JP2014221066A - 増大したデンプンリン酸化酵素活性を有する植物 - Google Patents

増大したデンプンリン酸化酵素活性を有する植物 Download PDF

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Abstract

【課題】高いリン酸含量及び／又は修飾されたリン酸分布を有する修飾されたデンプンを合成する様、デンプンリン酸化活性の増大をもたらす遺伝的に修飾された植物細胞及び植物、及び、植物においての修飾デンプン製造法の提供。【解決手段】デンプンをリン酸化するＯＫ１タンパク質、ＯＫ１タンパク質をコードする核酸を導入し、増大したデンプンリン酸含量及び／又は修飾されたリン酸分布を有する植物細胞、又はトウモロコシ植物又はコムギ植物とその収穫可能な植物部分、及び、それらを用いたリン酸化修飾デンプン誘導体及び穀粉の製造方法。【選択図】なし

Description

本発明は、遺伝的に修飾されていない対応する野生型植物細胞または野生型植物と比較して、デンプンリン酸化ＯＫ１タンパク質の活性が増大するように遺伝的に修飾された植物細胞および植物に関する。本発明はまた、そのような植物細胞および植物の作製のための手段および方法に関する。これらの型の植物細胞および植物は、修飾デンプンを合成する。したがって、本発明はまた、本発明による植物細胞および植物から合成されたデンプン、このデンプンの作製のための方法、およびこの修飾デンプンのデンプン誘導体の作製、ならびに本発明によるデンプンを含む穀粉に関する。
さらに、本発明は、デンプンリン酸化ＯＫ１タンパク質をコードする核酸、そのような核酸分子を含むベクター、宿主細胞、植物細胞、および植物に関する。ここでの追加はまたデンプンリン酸化活性を示すＯＫ１タンパク質を含む。
再生可能な原料源としての植物構成成分に現在帰せられて増大している重要性に関連して、バイオテクノロジー研究の課題の１つは、これらの植物原料を加工産業の必要条件に合致するよう適応させる努力をすることである。さらに、できるだけ多くの応用分野で用いられることになる原料の再生を可能にするために、種々様々の材料を実現することが必要である。
多糖類デンプンは、化学的に一定の基本成分、グルコース分子から構成されるが、種々の分子形の複雑な混合物を構成する。それらは重合と分岐の程度に関して差異を示し、したがってそれらの物理的・化学的特性において、互いに著しく異なる。
α−１，４−グリコシド結合したグルコース単位から構成される本質的に分岐のないポリマーであるアミロースデンプンと、α−１，６−グリコシド結合が加わって分岐が形成される分岐ポリマーであるアミロペクチンデンプンとが区別されている。アミロースとアミロペクチン間のさらに本質的な差は分子量である。デンプンの起源に依存して、アミロースは５×１０5〜１０6Daの分子量を有するのに対し、アミロペクチンの分子量は１０7〜１０8Daである。２つの巨大分子を、その分子量および種々の物理的・化学的特性によって区別することができ、それらは異なるヨウ素結合特性によって、最も容易に可視化することができる。
アミロースは長い間、α−１，４−グリコシド結合したα−Ｄ−グルコースモノマーから成る直鎖状ポリマーであると見なされてきた。最近の研究において、しかし、α−１，６−グリコシド分岐点（約０．１％）の存在が示された（Hizukuri and Takagi, Carbohydr. Res.134,(1984),1-10; Takeda et al., Carbohydr.Res. 132,（1984）, 83-92）。
デンプンの機能的持性、例えば溶解度、劣化挙動、水結合能力、被膜形成特性、粘性、糊化特性、凍結融解安定性、酸安定性、ゲル強度、およびデンプン粒のサイズ、などは、特に、例えば、アミロース／アミロペクチン比率、分子量、側鎖分布のパターン、イオン濃度、脂質およびタンパク質含有量、デンプンの平均粒子サイズ、デンプンの粒子形態、その他による影響を受ける。デンプンの機能的持性はまた、デンプンの非炭素成分であるリン酸含有量からも影響を受ける。ここで、共有結合によりモノエステルの形でデンプンのグルコース分子へ結合しているリン酸（以下にデンプンリン酸と記述する）、とリン脂質の形でデンプンに結合しているリン酸とを区別する。
デンプンリン酸含量は、植物種によって変動する。したがって、あるトウモロコシ突然変異体は、例えば、増加したデンプンリン酸含量（モチトウモロコシ０．００２％、および高アミローストウモロコシ０．０１３％）を有するデンプンを合成するが、従来型のトウモロコシは、痕跡量のデンプンリン酸のみを有する。同様に小量のデンプンリン酸がコムギ（０．００１％）で見出される。しかし、エンバクとモロコシではデンプンリン酸が検出できなかった。イネの突然変異体では、同様に、イネの従来種中（０．０１３％）よりも少ないデンプンリン酸が見出された（モチゴメ０．００３％）。有意な量のデンプンリン酸が、例えばタピオカ（０．００８％）、サツマイモ（０．０１１％）、クズウコン（０．０２１％）またはジャガイモ（０．８９％）のような、塊茎貯蔵または根茎貯蔵デンプンを合成する植物に検出された。上に引用されたデンプンリン酸含量の百分率による値は、各場合におけるデンプンの乾燥重量当たりを示し、Jane et al.(1996, Cereal Foods World 41（11), 827-832) によって決定された。
デンプンリン酸は、重合されたグルコースモノマーのＣ−２、Ｃ−３またはＣ−６位置にモノエステルの形で存在することができる（Takeda and Hizukuri, 1971, Starch/ Staerke 23, 267-272)。植物によって合成されるデンプン中のデンプンリン酸のリン酸の分布は、一般にリン酸基の約３０％から４０％がグルコース分子のＣ−３位置に共有結合により結合されており、リン酸基の約６０％から７０％がＣ−６位置に共有結合により結合されているという事実により特徴付けられる(Blennow et al., 2000, Int. J. of Biological Macromolecules 27, 211- 218）。Blennow et al.(2000, Carbohydrate Polymers 41, 163-174) が、様々なデンプンのグルコース分子のＣ−６位置に結合しているデンプンリン酸含量を決定した。それは例えば、ジャガイモデンプン（デンプンmg当たり７．８〜３３．５nmol、型に依存する）、様々なCurcuma種のデンプン（mg当たり１．８〜６３nmol）、タピオカデンプン（デンプン mg当たり２．５nmol）、コメデンプン（デンプンmg当たり１．０nmol）、リョクトウデンプン（デンプン mg当たり３．５nmol）およびモロコシデンプン（デンプンmg当たり０．９nmol）などであった。この著者は、オオムギデンプンおよびトウモロコシの種々のモチ突然変異体のデンプン中には、Ｃ−６位置に結合されたデンプンリン酸を示すことができなかった。今までに、植物の遺伝子型とデンプンリン酸含量の間の関係を明らかにすることはできなかった（Jane et al., 1996, Cereal Foods World 41（11), 827-832）。したがって、現在、育種によって植物中のデンプンリン酸含量に影響を及ぼすことはできない。
これまでに、デンプンのグルコース分子へのリン酸基の共有結合の導入を仲介するタンパク質がただ１つだけ報告された。科学文献中にしばしばＲ１と称されているこのタンパク質は、ジャガイモ塊茎中の貯蔵デンプンのデンプン粒に結合しており(Lorberth et al., 1998, Nature Biotechnology 16, 473-477)、α−グルカン水ジキナーゼ（Ｅ．Ｃ．０２．０７．０９．４）酵素活性を有する。Ｒ１に触媒される反応において、遊離体α−１，４−グルカン（デンプン）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）および水が、生成物であるグルカンリン酸（リン酸化デンプン）、一リン酸およびアデノシン一リン酸に変換される。この場合、ＡＴＰのγリン酸残基は水に転移され、ＡＴＰのβリン酸残基はグルカン（デンプン）に転移される。Ｒ１は、インビトロでＡＴＰのβリン酸残基を、α−１，４−グルカンのグルコース分子のＣ−６およびＣ−３位置へ転移する。インビトロの反応で得られるＣ−６リン酸のＣ−３リン酸に対する比率が、植物から単離されるデンプン中に存在する比率に一致する（Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171）。ジャガイモデンプン中に存在するデンプンリン酸の約７０％がＣ−６位置で、また約３０％が、Ｃ−３位置でデンプンのグルコースモノマーへ結合しているので、これはＲ１がグルコース分子のＣ−６の位置を好んでリン酸化することを意味する。さらに、トウモロコシのアミロペクチンを用いて、特に、Ｒ１がまだ共有結合で結合したリン酸を含んでいないα−１，４−グルカンをリン酸化することができることが示された（Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171）、即ち、Ｒ１はα−１，４−グルカンへ新規にリン酸を導入することができる。
Ｒ１タンパク質をコードする核酸配列およびそれに対応するアミノ酸配列が様々な種から記述されている。それらには、例えば、ジャガイモ（ＷＯ ９７ １１１８８、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ.：ＡＹ０２７５２２、Ｙ０９５３３）、コムギ（ＷＯ ００ ７７２２９、ＵＳ ６，４６２，２５６、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ.：ＡＡＮ９３９２３、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ.：ＡＲ２３６１６５）、イネ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ.：ＡＡＲ６１４４５、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ.：ＡＲ４００８１４）、トウモロコシ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ.：ＡＡＲ６１４４４、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ.：ＡＲ４００８１３）、ダイズ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ.：ＡＡＲ６１４４６、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ.：ＡＲ４００８１５）、カンキツ類（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ.：ＡＹ０９４０６２）、およびArabidopsis（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ.：ＡＦ３１２０２７）などの種がある。
ジャガイモからのＲ１遺伝子の過剰発現の結果Ｒ１タンパク質の高い活性を示すコムギ植物について、ＷＯ ０２ ３４９２３に記述されている。デンプンリン酸を検出することができなかった対応する野生型の植物と比較して、これらの植物は、グルコース分子のＣ−６位置に有意な量のデンプンリン酸を有するデンプンを合成する。
共有結合により結合されたリン酸基をデンプンに導入する反応を触媒する更なるタンパク質は、これまでに報告されていない。デンプンのグルコース分子のＣ−３位置および／またはＣ−２位置に好ましくリン酸基を導入する酵素もまた知られていない。したがって、植物中のデンプンリン酸の含量を増加させることを別にして、植物によって合成されたデンプン内のリン酸分布を修飾し、および／またはデンプンリン酸の含量をさらに増加させて、植物中のデンプンのリン酸化に特異的に影響を及ぼすために利用できる方法がない。
したがって、高いリン酸含量および／または修飾されたリン酸分布を有する修飾されたデンプンを合成する植物を生成するための方法および手段を提供すること、ならびにそのような修飾されたデンプンを合成する植物細胞および／または植物を提供することが本発明の目的である。
この問題は、特許請求の範囲に記述された実施態様によって解決される。
したがって本発明は、植物細胞または植物が、遺伝的に修飾されていない対応する野生型植物細胞または野生型植物と比較して少なくとも１つのＯＫ１タンパク質の増大した活性を有していることを特徴とする、遺伝的に修飾された植物細胞および遺伝的に修飾された植物に関する。
本発明の第１の局面は、遺伝的に修飾された植物細胞または植物であって、その遺伝的修飾が、遺伝修飾されなかった対応する野生型植物細胞または野生型植物と比較して、少なくとも１つのＯＫ１タンパク質の活性の増大をもたらす、遺伝的に修飾された植物細胞または植物に関する。
同時に、遺伝的修飾は、遺伝的に修飾されていない野生型植物細胞または野生型植物と比較して、少なくとも１つのＯＫ１タンパク質の活性の増加をもたらす任意の遺伝的修飾でよい。
本発明に関連して、用語「野生型植物細胞」とは、当該植物細胞を本発明による植物細胞作製用の出発物質として用いたことを、すなわちそれらの遺伝子情報が、導入された遺伝的修飾は別にして、本発明による植物細胞の遺伝子情報に一致することを意味する。
本発明に関連して、用語「野生型植物」とは、当該植物を本発明による植物作製に出発物質として用いたことをすなわちそれらの遺伝子情報が、導入された遺伝的修飾は別にして、本発明による植物の遺伝子情報に一致することを意味する。
本発明に関連して、用語「対応する」とは、いくつかの対象の比較において、互いに比較される当該対象が同じ条件に保たれてきたことを意味する。本発明に関連して、野生型植物細胞または野生型植物に関連して用語「対応する」とは、互いに比較される植物細胞または植物が、同一の栽培条件下で生育され、およびそれらが同じ（栽培）年齢を有すことを意味する。
本発明の枠組みの中で、用語「少なくとも１つのＯＫ１タンパク質の増大した活性」とは、この場合、ＯＫ１タンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の増加、および／または細胞内のＯＫ１タンパク質量の増加、および／または細胞内のＯＫ１タンパク質の酵素活性の増加を意味する。
発現の増加を、例えばＯＫ１タンパク質をコードする転写物の量を、例えばノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲを用いて測定することにより、決定することができる。増加とは、遺伝的に修飾されていない対応する細胞と比較して、転写物の量の少なくとも５０％の、好ましくは少なくとも７０％の、より好ましくは少なくとも８５％の、および最も好ましくは少なくとも１００％の、増加を意味する。ＯＫ１タンパク質をコードする転写物の量の増加とはまた、ＯＫ１タンパク質をコードする検出可能な量の転写物を示さない植物または植物細胞が、本発明による遺伝的修飾の後に、ＯＫ１タンパク質をコードする検出可能な量の転写物を示すことを意味する。
当該植物細胞中のＯＫ１タンパク質の活性増加をもたらすＯＫ１タンパク質のタンパク質量の増加を、免疫学的方法、例えば、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）またはＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）などにより測定することができる。ここで増加とは、好ましくは、遺伝的に修飾されていない対応する植物細胞と比較した、ＯＫ１タンパク質の量の、少なくとも５０％の、特に少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８５％の、および特に好ましくは少なくとも１００％の増加を意味する。ＯＫ１タンパク質の量の増加とはまた、検出可能なＯＫ１タンパク質活性を有しない植物または植物細胞が、本発明による遺伝的修飾の後に、検出できる量のＯＫ１タンパク質を示すことを意味する。
あるタンパク質と特異的に反応する、即ち特異的に前記タンパク質に結合する抗体を製作する方法は、当業者に公知である（例えば、Lottspeich and Zorbas (Eds.), 1998, Bioanalytik, Spektrum akad, Verlag, Heidelberg, Berlin, ISBN 3-8274-0041-4 参照）。いくつかの会社（例えば Eurogentec, Belgium）が、契約サービスとしてそのような抗体の製作を行う。ＯＫ１タンパク質と特異的に反応する抗体を作製するための可能な方法の１つについては後述する（実施例１０を参照のこと）。
本発明の枠組みの中では、用語「ＯＫ１タンパク質」とは、ＡＴＰのリン酸残基を、既にリン酸化されているデンプン（Ｐ−デンプン）に転移させるタンパク質を意味すると理解するべきである。Arabidopsis thaliana sex1-3 突然変異体の葉から単離されたデンプンは、検知可能な量の共有結合で結合したリン酸残基を有せず、ＯＫ１タンパク質によってリン酸化されない、すなわち、本発明によるＯＫ１タンパク質は、さらにリン酸残基を転移するために、基質として既にリン酸化されたデンプンを要求する。
好ましくは、ＡＴＰのβリン酸残基はＯＫ１タンパク質からデンプンに転移され、ＡＴＰのγリン酸残基は水に転移される。ＯＫ１タンパク質を用いて実施された、Ｐ−デンプンのリン酸化反応によって生成されたさらなる反応生成物は、ＡＭＰ（アデノシン１リン酸）である。したがって、ＯＫ１タンパク質は、［リン酸化−α−グルカン］−水−ジキナーゼ（［Ｐ−グルカン］−水−ジキナーゼ）、または［リン酸化デンプン］−水−ジキナーゼ、と記述される。
好ましくは、ＯＫ１タンパク質によってリン酸化されるＰ−デンプンのグルコース分子のＣ−６位置および／またはＣ−３位置で、追加のリン酸モノエステル結合が生成される。ＯＫ１タンパク質によって触媒されるＰ−デンプンのリン酸化においては、当該Ｐ−デンプンのグルコース分子のＣ−６位置のリン酸モノエステル結合と比較して、Ｃ−３位置でより多くの追加のリン酸モノエステル結合が生成されるならば、特に好ましい。
ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列は、ホスホヒスチジン領域を含む。ホスホヒスチジン領域は例えば、Tien-Shin Yu et al.(2001, Plant Cell 13, 1907-1918)によって記述されている。アミノ酸をコードするＯＫ１タンパク質のホスホヒスチジン領域は、好ましくは２個のヒスチジンを含む。
ＯＫ１タンパク質によるＰ−デンプンリン酸化反応の触媒作用においては、リン酸化ＯＫ１タンパク質が中間生成物として生成され、中間生成物中では、ＡＴＰのリン酸残基がＯＫ１タンパク質のアミノ酸に共有結合により結合されている。中間生成物はＯＫ１タンパク質の自己リン酸化により生成される、即ちＯＫ１タンパク質それ自身が反応を触媒し、それが中間生成物をもたらす。好ましくは、ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列のヒスチジン残基が自己リン酸化過程の結果リン酸化され、それは特に好ましくはホスホヒスチジン領域の一部であるヒスチジン残基である。
更に本発明によるＯＫ１タンパク質は、Ｐ−デンプンに対して非リン酸化デンプンと比較して増大した結合活性を有する。
Ｐ−デンプンをさらにリン酸化するために、基質としてＰ−デンプンを要求する酵素はこれまでに報告されていなかったので、植物中の既にリン酸化されたデンプンのデンプンリン酸含量を、一定量を越えて増加させることはこれまで不可能であった。これがいまや、本発明によるタンパク質または本発明による植物の遺伝的修飾のための核酸分子を利用することにより、可能である。ＯＫ１タンパク質の機能の解明、そしてＯＫ１タンパク質を提供することにより、修飾された特性を有するデンプンを合成するように植物を遺伝的に修飾することがいまや可能である、という事実がもたらされる。植物によって合成されたデンプン中のリン酸分布を修飾することは、利用できる手段が欠けていたために、いままでは不可能であった。本発明によるタンパク質および核酸を本発明によって提供することにより、いまやネイティブのデンプン中のリン酸比率も修飾することができる。
本発明に関連して、用語「増大した結合活性」とは、タンパク質の、第２の基質と比較して第１の基質に対する増大した親和性を意味すると理解するべきである。すなわち、同じインキュベーション条件下で、第２の基質と比較して第１の基質により大量に結合するタンパク質の量は、第１の基質に対する増大した結合活性を示す。
本発明に関連して、用語「デンプンリン酸」とは、デンプンのグルコース分子に共有結合により結合しているリン酸基を意味すると理解するべきである。
本発明に関連して、用語「非リン酸化デンプン」とは、検出可能な量のデンプンリン酸を含まないデンプンを意味すると理解するべきである。デンプンリン酸量を決定する様々な方法が報告されている。好ましくは、Ritte et al. (2000, Starch/Starke 52, 179-185) により記述されたデンプンリン酸量の測定法を用いることができる。特に好ましくは、31Ｐ−ＮＭＲによるデンプンリン酸量の測定を、Kasemusuwan and Jane (1996, Cereal Chemistry 73, 702-707）により記述された方法によって実施する。
本発明に関連して、用語「リン酸化デンプン」または「Ｐ−デンプン」とは、デンプンリン酸を含むデンプンを意味すると理解するべきである。
ＯＫ１タンパク質の活性を、例えばβ位置でラベルされたリン酸残基を含むＡＴＰ（ラベルＡＴＰ）を用いて、インビトロでＯＫ１タンパク質をインキュベーションすることにより実証することができる。好ましくは、リン酸残基が特異的にβ位置でラベルされたＡＴＰ、すなわち、β位置のリン塩残基のみが標識を有するＡＴＰを用いる。好ましくは放射性ラベルされたＡＴＰ、特に好ましくはβ位置で特異的にリン酸残基が放射性ラベルされたＡＴＰ、およびとりわけ好ましくはβ位置のリン酸塩残基が33Ｐで特異的にラベルされたＡＴＰを用いる。ＯＫ１タンパク質をラベルＡＴＰおよび非リン酸化デンプンとインキュベーションする場合は、ＯＫ１によってデンプンにリン酸が転移されない。好ましくは、Arabidopsis thaliana の突然変異体 sex1-3 (Tien-Shin Yu et al., 2001 , Plant Cell 13, 1907-1918）の葉のデンプンを用いる。
一方、ＯＫ１タンパク質をＰ−デンプンとラベルＡＴＰの存在下でインキュベーションする場合は、その後でＰ−デンプンに共有結合により結合したラベルされたリン酸を示すことができる。好ましくは、Arabidopsis thaliana の葉からのデンプン、特に好ましくは、Ｒ１タンパク質 (Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171) によって酵素的にリン酸化された Arabidopsis thaliana sex1-3 突然変異体からのデンプンを用いる。
ＯＫ１タンパク質によりＰ−デンプンに取り込まれたラベルされたリン酸残基を、例えば、反応混合液の残りからラベルされたＰ−デンプンを分離し（例えばエタノールによる沈澱、濾過、クロマトグラフ法その他、により）、続いてＰ−デンプン分画のラベルされたリン酸残基を検出することにより、示すことができる。同時に、Ｐ−デンプン分画に結合したラベルされたリン酸残基を、例えばＰ−デンプン分画中に存在する放射活性の量を測定することにより（例えばシンチレーション・カウンターによる）、実証することができる。リン酸化反応用の基質としてＰ−デンプンを要求するタンパク質を実証する可能な方法について、後に一般的方法項目１１および実施例６において記述する。
Ｐ−デンプン中のグルコースモノマーの炭素原子のどの位置（Ｃ−２、Ｃ−３またはＣ−６）がＯＫ１タンパク質によって好んでリン酸化されるかを、Ritte et al.(2002, PNAS 99, 7166-7171) に記述されるように、例えばタンパク質によりリン酸化されたＰ−デンプンを分析して決定することができる。この目的のために、タンパク質によってリン酸化されたＰ−デンプンを、酸を用いて加水分解し、続いて陰イオン交換クロマトグラフィーによって分析する。
Ｐ−デンプン中のグルコースモノマーの炭素原子のどの位置（Ｃ−２、Ｃ−３またはＣ−６）がリン酸化されているか決定するために、好ましくは、ＯＫ１タンパク質によってリン酸化されたＰ−デンプンをＮＭＲによって分析する。デンプンのグルコース分子のＯＫ１タンパク質が触媒する反応によってリン酸化されるＣ−原子位置を同定するための、特に好ましい方法について、後に一般的方法項目１３に記述する。
ＯＫ１タンパク質により促進されるＰ−デンプンのリン酸化において、中間生成物として生成されるリン酸化されたタンパク質を、例えばＲ１タンパク質に対してRitte et al.(2002, PNAS 99, 7166-7171) により記述されているようにして実証することができる。
自己リン酸化された中間生成物の存在を実証するために、最初にデンプンが存在しない状態で、ＯＫ１タンパク質をラベルＡＴＰと、好ましくは特異的にβリン酸位置にラベルされたＡＴＰと、特に好ましくは33Ｐにより特異的にβリン酸位置にラベルされたＡＴＰとインキュベーションする。これと並行して、ラベルＡＴＰの代わりに、対応する量のラベルされていないＡＴＰを含む反応調製物２を、それ以外は同じ条件下でインキュベーションする。続いて、過剰のラベルされていないＡＴＰを反応混合物１に加え、ラベルされていないＡＴＰおよびラベルＡＴＰの混合物（反応混合液１中で以前に用いたものと同量のラベルＡＴＰおよび反応混合液１に過剰に加えたものと同量のラベルされていないＡＴＰ）を反応混合液２に加えて、これをさらにインキュベーションし、 その後Ｐ−デンプンを反応混合液１の部分Ａ（部分１Ａ）および反応混合液２の部分Ａ（部分２Ａ）に加える。反応混合物の残存部分１Ｂおよび部分２Ｂの反応を、タンパク質を変性させることにより止める。反応混合液の部分Ｂを、当業者に公知のタンパク質の変性をもたらす方法、好ましくはラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の添加により止めることができる。反応混合物の部分１Ａおよび部分２Ａを、少なくともさらに１０分間インキュベーションしてから、これらの反応も止める。それぞれの反応混合液の部分Ａまたは部分Ｂ中に存在するデンプンを反応混合物のそれぞれの残りから分離する。例えば、それぞれのデンプンを遠心によって分離する場合は、遠心の完了時に、反応混合物の部分Ａまたは部分Ｂのそれぞれのデンプンは、沈殿したペレット中に見出され、またそれぞれの反応混合物中のタンパク質はそれぞれの遠心分離の上清で見出される。次に反応混合物の各々部分１Ａまたは２Ａ、および各々部分１Ｂまたは２Ｂの上清を、例えば変性アクリルアミドゲル電気泳動を行い、続いて得られたアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィを行って分析することができる。アクリルアミドゲル電気泳動によって分離された放射性ラベルタンパク質の量を計るために、例えば当業者に公知のいわゆる「ホスホイメーイング」法を用いることができる。もし、反応混合物１の部分Ｂの遠心上清中のタンパク質のオートラジオグラフィまたは「phosphoimagers」による分析が、反応混合液１の部分Ａの遠心過剰に比較して、有意に増大した信号を示すならば、これはデンプンのリン酸化を促進するタンパク質が自己リン酸化された中間生成物として存在することを示す。反応混合物２の部分ＡおよびＢは対照として役立ち、したがって、オートラジオグラフィまたは「phosphoimagers」による分析においては、遠心分離上清に有意に増大した信号を示しさないはずである。
