375 380

Asn Asp ile Pro His Asp Leu Lys Gin Glu Ile Lys His Thr Ile Gin 385 390 395 400

Asn Lys Leu His Arg Asn Ala Gly Pro Glu Asp Leu Ile Ala Thr Glu 405 410 415 val Met Leu Ala Arg ile Thr Lys Thr pro Gly Glu Tyr Ser Glu Thr 420 425 430 phe val Glu Gin Phe Thr ile Phe Tyr ser Glu Leu Lys Asp Phe Phe 435 440 445

Asn Ala Gly ser Leu Phe Glu Gin Leu Glu ser ile Lys Glu ser Leu 450 455 460

Asn Glu Ser Gly Leu Glu Val Leu ser Ser Phe Val Glu Thr Lys Arg 465 470 475 480

Ser Leu Asp Gin Val Asp His Ala Glu Asp Leu Asp Lys Asn Asp Thr 485 490 495 -137- ile Gin ile Leu Met Thr Thr Leu Gin Ser Leu ser ser Leu Arg ser 500 505 510

Vai Leu Met Lys Gly Leu Glu ser Gly Leu Arg Asn Asp Ala Pro Asp 515 520 525

Asn Ala lie Ala Met Arg Gin Lys Trp Arg Leu cys Glu Ile Ser Leu 550 535 540

Glu Asp Tyr Ser Phe vai Leu Leu ser Arg Phe ile Asn Thr Leu Glu 545 550 555 560

Ala Leu Gly Gly Ser Ala Ser Leu Ala Lys Asp Vai Ala Arg Asn Thr 565 570 575

Thr Leu Trp Asp Thr Thr Leu Asp Ala Leu Vai ile Gly ile Asn Gin 580 585 590 vai Ser Phe Ser Gly Trp Lys Thr Asp Glu Cys ile Ala Ile Gly Asn 595 600 605

Glu ile Leu Ser Trp Lys Gin Lys Gly Leu Ser Glu Ser Glu Gly cys 610 615 620

Glu Asp Gly Lys Tyr ile Trp Ser Leu Arg Leu Lys Ala Thr Leu Asp 625 630 635 640

Arg Ala Arg Arg Leu Thr Glu Glu Tyr ser Glu Ala Leu Leu ser ile 645 650 655

Phe pro Glu Lys vai Met vai Ile Gly Lys Ala Leu Gly He Pro Asp 660 665 670

Asn Ser vai Arg Thr Tyr Thr Glu Ala Glu Ile Arg Ala Gly ile Vai 675 680 685

Phe Gin vai Ser Lys Leu Cys Thr vai Leu Gin Lys Ala Ile Arg Glu 690 695 700

Vai Leu Gly Ser Thr Gly Trp Asp vai Leu Vai Pro Gly vai Ala His 705 710 715 720

Gly Thr Leu Met Arg vai Glu Arg Ile Leu Pro Gly ser Leu Pro Ser 725 730 735

Ser val Lys Glu Pro Vai vai Leu Ile Vai Asp Lys Ala Asp Gly Asp 740 745 750

Glu Glu val Lys Ala Ala Gly Asp Asn Ile val Gly val Ile Leu Leu 755 760 765 -138-

Gln Glu Leu Pro His Leu Ser His Leu Gly vai Arg Ala Arg Gin Glu 770 775 780

Asn vai Vai Phe vai Thr cys Glu Tyr Asp Asp Thr vai Thr Asp vai 785 790 795 800

Tvr Leu Leu Glu Gly Lys Tyr ile Arg Leu Glu Ala Ser ser ile Asn 805 810 815 val Asn Leu Ser Ile Vai ser Glu Lys Asn Asp Asn Ala Vai ser Thr 820 825 830

Glu Pro Asn Ser Thr Gly Asn Pro Phe Gin Gin Lys Leu Gin Asn Glu 835 840 845

Phe ser Leu Pro Ser Asp ile Glu Met Pro Leu Gin Met ser Lys Gin 850 855 860

Lys Ser Lys Ser Gly Val Asn Gly ser Phe Ala Ala Leu Glu Leu ser 865 870 875 880

Glu Ala Ser val Glu ser Ala Gly Ala Lys Ala Ala Ala Cys Arg Thr 885 890 895

Leu ser val Leu Ala ser Leu ser Asn Lys val Tyr ser Asp Gin Gly 900 905 910

Val Pro Ala Ala Phe Arg val Pro ser Gly Ala val Ile Pro Phe Gly 915 920 925

Ser Met Glu Asp Ala Leu Lys Lys ser Gly Ser Leu Glu ser Phe Thr 930 935 940

Ser Leu Leu Glu Lys Ile Glu Thr Ala Lys val Glu Asn Gly Glu val 945 950 955 960 asd Ser Leu Ala Leu Glu Leu Gin Ala Ile Ile Ser His Leu Ser Pro K 965 970 975

