ES2624258T3 - Indolocarbazoles glicosilados, procedimiento de obtención y usos de los mismos - Google Patents

Indolocarbazoles glicosilados, procedimiento de obtención y usos de los mismos Download PDF

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César SÁNCHEZ REILLO
Alfredo FERNÁNDEZ BRAÑA
Carmen MÉNDEZ FERNÁNDEZ
Jose Antonio SALAS FERNÁNDEZ
Francisco MORÍS VARAS
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Abstract

Indolocarbazoles glicosilados, su procedimiento de obtencin y sususos. Esta invención se refiere a derivados de rebecamicina y estaurosporina obtenidos por fermentacin de cepas bacterianas recombinantes. La invención se refiere también a los procedimientos empleados para la obtención de las cepas recombinantes y la producción de derivados de rebecamicina y estaurosporina. La invención también se refiere a cepas bacterianas útiles para la producción de derivados de rebecamicina y estaurosporina. Finalmente, los derivados de rebecamicina y estaurosporina aqu descritos son de aplicación en el campo de la salud humana, en concreto para fabricarmedicamentos útiles en el tratamiento de enfermedades tumorales,neurolgicas e inflamatorias.

Description

imagen1
DESCRIPCION
Indolocarbazoles glicosilados, procedimiento de obtención y usos de los mismos
La invención se adscribe al campo farmacéutico y en concreto se refiere a compuestos con aplicación en oncología, con estructura química derivada de indolocarbazol, y que se obtienen por fermentación de microorganismos.
5 Estado de la técnica
Más de 120 productos naturales de tipo indolocarbazol han sido aislados a partir de bacterias, hongos e invertebrados marinos (Studies in Natural Product Chemistry, Elsevier, Amsterdam, vol. 12, pp. 365-409, 1993; Chem. Rev. 2002, 102: 4303-4427; Nat. Prod. Rep. 2006, 23, 1007-1045). Entre estos compuestos de origen natural destacan la estaurosporina (STP, Fig. 1) y la rebecamicina (RBM), que son indolocarbazoles glicosilados producidos por bacterias del grupo de los 10 actinomicetos (U.S. Pat. No. 4,487,925; U.S. Pat. No 4,552,842; J. Antibiot. 1977, 30, 275-282; Tetrahedron Lett. 1985, 26, 4011-4014; J. Antibiot. 1987, 40, 668-678; Nat. Prod. Rep. 2006, 23, 1007-1045). Además, se ha obtenido un elevado número de derivados de tipo indolocarbazol, incluyendo un número de derivados de tipo indolocarbazol, incluyendo indolocarbazoles glicosilados, mediante síntesis química o semi-síntesis (Studies in Natural Product Chemistry, Elsevier, Amsterdam, vol. 12, pp. 365-409, 1993; Chem. Rev. 2002, 102: 4303-4427; Eur. J. Med. Chem. 15 2003, 38, 123-140; Curr. Med. Chem. Anti-Cancer Agents 2002, 2, 255-266; Anti-Cancer Drug Design 2000, 15, 43-52;
J. Med. Chem. 2005, 48, 2600-2611; Tetrahedron Letters 2004, 45 1095-1098; U.S. Pat. No. 4,785,085; EP0545195; EP0602597; WO9807433; WO9902532; WO9530682; US Pat. No. 5,475,110; US Pat. No. 5,468,872; U.S Pat. Num. 6,686,385; U.S Pat. Num. 6,610,727; U.S. Pat. No. 6,855,698).