さらに、必要ならばそれぞれのデンプンを洗浄した後、使用したラベルＡＴＰに対応する標識を有するデンプンリン酸の存在について、それぞれの沈殿したペレット中に残存している反応混合物１および２のそれぞれの部分Ａのデンプンを調べることができる。もし反応混合物１の部分Ａのデンプンがラベルされたリン酸基を含んでおり、かつ反応混合液１の部分Ｂの遠心分離上清のオートラジオグラフィが、反応混合物１の部分Ａの遠心分離上清のオートラジオグラフィに比較して有意に増大した信号を示す場合は、これはデンプンのリン酸化を促進するタンパク質が自己リン酸化された中間生成物として存在することを示す。反応混合物２の部分ＡおよびＢは対照として役立ち、したがって、α−１，４−グルカンを含む沈殿ペレット中の33Ｐでラベルされたα−１，４−グルカンの有意に増大した信号は示さないに違いない。リン酸化されたＯＫ１タンパク質中間生成物を実証する可能な方法について、後に一般的方法項目１２、および実施例７に述べる。
ＯＫ１タンパク質が、Ｐ−デンプンに対して非リン酸化デンプンと比較して増大した結合活性を有することを、ＯＫ１タンパク質を、別々の調製物中でＰ−デンプンおよび非リン酸化デンプンとインキュベーションすることにより実証することができる。
すべての非リン酸化デンプンは、基本的に、ＯＫ１タンパク質を非リン酸化デンプンとインキュベーションするために適している。好ましくは非リン酸化植物デンプン、特に好ましくはコムギデンプン、およびとりわけ好ましくは Arabidopsis thaliana 突然変異体 sex1-3 の葉の粒状デンプンを用いる。
例えば植物からデンプンを単離する方法は、当業者に公知である。当業者に公知のすべての方法は、適当な植物種から非リン酸化デンプンを単離するために基本的に適する。好ましくは、後に述べる非リン酸化α−１，４−グルカンを分離するための方法を用いる（一般的方法項目２を参照のこと）。
デンプンリン酸を含むすべてのデンプンは、ＯＫ１タンパク質をＰ−デンプンとインキュベーションするために基本的に適する。化学的にリン酸化されたデンプンもまたこの目的に用いることができる。好ましくは、Ｐ−デンプン、特に好ましくは予め酵素的にリン酸化された植物デンプン、とりわけ好ましくは Arabidopsis thaliana sex-1 突然変異体から分離されて予め酵素的にリン酸化された植物粒状デンプンを、ＯＫ１タンパク質とインキュベーションするために用いる。
ＯＫ１タンパク質の、非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンへの増大した結合活性を実証するために、ＯＫ１タンパク質を別々の調製物中で、Ｐ−デンプン（調製物Ａ）、および非リン酸化デンプン（調製物Ｂ）とインキュベーションする。首尾よくインキュベーションした後、調製物ＡおよびＢの適切なデンプンに結合していないタンパク質を、デンプンおよびそれが結合するタンパク質から分離する。続いて調製物Ａ中のタンパク質とＰ−デンプン間の結合、および調製物Ｂ中のタンパク質と非リン酸化デンプン間の結合を除去する、即ちそれぞれのタンパク質を溶解する。次に、調製物Ａおよび調製物Ｂの溶解したタンパク質を、それぞれの調製物中に存在する当該デンプンから分離することができる。これに続いて、単離した調製物ＡのＰ−デンプン結合タンパク質、および単離した調製物Ｂの非リン酸化デンプン結合タンパク質を、当業者に公知の方法、例えばゲルろ過、クロマトグラフ法、電気泳動、ＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動など、の助けを借りて、分離することができる。分離された調製物Ａのタンパク質の量を、対応する分離された調製物Ｂのタンパク質の量と比較することにより、タンパク質が、非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンについて増大した結合活性を有するかどうかを決定することができる。非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンへのタンパク質の優先的結合を実証するために用いることができる方法を、後に一般的方法項目８および実施例１に記述する。
配列番号２に示すアミノ酸配列は、Arabidopsis thaliana からのＯＫ１タンパク質をコードし、また配列番号４に示すアミノ酸配列は、Oryza sativa からのＯＫ１タンパク質をコードする。
本発明のさらなる実施態様において、ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列は配列番号２または配列番号４に指定された配列と、少なくとも６０％の、特に少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８０％の、特に好ましくは少なくとも９０％の、およびとりわけ好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。
本発明のさらなる実施態様において、ＯＫ１タンパク質はホスホヒスチジン領域（Tien-Shin Yu et al., 2001, Plant Cell 13, 1907-1918）を示す。ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列は、配列番号５に指定された Arabidopsis thaliana および Oryza sativa 由来のＯＫ１タンパク質のホスホヒスチジン領域のアミノ酸配列と、少なくとも５０％の、特に少なくとも６０％の、好ましくは少なくとも７０％の、特に好ましくは少なくとも８０％の、および特別に好ましくは少なくとも９０％の同一性を示すホスホヒスチジン領域を含む。ホスホヒスチジン領域は、好ましくは２個のヒスチジン残基を含む。
本発明のさらなる実施態様は、遺伝的修飾が植物ゲノム中への少なくとも１つの外来性核酸分子の導入である、本発明による遺伝的に修飾された植物細胞または本発明による遺伝的に修飾された植物に関する。
この文脈において、用語「遺伝的修飾」とは、植物細胞のゲノムまたは植物のゲノムの中への、相同のおよび／または非相同の外来性核酸分子の導入であって、れらの分子の前記導入がＯＫ１タンパク質の活性の増大をもたらすものを意味する。
本発明による植物細胞または本発明による植物は、外来性核酸分子の導入により、それらの遺伝子情報に関して修飾される。外来性核酸分子の存在または発現が、表現型の変化をもたらす。ここで「表現型の」変化とは、好ましくは、１以上の細胞の機能の測定可能な変化を意味する。例えば、本発明による遺伝的に修飾された植物細胞および本発明による遺伝的に修飾された植物は、導入された核酸分子の存在またはその発現により、ＯＫ１タンパク質の活性の増大を示す。
本発明に関連して、用語「外来性核酸分子」とは、対応する野生型植物細胞には自然には存在しないような、または野生型植物細胞中の実在する空間的配置には自然には存在しないような分子、または植物細胞ゲノム中の、野生型植物細胞においてはそれが自然には存在しない場所に局在している分子、を意味するものと理解する。好ましくは、外来性核酸分子は、種々の要素、植物細胞中に自然には存在しない組合せまたは特異的な空間的配置、から成る組換え分子である。
原則として、外来性核酸分子は、植物細胞または植物中のＯＫ１タンパク質の活性の増加をもたらす任意の核酸分子でよい。
本発明に関連して、用語「ゲノム」とは、植物細胞中に存在する遺伝物質の全体を意味すると理解するべきである。細胞核に加えて、他のコンパートメント（例えばプラスチド、ミトコンドリア）もまた遺伝物質を含んでいることは当業者に公知である。
さらなる実施態様において、本発明による植物細胞および本発明による植物は、外来性核酸分子がＯＫ１タンパク質、好ましくは Arabidopsis thaliana からのＯＫ１タンパク質、または Oryza sativa からのＯＫ１タンパク質をコードすることを特徴とする。
さらなる実施態様において、外来性核酸分子は、配列番号２または配列番号４で特定されるアミノ酸配列を有するＯＫ１タンパク質をコードする。
多数の技術をＤＮＡの植物宿主細胞中への導入に利用することができる。これらの技術には、形質転換媒体としてAgrobacterium tumefaciens または Agrobacterium rhizogenes を用いたＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転換、プロトプラストの融合、注入、ＤＮＡのエレクトロポレーション、バイオリスティックによるＤＮＡの導入、ならびに他の可能性が含まれる。アグロバクテリウムを介する植物細胞の形質転換の使用は、集中的に研究され、ＥＰ １２０５１６、 Hoekema, in: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V、Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46 および An et al. EMBO J. 4, (1985), 277-287 に十分に記述されている。ジャガイモの形質転換については、例えば Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8, (1989), 29-33 を参照のこと。
Agrobacterium の形質転換に基づいた、ベクターによる単子葉植物の形質転換についてもまた記述されている (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22, (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6, (1994) 271-282; Deng et al, Science in China 33, (1990), 28-34; Wilmink et al., Plant Cell Reports 11, (1992), 76-80; May et al., Bio/Technology 13, (1995), 486-492; Conner and Domisse, Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550-555; Ritchie et al, Transgenic Res. 2, (1993), 252-265) 153 (1992), 550- 555; Ritchie et al, Transgenic Res. 2,(1993), 252-265)。単子葉植物の形質転換の別のシステムは、バイオリスティックによる形質転換 (Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994), 37-48; Vasil et al., Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala et al., Plant Mol. Biol. 24, (1994), 317- 325; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79, (1990), 625-631)、プロトプラスト形質転換、部分的に透過性を与えられた細胞のエレクトロポレーション、およびガラス繊維によるＤＮＡの導入である。特にトウモロコシの形質転換については、文献に幾度も記述された（例えば、Ｗ０９５／０６１２８、ＥＰ０５１３８４９、ＥＰ０４６５８７５、ＥＰ０２９２４３５； Fromm et al., Biotechnology 8, (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2, (1990), 603-618; Koziel et al., Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc et al., Theor. Appl. Genet. 80, (1990), 721-726 参照) 。
他の型の穀類の成功した形質転換についても、既に例えばオオムギについて (Wan and Lemaux,上記; Ritala et al.,上記; Krens et al., Nature 296, (1982), 72-74) およびコムギについて (Nehra et al., Plant J. 5, (1994), 285-297; Becker et al., 1994, Plant Journal 5, 299-307） 記述されている。上記の方法はすべて本発明の枠組み内において適当である。
とりわけ、ＯＫ１タンパク質の導入により遺伝的に修飾された植物細胞および植物を、野生型植物細胞および野生型植物それぞれから、それらが野生型植物細胞または野生型植物に自然には存在しない外来性核酸分子を含むという点で、あるいはそのような分子が、本発明による植物細胞のゲノム中のまたは本発明による植物のゲノム中の、野生型植物細胞または野生型植物中には存在しない場所に、即ち異なるゲノム環境に、組入れられて存在するという点で、区別することができる。さらに、この型の本発明による植物細胞および本発明による植物は、それらがゲノム内に安定して組入れられた外来性核酸分子の少なくとも１つのコピーを、おそらくは野生型植物細胞または野生型植物中で自然に存在するそのような分子のコピーに加えて、含むという点で、野生型植物細胞および野生型植物とそれぞれ異なる。もし本発明による植物細胞または本発明による植物へ導入した外来性核酸分子が、野生型植物細胞または野生型植物にそれぞれ既に自然に存在している分子の付加的なコピーである場合は、本発明による植物細胞および本発明による植物と野生型植物細胞および野生型植物それぞれとを、特にこのまたはこれらの追加のコピーがゲノム中のそれが（あるいは、それらが）野生型植物細胞または野生型植物では生じない場所に局在しているという点で、区別することができる。例えばこれを、サザンブロット分析を用いることにより確認することができる。
更に、本発明による植物細胞また本発明による植物を、野生型植物細胞または野生型植物それぞれから、好ましくは次の特徴の少なくとも１つによって区別することができる：導入された外来性核酸分子が、植物細胞または植物に関して非相同の場合は、本発明による植物細胞または本発明による植物は、導入された核酸分子の転写物を有する。これらを例えばノーザンブロット分析、またはＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）によって確認することができる。アンチセンスのおよび/またはＲＮＡｉの転写物を発現する本発明による植物細胞および本発明による植物を、例えばタンパク質をコードするＲＮＡ（植物細胞に自然に生ずる）に相補的な特異的核酸プローブの助けを借りて、確認することができる。好ましくは本発明による植物細胞および本発明による植物は、導入された核酸分子によってコードされるタンパク質を含む。これを、例えば免疫学的方法、特にウエスタンブロット分析によって実証することができる。
もし導入された外来性核酸分子が植物細胞または植物に関して相同である場合は、本発明による植物細胞あるいは本発明による植物を野生型植物細胞または野生型植物それぞれから、例えば導入された外来性核酸分子の追加の発現により、区別することができる。本発明による植物細胞および本発明による植物は、好ましくは外来性核酸分子の転写物を含む。これを、例えばノーザンブロット分析、またはいわゆる定量ＰＣＲを用いることにより実証することができる。
さらなる実施態様では、本発明による植物細胞および本発明による植物は、それぞれ遺伝子組換え植物細胞または遺伝子組換え植物である。
さらなる実施態様において、本発明は、本発明による植物細胞におよび本発明による植物であって、外来性核酸分子が：
ａ） 配列番号２または配列番号４に与えられたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｂ） プラスミドＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭ中の挿入またはプラスミドｐＭＩ５０中の挿入によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子；
ｃ） 配列番号２または配列番号４に与えられるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性がある配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｄ） プラスミドＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭ中の挿入のコード領域またはプラスミドｐＭＩ５０中の挿入のコード領域によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも６０％の同一性がある配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｅ） 配列番号１または配列番号３に示されたヌクレオチド配列または相補的配列を含む核酸分子；
ｆ） プラスミドＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭまたはプラスミドｐＭＩ５０に含まれる挿入ヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｇ） ａ）、ｂ）、ｅ）またはｆ）に記述された核酸配列と少なくとも６０％の同一性を有する核酸分子；
ｈ） ストリンジェントな条件下で、ａ）、ｂ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）に記述された核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリダイズする核酸分子；
ｉ） ヌクレオチド配列が、遺伝子コードの縮退により、ａ）、ｂ）、ｅ）またはｆ）で同定された核酸分子の配列と相違している核酸分子；および
ｊ） ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、またはｉ）で同定された核酸分子の断片、対立遺伝子変異体、および／または誘導体、に相当する核酸分子、
から成る群より選ばれる植物細胞または植物に関する。
配列番号２に示されるアミノ酸配列は、Arabidopsis thaliana からのＯＫ１タンパク質をコードし、また配列番号４に示されるアミノ酸配列は、Oryza sativa からのＯＫ１タンパク質をコードする。
本発明による様々な種類の核酸分子からコードされるタンパク質は、ある共通の特性を有する。これらには例えば生物活性、分子量、免疫学的反応性、コンフォメーションその他が、ならびに例えばゲル電気泳動における走行性、クロマトグラフィーの挙動、沈降定数、溶解度、分光学的特性、安定性、最適ｐＨ、最適温度などの物理的特性が含まれ得る。
配列番号２に示されるアミノ酸配列から導かれるArabidopsis thaliana からのＯＫ１タンパク質の分子量はおよそ１３１kDaであり、また配列番号４に示されるアミノ酸配列から導かれるOryza sativaからのＯＫ１タンパク質の分子量はおよそ１３２kDaである。したがって、本発明によるタンパク質の導出された分子量は、好ましくは１２０kDa〜１４５kDaの範囲、好ましくは１２０kDa〜１４０kDa、特に好ましくは１２５kDa〜１４０kDa、およびとりわけ好ましくは１３０kDa〜１３５kDaの範囲にある。
Arabidopsis thaliana および Oryza sativa からのＯＫ１タンパク質をそれぞれコードする配列番号２および配列番号４で示されるアミノ酸配列は、ホスホヒスチジン領域を各々含む。したがって好ましくは本発明によるＯＫ１タンパク質は、配列番号５に示されるホスホヒスチジン領域と、少なくとも５０％の、好ましくは少なくとも６０％の、特に好ましくは少なくとも８０％の、およびとりわけ好ましくは９０％の同一性を有するホスホヒスチジン領域を含む。
本発明は、本発明によるＯＫ１タンパク質の酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸分子であって、コードされるＯＫ１タンパク質が、配列番号２または配列番号４で特定されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８０％の、特に好ましくは少なくとも９０％の、およびとりわけ好ましくは９５％の同一性を有する核酸分子に関する。
Arabidopsis thaliana からの本発明によるタンパク質（Ａ.ｔ.−ＯＫ１）をコードするｃＤＮＡを含むプラスミド（Ａ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭ）が、ブダペスト条約によりthe German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany に、番号ＤＳＭ１６２６４の下に２００４年３月８日に寄託され、Oryza sativaからの本発明によるさらなるタンパク質（Ｏ.ｓ.−ＯＫ１）をコードするｃＤＮＡを含むプラスミド（ｐＭ１５０）が、２００４年３月２４日に番号ＤＳＭ１６３０２の下に寄託された。
配列番号２に示されるアミノ酸配列はプラスミドＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭに組み込まれたｃＤＮＡ配列のコード領域から導出することができ、Arabidopsis thaliana からのＯＫ１タンパク質をコードする。配列番号４に示されるアミノ酸配列は、プラスミドｐＭＩ５０に組み込まれたｃＤＮＡ配列のコード領域から導出することができ、Oryza sativa からのＯＫ１タンパク質をコードする。したがって、本発明はまた、プラスミドＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭ中の挿入またはプラスミドｐＭＩ５０中の挿入によってコードされるアミノ酸配列を含むＯＫ１タンパク質の酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸分子であって、コードされるタンパク質は、Ａ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭまたはｐＭＩ５０中の挿入から導くことができるアミノ酸配列と、少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８０％の、特に好ましくは少なくとも９０％の、また、特に好ましくは９５％の同一性を有する核酸分子に関する。
配列番号１に示される核酸配列は、Arabidopsis thaliana からのＯＫ１タンパク質のコード領域を含むｃＤＮＡ配列であり、また配列番号３に示される核酸配列は、Oryza sativa からのＯＫ１タンパクのコード領域を含むｃＤＮＡ配列である。
したがって、本発明はまた、ＯＫ１タンパク質および配列番号１または配列番号３に示されたヌクレオチド配列のコード領域またはそれに相補的な配列をコードする核酸分子、プラスミドＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭまたはプラスミドｐＭＩ５０に含まれる挿入のヌクレオチド配列のコード領域を含む核酸分子、および前記核酸分子と少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８０％の、特に好ましくは少なくとも９０％の、およびとりわけ好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する核酸分子、に関する。
当業者にとって、本発明による核酸分子の配列情報を利用して、または本発明による核酸分子を利用して、他の植物種から、好ましくはデンプン貯蔵植物から、好ましくはOryza属の植物種から、特にOryza sativaから、またはArabidopsis thalianaから、相同の配列を単離することが可能である。例えば適当なハイブリダイゼーション試料のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーの調査のような従来の方法を利用して、これを実施することができる。当業者は、（縮重した）オリゴヌクレオチドの利用およびＰＣＲに基づいた方法の使用により相同の配列を単離することができることを知っている。
例えばＥＭＢＬ（http:// www.ebi.ac.uk/Tools/index.htm）またはＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information, http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/）などにより利用可能となるデータベースの調査もまた、ＯＫ１タンパク質をコードする相同配列の同定のために用いることができる。この場合、１つ以上の配列をいわゆるクエリーとして指定する。このクエリー配列を、次に、統計的コンピュータープログラムによって選択されたデータベースに含まれる配列と比較する。そのようなデータベースクエリー（例えばｂｌａｓｔまたはｆａｓｔａ検索）は当業者に公知であり、様々なプロバイダーによって実施することができる。
そのようなデータベースクエリーを、例えばＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）で実行する場合は、個別比較調査のために指定される標準設定を用いるべきである。タンパク質配列比較（blastp）に対しては、これらは次の設定である：Limit entrez = not activated; Filter = low complexity activated; Expect value = 10; word size = 3; Matrix = BLOSUM62; Gap costs: Existence = 11, Extension = 1.
核酸配列比較（blastn）については、次のパラメーターを設定しなければならない：Limit entrez = not activated; Filter = low complexity activated; Expect value = 10; word size = 11.