Pro Glu Glu Thr Ile ile Phe Leu Lys Arg Ile Phe pro Gin Asp val 980 985 990

Ara Leu ile val Arg ser ser Ala Asn val Glu Asp Leu Ala Gly Met 995 1000 1005

Ser Ala Ala Gly Leu Tyr Asp ser Ile pro Asn Val ser Leu Met 1010 1015 1020 Asp Pro cys Ala Phe Gly Ala Ala Val Gly Lys val Trp Ala ser 1025 1030 1035 -139 -

Leu Tyr Thr Arg Arg Ala Ile Leu Ser Arg Arg Ala Ala Gly Vai 1040 1045 1050

Tyr Gin Arg Asp Ala Thr Met Ala vai Leu vai Gin Glu ile Leu 1055 1060 1065

Gin pro Asp Leu Ser Phe Vai Leu His Thr Vai Cys pro Ala asd 1070 1075 1080

His Asp Pro Lys vai Vai Gin Ala Glu vai Ala Pro Gly Leu Gly 1085 1090 1095

Glu Thr Leu Ala Ser Gly Thr Arg Gly Thr Pro Trp Arg Leu ser 1100 1105 1110

Cys Asn Lys Phe Asp Gly Lys Vai Ala Thr Leu Ala phe Ser Asn 1115 1120 1125

Phe ser Glu Glu Met Vai vai His Asn Ser Gly Pro Ala Asn Gly 1130 1135 1140

Glu val ile Arg Leu Thr Vai Asp Tyr ser Lys Lys pro Leu Ser 1145 1150 1155 val Asp Thr Thr Phe Arg Lys Gin Phe Gly Gin Arg Leu Ala Ala 1160 1165 1170 ile Gly Gin Tyr Leu Glu Gin Lys Phe Gly Ser Ala Gin Asp val 1175 1180 1185

Glu Gly cys Leu val Gly Lys Asp ile Phe ile val Gin ser Arg 1190 1195 1200

Pro Gin Pro 1205

<210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Oryza sativa, Arabidopsis thaliana, sorgo bicolor <400> 5

Leu pro His Leu Ser His Leu Gly Val Arg Ala Arg 1 5 10 - 140 - <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 6

Ser Arg Arg Vai Ala Gly Vai 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 1

Vai Glu Ala Glu Val Ala Pro 1 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 8

His Thr vai Ser Pro Ser Asp His Asp 1 5 <210> 9 <211> 807 <212> ADN <213> <22 0> Hordeum vulgare <221> CDS <222> (3)..(590) <223> <400> 9 cg gca cga gga gtc ctc ccc aat gtg age ctc teg gac cca acc aac Ala Arg Gly vai Leu Pro Asn vai ser Leu ser Asp pro Thr Asn 47 - 141 - 15 10 15 ttc 999 tet gça gta gçg cgg 9tç tgg gçc teg ctg tac act cgg agg 95 Phe Gly ser Ala vai 20 Ala Arg vai Trp Ala 25 Ser Leu Tyr Thr Arg 30 Arg gçc ate ctc age ege cgg gtg gçt ggc gtg ccc cag agg gac gçc aag 143 Ala ile Leu Ser Arg Arg VaT Ala Gly vai Pro Gin Arg Asp Ala Lys 35 40 45 atg gct gtç ctg gtg ran nan atg ctg gag cca nan cta frr ww ttc gtg 191 Met Ala vai Leu vai Gin Glu Met Leu Glu Pro Glu Leu Ser Phe val 50 55 60 ctc cac acg gtç age ccc teg gac cac gac acc agg gtc gtc gag gct 239 Leu His 65 Thr vai ser Pro ser 70 Asp His Asp Thr Arg 75 Val val Glu Ala gag gtt gçc ccg ggg ctg ggc gag acc ctt gçc gçt ggc acc ege ggc 287 Glu Vai Ala Pro Gly Leu Gly Glu Thr Leu Ala Ala Gly Thr Arg Gly 80 85 90 95 acc ccg tgg cgt ctc tcc tgc gac aag ttc gac acc gac gtc gçc acc 335 Thr Pro Trp Arg Leu Ser cys Asp Lys Phe Asp Thr Asp val Ala Thr 100 105 110 ctg gçc ttc gçc aac ttc agt gag gag atg cgg gtg ctc ggc teg ggc 383 Leu Ala Phe Ala Asn Phe ser Glu Glu Met Arg Vai Leu Gly Ser Gly 115 120 125 ccc gçc gac ggc gag gtg gtg agg ctc act gtç gac tac age acg aag 431 Pro Ala Asp Gly Glu vai vai Arg Leu Thr vai Asp Tyr Ser Thr Lys 130 135 140 ctg ctc tcc gtc gac agg acc ttc agg cag aag ttc ggt cag cgg ctg 479 Leu Leu 145 Ser vai Asp Arg Thr 150 Phe Arg Gin Lys Phe 155 Gly Gin Arg Leu gçc gçc gtg ggg cag tac ctg gag cag agg ttc ggg age gçc cag gac 527 Ala Ala vai Gly Gin Tyr Leu Glu Gin Arg Phe Gly Ser Ala Gin Asp 160 165 170 175 gtg gag ggc tgc atg gtç tgg gaa gac ate tac ata gtg cag age atg 575 vai Glu Gly cys Met Vai Trp Glu Asp Ile Tyr Ile Val Gin Ser Met 180 185 190 cca caa ccg ctg tag agtcatccgt . aataatgttt agatgagcaa agttttggtt 630 ΡΓΟ Gin Pro Leu 195 ggtgaaataa aatttgccga aaatcccatg gcaaaataag tcaggtatga agagcccgcc 690 tgcgaaacca actgattcta aataatgttt tgaattcgtg tttaaattat gggacgtgaa 750 caatgatttc cttggaatgc atgcattgta agttttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 807

