CN1930296B - 具有增加的淀粉磷酸化酶活性的植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及经基因修饰的植物细胞和植物，其中与相应未经基因修饰的野生型植物细胞和野生型植物相比，该基因修饰导致淀粉磷酸化OK1蛋白质的活性增加。此外，本发明涉及用于制造此类植物细胞和植物的手段和方法。这些类型的植物细胞和植物合成改性淀粉。因此，本发明还涉及从本发明植物细胞和植物中所合成的淀粉、用于制造这些淀粉的方法以及对这些改性淀粉的衍生物的制造和含有本发明淀粉的粉末。另外，本发明还涉及编码淀粉磷酸化OK1蛋白质的核酸、含有此类核酸分子的载体、宿主细胞、植物细胞和植物。此外，本发明还涉及具有淀粉磷酸化活性的OK1蛋白质。

Description

具有增加的淀粉磷酸化酶活性的植物
描述
本发明涉及经基因修饰的植物细胞和植物，其中与相应未经基因修饰的野生型植物细胞和野生型植物相比，该基因修饰引起淀粉磷酸化OK1蛋白质的活性增加。本发明还涉及用于制造此类植物细胞和植物的手段及方法。这些类型的植物细胞和植物合成改性淀粉。因此，本发明还涉及本发明植物细胞和植物中所合成的淀粉、用于制造该淀粉的方法以及对该改性淀粉的衍生物以及含有本发明淀粉的粉末的制造。
另外，本发明还涉及编码淀粉磷酸化OK1蛋白质的核酸、含有此类核酸分子的载体、宿主细胞、植物细胞和植物。此外，本发明还涉及表现淀粉磷酸化活性的OK1蛋白质。
鉴于目前植物成分作为可更新原料来源的日益增长重要性，生物技术研究的任务之一是努力调整这些植物原料，使之适应加工工业需要。此外，为了在尽可能多的应用领域内使用再生性原料，需要获得多样的材料。
多糖淀粉由化学均一的基础组件-葡萄糖分子构成，但是多糖淀粉组成不同分子形式的复杂混合物，其在聚合程度和分支程度上显示出差异，并因此其物理化学特性显著不同。直链淀粉和支链淀粉间的区别在于前者是通过α-1，4-糖苷键连接的葡萄糖单元构成的基本不分支的聚合物，后者是因额外的α-1，6-糖苷键的存在而发生分支的分支聚合物。直链淀粉和支链淀粉间的另一个基本差异在于分子量。直链淀粉根据淀粉的来源具有5×105-106Da的分子量，而支链淀粉的分子量在107和108Da之间。这两种巨分子可通过分子量和不同的物理化学特性区分，它们不同的物理化学特性可因不同的碘结合特性最易观察到。
迄今一直视直链淀粉为由α-1，4-糖苷键连接的α-D-葡萄糖单体组成的线形聚合物。然而近来研究已证实存在α-1，6-糖苷分支点(大约0.1％)(Hizukuri和Takagi，Carbohydr.Res.134，(1984)，1-10；Takeda等，Carbohydr.Res.132，(1984)，83-92)。
淀粉的功能性特性例如溶解度、老化行为、水结合能力、成膜特性、粘度、凝胶化作用特性、冻融稳定性、酸稳定性、凝胶强度和淀粉粒的大小受其中的直链淀粉/支链淀粉比率、分子量、侧链分布的样式、离子浓度、脂和蛋白质含量、淀粉的平均粒度、淀粉的粒形态等影响。淀粉的功能性特性还受淀粉中非碳成分-磷酸含量的影响。这里，对以单酯形式与淀粉中葡萄糖分子结合的磷酸(以下称作淀粉磷酸)和以磷脂形式与淀粉结合的磷酸进行区分。
淀粉磷酸含量随植物的类型变动。因此，例如某些玉米突变体合成具有增加的淀粉磷酸含量的淀粉(蜡质种玉米0.002％和高直链淀粉玉米0.013％)，而常规类型的玉米仅具有微量淀粉磷酸。类似地，在小麦中仅找到少量淀粉磷酸(0.001％)，而在燕麦和高梁中未发现淀粉磷酸存在的证据。在稻突变体(糯米0.003％)和常规类型稻(0.013％)中也发现有少量淀粉磷酸。在合成块茎贮藏淀粉或根贮藏淀粉的植物中还证实存在明显量的淀粉磷酸，如木薯(0.008％)、甜马铃薯(0.011％)、竹芋(0.021％)或马铃薯(0.089％)。在每一例子中，以上所引用的淀粉磷酸含量百分比数值指淀粉干重，并且由Jane等测定(1996，Cereal Foods World 41(11)，827-832)。
淀粉磷酸可以以单酯形式存在于聚合葡萄糖单体的C-2、C-3或C-6位(Takeda和Hizukuri，1971，Starch/St
Figure 058070802_0
rke 23，267-272)。植物所合成的淀粉中磷酸分布特征一般是，葡萄糖分子C-3位的大致30％至40％残基磷酸以及C-6位的大致60％至70％残基磷酸呈共价结合(Blennow等，2000，Int.J.of Biological Macromolecule 27，211-218)。Blennow等(2000，Carbohydrate Polymers 41，163-174)已测定了不同淀粉中葡萄糖分子C-6位内所结合的淀粉磷酸含量，例如马铃薯淀粉(取决于品种每mg淀粉在7.8至33.5nM之间)、来自不同姜黄属(Curcuma)物种的淀粉(每mg淀粉在1.8至63 nM之间)、木薯淀粉(每mg淀粉2.5nM)、稻淀粉(每mg淀粉1.0nM)、绿豆淀粉(每mg淀粉3.5nM)和高梁淀粉(每mg淀粉0.9nM)。这些作者证明，在大麦淀粉和来自玉米不同蜡质突变体的淀粉中的C-6位不存在任何的结合的淀粉磷酸。迄今，仍不可能确立植物基因型和淀粉磷酸含量间的联系(Jane等，1996，Cereal Foods World 41(11)，827-832)。因此目前不可能通过育种方法影响植物中淀粉磷酸的含量。
以前仅描述了一种促进向淀粉的葡萄糖分子中导入磷酸残基共价键的蛋白质，这种蛋白质具有α-葡聚糖-水双激酶的酶活性(GWD，E.C.：2.7.9.4)(Ritte等，2002，PNAS 99，7166-7171)，在文献中常称作R1，并且与马铃薯块茎内的贮藏淀粉的淀粉粒结合(Lorberth等，1998，NatureBiotechnology 16，473-477)。在R1所催化的反应中，将离析物α-1，4-葡聚糖(淀粉)、三磷酸腺苷(ATP)和水转换为产物葡聚糖-磷酸(淀粉磷酸)、单磷酸和单磷酸腺苷。在转换时，ATP的残余γ磷酸转移至水，并且ATP的残余β磷酸转移至葡聚糖(淀粉)。在体外(in vitro)R1将ATP的残余β磷酸转移至α-1，4-葡聚糖C-6位和C-3位。在此体外反应中所得到的C-6磷酸与C-3磷酸的比率与从植物内所分离的淀粉中存在的该比率相同(Ritte等，2002，PNAS 99，7166-7171)。由于马铃薯淀粉中存在的淀粉磷酸的大约70％结合至淀粉的葡萄糖单体C-6位，并且大约30％结合至C-3位，这意味着R1优先磷酸化葡萄糖分子C-6位。此外，已经证实，通过利用来自玉米的支链淀粉，R1可磷酸化本不含共价结合磷酸的α-1，4-葡聚糖(Ritte等，2002，PNAS 99，7166-7171)，即R1能够向α-1，4-葡聚糖内从头(de novo)导入磷酸。
描述了来自不同种例如马铃薯(WO97 11188，GenBank登录号：AY027522、Y09533)、小麦(WO 00 77229，US 6,462,256，GenBank登录号：AAN93923，GenBank登录号：AR236165)、稻(GenBank登录号：AAR61445，GenBank登录号：AR400814)、玉米(GenBank登录号：AAR61444，GenBank登录号：AR400813)、大豆(GenBank登录号：AAR61446，GenBank登录号：AR400815)、柑橘(GenBank登录号：AY094062)和拟南芥菜(Arabidopsis)(GenBank登录号：AF312027)的编码R1蛋白质的核酸序列及其相应的氨基酸序列。
在WO 02 34923中描述了因马铃薯R1基因过表达而表现增加的R1蛋白质活性的小麦植物。与不能检测到淀粉磷酸的相应野生植物相比，这些植物合成了葡萄糖分子C-6位内具有明显量淀粉磷酸的淀粉。
以往未曾描述另一些催化共价结合的磷酸基团导入淀粉内反应的蛋白质。也不知道优先向淀粉中的葡萄糖分子C-3位和/或C-2位导入磷酸基团的酶。除了增加植物中的淀粉磷酸含量以外，仍没有特异性地影响植物中淀粉磷酸化、改良植物所合成的淀粉中磷酸分布和/或进一步增加淀粉磷酸含量的可用方法。
因此，本发明目标基于提供具有增加的磷酸含量和/或改良的磷酸分布的改性淀粉及合成此改良淀粉的植物细胞和/或植物，以及用于产生所述植物和/或植物细胞的手段和方法。
通过权利要求中所述的实施方案解决了这个问题。
因此，本发明涉及基因修饰的植物细胞和基因修饰的植物，其特征在于与未经基因修饰的相应野生植物细胞或野生型植物相比，该植物细胞或植物具有增加的至少一种OK1蛋白质活性。
本发明第一个方面涉及经基因修饰的植物细胞或植物，其中与未经基因修饰的相应野生植物细胞或野生型植物相比，该基因修饰引起至少一种OK1蛋白质活性增加。
与此同时，与未经基因修饰的相应野生植物细胞或野生型植物相比，该基因修饰可以是引起至少一种OK1蛋白质活性增加的任意基因修饰。
与本发明相关的术语“野生型植物细胞”意思是指用所提及的植物细胞作为制造本发明植物细胞的起始材料，即除了所导入的基因修饰外，它们的遗传信息与本发明植物细胞的遗传信息一致。
与本发明相关的术语“野生型植物”意思是指用所提及的植物作为制造本发明植物的起始材料，即除了所导入的基因修饰外，它们的遗传信息与本发明植物的遗传信息一致。
与本发明相关的术语“相应的”意思是指在比较数个对象时，将所提到的与另一个对象相比的对象置于相同条件下。与本发明相关的、与野生型植物细胞或野生型植物联系的术语“相应的”意思是指在相同培养条件下培育相互进行比较的植物细胞或植物，并且它们具有相同(培育)年龄。
在本发明的范围内术语“增加的至少一种OK1蛋白质活性”意思是指编码OK1蛋白质的内源性基因的表达增加和/或细胞中OK1蛋白质的量增加和/或细胞中OK1蛋白质的酶活性增加。
可通过测量编码OK1蛋白质的转录物的量，例如通过RNA印迹分析或RT-PCR测定表达的增加。“增加”优选地意思是指与未经基因修饰的相应细胞相比，转录物的量增加至少50％、优选地至少70％、更优选地至少85％并且最优选地至少100％。编码OK1蛋白质的转录物的量的增加也意思是指，未表现出可检测量的编码OK1蛋白质的转录物的任何植物或植物细胞在经过本发明基因修饰后表现出可检测量的编码OK1蛋白质的转录物。
例如可通过免疫学方法如蛋白质印迹分析、ELISA(酶联免疫吸附测定法)或RIA(放射免疫测定法)测定OK1蛋白质量的增加，这导致所提及植物中该蛋白质增加的活性。在这里，“增加”优选地意思是指与未经基因修饰的相应细胞相比，OK1蛋白质的量增加至少50％、特别地至少70％、优选地至少85％并且特别优选地至少100％。OK1蛋白质量的增加也意思是指不具有任何可检测的OK1蛋白质活性的植物或植物细胞在经本发明基因修饰后，表现出可检测量的OK1蛋白质。
用于制造与某蛋白质特异性反应，即与所述蛋白质特异性结合的抗体的方法为本领域技术人员所知(参见例如Lottspeich和Zorbas(编者)，1998，Bioanalytik，Spektrum akad，Verlag，Heidelberg，Berlin，ISBN3-8274-0041-4)。数家公司(例如比利时的Eurogentec)依合同制造此类抗体。制造与OK1蛋白质特异性反应的抗体的可能方法如下所述(见实施例10)。
在本发明的范围内，将术语“OK1蛋白质”理解为意思是指向已磷酸化的淀粉(P-淀粉)转移ATP磷酸残基的蛋白质。从拟南芥菜(Arabisopsisthaliana)sex1-3突变体的叶中所分离的淀粉没有可检测量的共价结合的磷酸残基并且不受OK1蛋白质磷酸化，即本发明的OK1蛋白质需要已磷酸化的淀粉作为进一步转移磷酸残基的底物。
优选地，ATP的残基β磷酸从OK1蛋白质转移至淀粉，并且ATP的残基γ磷酸转移至水。通过使用OK1蛋白质所进行的P-淀粉磷酸化反应而产生的另一反应产物是AMP(腺苷单磷酸)。因此将OK1蛋白质称作[磷酸化-α-葡聚糖]-水-双激酶([P-葡聚糖]-水-双激酶)或称作[磷酸化-淀粉]-水-双激酶。
优选地，在OK1蛋白质所磷酸化的P-淀粉中的葡萄糖分子C-6位和/或C-3位内产生了额外的磷酸单酯键。在OK1蛋白质所催化的P-淀粉的磷酸化作用中，与所述P-淀粉中的葡萄糖分子C-6位内的磷酸单酯键相比，在C-3位内产生更多的额外磷酸单酯键为特别优选的。
编码OK1蛋白质的氨基酸序列含有磷酸组氨酸结构域。例如Tien-Shin Yu等(2001，Plant cell 13，1907-1918)描述了磷酸组氨酸结构域。编码OK1蛋白质磷酸组氨酸结构域的氨基酸中优选地含有两个组氨酸。
在OK1蛋白所催化的P-淀粉的磷酸化反应中，产生了作为中间产物的磷酸化OK1蛋白质，其中ATP的磷酸残基与OK1蛋白质的氨基酸共价结合。此中间产物通过OK1蛋白质的自身磷酸化作用产生，即OK1蛋白质自身催化了导致该中间产物的反应。优选地，编码OK1蛋白质的氨基酸序列中的组氨酸残基作为自身磷酸化过程的结果被磷酸化，尤其优选地是作为磷酸组氨酸结构域一部分的组氨酸残基被磷酸化。
此外，与非磷酸化淀粉相比，本发明的OK1蛋白质具有增加的结合P-淀粉的活性。
由于以前未描述过需要P-淀粉作为底物以进一步使之磷酸化的酶，因此以前也不可能将植物的已磷酸化淀粉中的淀粉磷酸含量提高至高于一定量。现在其随着本发明蛋白质或本发明核酸分子在植物基因修饰中的应用而成为可能。OK1蛋白质功能的阐明及因此对OK1蛋白质的提供导致现在可以以使得植物合成具有改良特性淀粉的方式来对植物进行基因修饰。因为缺乏可利用的方法，故以前不可能改变植物所合成淀粉的磷酸分布。由于本发明提供了根据本发明的蛋白质和核酸，故现在有可能改变天然淀粉中的磷酸比率。
将与本发明相关的术语“增加的结合活性”理解为意思是指，蛋白质对第一种底物的亲和性与第二种底物相比增加。这就是说，在相同温育条件下以与结合第二种底物相比更大程度结合第一种底物的蛋白质的量表现出对第一种底物具有增加的结合活性。
将与本发明相关的术语“淀粉磷酸”理解为意思是指与淀粉中的葡萄糖分子共价结合的磷酸基。
将与本发明相关的术语“非磷酸化淀粉”理解为意思是指不含可检测量淀粉磷酸的淀粉。描述了测定淀粉磷酸数量的不同方法。优选地，可使用由Ritte等(2000，Starch/Strke 52，179-185)所描述的测定淀粉磷酸数量的方法。特别优选地，根据Kasemusuwan和Jane(1996，Cereal Chemistry73，702-707)所述方法，通过31P-NMR测定淀粉磷酸数量。
将与本发明相关的术语“磷酸化淀粉”或“P-淀粉”理解为意思是指含有淀粉磷酸的淀粉。
例如可使用β位内含有标记磷酸残基的ATP(标记的ATP)通过体外温育OK1蛋白质证实OK1蛋白质活性。优选地使用β位磷酸残基经特异性标记的ATP，即仅β位的磷酸残基具有标记。优选地使用放射性标记的ATP，特别优选地是β位磷酸残基经特异性放射性标记的ATP，并且尤其优选地是β位磷酸残基用33P特异性标记的ATP。若将OK1蛋白质与标记的ATP及未磷酸化淀粉温育，则没有磷酸被OK1转移至淀粉上。优选地使用拟南芥菜sex1-3突变体(Tien-Shin Yu等，2001，Plant cells 13，1907-1918)的叶淀粉。
而另一方面，若在标记的ATP存在时将OK1蛋白质与P-淀粉温育，则随后显示标记磷酸共价结合至P-淀粉上。优选地，来自拟南芥菜叶的淀粉、特别优选来自拟南芥菜sex1-3突变体的淀粉被经R1蛋白质(Ritte等，2002，PNAS 99，7166-7171)酶促磷酸化。
例如可通过从剩余反应混合物中分离(例如通过乙醇沉淀、过滤、层析方法等)标记的P-淀粉并且随后检测P-淀粉级分中的标记磷酸残基证实，标记磷酸残基已经通过OK1蛋白质掺入到P-淀粉中。与此同时，可通过测量P-淀粉级分中存在的放射性数量(例如通过闪烁计数器)证明所标记磷酸残基限制在P-淀粉级分中。在如下一般方法第11项和实施例6中描述了用于证实需要P-淀粉作为磷酸化反应底物的蛋白质的可能方法。
如Ritte等(2002，PNAS 99，7166-7171)所述，可通过分析由蛋白质所磷酸化的P-淀粉，来确定OK1蛋白质优选磷酸化P-淀粉中葡萄糖单体的哪个碳原子位置(C-2、C-3或C-6)。为此目的，用酸水解由蛋白质所磷酸化的P-淀粉，随后通过磷酸化阴离子交换层析法分析。
优选地，通过NMR分析由OK1蛋白质所磷酸化的P-淀粉，以便证实P-淀粉中葡萄糖单体的哪个碳原子位置(C-2、C-3或C-6)被磷酸化。在如下一般方法第13项中描述了用于鉴定淀粉葡萄糖单体中由OK1蛋白质所催化磷酸化的C-原子位置的特别优选的方法。
如Ritte等(2002，PNAS 99，7166-7171)对R1蛋白质所述，可证实在OK1蛋白质所促进的P-淀粉的磷酸化作用中产生的作为中间产物的磷酸化蛋白质。
为证实存在自身磷酸化的中间产物，首先在无淀粉条件下将OK1蛋白质与标记的ATP、优选地与β磷酸位内特异性标记的ATP、特别优选地与β磷酸位内用33P特异性标记的ATP温育。与此平行，在完全相同条件下温育反应制备物2，其含有相应量的作为替代标记ATP的非标记ATP。随后，向反应混合物1中添加过量的非标记ATP，并且向反应混合物2中添加非标记ATP和标记ATP的混合物(与先前反应混合物1中所用量相同的标记ATP，和与向反应混合物1中所添加量相同的的过量非标记ATP)，并进一步温育，随后向反应混合物1的A部分(1A部分)和反应混合物2的A部分(2A部分)中添加P-淀粉。通过蛋白质变性终止剩余的1B部分和2B部分中的反应。可通过本领域技术人员所知的导致蛋白质变性的方法、优选地通过添加十二烷基硫酸钠(SDS)终止反应混合物的B部分。将反应混合物的1A部分和2A部分的反应至少再温育10分钟，然后同样终止。从反应混合物的残留物里分离存在于各自反应混合物的A部分和B部分中的淀粉。如果通过例如离心分离各自的淀粉，则离心结束时，在沉淀物中可见各反应混合物A部分或B部分的淀粉，并且各反应混合物中的蛋白质存在于各自的离心上清液中。随后可通过例如变性丙烯酰胺凝胶电泳然后对所得到的丙烯酰胺凝胶进行放射自显影来分析反应混合物各自的1A部分或2A部分以及各自的1B部分或2B部分的上清液。为了对已经通过丙烯酰胺凝胶电泳分离的放射性标记蛋白质的数量进行定量，例如可使用本领域技术人员所知的所谓“磷成像法”。如果与反应混合物1的A部分离心上清相比，反应混合物1的B部分离心上清中的蛋白质的放射自显影或通过”磷成像仪”分析显示信号显著增加，则表示促进淀粉磷酸化作用的蛋白质作为自身磷酸化中间产物存在。反应混合物2的A部分和B部分充当对照，并且因而在离心上清液的放射自显影或”磷成像仪”分析中不表现出信号显著增加。
此外，如果需要，在随后洗涤各自的淀粉之后，研究各自反应混合物1和2的各自A部分沉淀中剩余淀粉中淀粉磷酸的存在，淀粉磷酸是对应于所用标记ATP的标志。如果反应混合物1的A部分的淀粉含有标记磷酸残基，并且如果反应混合物1的B部分离心上清液的放射自显影与反应混合物1的A部分离心上清液相比信号显著增加，则表示促进淀粉磷酸化的蛋白质作为自身磷酸化中间产物存在。反应混合物2的A部分和B部分充当对照，并且因而在含有α-1，4-葡聚糖的沉淀物中33P标记α-1，4-葡聚糖信号没有显著增加。在以下一般方法第12项和实施例7中描述了用于证实磷酸化OK1蛋白质中间产物的可能方法。
可通过将OK1蛋白质与各个制备物中P-淀粉和非磷酸化淀粉温育来证实OK1蛋白质结合P-淀粉的活性与非磷酸化淀粉相比增加。
所有的非磷酸化淀粉基本适合于OK1蛋白质和非磷酸化淀粉的温育。优选地使用非磷酸化的植物淀粉，特别优选地是小麦淀粉，并且尤其优选地是拟南芥菜突变体sex1-3的粒状叶淀粉。
例如用于从植物中分离淀粉的方法为本领域技术人员所知。本领域技术人员所知的所有方法基本适用于从适宜植物物种中分离非磷酸化淀粉。优选地使用如下所述的用于分离非磷酸化α-1，4-葡聚糖的方法(参见一般方法第2项)。
含有淀粉磷酸的全部淀粉基本适用于OK1蛋白质和P-淀粉的温育。为此目的，还可使用化学性磷酸化的淀粉。优选地，P-淀粉用于与OK1蛋白质温育，特别优选地是回溯性(retrospective)酶促磷酸化的植物淀粉，尤其优选地是自拟南芥菜sex-1突变体中分离的回溯性酶促磷酸化的植物粒状淀粉。
为证实与非磷酸化淀粉相比，OK1蛋白质对P-淀粉具有增加的结合活性，在各制备物中将OK1蛋白质与P-淀粉(制备物A)和非磷酸化淀粉(制备物B)温育。在成功温育后，将与制备物A和制备物B中的相关淀粉结合的蛋白质从与这些蛋白质所结合的淀粉和蛋白质中分离出来。随后打断制备物A中蛋白质和P-淀粉的结合以及制备物B中蛋白质和非磷酸化淀粉的结合，即将各自的蛋白质溶解。然后可将制备物A和制备物B中的溶解蛋白质与在各自制备物中存在的淀粉分离。此后，借助本领域技术人员所知的方法例如凝胶过滤、层析方法、电泳、SDS丙烯酰胺凝胶电泳等将已分离的制备物A中结合P-淀粉的蛋白质和已分离的制备物B中结合非磷酸化淀粉的蛋白质分开。通过比较制备物A的分离蛋白质的量和制备物B的相应分离蛋白质的量，可以确定蛋白质对P-淀粉的结合活性是非磷酸化淀粉相比否与增加。可用于证实与非磷酸化淀粉相比，蛋白质对P-淀粉优选结合的方法描述如下(一般方法第8项和实施例1)。
SEQ ID NO 2中所示氨基酸序列编码来自拟南芥菜的OK1蛋白质并且SEQ ID NO 4中所示氨基酸序列编码来自稻(Oryza sativa)的OK1蛋白质。
在本发明的又一实施方案中，编码OK1蛋白质的氨基酸序列与SEQID NO 2或SEQ ID NO 4所指定序列具有至少60％、特别地至少70％、优选地至少80％及特别优选地至少90％以及尤其优选地至少95％的同一性。
在本发明的又一实施方案中，OK1蛋白质具有磷酸组氨酸结构域(Tien-Shin Yu等，2001，Plant Cell 13，1907-1918)。编码OK1蛋白质的氨基酸序列含有磷酸组氨酸结构域，其显示出与SEQ ID NO 5中所指定的来自拟南芥菜和稻OK1蛋白质的磷酸组氨酸结构域的氨基酸序列具有至少50％、特别地至少60％、优选地至少70％、特别优选地至少80％并且更加特别优选地至少90％的同一性。该磷酸组氨酸结构域优选地含有两个组氨酸残基。
本发明的又一实施方案涉及经基因修饰的本发明植物细胞或经基因修饰的本发明植物，其中该基因修饰是向植物基因组中导入至少一种外来核酸分子。
在本文中，术语“基因修饰”意思是指向植物细胞基因组或植物基因组内导入同源的和/或异源的外来核酸分子，其中所述的这些分子的导入引起OK1蛋白质活性的增加。
就遗传信息而言，通过导入外来核酸分子修饰了本发明植物细胞或本发明植物。外来核酸分子的存在或表达引起表型改变。在这里，“表型”改变优选地意思是指细胞中一种或多种功能的可测量的改变。例如因所导入核酸分子的表达，本发明基因修饰的植物细胞和本发明基因修饰的植物表现出OK1蛋白质活性增加。
将与本发明相关的术语“外来核酸分子”理解为意思是指这样的分子，其在相应野生植物细胞中天然不存在，或者其在野生型植物细胞中不以实际空间排列存在，或者其位于该植物细胞基因组中这样的位置中，即在天然情况下野生型植物细胞基因组的该位置不存在此分子。优选地，该外来核酸分子是由不同元件、植物细胞中非天然存在的组合或特定空间排列所组成的重组分子。
原则上，外来核酸分子可以是引起植物细胞或植物中OK1蛋白质活性增加的任意核酸分子。
将与本发明相关的术语“基因组”理解为意思是指在植物细胞中存在的全部遗传物质。本领域技术人员知道，除细胞核以外，其它区室(例如质体、线粒体)也含有遗传物质。
在又一个实施方案中，本发明植物细胞和本发明植物的特征在于外来核酸分子编码OK1蛋白质，优选地是来自拟南芥菜的OK1蛋白质或来自稻的OK1蛋白质。
在又一个实施方案中，外来核酸分子编码具有SEQ ID NO 2或SEQID NO 4中所指定氨基酸序列的OK1蛋白质。
可使用多种技术向植物宿主细胞中导入DNA。这些技术包括使用根癌农杆菌(Agrobacteurium tumefacien)或发根农杆菌(Agrobacteuriumrhizogenes)作为转化介质的T-DNA向植物细胞的转化、原生体融合、注射、DNA的电穿孔、通过生物射弹方法导入DNA及其它可能方法。农杆菌介导性植物细胞转化的用途已充分研究并且充分描述于EP 120516；Hoekema，在The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij KantersB.V.，Alblasserdam(1985)第五章；Fraley等，Crit.Rev.Plant Sci.4，1-46以及An等，EMBO J.4，(1985)，277-287。对于马铃薯转化，例如参见Rocha-Sosa等，EMBO J.8，(1989)，29-33。
也已描述通过基于农杆菌属转化载体对单子叶植物的转化(Chan等，Plant Mol.Biol.22，(1993)，491-506；Hiei等，Plant J.6，(1994)271-282；Deng等，Science in China 33，(1990)，28-34；Wilmink等，Plant CellReports 11，(1992)，76-80；May等，Bio/Technology 13，(1995)，486-492；Conner和Domisse，Int.J.Plant Sci.153(1992)，550-555；Ritchie等，Transgenic Res.2，(1993)，252-265)。转化单子叶植物的备选系统是通过生物射弹方法转化(Wan和Lemaux，Plant Physiol.104，(1994)，37-48；Vasil等，Bio/Technology 11(1993)，1553-1558；Ritala等，Plant Mol.Biol.24，(1994)，317-325；Spencer等，Theor.Appl.Genet.79，(1990)，625-631)、原生体转化、部分通透性细胞的电穿孔以及通过玻璃纤维对DNA的导入。具体而言，对玉米的转化已在文献(参考例如WO95/06128、EP0513849、EP0465875、EP0292435；Fromm等，Bio Technology 8，(1990)，833-844；Gordon-Kamm等，Plant Cell 2，(1990)，603-618；Koziel等，Biotechnology11(1993)，194-200；Moroc等，Theor.Appl.Genet.80，(1990)，721-726)中多次描述。
对其它类型谷类的成功转化也已经描述，例如对大麦的转化(Wan和Lemaux，见上；Ritala等，见上；Krens等，Nature 296，(1982)，72-74)以及对小麦的转化(Nehra等，Plant J.5，(1994)，285-297；Becker等，1994，Plant Journal 5，299-307)。在本发明的范围内以上的全部方法均适合。
其中，已经通过导入OK1蛋白质进行基因修饰的植物细胞和植物可以分别与野生型植物细胞和野生型植物区分，这是因为基因修饰的植物细胞和植物含有在野生型植物细胞或野生型植物中天然不存在的外来核酸分子，或者是因为此种分子在本发明植物细胞基因组中或本发明植物基因组中的这样一种位置内整合存在，即在野生型植物细胞基因组或野生型植物基因组的该位置不存在此种分子，即此种分子处于不同基因组环境中。此外，此类型的本发明植物细胞和本发明植物分别与野生型植物细胞和野生型植物不同，这是因为本发明植物细胞和本发明植物除了可能含有野生型植物细胞或野生型植物中天然存在的此类外来核酸分子的拷贝以外，还含有稳定整合入其基因组的至少一个拷贝的外来核酸分子。如果向本发明植物细胞或本发明植物中所导入的外来核酸分子是已在野生型植物细胞或野生型植物中天然存在的分子的额外拷贝，则本发明植物细胞和本发明植物分别可与野生型植物细胞或野生型植物区别，这特别是因为该额外拷贝或这些额外拷贝位于基因组中的这种的位置，即在野生型植物细胞或野生型植物的基因组内的该位置不存在该额外拷贝(或这些拷贝)。这可借助例如DNA印迹分析验证。
另外，本发明植物细胞和本发明植物可优选地通过至少如下特性之一分别与野生型植物细胞或野生型植物相区分：如果所导入的外来核酸分子相对于植物细胞或植物而言为异源的，则本发明植物细胞或本发明植物具有所导入外来核酸分子的转录物。这些转录物例如可通过RNA印迹分析或通过RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)验证。例如，可借助于与编码蛋白质的RNA(天然存在于植物细胞内)互补的特异核酸探针证实表达反义和/或RNAi转录物的本发明植物细胞和本发明植物。优选地，本发明植物细胞和本发明植物含有由所导入的核酸分子编码的蛋白质。此蛋白质可通过例如免疫学方法、特别是通过蛋白质印迹分析证实。
如果所导入的外来核酸分子相对于植物细胞或植物而言为同源的，因所导入的外来核酸分子的额外表达，本发明植物细胞或本发明植物可分别与野生型植物细胞或野生型植物区分。例如，本发明植物细胞和本发明植物优选地含有该外来核酸分子的转录物。这可通过例如RNA印迹分析或借助于所谓的定量PCR证实。
在又一个实施方案中，本发明植物细胞和本发明植物分别是转基因的植物细胞或转基因的植物。
在又一个实施方案中，本发明涉及本发明植物细胞和本发明植物，其中外来核酸分子选自：
a)编码蛋白质的核酸分子，其中该蛋白质具有SEQ ID NO 2或SEQID NO 4中所给出的氨基酸序列；
b)编码蛋白质的核酸分子，其中该蛋白质包含质粒A.t.-OK1-pGEM中插入片段或质粒pMI50中插入片段所编码的氨基酸序列；
c)编码蛋白质的核酸分子，其中该蛋白质的序列与SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4中所给出的氨基酸序列具有至少60％的同一性；
d)编码蛋白质的核酸分子，其中该蛋白质的序列与质粒A.t.-OK1-pGEM中插入片段或质粒pMI50中插入片段所编码的氨基酸序列具有至少60％的同一性；
e)核酸分子，其包含SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3中所示的核苷酸序列或互补序列；
f)核酸分子，其包含质粒A.t.-OK1-pGEM或质粒pMI50中所含插入片段的核苷酸序列；
g)核酸分子，其与a)、b)、e)或f)中所述的核酸序列具有至少60％的同一性；
h)核酸分子，其在严格条件下与a)、b)、e)或f)中所述核酸分子中的至少一条链杂交；
i)核酸分子，其核苷酸序列因遗传密码子简并性而由a)、b)、e)或f)中所鉴定核酸分子序列衍生；以及
j)核酸分子，其代表a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)或i)中所鉴定的核酸分子的片段、等位变异体和/或衍生物。
SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列编码来自拟南芥菜的OK1蛋白质，并且SEQ ID NO 4中所示的氨基酸序列编码来自稻的OK1蛋白质。
由本发明核酸分子的不同变种所编码的蛋白质具有某些共同特性。这些共同特性可包括例如生物活性、分子量、免疫学反应性、构象等，以及物理特性如凝胶电泳中的迁移行为、层析行为、沉降系数、溶解度、光谱特性、稳定性；最适pH、最适温度等。
从SEQ ID NO 2中所示氨基酸序列衍生的来自拟南芥菜的OK1蛋白质的分子量是大约131 kDa，并且从SEQ ID NO4中所示氨基酸序列衍生的来自稻的OK1蛋白质的分子量是大约132kDa。因此本发明蛋白质的衍生分子量优选地位于120kDa至145kDa范围、优选地120kDa至140kDa范围、特别优选地125kDa至140kDa并且尤其优选地130kDa至135kDa。
SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4中所示的、分别编码来自拟南芥菜和稻的OK1蛋白质的氨基酸序列的每一个包含一个磷酸组氨酸结构域。因此优选地，本发明的OK1蛋白质包含与SEQ ID NO 5中所示磷酸组氨酸结构域具有至少50％、优选地至少60％、特别优选地至少80％和尤其优选地90％同一性的磷酸组氨酸结构域。
本发明涉及核酸分子，该核酸分子编码具有本发明OK1蛋白质的酶活性的蛋白质，其中所编码的OK1蛋白质与SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4中所指定氨基酸序列具有至少70％、优选地至少80％、特别优选地至少90％以及尤其优选地95％的同一性。
按照布达佩斯条约，将包含编码来自拟南芥菜的本发明蛋白质(A.t.-OK1)的cDNA的质粒(A.t.-OK1-pGEM)和包含编码来自稻的另一本发明蛋白质(O.s.-OK1)的cDNA的质粒(pM150)分别于2004年3月8日和2004年3月24日保藏于德国微生物保藏中心(German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures GmbH，Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，德国)，保藏号分别为DSM16264和DSM16302。
SEQ ID NO 2中所示氨基酸序列可从质粒A.t.-OK1-pGEM中所整合的cDNA序列的编码区得到并且编码来自拟南芥菜的OK1蛋白质。SEQ IDNO 4中所示的氨基酸序列可从质粒pMI50中所整合cDNA序列的编码区得到并且编码来自稻的OK1蛋白质。因此本发明还涉及核酸分子，该核酸分子编码包含由质粒A.t.-OK1-pGEM中插入片段或质粒pMI50中插入片段所编码氨基酸序列的、具有OK1蛋白质的酶活性的蛋白质，其中所编码的蛋白质与从A.t.-OK1-pGEM或pMI50中插入片段得到的氨基酸序列具有至少70％、优选地至少80％、特别优选地至少90％以及尤其优选地95％的同一性。
SEQ ID NO 1中所示的核酸序列是包含来自拟南芥菜的OK1蛋白质的编码区的cDNA序列，并且SEQ ID NO 3中所示的核酸序列是包含来自稻的OK1蛋白质的编码区的cDNA序列。