そのようなデータベース検索で、本発明に記述された配列を、さらなるＯＫ１タンパク質をコードする核酸分子および／またはタンパク質を同定するためのクエリー配列として用いることができる。
上記方法を利用して、配列番号１または配列番号３に指定された配列にハイブリダイズし、ＯＫ１タンパク質をコードする本発明による核酸分子を同定しおよび／または単離することがさらに可能である。
本発明の枠組みの内では、用語「ハイブリダイズすること」とは、従来のハイブリダイゼーション条件下の、好ましくは、例えば Sambrock et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY., ISBN: 0879695773, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5th edition (2002), ISBN: 0471250929 に記述されているような、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションを意味する。特に好ましくは、「ハイブリダイズすること」とは、下記の条件下のハイブリダイゼーションを意味する：
ハイブリダイゼーション緩衝液：
２×ＳＳＣ；１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（フィコール４００＋ＰＥＧ＋ＢＳＡ；比率
１：１：１）；０．１％ＳＤＳ；５mMＥＤＴＡ；５０ｍMＮａ2ＨＰＯ4；２５０μg/mlニ
シン精子ＤＮＡ；５０μg/ml ｔＲＮＡ；または２５Mリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．
２；１ｍM ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳ
ハイブリダイゼーション温度：Ｔ＝６５〜６８℃
洗浄緩衝液：０．１×ＳＳＣ；０．１％ＳＤＳ
洗浄温度：Ｔ＝６５〜６８℃
原則として、本発明による核酸分子とハイブリダイズする核酸分子は、適切なタンパク質をコードする任意の植物種に由来するものでよく、好ましくはデンプン貯蔵植物に、好ましくは（系統上の）Poacea科の種に、特に好ましくはOryza sativaに由来することができる。本発明による分子にハイブリダイズする核酸分子は、例えばゲノムの、またはｃＤＮＡのライブラリーから特定することができる。この型の核酸分子の同定および単離を、本発明よる核酸分子またはこれらの分子の部分またはこれらの分子の逆相補体を用いて、例えば標準法によるハイブリダイゼーション（例えば、 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN: 0879695773, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5th edition (2002), ISBN: 0471250929 を参照のこと）またはＰＣＲを用いる増幅により実施することができる。
配列番号１または配列番号３によって指定されるヌクレオチド配列またはこれらの配列の部分のヌクレオチド配列を、正確にまたは本質的に有する核酸分子を、ハイブリダイゼーション試料として用いることができる。ハイブリダイゼーション試料として用いられる断片は、確立した合成技術を用いて製造され、その配列が本発明による核酸分子の配列に本質的に一致する合成断片またはオリゴヌクレオチドでもよい。もし本発明による核酸配列にハイブリダイズする遺伝子を同定および単離した場合は、この配列の決定およびこの配列によってコードされるタンパク質の特性の分析を、ＯＫ１タンパク質が含まれているかどうかを確証するために実施するべきである。核酸またはアミノ酸配列のレベルの相同性比較および酵素活性の測定が、この目的に特に適する。ＯＫ１タンパク質の活性は、例えば上に述べたように一般的方法項目１１に記述されるようにして生起することが可能である。ＯＫ１タンパク質の非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンへの選択的な結合親和性および自己リン酸化を、既に記述され、また一般的方法項目８および１２に記述される方法を用いて実証することができる。
本発明による核酸分子にハイブリダイズする分子は特に、植物由来の、好ましくはデンプ貯蔵植物由来の、好ましくは Oryza 属の植物種由来の、特に好ましくは Oryza sativa または Arabidopsis thaliana 由来のＯＫ１タンパク質をコードする本発明による核酸分子の断片、誘導体および対立遺伝子変異体を含む。本発明に関連して用語「誘導体」とは、これらの分子の配列が、上に記述された核酸分子の配列とは１つ以上の位置で異なり、またこれらの配列と高度の同一性を有することを意味する。ここで、上に記述された核酸分子からの偏異は、例えば欠失、付加、置換、挿入または組換えによって起こった可能性がある。
本発明に関連して、用語「同一性」とは、コード領域の全長に渡る少なくとも６０％の配列同一性、特に少なくとも７０％の、好ましくは８０％を越える、特に好ましくは９０％を越える、およびとりわけ少なくとも９５％の同一性を意味する。本発明に関連して、用語「同一性」を、パーセンテージとして表現される、他のタンパク質／核酸と一致するアミノ酸／ヌクレオチドの数（同一性）を意味すると理解するべきである。好ましくは同一性を、アミノ酸に対して配列番号２または配列番号４を、または核酸に対して配列番号１または配列番号３を、他のタンパク質／核酸と、コンピュータープログラムを利用して比較することにより決定する。互いに比較する配列が異なる長さを有する場合は、同一性は、長い配列と共通の短い配列を有するアミノ酸の数が、同一性のパーセンテージ率を決定するようにして、決定することになる。好ましくは同一性を、周知であり公に利用可能であるコンピュータープログラム ＣｌｕｓｔａｌＷ によって決定する（Thompson et al., Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680）。ＣｌｕｓｔａｌＷ は、Julie Thompson (Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) および Toby Gibson (Gibson@EMBL-Heidelberg.DE), European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Germany によって公に利用できるようにされている。ＣｌｕｓｔａｌＷ はまた、ＩＧＢＭＣ（Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire, BP.163, 67404 Illkirch Cedex, France; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/）およびＥＢＩ（ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/）、ならびにＥＢＩ（European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK）のすべてのミラーインターネットサイトを含む、種々のインターネットサイトからダウンロードすることもできる。
好ましくは、ＣｌｕｓｔａｌＷ コンピュータープログラムのバージョン１．８を本発明によるタンパク質と他のタンパク質の間の同一性を決定するために用いる。それを行う際に、次のパラメーターを設定しなければならない：
Figure 2014221066
好ましくは、ＣｌｕｓｔａｌＷ コンピュータープログラムのバージョン１．８を、本発明による核酸分子のヌクレオチド配列と、例えば他の核酸分子のヌクレオチド配列の間の同一性を決定するために用いる。それを行う際に、次のパラメーターを、加重なしで設定しなければならない：
Figure 2014221066
さらに、同一性とは、機能的なおよび／または構造的な等価性が、当該核酸分子間あるいはそれらによってコードされるタンパク質間に存在することを意味する。上記の分子に相同であり、これらの分子の誘導体を構成する核酸分子は、一般にこれらの分子の変異体であって一時変異を構成し、同じ生物学的機能を遂行する。同時に、その変異体は自然に存在する可能性が、例えばそれらが他の植物種由来の配列である可能性があり、あるいは、自然に生じたまたは目的を持って突然変異誘発で導入された突然変異体である可能性がある。変異体はまた合成的に作製された配列である可能性がある。対立遺伝子変異体は、自然発生の変異体、および合成的に作製された変異体または組換えＤＮＡ技術によって生成された変異体のいずれでもあり得る。遺伝子コードの縮退により本発明による核酸分子と相違する核酸分子は、誘導体の特別な形を構成する。
本発明による核酸分子の種々の誘導体によってコードされるタンパク質は、ある共通の特性を有する。これらには、例えば、生物活性、基質特異性、分子量、免疫反応、コンフォメーションなどが、並びに、例えばゲル電気泳動における走行性、クロマトグラフィーの挙動、沈降定数、溶解度、分光学的特性、安定性、最適ｐＨ、最適温度などのような物理的特性が含まれ得る。ＯＫ１タンパク質の好ましい特性については、既に詳細に上述しており、従ってここでそれを用いる。
本発明による核酸分子は任意の核酸分子、特に、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのＤＮＡまたはＲＮＡ分子でよい。それらは、自然発生の分子、または遺伝的方法または化学合成法によって作製された分子でよい。それらは、コード鎖または非コード鎖を含む一本鎖分子、または二重鎖分子であってよい。
本発明のさらなる実施態様は、本発明による植物細胞および本発明による植物であって、外来性核酸分子が：
ａ） 植物ゲノム中への組込みにより少なくとも１つのＯＫ１遺伝子の発現の増加をもたらすＴ−ＤＮＡ分子（Ｔ−ＤＮＡ活性化タギング）；
ｂ） 植物ゲノム中への組込みによりＯＫ１遺伝子の発現の増加をもたらすトランスポゾンを含むＤＮＡ分子（トランスポゾン活性化タギング）；
ｃ） ＯＫ１タンパク質をコードするＤＮＡ分子であって、植物細胞中の転写をもたらし細胞の中でＯＫ１タンパク質活性の増加をもたらす調節配列と連結されているＤＮＡ分子；
ｄ） インビボの突然変異誘発によって導入された核酸分子であって、その突然変異誘発は、ＯＫ１タンパク質をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子中に突然変異または非相同配列の挿入をもたらし、突然変異または挿入はＯＫ１タンパク質をコードする遺伝子の発現の増加をもたらす、核酸分子、
から成る群より選ばれる植物細胞および植物に関する。
本発明に関連して、本発明による植物細胞および植物をまた、いわゆる挿入突然変異誘発（概説論文：Thomeycroft et al., 2001, Journal of experimental Botany 52 (361), 1593-1601）の使用によって作製することもできる。挿入突然変異誘発とは、特にトランスポゾンのあるいはいわゆるトランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）の、ＯＫ１タンパク質をコードする遺伝子へのまたは遺伝子の近くへの挿入であって、その結果当該細胞のＯＫ１タンパク質の活性が増加するものを意味すると理解するべきである。
トランスポゾンは、細胞内に自然に存在するもの（内在的トランスポゾン）および、前記細胞に自然には存在しないで、例えば細胞の形質転換などの遺伝子工学的方法によって細胞へ導入されるもの（非相同トランスポゾン）の両方であり得る。トランスポゾンにより遺伝子の発現を変更することは当業者に公知である。植物バイオテクノロジーの道具としての、内在的および非相同トランスポゾンの使用の概説が、Ramachandran and Sundaresan (2001 , Plant Physiology and Biochemistry 39, 234-252) に提示されている。
Ｔ−ＤＮＡ挿入突然変異誘発は、アグロバクテリウム由来のＴｉプラスミドのある切片（Ｔ−ＤＮＡ）が植物細胞ゲノムへ組み込まれることが可能であるという事実に基づく。植物染色体中の組込み場所は一定しておらず、どの位置にでも起こり得る。Ｔ−ＤＮＡが、遺伝子の機能を構成する染色体の一部へ、または染色体の一部の近くへ組み込まれると、遺伝子発現の増大、そしてまた当該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の変化をもたらすことが可能である。
ここで、ゲノムに挿入される配列（特にトランスポゾンまたはＴ−ＤＮＡ）は、ＯＫ１遺伝子の調節配列の活性化をもたらす配列（「活性化タギング」）を含むという事実により特徴づけられる。
本発明による植物細胞および植物は、いわゆる「活性化タギング」法（例えば Walden et al., Plant J. (1991), 281-288; Walden et al., Plant Mol. Biol. 26 (1994), 1521-1528 を参照のこと）によって生成することができる。これらの方法は、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ ＲＮＡプロモーターのエンハンサーまたはオクトピン合成酵素エンハンサーなどの「エンハンサー」配列による内在的なプロモーターの活性化に基づく。
本発明に関連して、用語「Ｔ−ＤＮＡ活性化タギング」とは、「エンハンサー」配列を含み、植物細胞のゲノムへの組込みによって少なくとも１つのＯＫ１タンパク質の活性の増加をもたらすＴ−ＤＮＡ断片を意味すると理解するべきである。
本発明に関連して、用語「トランスポゾン活性化タギング」とは、「エンハンサー」配列を含み、植物細胞のゲノムへの組込みによって少なくとも１つのＯＫ１タンパク質の活性の増加をもたらすトランスポゾンを意味すると理解するべきである。
別の実施態様において、ＯＫ１タンパク質をコードする本発明によるＤＮＡ分子を、植物細胞中で転写を開始し（プロモーター）細胞のＯＫ１タンパク質活性の増加をもたらす調節配列と連結させる。この場合、本発明による核酸分子は、調節配列に対して「センス」配向に存在する。
ＯＫ１タンパク質をコードする本発明による核酸分子を発現させるために、好ましくはこれらを、植物細胞中の転写を保証する調節ＤＮＡ配列と連結する。特にこれらはプロモーターを含む。一般に、植物細胞中で活性を有する任意のプロモーターは発現に対して適格である。
プロモーターを選択することにより、発現が、構成的にまたはある組織のみに、植物発生のある段階でまたは外部の影響によって決定されるある時に、起こるようにすることができる。プロモーターは、植物に関しておよび核酸分子に関して、相同であってもまたは非相同であってもよい。
適当なプロモーターは、例えばカリフラワーモザイクウィルスの３５ＳＲＮＡプロモーター、および構成的発現のためのトウモロコシのユビキチンプロモーター、ジャガイモの塊茎の特異的発現のためのパタチンプロモーターＢ３３（Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29）、または光合成活性を有する組織における発現のみを保証するプロモーター、例えばＳＴ−ＬＳ１プロモーター（Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451）、または、胚乳に特異的な発現のためのコムギからのＨＭＧプロモーター、ＵＳＰプロモーター、ファゼオリンプロモーター、トウモロコシからのゼイン遺伝子のプロモーター（Pedersen et al., Cell 29 (1982),1015-1026; Quatroccio et al., Plant Mol.Biol. 15 (1990), 81-93）、グルテリンプロモーター（Leisy et al., Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng et al., Plant J. 4 (1993), 357-366; Yoshihara et al., FEBS Lett. 383 (1996), 213-218）、あるいはｓｈｒｕｎｋｅｎ−１プロモーター（Werr et al., EMBO J. 4 (1985), 1373-1380）である。しかし、外部的影響によって決定された時にのみ活性化されるプロモーターもまた用いることができる（例えばＷＯ９３０７２７９を参照のこと）。単純な誘導が可能である熱ショックタンパク質のプロモーターは、ここで特に興味深い。さらに、Vicia fabaおよび他の植物の種子特異的な発現を保証する Vicia faba からのＵＳＰプロモーター（Fiedler et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Baeumlein et al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467）などの、種子特異的なプロモーターを用いることができる。
さらに、転写物にポリＡテールを加えるために用いられる終結配列（ポリアデニル化信号）が存在することが可能である。転写物の安定化の機能がポリＡテールに帰されている。この型の要素については文献に記載されており（Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29 を参照のこと）、任意に交換することができる。
イントロン配列がさらに、プロモーターとコード領域の間に存在することもできる。そのようなイントロン配列は植物中で発現の安定性および発現の増加をもたらすことができる（Callis et al., 1987, Genes Devel. 1, 1183-1200; Luehrsen, and Walbot, 1991, Mol. Gen. Genet. 225, 81-93; Rethmeier, et al., 1997; Plant Journal. 12(4):895-899; Rose and Beliakoff, 2000, Plant Physiol. 122 (2), 535-542; Vasil et al., 1989, Plant Physiol. 91 , 1575-1579; XU et al., 2003, Science in China Series C Vol.46 No.6, 561-569）。適当なイントロン配列は、例えばトウモロコシのｓｈ１遺伝子の第１イントロン、トウモロコシのポリユビキチン遺伝子１の第１イントロン、イネのＥＰＳＰＳ遺伝子の第１イントロン、またはアラビドプシスのＰＡＴ１遺伝子の２つの第１イントロンの１つである。
さらに、本発明による植物細胞および本発明による植物を、いわゆる「インサイチュー活性化」により作製することができる。この場合、導入された遺伝的修飾が、内在的なＯＫ１遺伝子の調節配列に変化をもたらし、それがＯＫ１遺伝子の増大した発現を引き起こす。好ましくは、ＯＫ１遺伝子の活性化が、内在的なＯＫ１遺伝子のプロモーターのまたは「エンハンサー」配列の「インビボの」突然変異誘発によって起こる。そうする際に、例えば、プロモーターまたは「エンハンサー」配列を、生成された突然変異が、野生型植物細胞または野生型植物中のＯＫ１遺伝子の発現と比較して、本発明による植物細胞または本発明による植物中のＯＫ１遺伝子の増大した発現をもたらすように変更することができる。プロモーターまたは「エンハンサー」配列の突然変異はまた、野生型植物細胞または野生型植物中では発現されないであろう時に発現される本発明による植物細胞または本発明による植物中のＯＫ１遺伝子をもたらすことができる。
本発明に関連して、用語「ＯＫ１遺伝子」とは、ＯＫ１タンパク質、好ましくはデンプン貯蔵植物からの、より好ましくは Arabidopsis thaliana からの、および最も好ましくはイネからのＯＫ１タンパク質をコードする核酸分子（ｃＤＮＡ、ＤＮＡ）を意味すると理解する。
いわゆる「インビボ」突然変異誘発中に、ハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド（「キメロプラスト」）が、植物細胞へ形質転換により導入される（Kipp, P.B. et al., Poster Session at the "5th International Congress of Plant Molecular Biology, September 21-27, 1997, Singapore; R. A. Dixon and CJ. Amtzen, Meeting report on "Metabolic Engineering in Transgenic Plants", Keystone Symposia, Copper Mountain, CO, USA, TIBTECH 15, (1997), 441-447; international patent WO 9515972; Kren et al., Hepatology 25, (1997), 1462-1468; Cole-Strauss et al., Science 273, (1996), 1386-1389; Beetham et al., 1999, PNAS 96, 8774-8778）。
ＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドのＤＮＡ成分の一部は、内在的なＯＫ１遺伝子の核酸配列に相同である、しかしそれは、内在的なＯＫ１遺伝子の核酸配列と比較して、相同領域に囲まれた突然変異を有するかまたは非相同部位を含む。
ＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドの相同領域と内在的な核酸分子との塩基対合、それに続く相同組換えにより、ＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドのＤＮＡ成分または非相同領域に含まれていた突然変異を、植物細胞のゲノムへ移入することができる。これが１つ以上のＯＫ１タンパク質の活性の増加をもたらす。
これらの方法はすべて、外来性核酸分子の植物細胞または植物のゲノム中への導入に基づいており、したがって本発明による植物細胞および本発明による植物の作製に基本的に適している。
驚いたことに、本発明による植物細胞および本発明による植物が、遺伝的に修飾されていない対応する野生型植物細胞または野生型植物のデンプンと比較して修飾されたデンプンを合成することが見出された。
本発明による植物細胞および本発明による植物は、物理的・化学的特性、特にデンプンリン酸含量またはリン酸の分布が、野生型植物細胞または植物中の合成されたデンプンと比較して変更されている修飾デンプンを合成し、これは特別の応用によく適している。
Ｐ−デンプンを排他的にリン酸化する酵素は以前には報告されていなかったので、植物中の既にリン酸化されたデンプンのデンプンリン酸含量をあるレベル以上に増加させることもまた以前には不可能であった。これがいまや、植物の遺伝的修飾のための本発明によるタンパク質または本発明による核酸を使用することを通じて、可能である。
利用可能な手段の欠如のために、植物から合成されるデンプン中にリン酸を分布させることもまた不可能であった。本発明によるタンパク質および核酸の提供により、いま、ネイティブのデンプン中のリン酸比率を変更することも可能である。
したがって、本発明はまた、遺伝的に修飾されていない対応する野生型植物細胞および野生型と比較して修飾されたデンプンを合成する本発明による植物細胞および植物も含む。
本発明に関連して、用語「修飾デンプン」とは、対応する野生型植物細胞または野生型植物から得ることができる非修飾デンプンと比較して、デンプンが変化した物理的・化学的特性を示すことを意味すると理解するべきである。
本発明の追加の実施態様では、本発明による植物細胞または植物が、対応する野生型植物細胞および野生型から単離したデンプンと比較して、高いデンプンリン酸含量および／または変更されたリン酸分布を含むデンプンを合成する。
この発明に関連して、用語「リン酸分布」とは、デンプン中の全デンプンリン酸含量に対して、グルコース分子のＣ−２位置、Ｃ−３位置、またはＣ−６位置に結合したデンプンリン酸の割合を意味すると理解するべきである。
本発明の追加の実施態様では、本発明による植物細胞または植物が、遺伝的に修飾されていない野生型植物からのデンプンと比較して、Ｃ−３リン酸のＣ−６リン酸に対する比率が変更されたデンプンを合成する。ここで好ましいのは、遺伝的に修飾されていない野生型植物細胞および野生型植物からのデンプンと比較して、Ｃ−６位置に結合したデンプンリン酸と比較してＣ−３位置に結合したデンプンリン酸の割合が増加しているデンプンである。
本発明に関連して、用語「Ｃ−３リン酸のＣ−６リン酸に対する比率」とは、Ｃ−３位置でまたはＣ−６位置でα−１，４−グルカンに結合したデンプンリン酸がそれぞれ、α−１，４−グルカンにＣ−３位置でおよびＣ−６位置で結合したデンプンリン酸の和（Ｃ−３位置＋Ｃ−６位置）に寄与する、デンプンリン酸の量を意味すると理解するべきである。
デンプンリン酸量を測定する様々な方法が報告されている。好ましくは、Ritte et al.(2000, Starch/Staerke 52, 179-185）によって記述されたデンプンリンの量を測定する方法を用いることができる。特に好ましくは、Kasemusuwan and Jane (1996, Cereal Chemistry 73, 702-707）に記述された方法に従い、３１Ｐ−ＮＭＲによるデンプンリン酸量の決定が実施される。
さらに本発明の目的の１つは、本発明による植物細胞を含む遺伝的に修飾された植物である。これらの型の植物を、本発明による植物細胞から再生により生成することができる。
原則として本発明による植物は任意の植物種の植物、即ち単子葉および双子葉植物の両方でよい。好ましくはそれらは有用植物、即ち人々により食用のまたは技術的な目的のために、特に工業的目的のために栽培される植物である。
さらなる実施態様では、本発明による植物はデンプン貯蔵植物である。
本発明に関連して用語「デンプン貯蔵植物」とは、例えばトウモロコシ、イネ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、キャッサバ、ジャガイモ、サゴ、リョクトウ、エンドウ、またはモロコシなどの、貯蔵デンプンを含む植物部分を有する全ての植物を意味する。
本発明に関連して用語「ジャガイモ植物」または「ジャガイモ」とは、Solanum属の植物種、特にSolanum属の塊茎生成種、特にSolanum tuberosumを意味する。
本発明に関連して用語「コムギ植物」とは、Triticum属の植物種またはTriticum属の植物との交雑から得られた植物、特に商業目的の農業に用いられる、Triticum属の植物種またはTriticum属の植物とのとの交雑から得られる植物、特に好ましくは Triticum aestivumを意味する。
本発明に関連して用語「トウモロコシ植物」とは、Zea属の植物種、特に商業目的の農業に用いられるZea属植物種、特に好ましくはZea maisを意味する。
追加の実施態様において、本発明は（系統上）Poaceae科の本発明によるデンプン貯蔵植物に関する。これらは好ましくはトウモロコシまたはコムギの植物である。
本発明はまた、本発明による植物細胞を含む本発明による植物の繁殖材料に関する。
ここで用語「繁殖材料」は、栄養的または実生的手段により子孫を生成することに適する植物の構成要素を含む。挿し木、カルス培養、根茎または塊茎が例えば栄養繁殖に適する。他の繁殖材料には、例えば、果実、種子、実生、プロトプラスト、細胞培養その他が含まれる。好ましくは繁殖材料は塊茎であり、特に好ましくは胚乳を含む穀粒である。
さらなる実施態様において、本発明は果物、貯蔵根、根、花、芽、枝または茎、好ましくは種子、穀粒または塊茎のような本発明による植物の収穫可能な植物部分に関し、その場合、これらの収穫可能な部分は本発明による植物細胞を含む。
さらに、本発明はまた、本発明による遺伝的修飾植物の作製のための方法であって：
ａ） 植物細胞を遺伝的に修飾し、その遺伝的修飾が遺伝的に修飾されていない対応
する野生型植物細胞と比較したＯＫ１タンパク質の活性の増加をもたらし；
ｂ） 工程ａ）から得られる植物細胞から植物を再生し；および
ｃ） 必要ならば、工程ｂ）によって得られる植物を利用してさらなる植物を生成する、
方法に関する。
工程ａ）により植物細胞へ導入される遺伝的修飾は、基本的に、ＯＫ１タンパク質活性の増加をもたらす任意の型の遺伝的修飾であってよい。