<210> 10 <211> 195 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 10 - 142-

Ala Arg Gly Val Leu pro Asn Val Ser Leu Ser Asp Pro Thr Asn Phe 1 5 10 15 Giy Ser Ala val Ala Arg val Trp Ala Ser Leu Tyr Thr Arg Arg Ala 20 25 30 lie Leu Ser Arg Arg val Ala Gly val pro Gin Arg Asp Ala Lys Met 35 40 45 Ala vai Leu Val Gin Glu Met Leu Glu Pro Glu Leu Ser Phe val Leu 50 55 60 His Thr vai ser Pro ser ASP His Asp Thr Arg val val Glu Ala Glu 65 70 75 80 vai Ala Pro Gly Leu Gly GlU Thr Leu Ala Ala Gly Thr Arg Gly Thr 85 90 95 pro Trp Arg Leu ser cys ASP Lys Phe Asp Thr Asp Val Ala Thr Leu 100 105 110 Ala Phe Ala Asn Phe ser Glu Glu Met Arg Val Leu Gly Ser Gly pro 115 120 125 Ala Asp Gly Glu val val Arg Leu Thr Val Asp Tyr Ser Thr Lys Leu 130 135 140 Leu Ser Vai Asp Arg Thr Phe Arg Gin Lys Phe Gly Gin Arg Leu Ala 145 150 155 160 Ala val Gly Gl n Tyr Leu Glu Gin Arg Phe Gly Ser Ala Gin Asp «í T Γ Val 165 170 175 Glu Gly Cys Met val Trp Glu Asp lie Tyr lie val Gin ser Met Pro 180 185 190

Gln ργο Leu 195

<210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Solanum tuberosum <400> 11

Pro Glu Glu cys Lys Ala vai Gly Asn 1 5 - 143 - <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Solanum tuberosum <4 0 0> 12 Thr Gl 1 u Glu Tyr ser Glu Thr 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Solanum tuberosum <4 0 0> 13 Arg Phe vai Asn 1 Ala vai Glu 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Solanum tuberosum <4 0 0> 14 Glu Gly Ser Glu 1 Asp Gly Lys 5 <210> 15 <211> 403 <212> ADN <213> Solanum tuberosum <22 0> <221> CDS <222> (1) . . (402 <4 0 0> 15 <223> - 144- gçg gat gçt tea ata gct atg cgt cag aag tgg cgt ctc tgc gaa ate 48 Ala Asp Ala ser lie Ala Met Arg Gin Lys Trp Arg Leu cys Glu Ile 1 5 10 15 ggg ctt gaa gac tat gça ttt ctt ttg age agg ttt gtg aat gea 96 Gly Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Vai Leu Leu Ser Arg Phe vai Asn Ala 20 25 30 gtt gaa gct cta ggc gga gct gat tgg ctt gea gag aat gta aca gtg 144 vai Glu Ala Leu Gly Gly Ala Asp Trp Leu Ala Glu Asn vai Thr vai 35 40 45 aaa aac att agt tet tgg aat gat cca att gga gea ctt aca gtt gga 192 Lys Asn ile Ser ser Trp Asn Asp Pro Ile Gly Ala Leu Thr vai Gly 50 55 60 ate caa cag cta ggt ata tet ggt tgg aag ccc gag gaa tgc aaa gct 240 ile Gin Gin Leu Gly ile ser Gly Trp Lys Pro Glu Glu cys Lys Ala 65 70 75 80 gtt gga aat gaa ctt ttg tea tgg aaa gaa agg ggt att tea gaa att 288 vai Gly Asn Glu Leu Leu ser Trp Lys Glu Arg Gly He ser Glu Ile 85 90 95 gaa ggc age gaa gat ggt aag act ata tgg gea tta aga cta aaa gcg 336 Glu Gly ser Glu Asp Gly Lys Thr ile Trp Ala Leu Arg Leu Lys Ala 100 105 110 act ctt gat aga agt cga agg tta act gag gag tat tcc gag aca ctt 384 Thr Leu Asp Arg ser Arg Arg Leu Thr Glu Glu Tyr Ser Glu Thr Leu 115 120 125 ctc caa ata ttc cct gaa a 403 Leu Gin ile Phe pro Glu 130