因此，本发明还涉及编码OK1蛋白质的核酸分子和SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3中所示核苷酸序列中的编码区序列或与之互补的序列，包含质粒A.t.-OK1-pGEM或质粒pMI50中所含插入片段的核苷酸序列中编码区的核酸分子；以及与所述核酸分子具有至少70％、优选地至少80％、特别优选地至少90％并且尤其优选地至少95％同一性的核酸分子。
借助本发明核酸分子的序列信息或借助本发明核酸分子，本领域技术人员有可能从其它植物物种、优选地从贮藏淀粉的植物、优选地从稻属植物物种(具体而言为稻)或从自拟南芥菜中分离同源序列。这可借助例如常规方法进行，如使用合适的杂交样本筛查cDNA文库或基因组文库。本领域技术人员知道，还可借助(简并性)寡核苷酸和利用基于PCR的方法分离同源序列。
对例如EMBL(http://www.ebi.ac.uk/Tools/index.htm)或NCBI(美国国立生物技术信息中心，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的可利用数据库筛查还可用于鉴定编码OK1蛋白质的同源序列。在该情况下，指定一个或多个序列序列为所谓的查询。随后该查询序列通过统计学计算机程序与选择的数据库中所包含的序列比较。此类数据库查询(例如blast或fasta检索)为本领域技术人员所知并且可通过多个提供者进行。
例如，如果在NCBI(美国国立生物技术信息中心，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中开展数据库查询，应当使用指定用于特定比较查询的标准设置。对于蛋白质序列比较(blastp)，设置如下：限制entrez＝未激活；过滤＝低复杂性激活的；期望值＝10；字大小＝3；矩阵＝BLOSUM62；缺口代价：存在＝11，延长＝1。
对于核酸序列比较(blastn)，必须设置如下参数：限制entrez＝未激活；过滤＝低复杂性激活的；期望值＝10；字大小＝11。
借助此类数据库检索，可用本发明中所述的序列作为查询序列，以鉴定编码OK1蛋白质的另一些核酸分子和/或蛋白质。
借助所述的方法，还有可能鉴定和/或分离与SEQ ID NO 1或SEQ IDNO 3中指定的序列杂交并且编码OK1蛋白质的本发明核酸分子。
在本发明的范围内，术语“杂交”意思是指例如在Sambrock等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第三版(2001)Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY.ISBN：0879695773；Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons；第5版(2002)，ISBN：0471250929中所述的常规杂交条件、优选地严格条件下的杂交。特别优选地，“杂交”意思是指如下条件下的杂交：
杂交缓冲液：
2×SSC；10×Denhardt溶液(Ficoll 400+PEG+BSA；比率1∶1∶1)；
0.1％SDS；5mM EDTA；50mM Na2HPO4；250μg/ml鲱精DNA；
50μg/ml tRNA；或者
25 M磷酸钠缓冲液pH 7.2；1mM EDTA；7％SDS
杂交温度：T＝65至68℃
洗涤缓冲液：0.1×SSC；0.1％SDS
洗涤温度：T＝65至68℃。
原则上，与本发明核酸分子杂交的核酸分子可源自编码适宜蛋白质的任意植物物种，优选地它们源自贮藏淀粉的植物，优选地源自(系统命名)禾本科(Poacea)的物种，尤其优选地源自稻。例如可从基因组文库或从cDNA文库中分离与本发明核酸分子杂交的核酸分子。可利用本发明核酸分子或这些分子的部分或这些分子的反向互补体，通过例如根据标准方法(参见例如，Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第三版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY.ISBN：0879695773，Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons；第5版(2002)，ISBN：0471250929)的杂交或通过使用PCR的扩增进行这种类型核酸分子的鉴定和分离。
可用完全或基本上具有SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3中指定核苷酸序列或者这些序列部分的核酸分子作为杂交样本。用作杂交样本的片段还可以是用已建立的合成技术所制造的、在序列上基本与本发明核酸分子的序列对应的合成性片段或寡核苷酸。如果已鉴定和分离了与本发明核酸序列杂交的基因，则应当对该序列进行测定并分析由此序列所编码的蛋白质的特性，以确定是否与OK1蛋白质有关。在核酸序列或氨基酸序列水平的同源性比较以及对酶活性的测定特别适于此目的。例如OK1蛋白质活性可如上述在一般方法第11项中测定。用已经在上面描述的方法和一般方法第8项和12A项中的方法可证实OK1蛋白质对P-淀粉具有与非磷酸化淀粉相比优选的结合亲和性以及OK1蛋白质的自身磷酸化。
与本发明核酸分子杂交分子特别包括编码来自植物、优选地来自贮藏淀粉的植物、优选地来自稻属植物物种、尤其优选地来自稻或拟南芥菜的OK1蛋白质的本发明核酸分子的片段、衍生物和等位变异体。与本发明相关的术语“衍生物”意思是指这些分子的序列在一个或多个位置上不同于来自以上所述核酸分子的序列并且与这些序列的具有高度同源性。在这里，与上述核酸分子的差别可例如因缺失、添加、替代，插入或重组而发生。
与本发明相关的术语“同一性”意思是指与编码区全长序列的序列同一性超过至少60％、特别至少70％、优选大于80％、特别优选大于90％并且尤其至少95％。将与本发明相关的术语“同一性”理解为意思是指以百分数表示的与其它蛋白质/核酸对应的氨基酸/核苷酸数(同一性)。优选地，借助计算机程序，通过将SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4(对于氨基酸)或者SEQ.ID NO 1或SEQ ID NO 3(对于核酸)与其它蛋白质/核酸比较来确定同一性。如果与另一个序列相比的序列具有不同长度，以如此方式确定同一性：即较短序列与较长序列共有氨基酸的数目决定同一性的百分比商。优选地，通过众所周知而且可公开获得的计算机程序ClustalW(Thompson等，Nucliec Research 22(1994)，4673-4680)确定同一性。欧洲分子生物学实验室(Meyerhofstrasse 1，D 69117，Heidelberg，德国)的Julie Thompson(ThompsonEMBL-Heidelberg.DE)和TobyGibson(GibsonEMBL-Heidelberg.DE)制作了公开获得的ClustalW。还可从不同的互联网网站下载ClustalW，包括从IGBMC(Institut deGénétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire，B.P.163，67404 IllkirchCedex，法国；ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)和EBI(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)以及EBI的全部镜像互联网网站(欧洲生物信息研究所，Wellcome Trust Gemone Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，英国)中下载。
优选地使用ClustalW计算机程序1.8版确定本发明蛋白质与其它蛋白质之间的同一性。在实施中，必须设置如下参数：KTUPLE＝1、TOPDIAG＝5、WINDOW＝5、PAIRGAP＝3、GAPOPEN＝10、GAPEXTEND＝0.05、GAPDIST＝8、MAXDIV＝40、MATRIX＝GONNET、ENDGAPS(关)、NOPGAP、NOHGAP。
优选地使用ClustalW计算机程序1.8版确定例如本发明核酸分子的核苷酸序列与其它核酸分子的核苷酸序列之间的同一性。在实施中，必须设置如下参数：KTUPLE＝2，TOPDIAGS＝4，PAIRGAP＝5，DNAMATRIX：IUB，GAPOPEN＝10，GAPEXT＝5，MAXDIV＝40，TRANSITIONS：未加权。
此外，同一性意思是指所提及核酸分子或由它们编码的蛋白质之间存在功能性和/或结构性等同。与以上所述的分子同源并且构成这些分子的衍生物的核酸分子通常是这些分子的变异，其构成了执行同样生物学功能的修饰。与此同时，这些变异可天然发生，例如它们可以是来自另一些植物物种的序列，或它们可以是突变体，其中这些突变体可能以天然方式存在或通过目的性诱变导入。这些变异还可以是合成性制造的序列。等位变异体既可以是天然存在的变异体，也可以是合成性制造的变异体或通过重组DNA技术产生的变异体。因遗传密码子的简并性而从本发明核酸分子衍生的核酸分子构成了特别形式的衍生物。
从本发明核酸分子的不同衍生物中所编码的蛋白质具有某些共同特性。这些特性可以包括例如生物活性、底物特异性、分子量、免疫学反应性、构象等，以及物理特性诸如凝胶电泳迁移行为、层析行为、沉降系数、溶解度、光谱特性、稳定性；最适pH、最适温度等。已经在上面详细描述了OK1蛋白质的优选特性并相应地在这里应用。
本发明核酸分子可为任意核酸分子，特别是DNA或RNA分子，例如cDNA、基因组DNA、mRNA等。它们可以是天然存在的分子或通过遗传方法或化学合成方法所产生的分子。它们可以是含有编码链或非编码链的单链分子或者双链分子。
本发明的又一实施方案涉及本发明植物细胞和本发明植物，其中外来核酸分子选自：
a)因整合至植物基因组内引起至少一种OK1基因表达增加的T-DNA分子(T-DNA活化标记)；
b)含有通过整合至植物基因组内的方式引起OK1基因表达增加的转座子的DNA分子(转座子活化标记)；
c)编码OK1蛋白质并且与提供在植物细胞中转录及引起细胞中OK1蛋白质活性增加的调节序列连接的DNA分子；
d)通过在至少一种编码OK1蛋白质的内源性基因中引起突变或异源序列插入的体内诱变方式所导入的核酸分子，其中所述突变或插入导致编码OK1蛋白质的基因表达增加。
在本发明中，还可使用所谓的插入诱变(综述文章：Thorneycroft等，2001，Journal of Experimental Botany 52(361)，1593-1601)制造本发明的植物细胞和植物。将插入诱变理解为特别是指在编码OK1蛋白质的基因中或其附近插入转座子或所谓的转移DNA(T-DNA)，由此导致所述细胞中OK1蛋白质的活性增加。
转座子既可以是在细胞中天然存在的转座子(内源性转座子)，也可以是在所述细胞中非天然存在的但通过遗传工程方法如细胞转化而导入该细胞的转座子(异源转座子)。通过转座子改变基因表达为本领域技术人员所知。Ramachandran和Sundaresan(2001，Plant Physiology andBiochemistry 39，234-252)综述了内源性转座子和异源转座子作为植物生物技术中工具的用途。
T-DNA插入诱变基于这样一种事实，即来自农杆菌属Ti质粒的某些片段(T-DNA)可整合至植物细胞基因组内。在植物染色体中的整合位置没有阐明，但可在任意点内发生。如果T-DNA整合至构成基因功能的染色体部分或附近时，则可能导致基因表达增加，并且因此还导致由所述基因编码的蛋白质活性的改变。
在这里，插入至基因组中的序列(具体而言是转座子或T-DNA)可通过它们所含有的引起OK1基因调节序列活化的序列(“活化标记”)区分。
通过所谓的“活化标记”方法(参见例如，Walden等，Plant J.(1991)，281-288；Walden等，Plant Mol.Biol.26(1994)，1521-1528)可产生本发明植物细胞和植物。这些方法基于通过“增强子”序列，诸如花椰菜花叶病毒35S RNA启动子的增强子或章鱼碱合酶增强子活化的内源性启动子。
将与本发明相关的术语“T-DNA活化标记”理解为意思是指含有“增强子”序列以及通过整合至植物细胞基因组内引起至少一种OK1蛋白质活性增加的T-DNA片段。
将与本发明相关的术语“转座子活化标记”理解为意思是指含有“增强子”序列以及通过整合至植物细胞基因组内引起至少一种OK1蛋白质活性增加的转座子。
在另一个实施方案中，编码OK1蛋白质的本发明DNA分子与启动植物细胞中转录(启动子)并引起细胞中OK1蛋白质活性增加的调节序列连接。在这种情况下，本发明的核酸分子以相对调节序列的“有义”方向存在。
为表达编码OK1蛋白质的本发明核酸分子，优选地将它们与确保在植物细胞中转录的调节性DNA序列连接。特别地，调节性DNA序列包括启动子。通常，在植物细胞中有活性的任意启动子均适合用于表达。
可以选择启动子以便组成型地或仅在某种组织内、在植物发育某个阶段或在由外界影响所决定的时间内发生表达。相对于植物和相对于核酸分子而言，启动子可以为同源的或异源的。
适宜启动子是例如以下的启动子：用于组成型表达的花椰菜花叶病毒35S RNA的启动子和来自玉米遍在蛋白的启动子，用于在马铃薯中进行块茎特异性表达的patatin启动子B33(Rocha-Sosa等，EMBO J.8(1989)，23-29)，或确保仅在光合活跃组织中表达的启动子如ST-LS1启动子(Stockhaus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987)，7943-7947；Stockhaus等，EMBO J.8(1989)，2445-2451)，或来自小麦的用于胚乳特异性表达的HMG启动子、USP启动子、菜豆球蛋白启动子、来自玉米的玉米醇溶蛋白基因启动子(Pedersen等，Cell 29(1982)，1015-1026；Quatroccio等，PlantMol.Biol.15(1990)，81-93)、谷蛋白启动子(Leisy等，Plant Mol.Biol.14(1990)，41-50；Zheng等，Plant J.4(1993)，357-366；Yoshihara等，FEBS Lett.383(1996)，213-218)或shrunken-1启动子(Werr等，EMBO J.4(1985)，1373-1380)。然而，还可使用仅在由外界影响所决定的时间内活化的启动子(参见例如WO 9307279)。在这里，允许进行简单诱导的热休克蛋白启动子特别有用。此外，还可使用种子特异性启动子，如来自蚕豆(Vicia faba)的确保在蚕豆和另一些植物中表达的USP启动子(Fiedler等，PlnatMol.Biol.22(1993)，669-679；B
Figure 058070802_2
umlein等，Mol.Gen.Genet.225(1991)，459-467)。
此外，可以存在用于向转录物添加聚A尾的终止序列(多聚腺苷酸化信号)。聚A尾在转录物稳定中的功能已经描述。这类元件在文献(参考Gielen等，EMBO J.8(1989)，23-29)中描述并且可任意互换。
在启动子和编码区之间可以存在内含子序列。此类内含子序列可导致植物中表达的稳定以及表达增加(Callis等，1987，Genes Devel.1，1183-1200；Luehrsen和Walbot，1991，Mol.Gen.Genet.225，81-93；Rethmeier，等，1997；Plant Journal.12(4)：895-899；Rose和Beliakoff，2000，Plant Physiol.122(2)，535-542；Vasil等，1989，Plant Physiol.91，1575-1579；XU等，2003，中国科学C辑第46卷，第6期，561-569)。适宜内含子序列是例如玉米sh1基因的第一内含子、玉米多聚遍在蛋白基因1的第一内含子、稻EPSPS基因的第一内含子或拟南芥菜PAT1基因中两个第一内含子之一。
此外，可通过所谓的“原位活化”制造本发明植物细胞和本发明植物。在此情况下，所导入的基因修饰在内源性OK1基因调节序列中引起改变，这导致OK1基因增加的表达。优选地，通过内源性OK1基因启动子或“增强子”序列的“体内”诱变活化OK1基因。在实施时，例如可以如此方式改变启动子或“增强子”序列以致于与野生型植物细胞或野生型植物中OK1基因的表达相比，所产生的突变引起本发明植物细胞或本发明植物中OK1基因表达的增加。启动子或“增强子”序列中的突变还可引起OK1基因在这样的时间在本发明植物细胞或本发明植物中表达，即在此时它们不在野生型植物细胞或野生型植物中表达。
将与本发明相关的术语“OK1基因”理解为意思是指编码OK1蛋白质、优选地来自贮藏淀粉的植物的OK1蛋白质、更优选地来自拟南芥菜并且最优选地来自稻的OK1蛋白质的核酸分子(cDNA、DNA)。
在所谓的“体内”诱变中，通过转化将杂交RNA-DNA寡核苷酸(“chimeroplast”)导入植物细胞内(Kipp，P.B.等在于1997年9月21-27日在新加坡“第五届国际植物分子生物学大会”的会议展板；R.A.Dixon和C.J.Arntzen，“转基因植物中的代谢工程”会议报告，KeystoneSymposia，Copper Mountain，CO，美国，TIBTECH 15，(1997)，441-447；国际专利WO 9515972；Kren等，Hepatology 25，(1997)，1462-1468；Cole-Strauss等，Science 273，(1996)，1386-1389；Beetham等，1999，PNAS 96，8774-8778)。
此RNA-DNA寡核苷酸中的一部分DNA成分与内源性OK1基因的核酸序列同源，但是与内源性OK1基因的核酸序列相比，其具有突变或含有为同源区域所包围的异源区域。
通过RNA-DNA寡核苷酸和内源性核酸分子中的同源区域的碱基配对，随后通过同源重组，将此RNA-DNA寡核苷酸的DNA成分中所含的突变及异源区域转移至植物细胞的基因组内。这引起一种或多种OK1蛋白质活性的增加。
所有这些方法以向植物细胞或植物的基因组内导入外来核酸分子为基础，并且因此基本适用于制造本发明植物细胞和本发明植物。
令人惊讶的是，已发现与未经基因修饰的相应野生型植物细胞或野生型植物中的淀粉相比，本发明植物细胞和本发明植物合成改性淀粉。
本发明植物细胞和本发明植物合成改性淀粉，与野生型植物细胞或植物所合成的淀粉相比，改性淀粉在物理化学特性、特别是淀粉磷酸含量或磷酸分布发生改变，以致于这特别适用于特定应用。
由于以前没有描述过专一性磷酸化P-淀粉的酶，因此以前也不可能将植物中已磷酸化淀粉中的淀粉磷酸含量增加至某个水平之上。现在通过使用用于植物基因修饰的本发明蛋白质或本发明核酸使其成为可能。
由于缺乏可利用的手段，不可能调整植物合成淀粉中的磷酸。由于本发明蛋白质和核酸的提供，现在有可能改变天然淀粉中的磷酸比率。
因此，本发明还包括本发明植物细胞和植物，与相应的未经基因修饰的野生植物细胞和野生型植物相比，本发明植物细胞和植物合成改性淀粉。
应当将与本发明相关的术语“改性淀粉”理解为意思是指与从相应野生型植物细胞或野生型植物中获得的未改性淀粉相比，表现出已改变的物理-化学特性的淀粉。
在本发明的另一个实施方案中，本发明植物细胞或植物合成与从相应野生植物细胞和野生型植物分离的淀粉相比具有高含量淀粉磷酸和/或改变的磷酸分布的淀粉。
应当将与本发明相关的术语“磷酸分布”理解为意思是指在萄糖分子C-2位、C-3位或C-6位所结合的淀粉磷酸相对于淀粉中总淀粉磷酸含量的比例。
在本发明的又一个实施方案中，本发明植物细胞或植物合成与未经基因修饰的野生型植物的淀粉相比表现出改变的C-3磷酸与C-6磷酸比率的淀粉。优选的是，与未经基因修饰的野生型植物细胞和野生型植物中的淀粉相比，C-3位所结合淀粉磷酸相对C-6位所结合淀粉磷酸的比例已增加的淀粉。
应当将与本发明相关的术语“C-3磷酸与C-6磷酸的比率”理解为意思是指在C-3位或C-6位与α-1，4-葡聚糖所结合的淀粉磷酸分别促成在C-3位和C-6位(C-3位+C-6位)与α-1，4-葡聚糖所结合的淀粉磷酸总量的淀粉磷酸的量。
描述了测定淀粉磷酸数量的不同方法。优选地，可使用Ritte等(2000，Starch/St
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rke 52，179-185)所述的测定淀粉磷酸数量的方法。特别优选地，根据Kasemusuwan和Jane(1996，Cereal Chemistry 73，702-707)所述的方法，通过31P-NMR测定淀粉磷酸的量。
此外，本发明目标是含有本发明植物细胞的经基因修饰的植物。这些类型的植物可通过再生从本发明植物细胞产生。
原则上，本发明植物可以是任意植物种的植物，即单子叶植物和双叶植物。优选地，它们是有用的植物，即为了食物目的或为了技术目的、尤其是为了工业目的由人栽培的植物。
在又一个实施方案中，本发明植物是贮藏淀粉的植物。
与本发明相关的术语“贮藏淀粉的植物”意思是指具有含贮藏淀粉的植物部分的所有植物，如玉米、稻、小麦、黑麦、燕麦、大麦、木薯、马铃薯、西米、绿豆、豌豆或高梁。
与本发明相关的术语“马铃薯植物”和“马铃薯”意思是指茄属(Solanum)的植物物种，尤其是茄属中产生块茎的物种，具体而言是马铃薯(Solanumtuberosum)。
与本发明相关的术语“小麦植物”意思是指小麦属(Triticum)的植物物种或与小麦属植物杂交所得到的植物，尤其是在农业中用于商业目的小麦属植物物种或与小麦属植物杂交所得到的植物，并且尤其优选地是普通小麦(Triticum aestivum)。
与本发明相关的术语“玉米植物”意思是指玉蜀黍属(Zea)的植物物种，尤其是在农业中用于商业目的玉米属植物物种，尤其优选地是玉米(Zeamais)。
在另一个实施方案，本发明涉及(系统命名)禾本科中的本发明的贮藏淀粉的植物，它们优选地是玉米或小麦植物。
本发明还涉及本发明植物的繁殖材料，其含有本发明植物细胞。
在这里，术语“繁殖材料”包括植物中适于通过无性生殖方法或有性生殖方法产生后代的那些部分。例如插条、愈伤组织培养物、根茎或块茎适用于无性繁殖。另一些繁殖材料包括例如果实、种子、幼苗、原生质体、细胞培养物等。优选地，繁殖材料是块茎，并且特别优选地是含有胚乳的颖果。
在又一个实施方案中，本发明涉及本发明植物的可收获植物部分，例如果实、贮藏根、根、花、芽、苗或茎，优选地是种子、颖果或块茎，其中这些可收获部分含有本发明植物细胞。
此外，本发明的还涉及用于制造本发明的经基因修饰植物的方法，其中：
a)将植物细胞进行遗传性修饰，由此导致OK1蛋白质活性与未经基因修饰的相应野生植物细胞中的活性相比增加；
b)从步骤a)的植物细胞再生植物；和
c)如果需要，借助步骤b)的植物产生更多植物。
根据步骤a)向植物细胞中所导入的基因修饰基本上可以是引起OK1蛋白质活性增加的任何类型的基因修饰。
根据步骤(b)再生植物可使用本领域技术人员所知(例如在“Plant cellCulture Protocols”，1999，由R.D.Hall编辑，Humana Press，ISBN0-89603-549-2中描述)的方法进行。
可通过无性繁殖(例如使用插条、块茎或通过逾伤组织培养和全植物的再生)或有性繁殖产生根据本发明方法步骤(c)的更多的植物。在这里，有性繁殖优选地在受控条件下进行，即将所选择的具有特定特征的植物彼此间杂交并且繁殖。在此情况中，选择以如此方式进行，即使的根据步骤c)所得到的更多的植物表现出在步骤a)中所导入的基因修饰。
在本发明方法的又一个实施方案中，基因修饰是向植物细胞基因组中导入本发明的外来核酸分子，其中该外来核酸分子的存在或表达引起细胞中OK1蛋白质活性增加。
在本发明方法的又一个实施方案中，基因修饰是向植物细胞基因组导入外来核酸分子，其中该外来核酸分子编码OK1蛋白质。
在又一个实施方案中，本发明的方法用于产生本发明的经基因修饰的植物，以便产生贮藏淀粉的植物。
在又一个实施方案中，本发明的方法用于产生本发明的玉米植物或小麦植物。
在本发明方法的又一个实施方案中，外来核酸分子选自：
a)编码蛋白质的核酸分子，其中该蛋白质具有SEQ ID NO 2或SEQID NO 4中所指定氨基酸序列；
b)编码蛋白质的核酸分子，其中该蛋白质包含质粒A.t.-OK1-pGEM中插入片段或质粒pMI50中插入片段所编码的氨基酸序列；
c)编码蛋白质的核酸分子，其中该蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO2或SEQ ID NO 4中所指定氨基酸序列具有至少60％的同一性；
d)编码蛋白质的核酸分子，其中该蛋白质的序列与质粒A.t.-OK1-pGEM中插入片段或质粒pMI50中插入片段所编码的氨基酸序列具有至少60％的同一性；
e)核酸分子，其包含SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3中所示的核苷酸序列或互补序列；
f)核酸分子，其包含质粒A.t.-OK1-pGEM或质粒pMI50中所含插入片段的核苷酸序列；
g)核酸分子，其与a)、b)、e)或f)中所述的核酸序列具有至少70％的同一性；
h)核酸分子，其与a)、b)、e)或f)中所述的核酸分子中的至少一条链在严格条件下杂交；
i)核酸分子，其核苷酸序列因遗传密码子简并性而从a)、b)、e)或f)中所鉴定核酸分子的序列衍生；和
j)核酸分子，其代表a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)或i)中所鉴定的核酸分子的片段、等位变异体和/或衍生物。
在本发明方法的又一个实施方案中，此外来核酸分子选自：
a)通过整合至植物基因组内引起OK1基因表达增加的T-DNA分子(T-DNA活化标记)；
b)含有通过整合至植物基因组内引起OK1基因表达增加的转座子的DNA分子(转座子活化标记)；
c)编码OK1蛋白质并且与确保(启动)在植物细胞中转录及引起细胞中OK1蛋白质活性增加的的调节序列连接的DNA分子；
d)通过在至少一种内源性OK1基因中引起突变或插入异源序列的体内诱变方式所导入的核酸分子，其中该突变或插入引起OK1基因表达的增加。
在又一个实施方案中，本发明涉及本发明的方法，其中与来自未经基因修饰的野生型植物的淀粉相比，经基因修饰的植物合成改性淀粉。
在本发明方法的又一个实施方案中，本发明植物合成与从相应野生植物中分离的淀粉相比淀粉磷酸含量较高和/或磷酸分布改良的改性淀粉。
在本发明方法的又一个实施方案中，本发明植物合成与未经基因修饰的野生型植物的淀粉相比具有改良的C-3磷酸与C-6磷酸比率的改性淀粉。特别优选的是与未经基因修饰的野生型植物中的淀粉相比，C-3位所结合淀粉磷酸相对C-6位所结合淀粉磷酸的比例已增加的淀粉。
本发明还涉及通过本发明的方法可获得的植物。
令人惊讶的是，已发现从具有增加的OK1蛋白质活性的本发明植物细胞和本发明植物中分离的淀粉是改性淀粉。
特别地，本发明淀粉中淀粉磷酸量的增加赋予淀粉惊奇的和有利的特性。本发明淀粉具有增加的填充基团比例，这归因于可显著影响功能特性的淀粉磷酸比例的增加。在将淀粉用于纸张涂层的造纸工业中含有填充官能团的淀粉特别有用。例如，用同样显示良好粘附特性的填充分子所涂层的纸张特别适合于吸附色素如染料、印刷墨水等。
本发明还涉及从本发明植物细胞或本发明植物、从本发明的繁殖材料或从本发明可收获植物部分中可获得的改性淀粉。
在又一个实施方案中，本发明涉及来自贮藏淀粉的植物、优选地来自(系统命名)禾本科中的贮藏淀粉的植物、特别优选地来自玉米或小麦植物的本发明改性淀粉。
此外，本发明涉及用于制造改性淀粉的方法，包括从本发明植物细胞或从本发明植物中、从该植物中的本发明繁殖材料中和/或从该植物中的本发明可收获植物部分中、优选地从该植物中的本发明的贮藏淀粉的部分中提取淀粉的步骤。优选地，此方法还包括在提取淀粉前收获所培育的植物或植物部分和/或此类植物繁殖材料的步骤，而且还特别优选地包括在收获前培育本发明植物的步骤。
用于从植物中或从植物的贮藏淀粉的部分中提取淀粉的方法为本领域技术人员所知。此外，从不同的贮藏淀粉的植物中提取淀粉的方法描述于例如Starch：Chemistry and Technology(出版者：Whistler，BeMiller和Paschall(1994)，第二版，Academic Press Inc.London Ltd；ISBN0-12-746270-8；参见例如第12章，第412-468页：Maize and SorghumStarches：Manufacture，由Watson编；第13章，第469-479页：Tapioca，Arrowroot and Sago Starches：Manufacture，由Corbishley和Mille编；第14章，第479-490页：Potato starch：Manufacture and Uses，由Mitch编；第15章，第491-506页：Wheat starch：Manufacture，Modification andUses，由Knight和Oson编；以及第16章，第507-528页：Rice starch：Manufacture and Uses，由Rohmer和Klem编；Maize starch：Eckhoff等，Cereal Chem.73(1996)，54-57，工业规模提取玉米淀粉通常通过所谓“湿磨法”完成。)。从植物材料中提取淀粉的常用装置是分离器、倾析器、水力旋流器、喷雾干燥器和流化床干燥器。
将与本发明相关的术语“贮藏淀粉的部分”理解为意思是指植物中的这些部分，其中与暂时叶淀粉不同，在这些部分中淀粉作为生存储备储藏更长的时间。优选的贮藏淀粉的植物部分是例如块茎、贮藏根和颖果，特别优选含有胚乳的颖果，尤其特别优选的是含有玉米植物或小麦植物胚乳的颖果。
通过用于制造改性淀粉的本发明方法可获得的改性淀粉也是本发明主旨。
在本发明的又一实施方案中，本发明的改性淀粉是天然淀粉。
与本发明相关的术语“天然淀粉”意思是指通过本领域技术人员所知方法从本发明植物、本发明可收获植物部分、本发明的贮藏淀粉的部分或本发明植物的繁殖材料中所分离的淀粉。
此外，本发明植物细胞或本发明植物用于制造改性淀粉的用途是本发明的主旨。
本领域技术人员知道，例如可通过热衍生、化学衍生、酶衍生或机械性衍生改变淀粉的特性。衍生的淀粉尤其适于食品领域和/或非食品领域内的不同应用。本发明淀粉因较高的淀粉磷酸含量而显示出较高比例的活性官能团，因此与常规淀粉相比，它们更好地适合作为制造衍生淀粉的起始材料。
本发明因此还涉及衍生淀粉的制造，其中将本发明改性淀粉回溯性衍生。
将与本发明相关的术语“衍生淀粉”理解为意思是指从植物细胞中分离后已经借助化学方法、酶方法、热方法或机械方法改变其特性的本发明改性淀粉。
在本发明的又一实施方案中，本发明的衍生淀粉是已经用热和/或酸处理的淀粉。
在又一个实施方案中，衍生淀粉是淀粉醚，尤其是淀粉烷醚、淀粉O-烯丙基醚、淀粉羟烷基醚、淀粉O-羧甲基醚、含氮的淀粉醚、含磷酸的淀粉醚或含硫的淀粉醚。
在又一个实施方案中，衍生淀粉是交联淀粉。
在又一个实施方案中，衍生淀粉是淀粉接枝聚合物。
在又一个实施方案中，衍生淀粉是氧化的淀粉。
在又一个实施方案中，衍生淀粉是淀粉酯，特别是使用有机酸导入淀粉的淀粉酯。特别优选地，这些淀粉酯是磷酸酯淀粉、硝酸酯淀粉、硫酸酯淀粉、黄原酸酯淀粉、乙酸酯淀粉或柠檬酸酯淀粉。
本发明衍生淀粉适合于制药工业和食品和/或非食品领域中的不同应用。用于制造本发明衍生淀粉的方法为本领域技术人员所知，并且在常见文献中充分描述。可在Orthoefer的文献(Corn，Chemistry andTechnology，1987，编者Watson和Ramstad，第16章，479-499)中找到制造衍生淀粉的综述。
通过用于制造衍生淀粉的本发明方法可获得的衍生淀粉也是本发明的主旨。
此外，本发明改性淀粉用于制造衍生淀粉的用途是本发明的主旨。
常常将植物的贮藏淀粉部分加工成粉末。用于产生粉末的植物部分的实例是例如马铃薯植物的块茎和谷类植物的颖果。为从谷类植物中制造粉末，研磨这些植物中含胚乳的颖果并过筛。淀粉是胚乳中的主要组分。在不含胚乳而作为替代含有其它贮藏淀粉部分如块茎或根的另一些植物的例子中，常常通过绞碎、干燥以及随后研磨所述贮藏器官产生粉末。胚乳淀粉或植物的贮藏淀粉部分中所含的淀粉是分别从这些植物部分产生的粉末的重要部分。因此，各自粉末中存在的淀粉影响粉末的特性。与未经基因修饰的野生型植物细胞和野生型植物相比，本发明植物细胞和本发明植物合成改性淀粉。从本发明植物细胞、本发明植物、本发明的繁殖材料或本发明的可收获部分中产生的粉末因此表现出改良的特性。通过混合淀粉与粉末或者混合具有不同特性的粉末也可以影响粉末的特性。
因此，本发明的另外一个主题涉及含有本发明淀粉的粉末。
本发明的又一主题涉及从本发明植物细胞、本发明植物、本发明植物的贮藏淀粉部分、本发明繁殖材料或本发明可收获植物部分中所产生的粉末。本发明植物的优选贮藏淀粉部分是块茎、贮藏根和含有胚乳的颖果。块茎优选地来自马铃薯植物，并且颖果优选地来自(系统命名)禾本科的植物，而且颖果特别优选地来自玉米植物或小麦植物。
将与本发明相关的术语“粉末”理解为意思是指通过研磨植物部分所得到的粉末。可以在研磨前以及研磨后绞碎和/或过筛前将植物部分干燥。
本发明粉末的特征在于它们含有淀粉，该淀粉特别因增加的水结合能力而表现出改良的磷酸含量和/或改良的磷酸分布。这在食品工业中用于众多用途的粉末加工中是受欢迎的，特别例如在焙烘产品制造中。
本发明的又一主题是用于制造粉末的方法，其包括研磨本发明植物细胞、本发明植物、本发明植物部分、本发明植物的贮藏淀粉部分、本发明的繁殖材料或本发明可收获材料的步骤。
可通过研磨本发明植物的贮藏淀粉部分产生粉末。用于制造粉末的方法为本领域技术人员所知。用于制造粉末的方法优选地包括在研磨前收获所培育的植物或这些植物的植物部分和/或繁殖材料或贮藏淀粉部分的步骤，并且特别优选地包括在收获前培育本发明植物的额外步骤。