工程ｂ）による植物の再生を、当業者に公知の方法（例えば、"Plant Cell Culture Protocols", 1999, edt. by R.D. Hall, Humana Press, ISBN 0-89603-549-2 に記載の）を用いて実施することができる。
本発明による方法の工程ｃ）によるさらなる植物の生成を、例えば栄養繁殖（例えば挿し木、塊茎を用いるまたはカルス培養および全植物体の再生による）または実生繁殖によって行なうことができる。ここで、実生繁殖は好ましくは制御された条件下で行われる、すなわち、特定の特性を有する選択された植物同士を交雑させ繁殖させる。この場合の選択を、好ましくは工程ｃ）によって得られるさらなる植物が、工程ａ）で導入された遺伝的修飾を示すように行なう。
本発明による方法のさらなる実施態様においては、遺伝的修飾は、本発明による外来性核酸分子の植物細胞のゲノム中への導入であり、前記外来性核酸分子の存在または発現が、細胞の中でＯＫ１タンパク質の活性増大をもたらす。
本発明による方法のさらなる実施態様においては、遺伝的修飾は外来性核酸分子の植物細胞のゲノム中への導入であり、外来性核酸分子はＯＫ１タンパク質をコードする。
さらなる実施態様では、本発明による方法を、デンプン貯蔵植物を生成するために本発明による遺伝的修飾植物を作製するために用いる。
さらなる実施態様では、本発明による方法を、本発明によるトウモロコシまたはコムギ植物を生成するために用いる。
本発明による方法のさらなる実施態様において、外来性核酸分子は：
ａ） 配列番号２または配列番号４に特定されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｂ） プラスミドＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥへの挿入またはプラスミドｐＭＩ５０への挿入によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子；
ｃ） 配列番号２または配列番号４に特定されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列のタンパク質をコードする核酸分子；
ｄ） プラスミドＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭへの挿入またはプラスミドｐＭＩ５０への挿入によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有する配列のタンパク質をコードする核酸分子；
ｅ） 配列番号１または配列番号３に示されるヌクレオチド配列または相補的配列を含む核酸分子；
ｆ） プラスミドＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭまたはプラスミドｐＭＩ５０に含まれる挿入のヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｇ） ａ）、ｂ）、ｅ）またはｆ）に記述される核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列の核酸分子；
ｈ） ストリンジェント条件下でａ）、ｂ）、ｅ）またはｆ）に記述される核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリダイズする核酸分子；
ｉ） 遺伝子コードの縮退によりａ）、ｂ）、ｅ）、またはｆ）で特定される核酸分子の配列と相違したヌクレオチド配列を有する核酸分子；および

ｊ） ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）またはｉ）で特定される核酸分子の断片、対立遺伝子変異体、および／または誘導体に相当する核酸分子；
からなる群より選ばれる。
本発明による方法のさらなる実施態様において、外来性核酸分子は：
ａ） 植物ゲノムへの組込みによって、ＯＫ１遺伝子の発現の増加をもたらすＴ−ＤＮＡ分子（Ｔ−ＤＮＡ活性化タギング）；
ｂ） 植物ゲノムへの組込みによってＯＫ１遺伝子の発現の増加をもたらすトランスポゾンを含むＤＮＡ分子（トランスポゾン活性化タギング）；
ｃ） ＯＫ１タンパク質をコードし、植物細胞中で転写を保証し（開始し）、それが細胞中でＯＫ１タンパク質の活性の増加をもたらす、調節配列に連結されＤＮＡ分子；
ｄ） インビボの突然変異誘発により導入され、少なくとも１つの内在的なＯＫ１遺伝子中に、突然変異または非相同配列の挿入をもたらす核酸分子であって、突然変異または挿入がＯＫ１遺伝子の発現の増大を引き起こす、核酸分子；
からなる群より選ばれる。
さらなる実施態様において、本発明は、遺伝的に修飾された植物が遺伝的に修飾されていない野生型植物由来のデンプンと比較して、修飾されたデンプンを合成する本発明による方法に関する。
本発明による方法のさらなる実施態様において、本発明による植物は、対応する野生型植物から単離されたデンプンと比較して、より高いデンプンリン酸含量および／または修飾されたリン酸分布を有する修飾デンプンを合成する。
本発明による方法のさらなる実施態様において、本発明による植物が、遺伝的に修飾されていない野生型植物からのデンプンと比較して、Ｃ−３リン酸のＣ−６リン酸に対する修飾された比率を有する修飾デンプンを合成する。ここで特に好ましいのは、遺伝的に修飾されていない野生型植物から得られるデンプンと比較して、Ｃ−３位置に結合したデンプンリン酸がＣ−６位置に結合したデンプンリン酸と比較して増大した割合を有するデンプンである。
本発明はまた、本発明による方法によって得ることが出来る植物に関する。
驚くべきことに、ＯＫ１タンパク質の増大した活性を有する本発明による植物細胞および本発明による植物から単離したデンプンが、修飾デンプンを合成することが見出された。
特に、本発明によるデンプン中のデンプンリン酸量の増大が、デンプンに驚くべきかつ有利な性質を与える。本発明によるデンプンは、デンプンリン酸の増大した割合のために、ロードされた基の割合が増大しており、それはかなり機能的特性に影響する。ロードされた官能基を含むデンプンは、特に製紙産業において有用であり、紙をコートするためにそれが利用される。ロードされた分子でコートされた紙はまた良好な接着性を示し、例えば染料、印刷インキその他などの色素を吸収するためにも特に適する。
本発明はまた、本発明による植物細胞または本発明による植物から、本発明による繁殖材料から、あるいは本発明による収穫可能な植物部分から得ることのできる修飾デンプンに関する。
さらなる実施態様において、本発明は、デンプン貯蔵植物からの、好ましくは（系統上の)イネ科デンプン貯蔵植物からの、特に好ましくはトウモロコシまたはコムギの植物からの本発明による修飾デンプンに関する。
さらに本発明は、本発明による植物細胞または本発明による植物から、そのような植物の本発明による繁殖殖材料から、および／またはそのような植物の本発明による収穫可能な植物部分から、好ましくはそのような植物の本発明によるデンプン貯蔵部分から、デンプンを抽出する工程を含む、修飾デンプンの作製のための方法に関する。好ましくは、そのような方法はまた、デンプンを抽出する前に栽培された植物または植物部分および／またはこれらの植物の繁殖材料を収穫する工程も含み、さらに特別に好ましくは収穫前に本発明による植物を栽培する工程を含む。
植物または植物のデンプン貯蔵部分からデンプンを抽出する方法は当業者に公知である。さらに、種々のデンプン貯蔵植物からデンプンを抽出する方法については、例えば：デンプン：Chemistry and Technology （Publisher: Whistler, BeMiller and Paschall (1994), 2nd Edition, Academic Press Inc. London Ltd; ISBN 0-12-746270-8; 例えば、Chapter XII, Page 412-468：トウモロコシおよびモロコシのデンプン：作製；by Watson; Chapter XIII, Page 469-479: タピオカ、クズウコンおよびサゴデンプン：作製；by Corbishley and Miller; Chapter XIV, Page 479-490: ジャガガイモデンプン：作製および使用；by Mitch; Chapter XV, Page 491 to 506: コムギデンプン：作製、修飾および使用；by Knight and Oson; and Chapter XVI, Page 507 to 528: 米澱粉：作製および使用； by Rohmer and Klem; トウモロコシデンプン：by Eckhoff et al., Cereal Chem. 73 (1996), 54-57；工業規模のトウモロコシデンプンの抽出は、一般にいわゆる「ウェットミリング」により行われる）に記述されている。植物材料からデンプンを抽出するための方法において慣用されている装置は、セパレーター、デカンター、液体サイクロン、噴霧乾燥器および流動床乾燥器である。
本発明に関連して、用語「デンプン貯蔵部分」とは、植物の一過性葉デンプンとは対照的に、長期間生存するための備蓄としてデンプンを貯蔵するような部分を意味すると理解するべきである。好ましいデンプン貯蔵植物部分は、例えば塊茎、貯蔵根および穀粒、特に好ましいのは胚乳を含む穀粒、とりわけ好ましいのはトウモロコシまたはコムギの植物の胚乳を含む穀粒である。
修飾デンプンを製造するための本発明による方法によって入手することができる修飾デンプンもまた、本発明の目標である。
本発明のさらなる実施態様において、本発明による修飾デンプンはネイティブのデンプンである。
本発明に関連して、用語「ネイティブのデンプン」とは、本発明による植物、本発明による収穫可能な植物、本発明によるデンプン貯蔵部分、または本発明による植物の繁殖材料から、当業者に公知の方法によってデンプンが単離されることを意味する。
さらに、本発明による植物細胞または本発明による植物の、修飾デンプンを作製するための使用が、本発明の課題である。
当業者には、デンプンの特性が、例えば熱的、化学的、酵素的な、または機械的な誘導により変更できることは、公知である。誘導デンプンは、食料および／または非食料産業分野における種々の応用に特に適する。本発明によるデンプンは、高いデンプンリン酸含量のため、より高い割合の反応性官能基を示すので、誘導デンプン作製用の出発物質として従来のデンプンよりもよく適している。
したがって本発明はまた、本発明による修飾デンプンが前もって導出されている誘導デンプンの作製に関する。
本発明に関連して、用語「誘導デンプン」とは、植物細胞からの単離後に、化学的、酵素的、熱的、または機械的方法を利用してその特性が変更された、本発明による修飾デンプンを意味すると理解するべきである。
本発明のさらなる実施態様において、本発明による誘導デンプンは熱および／または酸で処理されたデンプンである。
さらなる実施態様において、誘導デンプンはデンプンエーテル、特にデンプンアルキルエーテル、Ｏ−アリルエーテル、ヒドロキシアルキルエーテル、Ｏ−カルボキシルメチルエーテル、窒素含有デンプンエーテル、リン酸含有デンプンエーテル、または硫黄含有デンプンエーテルである。
さらなる実施態様において、誘導デンプンは架橋されたデンプンである。
さらなる実施態様において、誘導デンプンはデンプングラフトポリマーである。
さらなる実施態様において、誘導デンプンは酸化されたデンプンである。
さらなる実施態様において、誘導デンプンは、デンプンエステル、特に有機酸を用いてデンプンの中へ導入されたデンプンエステルである。特に好ましくは、これらは、リン酸、硝酸、硫酸、キサントゲン酸、酢酸、またはクエン酸デンプンである。
本発明による誘導デンプンは、医薬品工業および食料および／または非食料分野での種々の応用に適する。本発明による誘導デンプンを作製する方法は当業者に公知であり、一般的な文献に十分に記述されている。誘導デンプンの作製についての概説は、例えば、Orthoefer (in Corn, Chemistry and Technology, 1987, eds. Watson und Ramstad, Chapter 16, 479-499）に見出すことができる。
誘導デンプンを作製するための本発明による方法により入手可能な誘導デンプンもまた、本発明の課題である。
さらに、誘導デンプンを作製するために本発明による修飾デンプンを使用することが、本発明の課題である。
植物のデンプン貯蔵部分はしばしば穀粉へ加工される。穀粉が生成される植物部分の例は、例えばジャガイモ植物の塊茎および穀類植物の穀粒である。穀類植物から穀粉を作製するために、これらの植物の胚乳を含む穀粒を挽いて漉す。デンプンは胚乳の主成分である。胚乳を含まず、代わりに塊茎または根のような他のデンプン貯蔵部分を含む他の植物の場合には、しばしば当該貯蔵器官の、例えば細断、乾燥、およびそれに続く磨砕により穀粉を生成する。胚乳の、あるいは植物のデンプン貯蔵部分内に含まれるデンプンは、それぞれ、それらの植物部分から生成される穀粉の基本的部分である。したがって穀粉の特性は、それぞれの穀粉中に存在するデンプンの影響を受ける。本発明よる植物細胞および本発明による植物は、遺伝的に修飾されていない野生型植物細胞および野生型植物と比較して、修飾されたデンプンを合成する。本発明による植物細胞、本発明による植物、本発明による繁殖材料、または本発明による収穫可能部分から生成された穀粉は、したがって、修飾された特性を示す。穀粉の特性は、デンプンを穀粉に混合することにより、または種々の特性を有する穀粉を混合することにより影響を受ける可能性がある。
したがって、本発明の追加の課題は、本発明によるデンプンを含む穀粉に関する。
本発明のさらなる課題は、本発明による植物細胞から、本発明による植物から、本発明による植物のデンプン貯蔵部分から、本発明による繁殖材料から、または本発明による収穫可能植物部分から生成される穀粉に関する。本発明による植物の好ましいデンプン貯蔵部分は、塊茎、貯蔵根、および胚乳を含む穀粒である。塊茎は、好ましくはジャガイモ植物に由来し、また穀粒は好ましくは（系統上の）Poaceae科植物に由来し、一方穀粒は特に好ましくはトウモロコシまたはコムギの植物由来である。
本発明に関連して、用語「穀粉」とは、植物部分を磨砕することにより得られる粉末を意味すると理解するべきである。植物部分を磨砕の前におそらく乾燥させ、細断および／または磨砕の後に漉す。
本発明による穀粉は、修飾されたリン酸含量および／または修飾されたリン酸分布を示すデンプンを含むこと、特にそれらの増大した水結合能力によって特徴づけられる。これが、食料産業における多くの応用のために、特に例えば焼き菓子の作製における、穀粉の加工において望ましい。
本発明のさらなる課題は、本発明による植物細胞、本発明による植物、本発明による植物の部分、本発明による植物のデンプン貯蔵部分、本発明による繁殖材料、あるいは本発明による収穫可能な材料、を磨砕する工程を含む、穀粉の作製のための方法である。
穀粉を、本発明による植物のデンプン貯蔵部分を摩砕することにより生成することができる。穀粉の作製のための方法は当業者に公知である。穀粉の作製のための方法は、摩砕の前に、好ましくは栽培植物または植物部分、および／または繁殖材料、またはこれらの植物のデンプン貯蔵部分を収穫する工程、および特に好ましくは収穫前に本発明による植物を栽培する追加の工程を含む。
本発明に関連して、用語「植物の部分」とは、全体として完全な植物を構成する構成要素としての植物のすべての部分を意味すると理解するべきである。植物の部分は、接ぎ穂、葉、根茎、根、こぶ、塊茎、さや、種子または穀粒である。
本発明のさらなる実施態様において、穀粉のための方法には、本発明による植物、本発明によるデンプン貯蔵植物、本発明による繁殖材料、または本発明による収穫可能な材料の、摩砕前の加工が含まれる。
この場合、加工は、例えば熱処理および／または乾燥であり得る。熱処理およびそれに続く熱処理された材料の乾燥が、例えばジャガイモ塊茎のような貯蔵根または塊茎からの穀粉の作製において、摩砕の前に用いられる。本発明よる植物、本発明による植物のデンプン貯蔵部分、本発明による繁殖材料、または本発明による収穫可能な材料を摩砕前に細断することが、さらに本発明の意味での加工に相当する場合がある。摩砕前の、例えば穀物のもみ殻などの植物組織の除去もまた、本発明の意味での加工に相当する。
本発明のさらなる実施態様では、穀粉の作製方法には、摩砕後の摩砕生成物の加工が含まれる。この場合、摩砕生成物を、例えば様々な型の穀粉を生成するために、摩砕後に例えば漉すことができる。
本発明のさらなる課題は、遺伝的に修飾された本発明による植物細胞または本発明による植物を、穀粉の作製のために使用することである。
本発明による植物細胞および本発明による植物の生成のために、例えばＤＮＡ分子などの、遺伝的に修飾されていない修飾野生型植物細胞または野生型植物と比較して、修飾されたデンプンを合成する手段を提供することも本発明の課題である。
したがって、本発明はまた、ＯＫ１タンパク質の酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸分子であって：
ａ） 配列番号２または配列番号４に特定されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｂ） プラスミドＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭへの挿入またはプラスミドｐＭＩ５０への挿入によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子；
ｃ） 配列番号２または配列番号４に特定されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列のタンパク質をコードする核酸分子；
ｄ） プラスミドＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭへの挿入またはプラスミドｐＭＩ５０への挿入によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有する配列のタンパク質をコードする核酸分子；
ｅ） 配列番号１または配列番号３に示されるヌクレオチド配列または相補的配列を含む核酸分子；
ｆ） プラスミドＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭまたはプラスミドｐＭＩ５０に含まれる挿入のヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｇ） ａ）、ｂ）、ｅ）またはｆ）に記述された核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列の核酸分子；
ｉ） ストリンジェント条件下でａ）、ｂ）、ｅ）、またはｆ）に記述された核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリダイズする核酸分子；
ｈ） 遺伝子コードの縮退によりａ）、ｂ）、ｅ）、またはｆ）で特定される核酸分子の配列と相違したヌクレオチド配列を有する核酸分子；および
ｊ） ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）またはｉ）で特定される核酸分子の断片、対立遺伝子変異体、および／または誘導体に相当する核酸分子、
からなる群より選ばれる核酸分子に関する。
基本的に、本発明による核酸分子は任意の植物起源であってよく、それらは好ましくはデンプン貯蔵植物起源、好ましくはジャガイモ、オオムギ、モロコシ、オオムギ、コムギまたはイネの植物起源、特に好ましくはArabidopsis 植物またはイネ植物起源、およびより特別に好ましくはOryza sativa起源である。
さらに本発明は、少なくとも２１の、好ましくは５０を越える、また特に好ましくは２００を越えるヌクレオチド長の、少なくとも１つの本発明による核酸分子に特異的にハイブリダイズする核酸分子に関する。ここで特異的にハイブリダイズするとは、これらの分子が本発明によるタンパク質をコードする核酸分子とハイブリダイズするが、他のタンパク質をコードする核酸分子とはハイブリダイズしないことを意味する。特に本発明は、本発明による核酸分子の転写物とハイブリダイズし、その結果それらの翻訳を妨害することができる核酸分子に関する。本発明による核酸分子と特異的にハイブリダイズするそのような核酸分子は、例えばアンチセンスの構成要素、ＲＮＡｉ、または共抑制コンストラクトであるか、またはリボザイムである可能性があり、あるいはプライマーとしてＰＣＲ増幅に用いることができる。
さらに本発明は、本発明による核酸分子を含む組換え核酸分子に関する。
本発明に関連して、用語「組換え核酸分子」とは、それが本発明による核酸分子に加えて自然には生じない追加の配列を、本発明による組換え核酸中に存在する組合せで含む、核酸分子を意味すると理解するべきである。ここで上の追加の配列は任意の配列であってよく、それらは好ましくは調節配列（プロモーター、終結シグナル、エンハンサー）であり、特に好ましくは植物組織において活性を有する調節配列であり、またとりわけ好ましくは貯蔵デンプンを合成する植物組織において活性を有する調節配列である。本発明による組換え核酸分子生成のための方法は、当業者に公知であり、例えば核酸分子のライゲーションによる結合、遺伝的組換え、または核酸分子の新しい合成などの遺伝学的方法を含む（例えば、Sambrok et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition (2001) Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY. ISBN: 0879695773, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5th edition (2002), ISBN: 0471250929 を参照のこと）。
本発明の組換え核酸分子のさらなる実施態様は、上に記述した本発明による核酸分子を含むベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、および遺伝子技術における他の通例のベクターである。
さらなる実施態様では、ベクターに含まれる本発明による核酸分子を、原核生物または真核細胞中で発現を開始する調節配列と連結する。ここで用語「発現」は、転写および翻訳の両方を意味することができる。本発明による核酸分子は、調節配列に関して「センス」配向および／または「アンチセンス」配向をとることができる。
原核生物、例えばE. coli中の、および真核生物中の発現用調節配列は、特に Saccharomyces cerevisiae などの酵母中の発現用調節配列は、十分に文献に記載されている。種々の宿主生物中のタンパク質の発現用の様々なシステムの概説が、例えば Methods in Enzymology 153 (1987), 383-516 および Bitter et al.(Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544) に見出される。
本発明のさらなる課題は、宿主細胞、特に本発明による核酸分子および／または本発明によるベクターにより遺伝的に修飾された原核または真核細胞、ならびにこれらの型の宿主細胞起源であって本発明による遺伝的修飾を含む細胞である。
さらなる実施態様において本発明は、宿主細胞、特に本発明による核酸分子または本発明によるベクターによって形質転換された原核または真核細胞、ならびにこれらの型の宿主細胞起源であって本発明による記述された核酸分子またはベクターを含む宿主細胞に関する。
宿主細胞は、バクテリア細胞（例えばE. coli、Agrobacterium属のバクテリア、特にAgrobacterium tumefaciensまたはAgrobacterium rhizogenes）または真菌細胞（例えば酵母，特にS. cerevisiae、Agaricus、特にAgaricus bisporus、Aspergillus、Trichoderma）、ならびに植物または動物細胞でよい。ここで用語「形質転換」とは、本発明による細胞が、そのネイティブのゲノムに加えて少なくとも１つの本発明による核酸分子を含むために、本発明による核酸分子によって遺伝的修飾されることを意味する。これは、恐らく自己複製分子として細胞中に自由な形で存在するか、または宿主細胞のゲノムへ安定して組み込まれることができる。
微生物の宿主細胞が好ましい。本特許出願の枠組み内では、これは、例えば Schlegel の"General Microbiology " (Georg Thieme Publishing House (1985), 1-2）に定義されているように、すべてのバクテリアおよびすべての原生生物（例えば真菌、特に酵母および藻類）を含んでいると理解する。
本発明によるさらなる宿主細胞は植物細胞である。原則として、これらは任意の植物種からの、即ち単子葉植物および双子葉植物の両方からの植物細胞であってよい。これらには、農業上の有用植物からの、即ち栄養上の、技術上の、または特に産業上の目的のために人間により栽培される植物からの植物細胞が好ましい。本発明は、好ましくはデンプン貯蔵植物（トウモロコシ、イネ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、キャッサバ、ジャガイモ、サゴ、リョクトウ、エンドウ、またはモロコシ）からの植物細胞および植物に関し；特に（系統上の）Poacea 科植物からの植物細胞、特に好ましくはトウモロコシまたはコムギの植物からの植物細胞に関する。
本発明による核酸分子、本発明による組換え核酸分子、または本発明によるベクターを含む組成物もまた、本発明の課題物質である。本発明による核酸分子、本発明による組換え核酸分子、または本発明によるベクター、および宿主細胞を含む組成物が好ましい。特に好ましくは、宿主細胞は植物細胞であり、より特別に好ましくはトウモロコシまたはコムギの植物からの細胞である。
本発明による組成物のさらなる局面は、本発明による宿主細胞を生成するために用いることができる、好ましくは本発明による植物細胞を生成するために用いることができる組成物に関する。好ましくは、これは本発明による核酸分子、本発明による組換え核酸分子または本発明によるベクター、および本発明による核酸分子の宿主細胞中への導入に適しているバイオリスティックの担体を含む組成物である。好ましいバイオリスティックの担体はタングステン、金または合成材料の粒子である。
本発明による組成物のさらなる実施態様は、本発明による核酸分子、本発明による組換え核酸分子、または本発明によるベクター、ならびに植物細胞および合成培地を含む組成物に関する。好ましくは、そのような組成物はまた、本発明よる核酸分子、植物細胞、および合成培地に加えて、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）も含む。これらの組成物の場合には、本発明による組換え核酸分子が植物細胞の外部に存在する、即ちそれが細胞膜に囲まれた植物細胞の細胞内部の外側に位置する。
植物細胞の栽培および／または形質転換に適する合成培地は当業者に公知であり、例えば、文献に十分に記載されている。さらに、様々な合成培地が、専門の業者（例えば DUCHEFA Biochemie B.V., Belgium）から購入できる。
本発明による組成物のさらなる実施態様は、本発明による核酸の同定に用いる組成物に関する。好ましくは、そのような組成物は、本発明による核酸分子、本発明による組換え核酸分子または本発明によるベクターに加えて、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡの形でまたはいわゆるＤＮＡライブラリー中のクローンとして存在する可能性がある追加の核酸分子、特に植物起源の核酸分子、を含む。コスミド、ファージミド、プラスミド、ＹＡＣまたはＢＡＣとして存在するＤＮＡライブラリーが、好ましい。ＤＮＡライブラリーは、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方を含むことができる。本発明による核酸分子、本発明による組換え核酸分子、または本発明によるベクターを、これらの組成物の中で、好ましくはハイブリダイゼーション試料として用いる。
本発明のさらなる実施態様は、デンプンリン酸化活性を示し、基質としてリン酸化デンプンを要求するタンパク質に関する。好ましくは、これはリン酸化デンプンをリン酸化する活性を示し、基質としてリン酸化デンプンを要求するタンパク質である。