<210> 16 <211> 134 <212> PRT <213> solanum tuberosum <400> 16

Ala Asp Ala Ser He Ala Met Arg Gin Lys Trp Arg Leu cys Glu Ile 1 5 10 15 Gly Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Vai Leu Leu Ser Arg Phe vàl Asn Ala 20 25 30 vai Gllí Ala Leu Gly Gly Ala Acn Trp Leu Ala Glu Asn Vai Thr Vai 35 40 45 Lys Asn He ser ser Trp Asn Asp pro He Gly Ala Leu Thr Vai Gly 50 55 60 Ile Gin Gin Leu Gly ile Ser Gly Trp Lys Pro Glu Glu cys Lys Ala - 145 - 65 70 75 80 vai Gly Asn Glu Leu Leu Ser Trp Lys Glu Arg Gly lie ser Glu lie 85 90 95

Glu Gly Ser Glu Asp Gly Lys Thr lie Trp Ala Leu Arg Leu Lys Ala mn mc nn

xvv XV«/ XXV

Thr Leu Asp Arg Ser Arg Arg Leu Thr Glu Glu Tyr Ser Glu Thr Leu 115 120 125

Leu Gin ile Phe Pro Glu 130

<210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Sorgo bicolor <4 0 0> 17

Asp Gly Gly His His Arg Pro 1 5

<210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Sorgo bicolor <400> 18

Asp Ala Pro Asp ser Ala lie Ala 1 5 <210> 19 <211> 9

<212> PRT <213> sorgo bicolor <400> 19 lie Pro Glu Asn Ser vai Arg Thr Tyr <210> 20 -146-

<211> 6 <212> PRT <213> sorgo bicolor <400> 20 vai Asn Lys Ala Asp Gly 1 5 <210> 21 <211> 1526

<212> ADN <213> sorgo bicolor <220> <221> CDS <222> (2)..(1525) <223> <400> 21 g cac gag gct gaa tat gtt cat gat cag agt cac ctg gag gct ctt aca 49

His Glu Ala Glu Tyr vai His Asp Gin Ser His Leu Glu Ala Leu Thr 15 10 15 tat tct gca ata tat cta aag tgg ata tat act ggt caa ata cca tgc 97

Tyr ser Ala ile Tyr Leu Lys Trp ile Tyr Thr Gly Gin He Pro Cys 20 25 30 ttt gag gat ggt ggt cac cat cga ccc aat aaa cat gct gag ata tcc 145 phe Glu Asp Gly Gly His His Arg Pro Asn Lys His Ala Glu lie ser 35 40 45 agg caa att ttt cgt gaa att gaa agg ata tac tat ggg gaa aac aca 193

Arg Gin lie Phe Arg Glu lie Glu Arg He Tyr Tyr Gly Glu Asn Thr 50 55 60 tca gct cag gat ttg ctt gtg ata cgc aag att cat cct tgt cta cct 241

Ser Ala Gin Asp Leu Leu vai lie Arg Lys li e His Pro Cys Leu Pro 65 70 75 80 tca ttt aaa tca gaa ttt act acc tct att cct cta aca rga att cgt 289 ser Phe Lys Ser Glu Phe Thr Ala ser vai Pro Leu Thr Arg lie Arg 85 90 95 gat att gct cat cgt aat gac ata cca cat gat ctc aag caa gaa ate 337

Asp ile Ala His Arg Asn Asp ile Pro His Asp Leu Lys Gin Glu lie 100 105 110 aag cat act ata caa aac aag ctt cac cgg aat gee ggc cct gag gat 385