Los indolocarbazoles presentan una amplia variedad de actividades biológicas de interés farmacéutico, con propiedades 20 antibacterianas, antifúngicas, antivirales, hipotensivas, antitumorales o neuroprotectoras. Por ejemplo, la rebecamicina
(U.S. Pat. Nos. 4,487,925 y 4,552,842) y su análogo hidrosoluble 6-(2-dietilaminoetil)-rebecamicina (U.S. Pat. No. 4,785,085) presentan actividad antitumoral. Estas actividades biológicas pueden ser el resultado de diferentes mecanismos de acción, incluyendo la inhibición de proteína quinasas, la inhibición de ADN topoisomerasas o la unión intercalativa al DNA (Anti-Cancer Drug Design 2000, 15, 43-52; Curr. Med. Chem. Anti-Cancer Agents 2002, 2, 255-266; 25 Eur. J. Med. Chem. 2003, 38, 123-140; Nat. Prod. Rep. 2006, 23, 1007-1045). Varios derivados de indolocarbazol han entrado en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer o de ciertas enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson (Nat. Prod. Rep. 2005, 22: 162-195; Nat. Prod. Rep. 2006, 23, 1007-1045). La mayoría de estos derivados son glicósidos, los cuales son generalmente más potentes que los correspondientes aglicones (Eur. J. Med. Chem. 2003, 38, 123-140; J. Med. Chem. 2005, 48, 2600-2611). En los glicósidos, el azúcar puede estar unido al
30 indolocarbazol mediante un único enlace N-glicosídico (como en el caso de la RBM, Fig. 1) o bien mediante dos enlaces, que consisten en un enlace N-glicosídico y un enlace C-N adicional (como en la STP). Otra diferencia relevante entre las estructuras de la RBM y la STP se encuentra en el grupo pirrol, que incluye una amida en la RBM y una imida en la STP. Estas diferencias son de gran importancia para el mecanismo de acción del compuesto, ya que la RBM es un inhibidor de la ADN topoisomerasa I, mientras que la STP es un inhibidor de proteína quinasas.
35 Actualmente existe una gran necesidad de nuevos agentes antitumorales, con actividad mejorada, con menos efectos secundarios indeseables y con mayor selectividad, en comparación con los fármacos actualmente en uso. Tradicionalmente, la industria farmacéutica ha desarrollado nuevos fármacos mediante dos vías fundamentales: (1) búsqueda de nuevos productos naturales, y (2) síntesis y/o modificación química de determinados compuestos. Estos métodos siguen siendo útiles, pero suelen requerir inversiones muy importantes de recursos (tiempo, dinero, energía),
40 pues normalmente es necesario analizar miles de productos para encontrar un nuevo compuesto prometedor. El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante ha abierto un interesante campo de investigación para la generación de nuevos compuestos bioactivos mediante la manipulación de genes implicados en la biosíntesis de agentes antitumorales, principalmente de bacterias del grupo de los actinomicetos (Trends Biotechnol. 2001, 19, 449-456; J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2005, 9, 77-85; Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2005, 8, 748-756; J. Ind. Microbiol. Biotechnol.
45 2006, 33, 560-568; Curr. Opin. Microbiol. 2006, 9, 252-260). Estas técnicas también pueden ser usadas para mejorar la producción de compuestos naturales ya conocidos, pues las cepas naturales suelen producir bajas concentraciones del metabolito de interés.
La manipulación genética de microorganismos ha sido ya utilizada para la obtención de varias decenas de derivados de tipo indolocarbazol (ES2255331-A1 2006; Chem. Biol. 2002, 9, 519-531; Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003, 67, 12750 138; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005, 102, 461-466; Mol. Microbiol. 2005, 58, 17-27). Al menos algunos de estos derivados presentan actividad antitumoral (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005, 102, 461-466). La biosíntesis de indolocarbazoles glicosilados puede conseguirse mediante la expresión de cuatro genes para la formación del aglicón, un gen que codifica una glicosiltransferasa, y un número variable de genes que codifican enzimas para la formación del azúcar. La expresión de un gen adicional (staN) permite la producción de análogos de STP, con el azúcar unido al
55 aglicón mediante dos enlaces (Mol. Microbiol. 2005, 58, 17-27). La expresión de todos estos genes en una célula huésped adecuada da lugar a una ruta biosintética como, por ejemplo, la ilustrada en la Fig. 2.