本発明のさらなる実施態様は、基質としてリン酸化デンプンを要求し、ＡＴＰのリン酸残基をリン酸化デンプンに転移する本発明によるタンパク質に関する。好ましくは、本発明によるタンパク質は、ＡＴＰのβ−リン酸残基をリン酸化デンプンに転移する。特に好ましくは、本発明によるタンパク質は、ＡＴＰのβ−リン酸残基をリン酸化デンプンへ、ＡＴＰのγ−リン酸残基を水へ転移し、したがって［リン酸化α−１，４−グルカン］−水−ジキナーゼ活性、または［リン酸化デンプン］−水−ジキナーゼ活性を有する。
本発明のさらなる実施態様は、リン酸残基をリン酸化デンプンに転移するときにリン酸化中間体生成物として蓄積する本発明によるタンパク質に関する。
本発明のさらなる実施態様は、非リン酸化デンプンと比較して、リン酸化デンプンに対して増大した結合活性を示す本発明によるタンパク質に関する。
本発明のさらなる実施態様は、リン酸化デンプンのグルコース分子のＣ−６位置のリン酸モノエステル結合に比較して、Ｃ−３位置により多くの追加のリン酸モノエステル結合を導入する本発明によるタンパク質に関する。
リン酸化デンプンのグルコース分子のＣ−６位置リン酸モノエステル結合と比較して、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも６０％、特に好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも１２０％多くのリン酸化デンプンのグルコース分子のＣ−３位置のリン酸塩モノエステル結合が導入される。
本発明のさらなる課題は、１２０kDa〜１４５kDaの、好ましくは１２０kDa〜１４０kDaの、特に好ましくは１２５kDa〜１４０kDaの、および最も特別に好ましくは１３０kDa〜１３５kDaのアミノ酸配列に由来する分子量を示す本発明によるタンパク質に関する。
本発明のさらなる実施態様は、ホスホヒスチジン領域を示す本発明によるタンパク質に関する。ホスホヒスチジン領域は、好ましくは２つのヒスチジン残基を含む。
本発明のさらなる課題は：
ａ） 配列番号２または配列番号４に指定されたアミノ配列を含むタンパク質；
ｂ） プラスミドＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭまたはｐＭＩ５０に挿入されたＤＮＡのコ
ード領域によってコードされるタンパク質； または
ｃ） ａ）またはｂ）に指定されたタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一
性を示すタンパク質、
からなる群より選ばれる、本発明によるタンパク質である。
さらなる実施態様において、本発明は、リン酸化デンプンリン酸化活性を有するタンパク質であって、コードされたタンパク質は、配列番号２または配列番号４に指定されたアミノ酸配列と、あるいはプラスミドＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭまたはプラスミドｐＭＩ５０中の挿入によりコードされるＯＫ１タンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８０％の、特に好ましくは少なくとも９０％の、そしてより特別に好ましくは少なくとも９５％の同一性を示すタンパク質に関する。
本発明のさらなる実施態様は、タンパク質をコードするアミノ酸配列がホスホヒスチジン領域を示すことを特徴とする本発明によるタンパク質に関する。好ましくは、本発明によるタンパク質は、配列番号５に指定されたアミノ酸配列と、少なくとも５０％の、特に少なくとも６０％の、好ましくは少なくとも７０％の、特に好ましくは少なくとも８０％の、およびより特別に好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するホスホヒスチジン領域を示す。
さらなる実施態様では、本発明はタンパク質がArabidopsisまたはイネ植物起源である本発明によるタンパク質に関する。
本発明のさらなる実施態様は、非リン酸化デンプンと比較してリン酸化デンプンに対して増大した結合活性を示すタンパク質であって、リン酸化デンプンへの結合活性が少なくとも３倍、好ましくは少なくとも４倍、特に好ましくは少なくとも５倍、およびより特別に好ましくは少なくとも６倍、非リン酸化デンプンへの結合活性と比較して増大しているタンパク質に関する。
さらなる実施態様において、本発明はまた、本発明による核酸分子によってコードされるタンパク質に関する。
配列の記述
配列番号１： Arabidopsis thaliana のＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質のコード領域を含む核酸配列。この配列を、ベクターＯＫ１−ｐＧＥＭ−Ｔ および ＯＫ１−ｐＤＥＳＴ（商標）１７に挿入する。
配列番号２： Arabidopsis thaliana のＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列。この配列は、配列番号１に示された核酸配列から導出することができる。
配列番号３： Oryza sativa のＯ.ｓ.−ＯＫ１タンパク質のコード領域を含む核酸配列。この配列をベクターＭＩ５０に挿入する。
配列番号４： Oryza sativa のＯ.ｓ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列。この配列は、配列番号３に示された核酸配列から導出することができる。
配列番号５： Arabidopsis thaliana、Oryza sativa およびSorghum bicolor のＯＫ１タンパク質のホスホヒスチジン領域をコードするペプチド配列。
Arabidopsis thaliana 由来の、リン酸化デンプンと比較して非リン酸化デンプンに好んで結合するタンパク質を同定するための変性アクリルアミドゲル。標準タンパク質分子量マーカーを、トレース「Ｍ」に示す。実施例１ｄ）からの対照調製物Ｃのインキュベーション後に得られたタンパク質を、トレース「−」に示す。Arabidopsis thaliana sex1-3 突然変異体（実施例１ｄ）の調製物Ｂ）の葉から単離された非リン酸化デンプンとのインキュベーション後に得られた、 Arabidopsis thaliana のタンパク質抽出物を、トレース「Ｋ」に示す。予めインビトロでＲ１タンパク質によりリン酸化されていたArabidopsis thaliana sex1-3 の葉から分離されたデンプンとインキュベーションした後に得られたArabidopsis thaliana のタンパク質抽出物（実施例１ｄ）の調製物Ａ）を、トレース「Ｐ」に示す。電気泳動の完了後、アクリルアミドゲルをクマシーブルーで染色した。 ＯＫ１タンパク質の自己リン酸化活性の実証。図２Ａ）は電気泳動完了後にクマシーブルーで染色した変性（ＳＤＳ）アクリルアミドゲルを示す。図２Ｂ）は、変性（ＳＤＳ）アクリルアミドゲルのオートラジオグラフィを示す。同じ量の同じ試料を２つの各ゲルに加えた。Ｍ：標準タンパク質分子量マーカー；Ｒ１：実施例７による反応容器１からの試料（ＯＫ１タンパク質をＡＴＰとインキュベーションした後）；Ｒ２：実施例７による反応容器２からの試料（ＯＫ１タンパク質をＡＴＰとインキュベーションした後に、タンパク質を９５℃に熱した）；Ｒ３：実施例７による反応容器３からの試料（ＯＫ１タンパク質をＡＴＰとインキュベーションした後に、タンパク質を０．５ M ＨＣｌ中でインキュベーションした）；Ｒ４：実施例７による反応容器４からの試料（ＯＫ１タンパク質をＡＴＰとインキュベーションした後に、タンパク質を０．５ M のＮａＯＨ中でインキュベーションした）。 ＯＫ１タンパク質のデンプンリン酸化活性の実証（実施例６を参照のこと）。ＯＫ１タンパク質を、Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の葉から単離された非リン酸化デンプン（調製物Ａ）、および予めインビトロでＲ１タンパク質によりリン酸化されていた、Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の葉から分離されたデンプン（調製物Ｂ）とインキュベーションした。調製物Ｃは、ＯＫ１タンパク質なしでこの調製物Ｃをインキュベーションした以外は、調製物Ｂと同じである。２つの独立したテストを各調製物（Ａ、Ｂ、Ｃ）について行なった（テスト１およびテスト２）。それぞれの量を、非リン酸化デンプン（調製物Ａ）およびリン酸化デンプン（調製物Ｂ）へ導入した33Ｐラベルリン酸のcpm（カウント／分）で測定して示す。 Ｒ１タンパク質およびＯＫ１タンパク質によりそれぞれリン酸化されたデンプンのグルコース分子のＣ−原子位置の比較（実施例９を参照のこと）。ＯＫ１タンパク質（調製物Ａ）を 33ＰラベルＡＴＰ存在下でArabidopsis thaliana sex1-3 突然変異体の葉から単離された、予めＲ１タンパク質によりインビトロでリン酸化されていたデンプンとインキュベーションした。Ｒ１タンパク質（調製物Ｂ）を、 Arabidopsis thaliana sex1-3 突然変異体の葉から分離されたデンプンと、33ＰラベルＡＴＰ存在下で インキュベーションした。インキュベーションが完了した後、デンプンの全加水分解を実行し、得られた加水分解生成物を、ＨＰＡＥクロマトグラフィーを用いて分離した。標準として、加水分解生成物にグルコース−６−リン酸およびグルコース−３−リン酸を分離の前に加えた。ＨＰＡＥクロマトグラフィーによって分離された加水分解生成物を個々の分画に集めた。加えたグルコース−６−リン酸が分画１５に、また加えたグルコース−３−リン酸が分画１７に溶出された。得られた分画を、続いて放射性ラベルされたリン酸の存在について調べた。個々の分画で測定されたcpm（カウント／分）で測った33Ｐラベルリン酸（それはＯＫ１タンパク質またはＲ１タンパク質によってリン酸化デンプンの加水分解生成物へ導入されたリン酸である）の量をグラフに示す。 ＯＫ１タンパク質の自己リン酸化の実証。図５Ａ）は、ウエスタンブロットを示す。図５Ｂ）は、変性（ＳＤＳ）アクリルアミドゲルのオートラジオグラフィを示す。同じ量の同じ試料を２つのゲル各々に添加した。ＯＫ１タンパク質を、無作為化放射性ラベルＡＴＰと、または特異的にγ位置に放射性ラベルされたＡＴＰとインキュベーションした。インキュベーションの完了後、タンパク質を３０℃または９５℃に熱するか、または０．５ M のＮａＯＨまたは０．５ M のＨＣｌ中でそれぞれインキュベーションした。 ＯＫ１タンパク質によって触媒された反応における、ＡＴＰのβリン酸残基のデンプンへの転移の実証。特異的に33Ｐでγ位置をラベルされたＡＴＰまたは無作為33Ｐ−ＡＴＰのいずれかを用いて、インビトロでＲ１タンパク質によりリン酸化されていた、Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の葉から分離されたデンプンを、ＯＫ１タンパク質によってリン酸化した。「対照」として指定された実験のいずれにもＯＫ１タンパク質を加えなかった。調製物をそれぞれ２回、互いに独立にテストした。両方のテストの結果を示す。 Arabidopsis thaliana のＯＫ１タンパク質に対する抗体を用いた、植物からのタンパク質抽出物のウエスタンブロット解析。次の植物の葉からのタンパク質抽出物を示す。Ａｒａ：Arabidopsis thaliana；５１、５４、５５、６７、７２、７３、７９、６２、６３、６４、６５、６９、６６、６８は、形質転換３８５ＪＨの独立な系統である。 Ｄ：野生型 Solanum tuberosum cv Desiree。
一般的方法
下記に本発明による方法を実施するために用いることができる方法について記述する。これらの方法は、本発明の特別の実施態様を構成するが、本発明はこれらの方法に制限されない。記述された方法を変更することによりおよび／または方法の個々の部分を方法の別の部分に置換することにより、同じように本発明を実施できることは、当業者に知られている。
１． 植物組織からのタンパク質抽出物の作製
ａ） 植物組織からのタンパク質抽出物の作製
葉材料を収穫直後に液体窒素で凍結し、続いて液体窒素下乳鉢中で均質化する。縮小させた葉材料を約３．５倍の体積（用いる葉材料の重量に対して）の冷却した（４℃）結合用緩衝液と混合し、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘを用いて、２×１０秒間浸軟した（最高速度）。Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘによる第１の処理の後、第２の処理を実行する前に縮小させた葉材料を氷上で冷却する。その後、処理した葉材料を、１００μmのナイロンメッシュを通し、２０分間遠心した（５０ml遠心管、２０，０００×ｇ、４℃）。
ｂ） タンパク質抽出物に含まれるタンパク質の沈澱
工程ａ）による遠心分離によって得られた上清を取り出し、その体積を測定した。タンパク質を沈殿させるために、硫酸アンモニウムを上清に、３０分間かけて氷上で撹拌しながら、７５％（重量／体積）の最終濃度になるまで連続的に加える。上清を続いてもう１時間氷上で撹拌しながらインキュベーションする。上清から沈殿させたタンパク質を、２０，０００×ｇおよび４℃１０分間でペレット化し、続いてペレットを５mlの結合用緩衝液に吸収させる、すなわちペレット中に存在するタンパク質を溶解させる。
ｃ） 沈殿したタンパク質の脱塩
溶解したタンパク質を、セファデックスＧ２５(Amersham Bioscience, Freiburg, Prod. No. columns: 17-0851-01, Prod. No. Sephadex G25-M: 17-0033-01)を詰めたＰＤ１０カラムを用いて温度４℃で脱塩する、すなわち工程ｂ）の沈澱に用いられた硫酸アンモニウムを溶解したタンパク質から分離する。工程ｂ）に従って溶解されたタンパク質を加える前に、ＰＤ１０カラムを結合用緩衝液と平衡にする。この目的のために、各５mlの結合用緩衝液をカラム上に散布する。続いて、工程ｂ）に従って得られたタンパク質溶液の２．５mlを各カラムへ加え、次に３．５mlの結合用緩衝液によりカラムからタンパク質を溶出させる。
ｄ） タンパク質濃度の決定
タンパク質濃度を、ブラッドフォード分析（Biorad, Munich, Prod. No.500-0006（Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72, 248-254)）により決定する。
ｅ） 結合用緩衝液の組成
結合用緩衝液： ５０mM ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（またはＫＯＨ）、ｐＨ７．２
１mM ＥＤＴＡ、
２mM ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、
２mM ベンズアミジン、
２mM ε−アミノカプロン酸、
０．５mM ＰＭＳＦ、
０．０２％ トリトンＸ−１００。
２． 葉のデンプンの単離
ａ） 植物組織からのデンプン粒の単離
葉材料を収穫直後に液体窒素中で凍結する。葉材料を小分けして乳鉢中で液体窒素下均質化し、全体で約２．５倍の体積（重量／体積）のデンプン緩衝液中に吸収させる。さらにこの懸濁液を、ワーリングブレンダー中最高速度で２０秒間再び均質化する。ホモジネートをナイロンメッシュ（メッシュ幅１００μm）に通し、５分間１，０００×ｇで遠心する。可溶性タンパク質を含む上清を捨てる。
ｂ） 植物組織から単離されたデンプンの精製
デンプンの上にある緑の物質を、デンプン緩衝液で緑の物質をすすぎ落とすことによって除去した後、工程ａ）から得られたデンプンを含むペレットをデンプン緩衝液に吸収させ、種々のメッシュ幅（６０μm、３０μm、２０μmの順に）のナイロンメッシュに次々と通す。濾液を、１０mlのパーコール・クッション（９５％（v/v）パーコール（Pharmacia, Uppsala, Sweden)、５％（v/v）０．５Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．２）（Ｃｏｒｒｅｘチューブ、１５min、２，０００×ｇ）を用いて、遠心分離する。この遠心分離後に得られた沈殿物をデンプン緩衝液に一度再懸濁し、再び遠心分離する（５min、１，０００×ｇ）。
ｃ） デンプンに結合したタンパク質の除去。
工程ｂ）に従って、デンプンに結合したタンパク質を含むデンプン粒を得る。デンプン粒の表面に結合したタンパク質を４回、各回に０．５％ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）と１０〜１５分間室温で攪拌下インキュベーションすることにより、除去する。各洗浄工程の次に、洗浄緩衝液からデンプン粒を分離するために遠心分離（５min、５，０００×ｇ）を行う。
ｄ） タンパク質を除去されたデンプンの精製
工程ｃ）から得た、表面へ結合したタンパク質を除いたデンプンを、続いて洗浄緩衝液と４回、各場合に室温で攪拌下１０〜１５分インキュベーションすることにより除く。各洗浄工程に続いて、それぞれの洗浄緩衝液からデンプン粒を分離するために遠心分離（５分、１，０００×ｇ）を行う。これらの精製工程は、主として工程ｃ）でインキュベーション中に用いられるＳＤＳを除去する役割を果たす。
ｅ） 単離したデンプンの濃度の決定
工程ｄ）で分離されたデンプンの量を光度計で決定する。適当な希釈の後、デンプン懸濁液の光学密度を検量線に対して６００nmの波長で測定する。検量線が直線状である範囲は、０〜０．３吸光単位の間に存在する。
検量線を生成するために、例えばArabidopsis thaliana sex1-3 突然変異体の葉から分離されたデンプンを真空下で乾燥させ、重さを量り、規定体積の水に吸収させる。このようにして得られた懸濁液を、水の１ml当たり約５μgのデンプン懸濁液を得るまで、数工程で、各工程において水で１対１の比率で希釈する。個々の希釈工程によって得られた懸濁液を光度計により６００nmの波長で測定する。各懸濁液について得られた吸収値を、各懸濁液のデンプン濃度に対してプロットする。得られた検量線は、水ml当たり０μｇのデンプン〜水ml当たり０．３μgのデンプンの範囲で線形の数学関数に従うはずである。
ｆ） 単離したデンプンの貯蔵
デンプンをそれ以上貯蔵しないでさらなるテストに直接用いてもよいし、または１．５mlエッペンドルフ管に分注して−２０℃で貯蔵してもよい。冷凍デンプンおよび非貯蔵の新鮮に分離されたデンプンの両方を、もし必要なら、例えばインビトロのリン酸化および／または結合テストに関する本発明に記述された方法に用いることができる。
ｇ） 用いられる緩衝液の組成
１×デンプン緩衝液： ２０mMＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ８．０、
０．２mMＥＤＴＡ、
０．５％ トリトンＸ−１００
洗浄緩衝液： ５０mMＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．２
３． 同定されたデンプンリン酸化タンパク質の組換え発現
ａ） デンプンリン酸化タンパク質をコードするｃＤＮＡを含むバクテリアの発現ベクターの作製
デンプンリン酸化タンパク質をコードするｃＤＮＡを、例えば「鋳型」として植物組織のｍＲＮＡまたはポリＡ−プラス−ｍＲＮＡを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅することができる。この目的のために、先ず、逆転写酵素を用いてデンプンリン酸化タンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ鎖を作製し、その後当該ｃＤＮＡ鎖をＤＮＡポリメラーゼにより増幅する。ＰＣＲ反応を実施するための物質、酵素および指示を含むいわゆる「キット」を、購入することができる（例えば、SuperScript(商標) One-Step RT-PCR System, Invitrogen, Prod. No.: 10928-034）。デンプンリン酸化タンパク質をコードする増幅されたｃＤＮＡを、その後、バクテリアの発現ベクター、例えばｐＤＥＳＴ(商標）１７（lnvitrogen)中にクローニングすることができる。ｐＤＥＳＴ(商標）１７は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの転写を開始するために用いられるＴ７プロモーターを含む。更に、発現ベクターｐＤＥＳＴ(商標）１７は、Ｔ７プロモーターの５’方向にシャイン・ダルガルノ配列を含み、その後に開始コドン（ＡＴＧ）および、いわゆるＨｉｓタグが続く。このＨｉｓタグは直接連続する６つのコドンから成り、各々はアミノ酸ヒスチジンをコードし、また前記開始コドンの読枠中に位置する。デンプンリン酸化タンパク質をコードするｃＤＮＡのｐＤＥＳＴ(商標）１７中へのクローニングを、翻訳の融合が、開始コドン、Ｈｉｓタグ、およびデンプンリン酸化タンパク質をコードするｃＤＮＡのコドン間に生じるように行なう。この結果として、Ｔ７プロモーター上で開始される転写およびその後の翻訳に続いて、そのＮ末端にＨｉｓタグを含む追加のアミノ酸を含むデンプンリン酸化タンパク質が得られる。
しかし、微生物中での発現に適している他のベクターもまた、デンプンリン酸化タンパク質の発現に用いることができる。発現ベクターおよび関連する発現株は当業者に公知であり、また適当な組合せで適当な業者から購入することができる。
ｂ） Escherichia coli中の発現クローンの作製
まず第一に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを染色体的にコードする適切な形質転換受容性E.coli 菌株を工程ａ）で作製された発現プラスミドにより形質転換し、続いて寒天で固めた培地上終夜３０℃でインキュベーションする。適切な発現菌株は、例えば、ＢＬ２１菌株（Invitrogen Prod. No.: C6010-03）であり、これは、ＩＰＴＧ誘導が可能なプロモーター（ｌａｃＺ）の制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼを染色体的にコードする。
形質転換の結果得られたバクテリアコロニーは、当業者に公知の方法により、それらがデンプンリン酸化タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む必要な発現プラスミドを有しているかどうかを確かめるために調べることができる。同時に、発現クローンが得られる。
ｃ） Escherichia coliにおけるデンプンリン酸化タンパク質の発現
まず第一に、予備培養を生成する。このために、工程ｂ）に従って得られた発現クローンを、発現プラスミドの存在を選択するための抗生物質を含む３０mlのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（ＴＢ培地）に播種し、終夜３０℃で攪拌下（２５０rpm）インキュベーションする。
デンプンリン酸化タンパク質発現用の本培養を次に生成する。これを行うために、各々３０℃に予熱された３００mlのＴＢ培地および発現プラスミドの存在を選択するための抗生物質を含む１ L エルレンマイヤーフラスコに、各々１０mlの適切な予備培養を播種し、（６００nmの波長で測定した）光学密度（ＯＤ600）が約０．８になるまで、３０℃で攪拌下（２５０rpm）インキュベーションした。
もし、デンプンリン酸化タンパク質の発現のために、デンプンリン酸化タンパク質の発現が誘導可能なシステム（例えばＩＰＴＧにより誘導可能なＢＬ２１ E.coli 菌株中の発現ベクターｐＤＥＳＴ（商標）１７）を用いて開始されるような発現プラスミドを用いる場合は、約０．８のＯＤ600に達したときに、当該（例えばＩＰＴＧ）誘導物質を本培養に加える。誘導物質を加えた後に、本培養液を３０℃で攪拌下（２５０rpm）約１．８のＯＤ600までインキュベーションする。本培養を次に氷上で３０分間冷却し、続いて本培養の細胞を遠心分離（１０分間４，０００×ｇ、４℃）により、培地から分離する。
４． デンプンリン酸化タンパク質の精製
ａ） デンプンリン酸化タンパク質を発現している細胞の破砕
一般的方法項目３の工程ｃ）で得た細胞を、溶解緩衝液中に再懸濁する。その際、約４mlの溶解緩衝液を約１gの細胞へ加える。次に再懸濁した細胞を氷上で３０分間インキュベーションし、その後、超音波プローブ（Baudelin Sonoplus UW 2070, Baudelin electronic, Berlin、 設定：サイクル６、７０％、１分間）を用いて、氷による連続冷却下で破砕する。ここで、細胞懸濁液を超音波処理の間に熱しすぎないことを確実にするように注意しなければならない。超音波処理の結果得られた懸濁液を遠心し（１２分２０，０００×ｇ、４℃）、遠心分離の後に得られた上清を、４５μmのポアサイズを有するフィルタを用いて濾過する。
ｂ） デンプンリン酸化タンパク質の精製
もし E.coli 細胞中に発現したデンプンリン酸化タンパク質がＨｉｓタグとの融合タンパク質である場合は、Ｈｉｓタグが非常に大きな親和性で結合するニッケルイオンを用いて精製することができる。これを行うために、工程ｄ）で得られた２５mlの濾液を１mlのＮｉ−アガローススラリー（Qiagen, Prod. No.: 30210）と混合し、氷上で１時間インキュベーションする。Ｎｉ−アガローススラリーと濾液の混合物を、続いてポリスチレンカラム（Pierce, Prod. No.:29920）上で展開する。カラムを通過する生成物を捨てる。次に８mlの溶解緩衝液を加えることによりカラムを洗浄し、カラムを通過する生成物を再び捨てる。デンプンリン酸化タンパク質の溶出は、次に、１mlのＥ１緩衝液を２回、続いて１mlのＥ２緩衝液を１回、また続いて１mlＥ３緩衝液を５回、カラムへ区分けして加えることにより起こる。カラムへ適切な溶出緩衝液（Ｅｌ、Ｅ２、Ｅ３緩衝液）の個々の分画を加えることにより生成される、カラムを通過する生成物を、別々の分画に集める。これらの分画の小部分を、次に変性ＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動とそれに続くクマシーブルー染色により分析する。十分な量および満足すべき純度のデンプンリン酸化タンパク質を含む分画を、加圧濾過を用いて４℃で精製し濃縮する。加圧濾過を、例えばＡｍｉｃｏｎセル（Amicon Ultrafiltration Cell, Model 8010, Prod. No.: 5121）を用いて、ＤｉａｆｌｏＰＭ３０膜（Millipore, Prod. No.: 13212）を使用して４℃で実施することができる。しかし、当業者に公知の他の方法も濃縮に用いることができる。
ｃ） 用いられる緩衝液の組成
溶解緩衝液： ５０mM ＨＥＰＥＳ、
３００mM ＮａＣｌ、
１０mM イミダゾール、
ｐＨ８．０（ＮａＯＨで調節する）、
１mg/mlリゾチーム（緩衝液を用いる直前に加える）
１０ml当たり１／４錠の完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤（Roche Product No.:1873580）(緩衝液を用いる直前に加える）。
溶出緩衝液Ｅ１： ５０mM ＨＥＰＥＳ、
３００mM ＮａＣｌ、
５０mM イミダゾール、
ｐＨ８．０（ＮａＯＨで調節する）
溶出緩衝液Ｅ２： ５０mM ＨＥＰＥＳ、
３００mM ＮａＣｌ、
７５mM イミダゾール、
ｐＨ８．０（ＮａＯＨで調節する）
溶出緩衝液Ｅ３： ５０mM ＨＥＰＥＳ、
３００mM ＮａＣｌ、
２５０mM イミダゾール、
ｐＨ８．０（ＮａＯＨで調節する）
５． Ｒ１タンパク質の組換え発現
Ｒ１タンパク質の組換え発現については、文献（Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171; Mikkelsen et al., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532) に記載されているが、しかしまた、一般的方法項目３の下に上に記述されたデンプンリン酸化タンパク質の組換え発現に関する方法に従って実施することもできる。
６． Ｒ１タンパク質の精製
Ｒ１タンパク質の精製については、文献（Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171; Mikkelsen et al., Mikkelsen et al., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532) に記述されているが、しかし、E. coli 細胞のＲ１の発現によってＨｉｓタグを含むＲ１融合タンパク質が生成される場合は、一般的方法項目４の下に上に記述された、デンプンリン酸化タンパク質の精製に関する方法に従って実施することもできる。