Lys His Thr He Gin Asn Lys Leu His Arg Asn Ala Gly Pro Glu Asp 115 120 125 433 -147- 433 -147- ctt att gct act gaa gee atg ctt gçt agg att act aag act cct gga Leu Ile Ala Thr Glu Ala Met Leu Ala Arg Ile Thr Lys Thr Pro Gly 130 135 140 gag tac agt gaa gçt ttt gtt gaa caa ttc aag acg ttt tat agt gaa Glu Tyr ser Glu Ala Phe Vai Glu Gin Phe Lys Thr Phe Tyr Ser Glu 145 150 155 160 tta aaa gat ttc ttc aat gct ggc age cta ctg gag caa gtg caa tcc Leu Lys Asp Phe Phe Asn Ala Gly Ser Leu Leu Glu Gin Val Gin Ser 165 170 175 ate gag caa tet ttg gat gag tet ggc tta gaa gçt ctc tea tcc ttt He Glu Gin ser Leu Asp Glu ser Gly Leu Glu Ala Leu Ser Ser Phe 180 185 190 ctg aaa acc aaa aag aat tta gac caa ctg gaa gat gea aaa gat ttg Leu Lys Thr Lys Lys Asn Leu Asp Gin Leu Glu Asp Ala Lys Asp Leu 195 200 205 gat gaa aat ggt ggc gct caa gtt ttg ttg aaa gçc ttg ctg teg tta Asp Glu Asn Gly Gly vai Gin vai Leu Leu Lys Ala Leu Leu ser Leu 210 215 220 tet tat cta aga tea att cta atg aag ggt ctg gaa agt ggc ctt aga Ser Tyr Leu Arg Ser Ile Leu Met Lys Gly Leu Glu Ser Gly Leu Arg 225 230 235 240 aat gat gçt cca gat agt gçt att gça atg cga caa aag tgg cgt ctt Asn Asp Ala Pro Asp Ser Ala Ile Ala Met Arg Gin Lys Trp Arg Leu 245 250 255 tgt gag ate ggg ctt gaa gat tat teg ttt gta ttg tta agt aga tac rwr W e Glu ile Gly Leu Glu Acn rwfs Ti/r »7» Ser Phe val Leu 1 AI 1 bCM C ΑΠ Arg Tyr 260 265 270 ate aat gçt ctt gaa gçt ttg ggt gga tea gçt tea ctt gea gag ggt ile Asn Ala Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Ala Ser Leu Ala Glu Gly 275 280 285 ctt cct aca aat aca agt cta tgg gat gat gee ctt gat gçc ctt gtç Leu pro Thr Asn Thr Ser Leu Trp Asp Asp Ala Leu Asp Ala Leu val 290 295 300 att ggc ata aat caa gtt age ttt tea gga tgg aaa cca aat gag tgt Ile Gly ile Asn Gin vai ser Phe ser Gly Trp Lys Pro Asn Glu cys 305 310 315 320 act gça ata gtg aat gag ctt ctt tet tgg aag cag aaa ggt cta tet Thr Ala ile vai Asn Glu Leu Leu Ser Trp Lys Gin Lys Gly Leu ser 325 330 335 gaa ttt gaa ggc agt gag gat gga aag tat att tgg gea ctg aga ctc Glu Phe Glu Gly Ser Glu Asp Gly Lys Tyr ile Trp Ala Leu Arg Leu 340 345 350 aaa gçc act ctt gat aga tea cga aga cta aca gaa gaa tac tet gaa Lys Ala Thr Leu Asp Arg ser Arg Arg Leu Thr Glu Glu Tyr Ser Glu 355 360 365 gea ctt ctt tet ata ttt cct gaa aaa gtc aag gtt ctt ggg aaa gee Ala Leu Leu Ser Ile Phe pro Glu Lys Val Lys val Leu Gly Lys Ala 370 375 380 ctt gga ata cca gag aac agt gtg aga aca tac act gaa gct gaa att Leu Gly ile Pro Glu Asn Ser vaí Arg Thr Tyr Thr Glu Ala Glu Ile 385 390 395 400 481 529 577 625 673 721 769 817 865 913 961 1009 1057 1105 1153 1201 -148 - cgt gct ggt Arg Ala Gly gtt vai att ttt ile Phe 405 cac His gtc val teg Ser aaa Lys 410 ctt Leu tgc cys act Thr gta val ctt Leu 415 tta Leu 1249 aaa gca act Lys Ala Thr cga Arg 420 gca gtt Ala vai ctt Leu gga Gly teg Ser 425 tet Ser tgg Trp gat Asp gtt val 430 ctt Leu gtt val 1297 cct gga gtg Pro Gly vai 435 gcc Ala cat gga His Gly rtrr Ala +··+-γ· Leu 440 ata ile cag Gin «3 gaa Glu 3Π9 Arg 445 ata lie r*/-*t* Ala cct Pro 1345 gga tca ttg Gly ser Leu 450 cca pro tca tcc ser ser ate ile 455 aaa Lys gaa Glu cct pro gtc val gtg val 460 cta Leu gtt val gta val aac Asn 1393 aag gct gat Lys Ala Asp 465 gga gat gaa Gly Asp Glu 470 g?g Glu gtc Val aaa Lys gçt Ala gçt Ala 475 ggg Giy gat Asp aac Asn ata ile gtg val 480 1441 ggt gtt att Gly vai ile ctt Leu cta caa Leu Gin 485 gaa Glu tta Leu cct pro cac His 490 cta Leu tca ser cat His ctt Leu ggt Gly 495 gtt val 1489 aga gct cgt Arg Ala Arg caa gag aaa Gin Glu Lys 500 g« val gta Val ttt Phe 505 gta val act Thr tgc cys 9 1526 <210> 22 <211> 508