应当将与本发明相关的术语“植物部分”理解为意思是指植物中作为组成部分的所有部分，所有组成部分构成完整植物。植物部分是幼芽、叶、根茎、根、瘤(knob)、块茎、荚、种子或颖果。
在本发明的又一实施方案中，用于制造粉末的方法包括在研磨前加工本发明植物、本发明的贮藏淀粉的植物、本发明的繁殖材料或本发明的可收获材料。
在这种情况下，加工可以是热处理和/或干燥。例如从贮藏根或块茎，如马铃薯块茎中制造粉末时，在研磨前使用热处理并随后将经热处理的材料干燥。在研磨前，绞碎本发明植物、本发明植物的贮藏淀粉部分、本发明的繁殖材料或本发明的可收获材料也是本发明意义内的加工。研磨前去除植物组织如颖果外壳也是本发明意义内的研磨前加工。
在本发明的又一实施方案中，用于制造粉末的方法包括加工研磨后的蘑碎产物。
在此情况下，例如可对研磨后的磨碎产物过筛以产生多种类型的粉末。
本发明又一主题是基因修饰的本发明植物细胞和本发明植物用于制造粉末的用途。
提供用于产生本发明植物细胞和本发明植物的手段如DNA分子也是本发明的目标，其中与未经基因修饰的野生型植物细胞或野生型植物相比，本发明植物细胞和本发明植物合成了改性淀粉。
因此本发明还涉及编码具有OK1蛋白质酶活性蛋白质的核酸分子，选自：
a)编码蛋白质的核酸分子，其中该蛋白质具有SEQ ID NO 2或SEQID NO 4中指定的氨基酸序列；
b)编码蛋白质的核酸分子，其中该蛋白质包含质粒A.t.-OK1-pGEM中插入片段或质粒pMI50中插入片段所编码的氨基酸序列；
c)编码蛋白质的核酸分子，其中该蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO2或SEQ ID NO 4中指定的氨基酸序列具有至少60％的同一性；
d)编码蛋白质的核酸分子，其中该蛋白质的序列与质粒A.t.-OK1-pGEM中插入片段或质粒pMI50中插入片段所编码的氨基酸序列具有至少60％的同一性；
e)核酸分子，其包含SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3中所指定的核苷酸序列或互补序列；
f)核酸分子，其包含在质粒A.t.-OK1-pGEM或质粒pMI50中所含插入片段的核苷酸序列；
g)核酸分子，其与a)、b)、e)或f)中所述的核酸序列具有至少70％的同一性；
h)核酸分子，其与a)、b)、e)或f)中所述的核酸分子中的至少一条链在严格条件下杂交；
i)核酸分子，其核苷酸序列因遗传密码子简并性而从a)、b)、e)或f)中所指定核酸分子的序列衍生；和
j)核酸分子，其代表a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)或i)中所指定的核酸分子的片段、等位变异体和/或衍生物。
基本上，本发明核酸分子可源自任意植物，优选地它们源自贮藏淀粉的植物，优选地源自马铃薯植物、大麦植物、高梁植物、大麦植物、小麦植物或稻植物，特别优选地源自拟南芥菜植物或稻植物，并且更特别优选地源自稻。
此外，本发明涉及长度至少21个、优选地超过50个并且特别优选地超过200个核苷酸的核酸分子，其与至少一种本发明核酸分子特异性杂交。在这里，特异性杂交意思是指这些分子与编码本发明蛋白质的核酸分子杂交而不与编码其它蛋白质的核酸分子杂交。特别地，本发明涉及与本发明核酸分子的转录物杂交并且因此可以阻止这些转录物翻译的核酸分子。与本发明核酸分子特异性杂交的此类核酸分子可例如是反义组件、RNAi或共抑制构建体或者核酶，或可用作PCR扩增的引物。
此外，本发明涉及含有本发明核酸分子的重组核酸分子。
将与本发明相关的术语“重组核酸分子”理解为意思是指除了包含本发明核酸分子以外还含有额外序列的核酸分子，其中在本发明重组核酸中存在的核酸组合在天然情况下不存在。在这里，上述额外序列可为任意序列，它们优选地是调节序列(启动子、终止信号、增强子)，它们特别优选地是在植物组织中具有活性的调节序列，并且它们尤其特别优选地是在合成贮藏淀粉的植物组织中具有活性的调节序列。用于产生本发明重组核酸分子的方法为本领域技术人员所知，并且包括基因方法，如通过连接作用连接核酸分子、基因重组、重新合成核酸分子(参见例如Sambrok等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第三版，(2001)Cold SpringHarbour Laboratory Press，Cold Spring Harbour，NY.ISBN：0879695773；Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons；第5版，(2002)，ISBN：0471250929)。
本发明重组核酸分子的又一个实施方案是含有上述本发明核酸分子的载体，具体而言是质粒、粘粒、病毒、噬菌体和基因技术中常用的其它载体。
在又一个实施方案中，载体内所含的本发明核酸分子与启动在原核细胞或真核细胞中表达的调节序列连接。在这里，术语“表达”可意味着转录和翻译。本发明核酸分子可具有相对于该调节序列的“有义”方向和/或“反义”方向。
在文献中充分描述了用于在原核生物例如大肠杆菌(E.coli)和真核生物中表达的调节序列，特别描述了用于酵母例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中表达的调节序列。例如Methods in Enzymology 153(1987)，383-516和Bitter等(Methods in Enzymology 153(1987)，516-544)综述了用于在多种宿主生物中表达蛋白质的多种系统。
本发明又一主题的是用本发明核酸分子和/或用本发明载体进行基因修饰的宿主细胞，特别是原核细胞或真核细胞，以及源自这些类型宿主细胞并含有本发明基因修饰的细胞。
在又一个实施方案中，本发明涉及用本发明核酸分子或者用本发明载体进行转化的宿主细胞，特别是原核细胞或真核细胞，以及源自这些类型宿主细胞并含有所述的本发明核酸分子或载体的宿主细胞。
宿主细胞可以是细菌细胞(例如大肠杆菌、农杆菌属细菌，特别是根癌农杆菌或发根农杆菌)或真菌细胞(例如酵母，特别是酿酒酵母、蘑菇属(Agaricus)，具体而言是双孢蘑菇(Agaricus bisporus)、曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma))及植物细胞或动物细胞。在这里，术语“转化”意思是指用本发明核酸分子对本发明细胞进行基因修饰以致于本发明细胞除了包含其天然基因组以外还含有至少一种本发明核酸分子。本发明核酸分子在细胞中可能作为自我复制分子游离存在，或者稳定整合入宿主细胞基因组内。
微生物宿主细胞为优选。在本专利申请的范围内，将微生物宿主细胞理解为包含所有细菌和原生生物(例如真菌，特别是酵母及藻类)，这如在Schlegel“General Microbiology”(Georg Thieme Publishing House(1985)，1-2)中所定义。
此外，本发明宿主细胞是植物细胞。原则上，它们是来自任意植物物种(即单子叶植物和双子叶植物)的植物细胞。它们优选地是来自农用植物的植物细胞，即来自为营养目的、技术目的或特别是工业目的由人栽培的植物。本发明优选地涉及来自贮藏淀粉的植物(玉米、稻、小麦、黑麦、燕麦、大麦、木薯、马铃薯、西米、绿豆、豌豆或高梁)的植物细胞和植物；特别是来自(系统命名)禾本科植物的植物细胞，特别优选地是来自玉米植物或小麦植物的植物细胞。
含有本发明核酸分子、本发明重组核酸分子或本发明载体的组合物也是本发明的主旨。含有本发明核酸分子、本发明重组核酸分子或本发明载体以及宿主细胞的组合物为优选的。特别优选地，宿主细胞是植物细胞，更特别优选地是来自玉米植物或小麦植物的细胞。
本发明组合物的另一个方面涉及可用于产生本发明宿主细胞、优选地用于产生本发明植物细胞的组合物。优选地，这是含有本发明核酸分子、本发明重组核酸分子、本发明载体以及适用于向宿主细胞内导入本发明核酸分子的生物射弹载体的组合物。优选的生物射弹载体是钨、金或合成材料的粒子。
本发明组合物的又一实施方案涉及包含本发明核酸分子、本发明重组核酸分子或本发明载体以及植物细胞和合成培养基的组合物。优选地，此类组合物除了含有本发明核酸分子、植物细胞和合成培养基以外还含有聚乙二醇(PEG)。在这些组合物的情况下，本发明重组核酸分子存在于植物细胞之外，即其位于由细胞质膜所包围的植物细胞的细胞内部以外。
适用于培育和/或转化植物细胞的合成培养基为本领域技术人员所知，并且例如在文献中充分描述。还可从专门的经销商(例如比利时DUCHEFABiochemie B.V.)购买多种不同的合成培养基。
本发明组合物的又一实施方案涉及用于鉴定本发明核酸的组合物。优选地，此类组合物除了含有本发明核酸分子、本发明重组核酸分子或本发明载体以外还含有另外的核酸分子，特别是植物来源的核酸分子，其可以以基因组DNA、mRNA形式或作为所谓的DNA文库中的克隆存在。作为粘粒、噬菌粒、质粒、YAC或BAC存在的DNA文库为优选的。DNA文库可以含有基因组DNA和cDNA。在这些组合物中，本发明核酸分子、本发明重组核酸分子或本发明载体优选地用作杂交样本。
本发明的又一实施方案涉及显示出淀粉磷酸化活性和需要磷酸化淀粉作为底物的蛋白质。优选地，其为显示出对磷酸化淀粉具有磷酸化活性和需要磷酸化淀粉作为底物的蛋白质。
本发明的又一实施方案涉及需要磷酸化淀粉作为底物并且将ATP的残基磷酸转移至磷酸化淀粉的本发明蛋白质。优选地，本发明蛋白质将ATP的残基β-磷酸转移至磷酸化的淀粉上。特别优选地，本发明蛋白质将ATP的残基β-磷酸转移至磷酸化的淀粉上并且将ATP残基γ-磷酸转移至水，并且因此具有[磷酸化-α-1，4-葡聚糖]-水-双激酶或[磷酸化-淀粉]-水-双激酶活性。
本发明的又一实施方案涉及在向磷酸化淀粉转移残基磷酸时作为磷酸化中间产物积累的本发明蛋白质。
本发明的又一实施方案涉及对磷酸化淀粉具有与非磷酸化淀粉相比增加的结合活性的本发明蛋白质。
本发明的又一实施方案涉及本发明蛋白质，其与磷酸化淀粉中的葡萄糖分子C-6位磷酸单酯键相比，在C-3位导入更多的额外磷酸单酯键。
优选地，与磷酸化淀粉中葡萄糖分子C-6位的磷酸单酯键相比，在磷酸化淀粉中葡萄糖分子C-3位导入的磷酸单酯键多至少30％、更优选至少60％、特别优选至少90％并且最优选至少120％。
本发明又一主题涉及本发明蛋白质，其具有从120kDa至145kDa、优选地从120kDa至140kDa、特别优选地从125kDa至140kDa并且最特别优选地从130kDa至135kDa的氨基酸序列导出的分子量。
本发明的又一实施方案涉及具有磷酸组氨酸结构域的本发明蛋白质。该磷酸组氨酸结构域优选地含有两个组氨酸残基。
本发明又一主题是选自如下的本发明蛋白质：
a)包含SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4中指定的氨基酸序列的蛋白质；
b)由质粒A.t.-OK1-pGEM或pMI50中所插入DNA的编码区编码的蛋白质；或
c)显示与a)或b)中指定的氨基酸序列具有至少60％同一性的蛋白质。
在又一个实施方案中，本发明涉及对磷酸化淀粉具有磷酸化活性的蛋白质，其中所编码的蛋白质显示与SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4中指定的氨基酸序列或与质粒A.t.-OK1-pGEM或质粒pMI50中插入片段所编码OK1蛋白质的氨基酸序列具有至少70％、优选地至少80％、特别优选地至少90％和更特别优选地至少95％的同一性。
本发明的又一实施方案涉及本发明蛋白质，其特征在于编码该蛋白的氨基酸序列具有磷酸组氨酸结构域。优选地，本发明蛋白质具有磷酸组氨酸结构域，其与SEQ ID NO 5中指定氨基酸序列具有至少50％、特别地至少60％、优选地至少70％、特别优选地至少80％和更特别优选地至少90％的同一性。
在又一个实施方案中，本发明涉及源自拟南芥菜植物或稻植物的本发明蛋白质。
本发明的又一实施方案涉及对磷酸化淀粉具有与非磷酸化淀粉相比增加的结合活性的蛋白质，其中与非磷酸化淀粉结合活性相比，对磷酸化淀粉的结合活性增加至少3倍、优选地至少4倍、特别优选地至少5倍并且更特别优选地至少6倍。
在又一个实施方案中，本发明还涉及由本发明核酸分子所编码的蛋白质。
序列的描述
SEQ ID NO 1：包含来自拟南芥菜的A.t.-OK1蛋白质的编码区核酸序列。此序列被插入到A.t.-OK1-pGEM和OK1-pDEST17载体中。
SEQ ID NO 2：编码来自拟南芥菜的A.t.-OK1蛋白质的氨基酸序列。该序列可从SEQ ID NO 1中指定核酸序列推导出。
SEQ ID NO 3：包含来自稻的O.s.-OK1蛋白质的编码区核酸序列。此序列被插入到pMI50载体中。
SEQ ID NO 4：编码来自稻的O.s.-OK1蛋白质的氨基酸序列。该序列可从SEQ ID NO 3中指定核酸序列推导出。
SEQ ID NO 5：编码来自拟南芥菜和稻的OK1蛋白质中的磷酸组氨酸结构域的肽序列。
附图简述
图1：用于鉴定来自拟南芥菜的蛋白质的变性丙烯酰胺凝胶，其中与磷酸化淀粉相比，所述的蛋白质优选地结合非磷酸化淀粉。标准蛋白质分子量标记示于“M”道。将来自实施例1d)的对照制备物C温育后所得到的蛋白质示于“-道，与从拟南芥菜sex1-3突变体的叶中分离的非磷酸化淀粉温育后所得到的拟南芥菜蛋白质提取物(制备物B，实施例1d)示于“K”道。与从拟南芥菜sex1-3突变体的叶中分离并用R1蛋白质体外回溯性磷酸化的淀粉温育后所得到的拟南芥菜蛋白质提取物(制备物A，实施例1d)示于“P”道。电泳结束后，丙烯酰胺凝胶用考马斯蓝染色。
图2：OK1蛋白质自身磷酸化作用的证明。图2A)显示电泳结束后用考马斯蓝染色的变性(SDS)丙烯酰胺凝胶。图2B)显示了变性(SDS)丙烯酰胺凝胶的放射自显影。在两块凝胶中均使用等量的相同样品。M：标准蛋白分子量标记；R1：来自实施例7反应器1(在OK1蛋白质与ATP温育后)的样品；R2：来自实施例7反应器2(在OK1蛋白质与ATP温育后，加热至95℃)的样品；R3：来自实施例7反应器3(在OK1蛋白质与ATP温育后，在0.5M HCl中温育)的样品；R4：来自实施例7反应器4(在OK1蛋白质与ATP温育后，在0.5M NaOH中温育)的样品。
图3：OK1蛋白质的淀粉磷酸化活性的证明(参见实施例6)。将OK1蛋白质与从拟南芥菜sex1-3突变体叶中分离的非磷酸化淀粉(制备物A)及从拟南芥菜sex1-3突变体叶中分离的、用R1蛋白质体外回溯性磷酸化的淀粉(制备物B)温育。制备物C与制备物B相同，但在无OK1蛋白质时温育制备物C。对于每一制备物(A，B，C)进行两次独立试验(试验1和试验2)。作图显示以cpm(每分钟计数)所测量的由OK1蛋白质向非磷酸化淀粉《制备物A)和磷酸化淀粉(制备物B)内导入的33P标记磷酸的各自的量。
图4：分别由R1蛋白质和OK1蛋白质磷酸化的淀粉中葡萄糖分子C-原子位置的比较(参见实施例9)。在用33P标记的ATP存在时，将OK1蛋白质(制备物A)与从拟南芥菜sex1-3突变体的叶中分离的、用R1蛋白质体外回溯性磷酸化的淀粉温育。在用33P标记的ATP存在时，将R1蛋白质(制备物B)与从拟南芥菜sex1-3突变体的叶中分离的淀粉温育。温育结束时，将淀粉完全水解并且通过HPAE层析水解产物。在分离前，向水解产物中加入作为标准的葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-3-磷酸。在单个级分中收集通过HPAE层析所分离的水解产物。所加入的葡萄糖-6-磷酸随第15级分洗脱而所加入的葡萄糖-3-磷酸随第17级分洗脱。随后研究所得到的级分中放射性标记磷酸的存在。作图显示各级分中以cpm(每分钟计数)所测量的33P标记磷酸的量，所述标记磷酸由OK1蛋白质或R1蛋白质引入到磷酸化淀粉的水解产物中。
图5：OK1蛋白质自身磷酸化作用的证明。图5A)显示蛋白质印迹。图5B)显示变性(SDS)丙烯酰胺凝胶的放射自显影。在两块凝胶中均使用等量的相同样品。将OK1蛋白质与随机性放射性标记的ATP或者与γ位特异性放射性标记的ATP温育。温育结束后，将蛋白质分别加热至30℃或95℃，或者分别在0.5M NaOH或0.5M HCl中温育。
图6：OK1蛋白质所催化的反应中ATP的β-磷酸残基转移至淀粉内的证明。γ位特异性放射性标记的33P ATP或随机化33P ATP用于通过OK1蛋白质对经R1蛋白质体外磷酸化的淀粉以及从拟南芥菜sex1-3突变体叶中分离的淀粉进行磷酸化。在任何“对照”实验中不添加OK1蛋白质。每一制备物彼此独立试验两次。显示了两次试验的结果。
图7：使用抗拟南芥菜OK1蛋白质的抗体对来自植物的蛋白质提取物进行蛋白质印迹分析。显示来自如下植物的叶蛋白质提取物：Ara为拟南芥菜；51、54、55、67、72、73、79、62、63、64、65、69、66、68是385JH转化的独立系；D是野生型马铃薯Dséirée栽培变种。
一般方法
如下描述的方法可用于开展本发明中所述方法。这些方法形成本发明的具体实施方案，但是不使本发明限于这些方法。本领域技术人员知道，通过改进所述方法和/或通过用该方法的备选部分替换方法中的单个部分能以相同方式实施本发明。
1.从植物组织中产生蛋白质提取物
a)从植物组织中产生蛋白质提取物
叶材料收获后立即在液氮中冷冻，随后于液氮下在研钵中研磨。将碾碎的叶材料与大约3.5倍体积(相对所用叶材料的重量)的冷(4℃)结合缓冲液混合，并且用Ultraturrax(最大速度)以2×10秒破碎。用Ultraturrax第一次处理后，在冰上冷却碾碎的叶材料，随后进行第二处理。然后使已处理的叶材料通过100-μm尼龙滤网并离心20分钟(50ml离心管，20,000×g，4℃)。
b)蛋白质提取物中所含蛋白质的沉淀
取出根据步骤a)离心所得的上清液并测定其体积。为沉淀蛋白质，在30分钟时间内持续向在冰上并搅拌着的上清液内加入硫酸铵至75％(重量/体积)的终浓度。随后在冰上继续温育该上清液1小时并搅拌。在4℃于20,000×g下离心10分钟，使蛋白质从上清液中沉淀出来，随后在5ml结合缓冲液中吸收该沉淀，即溶解此沉淀中存在的蛋白质。
c)已沉淀蛋白质的脱盐
在4℃下使溶解的蛋白质通过填充有Sephadex G25(AmershamBioscience，Freiburg，柱产品号：17-0851-01，Sephadex G25-M产品号：17-0033-01)的PD10柱脱盐，即在步骤b)中为沉淀所用的硫酸铵也与溶解的蛋白质分开。在应用根据步骤b)所溶解的蛋白质之前，用结合缓冲液平衡PD10柱。为此目的，在每一情况下，在该柱中覆盖5ml结合缓冲液。随后向每个柱中加入2.5ml的根据步骤b)所得到的蛋白质溶液，然后用3.5ml结合缓冲液从柱中洗脱蛋白质。
d)蛋白质浓度的测定
用Bradford测定法(Biorad，Munich，产品号500-0006(Bradford，1976，Anal.Biochem.72，248-254))测定蛋白质浓度。
e)结合缓冲液的组成
结合缓冲液：50mM    HEPES/NaOH(或KOH)，pH 7.2
            1mM     EDTA
            2mM     二硫赤藓糖醇(DTE)
            2mM     苄脒
            2mM     ε-氨基己酸
            0.5mM   PMSF
            0.02％  Triton X-100
2.叶淀粉的分离
a)从植物组织分离淀粉粒
叶材料收获后立即在液氮中冷冻。于液氮下在研钵中逐份研磨叶材料并且在总共大约2.5倍体积(重量/体积)的淀粉缓冲液中溶解。此外在韦林氏搅切器(Waring blender)中以最大速度再次匀浆该悬液20秒。将匀浆液通过尼龙滤网(100μm筛格尺寸)并在1,000×g下离心5分钟。弃去含有可溶性蛋白的上清液。
b)从植物组织中所分离淀粉的澄清
在用淀粉缓冲液淋洗除去淀粉上面的绿色物质后，在淀粉缓冲液中溶解从步骤a)中所得到的含有淀粉的沉淀，随后通过具有不同筛格尺寸的尼龙滤网(以60μm、30μm、20μm的顺序)。使用10ml Percoll缓冲垫(95％(v/v)Percoll(Pharmacia，Uppsala，瑞典)，5％(v/v)0.5M HEPES-KOHpH7.2)(Correx管，15分钟，2,000×g)离心此过滤液。离心后所得到的沉积物重悬于淀粉缓冲液中并再次离心(5分钟，1,000×g)。
c)与淀粉结合的蛋白质的去除
在步骤b)后获得了含有与淀粉结合的蛋白质的淀粉粒。在室温下与0.5％SDS(十二烷基硫酸钠)摇动温育四次，每次10-15分钟，以除去结合在淀粉粒表面的蛋白质。每次洗涤步骤后均离心(5分钟，5,000×g)以便从每次洗涤缓冲液中分离淀粉粒。
d)无蛋白质的淀粉的纯化
随后在室温下通过与洗涤缓冲液摇动温育四次，每次10-15分钟，取出步骤c)中所得到的淀粉，该淀粉已没有结合在淀粉粒表面的蛋白质。每次洗涤步骤后均离心(5分钟，5,000×g)以便从每次洗涤缓冲液中分离淀粉粒。这些清洗步骤主要目的在于除去步骤c)中温育时所用的SDS。
e)已分离淀粉的浓度测定
用光度计方式测定步骤d)中所分离淀粉的量。在适度稀释后，对波长600nm下的标准曲线测量淀粉悬液的光密度。标准曲线的线性范围在0至0.3个消光单位之间。
为产生标准曲线，在真空下干燥淀粉，例如从拟南芥菜sex1-3突变体的叶中所分离的淀粉，称重并在限定体积的水中溶解。以数个步骤在每一情况下均以1∶1的比例用水稀释得到悬液，直至获得每ml水含大约5μg淀粉的悬液。在光度计中以600nm波长测定各个稀释步骤中所得到的悬液。将每一悬液的吸收值对各自悬液的淀粉浓度作图。所得到的标准曲线应当在每ml水0μg淀粉至每ml水0.3μg淀粉的范围内服从线形数学函数。
f)已分离淀粉的贮存
淀粉可直接使用而无需进一步贮存(对于进一步的实验)，或者在1.5mL Eppendorf管中于-20℃下贮存。如果需要，冷冻的淀粉和未贮存的新鲜分离淀粉均可用于例如本发明中所述的涉及体外磷酸化和/或结合试验的方法。
g)所用缓冲液的组成
1×淀粉缓冲液：20mM HEPES-KOH，pH 8.0
               0.2mM EDTA
               0.5％Triton X-100
洗涤缓冲液：   50mM HEPES/KOH，pH 7.2
3.已鉴定的淀粉磷酸化蛋白质的重组表达
a)含有编码淀粉磷酸化蛋白质的cDNA的细菌表达载体的产生
例如可使用来自植物组织的mRNA或聚腺苷酸mRNA作为“模板”，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增编码淀粉磷酸化蛋白质的cDNA。为此目的，首先用逆转录酶产生与编码淀粉磷酸化蛋白质的mRNA互补的cDNA链，然后通过DNA聚合酶扩增所述cDNA链。可购买含有用于开展PCR反应的物质、酶和说明书的所谓“试剂盒”(例如SuperScriptTM一步法RT-PCR系统，Invitrogen，产品号：10928-034)。随后可在细菌表达载体如pDESTTM17(Invitrogen))中克隆所扩增的编码淀粉磷酸化蛋白质的cDNA。pDESTTM17包含用于启动T7-RNA-聚合酶转录的T7启动子。此外，表达载体pDESTTM17含有位于T7启动子5′-方向的SD序列，其后是起始密码子(ATG)和所谓的“His标签”。该His标签由六个彼此直接相连的密码子组成，每个密码子均编码组氨酸，并且位于所述起始密码子的阅读框内。在pDESTTM17中如此克隆编码淀粉磷酸化蛋白质的cDNA，以便在起始密码子、His标签和编码淀粉磷酸化蛋白质的cDNA的密码子之间发生翻译融合。因此，在T7启动子启动转录以及后续翻译后，获得了在N末端包含带His标签的额外氨基酸的淀粉磷酸化蛋白质。
然而，还可用适于在微生物中表达的其它载体来表达淀粉磷酸化蛋白质。表达载体和相关的表达菌株为本领域技术人员所知并且可从适宜零售商那里以合适的组合购买获得。
b)大肠杆菌表达克隆的产生
首先，用步骤a)中所产生的表达质粒转化处于适宜转化感受态的大肠杆菌菌株，该菌株在染色体内编码T7-RNA聚合酶，随后在琼脂固化的培养基上于30℃培养过夜。适宜表达菌株是例如BL21株(Invitrogen产品号：C6010-03，其染色体上编码处于IPTG可诱导性启动子(lacZ)控制下的T7-RNA聚合酶)。
可使用本领域技术人员所知的方法研究来自所述转化的细菌菌落，以观察它们是否包含了含有淀粉磷酸化蛋白质的cDNA的所需表达质粒。与此同时，获得表达克隆。
c)淀粉磷酸化蛋白质在大肠杆菌中的表达
首先制备预备培养物。为此，在含有用于选择表达质粒存在的抗生素的30ml Terrific Broth(TB培养基)中接种根据步骤b)所得到的表达克隆，并且在30℃振荡(250转/分)培养过夜。
接着，制备用于表达淀粉磷酸化蛋白质的主要培养物。为此，在每一情况下，用10ml适宜的预备培养物接种到含有300ml预热至30℃的TB培养基和用于选择表达质粒存在的抗生素的1升锥形瓶中，并且在30℃振荡(250转/分)培养，直至达到大约0.8光密度(在波长600nm下测量；OD600)。
若为表达淀粉磷酸化蛋白质，使用通过可诱导系统启动其中淀粉磷酸化蛋白质表达的表达质粒(例如BL21大肠杆菌菌株中的通过IPTG可诱导的表达载体pDESTTM17)，随后在达到大约OD600 0.8时，向主要培养物中添加所述诱导物(例如IPTG)。添加该诱导物后，在30℃振荡(250转/分)培养主要培养物直至达到大约1.8的OD600。随后在冰上冷却主要培养物30分钟，随后通过离心(于4℃下，4,000×g离心10分钟)从培养基中分离主要培养物内的细胞。
4.淀粉磷酸化蛋白质的纯化
a)表达淀粉磷酸化蛋白质的细胞的破碎
在裂解缓冲液内重悬一般方法第3项步骤c)中所得到的细胞。在重悬时，向大约1g细胞中加入大约4ml裂解缓冲液。在冰上温育已重悬的细胞30分钟，随后在用冰连续冷却时使用超声波探头(Baudelin SonoplusUW 2070，Baudelin electronic，Berlin，设置：Cycle 6，70％，1分钟)使之破碎。必须小心确保超声波处理期间细胞悬液不过热。离心超声波处理后所获得的悬液(在4℃下，20,000×g 12分钟)，并且将离心后所得到的上清液用45μm孔径的滤器过滤。
b)淀粉磷酸化蛋白质的纯化
如果在大肠杆菌细胞中所表达的淀粉磷酸化蛋白质是带His标签的融合蛋白质，则其可用与His标签高度亲和力结合的镍离子借助His标签纯化。为此，在冰上混合25ml在步骤d)中得到的滤液和1ml Ni-琼脂糖浆液(Qiagen，产品号：30210)并温育1小时。最后在聚苯乙烯柱(Pierce，产品号：29920)上覆盖Ni-琼脂糖浆液和滤液的混合物。弃去流过柱子的产物。随后通过加入8ml裂解缓冲液洗涤该柱，再次弃去流过柱子的产物。通过向该柱分开加入1ml E1缓冲液两次，随后1ml E2缓冲液一次，以及随后的1ml E3缓冲液五次来洗脱淀粉磷酸化蛋白质。在分开的级分中收集加入单独部分适宜洗脱缓冲液(E1、E2、E3缓冲液)所产生的流过柱子的产物。随后通过变性SDS丙烯酰胺凝胶电泳及考马斯蓝染色分析等份的这些级分。纯化含有足量且具备令人满意纯度的淀粉磷酸化蛋白质的级分，并在4℃借助增压过滤进行浓缩。例如，可在4℃借助使用Diaflo PM30膜(Millipore，产品号：13212)的Amicon室(产品号为5121的8010型Amicon超滤室)实施增压过滤。然而，本领域技术人员所知的其它方法也可用于浓缩。
c)所用缓冲液的组成
裂解缓冲液：  50mM     HEPES
              300mM    NaCl
              10mM     咪唑
              pH 8.0(用NaOH调节)
1mg/ml溶菌酶(使用缓冲液前即刻加入)
每10ml用1/4片完全无EDTA的蛋白质抑制剂(Roche产品编号：
1873580，使用缓冲液前即刻加入)
洗脱缓冲液E1：50mM    HEPES
              300mM   NaCl
              50mM    咪唑
              pH 8.0(用NaOH调节)
洗脱缓冲液E2：50mM    HEPES
              300mM   NaCl
              75mM    咪唑
              pH 8.0(用NaOH调节)
洗脱缓冲液E3：50mM    HEPES
              300mM   NaCl
              250mM   咪唑
              pH 8.0(用NaOH调节)
5.R1蛋白质的重组表达
在文献中(Ritte等，2002，PNAS 99，7166-7171；Mikkelsen等，2004，Biochemical Journal 377，525-532)描述了R1蛋白质的重组表达，但其还可根据以上在一般方法第3项中所述的关于重组表达淀粉磷酸化蛋白质的方法开展。
6.R1蛋白质的纯化
在文献中(Ritte等，2002，PNAS 99，7166-7171；Mikkelsen等，Mikkelsen等，2004，Biochemical Journal 377，525-532)描述了R1蛋白质的纯化，但若在大肠杆菌细胞中表达R1产生了带His标签的R1融合蛋白质，则纯化还可根据以上在一般方法第4项中所述的关于淀粉磷酸化蛋白质纯化的方法开展。
7.基于非磷酸化淀粉的磷酸化淀粉的体外产生
a)非磷酸化淀粉的体外磷酸化
将不含淀粉磷酸的淀粉(例如借助以上在一般方法第2项中所述的方法从拟南芥菜sex1-3突变体叶中分离的淀粉)与R1缓冲液及纯化的R1蛋白质(每mg淀粉大约0.25μg R1蛋白质)混合以产生每ml 25mg的淀粉含量。室温摇动温育此反应制备物过夜(大约15小时)。反应结束后，通过用大约800μl 0.5％SDS洗涤四次除去与反应制备物中存在淀粉结合的R1。随后，通过每次1ml洗涤缓冲液洗涤五次除去仍在体外磷酸化淀粉中存在的SDS。所有洗涤步骤均在室温中摇动进行10至15分钟。每一洗涤步骤后均离心(2分钟，10,000×g)以便从各自的SDS缓冲液或洗涤缓冲液中分离淀粉粒。
b)所用缓冲液的组成
R1缓冲液：50mM    HEPES/KOH，pH 7.5
          1mM     EDTA
          6mM     MgCl2
          0.5mM   ATP
洗涤缓冲液：50mM HEPES/KOH，pH 7.2
8.蛋白质对磷酸化淀粉和非磷酸化淀粉的结合
a)P-淀粉蛋白质复合体或非磷酸化淀粉蛋白质复合体的分离
在每一情况下，大约800μl蛋白质提取物的单独制备物中分别重悬大约50mg P-淀粉或大约50mg非磷酸化淀粉。在每一情况下，蛋白质提取物的蛋白质浓度应当是每ml大约4mg至5mg。将蛋白质提取物与P-淀粉或非磷酸化淀粉的混合物于4℃下摇动温育15分钟。温育结束后，使用Percoll缓冲垫(4ml)离心(15分钟，3500转/分，4℃)此反应制备物。离心后，不与磷酸化淀粉结合或不与P-淀粉结合的蛋白质位于上清液内，并且可使用巴斯德吸管除去。弃去上清液。每一情况下，将离心后得到的沉淀用每次1ml的洗涤缓冲液(参见以上一般方法第7b项)通过在4℃下摇动温育3分钟洗涤两次，其中所述沉淀含有P-淀粉和非磷酸化淀粉并包含分别与各自淀粉所结合的蛋白质(分别是P-淀粉蛋白质复合体或非磷酸化淀粉蛋白质复合体)。每一洗涤步骤后均离心(于4℃下在Hettich EBA 12R台式离心机内以8000转/分离心5分钟)以便从洗涤缓冲液中分离P-淀粉或非磷酸化淀粉。
b)溶解分别结合于P-淀粉蛋白质复合体或非磷酸化淀粉蛋白质复合体中的蛋白质
在每一情况下，在大约150μl SDS试验缓冲液内重悬根据步骤a)所得到的P-淀粉蛋白质复合体或非磷酸化淀粉蛋白质复合体，并且在室温下摇动温育15分钟。随后通过离心(室温下，Eppendorf台式离心机13,000转/分，离心1分钟)分别从溶解的蛋白质中移去P-淀粉或非磷酸化淀粉。将离心后所得到的上清液再次离心(1分钟，13,000转/分，室温，Eppendorf台式离心机)以便去除所有残余的P-淀粉或非磷酸化淀粉，随后取出上清。因此，获得溶解了的、分别与P-淀粉或非磷酸化淀粉结合的蛋白质。
c)所用缓冲液的组成
SDS试验缓冲液：187.5mM    Tris/HCl pH 6.8
               6％        SDS
               30％       甘油
               ～0.015％  溴酚蓝
               60mM       二硫赤藓糖醇(DTE，新鲜加入！)
Percoll：将Percoll在由和25mM HEPES/KOH，pH 7.0组成的溶液中透析过夜。
9.结合于P-淀粉和/或非磷酸化淀粉的蛋白质的分离
在每一情况下，将关于分别与P-淀粉或非磷酸化淀粉结合的蛋白质的一般方法第8项步骤c)中所得到的已溶解蛋白质于95℃温育5分钟，随后用变性丙烯酰胺凝胶电泳分离。为此，在每一情况下，对于通过与P-淀粉结合得到的已溶解蛋白质以及通过与非磷酸化淀粉结合得到的已溶解蛋白质而言，上样至聚丙烯酰胺凝胶中的体积相等。电泳结束后，用胶态考马斯兰(Roth，Karlsruhe，Roti-Blue Rod.编号：A152.1)将所得凝胶染色至少过夜，随后在30％甲醇、5％乙酸或者25％甲醇中脱色。
10.与P-淀粉和/或非磷酸化淀粉结合的蛋白质鉴定和分离
a)与非磷酸化淀粉相比，具有对P-淀粉增加的结合活性的蛋白质的鉴定
在通过丙烯酰胺凝胶电泳分离并染色(参见以上一般方法第9项)后可见，蛋白质在结合P-淀粉后显示出与结合非磷酸化淀粉后的相应信号相比信号增加；该蛋白质对P-淀粉具有与非磷酸化淀粉相比增加的结合活性。通过这种方式，有可能鉴定出与非磷酸化淀粉相比，具有对P-淀粉增加的结合活性的蛋白质。从丙烯酰胺凝胶中切下与非磷酸化淀粉相比具有对P-淀粉增加的结合活性的蛋白质。