７． 非リン酸化デンプンに基づくリン酸化デンプンのインビトロにおける作製
ａ） 非リン酸化デンプンのインビトロにおけるリン酸化
１ml当たり２５mgのデンプン含量を生成するために、デンプンリン酸を含まないデンプン（例えば、一般的方法項目２、の下で上に記述された方法を用いて、 Arabidopsis thaliana sex1-3 突然変異体の葉から単離された）を、Ｒ１緩衝液および精製されたＲ１タンパク質（１mgデンプン当たり約０．２５μgのＲ１タンパク質）と混合する。この反応調製物を、終夜（約１５ｈ）攪拌下室温でインキュベーションする。反応調製物中に存在するデンプンに結合しているＲ１を、反応の完了時に４回、各回約８００μlの０．５％ＳＤＳで洗浄することにより除去する。続いてインビトロでリン酸化されたデンプン中にまだ存在するＳＤＳを５回、各回１mlの洗浄緩衝液で洗うことにより、除去する。すべての洗浄工程を室温で１０〜１５分間攪拌下行なう。各洗浄工程に続けて、それぞれのＳＤＳ緩衝液または洗浄緩衝液からデンプン粒を分離するために、遠心分離（２分間、１０，０００×ｇ）を行う。
ｂ） 用いられる緩衝液の組成
Ｒ１緩衝液： ５０mM ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．５、
１mM ＥＤＴＡ、
６mM ＭｇＣｌ２、
０．５mM ＡＴＰ
洗浄緩衝液： ５０mM ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．２
８． リン酸化デンプンまたは非リン酸化デンプンへのタンパク質の結合
ａ） Ｐ−デンプンタンパク質複合体または非リン酸化デンプンタンパク質複合体の単離
約５０mgのＰ−デンプンまたは約５０mgの非リン酸化デンプンを、個別の調製物中の各タンパク質抽出物約８００μlに再懸濁する。タンパク質抽出物のタンパク質濃度は、各々１ml当たり約４mg〜５mgとするべきである。Ｐ−デンプンまたは非リン酸化デンプンとタンパク質抽出物のインキュベーションを攪拌下室温１５分間４℃で実施する。インキュベーションの完了時に、反応調製物をパーコールクッション（４ml）を用いて遠心する（１５分、３，５００rpm、４℃）。遠心分離の後、リン酸化デンプン即ちＰ−デンプンに結合していないタンパク質は上清で見つかり、パスツールピペットで除去ことができる。上清を捨てる。遠心分離後に得られたＰ−デンプンおよび非リン酸化デンプンを含み、またそれぞれのデンプンに結合したタンパク質（それぞれ、Ｐ−デンプンタンパク質複合体または非リン酸化デンプンタンパク質複合体）を含む沈殿したペレットを２回、各回１mlの洗浄緩衝液で（上記、一般的方法項目７．ｂ）を参照のこと）、３分間４℃攪拌下でインキュベーションすることにより、洗浄した。洗浄工程の次に、洗浄緩衝液からＰ−デンプンまたは非リン酸化デンプンをそれぞれ分離するために、遠心分離（５分、８０００rpm、４℃で卓上遠心機 Hettich EBA 12Rで）を行った。
ｂ） Ｐ−デンプンタンパク質複合体または非リン酸化デンプンタンパク質複合体それぞれ中の結合したタンパク質の溶解
工程ａ）で得られたＰ−デンプンタンパク質複合体または非リン酸化デンプンタンパク質複合体をそれぞれ約１５０μlＳＤＳテスト緩衝液中に再懸濁し、室温１５分間攪拌下でインキュベーションする。続いてＰ−デンプンまたは非リン酸化デンプンを、それぞれ溶解されたタンパク質から遠心分離により（１分、１３，０００rpm、室温、Eppendorf 卓上遠心機）、取り除く。Ｐ−デンプンまたは非リン酸化デンプンの残りをそれぞれすべて除去するために、遠心分離後に得られた上清を再び遠心し（１分、１３，０００rpm、室温、Eppendorf 卓上遠心機）、除去する。その結果、Ｐ−デンプンまたは非リン酸化デンプンにそれぞれ結合する溶解されたタンパク質が得られる。
ｃ） 用いる緩衝液の組成
ＳＤＳテスト緩衝液： １８７．５mM トリス／ＨＣl、ｐＨ６．８、
６％ ＳＤＳ、
３０％ グリセリン、
〜０．０１５％ ブロモフェノールブルー、
６０mM ＤＴＥ（新たに添加）
パーコール： パーコールを、および２５mMＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．０）から構成される溶液に対して終夜透析する。
９． Ｐ−デンプンおよび／または非リン酸化デンプンに結合するタンパク質の分離
タンパク質のそれぞれＰ−デンプンまたは非リン酸化デンプンへの結合に関する一般的方法項目８工程ｃ）で得られた溶解されたタンパク質を、各々５分間９５℃でインキュベーションし、続いて変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて分離する。その際、Ｐ−デンプンに結合することにより得られた溶解されたタンパク質および非リン酸化デンプンに結合することにより得られた溶解されたタンパク質の等しい体積を、各々アクリルアミドゲルに加える。電気泳動の完了時に得られたゲルを少なくとも終夜コロイド状クマシーで染色し(Roth, Karlsruhe, Roti-Blue Rod. No.: A152.1)、続いて３０％メタノール、５％酢酸、または２５％メタノール中で脱色する。
１０． Ｐ−デンプンおよび／または非リン酸化デンプンに結合するタンパク質の同定および単離
ａ） 非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンに対して増加した結合活性を有するタンパク質の同定
アクリルアミドゲル電気泳動による分離およびそれに続く染色による可視化（上記一般的方法項目９を参照のこと）の後に、非リン酸化デンプンに結合した後の対応する信号と比較して、Ｐ−デンプンに結合した後に増加した信号を示すタンパク質は、非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンに対して増大した結合活性を有する。この手段によって、非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンに対して増大した結合活性を有するタンパク質を同定することができる。非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンに対して増大した結合活性を有するタンパク質を、アクリルアミドゲルから切り出す。
ｂ） 非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンに対して増大した結合活性を有するタンパク質の同定
工程ａ）に従って同定されたタンパク質をトリプシンにより消化し、得られたペプチドをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析して、得られたペプチドの質量を決定する。トリプシンは配列特異的なプロテアーゼである、即ちトリプシンは、タンパク質があるアミノ酸配列を含んでいる場合に、特異的位置でのみ当該タンパク質を分割する。Ｎ末端からスタートして、アミノ酸アルギニンおよびリジンが互いに続く場合トリプシンは常にペプチド結合を分割する。したがって、アミノ酸配列のトリプシン消化後に生成されることになるペプチドをすべて理論的に決定することが可能である。理論的に決定されたペプチドをコードするアミノ酸についての知識から、理論的なトリプシン消化後に得られるペプチドの質量を決定することができる。したがって、理論的なトリプシン消化後のペプチドの質量に関する情報を含むデータベース（例えば、NCBInr http:// prospector. ucsf.edu/ucsfhtml4.0/msfit.htm; Swissprot http://cbrg.inf.ethz.ch/Server/ MassSearch.html）を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって得られた未知のタンパク質のペプチドの実際の質量と比較することができる。理論的および／または現実のトリプシン消化の後に同じペプチド質量を有するアミノ酸配列は、同一であると見なされる。当該データベースは、既にその機能が示されているタンパク質のペプチド質量、および配列決定計画により得られた核酸配列から出発したアミノ酸配列から導出された、今までのところ単に仮説的に存在するタンパク質のペプチド質量の両方を含む。そのような仮説タンパク質の実際の存在および機能が示されたことは希であり、また何らかの機能が存在するとしても、これは通常予測のみに基づいていて、実際の機能の実証には基づいていない。
工程ａ）に従って得られたタンパク質を含むバンドをアクリルアミドゲルから切り出し；切り出されたアクリルアミド片を、約３０分間３７℃で、約１mlの６０％５０mMＮＨ４ＨＣＯ３４０％アセトニトリル中でインキュベーションすることにより、還元して脱色する。続いて脱色溶液を除き、残ったゲルを真空下（例えば Speedvac）で乾燥させる。乾燥後、トリプシン溶液を加えて、当該ゲル片に含まれるタンパク質を消化する。消化は、３７℃で終夜行う。消化の後、小量のアセトニトリルを加えて（アクリルアミドゲルが白く染まるまで）、調製物を真空下（例えばSpeedvac）で乾燥させる。乾燥が完了したとき、乾いた内容物を被うためにちょうど十分な５％ギ酸を加え、数分間３７℃でインキュベーションする。アセトニトリル処理とそれに続く乾燥をもう一度繰り返す。続いて、乾燥した内容物を０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸、５μl〜１０μl）に吸収させ、担体上に約０．５μlずつ滴下する。等量のマトリックス（ε−シアノ−４−ヒドロキシ−桂皮酸）を担体に加える。マトリックスを結晶化させた後に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ−ＭＳ（例えば Burker Reflex(商標) II, Bruker Daltonic, Bremen ）によってペプチドの質量を決定する。得られた質量についてデータベースを探索して、理論的トリプシン消化後に同じ質量を与えるアミノ酸配列を求める。このようにして、好んでリン酸化α−１，４−グルカンに結合する、および／または基質としてＰ−α−１，４−グルカンを必要とするタンパク質をコードするアミノ酸配列を同定することができる。
１１． タンパク質のデンプンリン酸化活性を実証する方法
ａ） タンパク質のＰ−デンプンおよび／または非リン酸化デンプンとのインキュベーション
タンパク質がデンプンリン酸化活性を有するかどうかを実証するために、調べるべきタンパク質をデンプンおよび放射性ラベルされたＡＴＰとインキュベーションすることができる。これを行うために、約５mgのＰ−デンプンまたは約５mgの非リン酸化デンプンを、調べるタンパク質（用いるデンプン１mg当たり０．０１μg〜５．０μg）と５００μlリン酸化緩衝液中で１０分〜３０分間室温で攪拌下インキュベーションする。続いて反応を、ＳＤＳの２％（重量／体積）濃度までの添加によって止める。それぞれの反応混合物中のデンプン粒を遠心（１分間、１３，０００×ｇ）し、９００μlの２％ＳＤＳ溶液で１回および各々９００μlの２mMＡＴＰ溶液で４回洗浄する。各洗浄工程を、１５分間室温で撹拌下行なう。各洗浄工程の後、デンプン粒をそれぞれの洗浄緩衝液から遠心分離（１分間、１３，０００×ｇ）により分離する。
さらに、タンパク質のデンプンリン酸化活性を実証する実験を実施するときは、タンパク質を含んでいないかまたは不活性化されたタンパク質を含むが、それ以外は記述した反応調製物と同じ方法で処理されるさらなる反応調製物を、いわゆる対照として処理するべきである。
ｂ） 酵素活性によりＰ−デンプンおよび／または非リン酸化デンプンに取り込まれたリン酸残基の量の決定。
工程ａ）に従って得られたデンプン粒を、放射性ラベルされたリン酸残基の存在について調べることができる。これを行うために、それぞれのデンプンを１００μlの水に再懸濁し、それぞれ３mlのシンチレーションカクテル（例えば Ready Safe（商標), BECKMANN Coulter）と混合し、次にシンチレーションカウンター(例えば、 LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN COULTER(商標)）を用いて分析する。
ｃ） 基質としてＰ−デンプンを好んで用いるタンパク質の同定
もしタンパク質をＰ−デンプンと共に一度、および非リン酸化デンプンと共に一度、別々の調製物中でａ）に記述した方法に従いインキュベーションするならば、工程ｂ）によって得られたデンプンリン酸の存在量を比較することよって、当該タンパク質が非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンにより多くのリン酸を取込んだかどうかを決定することができる。したがって、Ｐ−デンプンへリン酸を導入することができるが、非リン酸化デンプンへはできないタンパク質を同定することが出来る。即ちさらなるリン酸化反応用基質として既にリン酸化されているデンプンを要求するタンパク質を同定することができる。
ｄ） 用いられる緩衝液の組成
リン酸化緩衝液： ５０mM ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ ｐＨ７．５、
１mM ＥＤＴＡ、
６mM ＭｇＣｌ２、
０．０１〜０．５mM ＡＴＰ、
１ml当たり０．２〜２ pCi の無作為化33Ｐ−ＡＴＰ（あるいは、β位置に特異的にラベルされたリン酸残基を含むＡＴＰを用いることもできる）。
本発明に関連しては、用語「無作為化ＡＴＰ」とはγ位置およびβ位置の両方にラベルされたリン酸残基を含むＡＴＰを意味すると理解するべきである（Ritte et al. 2002, PNAS 99, 7166-7171）。無作為化ＡＴＰはまた科学文献にβ／γＡＴＰとして記述されている。無作為化ＡＴＰを作製する方法について下記に記述する。
ｉ） 無作為化ＡＴＰの作製
ここで記述する、酵素触媒反応を用いる無作為化ＡＴＰの作製のための方法は、次の反応機構に基づく：
反応工程１
γ33Ｐ−ＡＴＰ＋ＡＭＰ＋ミオキナーゼ → β33Ｐ−ＡＤＰ＋ＡＤＰ
（アデノシン−Ｐ−Ｐ−33Ｐ＋アデノシン−Ｐ →
アデノシン−Ｐ−Ｐ＋アデノシン−Ｐ−33Ｐ）
反応工程２
33Ｐ−ＡＤＰ＋ＡＤＰ＋２ ＰＥＰ＋ピルビン酸キナーゼ →
β33Ｐ−ＡＴＰ＋ＡＴＰ＋２ ピルビン酸
（アデノシン−Ｐ−Ｐ＋アデノシン−Ｐ−33Ｐ＋２ ＰＥＰ →
アデノシン−Ｐ−Ｐ−Ｐ ＋ アデノシン−Ｐ−33Ｐ−Ｐ＋２ ピルビン酸）
反応平衡が生成物側に存在するにもかかわらず、この反応は、主としてβ33Ｐ−ＡＴＰおよびいくらかのγ33Ｐ−ＡＴＰからなる混合物を生成する。
ii） 第１の反応工程の実施
33Ｐでラベルされたリン酸残基をγ位置に含むＡＴＰ(Hartmann Analytic,10μCi/μl)（１００μCi、３０００Ci/mmol）を、２μlミオキナーゼ（ウサギ筋肉のＡＭＰホスホトランスフェラーゼ；SIGMA, Prod. No.: M3003、３．８mg/ml、１，６２６単位/mg）と９０μlの無作為化緩衝液中１時間３７℃でインキュベーションする。１２分間９５℃でインキュベーションすることにより反応を停止し、その後、反応調製物をＭｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ１０フィルタ（Amicon, Millipore Prod. No. 42407）を用い、１４，０００×ｇで少なくとも１０分間遠心濾過することにより精製した。
iii） 第２の反応工程の実施
２μlのピルビン酸キナーゼ（適切な溶液を作製する方法については下を参照）および３μlの５０mMＰＥＰ（ホスホエノールピルビン酸）を工程ii）で得られた濾液に加える。この反応混合物を４５分間３０℃でインキュベーションしてから、９５℃で１２分間インキュベーションすることにより反応を止める。続いて反応混合物を遠心する（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ卓上遠心機で２分間、１２，０００rpm）。遠心分離後に得られた無作為化ＡＴＰを含む上清を取り出して、小分けにし、−２０℃で貯蔵することができる。
ピルビン酸キナーゼ溶液の作製
１５μlピルビン酸キナーゼ（ウサギ筋肉、Roche, Prod. No.12815,１０mg/ml, ２００単位/mg，２５℃で) を遠心し、上清を捨て、またペレットを２７μlピルビン酸キナーゼ緩衝液に吸収した。
iv） 用いられる緩衝液
ピルビン酸キナーゼ緩衝液： ５０mM ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．５、
１mM ＥＤＴＡ
無作為化緩衝液： １００mM ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ ｐＨ７．５、
１mM ＥＤＴＡ、
１０％ グリセリン、
５mM ＭｇＣｌ２、
５mM ＫＣｌ、
０．１mM ＡＴＰ、
０．３mM ＡＭＰ
１２． タンパク質の自己リン酸化の実証
タンパク質が自己リン酸化活性を有するかどうかを実証するために、調べたいタンパク質を放射性ラベルされたＡＴＰとインキュベーションすることができる。これを行うために、調べたいタンパク質（５０μg〜１００μg）を、２２０μlリン酸化緩衝液（上記の一般的方法、項目１２ｄ）を参照のこと）の中で３０分〜９０分間室温で撹拌下インキュベーションする。その後、反応を最終濃度０．１１MまでのＥＤＴＡを加えることによって止める。その後、約２μg〜４μgのタンパク質を、変性ポリアクリルアミド電気泳動（７．５％アクリルアミドゲル）を用いて分離する。ポリアクリルアミドゲル電気泳動法後に得られたゲルをオートラジオグラフィに付す。オートラジオグラフィで信号を示すタンパク質は放射性リン酸残基を保持している。
１３． デンプンリン酸化タンパク質によりリン酸残基を導入されるα−１，４−グルカンのグルコース分子のＣ−原子位置の同定
α−１，４−グルカンのグルコース分子のどのＣ−原子位置がタンパク質によりリン酸化されるかを、制御された様式で、適切なタンパク質を用いて得られたリン酸化グルカンのインビトロの加水分解、それに続く加水分解後に得られたグルコースモノマーの分離、およびそれに続く、適切なタンパク質によりグルコース分子の一定の分画に組み入れられたリン酸の測定、により実証することができる
ａ） α−１，４−グルカンの全加水分解
α−１，４−グルカンを含む水懸濁物を遠心し、続いて沈殿したペレットを０．７MのＨＣl（Baker、解析用）に再懸濁して、撹拌下２時間９５℃でインキュベーションする。インキュベーションの完了後、試料を短時間冷却し、遠心する（例えば２分間、１０，０００×g）。得られた上清を新しい反応容器に移し、２M ＮａＯＨ（Baker、解析用）を添加して中和する。ペレットが残っている場合は、それを１００μlの水に再懸濁し、そこに存在するラベルされたリン酸の量を対照として測定する。
続いて中和した上清を１０kDaフィルタに載せて遠心する。得られた濾液の小分画を、例えば、シンチレーションカウンターを用いて測定して、濾液中のラベルされたリン酸の量を決定する。
ｂ） 加水分解生成物の分別およびリン酸化されたＣ−原子位置の決定
工程ａ）によって得られた加水分解生成物の中和された濾液を、例えば高圧陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ）を用いて、分離することができる（約３０００cpmの放射性ラベルＡＴＰを用いる場合）。ＨＰＡＥに必要な体積を得るために中和された濾液をＨ２０で薄めることができる。さらに、グルコース−６−リン酸（約０．１５mM）およびグルコース−３−リン酸（約０．３mM）を、適切な濾液に各々内部対照として加える。ＨＰＡＥによる分離を例えば、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ １００カラム（適切なプレカラムを備えた）およびパルスアンペロメトリック検出器（ＥＤ ５０）を用いるＤｉｏｎｅｘ ＤＸ ６００ ＢｉｏＬｃシステムを用いて、行なうことができる。そうする際に、試料を注入する前に、カラムをまず１０分間９９％溶出液Ｃおよび１％溶出液Ｄで濯ぐ。その後、６０μlの試料体積を注入する。試料の溶出は下記条件下で起こる：
流量：１ml／分
勾配：０分〜３０分まで直線的に増加する
溶出液Ｃ 溶出液Ｄ
０分 ９９％ １％
３０分 ０％ １００％
３５分 ０％ １００％
溶出終了。
カラムから溶出した加水分解生成物を、各々１mlの分画毎に集める。毎回非ラベルグルコース−３−リン酸（Ritte et al. 2002, PNAS 99, 7166-7171）および非ラベルグルコース−６−リン酸（Sigma, Prod. No.: G7879）を、注入された加水分解生成物の試料に内部基準として加えておくので、グルコース−３−リン酸またはグルコース−６−リン酸のいずれかを含む分画を、パルスアンペロメトリック検出により決定することができる。個々の分画中のラベルされたリン酸の量を測定し、続いてグルコース−３−リン酸またはグルコース−６−リン酸を含む分画と比較することにより、これをラベルされたグルコース−６−リン酸またはラベルされたグルコース−３−リン酸を含む分画を決定するために用いることができる。当該分画中のラベルされたリン酸の量を決定する。個々の加水分解生成物中でラベルされたリン酸について測定されたグルコース−３−リン酸のグルコース−６−リン酸に対する量比から、α−１，４−グルカンリン酸化酵素がどのＣ−原子位置を好んでリン酸化するかをここで決定することができる。
ｃ） 用いる緩衝液
溶出液Ｃ：１００ mM ＮａＯＨ
溶出液Ｄ：１００ mM ＮａＯＨ、
５００ mM 酢酸ナトリウム
１４． イネ植物の形質転換
イネ植物を、Hiei et al.（1994, Plant Journal 6(2), 271-282）によって記述された方法に従って形質転換した。
１５． ジャガイモ植物の形質転換
ジャガイモ植物を、アグロバクテリウムを用いて、Rocha-Sosa et al.（EMBO J. 8,（1989), 23-29）によって記述されているように形質転換した。
１６． コムギ植物の形質転換
コムギ植物を Becker et al.(1994, Plant Journal 5, 299-307）により記述された方法に従って形質転換した。
１７． トウモロコシ植物の形質転換
系統Ａ１８８のトウモロコシ植物の未成熟胚をlshida et al. (1996, Nature Biotechnology 14, 745-750）により記述された方法に従って形質転換した。
１８． デンプンリン酸含量の決定
Ｃ−６リン酸含有量の決定
デンプンにおいては、グルコース単位のＣ２、Ｃ３およびＣ６位置がリン酸化される可能性がある。デンプンのＣ６−Ｐ含量を決定するために、５０mgのデンプンを、５００μlの０．７M ＨＣｌ中４時間９５℃で加水分解した。その後、調製物を１５，５００ｇで１０分間遠心し、上清を取り出した。上清７μlを１９３μlのイミダゾール緩衝液（１００mM イミダゾール、ｐＨ７．４；５mM ＭｇＣｌ2、１mM ＥＤＴＡおよび０．４mM ＮＡＤ）と混合した。光度計を用いて３４０nmで測定を行った。基礎吸収を確定した後、２単位のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Leuconostoc mesenteroidesの, Boehringer Mannheim）を加えることにより、酵素反応を開始した。吸収の変化は、デンプン中のＧ−６−Ｐ含量の濃度に正比例する。
ｂ） 全リン酸含量の決定
全リン酸含量の決定をエームズ法（Methods in Enzymology VIII, (1966), 115-118）を用いて行う。
約５０mgのデンプンを３０μlのエタノール硝酸マグネシウム溶液と混合し、マッフル炉中３時間５００℃で灰化する。残渣を３００μlの０．５M塩酸と混合し、３０分間６０℃でインキュベーションする。次に、一部分を０．５M塩酸で３００μlまで増加させ、１００μlの１０％アスコルビン酸および６００μlの２M硫酸中の０．４２％モリブデン酸アンモニウムの混合物に加えて、２０分間４５℃でインキュベーションする。
ｃ） Ｃ−６リン酸およびＣ−３リン酸の含量の決定
α−１，４−グルカンのグルコース分子のＣ−６位置およびＣ−３位置に結合したリン酸の含量を決定するために、一般的方法項目１３に記載されたＨＰＡＥ法による全加水分解を用いて各グルカンを分離することができる。グルコース−６−リン酸およびグルコース−３−リン酸の量を、ＨＰＥＡ分離の後に得られる個々のピーク面積の積分により決定することができる。未知の試料で得られたグルコース−６−リン酸に対するピーク面積を、既知量のグルコース−６−リン酸およびグルコース−３−リン酸を有するＨＰＡＥ分離後のピーク面積と比較することにより、調査する試料中のグルコース−６−リン酸およびグルコース−３−リン酸の量を決定することができる。
Arabidopsis thaliana からの非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンに対して増加した結合活性を有するタンパク質の単離
ａ） Arabidopsis thaliana からのタンパク質抽出物の作製
タンパク質抽出物を、Arabidopsis thaliana（Oekotyp Columbia, Col-O）の約７ｇの葉（生体重）から、一般的方法項目１に記述された方法に従って作製した。
ｂ） Arabidopsis thaliana sex1-3 突然変異体の葉からのデンプン粒の単離
デンプン粒を、Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の約２０gの葉（生体重量）から、一般的方法項目２に記述された方法に従って単離した。
ｃ） Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体から単離されたデンプンの、精製されたＲ１タンパク質によるインビトロのリン酸化
Arabidopsis thaliana sexl-3突然変異体から単離された約３０mgの非リン酸化デンプンを、一般的方法項目７に記述された方法に従って、E. coli 中で組換え発現され精製されたＲ１タンパク質によってリン酸化した。Ritte et al.（2002, PNAS 99, 7166- 7171）に記述された方法を、E. coli 中のＲ１タンパク質の発現、およびそれに続く精製に用いた。
ｄ） Ｐ−デンプンおよび／または非リン酸化デンプンに結合するタンパク質の単離
工程ａ）に従って得られたArabidopsis thaliana のタンパク質抽出物を、５０mgの工程ｃ）に従って作製されたインビトロでリン酸化されたデンプンと、一般的方法項目８ａ）に記述された方法を用いて、調製物Ａ中でインキュベーションし洗浄した。
第２の調製物Ｂ中で、工程ａ）に従って得られた Arabidopsis thaliana のタンパク質抽出物を、工程ｂ）に従って作製された５０ mgの非リン酸化デンプンと、一般的方法項目８ａ）に記述された方法を用い、インキュベーションし洗浄した。
続いて、調製物ＡのＰ−デンプンに、および調製物Ｂの非リン酸化デンプンに結合したタンパク質を、一般的方法項目８ｂ）に記述された方法に従って溶解した。
第３の調製物Ｃ中で、工程ｃ）に従って作製された５０mgのインビトロでリン酸化されたデンプンを、一般的方法項目８ａ）に記述された方法を用いて、インキュベーションし洗浄した。しかし、調製物Ｃはタンパク質抽出物を含まなかった。
ｅ） 工程ｄ）に従って得られたタンパク質のアクリルアミドゲル電気泳動による分離
工程ｄ）中で得られた調製物Ａ、Ｂ、およびＣのタンパク質を、一般的方法項目９に記述された方法を用いて、変性条件（ＳＤＳ）下の９％アクリルアミドゲルによって分離し、続いてクマシーブルーで染色した。染色されたゲルを図１に示す。変性アクリルアミドゲル中で、タンパク質標準マーカー（トレースＭ）と照合して約１３０kDa の分子量を有するタンパク質が、非リン酸化デンプン（Ｋ）と比較して好んでリン酸化デンプン（トレースＰ）に結合することを、はっきり見ることができる。
ｆ） 非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンに好んで結合するタンパク質の同定