imagen2
5
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35
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Descripción de la invención
La presente invención proporciona nuevos compuestos derivados de Rebecamicina y Estaurosporina, pertenecientes a la familia de indolocarbazoles glicosilados. La presente invención también proporciona nuevas cepas bacterianas que producen indolocarbazoles glicosilados. Estas cepas bacterianas son obtenidas mediante la introducción de ciertos ácidos nucleicos adicionales en cepas de Streptomyces spp. no productoras de indolocarbazoles, en particular de Streptomyces albus. Los ácidos nucleicos mencionados son de dos tipos. El primer tipo consiste en ácidos nucleicos que codifican actividades enzimáticas implicadas en la biosíntesis de Rebecamicina y Estaurosporina, y pueden ser obtenidos a partir de Lechevalieria aerocolonigenes ATCC39243, Streptomyces longisporoflavus DSM10189 o de cualquier otro organismo productor de indolocarbazoles. El segundo tipo consiste en ácidos nucleicos que codifican actividades enzimáticas implicadas en la biosíntesis de azúcares que forman parte de la estructura de diversos glicósidos (glicósidos tales como RBM, STP, eritromicina, oleandomicina, urdamicina, u otros), y pueden ser obtenidos a partir de Lechevalieria aerocolonigenes ATCC39243, Streptomyces longisporoflavus DSM10189, Saccharopolyspora erythraea NRRL2338, Streptomyces antibioticus ATCC11891, Streptomyces fradiae Tü2717 o cualquier organismo productor de glicósidos.
La introducción de ácidos nucleicos en Streptomyces spp. se puede realizar mediante transformación de protoplastos, conjugación u otros métodos conocidos (tales como los descritos en Practical Streptomyces genetics, The John Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000), de tal forma que los ácidos nucleicos son replicables en el organismo, bien en forma de elemento extracromosómico o bien integrados en el cromosoma del organismo.
Las cepas bacterianas de esta invención pueden ser cultivadas en cualquier medio adecuado, en condiciones que permitan su crecimiento, tal como se describe enJU. Nat. Prod. 2002, 65, 779-782; Chembiochem. 2004, 5, 1181-1187. Tras varios días de incubación, estos cultivos contienen una cantidad elevada de células (micelio), junto con una mezcla de compuestos, incluyendo derivados de indolocarbazol. A continuación, los cultivos son sometidos a procesos para la separación de una fase líquida (sobrenadante) y una fase sólida (micelio). Seguidamente las dos fases son sometidas, separadamente, a diversos procedimientos que pueden incluir extracción con diversos solventes orgánicos y varios tipos de cromatografías (tales como HPLC, cromatografía líquida de alta presión), con el fin de obtener los derivados de indolocarbazol en forma de compuestos puros. Los derivados de indolocarbazol tienen actividad antitumoral y antibiótica, actividad inhibidora de proteína quinasas, actividad inhibidora de DNA topoisomerasas, y otras.
Se describen compuestos caracterizados por las siguientes fórmulas (I) y (II):
R1 R1 imagen3 R3R2
R10 R7
(II) (I)
donde
R1, R2, R3 y R4 son, cada uno e independientemente, hidrógeno o un grupo protector. El grupo protector puede consistir en un grupo alquilo, un grupo cicloalquilo, un grupo cicloalquilo heterocíclico, un grupo hidroxialquilo, un grupo alquilo halogenado, un grupo alcoxialquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo arilo, un grupo arilo heterocíclico, un grupo alquilarilo, un grupo éster, un grupo carbonato, un grupo ácido carboxílico, un grupo aldehído, un grupo cetona, un grupo uretano, un grupo sililo, un grupo sulfoxido o una combinación de ellos,
R5, R6, R7, R8, R9 y R10 son, cada uno e independientemente, hidrógeno, hidroxilo (–OH) o un grupo –OR13, donde R13 es un grupo protector según la definición anterior,
R11 y R12 son cada uno e independientemente hidrógeno, metilo (–CH3), un grupo hidroximetilo (-CH2OH) o un grupo -CH2OR14, donde R14 es un grupo protector según la definición anterior.
Se describen los compuestos con las fórmulas (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII) y (IX):
imagen4
H HHH
N NNN
imagen5
H H H
H imagen6 O imagen7 O imagen8 O imagen9 O OH Me
imagen10Me
imagen11Me
imagen12Me OH OH OH OHHO HO HO HO
(III) (IV) (V) (VI)
H HH
N NN
imagen13
Me
imagen14 Me
imagen15Me
HO
OH HO
HO
imagen16
imagen17
OH OH OH
(VII) (VIII) (IX)
El compuesto de fórmula (III) es nuevo pues anteriormente se describió un indolocarbarzol glicosilado similar pero cuya estereoquímica no está definida en el enlace glicosídico, que en el caso de esta invención es de configuración ß (Tetrahedron Lett. 2004, 45, 1095-1098).