b)鉴定与非磷酸化淀粉相比具有对P-淀粉结合活性增加的蛋白质的氨基酸序列
用胰蛋白酶消化根据步骤a)所鉴定的蛋白质，并且通过MALDI-TOF分析所得到的肽，以确定所得到的肽的质量。胰蛋白酶是序列特异性蛋白酶，即当蛋白质含有特定氨基酸序列时，胰蛋白酶仅在特异性位置内切开有关蛋白质。胰蛋白酶常常切开精氨酸和赖氨酸与另一N端氨基酸的肽键。以这种方式，理论上有可能确定用胰蛋白酶消化氨基酸序列后所产生的全部肽。从氨基酸编码知识在理论上可确定肽，也可以在理论上确定胰蛋白酶消化后所得到的肽的质量。因此可将含有关于理论性胰蛋白酶消化后肽质量信息的数据库(例如NCBInrhttp://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml4.0/msfit.htm；Swissprothttp://cbrg.inf.ethz.ch/Server/MassSearch.html)与用MALDI-TOF-MS所得到的未知蛋白质的肽的实际质量相比较。将在理论上的和/或实际的胰蛋白酶消化后的具有相同肽的质量的氨基酸序列视作完全相同。所提及的数据库既包含功能已知蛋白质的肽的质量，也包含迄今仅假定存在的蛋白质的肽的质量，其中所述假定存在的蛋白质源自从测序计划所得到的核酸序列开始的氨基酸序列。因此，此类假定蛋白质的实际存在和功能几乎未经证实，并且若确实存在某个功能，则这通常仅基于预测而并非基于该功能的实际证明。
从丙烯酰胺凝胶中切下含有根据步骤a)所鉴定的蛋白质的条带；在大约1ml的60％50mM NH4HCO3、40％乙腈中37℃温育大致半小时将所切下的丙烯酰胺块还原并脱色。随后移去脱色溶液并在真空下干燥(例如Speedvac)剩余凝胶。干燥后，加入胰蛋白酶溶液消化凝胶块内含有的蛋白质。37℃消化过夜。消化后，加入少量乙腈(直至丙烯酰胺凝胶染成白色)并且在真空(例如Speedvac)下干燥制备物。干燥完成后，加入恰好量的5％甲酸覆盖已干燥的成分并且将它们在37℃温育数分钟。再次重复乙腈处理及随后的干燥。最后将已干燥的成分溶解于0.1％TFA(三氟乙酸，5μl至10μl)，并大约0.5μl的小份滴加到载体表面。在该载体上还应用等量基质(ε-氰基-4-羟基-肉桂酸)。在基质结晶后，通过MALDI-TOF-MS-MS(例如Burker ReflexTM II，Bruker Daltonic，Bremen)测定肽的质量。获得质量后，在数据库中检索理论性胰蛋白酶消化后所产生的相同质量的氨基酸序列。以这种方式，可鉴定编码优选地结合磷酸化α-1，4-葡聚糖和/或需要P-α-1，4-葡聚糖作为底物的蛋白质的氨基酸序列。
11.用于证明蛋白质的淀粉磷酸化活性的方法
a)蛋白质与P-淀粉和/或非磷酸化淀粉的温育
为证明蛋白质是否具有淀粉磷酸化活性，可将待研究蛋白质与淀粉和放射性标记ATP温育。为此，在500μl磷酸化作用缓冲液中将大约5mgP-淀粉或大约5mg非磷酸化淀粉与待研究的蛋白质(每mg所用淀粉0.01μg至5.0μg)室温下摇动温育10分钟至30分钟。随后添加SDS至浓度为2％(重量/体积)来终止此反应。将各自反应混合物中的淀粉粒离心下来(1分钟，13,000×g)，并用900μl的2％SDS溶液洗涤一次，用2mM ATP溶液洗涤四次，每次900μl。每一洗涤步骤在室温下摇动15分钟进行。每一洗涤步骤后，从各自洗涤缓冲液中离心(1分钟，13,000×g)分离淀粉粒。
此外，当开展证明蛋白质的淀粉磷酸化活性的实验时，作为所谓对照的不含蛋白质或含有灭活蛋白质另外的反应制备物应当如对所述反应制备物相同的方式进行处理。
b)对因酶活性向P-淀粉和/或非磷酸化淀粉中掺入的磷酸残基量的测定
可研究根据步骤a)所得到的淀粉粒中放射性标记磷酸残基的存在。为此，在每一情况下，在100μl水中重悬各淀粉并与3ml闪烁混合物(例如Ready SafeTM，BECKMANN Coulter)混合，随后用闪烁计数器(例如LS6500多功能闪烁计数器，BECKMANN COULTERTM)分析。
c)对优选地使用P-淀粉作为底物的蛋白质的鉴定
根据a)所述的方法，在分开的制备物(一个含有P-淀粉，一个含有非磷酸化淀粉)中温育蛋白质，随后比较根据步骤b)所得到的淀粉磷酸存在值，可以确定与非磷酸化淀粉相比，所述蛋白是否向P-淀粉中掺入更多的磷酸。以这种方式，还可鉴定可向P-淀粉中导入而不向非磷酸化淀粉中导入磷酸的蛋白质。这意味着可鉴定需要已磷酸化的淀粉作为底物用于进一步磷酸化反应的蛋白质。
d)所用缓冲液的组成
磷酸化作用缓冲液：50mM        HEPES/KOH，pH 7.5
                  1mM         EDTA
                  6mM         MgCl2
                  0.01-0.5mM  ATP
                  0.2-2μCi/ml随机化33P-ATP(备选地，还可使用
                  β位内含有特异性标记磷酸残基的ATP)
将与本发明相关的术语“随机化ATP”理解为意思是指在γ位和β位内均含有标记磷酸残基的ATP(Ritte等2002，PNAS 99，7166-7171)。随机化ATP还在科学文献中描述为β/γATP。产生随机化ATP的方法描述如下：
i)随机化ATP的产生
此处所述的通过酶-催化反应产生随机化ATP的方法基于如下反应机制：
第一反应步骤：
γ33P-ATP+AMP+肌激酶→β33P-ADP+ADP
(腺苷-P-P-33P+腺苷-P→腺苷-P-P+腺苷-P-33P)
第二反应步骤：
33P-ADP+ADP+2 PEP+丙酮酸激酶→β33P-ATP+ATP+2丙酮酸盐
(腺苷-P-P+腺苷-P-33P+2 PEP→腺苷-P-P-P+腺苷-P-33P-P+2丙酮酸盐)
反应平衡偏向产物侧，但是尽管如此，该反应产生了由主要的β33P-ATP和一些γ33P-ATP组成的混合物。
ii)第一反应步骤的实施
将γ位内含有33P(Hartmann Analytic，10μCi/μl)标记的磷酸残基的ATP(100μCi，3000Ci/mmol)与2μl肌激酶(来自兔肌肉的AMP-磷酸转移酶；SIGMA，产品号：M3003，3.8mg/ml，1,626单位/mg)在90μl随机化缓冲液中于37℃下温育1小时。随后通过95℃温育12分钟终止反应，然后使用Microcon YM 10滤器(Amicon，Millipore产品号：42407)，通过离心性过滤方式以14,000×g离心至少10分钟纯化反应制备物。
iii)第二反应步骤的实施
向步骤ii)中所得到的滤液中加入2μl丙酮酸激酶(如何制备适宜溶液参见如下)及3μl 50mM PEP(磷酸烯醇丙酮酸)。此反应混合物于30℃温育45分钟，最后通过95℃温育12分钟终止反应。然后离心反应混合物(在Eppendorf台式离心机内以12,000转/分离心2分钟)。移出离心后所得到的含有随机化ATP的上清液，分装并储存于-20℃。
丙酮酸激酶溶液的产生
将15μl丙酮酸激酶(来自兔肌肉，Roche产品号：12815，10mg/ml，25℃时为200单位/mg)离心。弃去上清液，并在27μl丙酮酸激酶缓冲液中溶解沉淀。
iv)所用缓冲液
丙酮酸激酶缓冲液：50mM    HEPES/KOH pH 7.5
                  1mM     EDTA
随机化缓冲液：    100mM   HEPES/KOH pH 7.5
                  1mM     EDTA
                  10％    甘油
                  5mM     MgCl2
                  5mM     KCl
                  0.1mM   ATP
                  0.3mM   AMP
12.蛋白质自身磷酸化作用的证明
为证明蛋白质是否具有自身磷酸化活性，可将待研究蛋白质和放射性标记的ATP温育。为此，在220μl磷酸化作用缓冲液(见以上一般方法第12d)项)中将待研究蛋白质(50μg至100μg)室温摇动温育30分钟-90分钟。随后加入EDTA至0.11M终浓度以终止反应。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(7.5％聚丙烯酰胺凝胶)分离大约2μg至4μg的蛋白质。对聚丙烯酰胺凝胶电泳后所得到的凝胶进行放射自显影。在放射自显影中呈现信号的蛋白质携带放射活性的磷酸残基。
13.对通过淀粉磷酸化蛋白质导入残基磷酸的α-1，4-葡聚糖中葡萄糖分子C-原子位置的鉴定
如下证实α-1，4-葡聚糖中葡萄糖分子的哪个C-原子位置被蛋白质磷酸化：对通过适宜蛋白质在体外获得的磷酸化葡聚糖进行水解，随后分离水解后所得到的葡萄糖单体，最后测量由适宜蛋白质向该葡萄糖分子的某部分中所掺入的磷酸。
a)α-1，4-葡聚糖的完全水解
离心含有α-1，4-葡聚糖的水悬液，随后在0.7M HCl(Baker，分析用)中重悬沉淀并且于95℃摇动温育2小时。温育结束后，短暂冷却样品并离心(例如10.000×g离心2分钟)。转移所得到的上清液至新反应器内并通过加入2M NaOH(Baker，分析用)中和。若仍有沉淀，在100μl水中重悬之，并测定其中存在的标记磷酸的量来作为对照。
随后经10-kDa滤器离心已中和的上清液。通过测量部分的滤液，例如借助闪烁计数器测定此滤液中的标记磷酸的量。
b)水解产物的分级分离和磷酸化C-原子位置的测定
可借助例如高压阴离子交换层析(HPAE)，将通过步骤a)得到的水解产物的中和滤液进行分离(当使用放射性标记的ATP时大约3000cpm)。可用H2O稀释中和滤液以便获得HPAE所需的体积。此外，在每一情况下，向适当滤液中加入作为内部对照的葡萄糖-6-磷酸(大约0.15mM)和葡萄糖-3-磷酸(大约0.3mM)。例如可借助于使用CarboPac PA 100柱(以适宜的预装柱)和脉冲安培检测器(ED 50)的Dionex DX 600 Bio Lc系统通过HPAE方式分离。为此，在注射样品前，首先用99％洗脱液C和1％洗脱液D淋洗此柱10分钟。然后注入60μl体积的样品。样品的洗脱在如下条件中进行：
流速：1ml/分
梯度：从0分钟至30分钟的线性递增
          洗脱液  C洗脱液D
0分钟     99％    1％
30分钟    0％     100％
35分钟    0％     100％
运行终止
将从柱中洗脱的水解产物以1ml的单独级分收集。由于在每一情况下，在所注入的水解产物样品中均加入作为内部对照的非标记葡萄糖-3-磷酸(Ritte等2002，PNAS 99，7166-7171)和非标记葡萄糖-6-磷酸(Sigma，产品号：G7879)，可通过脉冲安培检测确定含有葡萄糖-3-磷酸或葡萄糖-6-磷酸的级分。通过测量单独级分中的标记磷酸的量，随后与含有葡萄糖-3-磷酸或葡萄糖-6-磷酸的级分比较，可以确定含有标记葡萄糖-6-磷酸或标记葡萄糖-3-磷酸的那些级分。测定了所述级分中的标记磷酸的量。现在从单份水解产物中的由标记磷酸所测量的葡萄糖-3-磷酸量对葡萄糖-6-磷酸量的比率中，可以确定α-1，4-葡聚糖磷酸化酶优选地磷酸化哪个C-原子位置。
c)所用缓冲液：
洗脱液C：100mM NaOH
洗脱液D：100mM NaOH
         500mM乙酸钠
14.稻植物的转化
根据Hiei等(1994，Plant Journal 6(2)，271-282)所述的方法转化稻植物。
15.马铃薯植物的转化
如Rocha-Sosa等(EMBO J.8，(1989)，23-29)所述，借助农杆菌转化马铃薯植物。
16.小麦植物的转化
根据Becker等(1994，Plant Journal 5，299-307)所述的方法转化小麦植物。
17.玉米植物的转化
根据Ishida等(1996，Nature Biotechnology 14，745-750)所述的方法转化玉米植物A188系的未成熟胚。
18.淀粉磷酸含量的测定
a)C-6磷酸含量的测定
在淀粉中，葡萄糖单元C2、C3和C6位置可被磷酸化。为测定淀粉的C6-P含量，在500μl 0.7M HCl中将50mg淀粉于95℃水解4小时。随后，在15,500g离心制备物10分钟，取出上清液。混合7μl上清液和193μl咪唑缓冲液(100mM咪唑，pH 7.4；5mM MgCl2，1mM EDTA和0.4mM NAD)。在光度计中于340nm下实施测量。在确定基础吸收后，通过加入2单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(来自肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，Boehringer Mannheim)开始酶反应。吸收的改变与淀粉中G-6-P内容物的浓度成正比。
b)总磷酸含量的测定
根据Ames方法(Methods in Enzymology VIII，(1966)，115-118)进行总磷酸含量的测定。
混合大约50mg淀粉和30μl硝酸镁乙醇溶液，并且在闭式烘箱中于500℃煅烧3小时。残余物与300μl 0.5M盐酸混合并在60℃温育30分钟。随后，向一部分中加入用300μl 0.5M盐酸、100μl 10％抗坏血酸与600μl的2M硫酸中的0.42％钼酸铵的混合物，并在45℃温育20分钟。
c)C-6磷酸和C-3磷酸含量的测定
为测定α-1，4-葡聚糖中葡萄糖分子C-6位和C-3位所结合的磷酸的含量，可根据一般方法第13项中所列的利用完全水解的HPAE方法分离相应葡聚糖。可通过将HPAE分离后所得到的单个峰面积进行积分来确定葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-3-磷酸的量。可通过将未知样品中葡萄糖-6-磷酸的峰面积与已知量的葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-3-磷酸在HPAE分离后所得到的峰面积进行比较来确定待查样品中葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-3-磷酸的量。
实施例
1.与非磷酸化淀粉相比，对P-淀粉表现增加结合活性的来自拟南芥菜的蛋白质的分离
a)来自拟南芥菜的蛋白质提取物的产生
根据一般方法第1项从大约7g拟南芥菜(
Figure 058070802_4
kotyp Columbia，Col-O)的叶(鲜重)中产生蛋白质提取物。
b)拟南芥菜sex1-3突变体叶中淀粉粒的分离
根据一般方法第2项从大约20g拟南芥菜sex1-3突变体的叶(鲜重)中分离了淀粉粒。
c)用纯化的R1蛋白质对从拟南芥菜sex1-3突变体中分离的淀粉进行体外磷酸化
大约30mg的从拟南芥菜sex1-3突变体中分离的非磷酸化淀粉通过根据一般方法第7项中所述方法重组表达于大肠杆菌并纯化的R1蛋白质进行磷酸化。对于R1蛋白质在大肠杆菌中的表达以随后的纯化，使用Ritte等(2002，PNAS 99，7166-7171)所述的方法。
d)与P-淀粉和/或非磷酸化淀粉结合的蛋白质的分离
在制备物A中，使用一般方法第8a项内所述的方法，将根据步骤a)所得到的拟南芥菜蛋白质提取物与50mg根据步骤c)所产生的体外磷酸化的淀粉温育并洗涤。
在第二个制备物B中，使用一般方法第8a项所述方法，将根据步骤a)所得到的拟南芥菜蛋白质提取物与50mg根据步骤b)所产生的非磷酸化淀粉温育并洗涤。
随后，根据一般方法第8b项所述方法，溶解与制备物A中与P-淀粉结合的蛋白质和制备物B中与非磷酸化淀粉结合的蛋白质。
在第三个制备物C中，使用一般方法第8a项所述方法将50mg根据步骤c)所产生的体外磷酸化的淀粉温育并洗涤。
e)通过丙烯酰胺凝胶电泳分离根据步骤d)所得到的蛋白质
使用一般方法第9项所述方法，通过变性条件(SDS)下的9％丙烯酰胺凝胶分离步骤d)中所得到的制备物A、B和C中的蛋白质，随后用考马斯蓝染色。染色凝胶示于图1。可在变性丙烯酰胺凝胶中明显观察到一种与非磷酸化淀粉(K)相比优选地结合磷酸化淀粉(P道)的蛋白质，该蛋白质具有相对蛋白质标准大约130kDa的分子量。
f)与非磷酸化淀粉相比，优选地结合P-淀粉的蛋白质的鉴定
从凝胶内切下在步骤e)中所鉴定的大约130kDa分子量蛋白质的条带。随后如一般方法第10b项中所述，从丙烯酰胺凝胶中释放蛋白质，用胰蛋白酶消化，并且通过MALD-TOF-MS确定所得到的肽的质量。将通过MALDI-TOF-MS获得的所谓“指纹图谱”与数据库(Mascot：http://www.matrixscience.com/search_form_select.html；ProFound：http://129.85.19.192/profound_bin/WebProFound.exe；PepSea：http://195.41.108.38/PepSeaIntro.html)中经理论性消化的氨基酸分子的指纹图谱比较。由于这种指纹图谱对蛋白质极为特异，因此有可能鉴定氨基酸分子。借助该氨基酸分子的序列，有可能分离出来自拟南芥菜的编码OK1蛋白质的核酸序列。用此方法所鉴定的蛋白质命名为A.t.-OK1。对来自拟南芥菜的OK1蛋白质的氨基酸序列分析表明，该氨基酸序列衍生自数据库中存在的序列(NP 198009，NCBI)。在SEQ ID No 2中所示的氨基酸序列编码A.t.-OK1蛋白质。当与数据库中的序列(登录号：NP 198009.1，NCBI)比较时，SEQ ID No 2存在差异。在数据库序列(登录号：NP 198009.1)中不存在SEQ ID No 2中所包含的第519至523位氨基酸(WRLCE)及第762至766位氨基酸(VRARQ)。与数据库序列的第二版(登录号：NP198009.2)比较，SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列还含有额外的第519至523氨基酸(WRLCE)。
2.编码已鉴定OK1蛋白质的cDNA的克隆
使用从拟南芥菜的叶中分离的mRNA，借助逆转录PCR分离A.t.-OK1cDNA。为此，通过逆转录酶(用于RT PCR的SuperScriptTM第一链合成系统，Invitrogen产品号：11904-018)合成cDNA链，随后用DNA聚合酶(Expand高保真PCR系统，Roche产品号：1732641)扩增。在载体pGEM
Figure 058070802_5
-T(Invitrogen产品号：A3600)中克隆通过PCR反应所得到的扩增产物。得到的质粒命名为A.t.-OK1-pGEM，测定编码A.t.-OK1蛋白质的cDNA序列并示于SEQ ID NO.1。
SEQ ID NO 1中所示的序列与数据库中所含的序列不相同。对于编码A.t.-OK1蛋白质的氨基酸序列，这已经有所讨论。
用于扩增编码A.t.-OK1蛋白质的cDNA的条件：
第一链合成：
使用了由制造商指定的条件和缓冲液。此外，用于第一链合成的反应制备物含有如下物质：
3μg    总RNA
5μM    3’-引物(OK1 rev1：5′-GACTCAACCACATAACACACAAAGATC)
0.83uM  dNTP混合物
反应制备物在75℃温育5分钟，随后冷却至室温。
随后加入第一链缓冲液、RNA酶抑制剂和DTT，并且在42℃温育2分钟，随后加入1μL Superscript RT DNA聚合酶，而后此反应制备物在42℃温育50分钟。
通过PCR扩增第一链的条件：
1μL     合成第一链的反应制备物
0.25μM  3’引物(OK1 rev2：5′-TGGTAACGAGGCAAATGCAGA)
0.25μM  5’引物(OK1 fwd2：5′-ATCTCTTATCACACCACCTCCAATG)
反应条件：
步骤195℃，2分钟
步骤2 94℃，20秒
步骤3 62℃，30秒(每一循环温度递减0.67℃)(30秒)，68℃
步骤4 68℃，4分钟
步骤5 94℃，20秒
步骤6 56℃，30秒
步骤7 68℃，4分钟
步骤8 68℃，10分钟
首先按照步骤1至4进行反应。在步骤4和步骤2之间进行10次重复(循环)，步骤3的温度每次循环后降低0.67℃。随后按照步骤5至8中指定的条件进行反应。在步骤7至步骤5之间进行25次重复(循环)，步骤7的时间在每次循环中增加5秒。反应结束后，将反应物冷却至4℃。
3.用于重组表达OK1蛋白质cDNA的载体的产生
利用Gateway技术(Invitrogen)，使用质粒A.t.-OK1-pGEM作为模板通过PCR方法扩增后，在载体pDONORTM 201(Invitrogen产品号：11798-014)中再次克隆来自拟南芥菜的OK1蛋白质的序列。然后通过序列特异性重组在表达载体pDEST17TM(Invitrogen产品号：11803-014)中克隆来自所得到载体中OK1蛋白质的编码区。得到的表达载体命名为A.t.-OK1-pDESTTM17。此克隆导致编码A.t-OK1蛋白质的cDNA与表达载体pDESTTM17中存在的核苷酸翻译性融合。与编码A.t-OK1蛋白质的cDNA翻译性融合的源自载体pDESTTM17的核苷酸编码21个氨基酸。这21个氨基酸当中包含起始密码子(ATG)和所谓His标签(6个组氨酸残基彼此直接相连)。当这些翻译性融合序列翻译后，产生了N末端具有由源自载体的核苷酸所编码的额外21个氨基酸的A.t.-OK1蛋白质。因此，来自该载体的重组A.t.-OK1蛋白质在其N末端含有21个源自载体pDESTTM17的额外氨基酸。
4.OK1蛋白质在大肠杆菌中的异源表达
在大肠杆菌菌株BL21 StarTM(DE3)(Invitrogen，产品号C6010-03)中转化根据实施例3所得到的表达载体A.t.-OK1-pDESTTM17。该表达系统以上已经描述(参见一般方法第3项)。随后使用已转化的含有载体A.t.-OK1-pDESTTM17的细菌克隆制造预备培养物，然后使用该预备培养物接种主要培养物(参见在一般方法第3c项)。均在30℃摇动(250转/分)温育原代培养物和主要培养物。当主要培养物达到OD600大约0.8时，通过加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖呋喃糖苷)至终浓度1mM诱导重组A.t.-OK1蛋白质的表达。添加IPTG后，在30℃摇动(250转/分)温育主要培养物直至达到OD600大约1.8。然后在冰上冷却主要培养物30分钟，随后通过离心(在4℃下，4,000×g离心10分钟)从培养基中分离主要培养物中的细胞。
5.重组表达的OK1蛋白质的纯化
使用一般方法第4项所述方法纯化和浓缩根据实施例4从细胞中所得到的A.t.-OK1蛋白质。
6.OK1蛋白质淀粉磷酸化活性的证明
根据一般方法第11项所述方法证实A.t.-OK1蛋白质的淀粉磷酸化活性。为此，在每一情况下，于含有0.05mM放射性(33P)标记的随机化ATP(总共1,130,00cpm，大约0.55μCi)的500μl磷酸化作用缓冲液中，分别将5μg根据实施例5所产生的已纯化A.t.-OK1蛋白质与制备物A中的5mg根据实施例1b)从拟南芥菜sex1-3突变体中分离的淀粉以及与制备物B中的5mg根据实施例1c)的酶促磷酸化的淀粉室温摇动温育30分钟。用制备物C作为对照，制备物C除了不含OK1蛋白质之外其余成分与制备物B相同，但是接受与制备物A和制备物B相同的处理。对所有制备物(A、B、C)开展两个彼此独立的试验。
使用闪烁计数器，研究来自制备物A、B和C的淀粉中放射性标记磷酸的存在(参见一般方法第11b项)。结果示于表1和图3。
表1：OK1蛋白质的淀粉磷酸化活性的证明
Figure 000011
从所得到结果可以看出，当非磷酸化淀粉作为底物时，OK1蛋白质不能将磷酸基从ATP转移至淀粉，因为以cpm所测量的通过OK1蛋白质转移至非磷酸化淀粉的磷酸基的比例未超过制备物C(对照)中放射性标记的磷酸基的比例。而另一方面，如果提供P-淀粉作为底物，以cpm所测量的从ATP转移至P-淀粉的放射性磷酸基的比例显著较高。因此可认为OK1蛋白质需要P-淀粉作为底物，并且OK1蛋白质不将非磷酸化淀粉作为底物。
如果使用以33P在γ位特异性标记的ATP进行以上所述试验，则不能确定淀粉中放射性标记磷酸的掺入。因此可以看出，ATP的β磷酸残基从OK1蛋白质转移至淀粉。此试验结果示于图6。
7.自身磷酸化作用的证明
通过以上所述的方法(参见一般方法第12项)证明A.t.-OK1蛋白质的自身磷酸化作用。在这里，在220μl磷酸化作用缓冲液(见以上一般方法第12d项)中，将50μg纯化的A.t.-OK1蛋白质与放射性标记的随机化ATP室温摇动温育60分钟。随后从温育制备物中各取出100μl，并转移至四个新反应器内。在反应器1中，通过加入40μl 0.11M EDTA终止反应。反应器2在95℃温育5分钟。向反应器3中加入HCl至终浓度0.5M，并且向反应器4加入NaOH至终浓度0.5M。反应器3和4在30℃分别温育25分钟。随后，从反应器1、2、3和4中各取出50μl与SDS试验缓冲液混合，并通过SDS丙烯酰胺凝胶电泳(7.5％丙烯酰胺凝胶)分离。为此目的，将来自各反应器的样品加到两块完全相同的丙烯酰胺凝胶中的每一块中。电泳结束后，两块凝胶中的一块进行放射自显影，而第二块凝胶用考马斯蓝染色。
在考马斯蓝染色的凝胶(参见图2A)中，可清楚地看到，用0.5M NaOH处理导致OK1蛋白质的降解。因此，OK1蛋白质对NaOH不稳定。在30℃、95℃并存在0.5M HCl时的温育显示，在所述温育条件下OK1蛋白质相对稳定。从该事实可以得出结论：在这些温育条件下，可在考马斯蓝染色后的凝胶中证明在每一情况下OK1蛋白质的量大致相同。
在放射自显影(参见图2B)中，可以看出，与30℃下温育的磷酸化OK1蛋白质相比，在95℃下温育磷酸化OK1蛋白质导致与OK1蛋白质结合的磷酸显著减少。因此磷酸残基与OK1蛋白质的氨基酸间的键为热不稳定的。此外，与30℃下温育磷酸化OK1蛋白相比，用0.5M HCl和0.5MNaOH温育也导致结合于OK1蛋白质的磷酸稍微减少。如果考虑到以下事实，即由于OK1蛋白质对NaOH的不稳定性，用0.5M NaOH处理后的OK1蛋白质在放射自显影中的量显著低于用热和酸处理样品中OK1蛋白质的量，则可以得出结论：磷酸残基与OK1蛋白质的氨基酸间的键对于碱相对稳定。因为用酸所处理的样品与在30℃和95℃下所温育的样品中含有大致相同量的蛋白质，但在放射自显影中用酸所处理的样品中的信号却显著低于在30℃下处理样品中的信号，必须假定酸温育条件也在某种程度上使磷酸残基与OK1蛋白质的氨基酸之间键断裂。因此在所开展的试验中证实了磷酸残基与OK1蛋白质的氨基酸之间键的不稳定性。与此同时，这种对酸的不稳定性显著低于对热的不稳定性。
组氨酸与磷酸之间的键是热不稳定性的、酸不稳定性的，但是是碱稳定性的(Rosenberg，1996，Protein Analysis and Purification，Birkh
Figure 058070802_6
user，Boston，242-244)。因此，以上所述结果说明磷酸组氨酸通过OK1蛋白质的自身磷酸化作用产生。
如果将如上所述的重组性表达的OK1蛋白质与γ位经33P特异性标记的ATP温育，未能检测到自身磷酸化作用。图5A显示了通过适宜温育步骤后的蛋白质印迹分析显示的各反应制备物中蛋白质的量。图5B显示了来自各反应制备物中的蛋白质的放射自显影。可以看出，当使用γ位内特异性标记的ATP时，没有发生OK1蛋白质的自身磷酸化作用，而当使用随机化ATP时，可证实自身磷酸化作用。这意味着，当OK1蛋白质自身磷酸化时，ATP中的β位磷酸残基与OK1蛋白质的氨基酸共价性结合。
8.受OK1蛋白质磷酸化的淀粉中葡萄糖分子C-原子位置的证实
a)磷酸化淀粉的产生
根据一般方法第7项产生磷酸化淀粉。为此目的，将5mg从拟南芥菜sex1-3突变体叶中分离的非磷酸化淀粉与制备物A中25μg纯化的A.t.-OK1蛋白质反应，并且将5mg的体外磷酸化的淀粉(最初自拟南芥菜sex1-3突变体叶中分离)与第二种制备物B中的5μg纯化的R1蛋白质反应。在每一情况下，于500μl含有33P标记的ATP(大约2.5×106cpm)的磷酸化作用缓冲液中室温摇动温育1小时进行反应。此外，使用含有5mg从拟南芥菜sex1-3突变体叶中分离的淀粉及所述磷酸化作用缓冲液，但不含蛋白质的对照制备物。完全如同制备物A和制备物B那样处理该对照制备物。在每一情况下，各反应通过加入125μl 10％SDS终止，并且用2％SDS洗涤一次、用2mM ATP洗涤五次、用H2O洗涤两次，每次均900μl。每一洗涤步骤后均离心(每次均在Eppendorf台式离心机内以13,000转/分离心2分钟)。每一情况下在1ml H2O中重悬所得到的淀粉沉淀，向100μl的每一制备物中加入3ml闪烁混合物(Ready SafeTM，BECKMANN)并混合，随后用闪烁计数器(LS 6500多功能闪烁计数器，BECKMANNCOULTERTM)测量制备物。
测量结果如下：
对照：        63cpm/100μL      630cpm/1000μl
制备物A(OK1)：1351cpm/100μl    13512cpm/1000μl
制备物B(R1)：3853cpm/100μl    38526cpm/1000μl
b)P-淀粉的完全水解
再次离心(在Eppendorf台式离心机中以13,000转/分离心5分钟)根据步骤a)所得到的制备物A、B和C的悬液，在90μl 0.7M HCl(Baker，分析用)中重悬所得到的沉淀，随后在95℃温育2小时。然后再次离心(在Eppendorf台式离心机中以13,000转/分离心5分钟)制备物A、B和C，并将上清液转移至新反应器内。在每一情况下，在100ml H2O中重悬所沉淀的制备物残余物，并且在加入3ml闪烁混合物(Ready SafeTM，BECKMANN)后用闪烁计数器(LS 6500多功能闪烁计数器，BECKMANNCOULTERTM)测量。在任何残余物中均没有显著量的放射性，这意味着所有放射性磷酸标记的水解产物均位于上清液内。
随后，通过在每一情况下加入30μl 2M NaOH(事先在盲样中测试了中和所需的NaOH量)中和含有水解产物的各上清液。将已中和的水解产物置于事先用H2O淋洗两次(每次200μl)的10kDa Microcon滤器内，并在Eppendorf台式离心机中以12,000转/分离心大约25分钟。从所得到的滤液(每份滤液大约120μl)中取出10μl，并且在加入3ml闪烁混合物(Ready SafeTM，BECKMANN)后用闪烁计数器(LS 6500多功能闪烁计数器，BECKMANN COULTERTM)测量。测定存在于各制备物中的活性结果如下：
制备物A(OK1)：934cpm/10μl  11,208cpm/120μl  93cpm/μl
制备物B(R1)：2518cpm/10μl  30,216cpm/120μl  252cpm/μl
c)水解产物的分离
使用Dionex系统在以上所述的条件下(参见一般方法第13c项)，通过HPAE方式分离根据步骤b)所得到的水解产物。用于分离根据步骤b)所得到制备物A和制备物B的已过滤上清液的样品组成如下：
制备物A(OK1)：根据步骤b)所得到的制备物A的上清液43μl(相当于大约4,000cpm)、32μl H2O、2.5μl 2.5mM葡萄糖-6-磷酸和2.5μl 5mM葡萄糖-3-磷酸(总体积＝80μl)。
制备物B(R1)：根据步骤b)所得到的制备物B的上清液16μl(相当于大约4,000cpm)、59μl H2O、2.5μl 2.5mM葡萄糖-6-磷酸和2.5μl 5mM葡萄糖-3-磷酸(总体积＝80μl)。
在每一情况下，为通过HPAE分离，注射含有大约3,000cpm的60μl适宜样品。根据23c项指定的条件进行HPAE。在通过HPAE柱后，按每一级分1ml收集洗脱缓冲液。注射样品后10分钟开始收集级分。基于从所用PAD检测器接收到的信号，指定葡萄糖-6-磷酸的洗脱为级分15并指定葡萄糖-3-磷酸的洗脱为级分17。在每一情况下，将500μl各级分与3ml闪烁混合物(Ready SafeTM，BECKMANN)混合，随后用闪烁计数器(LS6500多功能闪烁计数器，BECKMANN COULTERTM)测量。对各级分的测量结果如下：
表4：通过水解由OK1蛋白质或R1蛋白质所磷酸化的淀粉
所得到的水解产物各级分中测定的放射性的数量[cpm]
每一级分中的总cpm
Figure 000021
本结果还以图的方式示于图5。
淀粉经R1蛋白质催化磷酸化，在淀粉水解后，占所分析级分中测定的总放射性磷酸大约66％的放射性标记磷酸随含有葡萄糖-6-磷酸作为标准物的级分洗脱，而占大约27％的放射性标记磷酸随含有葡萄糖-3-磷酸作为标准物的级分洗脱。淀粉经OK1蛋白质催化磷酸化，在淀粉水解后，占所分析级分中测定的总放射性磷酸大约67％的放射性标记磷酸随含有葡萄糖-3-磷酸作为标准物的级分洗脱，而占大约8％的放射性标记磷酸随含有葡萄糖-6-磷酸作为标准物的级分洗脱。由此可得出结论：R1蛋白质优选在C-6位磷酸化淀粉中的葡萄糖分子，而OK1蛋白质优选在C-3位磷酸化淀粉中的葡萄糖分子。
9.稻中的OK1蛋白质的鉴定
使用一般方法第1至13项中所述的方法，还鉴定出稻(M202变种)中的可将磷酸残基转移至P-淀粉的蛋白质。该蛋白质命名为O.s.-OK1。O.s.-OK1蛋白质不能用非磷酸化淀粉作为底物，即O.s.-OK1蛋白质也不需要P-淀粉作为底物。在SEQ ID NO 3中显示了所鉴定O.s.-OK1蛋白质的核酸序列，并且在SEQ ID NO.4中显示了编码O.s.-OK1蛋白质的氨基酸序列。SEQ ID NO 4中所示编码O.s.-OK1蛋白质的氨基酸序列与SEQID NO 2中所示编码A.t.-OK1蛋白质的氨基酸序列具有57％的同一性。SEQ ID NO 3中所示编码O.s.-OK1蛋白质的核酸序列与SEQ ID NO1中所示编码A.t.-OK1蛋白质的核酸序列具有61％的同一性。