<212> PRT <213> sorgo bicolor <400> 22 - 149-

His Glu Ala Glu Tyr vai His Asp Gin Ser His Leu Glu Ala Leu Thr 1 5 10 15

Tyr Ser Ala lie Tyr Leu Lys Trp ile Tyr Thr Gly Gin ile Pro cys 20 25 30

Phe Glu Asp Gly Gly His His Arg pro Asn Lys His Ala Glu lie ser 35 40 45

Arg Gin lie Phe Arg Glu Ile Glu Arg Ile Tyr Tyr Gly Glu Asn Thr 50 55 60

Ser Ala Gin Asp Leu Leu vai ile Arg Lys ile His Pro Cys Leu pro 65 70 75 80

Ser Phe Lys ser Glu Phe Thr Ala ser Vai Pro Leu Thr Arg ile Arg 85 90 95

Asp Ile Ala His Arg Asn Asp ile pro His Asp Leu Lys Gin Glu ile 100 105 110 -150-

Lys HÍS Thr Ile Gin Asn Lys Leu HÍS Arg Asn Ala Pro Glu ASP 115 120 125 Leu Ile Ala Thr Glu Ala Met Leu Ala Arg ile Thr Lys Thr pro Gly 130 135 140 Glu 145 Tyr Ser Glu Ala Phe 150 Val Glu Gin phe Lys 155 Thr Phe Tyr Ser Glu 160 Leu Lys Asp Phe Phe 165 Asn Ala Gly Ser Leu 170 Leu Glu Gin Val Gin 175 ser lie Glu Gin Ser Leu Asp Glu Ser Gly Leu Glu Ala Leu Ser Ser Phe 180 185 190 Leu Lys Thr 195 Lys Lys Asn Leu ASp 200 Gin Leu Glu Asp Ala 205 Lys Asp Leu Asp Glu Asn Gly Gly val Gin val Leu Leu Lys Ala Leu Leu Ser Leu 210 215 220 Ser 225 Tyr Leu Arg Ser Ile 230 Leu Met Lys Gly Leu 235 Glu ser Gly Leu Arg 240 Asn Asp Ala Pro Asp Ser Ala ile Ala Met Arg Gin Lys Trp Arg Leu 245 250 255 cys Glu Ile Gly 260 Leu Glu Asp Tyr Ser 265 Phe Val Leu Leu ser 270 Arg Tyr ile Asn Ala Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Ala Ser Leu Ala Glu Gly 275 280 285 Leu Pro Thr Asn Thr Ser Leu Trp Asp Asp Ala Leu Asp Ala Leu Val 290 295 300 Ile Gly Ile Asn Gin val Ser Phe ser Gly Trp Lys Pro Asn Glu Cys 305 310 315 320 Thr Ala Ile Val Asn Glu Leu Leu ser Trp Lys Gin Lys Gly Leu Ser 325 330 335 Glu Phe Glu Gly Ser Glu Asp Gly Lys Tyr Ile Trp Ala Leu Arg Leu 340 345 350 Lys Ala Thr Leu Asp Arg ser Arg Arg Leu Thr Glu Glu Tyr ser Glu 355 360 365 Ala Leu Leu ser ile Phe Pro Glu Lys Val Lys val Leu Gly Lys Ala 370 375 380 -151 -

Arg Ala Gly vai lie Phe His vai ser Lys Leu cys Thr vai Leu Leu

Lys Ala Thr Arg Ala vai Leu Gly Ser ser vai Trp Asp Vai Leu vai

Prn elv vai Ala His. Gly Ala Leu lie Gin vai Glu Arg ile Ala Pro pro « y V|5 440 44|