Se describen usos para los compuestos caracterizados por las fórmulas (X) y (XI):
R1 R1
imagen18
(XI) (X)
donde
R1, R2, R3 y R4 son, cada uno e independientemente, hidrógeno o un grupo protector. El grupo protector puede consistir
10 en un grupo alquilo, un grupo cicloalquilo, un grupo cicloalquilo heterocíclico, un grupo hidroxialquilo, un grupo alquilo halogenado, un grupo alcoxialquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo arilo, un grupo arilo heterocíclico, un grupo alquilarilo, un grupo éster, un grupo carbonato, un grupo ácido carboxílico, un grupo aldehído, un grupo cetona, un grupo uretano, un grupo sililo, un grupo sulfoxido o una combinación de ellos,
R5, R6, R7, R8, R9 y R10 son, cada uno e independientemente, hidrógeno, hidroxilo (–OH) o un grupo –OR13, donde R13 15 es un grupo protector según la definición anterior,
imagen19
R11 y R12 son cada uno e independientemente hidrógeno, metilo (–CH3), un grupo hidroximetilo (-CH2OH) o un grupo -CH2OR14, donde R14 es un grupo protector según la definición anterior.
Se describen usos para, entre otros, los compuestos con las fórmulas (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI), (XVII) y (XVIII):
H HHH
N imagen20 N imagen21 N N
O
N NH H H
H imagen22 O imagen23 O imagen24 O imagen25 O imagen26 OH Me Me
imagen27Me
imagen28 Me OH OH OH OH
HO HO HO HO
imagen29
imagen30
imagen31
imagen32
(XII) (XIII) (XIV) (XV) HHH
N NN
imagen33
imagen34Oimagen35O imagen36O
Me
imagen37Me
Me
HO
OH HO
HO
imagen38
imagen39
imagen40
OH OH OH
(XVI) (XVII) (XVIII)
5 De todos estos compuestos, se ha descrito uso como inhibidor de proteína quinasa C (PKC) el compuesto de fórmula (XII), también denominado K252d, (J. Antibiot. 1986, 39, 1059-1065; J. Antibiot. 1986, 39, 1066-1071) y el compuesto de fórmula (XIV), también denominado RK-286D, (J. Antibiot. 1990, 43, 168-173; J. Antibiot. 1990, 43, 163-167; J. Antibiot. 1992, 45, 278-279).
Los compuestos de la invención son inhibidores de crecimiento de tumores y son por tanto útiles en el tratamiento del 10 cáncer.
Se describen las composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad efectiva de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI), (XVII) o (XVIII), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
15 Se describe también el uso de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI), (XVII) o (XVIII), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento.
Se describe el uso de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI), (XVII) o (XVIII), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, para
20 inhibir el crecimiento de un tumor.
Tal como es usado aquí, “inhibir” significa disminuir, hacer más lento o detener. Por tanto, un compuesto de esta invención puede disminuir, hacer más lento o detener el crecimiento de una célula tumoral. Tal como es usado aquí, “crecimiento” significa aumento en tamaño, o proliferación, o ambos. Por tanto, un compuesto de esta invención puede inhibir el aumento de tamaño de una célula tumoral y/o puede impedir que la célula tumoral se divida y aumente el 25 número de células tumorales. Una “célula tumoral” es una célula que constituye un neoplasma (crecimiento nuevo), el cual puede ser canceroso (maligno) o no canceroso (benigno). Una célula tumoral cancerosa puede invadir los tejidos normales a su alrededor y los vasos sanguíneos/linfáticos y formar metástasis en tejidos alejados del tumor original. Por el contrario, una célula tumoral no cancerosa puede crecer y comprimir los tejidos normales adyacentes pero no puede invadir tejidos normales y vasos sanguíneos/linfáticos, y tampoco puede formar metástasis en tejidos alejados del tumor
30 original.
Se describe también el uso de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI), (XVII) o (XVIII), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, para tratar el cáncer.
imagen41
Se describe también el uso de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI), (XVII) o (XVIII), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en la manufactura de un medicamento con actividad antitumoral.