含有编码来自稻OK1蛋白质的核酸序列的质粒pMI50的产生
载体pMI50含有编码来自稻M202变种的完整OK1蛋白质的DNA片段。
以如下5个步骤从稻中扩增此DNA。
使用合成的寡核苷酸Os_ok1-R9(GGAACCGATAATGCCTACATGCTC)和Os_ok1-F6(AAAACTCGAGGAGGATCAATGACGTCGCTGCGGCCCCTC)作为引物，借助逆转录酶和聚合酶链式反应从非成熟的稻种子的RNA中扩增了SEQ DIE NO 3中指定序列第11位至第288位的部分可读框。在载体pCR2.1(Invitrogen产品目录号K2020-20)中克隆所扩增的DNA片段。得到的质粒命名为pML123。
使用合成的寡核苷酸Os_ok1-F4(CCAGGTTAAGTTTGGTGAGCA)和Os_ok1-R6(CAAAGCACGATATCTGACCTGT)作为引物，借助逆转录酶和聚合酶链式反应从非成熟的稻种子的RNA中扩增了SEQ DIE NO 3中指定序列第250位至第949位的部分可读框。在载体pCR2.1(Invitrogen产品目录号K2020-20)中克隆所扩增的DNA片段。得到的质粒命名为pML120。
使用合成的寡核苷酸Os_ok1-F7(TTGTTCGCGGGATATTGTCAGA)和Os_ok1-R7(GACAAGGGCATCAAGAGTAGTATC)作为引物，借助逆转录酶和聚合酶链式反应从非成熟的稻种子的RNA扩增了SEQ DIE NO 3中指定序列第839位至第1761位的部分可读框。在载体pCR2.1(Invitrogen产品目录号K2020-20)中克隆所扩增的DNA片段。得到的质粒命名为pML121。
使用合成的寡核苷酸Os_ok1-F8(ATGATGCGCCTGATAATGCT)和Os_ok1-R4(GGCAAACAGTATGAAGCACGA)作为引物，借助逆转录酶和聚合酶链式反应从非成熟的稻种子的RNA中扩增了SEQ DIE NO 3中指定序列第1571位至第3241位的部分可读框。在载体pCR2.1(Invitrogen产品目录号K2020-20)中克隆所扩增的DNA片段。得到的质粒命名为pML119。
使用合成的寡核苷酸Os_ok1-F3(CATTTGGATCAATGGAGGATG)和Os_ok1-R2(CTATGGCTGTGGCCTGCTTTGCA)作为引物，借助逆转录酶和聚合酶链式反应从稻基因组DNA扩增了从第2777位至第3621位的部分可读框。在载体pCR2.1(Invitrogen产品目录号K2020-20)中克隆所扩增的DNA片段。得到的质粒命名为pML122。
如下将OK1可读框的各部分克隆在一起：
将含部分OK1可读框的700个碱基对长的pML120 ApaI片段克隆到pML121的ApaI位点内。得到质粒命名为pMI47。
通过聚合酶链式反应扩增了含有来自pML120和pML123载体的编码OK1区域的960个碱基对长的片段。为此，使用浓度均为50nm的引物Os_ok1-F4(见上)和Os_ok1-R9(见上)以及浓度均为500nm的引物Os_ok1-F6和Os_ok1-R6。将所扩增的DNA片段克隆到载体pCR2.1(Invitrogen产品目录号K2020-20)中。得到的质粒命名为pMI44。
为了在终止密码子后导入XhoI位点，使用引物Os_ok1-F3(见上)和Os_ok1-R2Xho(AAAACTCGAGCTATGGCTGTGGCCTGCTTTGCA)再次扩增pML122中的845个碱基对长的片段并克隆到载体pCR2.1(Invitrogen产品目录号K2020-20)中。得到的质粒命名为pMI45。
通过限制性酶SpeI和PstI消化，从pML119中获得含有部分的OK1可读框的长1671个碱基对的片段。在pBluescript II SK+(Genbank登录号：X52328)中克隆此片段。得到的质粒命名为pMI46。
用限制性酶SpeI和XhoI从pMI46中切下含有部分的OK1可读框的长1706个碱基对的片段并克隆到已用相同限制性酶切开的载体pMI45内中。得到的质粒命名为pMI47。
用限制性酶AflII/NotI从pMI43中切下含有部分的OK1可读框的长146个碱基对的片段并克隆到已用相同限制性酶切开的载体pMI44中。得到的质粒命名为pMI49。
用限制性酶NotI和NarI从载体pMI49切下含有部分的OK1可读框的长1657个碱基对的片段并克隆到已用相同限制性酶切开的载体pMI47中。得到的质粒命名为pMI50并含有已鉴定的稻OK1蛋白质的完整编码区。
10.特异性识别OK1蛋白质的抗体的产生
通过SDS凝胶电泳分离作为抗原的大约100μg纯化的A.t.-OK1蛋白质。将含有A.t.-OK1蛋白质的蛋白质条带切下并送至EUROGENTECS.A.(Belgium)公司，根据合同进行抗体生产。接着，检查兔的免疫前血清以研究其是否在用重组OK1免疫前已经检测到来自A.t.总提取物中的蛋白质。在两只兔的免疫前血清中均未检测到100-150kDa范围的蛋白质，因而选择用于免疫。每只兔注射100μg蛋白质(标签0、14、28、56)，共4次。从每只兔中共采取4份血样(标签38、标签66、标签87和最后采血)。在第一次采血后得到的血清已经在蛋白质印迹中显示对OK1抗原的特异性反应。然而，在所有其它试验中使用最后采集的兔血清。
11.具有增加的OK1蛋白质活性的转基因稻植物的产生
a)pGlo-A.t.-OK1质粒的产生
使用引物glb1-F2(AAAACAATTGGCGCCTGGAGGGAGGAGA)和glb1-R1(AAAACAATTGATGATCAATCAGACAATCACTAGAA)，通过聚合酶链式反应(94℃，20秒；62℃，20秒；68℃，1分钟；30个循环；含4mM Mg2SO4)利用高保真Taq聚合酶(Invitrogen产品目录号11304-011)从稻M202变种的基因组DNA中扩增稻的球蛋白基因启动子，并在pCR2.1(Invitrogen产品目录号K2020-20)中克隆获得了质粒pIR94。
将由寡核苷酸X1(TGCAGGCTGCAGAGCTCCTAGGCTCGAGTTAACACTAGTAAGCTTAATTAAGATATCATTTAC)和X2(AATTGTAAATGATATCTTAATTAAGCTTACTAGTGTTAACTCGAGCCTAGGAGCTCTGCAGCCTGCA)组成的合成性DNA克隆到在已用SdaI和MunI切开的载体pGSV71中获得了质粒pIR115。
用SdaI切开所得到的质粒pIR115，其突出的3’末端用T4 DNA聚合酶补平，并将经T4 DNA聚合酶补平并含有根癌农杆菌的章鱼碱合酶基因终止信号的pBinAR(H
Figure 058070802_7
fgen和Willmitzer，1990，Plant Science 66，221-230)的197个碱基对大小的HindII/SphI片段插入。得到的质粒命名为pIR96。
将pIR94中含有稻球蛋白基因启动子的长986个碱基对的DNA片段克隆到质粒pIR96中，获得质粒pIR103。
pGSV71是中间载体pGSV1衍生的质粒pGSV7的衍生物。pGSV1是pGSC1700的衍生物，其构建已由Cornelissen和Vanderwiele(Nucliecacid Research 17，(1989)，19-25)描述。通过从pGSC1700中缺失羧苄青霉素抗性基因和缺失质粒pTiB6S3中TL-DNA区域的T-DNA序列获得pGSV1。
pGSV7含有质粒pBR322(Bolivar等，Gene 2，(1977)，95-113)的复制起点及假单胞菌(Pseudomonas)质粒pVS1(Itoh等，Plasmid 11，(1984)，206)的复制起点。pGSV7还含有来自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)转座子Tn1331的可提供抗壮观霉素和链霉素抗性的选择标记基因aadA(Tolmasky，Plasmid 24(3)，(1990)，218-226；Tolmasky和Crosa，Plasmid 29(1)，(1993)，31-40)。
通过在pGSV7的边界区域间克隆嵌合性bar基因获得质粒pGSV71。嵌合性bar基因含有用于启动转录的花椰菜花叶病毒启动子序列(Odell等，Nature 313，(1985)，180)、来自吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)bar基因(Thompson等，Embo J.6，(1987)，2519-2523)和用于终止转录和多聚腺苷酸化的pTiT37的T-DNA中的胭脂碱合酶基因3’-非翻译区。bar基因提供对除草剂草铵膦的抗性。
从载体A.t.-OK1-pGEM中切下含有来自拟南芥菜OK1蛋白质的完整可读框序列的DNA片段并克隆到载体pIR103中。为此目的，用限制性酶Bsp120I切割质粒A.t.-OK1-pGEM，用T4-DNA聚合酶补平，并且再用Sal I切开。将编码来自拟南芥菜的OK1蛋白质的DNA片段克隆到已经用Ecl136II和XhoI切开的载体pIR103中。得到的质粒命名为pGlo-A.t.-OK1。
b)稻植物的转化
使用Hiei等(1994，Plant Journal 6(2)，271-282)所述的方法，用农杆菌(含有质粒pGlo-A.t.-OK1)转化稻植物(M202变体)。
c)对转基因稻植物及其所合成淀粉的分析
通过定量RT-PCR分析，有可能鉴定显示出编码A.t.-OK1蛋白质的mRNA表达的植物。
将与相应野生植物相比表现出可检测量的编码A.t.-OK1蛋白质的mRNA的植物在温室中生长，收获这些植物的颖果。从这些成熟的颖果中分离的淀粉与从相应野生植物的颖果中分离的淀粉相比，与淀粉结合的磷酸含量增加。
12.具有增加的OK1蛋白质活性的转基因马铃薯植物的产生
a)质粒pBinB33-Hyg的产生
以质粒pBinB33为基础，切下含有B33启动子、一部分的多接头和ocs-止子的EcoRI-HindIII片段并与相应地已切开的载体pBIB-Hyg(Becker，1990，Nucl.Acids Res.18，203)连接。将来自马铃薯patatin基因B33启动子(Rocha-Sosa等，1989)的DraI片段(核苷酸-1512-+14)与经SstI切割并用T4 DNA聚合酶补平的载体pUC19连接，获得质粒pBinB33。这导致产生质粒pUC19-B33。用EcoRI和SmnaI从该质粒中切下B33启动子并与相应地已切开的载体pBinAR(H
Figure 058070802_8
fgen和Willmitzer，1990，Plant Science 66，221-230)连接。这导致产生植物表达载体pBinB33。
b)载体A.t.-OK1-pBinB33-Hyg的产生
用限制性核酸内切酶Bsp120I和SalI从质粒A.t.-OK1-pGEM中切下A.t.-OK1蛋白质的编码序列并与已用SmaI和SalI切开的载体pBinB33-Hyg连接。得到的质粒命名为A.t.-OK1-pBinB33-Hyg。
c)马铃薯植物的转化
用质粒A.t.-OK1-pBinB33-Hyg转化根癌农杆菌(GV2260株)。随后根据Rocha-Sosa等(EMBO J.8，(1989)，23-29)所述的方法，借助含有质粒A.t.-OK1-pBinB33-Hyg的根癌农杆菌转化马铃薯的Désirée变体并使该植物再生。从该转化中所获得的植株命名为385JH。
d)对转基因马铃薯植物及其所合成淀粉的分析
通过RNA印迹分析，有可能鉴定显示出编码A.t.-OK1蛋白质的mRNA表达的转化植物385JH。
用实施例10中所述抗体进行的蛋白质印迹分析证实，在转化植株385JH中已检测到OK1蛋白质的mRNA的异源性表达，并且与未经转化的野生型植物相比，其表现出OK1蛋白质的量增加。图7示范性显示了通过蛋白质印迹分析检测到来自转化植株385JH的单个植物中的A.t.-OK1蛋白质。为了在叶组织内诱导B33启动子，将转化植株385JH的单一株系在组织培养箱中于含有100mM蔗糖的固化Musharige Skoog培养基上培养2天。收获后，根据一般方法第1a)项中所述方法从这些植物的叶组织中产生蛋白质提取物。通过变性丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质后，使用实施例第10项中所述的抗体，通过蛋白质印迹分析对来自每一株系中的40μg蛋白质提取物进行分析。作为对照样品，还分析了来自拟南芥菜植物和来自马铃薯野生型植物(Désirée栽培变种)的蛋白质提取物。
将表现出增加量的OK1蛋白质和可检测量的编码A.t.-OK1蛋白质的mRNA的植物生长于温室中。从这些植物的块茎中分离的淀粉中，与相应淀粉共价结合的磷酸含量增加。
13.具有OK1蛋白质活性增加的转基因玉米植物的产生。
a)pUbi-A.t.-OK1质粒的产生
首先产生质粒pIR96。将由两种寡核苷酸X1(TGCAGGCTGCAGAGCTCCTAGGCTCGAGTTAACACTAGTAAGCTTAATTAAGATATCATTTAC)和X2(AATTGTAAATGATATCTTAATTAAGCTTACTAGTGTTAACTCGAGCCTAGGAGCTCTGCAGCCTGCA)组成的一段合成性DNA克隆到已用SdaI和MunI切开的载体pGSV71中，获得质粒pIR96。用SdaI切开所得到的质粒，并用T4 DNA聚合酶将其突出的3’末端补平，并将含有来自根癌农杆菌的章鱼碱合酶基因终止信号的、已用T4 DNA聚合酶补平的197个碱基对大小的pBinAR(Hfgen和Willmitzer，1990，Plant Science 66，221-230)HindIII/SphI片段插入。得到的质粒命名为pIR96。
pGSV71是由中间载体pGSV1所衍生质粒pGSV7的衍生物。pGSV1是pGSC1700的衍生物，其已由Cornelissen和Vanderwiele(Nucliec acidResearch 17，(1989)，19-25)描述。通过从pGSC1700中缺失羧苄青霉素抗性基因和缺失质粒pTiB6S3中TL-DNA区域的T-DNA序列获得pGSV1。
pGSV7含有质粒pBR322(Bolivar等，Gene 2，(1977)，95-113)的复制起点及假单胞菌质粒pVS1(Itoh等，Plasmid 11，(1984)，206)的复制起点。pGSV7还含有来自肺炎克雷伯氏菌转座子Tn1331的可提供抗壮观霉素和链霉素抗性的选择标记基因aadA(Tolmasky，Plasmid 24(3)，(1990)，218-226；Tolmasky和Crosa，Plasmid 29(1)，(1993)，31-40)。
通过在pGSV7的边界区域间克隆嵌合性bar基因获得质粒pGSV71。嵌合性bar基因含有用于启动转录的花椰菜花叶病毒启动子序列(Odell等，Nature 313，(1985)，180)、来自吸水链霉菌bar基因(Thompson等，Embo J.6，(1987)，2519-2523)和用于终止转录和多聚腺苷酸化的pTiT37的T-DNA中的胭脂碱合酶基因3’-非翻译区。bar基因提供对除草剂草铵膦的抗性。
将含有玉米多聚遍在蛋白基因启动子(来自玉米的基因(Gens ausMais)，EMBL登录号：94464，Christensen等，1992，Plant Mol.Biol.18：675-689)的1986个碱基长的PstI片段克隆到pBluescript II SK+中。得到的质粒命名为pSK-ubq。
用限制性酶Bsp120I切开质粒A.t.-OK1-pGEM，其末端用T4-DNA聚合酶补平，并且用SacI再次切开。将编码来自拟南芥菜的OK1蛋白质的DNA片段克隆到已用SmaI和SacI切开的质粒pSK-ubq中。得到的质粒命名为pSK-ubq-ok1。
从质粒pSK-ubq-ok1中分离含有玉米遍在蛋白启动子和拟南芥菜A.t.-OK1蛋白质完整可读框的片段。为此目的，用限制性酶Asp718I切开该质粒，末端用T4-DNA聚合酶补平，并且用SdaI再次切开。将所得到的5799个碱基对的大片段克隆到已用EcoRV和PstI用切开的质粒pIR96中。从该克隆中得到的质粒命名为pUbi-A.t.-OK1。
b)玉米植物的转化
使用一般方法第17项中所述方法用质粒pUbi-A.t.-OK1转化玉米植物。
c)对转基因玉米植物及其所合成淀粉的分析
使用RNA印迹分析可鉴定显示出编码A.t.-OK1蛋白质的mRNA表达的植物。
将与相应野生植物相比，显示出可检测量的编码A.t.-OK1蛋白质的mRNA的玉米植物生长于温室中。收获这些植物的单个颖果。从这些颖果中分离的淀粉与从相应野生植物的颖果中分离的淀粉相比，结合于相应淀粉的磷酸含量增加。
14.具有增加的OK1蛋白质活性的转基因小麦植物的产生
a)用于转化小麦植物的质粒的产生
用BglII和BamHI消化pMCS5(Mobitec，www.mobitec.de)并再次插入。得到的质粒命名为pML4。
用引物P9(ACTTCTgCAgCggCCgCgATCgTTCAAACATTTggCAATAAAgTTTC)和P10(TCTAAgCTTggCgCCgCTAgCAgATCTgATCTAgTAACATAgATgACACC)扩增(25个循环；94℃，30秒；58℃，30秒；72℃，30秒)来自根癌农杆菌的nos终止子(Depicker等，1982，Journal ofMolecular and Applied Genetics 1：561-573)，用HindIII和PstI消化，并克隆到已用相同酶切开的质粒pML4中。得到的质粒命名为pML4-nos。将含有玉米多聚遍在蛋白基因启动子(Genbank登录号：94464，Christensen等，1992，Plant Mol.Biol.18：675-689)和经ClaI消化缩短并再次插入的玉米多聚遍在蛋白基因第一内含子的长1986个碱基对的长片段克隆到该载体中。得到的质粒命名为pML8。
将拟南芥菜OK1的完整可读框克隆到质粒pML8中。为此目的，用Bsp120/NotI从A.t.-OK1-pGEM中切下相应片段，并以“有义”方向连接到pML8的NotI位点中。
用限制性酶AvrII和SwaI从所得到的pML8-A.t.-OK1载体中切下用于转化小麦植物的片段，其含有玉米多聚遍在蛋白基因启动子、拟南芥菜OK1的完整可读框和根癌农杆菌的nos终止子。
b)小麦植物的转化
根据Becker等(1994，Plant Journal 5，299-307)所述的生物射弹方法，使用从琼脂糖凝胶中纯化的片段和质粒pGSV71转化佛罗里达变种小麦，其中所述片段由限制性酶AvrII和SwaI从质粒pML8-A.t.-OK1中切下并含有玉米多聚遍在蛋白基因启动子、拟南芥菜OK1的完整可读框和根癌农杆菌的nos终止子。
c)对转基因小麦植物及其所合成淀粉的分析
从所述转化中所得T0植物的成熟颖果中分离了淀粉，并测定了与淀粉共价结合的磷酸的含量。从单个颖果中分离的淀粉磷酸含量明显高于从相应野生植物颖果中分离的淀粉磷酸含量。
序列表
<110>拜尔作物科学有限公司(Bayer CropScience GmbH)
<120>具有增加的淀粉磷酸化酶活性的植物
<130>BCS 04-5002-PCT
<150>EP04090086.2
<151>2004-03-05
<150>US60/549,945
<151>2004-03-05
<150>US60/549,945临时的
<151>2004-03-05
<150>EP04090121.7
<151>2004-03-29
<160>5
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>3591
<212>DNA
<213>拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(3591)
<223>
<400>1
atg gag agc att ggc agc cat tgt tgc agc tct cct ttc acc ttc atc       48
Met Glu Ser Ile Gly Ser His Cys Cys Ser Ser Pro Phe Thr Phe Ile
1               5                   10                  15
act aga aac tca tca tca tca ctt cct aga ctc gtt aac atc act cac       96
Thr Arg Asn Ser Ser Ser Ser Leu Pro Arg Leu Val Asn Ile Thr His
            20                  25                  30
aga gtt aat ctc agc cac caa tct cac cga ctc aga aac tcc aat tct      144
Arg Val Asn Leu Ser His Gln Ser His Arg Leu Arg Asn Ser Asn Ser
        35                  40                  45
cgt ctc act tgc act gct act tct tct tcc acc att gag gaa caa cgg      192
Arg Leu Thr Cys Thr Ala Thr Ser Ser Ser Thr Ile Glu Glu Gln Arg
    50                  55                  60
aag aag aaa gat gga tca gga acg aaa gtg agg ttg aat gtg agg tta      240
Lys Lys Lys Asp Gly Ser Gly Thr Lys Val Arg Leu Asn Val Arg Leu
65                  70                  75                  80
gat cat caa gtt aat ttt ggt gac cat gtg gct atg ttt gga tca gct      288
Asp His Gln Val Asn Phe Gly Asp His Val Ala Met Phe Gly Ser Ala
                85                  90                  95
aaa gag att ggt tca tgg aaa aag aaa tcg cct ttg aat tgg agt gag      336
Lys Glu Ile Gly Ser Trp Lys Lys Lys Ser Pro Leu Asn Trp Ser Glu
            100                 105                 110
aat gga tgg gtt tgt gag ttg gaa ctt gac ggt ggt cag gtt ttg gag      384
Asn Gly Trp Val Cys Glu Leu Glu Leu Asp Gly Gly Gln Val Leu Glu
        115                 120                 125
tat aag ttt gtc att gtt aag aat gat ggt tca ctt tca tgg gaa tct      432
Tyr Lys Phe Val Ile Val Lys Asn Asp Gly Ser Leu Ser Trp Glu Ser
    130                 135                 140
ggt gat aat cgt gtc ctt aag gtt cca aat tct ggg aat ttt tct gtt      480
Gly Asp Asn Arg Val Leu Lys Val Pro Asn Ser Gly Asn Phe Ser Val
145                 150                 155                 160
gtt tgt cat tgg gat gct act aga gaa acc ctt gat ttg cct cag gag      528
Val Cys His Trp Asp Ala Thr Arg Glu Thr Leu Asp Leu Pro Gln Glu
                165                 170                 175
gtt ggt aat gat gat gat gtt ggt gat ggt ggg cat gag agg gat aat      576
Val Gly Asn Asp Asp Asp Val Gly Asp Gly Gly His Glu Arg Asp Asn
            180                 185                 190
cat gat gtt ggt gat gat aga gta gtg gga agt gaa aat ggt gcg cag      624
His Asp Val Gly Asp Asp Arg Val Val Gly Ser Glu Asn Gly Ala Gln
        195                 200                 205
ctt cag aag agt aca ttg ggt ggg caa tgg caa ggt aaa gat gcg tcc      672
Leu Gln Lys Ser Thr Leu Gly Gly Gln Trp Gln Gly Lys Asp Ala Ser
    210                 215                 220
ttt atg cgt tct aat gat cat ggt aac aga gaa gtt ggt aga aat tgg      720
Phe Met Arg Ser Asn Asp His Gly Asn Arg Glu Val Gly Arg Asn Trp
225                 230                 235                 240
gat act agt ggt ctt gaa ggc aca gct ctt aag atg gtt gag ggt gat      768
Asp Thr Ser Gly Leu Glu Gly Thr Ala Leu Lys Met Val Glu Gly Asp
                245                 250                 255
cgc aac tct aag aac tgg tgg aga aag ctt gaa atg gta cgc gag gtt      816
Arg Asn Ser Lys Asn Trp Trp Arg Lys Leu Glu Met Val Arg Glu Val
            260                 265                 270
ata gtt ggg agt gtt gag agg gag gaa cga ttg aag gcg ctc ata tac      864
Ile Val Gly Ser Val Glu Arg Glu Glu Arg Leu Lys Ala Leu Ile Tyr
        275                 280                 285
tct gca att tat ttg aag tgg ata aac aca ggt cag att cct tgt ttt      912
Ser Ala Ile Tyr Leu Lys Trp Ile Asn Thr Gly Gln Ile Pro Cys Phe
    290                 295                 300
gaa gat gga ggg cat cac cgt cca aac agg cat gcc gag att tcc aga      960
Glu Asp Gly Gly His His Arg Pro Asn Arg His Ala Glu Ile Ser Arg
305                 310                 315                 320
ctt ata ttc cgt gag ttg gag cac att tgc agt aag aaa gat gct act     1008
Leu Ile Phe Arg Glu Leu Glu His Ile Cys Ser Lys Lys Asp Ala Thr
                325                 330                 335
cca gag gaa gtg ctt gtt gct cgg aaa atc cat ccg tgt tta cct tct     1056
Pro Glu Glu Val Leu Val Ala Arg Lys Ile His Pro Cys Leu Pro Ser
            340                 345                 350
ttc aaa gca gag ttt act gca gct gtc cct cta act cgg att agg gac     1104
Phe Lys Ala Glu Phe Thr Ala Ala Val Pro Leu Thr Arg Ile Arg Asp
        355                 360                 365
ata gcc cat cgg aat gat att cct cat gat ctc aag caa gaa atc aag     1152
Ile Ala His Arg Asn Asp Ile Pro His Asp Leu Lys Gln Glu Ile Lys
    370                 375                 380
cat acg ata caa aat aag ctt cac cgg aat gct ggt cca gaa gat cta     1200
His Thr Ile Gln Asn Lys Leu His Arg Asn Ala Gly Pro Glu Asp Leu
385                 390                 395                 400
att gca aca gaa gca atg ctt caa cga att acc gag acc cca gga aaa     1248
Ile Ala Thr Glu Ala Met Leu Gln Arg Ile Thr Glu Thr Pro Gly Lys
                405                 410                 415
tat agt gga gac ttt gtg gag cag ttt aaa ata ttc cat aat gag ctt     1296
Tyr Ser Gly Asp Phe Val Glu Gln Phe Lys Ile Phe His Asn Glu Leu
            420                 425                 430
aaa gat ttc ttt aat gct gga agt ctc act gaa cag ctt gat tct atg     1344
Lys Asp Phe Phe Asn Ala Gly Ser Leu Thr Glu Gln Leu Asp Ser Met
        435                 440                 445
aaa att tct atg gat gat aga ggt ctt tct gcg ctc aat ttg ttt ttt     1392
Lys Ile Ser Met Asp Asp Arg Gly Leu Ser Ala Leu Asn Leu Phe Phe
    450                 455                 460
gaa tgt aaa aag cgc ctt gac aca tca gga gaa tca agc aat gtt ttg     1440
Glu Cys Lys Lys Arg Leu Asp Thr Ser Gly Glu Ser Ser Asn Val Leu
465                 470                 475                 480
gag ttg att aaa acc atg cat tct cta gct tct tta aga gaa aca att     1488
Glu Leu Ile Lys Thr Met His Ser Leu Ala Ser Leu Arg Glu Thr Ile
                485                 490                 495
ata aag gaa ctt aat agc ggc ttg cga aat gat gct cct gat act gcc     1536