Gly ser Leu Pro Ser ser lie Lys Glu Pro vai vai Leu vai Vai Asn 450 455 460

Lys Ala Asp Gly Asp Glu Glu vai Lys Ala Ala Gly Asp Asn lie vai

Glv val ile Leu.Leu Gin Glu Leu Pro His Leu ser His Leu Gly Vai y 485 490 495

Arg Ala Arg Gin Glu Lys val val Phe val Thr cys 500 505

<210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 23

Arg Asn Asp Ala Thr Asp Ala Gly

<210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 24

Gly Asn Thr ser val Trp Asp Asp 1 5 <210> 25 <211> 509 -152-

<212> ADN <213> Triticum aestivum <22 0> :221 > CDS <222> 1 :d . • (5 07) <22 !3> O O > 2 5 aat ggc gct ttt gtc gaa caa ttt caa ata Asn Gly Ala Phe vai Glu Gin Phe Gin ile 1 5 10 gac ttc ttt aat gcc ggc age ctg ttt gaa Asp Phe Phe Asn Al a Gly ser Leu Phe Glu 20 25 gaa tct ttg aat gat tct ggc tta gaa gea Glu ser Leu Asn Asp Ser Gly Leu Glu Ala 35 40 acc aaa cag agt ttg gac caa gtg gat gct Thr Lys Gin Ser Leu Asp Gin val Asp Ala 50 55 atg aag acc ttg cag tca' ttg tct tca ttg Met Lys Thr Leu Gin Ser Leu Ser Ser Leu 65 70 ggc ctt gaa agt ggc ctt aga aat gat gcg Gly Leu Glu Ser Gly 85 Leu Arg Asn Asp Ala 90 atg cga caa aag tgg ege ctt tgt gag att Met Arg Gin Lys Trp Arg Leu cys Glu Ile 100 105 ttt gtt ttg tta age aga tat ate aat ggt Phe Vai Leu Leu Ser Arg Tyr lie Asn Gly 115 120 tca gct tca ctt gea caa tgt gtg gct gga Ser Ala Ser Leu Ala Gin Cys vai Ala Gly 130 135 gat acc ctt gat gcc ctt att att ggc gtç ÍIÇ Thr Leu Asp Ala Leu 150 lie ile Gly val ggt tgg aag cca gag gaa tgc att gçt at Gly Trp Lys Pro Glu Glu cys ile Ala 165

<210> 26 <211> 169 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 26 ttt tat age gaa cta aaa 48 Phe Tyr Ser Glu Leu 15 Lys caa ctg gaa tcc ate aag 96 Gin Leu Glu Ser ile Lys 30 ctg tca tca ttt gtc aaa 144 Leu Ser Ser Phe val Lys 45 gcg aac att caa gtt gtg 192 Ala Asn ile Gin Val val 60 aga tca gtt cta atg aag 240 Arg 75 Ser val Leu Met Lys 80 act Thr gat Asp gcc Ala ggt Gly ata ile gea Ala 288 95 ggt ctt gag gat tat tct 336 Gly Leu Glu Asp 110 Tyr ser ctt gaa gct tca ggt gga 384 Leu Glu Ala Ser Gly Gly 125 aat aca agt gta tgg gac 432 Asn Thr ser val Trp Asp 140 aat caa gtt age ttt tca 480 Asn Gin Val Ser Phe ser 155 160 509 -153- Asn 1 Gly Ala Phe val 5 Asp Phe Phe Asn 20 Ala Glu ser Leu Asn Asp 35 Thr Lys Gin Ser Leu 50 Met Lys Thr Leu Gin 65 Gly Leu Glu Ser Gly 85 Met Arg Gin Lys Trp 100 Phe Vai Leu Leu ser 115 Ser Ala Ser Leu Ala 130

Asp Thr Leu Asp Ala 145 Glu Gin Phe Gin Ile 10 Gly Ser Leu Phe Glu 25 ser Gly Leu Glu Ala 40 ASp Gin 55 val Asp Ala ser Leu Ser Ser Leu 70 Leu Arg Asn Asp Ala 90 Arg Leu Cys Glu Ile 105 Arg Tyr Ile Asn Gly 120 Gin cys 135 val Ala Gly Leu 150 ile He Gly val

Phe Tyr ser Glu Leu Lys 15

Gin Leu Glu ser lie Lys 30

Leu Ser Ser Phe Vai Lys 45

Ala Asn ile Gin Vai Vai 60

Arg Ser Vai Leu Met Lys 75 80

Thr Asp Ala Gly He Ala 95

Gly Leu Glu Asp Tyr Ser 110

Leu Glu Ala Ser Gly Gly 125

Asn Thr ser vai Trp Asp 140

Asn Gin Vai Ser Phe Ser 155 160

Gly Trp Lys Pro Glu Glu cys lie Ala -154-

REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora muito cuidado tenha sido tomado na compilação das referências, erros ou omissões não podem ser excluídos e o IEP não assume qualquer responsabilidade neste sentido.