Se describe también el uso de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), 5 (X), (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI), (XVII) o (XVIII), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
Se describe además un método de tratamiento de un sujeto, incluyendo un ser humano, diagnosticado con cáncer, que consiste en tratar a dicho mamífero con una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI), (XVII) o (XVIII), o una sal
10 o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
Tal como es usado aquí, un “sujeto” puede incluir mascotas (por ejemplo, gatos, perros, etc.), ganado (por ejemplo, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, etc.), animales de laboratorio (por ejemplo, ratones, conejos, cobayas, etc.) y pájaros. De manera preferente, el sujeto es un mamífero tal como un primate y, con mayor preferencia, un ser humano.
En general, una “cantidad efectiva” de un compuesto es aquella cantidad necesaria para conseguir el resultado
15 deseado. Por ejemplo, la cantidad efectiva de un compuesto de la presente invención trata el cáncer mediante la inhibición del crecimiento de las células que constituyen el tumor, con lo que previene la invasión de tejidos normales y vasos sanguíneos/linfáticos por parte de las células tumorales y, por tanto, previene metástasis. Ejemplos de cánceres que pueden ser tratados incluyen, pero no están limitados a, pulmón, colon, ovario, próstata, testículo, melanoma, riñón, mama, sistema nervioso central y leucemia. La expresión “composición farmacéutica aceptable” consiste en un material
20 adecuado biológicamente, es decir, que el material puede ser administrado al sujeto sin causarle efectos biológicos sustancialmente dañinos.
Las dosis o cantidades de los compuestos de la invención deben ser suficientemente grandes para producir el efecto deseado. Sin embargo, la dosis no debe ser tan grande que cause efectos secundarios adversos, por ejemplo reacciones cruzadas indeseadas, reacciones anafilácticas y similares. Generalmente, la dosis variará con la edad,
25 condición, sexo y el grado de la enfermedad del sujeto, y puede ser determinada por cualquier experto en la materia. La dosis puede ser ajustada por cada médico, en base a la condición clínica del sujeto implicado. La dosis, régimen de dosificación y ruta de la administración pueden variarse.
Se describe también el uso de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI), (XVII) o (XVIII), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en
30 la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades neurológicas.
Se describe además un método de tratamiento de un sujeto, incluyendo un ser humano, diagnosticado con una enfermedad neurológica, que consiste en tratar a dicho sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI), (XVII) o (XVIII), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable. El sujeto puede ser un mamífero,
35 preferentemente un ser humano, y el compuesto puede ser, entre otras vías, administrado parenteralmente.
Ejemplos de enfermedades neurológicas que pueden ser tratadas incluyen, pero no están limitados a, enfermedades neurodegenerativas tales como las enfermedades de Parkinson, Alzheimer, y Huntington.
Los compuestos de la invención pueden ser útiles para la investigación en bioquímica o biología celular. Por ejemplo, los compuestos pueden ser eficaces para inhibir la actividad de DNA topoisomerasas y de varias proteína quinasas en
40 cultivos in vitro de diversos tipos celulares. Ejemplos de DNA topoisomerasas que pueden ser inhibidas por los compuestos de la invención incluyen topoisomerasa I, topoisomerasa II, girasa y otras. Ejemplos de proteína quinasas que pueden ser inhibidas por los compuestos de la invención incluyen AurA, AurB, Chk1, Dyrk1a, Ftl3, FGFR1, HGK, Ikkb, Jak2, KDR, SYK, y otras.
Cualquiera de los compuestos de la invención puede ser utilizado terapéuticamente formando parte de una composición
45 farmacéutica aceptable. Cualquier experto en la materia puede crear composiciones farmacéuticas aceptables, las cuales pueden consistir en soluciones estériles en agua, soluciones salinas o soluciones tamponadas a pH fisiológico. Cualquiera de los compuestos de la invención puede ser preparado en forma de composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir diversos agentes transportadores, espesantes, tamponantes, conservantes, tensoactivos y otros, además del compuesto de la invención. Las composiciones farmacéuticas pueden
50 incluir también ingredientes activos tales como agentes antimicrobianos, antiinflamatorios, anestésicos, etc.