Ile Lys Glu Leu Asn Ser Gly Leu Arg Asn Asp Ala Pro Asp Thr Ala
            500                 505                 510
att gca atg cgc cag aag tgg cgc ctt tgt gag atc ggc ctc gag gac     1584
Ile Ala Met Arg Gln Lys Trp Arg Leu Cys Glu Ile Gly Leu Glu Asp
        515                 520                 525
tac ttt ttt gtt cta cta agc aga ttc ctc aat gct ctt gaa act atg     1632
Tyr Phe Phe Val Leu Leu Ser Arg Phe Leu Asn Ala Leu Glu Thr Met
    530                 535                 540
gga gga gct gat caa ctg gca aaa gat gtg gga tca aga aac gtt gcc     1680
Gly Gly Ala Asp Gln Leu Ala Lys Asp Val Gly Ser Arg Asn Val Ala
545                 550                 555                 560
tca tgg aat gat cca cta gat gct ttg gtg ttg ggt gtt cac caa gta     1728
Ser Trp Asn Asp Pro Leu Asp Ala Leu Val Leu Gly Val His Gln Val
                565                 570                 575
ggt cta tct ggt tgg aag caa gaa gaa tgt tta gcc att gga aat gaa     1776
Gly Leu Ser Gly Trp Lys Gln Glu Glu Cys Leu Ala Ile Gly Asn Glu
            580                 585                 590
ctc ctt gct tgg cga gaa agg gac cta ctt gaa aaa gaa ggg gaa gag     1824
    Leu Leu Ala Trp Arg Glu Arg Asp Leu Leu Glu Lys Glu Gly Glu Glu
        595                 600                 605
gat gga aaa aca att tgg gcc atg agg ctg aaa gca act ctt gat cga     1872
Asp Gly Lys Thr Ile Trp Ala Met Arg Leu Lys Ala Thr Leu Asp Arg
    610                 615                 620
gca cgc aga tta aca gca gaa tat tct gat ttg ctt ctt caa ata ttt     1920
Ala Arg Arg Leu Thr Ala Glu Tyr Ser Asp Leu Leu Leu Gln Ile Phe
625                 630                 635                 640
cct cct aat gtg gag att tta gga aaa gct cta gga att cca gag aat     1968
Pro Pro Asn Val Glu Ile Leu Gly Lys Ala Leu Gly Ile Pro Glu Asn
                645                 650                 655
agt gtc aag acc tat aca gaa gca gag att cgt gct gga att att ttc     2016
Ser Val Lys Thr Tyr Thr Glu Ala Glu Ile Arg Ala Gly Ile Ile Phe
            660                 665                 670
cag atc tca aag ctc tgc act gtt ctt cta aaa gct gta aga aat tca     2064
Gln Ile Ser Lys Leu Cys Thr Val Leu Leu Lys Ala Val Arg Asn Ser
        675                 680                 685
ctt ggt tct gag ggc tgg gat gtc gtt gta cot gga tcg acg tct ggg     2112
    Leu Gly Ser Glu Gly Trp Asp Val Val Val Pro Gly Ser Thr Ser Gly
    690                 695                 700
aca tta gtt cag gtt gag agc att gtt ccg gga tca ttg cca gca act     2160
Thr Leu Val Gln Val Glu Ser Ile Val Pro Gly Ser Leu Pro Ala Thr
705                 710                 715                 720
tct ggt ggt cct att att ctc ttg gtc aat aaa gct gat ggc gat gaa     2208
Ser Gly Gly Pro Ile Ile Leu Leu Val Asn Lys Ala Asp Gly Asp Glu
                725                 730                 735
gag gta agt gct gct aat ggg aac ata gct gga gtc atg ctt ctg cag     2256
Glu Val Ser Ala Ala Asn Gly Asn Ile Ala Gly Val Met Leu Leu Gln
            740                 745                 750
gag ctg cct cac ttg tct cac ctt ggc gtt aga gcg cgg cag gag aaa     2304
Glu Leu Pro His Leu Ser His Leu Gly Val Arg Ala Arg Gln Glu Lys
        755                 760                 765
att gtc ttt gtg aca tgt gat gat gat gac aag gtt gct gat ata cga     2352
Ile Val Phe Val Thr Cys Asp Asp Asp Asp Lys Val Ala Asp Ile Arg
    770                 775                 780
cga ctt gtg gga aaa ttt gtg agg ttg gaa gca tct cca agt cat gtg     2400
Arg Leu Val Gly Lys Phe Val Arg Leu Glu Ala Ser Pro Ser His Val
785                 790                 795                 800
aat ctg ata ctt tca act gag ggt agg agt cgc act tcc aaa tcc agt     2448
Asn Leu Ile Leu Ser Thr Glu Gly Arg Ser Arg Thr Ser Lys Ser Ser
                805                 810                 815
gcg acc aaa aaa acg gat aag aac agc tta tct aag aaa aaa aca gat     2496
Ala Thr Lys Lys Thr Asp Lys Asn Ser Leu Ser Lys Lys Lys Thr Asp
            820                 825                 830
aag aag agc tta tct atc gat gat gaa gaa tca aag cct ggt tcc tca     2544
Lys Lys Ser Leu Ser Ile Asp Asp Glu Glu Ser Lys Pro Gly Ser Ser
        835                 840                 845
tct tcc aat agc ctc ctt tac tct tcc aag gat atc cct agt gga gga     2592
Ser Ser Asn Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Lys Asp Ile Pro Ser Gly Gly
    850                 855                 860
atc ata gca ctt gct gat gca gat gta cca act tct ggt tca aaa tct     2640
Ile Ile Ala Leu Ala Asp Ala Asp Val Pro Thr Ser Gly Ser Lys Ser
865                 870                 875                 880
gct gca tgt ggt ctt ctt gca tct tta gca gaa gcc tct agt aaa gtg     2688
Ala Ala Cys Gly Leu Leu Ala Ser Leu Ala Glu Ala Ser Ser Lys Val
                885                 890                 895
cac agc gaa cac gga gtt ccg gca tca ttt aag gtt cca act gga gtt     2736
His Ser Glu His Gly Val Pro Ala Ser Phe Lys Val Pro Thr Gly Val
            900                 905                 910
gtc ata cct ttt gga tcg atg gaa tta gct tta aag caa aat aat tcg     2784
Val Ile Pro Phe Gly Ser Met Glu Leu Ala Leu Lys Gln Asn Asn Ser
        915                 920                 925
gaa gaa aag ttt gcg tct ttg cta gaa aaa cta gaa acc gcc aga cct     2832
Glu Glu Lys Phe Ala Ser Leu Leu Glu Lys Leu Glu Thr Ala Arg Pro
    930                 935                 940
gag ggt ggt gag cta gac gac ata tgt gac cag atc cat gaa gtg atg     2880
Glu Gly Gly Glu Leu Asp Asp Ile Cys Asp Gln Ile His Glu Val Met
945                 950                 955                 960
aaa acg ttg caa gtg cct aaa gaa aca atc aac agc ata agc aaa gcg     2928
Lys Thr Leu Gln Val Pro Lys Glu Thr Ile Asn Ser Ile Ser Lys Ala
                965                 970                 975
ttt ctc aaa gat gct cgt ctc att gtt cgt tca agt gct aac gtc gag     2976
Phe Leu Lys Asp Ala Arg Leu Ile Val Arg Ser Ser Ala Asn Val Glu
            980                 985                 990
gac tta gcc gga atg tca gct gca  gga ctc tat gaa tca  atc cct aac   3024
Asp Leu Ala Gly Met Ser Ala Ala  Gly Leu Tyr Glu Ser  Ile Pro Asn
        995                 1000                 1005
gtg agt  ccc tcg gat cct ttg  gtg ttt tca gat tcg  gtt tgc caa      3069
Val Ser  Pro Ser Asp Pro Leu  Val Phe Ser Asp Ser  Val Cys Gln
    1010                 1015                 1020
gtt tgg  gct tct ctc tac aca  aga aga gct gtt cta  agc cgt aga      3114
Val Trp  Ala Ser Leu Tyr Thr  Arg Arg Ala Val Leu  Ser Arg Arg
    1025                 1030                 1035
gct gct  ggt gtc tct caa aga  gaa gct tca atg gct  gtt ctc gtt      3159
Ala Ala  Gly Val Ser Gln Arg  Glu Ala Ser Met Ala  Val Leu Val
    1040                 1045                 1050
caa gaa  atg ctt tcg ccg gac  tta tca ttc gtt ctg  cac aca gtg      3204
Gln Glu  Met Leu Ser Pro Asp  Leu Ser Phe Val Leu  His Thr Val
    1055                 1060                 1065
agt cca  gct gat ccg gac agt  aac ctt gtg gaa gcc  gag atc gct      3249
Ser Pro  Ala Asp Pro Asp Ser  Asn Leu Val Glu Ala  Glu Ile Ala
    1070                 1075                 1080
cct ggt  tta ggt gag act tta  gct tca gga aca aga  gga aca cca      3294
Pro Gly  Leu Gly Glu Thr Leu  Ala Ser Gly Thr Arg  Gly Thr Pro
    1085                 1090                 1095
tgg aga  ctc gct tcg ggt aag  ctc gac ggg att gta  caa acc tta      3339
Trp Arg  Leu Ala Ser Gly Lys  Leu Asp Gly Ile Val  Gln Thr Leu
    1100                1105                1110
gct ttc gca aac ttc agc gaa gag ctt ctt gtg tca gga aca ggt    3384
Ala Phe Ala Asn Phe Ser Glu Glu Leu Leu Val Ser Gly Thr Gly
    1115                1120                1125
cct gct gat gga aaa tac gtt cgg ttg acc gtg gac tat agc aaa    3429
Pro Ala Asp Gly Lys Tyr Val Arg Leu Thr Val Asp Tyr Ser Lys
    1130                1135                1140
aaa cgt tta act gtt gac tcg gtg ttt aga cag cag ctc ggt cag    3474
Lys Arg Leu Thr Val Asp Ser Val Phe Arg Gln Gln Leu Gly Gln
    1145                1150                1155
aga ctc ggt tcg gtt ggt ttc ttc ttg gaa aga aac ttt ggc tgt    3519
Arg Leu Gly Ser Val Gly Phe Phe Leu Glu Arg Asn Phe Gly Cys
    1160                1165                1170
gct caa gac gtt gaa ggt tgt ttg gtt ggt gaa gat gtt tac att    3564
Ala Gln Asp Val Glu Gly Cys Leu Val Gly Glu Asp Val Tyr Ile
    1175                1180                1185
gtt cag tca agg cca caa cct ctg tag                            3591
Val Gln Ser Arg Pro Gln Pro Leu
    1190                1195
<210>2
<211>1196
<212>PRT
<213>拟南芥菜
<400>2
Met Glu Ser Ile Gly Ser His Cys Cys Ser Ser Pro Phe Thr Phe Ile
1               5                   10                  15
Thr Arg Asn Ser Ser Ser Ser Leu Pro Arg Leu Val Asn Ile Thr His
            20                  25                  30
Arg Val Asn Leu Ser His Gln Ser His Arg Leu Arg Asn Ser Asn Ser
        35                  40                  45
Arg Leu Thr Cys Thr Ala Thr Ser Ser Ser Thr Ile Glu Glu Gln Arg
    50                  55                  60
Lys Lys Lys Asp Gly Ser Gly Thr Lys Val Arg Leu Asn Val Arg Leu
65                  70                  75                  80
Asp His Gln Val Asn Phe Gly Asp His Val Ala Met Phe Gly Ser Ala
                85                  90                  95
Lys Glu Ile Gly Ser Trp Lys Lys Lys Ser Pro Leu Asn Trp Ser Glu
            100                 105                 110
Asn Gly Trp Val Cys Glu Leu Glu Leu Asp Gly Gly Gln Val Leu Glu
        115                 120                 125
Tyr Lys Phe Val Ile Val Lys Asn Asp Gly Ser Leu Ser Trp Glu Ser
    130                 135                 140
Gly Asp Asn Arg Val Leu Lys Val Pro Asn Ser Gly Asn Phe Ser Val
145                 150                 155                 160
Val Cys His Trp Asp Ala Thr Arg Glu Thr Leu Asp Leu Pro Gln Glu
                165                 170                 175
Val Gly Asn Asp Asp Asp Val Gly Asp Gly Gly His Glu Arg Asp Asn
            180                 185                 190
His Asp Val Gly Asp Asp Arg Val Val Gly Ser Glu Asn Gly Ala Gln
        195                 200                 205
Leu Gln Lys Ser Thr Leu Gly Gly Gln Trp Gln Gly Lys Asp Ala Ser
    210                 215                 220
Phe Met Arg Ser Asn Asp His Gly Asn Arg Glu Val Gly Arg Asn Trp
225                 230                 235                 240
Asp Thr Ser Gly Leu Glu Gly Thr Ala Leu Lys Met Val Glu Gly Asp
                245                 250                 255
Arg Asn Ser Lys Asn Trp Trp Arg Lys Leu Glu Met Val Arg Glu Val
            260                 265                 270
Ile Val Gly Ser Val Glu Arg Glu Glu Arg Leu Lys Ala Leu Ile Tyr
        275                 280                 285
Ser Ala Ile Tyr Leu Lys Trp Ile Asn Thr Gly Gln Ile Pro Cys Phe
    290                 295                 300
Glu Asp Gly Gly His His Arg Pro Asn Arg His Ala Glu Ile Ser Arg
305                 310                 315                 320
Leu Ile Phe Arg Glu Leu Glu His Ile Cys Ser Lys Lys Asp Ala Thr
                325                 330                 335
Pro Glu Glu Val Leu Val Ala Arg Lys Ile His Pro Cys Leu Pro Ser
            340                 345                 350
Phe Lys Ala Glu Phe Thr Ala Ala Val Pro Leu Thr Arg Ile Arg Asp
        355                 360                 365
Ile Ala His Arg Asn Asp Ile Pro His Asp Leu Lys Gln Glu Ile Lys
    370                 375                 380
His Thr Ile Gln Asn Lys Leu His Arg Asn Ala Gly Pro Glu Asp Leu
385                 390                 395                 400
Ile Ala Thr Glu Ala Met Leu Gln Arg Ile Thr Glu Thr Pro Gly Lys
                405                 410                 415
Tyr Ser Gly Asp Phe Val Glu Gln Phe Lys Ile Phe His Asn Glu Leu
            420                 425                 430
Lys Asp Phe Phe Asn Ala Gly Ser Leu Thr Glu Gln Leu Asp Ser Met
        435                 440                 445
Lys Ile Ser Met Asp Asp Arg Gly Leu Ser Ala Leu Asn Leu Phe Phe
    450                 455                 460
Glu Cys Lys Lys Arg Leu Asp Thr Ser Gly Glu Ser Ser Asn Val Leu
465                 470                 475                 480
Glu Leu Ile Lys Thr Met His Ser Leu Ala Ser Leu Arg Glu Thr Ile
                485                 490                 495
Ile Lys Glu Leu Asn Ser Gly Leu Arg Asn Asp Ala Pro Asp Thr Ala
            500                 505                 510
Ile Ala Met Arg Gln Lys Trp Arg Leu Cys Glu Ile Gly Leu Glu Asp
        515                 520                 525
Tyr Phe Phe Val Leu Leu Ser Arg Phe Leu Asn Ala Leu Glu Thr Met
    530                 535                 540
Gly Gly Ala Asp Gln Leu Ala Lys Asp Val Gly Ser Arg Asn Val Ala
545                 550                 555                 560
Ser Trp Asn Asp Pro Leu Asp Ala Leu Val Leu Gly Val His Gln Val
                565                 570                 575
Gly Leu Ser Gly Trp Lys Gln Glu Glu Cys Leu Ala Ile Gly Asn Glu
            580                 585                 590
Leu Leu Ala Trp Arg Glu Arg Asp Leu Leu Glu Lys Glu Gly Glu Glu
        595                 600                 605
Asp Gly Lys Thr Ile Trp Ala Met Arg Leu Lys Ala Thr Leu Asp Arg
    610                 615                 620
Ala Arg Arg Leu Thr Ala Glu Tyr Ser Asp Leu Leu Leu Gln Ile Phe
625                 630                 635                 640
Pro Pro Asn Val Glu Ile Leu Gly Lys Ala Leu Gly Ile Pro Glu Asn
                645                 650                 655
Ser Val Lys Thr Tyr Thr Glu Ala Glu Ile Arg Ala Gly Ile Ile Phe
            660                 665                 670
Gln Ile Ser Lys Leu Cys Thr Val Leu Leu Lys Ala Val Arg Asn Ser
        675                 680                 685
Leu Gly Ser Glu Gly Trp Asp Val Val Val Pro Gly Ser Thr Ser Gly
    690                 695                 700
Thr Leu Val Gln Val Glu Ser Ile Val Pro Gly Ser Leu Pro Ala Thr
705                 710                 715                 720
Ser Gly Gly Pro Ile Ile Leu Leu Val Asn Lys Ala Asp Gly Asp Glu
                725                 730                 735
Glu Val Ser Ala Ala Asn Gly Asn Ile Ala Gly Val Met Leu Leu Gln
            740                 745                 750
Glu Leu Pro His Leu Ser His Leu Gly Val Arg Ala Arg Gln Glu Lys
        755                 760                 765
Ile Val Phe Val Thr Cys Asp Asp Asp Asp Lys Val Ala Asp Ile Arg
    770                 775                 780
Arg Leu Val Gly Lys Phe Val Arg Leu Glu Ala Ser Pro Ser His Val
785                 790                 795                 800
Asn Leu Ile Leu Ser Thr Glu Gly Arg Ser Arg Thr Ser Lys Ser Ser
                805                 810                 815
Ala Thr Lys Lys Thr Asp Lys Asn Ser Leu Ser Lys Lys Lys Thr Asp