Documentos de Patente citados na descrição wo 9627673 A [0009] wo 9507355 A [0009] wo 9711188 A [0012] wo 0077229 A [0012] us 6462256 B [0012] wo 0234923 A [0013] EP 120516 Ά . [0110] wo 9506128 A [0111] EP 0513849 A [0111] EP 0465875 A [0111] EP 0292435 A [0111] EP 04090483 A [0293] EP 04090121 A [0293] EP 04090087 A [0293] US 60549980 B [0293]

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Lisboa 5/07/2010

Claims (10)

1. - 1 - REIVINDICAÇÕES 1. Um método de identificação duma proteína que apresente actividade enzimática de fosforilação de alfa- 1.4- glucanos e que necessite de alfa-1,4-glucanos como substrato, em que a) extractos de proteína são incubados com alfa-1,4-glucanos fosforilados, b) proteínas especificamente ligadas a alfa- 1.4- glucanos fosforilados do passo a) são dissolvidas, c) proteínas obtidas conforme o passo b) são respectivamente incubadas com i ATP e alfa-1,4-glucanos fosforilados e ii ATP e alfa-1,4-glucanos não fosforilados em preparações separadas uma da outra, d) o respectivo alfa-1,4-glucano obtido após a incubação no passo c) i ou passo c) ii é examinado para introdução de mais grupos de fosfato e e) são identificadas proteínas que na preparação da incubação de acordo com c) i introduziram grupos fosfato em alfa-1,4-glucanos numa quantidade que é pelo menos duas vezes superior à quantidade determinada em experiências de controlo e na preparação da incubação de acordo com c) ii não introduziram grupos fosfato em alfa- 1.4- glucanos numa quantidade que é pelo menos duas vezes superior à quantidade determinada em experiências de controlo. 2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína com actividade enzimática de fosforilação de alfa-1,4-glucanos usa amido fosforilado como substrato -2- 3. 0 método de acordo com a reivindicação 2, em que a proteina com actividade enzimática de fosforilação de alfa-1,4-glucano tem origem numa planta.
2. 4. Uma proteina que requer alfa-1,4-glucanos fosforilados como substrato e introduz ligações de fosfato monoésteres na posição C-3 duma molécula de glicose do alfa-1,4-glucano, caracterizado por a sua sequência de aminoácidos codificadora ter um domínio de fosfohistidina com pelo menos 60% de identidade com o domínio de fosfohistidina como identificado na SEQ ID N.° 5.
3. 5. Um método para identificar uma molécula de ácido nucleíco que codifica uma proteína que apresenta actividade enzimática de fosforilação de alfa-1,4-glucanos, em que a) uma proteína é identificada utilizando um método de acordo com uma das reivindicações de 1 a 3, b) sequências de aminoácidos que codificam a proteína identificada conforme o passo a) são determinadas e c) moléculas de ácido nucleíco são identificadas utilizando aminoácidos determinados conforme o passo b).
4. 6. O método de acordo com a reivindicação 5, em que os oligonucleotídeos de ácido nucleíco baseados na sequência de aminoácidos determinada conforme o passo b) são produzidos para identificar a referida molécula de ácido nucleíco conforme o passo c). -3-
5. 7. Um método para identificar uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína que apresente actividade enzimática de fosforilação de alfa-1,4-glucanos, em que a) uma proteína é identificada utilizando um método de acordo com uma das reivindicações de 1 a 3, b) anticorpos que reagem especificamente com a proteína identificada conforme o passo a) são produzidos e c) moléculas de ácido nucleico são identificadas através de rastreio imunológico (immunoscreening) utilizando os anticorpos produzidos conforme o passo b).
6. 8. Uma célula vegetal geneticamente modificada caracterizada por a modificação genética consistir na introdução de pelo menos uma molécula de ácido nucleico exógena no genoma da planta, em que a molécula de ácido nucleico exógena codifica uma proteína conforme a reivindicação 4, em que a célula vegetal geneticamente modificada sintetiza um amido modificado que tem um teor elevado de fosfato de amido e/ou uma distribuição de fosfato modificada comparado com o amido das plantas de tipo selvagem correspondentes.
7. 9. A célula da planta de acordo com a reivindicação 8, em que o amido modificado é caracterizado por apresentar um teor elevado de fosfato com ligação covalente ao amido na posição C-3 da molécula de glicose comparado com o amido de plantas de tipo selvagem -4- correspondentes.
8. 10. Uma planta com células geneticamente modificadas de acordo com uma das reivindicações 8 ou 9.
9. 11. Planta de acordo com a reivindicação 10, que é uma planta de milho, arroz, trigo, centeio, aveia, cevada, mandioca, batata, sagu, feijão-mungo, ervilha ou sorgo.
10. 12. Planta de acordo com a reivindicação 11, que é milho ou trigo. Lisboa, 5/07/2010 - 1/6 - kDa 116- 97- 66 -45- 29- M K P 0K1 •‘SítH-ji-feSí»*

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