工程ｅ）で同定された約１３０kDa の分子量を有するタンパク質のバンドをゲルから切り出した。一般的方法１０ｂ）に記述したように、続いてタンパク質をアクリルアミドから放出させ、トリプシンで消化し、得られたペプチドの質量をＭＡＬＤ−ＴＯＦ−ＭＳによって決定した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって得られたいわゆる「フィンガープリント」を、データベース（Mascot: http://www.matrixscience. com/search form_select.html; ProFound: http://129.85.19.192/profound_bin/ WebProFound.exe; PepSea: http://195.41.108.38/PepSeaIntro.html）中の理論的に消化されたアミノ酸分子のフィンガープリントと比較した。このようなフィンガープリントはタンパク質に非常に特異的であるため、アミノ酸分子を同定することができた。このアミノ酸分子の配列を用いて、ＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列を、Arabidopsis thaliana から特定することができた。この方法を用いて同定したタンパク質をＡ.ｔ.−ＯＫ１と名付けた。Arabidopsis thaliana からのアミノ酸配列を分析した後に、これがデータベース中に存在する配列（ＮＰ １９８００９、ＮＣＢＩ）と相違することが判明した。配列番号２に示されるアミノ酸配列が、Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードする。配列番号２には、データベース中の配列（Ａｃｃ.：ＮＰ １９８００９．１，ＮＣＢＩ）と比較すると、差異が含まれる。配列番号２に含まれるアミノ酸５１９〜５２３（ＷＲＬＣＥ）および７６２〜７６６（ＶＲＡＲＱ）は、データベースに存在する配列（ＡＣＣ.: ＮＰ １９８００９．１）.ＮＰ １９８００９．１）中にはない。データベース配列のバージョン２（Ａｃｃ.：ＮＰ １９８００９．２）と比較して、配列番号２中に示されるアミノ酸配列は追加のアミノ酸５１９〜５２３（ＷＲＬＣＥ）を含む。
同定されたＯＫ１タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング
Ａ.ｔ.−ＯＫ１ｃＤＮＡを、 Arabidopsis thaliana の葉から単離したｍＲＮＡを用い、逆ＰＣＲ法を使用して単離した。これを行うために、逆転写酵素（SuperScript(商標) First-Strand Synthesis System for RT PCR, Invitrogen Prod. No.: 11904-018）によってｃＤＮＡ鎖を合成し、その後ＤＮＡポリメラーゼ（Expand High Fidelity PCR Systems, Roche Prod. No.: 1732641）を用いてこれを増幅した。このＰＣＲ反応から得られて増幅された生成物を、ベクターｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ（Invitrogen Prod.No.: A3600）へクローニングした。得られたプラスミドをＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔと名付け、Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を決定し、配列番号１（登録商標）に示す。
配列番号１に示された配列は、データベースに含まれている配列と同じではない。これは既に、Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列に対して議論した。
Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするｃＤＮＡの増幅に用いた条件
第１鎖の合成：
メーカーによって指定された条件および緩衝液を用いた。さらに、第１鎖合成用の反応調製物は次の物質を含んでいた：
３μg 全ＲＮＡ、
５μM ３’−プライマー（ＯＫ１逆方向１：５’−ＧＡＣＴＣＡＡＣＣＡＣＡＴＡＡＣＡＣＡＣＡＡＡＧＡＴＣ）
０．８３μM ｄＮＴＰ混合物。
反応調製物を５分間７５℃でインキュベーションし、続いて室温に冷却した。その後第１鎖緩衝液、ＲＮａｓｅ阻害剤およびＤＴＴを加えて２分間４２℃でインキュベーションし、その後１μlの SuperScript ＲＴ ＤＮＡポリメラーゼを加え、反応調製物を５０分間４２℃でインキュベーションした。
第１鎖のＰＣＲによる増幅の条件：
１μl 第１鎖合成の反応調製物
Figure 2014221066
反応条件：
工程１ ９５℃ ２分間
工程２ ９４℃ ２０秒間
工程３ ６２℃ ３０秒間（サイクル当たりの温度−０．６７℃）（３０ｓ）、６８℃
工程４ ６８℃ ４分間
工程５ ９４℃ ２０秒間
工程６ ５６℃ ３０秒間
工程７ ６８℃ ４分間
工程８ ６８℃ １０分間
まず反応を工程１〜４に従って行なった。工程４と工程２の間で１０回の繰返し（サイクル）を実施し、工程３の温度を各サイクルの後に０．６７℃だけ低下させた。次に、これに続けて工程５〜８で指定された条件に従う反応を行った。工程７と工程５の間で２５回の繰返し（サイクル）を実施し、工程７の時間を各サイクルで５秒ずつ増加させた。反応完了後すぐに、反応物を４℃に冷却した。
ＯＫ１タンパク質のｃＤＮＡの組換え発現のためのベクターの作製
鋳型としてプラスミドＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭ（登録商標）を用い、ゲートウェイ技術(Invitrogen)を用いるＰＣＲによる増幅に続いて、Arabidopsis thaliana のＯＫ１タンパク質をコードする配列を先ずベクターｐＤＯＮＯＲ（商標）２０１（Invitrogen Prod. No.: 11798-014）へクローニングした。続いて、得られたベクターのＯＫ１タンパク質のコード領域を、配列特異的組換えによって発現ベクターｐＤＥＳＴ（商標）１７（Invitrogen Prod. No.: 11803-014）中へクローニングした。得られた発現ベクターをＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＤＥＳＴ（商標）１と名付ける。クローニングは、その結果として、Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするｃＤＮＡの、発現ベクターｐＤＥＳＴ（商標）１７中に存在するヌクレオチドとの翻訳的融合を引き起こした。ベクターｐＤＥＳＴ１７(商標)１７起源のヌクレオチドはＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするｃＤＮＡと翻訳的に融合され、２１個のアミノ酸をコードする。これらの２１個のアミノ酸は、とりわけ、開始コドン（ＡＴＧ）およびいわゆるＨｉｓタグ（直接連続する６個のヒスチジン残基）を含む。翻訳的に融合した配列の翻訳の後、これは、Ｎ末端にベクター起源のヌクレオチドによりコードされる追加の２１個のアミノ酸を有するＡ,ｔ.−ＯＫ１タンパク質をもたらす。したがって、このベクターに起因する組換えＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質は、そのＮ末端にベクターｐＤＥＳＴ（商標）１７起源の２１個の追加のアミノ酸を含む。
E. coli 中のＯＫ１タンパク質の非相同発現
実施例３に従って得た発現ベクターＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＤＥＳＴ（商標）１７を、E.coli 菌株ＢＬ２１ Ｓｔａｒ(商標)(ＤＥ３）（Invitrogen, Prod. No. C6010-03）中に形質転換した。この発現系の記述は既に上に与えた（一般的方法項目３を参照）。形質転換の結果得られたベクターＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＤＥＳＴ（商標）１７を含むバクテリアのクローンを、まず予備培養の作製に使用し、それを、続いて本培養（一般的方法項目３ｃ）を参照のこと）へ接種するために用いた。予備培養および本培養を各々３０℃で撹拌下（２５０rpm）インキュベーションした。本培養が約０．８のＯＤ600に達した時、組換えＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質の発現を、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を最終濃度１mMに達するまで加えることにより誘導した。ＩＰＴＧの添加後、本培養を３０℃撹拌下（２５０rpm）でＯＤ600 が約１．８に達するまでインキュベーションした。本培養をその後３０分間氷上で冷却し、次に本培養の細胞を遠心分離（１０分間４，０００×ｇ、４℃）により培地から分離した。
組換え発現されたＯＫ１タンパク質の精製
実施例４に従って得られた細胞のＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質の精製および濃縮を、一般的方法項目４に記述された方法を用いて実施した。
ＯＫ１タンパク質のデンプンリン酸化活性の実証
Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質のデンプンリン酸化活性を、一般的方法項目１１に記述された方法に従って実証した。その際に、実施例５に従って作製された精製Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質５μgを各々調製物Ａでは実施例１ｂ）に従って Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体から単離された５mgのデンプンと、および調製物Ｂでは実施例１ｃ）に従って酵素的リン酸化によって得られた５ mgのデンプンと、それぞれ０．０５mM放射性（33Ｐ）ラベル無作為化ＡＴＰ（全体で１，１３０，００cpm、約０．５５μCi）を含むリン酸化緩衝液５００μl中で、３０分間室温で撹拌下インキュベーションした。調製物Ｂに対応し、ＯＫ１タンパク質を含んでいないがそれ以外は標品ＡおよびＢと同じ方法で処理された調製物Ｃを、対照として用いた。すべての調製物（Ａ、Ｂ、Ｃ）について、各々互いに独立に２つのテストを行なった。
シンチレーションカウンターを用い、調製物Ａ、ＢおよびＣから得られたデンプンを、放射性ラベルされたリン酸の存在について調べた（一般的方法項目１１ｂ）を参照）。結果を表１および図３に示す。
Figure 2014221066
ＯＫ１タンパク質により非リン酸化デンプンに転移されたリン酸基の分量（cpmで測定した）は、調製物Ｃ（対照）における放射性ラベルリン酸基の分量を超えないので、得られた結果から、基質として非リン酸化デンプンが与えられた場合は、ＯＫ１タンパク質はＡＴＰからデンプンにリン酸基を転移しないことが分かる。他方で、基質としてＰ−デンプンが与えられた場合は、ＡＴＰからＰ−デンプンへ転移される放射性リン酸基の分量（cpmで測定した）が、有意に高い。このことから、ＯＫ１タンパク質は基質としてＰ−デンプンを要求すること、またＯＫ１タンパク質は非リン酸化デンプンを基質として受け入れないことがわかる。
もし上記のテストが、33Ｐによりγ位置に特異的にラベルされたＡＴＰを用いて行われた場合は、放射性ラベルされたリン酸のデンプン中への取り込みは、まったく確立することができない。これにより、ＡＴＰのβリン酸残基がＯＫ１タンパク質からデンプンへ転移されることがわかる。そのようなテストの結果を図６に示す。
自己リン酸化の実証
Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質の自己リン酸化が上記の方法により実証された（一般的方法項目１２を参照のこと）。ここで、５０μgの精製されたＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質を放射性ラベルされた無作為化ＡＴＰと、２２０μlのリン酸化緩衝液（上記一般的方法項目１２ｄ）を参照のこと）中で、室温６０分撹拌下でインキュベーションした。続いて、インキュベーション調製物から各々１００μlを取り出し、４つの新鮮な反応容器に移した。反応容器１では、４０μlの０．１１M ＥＤＴＡの添加により反応を停止した。反応容器２を９５℃で５分間インキュベートした。反応容器３にＨＣｌを最終濃度０．５M まで加え、反応容器４にＮａＯＨを最終濃度０．５M まで加えた。反応容器３および４を各々２５分間３０℃でインキュベーションした。続いて、反応容器１、２、３および４から各々５０μlを取り出し、ＳＤＳテスト緩衝液と混合して、ＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動（７．５％アクリルアミドゲル）によって分離した。この目的のために、反応容器からの試料を各々２つの同一のアクリルアミドゲルのそれぞれに添加した。電気泳動を完了して得られたゲルのうちの１つをオートラジオグラフィに付し、もう１つのゲルをクマシーブルーで染色した。
クマシーブルーで染色したゲル中で（図２Ａを参照のこと）、０．５M のＮａＯＨによる処理がＯＫ１タンパク質の分解をもたらすことがはっきり分かる。したがって、ＯＫ１タンパク質はＮａＯＨに対して不安定であると言わなければならない。３０℃、９５℃および０．５M ＨＣｌでのインキュベーションは、ＯＫ１タンパク質が述べたインキュベーション条件下で比較的安定していることを示す。これを、これらのインキュベーション条件下では、いずれもクマシーブルー染色後の当該ゲル中でほぼ同じ量のＯＫ１タンパク質を実証することができるという事実から結論することができる。
オートラジオグラフィ（図２Ｂを参照）において、３０℃でインキュベーションしたリン酸化ＯＫ１タンパク質と比較してリン酸化ＯＫ１タンパク質の９５℃でのインキュベーションが、ＯＫ１タンパク質に結合したリン酸の有意な減少をもたらすことがわかる。したがって、リン酸残基とＯＫ１タンパク質のアミノ酸の間の結合は熱に不安定であると言わなければならない。更に、ＯＫ１タンパク質に結合したリン酸のわずかな減少が、０．５M ＨＣｌおよび０．５M ＮａＯＨとのインキュベーションについて、３０℃でインキュベーションしたリン酸化ＯＫ１タンパク質と比較して見られる。ＯＫ１タンパク質のＮａＯＨに対する不安定性のために、オートラジオグラフィ中の、０．５M ＮａＯＨ処理後のＯＫ１タンパク質の量が、熱と酸で処理された試料より有意に少ないという事実を考慮に入れるならば、リン酸残基とＯＫ１タンパク質のアミノ酸の間の結合は、塩基に関しては比較的安定しているだろうと結論付けることができる。酸で処理された試料が、３０℃および９５℃でインキュベーションした試料とほぼ同じ量のタンパク質を含んでおり、しかし３０℃で処理された試料よりオートラジオグラフィ中で有意に低い信号を有するので、酸とのインキュベーション条件は、リン酸残基とＯＫ１タンパク質のアミノ酸の間の結合もある程度切断すると考えなければならない。したがって、リン酸残基とＯＫ１タンパク質のアミノ酸の間の結合の不安定性を、行なわれたテストにより確立することができた。同時に、酸に関する不安定性は熱に関する不安定性より有意に小さいと分類される。
アミノ酸のヒスチジンおよびリン酸間の結合は、熱に不安定であり、酸に不安定であるが、しかし塩基に安定である（Rosenberg, 1996, Protein Analysis and Purification, Birkhaeuser, Boston, 242-244）。上述の結果は、したがってホスホヒスチジンがＯＫ１タンパク質の自己リン酸化によって生成されることを示す。
組換え発現されたＯＫ１タンパク質を、上述のようにγ位置を33Ｐで特異的ラベルされたＡＴＰとインキュベーションする場合は、自己リン酸化を立証することはできない。図５Ａ）は、適切なインキュベーション工程の後にウエスタンブロット解析によりそれぞれの反応調製物中で検出されるタンパク質の量を示す。図５Ｂ）は、個々の反応調製物からのタンパク質のオートラジオグラフィを示す。γ位置で特異的にラベルされたＡＴＰを用いる場合ＯＫ１タンパク質の自己リン酸化を実証することができないが、しかし無作為化されたＡＴＰを用いる場合、自己リン酸化を実証することができる。これは、ＯＫ１タンパク質が自己リン酸化される場合、ＡＴＰのβ位置のリン酸残基が共有結合でＯＫ１タンパク質のアミノ酸へ結合することを意味する。
ＯＫ１タンパク質によってリン酸化されるデンプンのグルコース分子のＣ−原子位置の実証
ａ） リン酸化されたデンプンの作製
リン酸化デンプンを一般的方法項目７に従って作製した。これを行うために、Arabidopsis thaliana sex1-3 突然変異体の葉から単離された５mgの非リン酸化デンプンを、調製物Ａ中で２５μgの精製されたＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質と共に用い、また別の調製物Ｂ中で、元はArabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の葉から分離され、インビトロでリン酸化されたデンプン５mgを５μgの精製されたＲ１タンパク質と共に用いた。各反応を、33ＰラベルＡＴＰ（約２．５×１０6cpm）を各々含む５００μlのリン酸化緩衝液中で、室温で１時間撹拌下インキュベーションすることにより、行なった。さらに、Arabidopsis thaliana sex1-3の突然変異体の葉から単離された５mgのデンプンおよび前記リン酸化緩衝液を含み、しかしタンパク質を含まない対照調製物を用いた。対照調製物を正確に調製物ＡおよびＢと同じ方法で処理した。個々の反応を、各々１２５μlの１０％ＳＤＳを加えることにより止め、２％ＳＤＳで１回、２mMＡＴＰで５回、およびＨ２Ｏで２回、各回に９００μlを用いて、洗浄を実施した。各洗浄工程の後に遠心分離（各回２分間Eppendorf 卓上遠心機で１３，０００rpm）を実施した。各調製物について、得られたデンプンペレットを１ml のＨ２Ｏに再懸濁し、１００μlの各調製物を３mlのシンチレーションカクテル（Ready Safer(商標), BECKMANN）を加えた後に混合し、続いて、シンチレーションカウンター（LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN COULTER（商標））を用いて測定した。
測定は次の結果を与えた：
対照： ６３cpm／１００μl ６３０cpm／１０００μl
調製物Ａ（ＯＫ１）： １３５１cpm／１００μl １３５１２cpm／１０００μl
調製物Ｂ（Ｒ１）： ３８５３cpm／１００μl ３８５２６cpm／１０００μl
ｂ） Ｐ−デンプンの全加水分解
工程ａ）に従って得られた調製物Ａ、Ｂ、およびＣの懸濁液を再び遠心（５分間Eppendorf 卓上遠心機で１３，０００rpm）して、得られたペレットを９０μlの０．７M ＨＣｌ（Baker、解析用）に再懸濁し、続いて２時間９５℃でインキュベーションした。調製物Ａ、Ｂ、およびＣを再び遠心（５分間Eppendorf 卓上遠心機で１３，０００rpm）して、上清を新しい反応容器に移した。調製物の沈殿残渣を各々１００mlのＨ２Ｏ中に再懸濁し、３mlのシンチレーションカクテル（Ready Safe(商標), BECKMANN）を加えた後にシンチレーションカウンター（LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN COULTER（商標））を用いて測定した。残渣の何れにも有意な量の放射活性は証明できなかったが、これは放射性リン酸でラベルされた加水分解生成物はすべて上清に存在することを意味する。
これに続いて、加水分解生成物を含む個々の上清に、各々３０μlの２M ＮａＯＨを加えて中和した（中和に必要なＮａＯＨの量を予めブランクの試料でテストしておいた）。中和した加水分解生成物を、前もって２回、各回に２００μlのＨ２Ｏで濯いでおいた１０kDa Microconフィルタ上に置き、Eppendorf卓上遠心機で１２，０００rpm 約２５分間遠心した。得られた濾液（各約１２０μl）から１０μlを採取し、３mlのシンチレーションカクテル（Ready Safer(商標), BECKMANN）を加えた後にシンチレーションカウンター（LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN COULTER（商標））を用いて測定した。個々の調製物中に存在する活性を決定して次の結果を得た：
調製物Ａ（ＯＫ１）： ９３４cpm／１０μl １１，２０８cpm／１２０μl、
９３cpm／μl
調製物Ｂ（Ｒ１）： ２５１８cpm／１０μl ３０，２１６cpm／１２０μl、
２５２cpm／μl
ｃ） 加水分解生成物の分離
工程ｂ）に従って得られた加水分解生成物を、上述の条件下で（一般的方法項目１３ｃ）を参照のこと）Dionexシステムを用いてＨＰＡＥにより、分離した。工程ｂ）に従って得られた調製物ＡおよびＢのろ過された上清を分離するための試料は以下の構成であった：
調製物Ａ（ＯＫ１）：工程ｂ）に従って得られた４３μlの調製物Ａの上清（約４，０００cpmに等価）、３２μlのＨ２０、２．５μlの２．５mMグルコース−６−リン酸および２．５μlの５mMグルコース−３−リン酸（合計体積＝８０μl）。
調製物Ｂ（Ｒ１）：工程ｂ）に従って得られた調製物Ｂの上清１６μl（約４，０００cpm に等価）、５９μlのＨ２０、２．５μlの２．５mMグルコース−６−リン酸および２．５μlの５mMグルコース−３−リン酸（合計体積＝８０μl）。
それぞれの場合に、６０μlの約３，０００cpmを含む対応する試料を、ＨＰＡＥを用いて分離するために注入した。ポイント２３ｃ）に指定された条件に従ってＨＰＡＥを実施した。ＨＰＡＥカラムを通した後、各々１mlの分画に溶出緩衝液を集めた。試料を注入して１０分後に分画の収集を開始した。用いたＰＡＤ検出器から受取った信号に基づいて、グルコース−６−リン酸の溶出を分画１５へ、およびグルコース−３−リン酸の溶出を分画１７へ割当てた。各々、個々の分画の５００μlを３mlのシンチレーションカクテル（Ready Safer(商標), BECKMANN）と混合し、続いてシンチレーションカウンター（LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN COULTER（商標））を用いて測定した。個々の分画について次の測定が得られた：
Figure 2014221066
表４：ＯＫ１タンパク質またはＲ１タンパク質によってリン酸化されたデンプンの加水分解によって得られた加水分解生成物の、個々の分画中の測定された放射活性量［cpm］。
結果を図５にグラフでも示す。
Ｒ１タンパク質により触媒されたデンプンのリン酸化後、デンプンを加水分解した後に、分析した分画中の全測定放射性リン酸のうち約６６％の放射性ラベルされたリン酸が、標準としてグルコース−６−リン酸を含む分画と共に、また約２７％が標準としてグルコース−３−リン酸を含む分画と共に、溶出した。ＯＫ１タンパク質により触媒されたデンプンのリン酸化後、デンプンを加水分解した後に、分析した分画中の全測定放射性ラベルリン酸のうち、約６７％の放射性ラベルされたリン酸が標準としてグルコース−３−リン酸を含む分画と共に、また約８％が標準としてグルコース−６−リン酸を含む分画と共に、溶出された。これから、Ｒ１タンパク質のデンプンのグルコース分子は、Ｃ−６位置で好んでリン酸化され、一方ＯＫ１タンパク質からのデンプンのグルコース分子は、Ｃ−３位置で好んでリン酸化されると結論付けることができる。
イネの中のＯＫ１タンパク質の同定
一般的方法項目１〜１３に記述された方法を用いて、Oryza sativa（品種Ｍ２０２）から、ＡＴＰからＰ−デンプンへリン酸残基を転移するタンパク質を同定することができた。そのタンパク質をＯ.ｓ.−ＯＫ１と名付けた。非リン酸化デンプンは、基質としてＯ.ｓ.−ＯＫ１タンパク質に使用されない、即ちＯ.ｓ.−ＯＫ１タンパク質もまたＰ−デンプンを基質として必要とする。同定されたＯ.ｓ.−ＯＫ１タンパク質を規定する核酸配列を配列番号３に示し、Ｏ.ｓ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列を配列番号４に示す。配列番号４に示すＯ.ｓ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列は、配列番号２に示すＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列と５７％の同一性を有する。配列番号３に示すＯ.ｓ.−ＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１に示すＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列と６１％の同一性を有する。
Oryza sativa のＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列を含むプラスミドｐＭＩ５０の作製
ベクターｐＭＩ５０はイネの品種Ｍ２０２の完全なＯＫ１タンパク質をコードするＤＮＡ断片を含む。イネからのＤＮＡの増幅を、５つの副工程により実施した。配列番号３に指定された配列の位置 −１１から位置２８８までの読取枠の部分を、合成オリゴヌクレオチド
Figure 2014221066
を、未熟な種もみのＲＮＡ上のプライマーとして用いる逆転写酵素およびポリメラーゼ連鎖反応を使用して、増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＬ１２３と名付けた。
配列番号３に指定された配列の位置２５０から位置９４９までの読取枠の部分を、合成オリゴヌクレオチド
Figure 2014221066
を、未熟な種もみのＲＮＡ上のプライマーとして用いる、逆転写酵素およびポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＬ１２０と名付けた。
配列番号３に指定された配列の位置８３９から位置１７６１までの読取枠の部分を、合成オリゴヌクレオチド
Figure 2014221066
を、未熟な種もみのＲＮＡ上のプライマーとして用いる、逆転写酵素およびポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＬ１２１と名付けた。
配列番号３に指定された配列の位置１５７１から位置３２４１までの読取枠の部分を、合成オリゴヌクレオチド
Figure 2014221066
を、未熟な種もみのＲＮＡ上のプライマーとして用いる、逆転写酵素およびポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＬ１１９と名付けた。
位置２７７７から位置３６２１までの読取枠の部分を、合成オリゴヌクレオチド
Figure 2014221066
をイネのゲノムＤＮＡ上のプライマーとして用いる、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＬ１２２と名付けた。
ＯＫ１の読取枠のサブパーツを一緒にクローニングすることを次のようにして実施した。ＯＫ１の読取枠の一部を含むｐＭＬ１２０の７００塩基対の長さのＡｐａＩ断片をｐＭＬ１２１のＡｐａＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドをｐＭI４７と名付けた。
ｐＭＬ１２０およびｐＭＬ１２３由来のベクターのＯＫ１をコードする領域を含む９６０塩基対の長さの断片を、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。それを行うために、各々５０nM の濃度のプライマーＯｓ_ｏｋ１−Ｆ４（上記参照）およびプライマーＯｓ_ｏｋ１−Ｒ９（上記参照）、ならびに各々５００nMの濃度のＯｓ_ｏｋ１−Ｆ６およびＯｓ_ｏｋｌ−Ｒ６を用いた。増幅されたＤＮＡ断片を、ベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＩ４４と名付けた。
停止コドンの後にＸｈｏＩ部位を導入するために、８４５塩基対の長さのｐＭＬ１２２の断片を、プライマーＯｓ_ｏｋ１−Ｆ３（上を参照）および
Figure 2014221066
によって再増幅し、ベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＩ４５と名付けた。
ＯＫ１の読取枠の一部を含む１６７１塩基対の長さの断片を、ｐＭＬ１１９から制限酵素ＳｐｅＩおよびＰｓｔＩで消化することにより得た。断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋（Genbank Acc.: X52328）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＩ４６と名付けた。