            820                 825                 830
Lys Lys Ser Leu Ser Ile Asp Asp Glu Glu Ser Lys Pro Gly Ser Ser
        835                 840                 845
Ser Ser Asn Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Lys Asp Ile Pro Ser Gly Gly
    850                 855                 860
Ile Ile Ala Leu Ala Asp Ala Asp Val Pro Thr Ser Gly Ser Lys Ser
865                 870                 875                 880
Ala Ala Cys Gly Leu Leu Ala Ser Leu Ala Glu Ala Ser Ser Lys Val
                885                 890                 895
His Ser Glu His Gly Val Pro Ala Ser Phe Lys Val Pro Thr Gly Val
            900                 905                 910
Val Ile Pro Phe Gly Ser Met Glu Leu Ala Leu Lys Gln Asn Asn Ser
        915                 920                 925
Glu Glu Lys Phe Ala Ser Leu Leu Glu Lys Leu Glu Thr Ala Arg Pro
    930                 935                 940
Glu Gly Gly Glu Leu Asp Asp Ile Cys Asp Gln Ile His Glu Val Met
945                 950                 955                 960
Lys Thr Leu Gln Val Pro Lys Glu Thr Ile Asn Ser Ile Ser Lys Ala
                965                 970                 975
Phe Leu Lys Asp Ala Arg Leu Ile Val Arg Ser Ser Ala Asn Val Glu
            980                 985                 990
Asp Leu Ala Gly Met Ser Ala Ala Gly Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Asn
        995                 1000                1005
Val Ser  Pro Ser Asp Pro Leu  Val Phe Ser Asp Ser  Val Cys Gln
    1010                 1015                 1020
Val Trp  Ala Ser Leu Tyr Thr  Arg Arg Ala Val Leu  Ser Arg Arg
    1025                 1030                 1035
Ala Ala  Gly Val Ser Gln Arg  Glu Ala Ser Met Ala  Val Leu Val
    1040                 1045                 1050
Gln Glu  Met Leu Ser Pro Asp  Leu Ser Phe Val Leu  His Thr Val
    1055                 1060                 1065
Ser Pro  Ala Asp Pro Asp Ser  Asn Leu Val Glu Ala  Glu Ile Ala
    1070                 1075                 1080
Pro Gly  Leu Gly Glu Thr Leu  Ala Ser Gly Thr Arg  Gly Thr Pro
    1085                 1090                 1095
Trp Arg  Leu Ala Ser Gly Lys  Leu Asp Gly Ile Val  Gln Thr Leu
    1100                 1105                 1110
Ala Phe  Ala Asn Phe Ser Glu  Glu Leu Leu Val Ser  Gly Thr Gly
    1115                 1120                 1125
Pro Ala  Asp Gly Lys Tyr Val  Arg Leu Thr Val Asp  Tyr Ser Lys
    1130                 1135                 1140
Lys Arg  Leu Thr Val Asp Ser  Val Phe Arg Gln Gln  Leu Gly Gln
    1145                 1150                 1155
Arg Leu  Gly Ser Val Gly Phe  Phe Leu Glu Arg Asn  Phe Gly Cys
    1160                 1165                 1170
Ala Gln  Asp Val Glu Gly Cys  Leu Val Gly Glu Asp  Val Tyr Ile
    1175                 1180                 1185
Val Gln  Ser Arg Pro Gln Pro  Leu
    1190                 1195
<210>3
<211>3644
<212>DNA
<213>稻(Oryza sativa)
<220>
<221>CDS
<222>(13)..(3633)
<223>
<400>3
cgaggaggat ca atg acg tcg ctg cgg ccc ctc gaa acc tcg ctc tcc ata   51
              Met Thr Ser Leu Arg Pro Leu Glu Thr Ser Leu Ser Ile
              1               5                   10
ggc ggc agg ccg cgc cgt ggt ctc gtc ctc ccg ccg ccc gga gtc ggt     99
Gly Gly Arg Pro Arg Arg Gly Leu Val Leu Pro Pro Pro Gly Val Gly
    15                  20                  25
gcg ggt gtg ctg ctc cgc cgg gga gcg atg gcg ctc cct ggg cgg cgc    147
Ala Gly Val Leu Leu Arg Arg Gly Ala Met Ala Leu Pro Gly Arg Arg
30                  35                  40                  45
ggc ttc gcg tgc cgc ggg aga tcc gcg gcc tcg gcg gca gag aga aca    195
Gly Phe Ala Cys Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Ala Ala Glu Arg Thr
                50                  55                  60
aag gag aaa aag aga aga gat tct tca aag cag cca ttg gtg cat ctc    243
Lys Glu Lys Lys Arg Arg Asp Ser Ser Lys Gln Pro Leu Val His Leu
            65                  70                  75
cag gtt tgt cta gag cac cag gtt aag ttt ggt gag cat gta ggc att    291
Gln Val Cys Leu Glu His Gln Val Lys Phe Gly Glu His Val Gly Ile
        80                  85                  90
atc ggt tcc aca aag gag ctt ggt tca tgg gag gag cag gtt gaa ctg    339
Ile Gly Ser Thr Lys Glu Leu Gly Ser Trp Glu Glu Gln Val Glu Leu
    95                  100                 105
gaa tgg act aca aat ggt tgg gtc tgc cag ctt aag ctc cct gga gaa    387
Glu Trp Thr Thr Asn Gly Trp Val Cys Gln Leu Lys Leu Pro Gly Glu
110                 115                 120                 125
aca ctt gtg gag ttt aaa ttt gtt ata ttt ttg gtg gga gga aaa gat    435
Thr Leu Val Glu Phe Lys Phe Val Ile Phe Leu Val Gly Gly Lys Asp
                130                 135                 140
aaa ata tgg gaa gat ggt aat aac cgt gtt gtt gag ctg ccg aag gat    483
Lys Ile Trp Glu Asp Gly Asn Asn Arg Val Val Glu Leu Pro Lys Asp
            145                 150                 155
ggt aag ttt gat ata gta tgc cac tgg aat aga aca gaa gag cca tta    531
Gly Lys Phe Asp Ile Val Cys His Trp Asn Arg Thr Glu Glu Pro Leu
        160                 165                 170
gaa ctt tta gga aca cca aag ttt gag ttg gtc gga gaa gct gaa aag    579
Glu Leu Leu Gly Thr Pro Lys Phe Glu Leu Val Gly Glu Ala Glu Lys
    175                 180                 185
aat act ggc gag gat gct tca gca tct gta act ttt gca cct gaa aaa    627
Asn Thr Gly Glu Asp Ala Ser Ala Ser Val Thr Phe Ala Pro Glu Lys
190                 195                 200                 205
gtt caa gat att tca gtt gtt gag aat ggt gat cca gca cca gag gcc    675
Val Gln Asp Ile Ser Val Val Glu Asn Gly Asp Pro Ala Pro Glu Ala
                210                 215                 220
gag tca agc aaa ttt ggt ggg caa tgg caa gga agt aaa act gtt ttc    723
Glu Ser Ser Lys Phe Gly Gly Gln Trp Gln Gly Ser Lys Thr Val Phe
            225                 230                 235
atg aga tca aat gag cat ctg aat aag gag gct gat agg atg tgg gat    771
Met Arg Ser Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Ala Asp Arg Met Trp Asp
        240                 245                 250
aca act ggg ctt gat gga ata gca ctg aaa ctg gtg gag ggc gat aaa    819
Thr Thr Gly Leu Asp Gly Ile Ala Leu Lys Leu Val Glu Gly Asp Lys
    255                 260                 265
gca tcc agg aac tgg tgg cgg aag tta gag gtt gtt cgc ggg ata ttg    867
Ala Ser Arg Asn Trp Trp Arg Lys Leu Glu Val Val Arg Gly Ile Leu
270                 275                 280                 285
tca gaa tct ttt gat gac cag agt cgt ctg ggg gcc ctt gta tac tca    915
Ser Glu Ser Phe Asp Asp Gln Ser Arg Leu Gly Ala Leu Val Tyr Ser
                290                 295                 300
gct att tat ctg aag tgg att tat aca ggt cag ata tcg tgc ttt gaa    963
Ala Ile Tyr Leu Lys Trp Ile Tyr Thr Gly Gln Ile Ser Cys Phe Glu
            305                 310                 315
gat ggt ggc cac cat cgg cct aac aaa cat gct gag ata tcg agg caa    1011
Asp Gly Gly His His Arg Pro Asn Lys His Ala Glu Ile Ser Arg Gln
        320                 325                 330
ata ttc cgt gaa ctt gaa atg atg tat tat ggg aaa acc aca tca gcc    1059
Ile Phe Arg Glu Leu Glu Met Met Tyr Tyr Gly Lys Thr Thr Ser Ala
    335                 340                 345
aag gat gtt ctc gtg att cgc aaa att cat ccc ttt tta cct tca ttt    1107
Lys Asp Val Leu Val Ile Arg Lys Ile His Pro Phe Leu Pro Ser Phe
350                 355                 360                 365
aag tca gag ttt aca gcc tct gtc cct cta aca cga att cgt gat att    1155
Lys Ser Glu Phe Thr Ala Ser Val Pro Leu Thr Arg Ile Arg Asp Ile
                370                 375                 380
gct cac cgg aat gac atc cca cat gat ctc aag caa gaa atc aag cat    1203
Ala His Arg Asn Asp Ile Pro His Asp Leu Lys Gln Glu Ile Lys His
            385                 390                 395
act ata caa aac aaa ctt cat cgt aat gct gga cct gag gat ctt att    1251
Thr Ile Gln Asn Lys Leu His Arg Asn Ala Gly Pro Glu Asp Leu Ile
        400                 405                 410
gct aca gaa gtc atg ctt gct agg att act aag acc cct gga gaa tac    1299
Ala Thr Glu Val Met Leu Ala Arg Ile Thr Lys Thr Pro Gly Glu Tyr
    415                 420                 425
agt gaa aca ttt gtt gaa caa ttc acg ata ttt tat agc gaa cta aaa    1347
Ser Glu Thr Phe Val Glu Gln Phe Thr Ile Phe Tyr Ser Glu Leu Lys
430                 435                 440                 445
gat ttc ttc aat gct ggc agc cta ttt gag caa ctg gag tcc atc aag    1395
Asp Phe Phe Asn Ala Gly Ser Leu Phe Glu Gln Leu Glu Ser Ile Lys
                450                 455                 460
gaa tct ctg aac gag tca ggc tta gaa gtt ctc tca tcc ttt gtg gaa    1443
Glu Ser Leu Asn Glu Ser Gly Leu Glu Val Leu Ser Ser Phe Val Glu
            465                 470                 475
acc aaa agg agt ttg gac caa gtg gat cat gca gaa gat ttg gat aaa    1491
Thr Lys Arg Ser Leu Asp Gln Val Asp His Ala Glu Asp Leu Asp Lys
        480                 485                 490
aat gat acc att caa att ttg atg act acc ttg caa tca tta tct tct    1539
Asn Asp Thr Ile Gln Ile Leu Met Thr Thr Leu Gln Ser Leu Ser Ser
    495                 500                 505
cta aga tcg gtt cta atg aag ggc ctt gaa agt ggc ctt aga aat gat    1587
Leu Arg Ser Val Leu Met Lys Gly Leu Glu Ser Gly Leu Arg Asn Asp
510                 515                 520                 525
gcg cct gat aat gct ata gca atg cga caa aag tgg cgc ctt tgt gaa    1635
Ala Pro Asp Asn Ala Ile Ala Met Arg Gln Lys Trp Arg Leu Cys Glu
                530                 535                 540
att agt ctt gag gat tat tca ttt gtt ctg tta agc aga ttc atc aat    1683
Ile Ser Leu Glu Asp Tyr Ser Phe Val Leu Leu Ser Arg Phe Ile Asn
            545                 550                 555
act ctt gaa gcc tta ggt gga tca gct tca ctt gca aag gat gta gct    1731
Thr Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Ala Ser Leu Ala Lys Asp Val Ala
        560                 565                 570
aga aat act act cta tgg gat act act ctt gat gcc ctt gtc att ggc    1779
Arg Asn Thr Thr Leu Trp Asp Thr Thr Leu Asp Ala Leu Val Ile Gly
    575                 580                 585
atc aat caa gtt agc ttt tca ggt tgg aaa aca gat gaa tgt att gcc    1827
Ile Asn Gln Val Ser Phe Ser Gly Trp Lys Thr Asp Glu Cys Ile Ala
590                 595                 600                 605
ata ggg aat gag att ctt tcc tgg aag caa aaa ggt cta tct gaa agt    1875
Ile Gly Asn Glu Ile Leu Ser Trp Lys Gln Lys Gly Leu Ser Glu Ser
                610                 615                 620
gaa ggt tgt gaa gat ggg aaa tat att tgg tca cta aga ctt aaa gct    1923
Glu Gly Cys Glu Asp Gly Lys Tyr Ile Trp Ser Leu Arg Leu Lys Ala
            625                 630                 635
aca ctg gac aga gca cgg aga tta acg gaa gag tac tct gaa gca ctt    1971
Thr Leu Asp Arg Ala Arg Arg Leu Thr Glu Glu Tyr Ser Glu Ala Leu
        640                 645                 650
ctt tct ata ttc cct gaa aaa gta atg gtt att ggg aaa gcc ctt gga    2019
Leu Ser Ile Phe Pro Glu Lys Val Met Val Ile Gly Lys Ala Leu Gly
    655                 660                 665
ata cca gat aac agt gtg aga act tac aca gag gca gaa att cgt gct    2067
Ile Pro Asp Asn Ser Val Arg Thr Tyr Thr Glu Ala Glu Ile Arg Ala
670                 675                 680                 685
ggc att gtt ttt cag gta tct aaa cta tgc aca gta ctt cag aaa gca    2115
Gly Ile Val Phe Gln Val Ser Lys Leu Cys Thr Val Leu Gln Lys Ala
                690                 695                 700
att cga gaa gta ctt gga tca act ggc tgg gat gtt ctt gtt cct gga    2163
Ile Arg Glu Val Leu Gly Ser Thr Gly Trp Asp Val Leu Val Pro Gly
            705                 710                 715
gtg gcc cat gga act ctg atg cgg gtg gaa aga att ctt cct gga tca    2211
Val Ala His Gly Thr Leu Met Arg Val Glu Arg Ile Leu Pro Gly Ser
        720                 725                 730
tta cct tca tct gtc aaa gaa cct gtg gtt cta att gta gat aag gct    2259
Leu Pro Ser Ser Val Lys Glu Pro Val Val Leu Ile Val Asp Lys Ala
    735                 740                 745
gat gga gat gaa gag gtc aaa gct gct ggg gat aat ata gtt ggt gtt    2307
Asp Gly Asp Glu Glu Val Lys Ala Ala Gly Asp Asn Ile Val Gly Val
750                 755                 760                 765
att ctt ctt cag gaa cta cct cac ctt tca cat ctt ggt gtt aga gct    2355
Ile Leu Leu Gln Glu Leu Pro His Leu Ser His Leu Gly Val Arg Ala
                770                 775                 780
cgt caa gag aat gtt gta ttt gta act tgt gaa tat gat gac aca gtt    2403
Arg Gln Glu Asn Val Val Phe Val Thr Cys Glu Tyr Asp Asp Thr Val
            785                 790                 795
aca gat gtg tat ttg ctt gag gga aaa tat atc aga tta gaa gca tca    2451
Thr Asp Val Tyr Leu Leu Glu Gly Lys Tyr Ile Arg Leu Glu Ala Ser
        800                 805                 810
tcc atc aat gtc aat ctc tca ata gtt tca gaa aaa aat gac aat gct    2499
Ser Ile Asn Val Asn Leu Ser Ile Val Ser Glu Lys Asn Asp Asn Ala
    815                 820                 825
gtc tct aca gaa cca aat agt aca ggg aat cca ttt caa cag aaa ctc    2547
Val Ser Thr Glu Pro Asn Ser Thr Gly Asn Pro Phe Gln Gln Lys Leu
830                 835                 840                 845
caa aat gaa ttc tct cta cca tcg gat atc gag atg cca ctg caa atg    2595
Gln Asn Glu Phe Ser Leu Pro Ser Asp Ile Glu Met Pro Leu Gln Met
                850                 855                 860
tct aag caa aaa agc aaa tca gga gtg aat ggt agt ttt gct gct ctt     2643
Ser Lys Gln Lys Ser Lys Ser Gly Val Asn Gly Ser Phe Ala Ala Leu
            865                 870                 875
gag ctt tca gaa gct tca gtg gaa tca gct ggt gca aaa gct gct gca     2691
Glu Leu Ser Glu Ala Ser Val Glu Ser Ala Gly Ala Lys Ala Ala Ala
        880                 885                 890
tgc aga act ctt tct gtt ctt gct tca ttg tct aat aaa gtc tat agt     2739
Cys Arg Thr Leu Ser Val Leu Ala Ser Leu Ser Asn Lys Val Tyr Ser
    895                 900                 905
gat caa gga gtt cca gca gcc ttt aga gtc cct tct ggt gct gtg ata     2787
Asp Gln Gly Val Pro Ala Ala Phe Arg Val Pro Ser Gly Ala Val Ile
910                 915                 920                 925
cca ttt gga tca atg gag gat gcg ctc aag aaa agt gga tca ctg gaa     2835
Pro Phe Gly Ser Met Glu Asp Ala Leu Lys Lys Ser Gly Ser Leu Glu
                930                 935                 940
tcc ttt aca agc ctt cta gaa aag att gaa aca gcc aaa gtc gaa aat     2883
Ser Phe Thr Ser Leu Leu Glu Lys Ile Glu Thr Ala Lys Val Glu Asn
            945                 950                 955
ggt gaa gtt gat agc ctg gcg ttg gag cta caa gca ata att tca cat     2931
Gly Glu Val Asp Ser Leu Ala Leu Glu Leu Gln Ala Ile Ile Ser His
        960                 965                 970
ctt tcc cca ccg gag gag act att ata ttt ctc aaa aga atc ttc cca     2979
Leu Ser Pro Pro Glu Glu Thr Ile Ile Phe Leu Lys Arg Ile Phe Pro
    975                 980                 985
cag gat gtc cgg ttg att gtt aga tct agt gct aat gtg gag gat ttg     3027
Gln Asp Val Arg Leu Ile Val Arg Ser Ser Ala Asn Val Glu Asp Leu
990                 995                 1000                1005
gct ggt atg tca gct  gct ggt ctc tat gat  tca att ccc aat gtc       3072
Ala Gly Met Ser Ala  Ala Gly Leu Tyr Asp  Ser Ile Pro Asn Val
                1010                 1015                 1020
agt ctc atg gac cca  tgt gcc ttt gga gct  gcg gtt ggg aag gtt       3117
Ser Leu Met Asp Pro  Cys Ala Phe Gly Ala  Ala Val Gly Lys Val
                1025                 1030                 1035
tgg gct tct tta tac  aca agg aga gcc atc  cta agc cgt cga gcc       3162
Trp Ala Ser Leu Tyr  Thr Arg Arg Ala Ile  Leu Ser Arg Arg Ala
                1040                 1045                 1050
gct ggt gtt tat cag  aga gac gcg aca atg  gct gtt ctt gtc caa       3207
Ala Gly Val Tyr Gln  Arg Asp Ala Thr Met  Ala Val Leu Val Gln
                1055                 1060                 1065
gaa ata ctg cag cca  gat ctc tcc ttc gtg  ctt cat act gtt tgc       3252
Glu Ile Leu Gln Pro  Asp Leu Ser Phe Val  Leu His Thr Val Cys
                1070                 1075                 1080
ccc gct gac cat gac  ccc aag gtt gtc cag  gct gag gtc gcc cct       3297
Pro Ala Asp His Asp  Pro Lys Val Val Gln  Ala Glu Val Ala Pro
                1085                 1090                 1095
ggg ctg ggt gaa acg  ctt gct tca gga acc  cgt ggc acc ccg tgg    3342
Gly Leu Gly Glu Thr  Leu Ala Ser Gly Thr  Arg Gly Thr Pro Trp
                1100                 1105                 1110
agg ctg tca tgt aac  aaa ttc gat gga aaa  gtt gcc act ctt gcc    3387
Arg Leu Ser Cys Asn  Lys Phe Asp Gly Lys  Val Ala Thr Leu Ala
                1115                 1120                 1125
ttt tca aat ttc agt  gag gag atg gtg gtg  cac aac tct ggt cct    3432
Phe Ser Asn Phe Ser  Glu Glu Met Val Val  His Asn Ser Gly Pro
                1130                 1135                 1140
gcc aat gga gaa gta  att cgt ctt act gtt  gat tac agc aag aag    3477
Ala Asn Gly Glu Val  Ile Arg Leu Thr Val  Asp Tyr Ser Lys Lys
                1145                 1150                 1155
cca ttg tcg gtt gat  aca acc ttt agg aag  cag ttt ggt cag cga    3522
Pro Leu Ser Val Asp  Thr Thr Phe Arg Lys  Gln Phe Gly Gln Arg
                1160                 1165                 1170
ctg gct gcg att ggc  cag tat ctg gag cag  aag ttc ggg agt gca    3567
Leu Ala Ala Ile Gly  Gln Tyr Leu Glu Gln  Lys Phe Gly Ser Ala
                1175                 1180                 1185
cag gat gtg gaa ggt  tgc ctg gtt ggg aaa  gat att ttt ata gtg    3612
Gln Asp Val Glu Gly  Cys Leu Val Gly Lys  Asp Ile Phe Ile Val
                1190                 1195                 1200
caa agc agg cca cag  cca tag aagccgaatt c                        3644
Gln Ser Arg Pro Gln  Pro
                1205
<210>4
<211>1206
<212>PRT
<213>稻
<400>4
Met Thr Ser Leu Arg Pro Leu Glu Thr Ser Leu Ser Ile Gly Gly Arg
1               5                   10                  15
Pro Arg Arg Gly Leu Val Leu Pro Pro Pro Gly Val Gly Ala Gly Val
            20                  25                  30
Leu Leu Arg Arg Gly Ala Met Ala Leu Pro Gly Arg Arg Gly Phe Ala
        35                  40                  45
Cys Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Ala Ala Glu Arg Thr Lys Glu Lys
    50                  55                  60
Lys Arg Arg Asp Ser Ser Lys Gln Pro Leu Val His Leu Gln Val Cys
65                  70                  75                  80
Leu Glu His Gln Val Lys Phe Gly Glu His Val Gly Ile Ile Gly Ser
                85                  90                  95
Thr Lys Glu Leu Gly Ser Trp Glu Glu Gln Val Glu Leu Glu Trp Thr
            100                 105                 110
Thr Asn Gly Trp Val Cys Gln Leu Lys Leu Pro Gly Glu Thr Leu Val
        115                 120                 125
Glu Phe Lys Phe Val Ile Phe Leu Val Gly Gly Lys Asp Lys Ile Trp
    130                 135                 140
Glu Asp Gly Asn Asn Arg Val Val Glu Leu Pro Lys Asp Gly Lys Phe
145                 150                 155                 160
Asp Ile Val Cys His Trp Asn Arg Thr Glu Glu Pro Leu Glu Leu Leu
                165                 170                 175
Gly Thr Pro Lys Phe Glu Leu Val Gly Glu Ala Glu Lys Asn Thr Gly
            180                 185                 190
Glu Asp Ala Ser Ala Ser Val Thr Phe Ala Pro Glu Lys Val Gln Asp
        195                 200                 205
Ile Ser Val Val Glu Asn Gly Asp Pro Ala Pro Glu Ala Glu Ser Ser
    210                 215                 220
Lys Phe Gly Gly Gln Trp Gln Gly Ser Lys Thr Val Phe Met Arg Ser
225                 230                 235                 240
Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Ala Asp Arg Met Trp Asp Thr Thr Gly
                245                 250                 255
Leu Asp Gly Ile Ala Leu Lys Leu Val Glu Gly Asp Lys Ala Ser Arg
            260                 265                 270
Asn Trp Trp Arg Lys Leu Glu Val Val Arg Gly Ile Leu Ser Glu Ser
        275                 280                 285
Phe Asp Asp Gln Ser Arg Leu Gly Ala Leu Val Tyr Ser Ala Ile Tyr
    290                 295                 300
Leu Lys Trp Ile Tyr Thr Gly Gln Ile Ser Cys Phe Glu Asp Gly Gly
305                 310                 315                 320
His His Arg Pro Asn Lys His Ala Glu Ile Ser Arg Gln Ile Phe Arg
                325                 330                 335
Glu Leu Glu Met Met Tyr Tyr Gly Lys Thr Thr Ser Ala Lys Asp Val
            340                 345                 350
Leu Val Ile Arg Lys Ile His Pro Phe Leu Pro Ser Phe Lys Ser Glu
        355                 360                 365
Phe Thr Ala Ser Val Pro Leu Thr Arg Ile Arg Asp Ile Ala His Arg
    370                 375                 380
Asn Asp Ile Pro His Asp Leu Lys Gln Glu Ile Lys His Thr Ile Gln
385                 390                 395                 400
Asn Lys Leu His Arg Asn Ala Gly Pro Glu Asp Leu Ile Ala Thr Glu
                405                 410                 415
Val Met Leu Ala Arg Ile Thr Lys Thr Pro Gly Glu Tyr Ser Glu Thr
            420                 425                 430
Phe Val Glu Gln Phe Thr Ile Phe Tyr Ser Glu Leu Lys Asp Phe Phe
        435                 440                 445
Asn Ala Gly Ser Leu Phe Glu Gln Leu Glu Ser Ile Lys Glu Ser Leu
    450                 455                 460
Asn Glu Ser Gly Leu Glu Val Leu Ser Ser Phe Val Glu Thr Lys Arg
465                 470                 475                 480
Ser Leu Asp Gln Val Asp His Ala Glu Asp Leu Asp Lys Asn Asp Thr
                485                 490                 495
Ile Gln Ile Leu Met Thr Thr Leu Gln Ser Leu Ser Ser Leu Arg Ser
            500                 505                 510
Val Leu Met Lys Gly Leu Glu Ser Gly Leu Arg Asn Asp Ala Pro Asp
        515                 520                 525
Asn Ala Ile Ala Met Arg Gln Lys Trp Arg Leu Cys Glu Ile Ser Leu
    530                 535                 540
Glu Asp Tyr Ser Phe Val Leu Leu Ser Arg Phe Ile Asn Thr Leu Glu
545                 550                 555                 560
Ala Leu Gly Gly Ser Ala Ser Leu Ala Lys Asp Val Ala Arg Asn Thr
                565                 570                 575
Thr Leu Trp Asp Thr Thr Leu Asp Ala Leu Val Ile Gly Ile Asn Gln
            580                 585                 590
Val Ser Phe Ser Gly Trp Lys Thr Asp Glu Cys Ile Ala Ile Gly Asn
        595                 600                 605
Glu Ile Leu Ser Trp Lys Gln Lys Gly Leu Ser Glu Ser Glu Gly Cys
     610                 615                 620
Glu Asp Gly Lys Tyr Ile Trp Ser Leu Arg Leu Lys Ala Thr Leu Asp
625                 630                 635                 640
Arg Ala Arg Arg Leu Thr Glu Glu Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Ser Ile
                645                 650                 655
Phe Pro Glu Lys Val Met Val Ile Gly Lys Ala Leu Gly Ile Pro Asp
            660                 665                 670
Asn Ser Val Arg Thr Tyr Thr Glu Ala Glu Ile Arg Ala Gly Ile Val
        675                 680                 685
Phe Gln Val Ser Lys Leu Cys Thr Val Leu Gln Lys Ala Ile Arg Glu
    690                 695                 700
Val Leu Gly Ser Thr Gly Trp Asp Val Leu Val Pro Gly Val Ala His
705                 710                 715                 720
Gly Thr Leu Met Arg Val Glu Arg Ile Leu Pro Gly Ser Leu Pro Ser
                725                 730                 735
Ser Val Lys Glu Pro Val Val Leu Ile Val Asp Lys Ala Asp Gly Asp
            740                 745                 750
Glu Glu Val Lys Ala Ala Gly Asp Asn Ile Val Gly Val Ile Leu Leu
        755                 760                 765
Gln Glu Leu Pro His Leu Ser His Leu Gly Val Arg Ala Arg Gln Glu
    770                 775                 780
Asn Val Val Phe Val Thr Cys Glu Tyr Asp Asp Thr Val Thr Asp Val
785                 790                 795                 800
Tyr Leu Leu Glu Gly Lys Tyr Ile Arg Leu Glu Ala Ser Ser Ile Asn
                805                 810                 815
Val Asn Leu Ser Ile Val Ser Glu Lys Asn Asp Asn Ala Val Ser Thr
            820                 825                 830
Glu Pro Asn Ser Thr Gly Asn Pro Phe Gln Gln Lys Leu Gln Asn Glu
        835                 840                 845
Phe Ser Leu Pro Ser Asp Ile Glu Met Pro Leu Gln Met Ser Lys Gln
    850                 855                 860
Lys Ser Lys Ser Gly Val Asn Gly Ser Phe Ala Ala Leu Glu Leu Ser
865                 870                 875                 880
Glu Ala Ser Val Glu Ser Ala Gly Ala Lys Ala Ala Ala Cys Arg Thr
                885                 890                 895
Leu Ser Val Leu Ala Ser Leu Ser Asn Lys Val Tyr Ser Asp Gln Gly
            900                 905                 910
Val Pro Ala Ala Phe Arg Val Pro Ser Gly Ala Val Ile Pro Phe Gly
        915                 920                 925
Ser Met Glu Asp Ala Leu Lys Lys Ser Gly Ser Leu Glu Ser Phe Thr
    930                 935                 940
Ser Leu Leu Glu Lys Ile Glu Thr Ala Lys Val Glu Asn Gly Glu Val
945                 950                 955                 960
Asp Ser Leu Ala Leu Glu Leu Gln Ala Ile Ile Ser His Leu Ser Pro
                965                 970                 975
Pro Glu Glu Thr Ile Ile Phe Leu Lys Arg Ile Phe Pro Gln Asp Val
            980                 985                 990
Arg Leu Ile Val Arg Ser Ser Ala  Asn Val Glu Asp Leu  Ala Gly Met
        995                 1000                 1005
Ser Ala  Ala Gly Leu Tyr Asp  Ser Ile Pro Asn Val  Ser Leu Met
    1010                 1015                 1020
Asp Pro  Cys Ala Phe Gly Ala  Ala Val Gly Lys Val  Trp Ala Ser
    1025                 1030                 1035
Leu Tyr  Thr Arg Arg Ala Ile  Leu Ser Arg Arg Ala  Ala Gly Val
    1040                 1045                 1050
Tyr Gln  Arg Asp Ala Thr Met  Ala Val Leu Val Gln  Glu Ile Leu
    1055                 1060                 1065
Gln Pro  Asp Leu Ser Phe Val  Leu His Thr Val Cys  Pro Ala Asp
    1070                 1075                 1080
His Asp  Pro Lys Val Val Gln  Ala Glu Val Ala Pro  Gly Leu Gly
    1085                 1090                 1095
Glu Thr  Leu Ala Ser Gly Thr  Arg Gly Thr Pro Trp  Arg Leu Ser
    1100                 1105                 1110
Cys Asn  Lys Phe Asp Gly Lys  Val Ala Thr Leu Ala  Phe Ser Asn
    1115                 1120                 1125
Phe Ser  Glu Glu Met Val Val  His Asn Ser Gly Pro  Ala Asn Gly
    1130                 1135                 1140
Glu Val  Ile Arg Leu Thr Val  Asp Tyr Ser Lys Lys  Pro Leu Ser
    1145                 1150                 1155
Val Asp  Thr Thr Phe Arg Lys  Gln Phe Gly Gln Arg  Leu Ala Ala
    1160                 1165                 1170
Ile Gly  Gln Tyr Leu Glu Gln  Lys Phe Gly Ser Ala  Gln Asp Val
    1175                 1180                 1185
Glu Gly  Cys Leu Val Gly Lys  Asp Ile Phe Ile Val  Gln Ser Arg
    1190                 1195                 1200
Pro Gln  Pro
    1205
<210>5
<211>12
<212>PRT
<213>拟南芥菜、稻
<400>5
Leu Pro His Leu Ser His Leu Gly Val Arg Ala Arg
1               5                   10

Claims (27)

1.产生经基因修饰的植物细胞的方法，其中，所述经基因修饰的植物细胞的特征在于，与未经基因修饰的相应野生型植物细胞相比，表现出至少一种[磷酸化-α-1，4-葡聚糖]-水-双激酶活性增加，其中所述[磷酸化-α-1，4-葡聚糖]-水-双激酶需要磷酸化淀粉作为底物，在由所述[磷酸化-α-1，4-葡聚糖]-水-双激酶催化的对磷酸化淀粉的磷酸化作用中，与所述淀粉的葡萄糖分子C-6位相比，在C-3位内产生更多的额外磷酸单酯键，且所述[磷酸化-α-1，4-葡聚糖]-水-双激酶：
i)由SEQ ID NO 2所示氨基酸序列组成；或
ii)由SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的核酸分子编码；
其中所述基因修饰由向植物基因组内导入至少一种外来核酸分子组成，其中外来核酸分子编码所述[磷酸化-α-1，4-葡聚糖]-水-双激酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述经基因修饰的植物细胞，与未经基因修饰的相应野生型植物细胞相比，合成改性淀粉。
3.根据权利要求2的方法，其中改性淀粉的特征在于具有增加的淀粉磷酸含量和/或改良的磷酸分布。
4.根据权利要求3的方法，其中改性淀粉的特征在于具有改良的C-3磷酸与C-6磷酸比率。
5.根据权利要求1-4之任一项的方法，其中所述植物为贮藏淀粉的植物。
6.根据权利要求5的方法，其中所述植物为玉米植物或小麦植物。
7.用于制造经基因修饰的植物的方法，其中：
a)根据权利要求1-6之任一项的方法，获得基因修饰的植物细胞；
b)从来自步骤a)的植物细胞再生植物。
8.根据权利要求7的方法，还包括获得含有所述的基因修饰的植物的可收获植物部分。
9.权利要求7的方法，其还包括步骤：借助步骤b)的植物产生更多的植物。
10.改性淀粉，其可从通过根据权利要求7至9中任一项所述的方法可获得的经基因修饰的植物、或该经基因修饰植物的植物繁殖材料、或该经基因修饰植物的可收获植物部分获得。
11.用于制造改性淀粉的方法，包括从通过根据权利要求1至6中任一项所述方法可获得的植物细胞中提取淀粉的步骤。
12.用于制造改性淀粉的方法，包括从通过根据权利要求7至9中任一项所述的方法可获得的经基因修饰植物中提取淀粉的步骤。
13.用于制造改性淀粉的方法，包括从通过根据权利要求7至9中任一项所述的方法可获得的经基因修饰植物的植物繁殖材料或可收获植物部分中提取淀粉的步骤。
14.用于制造衍生淀粉的方法，其中根据权利要求10的改性淀粉或根据权利要求11、12或13中任一项所述的方法可获得的改性淀粉被衍生。
15.通过根据权利要求1至6中任一项所述的方法可获得的经基因修饰植物细胞的用途或通过根据权利要求7至9中任一项所述的方法可获得的经基因修饰植物的用途，其用于制造改性淀粉。
16.衍生淀粉，其可基于根据权利要求14的方法获得。
17.根据权利要求10的改性淀粉的用途或者通过根据权利要求11、12或13中任一项所述方法可获得的改性淀粉的用途，其用于制造衍生淀粉。
18.含有根据权利要求10的改性淀粉的粉末。
19.粉末，其可从通过根据权利要求1至6之任一项的方法可获得的植物细胞、通过根据权利要求7至9中任一项所述的方法可获得的经基因修饰植物的植物繁殖材料或可收获植物部分获得。
20.用于制造粉末的方法，包括研磨含有根据权利要求1至6中任一项的方法可获得的经基因修饰植物细胞的植物的部分、或通过根据权利要求7至9中任一项所述的方法可获得的经基因修饰植物的植物繁殖材料的部分或可收获植物部分的步骤。
21.通过根据权利要求1至6中任一项所述的方法可获得的经基因修饰植物细胞的用途或通过根据权利要求7至9中任一项所述的方法可获得的经基因修饰植物的用途，其用于制造粉末。
22.编码具有[磷酸化-α-1，4-葡聚糖]-水-双激酶的酶活性的蛋白质的核酸分子，其中所述[磷酸化-α-1，4-葡聚糖]-水-双激酶需要磷酸化淀粉作为底物，在由所述[磷酸化-α-1，4-葡聚糖]-水-双激酶催化的对磷酸化淀粉的磷酸化作用中，与所述淀粉的葡萄糖分子C-6位相比，在C-3位内产生更多的额外磷酸单酯键，
所述核酸分子选自：
a)编码蛋白质的核酸分子，其中该蛋白质由SEQ ID NO 2中所指定氨基酸序列组成；
b)由SEQ ID NO 1中所示核苷酸序列或由与这些序列互补的序列组成的核酸分子；
c)核酸分子，其核苷酸序列因遗传密码的简并性而与a)或b)中所述核酸分子的核苷酸序列不同。
23.含有根据权利要求22所述核酸分子的载体。
24.根据权利要求23的载体，其中核酸分子与在原核细胞或真核细胞中启动转录的调节序列连接。
25.宿主细胞，其用根据权利要求22所述的核酸分子或根据权利要求23或24的载体进行基因修饰，其中所述宿主细胞是细菌或真菌细胞。
26.组合物，其含有根据权利要求22所述的核酸分子或根据权利要求23或24中任一项所述的载体。
27.根据权利要求26的组合物用于鉴定植物细胞的用途，其中与未经基因修饰的野生型植物细胞相比，所述植物细胞具有增加的如权利要求1的方法中所定义的[磷酸化-α-1，4-葡聚糖]-水-双激酶活性。
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