ＯＫ１の読取枠の一部を含む１７０６塩基対の長さの断片を制限酵素ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩによりｐＭＩ４６から切り出し、同じ制限酵素で切っておいたベクターｐＭＩ４５へクローンニングした。得られたプラスミドをｐＭＩ４７と名付けた。
ＯＫ１の読取枠の一部を含む１４６塩基対の長さの断片を制限酵素ＡｆｌII／ＮｏｔＩによりｐＭＩ４３から切り出し、同じ制限酵素で切っておいたベクターｐＭＩ４４へクローンニングした。得られたプラスミドをｐＭＩ４９と名付けた。
ＯＫ１の読取枠の一部を含む１６５７塩基対の長さの断片を制限酵素ＮｏｔＩおよびＮａｒＩによりベクターｐＭＩ４９から切り出し、同じ制限酵素で切っておいたベクターｐＭＩ４７へクローンニングした。得られたプラスミドはｐＭＩ５０と名付けられ、またイネで同定されたＯＫ１タンパク質の全コード領域を含む。
特異的にＯＫ１タンパク質を認識する抗体の作製
抗原として、約１００μgの精製されたＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をＳＤＳゲル電気泳動によって分離し、Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質を含むタンパク質バンドを切り取って、EUROGENTEC S.A.社（ベルギー)へ送り、同社が請負により抗体の作製を行なった。第１に、ウサギの未免疫血清を検査して、組換えＯＫ１で免疫化する前に既にＡ.ｔ.全抽出物から得たタンパク質を認識するかどうかを確かめた。２匹のウサギの未免疫血清が、１００〜１５０ kDa の範囲のタンパク質を認識しなかったので、免疫化のために選択した。各ウサギにタンパク質の１００μgを４回（０、１４、２８、５６日目）注射した。各ウサギから４つの血液サンプルを採取した：（３８日、６６日、８７日目、および最後の採血）。第１の採血後に得られた血漿は、既に特異的な反応をＯＫ１抗原に対してウエスタンブロットで示した。しかしながら、それ以上のすべてのテストでは、ウサギの最終採血を用いた。
上昇または低下したＯＫ１タンパク質の活性を有する遺伝子組換えイネ植物の作製
ａ） プラスミドｐＧｌｏ−Ａ.ｔ.−ＯＫ１の作製
イネの品種Ｍ２０２のゲノムＤＮＡに対してプライマー
Figure 2014221066
ならびに高忠実度Ｔａｑポリメラーゼ（Invitrogen, catalogue number 11304-011）によるポリメラーゼ連鎖反応（３０ × ２０秒９４℃、２０秒６２℃、１分６８℃、４mMＭｇ２ＳＯ４）を用いて、イネ由来のグロブリン遺伝子プロモーターを増幅し、それをｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）中へクローニングすることにより、プラスミドｐＩＲ９４を得た。２つのオリゴヌクレオチド
Figure 2014221066
から成る合成ＤＮＡ片を、ＳｄａＩおよびＭｕｎＩで切ったベクターｐＧＳＶ７１へクローニングすることにより、プラスミドｐＩＲ１１５を得た。
得られたプラスミドｐＩＲ１１５をＳｄａＩで切り、突出している３’末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、そしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化されまた Agrobacterium tumefaciens のオクトピン合成酵素遺伝子の終結シグナルを含むｐＢｉｎＡＲの１９７塩基対のＨｉｎｄIII／ＳｐｈI断片（Hoefgen and Willmitzer, 1990, Plant Science 66, 221-230）を挿入した。得られたプラスミドをｐIＲ９６と名付けた。
イネ由来のグロブリン遺伝子のプロモーターを含むｐIＲ９４からの９８６塩基対の長さのＤＮＡ断片を、プラスミドｐIＲ９６へクローンニングすることにより、プラスミドｐIＲ１０３を得た。
ｐＧＳＶ７１は、介在するベクターｐＧＳＶ１に由来するプラスミドｐＧＳＶ７の誘導体である。ｐＧＳＶ１は、 コンストラクションについて Cornelissen およびVanderwiele（Nucleic Acid Research 17,(1989),19-25) によって記述されたｐＧＳＣ１７００の誘導体である。ｐＧＳＶ１はｐＧＳＣ１７００から、カルベニシリン抵抗性遺伝子の欠失、ならびにプラスミドｐＴｉＢ６Ｓ３のＴＬ−ＤＮＡ領域のＴ−ＤＮＡ塩基配列の欠失により、得られた。
ｐＧＳＶ７は、プラスミドｐＢＲ３２２の複製開始点（Bolivar et al., Gene 2,（1977), 95-113）、ならびに Pseudomonas プラスミドｐＶＳ１の複製開始点（Itoh et al., Plasmid 11,（1984), 206）を含む。ｐＧＳＶ７は、さらに Klebsiella pneumoniae のトランスポゾンＴｎ１３３１から由来する選択可能なマーカー遺伝子ａａｄＡを含み、それが抗生物質スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに対する抵抗性を与える（Tolmasky, Plasmid 24（3),（1990), 218-226; Tolmasky and Crosa, Plasmid 29(1),（1993), 31-40）。
プラスミドｐＧＳＶ７１を、ｐＧＳＶ７の境界領域間にキメラのｂａｒ遺伝子をクローニングすることにより得た。キメラのｂａｒ遺伝子は、カリフラワーモザイクウィルスの転写開始用プロモーター配列（Odell et al., Nature 313,（1985), 180）、Streptomyces hygroscopicus のｂａｒ遺伝子（Thompson et al., Embo J. 6,（1987), 2519-2523）およびｐＴｉＴ３７のＴ−ＤＮＡのノパリン合成酵素遺伝子の、転写終了およびポリアデニル化用の３’−非翻訳領域を含む。ｂａｒ遺伝子は、除草剤グルホシネートアンモニウムに対する耐性を与える。
Arabidopsis のＯＫ１タンパク質の完全な読取枠を含むＤＮＡ断片を、ベクターＡ.ｔ.−ｏｋ１−ｐＧＥＭ−Ｔから切り出し、ベクターｐＩＲ１０３へクローニングした。この目的のために、プラスミドＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭ−Ｔを制限酵素Ｂｓｐ１２０１によって切断し、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、続いてＳａｌＩで切り取った。Arabidopsis thalianaのＯＫ１タンパク質をコードするＤＮＡ断片を、Ｅｃｌ１３６IIおよびＸｈｏＩで切開したベクターｐIＲ１０３へクローニングした。得られたプラスミドをｐＧｌｏ−Ａ.ｔ.−ＯＫ１と名付けた。
ｂ） イネ植物の形質転換
イネ植物（品種Ｍ２０２）を、Agrobacterium（プラスミドｐＧｌｏ−Ａ.ｔ.−ＯＫ１を含む）を用い、Hiei et al.(1994, Plant Journal 6(2), 271-282）により記述された方法を使用して形質転換した。
ｃ） 遺伝子組換えイネ植物およびこれらの植物によって合成されたデンプンの分析
ＲＴ ＰＣＲ分析により、Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を示す植物を同定することができた。
対応する野生型植物と比較して、Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードする検出可能な量のｍＲＮＡを発現する植物を温室で栽培した。これらの植物の穀粒を収穫した。これらの成熟した穀粒から単離したデンプンは、対応する野生型植物の穀粒から単離したデンプンと比較して、それぞれのデンプンに共有結合により結合したリン酸含量の増加を示した。
増大したＯＫ１タンパク質活性を示す遺伝子組換えジャガイモ植物の作製
ａ） プラスミドｐＢｉｎＢ３３−Ｈｙｇの作製
プラスミドｐＢｉｎＢ３３から出発して、Ｂ３３プロモーターを含むＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断片、ポリリンカーの一部、およびｏｃｓターミネーターを切り出し、対応して切断されたベクターｐＢＩＢ−Ｈｙｇ（Becker, 1990, Nucl. Acids Res. 18, 203）へ挿入した。Solanum tuberosum からのパタチン遺伝子Ｂ３３のプロモーター（Rocha-Sosa et al., 1989）をＤｒａＩ断片（ヌクレオチド-１５１２−＋１４）として、ＳｓｔＩで切断しＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて端部を平滑化しておいたベクターｐＵＣ１９へ挿入することにより、プラスミドｐＢｉｎＢ３３を得た。これによりプラスミドｐＵＣ１９−Ｂ３３を得た。Ｂ３３プロモーターをＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩによりこのプラスミドから切り出し、対応して切断されたベクターｐＢｉｎＡＲ（Hoefgen and Willmitzer, 1990, Plant Science 66, 221-230）へ挿入した。これにより植物発現ベクターｐＢｉｎＢ３３が得られた。
ｂ） ベクターＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＢｉｎＢ３３−Ｈｙｇの作製
Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質のコード配列を、制限酵素Ｂｓｐ１２０ＩおよびＳａｌＩでプラスミドＯＫ１−ｐＧＥＭから切り出し、ＳｍａＩおよびＳａｌＩで切断したベクターｐＢｉｎＢ３３−Ｈｙｇに挿入した。得られたプラスミドをＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＢｉｎＢ３３−Ｈｙｇと名付けた。
ｃ） ジャガイモ植物の形質転換
Agrobacterium tumefaciens (菌株 GV2260)をプラスミドＡ．ｔ.−ＯＫ１−ｐＢｉｎＢ３３−Ｈｙｇにより形質転換した。次にDesiree品種のジャガイモ植物を、プラスミドＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＢｉｎＢ３３−Ｈｙｇを含む Agrobacterium を用い、Rocha-Sosa et al.(EMBO J. 8, (1989), 23-29) に記述された方法で形質転換し、植物を再生させた。この形質転換イベントから得られた植物を３８５ＪＨと名付けた。
ｄ） 遺伝子組換えジャガイモ植物およびこれらによって合成されたデンプンの分析
ノーザンブロット分析により、Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を示す形質転換イベント３８５ＪＨの植物を同定することができた。
実施例１０に記述された抗体を用いて行なわれたウエスタンブロット分析により、非相同的に発現されたＯＫ１タンパク質のｍＲＮＡが検出された形質転換イベント３８５ＪＨの植物はまた、形質転換されなかった野生型植物に比較してＯＫ１タンパク質量の増大を示すことが確認された。図７は、形質転換イベント３８５ＪＨから得られた単一の植物中のＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質の、ウエスタンブロット分析による検出を典型的に示す。葉組織中におけるＢ３３プロモーターの誘導のために、形質転換イベント３８５ＪＨの単一の系統を、１００mM ショ糖を含む固形化されたMusharige Skoog 培地上で組織培養で２日間培養した。収穫後、タンパク質抽出物をこれらの植物の葉組織から、一般的方法項目１ａ）に記述された方法により生成した。変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるタンパク質の分離の後、各系統の４０μg のタンパク質抽出物を、実施例項目１０に記述した抗体を用いて、ウエスタンブロット分析により分析した。対照試料として、アラビドプシス植物およびジャガイモ野生型植物（cv Desiree）からのタンパク質抽出物もまた分析した。ＯＫ１タンパク質量の増大およびＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの検出可能な量を示した植物を温室で栽培した。これらの植物の 塊茎から分離されたデンプンは、対応するデンプンに共有結合で結合しているリン酸の増大した含量を示した。
ＯＫ１タンパク質の増大した活性を示す遺伝子組換えトウモロコシ植物の生成
ａ） プラスミドｐＵｂｉ−Ａ.ｔ.−ＯＫ１の作製
最初にプラスミドｐＩＲ９６を製造した。２つのオリゴヌクレオチド
Figure 2014221066
から成る合成ＤＮＡ片を、ＳｄａＩおよびＭｕｎＩで切断されたベクターｐＧＳＶ７１へクローニングすることにより、プラスミドｐＩＲ９６を得た。得られたプラスミドをＳｄａＩで切断し、突き出ている３’−端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化した。得られたプラスミドをＳｄａＩで切断し、突き出ている３’−端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化し、１９７塩基対の大きさの ｐＢｉｎＡＲから得たＨｉｎｄIII、／Ｓｐｈｌ断片（Ｈoefgen und Willmitzer, 1990, Plant Science 66, 221-230）（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化され、Agrobacterium tumefaciens からのオクトピン合成酵素遺伝子の終結シグナル終止コドンを含む）を挿入した。得られたプラスミドをｐＩＲ９６と名付けた。
ｐＧＳＶ７１は、中間ベクターｐＧＳＶｌに由来するプラスミドｐＧＳＶ７の誘導体である。ｐＧＳＶ１は、ｐＧＳＣ１７００の誘導体を構成し、そのコンストラクションについては Cornelissen and Vanderwiele (Nucleic Acid Research 17, (1989),19-25) により記述されている。ｐＧＳＶ１は、ｐＧＳＣ１７００からカルベニシリン抵抗性遺伝子の欠失およびプラスミドｐＴｉＢ６Ｓ３のＴＬ−ＤＮＡ領域のＴ−ＤＮＡ配列の欠失により得られた。
ｐＧＳＶ７は、プラスミドｐＢＲ３２２（Bolivar et al., Gene 2, (1977), 95-113）の複製起点、ならびにPseudomonas のプラスミドｐＶＳ１（Itoh et al., Plasmid 11, (1984), 206）の複製起点を含む。ｐＧＳＶ７はまた、Klebsiella pneumoniae 由来のトランスポゾンＴｎ１３３１から得られた選択可能なマーカー遺伝子ａａｄＡを含み、それが、抗生物質スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに対する抵抗性を与える（Tolmasky, Plasmid 24 (3), (1990),218-226; Tolmasky and Crosa, Plasmid 29(1),(1993), 31-40）。プラスミドｐＧＳＶ７１は、ｐＧＳＶ７の境界領域の間にキメラのｂａｒ遺伝子をクローニングすることにより得られた。キメラのＢａｒ遺伝子は、転写を開始するためのカリフラワーモザイクウィルスのプロモーター配列（Odell et al., Nature 313, (1985), 180）、Streptomyces hygroscopicus のＢａｒ遺伝子（Thompson et al., Embo J. 6, (1987), 2519-2523）、および転写終了およびポリアデニル化のためのｐＴｉＴ３７のＴ−ＤＮＡのノパリン合成遺伝子の３’−非翻訳領域を含む。Ｂａｒ遺伝子は、除草剤グルホシネートアンモニウムに対する耐性を与える。
トウモロコシ遺伝子（Gens aus Mais）からのポリユビキチン遺伝子のプロモーターを含む１９８６塩基対の長さの断片(EMBL Ace.: 94464, Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689）を、ＰｓｔＩ断片としてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋中へクローニングした。得られたプラスミドをｐＳＫ−ｕｂｑと名付けた。
プラスミドＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭを制限酵素Ｂｓｐ１２０Ｉで切断し、末端をＴ４−ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、ＳａｃＩでそれを再切断した。Arabidopsis thaliana 由来のＯＫ１タンパク質をコードするＤＮＡ断片を、ＳｍａＩおよびＳａｃＩにより切断したプラスミドｐＳＫ−ｕｂｑへクローニングした。得られたプラスミドをｐＳＫ−ｕｂｑ−ｏｋ１と名付けた。
プラスミドｐＳＫ−ｕｂｑ−ｏｋ１から、トウモロコシからのユビキチンプロモーター、および Arabidopsis thaliana からのＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質の全読取枠を含む断片を単離した。この目的のために、プラスミドを制限酵素Ａｓｐ７１８１で切断し、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで充填し、それをＳｄａＩで再切断した。得られた５７９９塩基対の大きさの断片を、ＥｃｏＲＶおよびＰｓｔＩによって切断されたプラスミドｐＩＲ９６中へクローニングした。このクローニングによって得られたプラスミドを、ｐＵｂｉ−Ａ.ｔ.−ＯＫ１と名付けた。
ｂ） トウモロコシ植物の形質転換
トウモロコシ植物を、一般的方法項目１７に記述された方法を用いて、プラスミドｐＵｂｉ−Ａ.ｔ.−ＯＫ１で形質転換した。
ｃ） 遺伝子組換えトウモロコシ植物およびこれから合成されたデンプンの分析
ノーザンブロット分析を用いて、Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を示す植物を同定することができた。
対応する野生型植物と比較して検知可能な量のＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするｍＲＮＡを示すトウモロコシ植物を、温室で生育した。これらの植物の単一の穀粒を収穫した。これらの穀粒から単離したデンプンは、対応する野生型植物の穀粒から単離したデンプンと比較して、それぞれのデンプンに共有結合で結合したリン酸含量の増加を示した。
ＯＫ１タンパク質の増大した活性を示す遺伝子組換えコムギ植物の生成
ａ） コムギ植物の形質転換用のプラスミドの作製
ｐＭＣＳ５（Mobitec, www.mobitec.de）をＢｇIIIおよびＢａｍＨＩで消化し、再挿入した。含まれるプラスミドをｐＭＬ４と名付けた。
Agrobacterium tumefaciens からのｎｏｓ終止コドン（Depicker et al.,1982, Journal of Molecular and Applied Genetics 1: 561-573）をプライマー
Figure 2014221066
によって増幅し（２５サイクル、３０秒９４℃、３０秒５８℃、３０秒７２℃）、ＨｉｎｄIIIおよびＰｓｔIで消化して、同じ酵素で切断されたプラスミドｐＭＬ４へクローニングした。含まれるプラスミドをｐＭＬ４−ｎｏｓと名付けた。トウモロコシからのポリユビキチン遺伝子（Genbank Ace: 94464, Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol.18: 675-689）のプロモーター、およびＣｌａＩによる消化および再挿入を通じて短縮された同じ遺伝子の第１イントロンを含む１９８６塩基対の長さの断片を、このベクターへクローニングした。含まれるプラスミドをｐＭＬ８と名付けた。
Arabidopsis thaliana からのＯＫ１の全読取枠を、プラスミドｐＭＬ８へクローニングした。このために、Ｂｓｐ１２０／ＮｏｔＩを有する対応する断片をＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭから切り出し、ｐＭＬ８のＮｏｔＩ部位へ“センス”配向で挿入した。
コムギ植物の形質転換のための断片（トウモロコシからのポリユビキチン遺伝子のプロモーター、Arabidopsis thalianaからのＯＫ１の全読取枠、およびAgrobacterium tumefaciensからのｎｏｓ終止コドンを含む）を、得られたベクターｐＭＬ８−Ａ.ｔ.−ＯＫ１から、制限酵素ＡｖｒIIおよびＳｗａＩによって切り出すことができる。
ｂ） コムギ植物の形質転換
Florida品種のコムギ植物を、制限酵素ＡｖｒIIおよびＳｗａＩでプラスミドｐＭＬ８−Ａ.ｔ.−ＯＫ１から切り出され、トウモロコシからのポリユビキチン遺伝子のプロモーター、Agrobacterium tumefaciens からのＯＫ１の全読取枠および Agrobacterium tumefaciensからのｎｏｓ終止コドンを含み、アガロースゲルによって精製された断片、ならびにプラスミドｐＧＳＶ７１によって、バイオリスティック法を用いBecker et al.(1994, Plant Journal 5, 299-307) により記述された方法に従って形質転換した。
ｃ） 遺伝子組換えコムギ植物およびこれから合成されたデンプンの分析
形質転換により得られたＴ０植物の成熟穀粒からデンプンを単離し、デンプンに共有結合で結合したリン酸含量を決定した。個々の穀粒から単離したデンプンのリン酸含量は、対応する野生型植物の穀粒から単離したデンプンの場合よりも、明らかに高かった。

Claims (34)

  1. 遺伝的に修飾されていない対応する野生型植物細胞と比較して、少なくとも１つのＯＫ１タンパク質の活性増大を示すことを特徴とする、遺伝的に修飾された植物細胞。
  2. 遺伝的修飾が少なくとも１つの外来性核酸分子の植物ゲノム中への導入から成る、請求項１記載の遺伝的に修飾された植物細胞。
  3. 外来性核酸分子がＯＫ１タンパク質をコードする、請求項２記載の遺伝的に修飾された植物細胞。
  4. 遺伝的に修飾されていない対応する野生型植物細胞と比較して、修飾されたデンプンを合成する、請求項１〜３のいずれか１項記載の植物細胞。
  5. 修飾デンプンが、増大したデンプンリン酸含量および／または修飾されたリン酸分布を有することを特徴とする、請求項４記載の遺伝的に修飾された植物細胞。
  6. 修飾デンプンが、Ｃ−３リン酸のＣ−６リン酸に対する修飾された比率を有することを特徴とする、請求項５記載の遺伝的に修飾された植物細胞。
  7. 請求項１〜６のいずれか１項記載の遺伝的に修飾された植物細胞を含む植物。
  8. デンプン貯蔵植物である、請求項７記載の植物。
  9. トウモロコシ植物またはコムギ植物である、請求項８記載の植物。
  10. 請求項１〜６のいずれか１項記載の植物細胞を含む、請求項７、８、または９のいずれか１項記載の植物から得られる繁殖材料。
  11. 請求項１〜６のいずれか１項記載の植物細胞を含む、請求項７、８、または９のいずれか１項記載の植物の収穫可能な植物部分。
  12. 遺伝的に修飾された植物の作製のための方法であって、
    ａ） 植物細胞を遺伝的に修飾して、遺伝的修飾により、遺伝的に修飾されていない対応する野生型植物細胞と比較してＯＫ１タンパク質の（酵素）活性の増大をもたらし；
    ｂ） 工程ａ）による植物細胞から植物を再生し；そして
    ｃ） 必要であれば、工程ｂ）による植物の助けを借りて追加の植物を生成する、
    方法。
  13. 請求項７、８、または９のいずれか１項記載の遺伝的に修飾された植物から、請求項１０記載の繁殖材料から、または請求項１１記載の収穫可能な植物部分から得ることができる修飾デンプン。
  14. 請求項１〜６のいずれか１項記載の植物細胞からデンプンを抽出する工程を含む、修飾デンプンの製造のための方法。
  15. 請求項７、８、または９のいずれか１項記載の植物からデンプンを抽出する工程を含む、修飾デンプンの作製のための方法。
  16. 請求項１１記載の収穫可能な植物部分からデンプンを抽出する工程を含む、修飾デンプンの作製のための方法。
  17. 請求項１３記載の、あるいは請求項１４、１５、または１６のいずれか１項記載の方法により得ることができる修飾されたデンプンが導出されている、誘導デンプンの製造のための方法。
  18. 請求項７、８、または９のいずれか１項記載の遺伝的に修飾された植物の、修飾デンプンの製造のための使用。
  19. 請求項１７記載の方法に基づいて入手可能な誘導デンプン。
  20. 請求項１３記載の修飾デンプンの、あるいは請求項１４、１５、または１６のいずれか１項記載の方法により得ることができる修飾デンプンの、誘導デンプン製造のための使用。
  21. 請求項１３記載の修飾デンプンを含む穀粉。
  22. 請求項１〜６記載の植物細胞から、請求項１０記載の繁殖材料から、または請求項１１記載の収穫可能な植物部分から得ることができる穀粉。
  23. 請求項７、８、または９記載の植物の部分、または請求項１０記載の繁殖材料の部分、または請求項１１記載の収穫可能な材料、を摩砕する工程を含む、穀粉の作製のための方法。
  24. 請求項１〜６のいずれか1項記載の遺伝的に修飾された植物細胞の、または請求項７、８、または９のいずれか１項記載の植物の、穀粉の作製のための使用。
  25. ＯＫ１タンパク質の酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸分子であって：
    ａ） 配列番号２または配列番号４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
    ｂ） 配列番号２または配列番号４に示されたアミノ酸配列と、少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
    ｃ） 配列番号１または配列番号３に示されたヌクレオチド配列を含む、あるいはこれらの配列と相補的な配列を含む核酸分子；
    ｄ） ａ）またはｃ）に記述された核酸配列と少なくとも６０％の同一性を有する核酸分子；
    ｅ） ストリンジェントな条件下で、ａ）またはｃ）に記述された核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリダイズする核酸分子；
    ｆ） 遺伝子コードの縮退により、ａ）またはｃ）に述べた核酸分子の配列と相違したヌクレオチド配列を有する核酸分子；および
    ｇ） ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、またはｆ）に列挙した核酸分子の断片、対立遺伝子変異体および／または誘導体に相当する核酸分子、
    からなる群より選ばれる核酸分子。
  26. ＯＫ１タンパク質がアラビドプシスからコードするかまたはＯＫ１タンパク質がイネからコードすることを特徴とする、請求項２５記載の核酸分子。
  27. 請求項２５または２６のいずれか１項記載の核酸分子を含む、組換え核酸分子。
  28. 請求項２５、２６、または２７のいずれか１項記載の核酸分子を含むベクター。
  29. 核酸分子が、原核生物または真核生物細胞中で転写を開始する調節配列と連結されている、請求項２８記載のベクター。
  30. 請求項２５または２６のいずれか１項記載の核酸分子により、請求項２７記載の組換え核酸分子により、または請求項２８または２９記載のベクターにより、遺伝的に修飾された宿主細胞。
  31. 請求項２５または２６のいずれか１項記載の核酸分子、請求項２７記載の組換え核酸分子、あるいは請求項２８または２９のいずれか１項記載のベクターを含む組成物。
  32. 遺伝的に修飾されていない野生型植物細胞と比較して増大したＯＫ１タンパク質の活性を有する植物細胞を同定するための、請求項３１記載の組成物の使用。
  33. デンプンリン酸化活性を示し、基質としてリン酸化デンプンを必要とするタンパク質。
  34. 基質としてリン酸化デンプンを必要とし、ＡＴＰのリン酸残基をリン酸化デンプンに転移するタンパク質。
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