Los compuestos de la invención pueden ser administrados al sujeto de varias maneras distintas, dependiendo de si se desea que el tratamiento sea local o sistémico, y dependiendo del área a ser tratada. Así, por ejemplo, un compuesto de la presente invención puede ser administrado en forma de solución oftálmica, de aplicación en la superficie del ojo. Además un compuesto puede ser administrado a un sujeto por vía vaginal, rectal, intranasal, oral, por inhalación o por 55 vía parenteral, ya sea por ruta intradermal, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intrarrectal, intraarterial, intralinfática, intravenosa, intratecal e intratraqueal. La administración parenteral, si se emplea, se realiza generalmente mediante inyección. Las soluciones inyectables pueden ser preparadas de diversas formas, tales como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para ser disueltas o puestas en suspensión antes de la inyección, o como emulsiones. Otras formas de administración parenteral emplean sistemas de liberación lenta o sostenida, de tal forma que se consigue mantener una dosis constante (ver, por ejemplo, patente US 3,710,795). Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones estériles acuosas o no acuosas, suspensiones y emulsiones, y que 5 además pueden contener tampones y aditivos diluentes y otros. Ejemplos de solventes no acuosos son: propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como el aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como etiloleato. Ejemplos de solventes acuosos son: agua, soluciones alcohólico-acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo soluciones salinas y tamponadas. Ejemplos de vehículos parenterales son: solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, cloruro de sodio y dextrosa, etc. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, gases inertes, etc. Las formulaciones para administración tópica pueden incluir cremas, lociones, geles, gotas, supositorios, sprays, líquidos y polvos. También pueden ser necesarios ciertos transportadores farmacéuticos convencionales, bases acuosas, oleosas, o en polvo, espesantes, etc. Las composiciones para administración oral pueden incluir polvos o gránulos, suspensiones o soluciones en agua o en medio no acuoso, cápsulas o tabletas. Puede ser deseable la inclusión de agentes espesantes, saborizantes, diluentes,
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15 emulsionantes, dispersantes, etc.
A los efectos de la presente descripción y su descripción, el término “derivado” de la rebecamicina o estaurosporina debe interpretarse como un compuesto recubierto por cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (X) o (XI). Del mismo modo, el término “prodroga” debe interpretarse a los efectos de la presente descripción y de la descripción de la misma, como cualquier compuesto que libere, al circular en sangre o entrar en la célula, la rebecamicina, estaurosporina o un derivado, de acuerdo con cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (X) o (XI), de las mismas.
Breve descripción de las figuras
Fig. 1. Estructura química de la estaurosporina (STP) y la rebecamicina (RBM).
Fig. 2. Biosíntesis de un indolocarbazol glicosilado. Abreviaturas: Trp (triptófano), CPA (ácido cromopirrólico), AF (arciriaflavina A), NDP-L-rham (nucleosidil difosfato [NDP]-L-ramnosa), Glc-1-P (glucosa 1-fosfato), IG(1N)
25 (indolocarbazol glicosilado con azúcar unido por un solo enlace), IG(2N) (indolocarbazol glicosilado con azúcar unido por dos enlaces). RebO, RebD, RebC y RebP son enzimas que participan en la biosíntesis de rebecamicina. StaG y StaN son enzimas de la ruta de formación de estaurosporina. OleL, OleS, OleE y OleU son enzimas implicados en la formación de los azúcares de la oleandomicina.
Fig. 3. Plásmidos utilizados, mostrando su composición genética. Los triángulos negros representan el promotor P*ermE.
Fig. 4A, Fig. 4B, Fig. 4C, Fig. 4D. Análisis mediante HPLC de los cultivos de las cepas recombinantes generadas con plásmidos que dirigen la biosíntesis de diferentes desoxiazúcares: S. albus 16GNT(pRHAM) (Fig. 4A), S. albus 16GNT(pLN2) (Fig. 4B), S. albus 16GNT(pLNR) (Fig. 4C) y S. albus 16GNT(pLNBIV) (Fig. 4D). Guía de picos: (VII): N125’(S)-N13-1’-(R)-L-ramnosilarciriaflavina [fórmula (VII)]; (III): N13-1’-ß-L-rhamnosilarciriaflavina [fórmula (III)]; (VIII): N125’(S)-N13-1’-(R)-L-olivosilarciriaflavina [fórmula (VIII)]; (IV): N13-1’-ß-L-olivosilarciriaflavina [fórmula (IV)]; (VI): N13-1’-ß-D
35 olivosilarciriaflavina [fórmula (VI)]; (V): N13-1’-ß-L-digitoxosilarciriaflavina [fórmula (V)]; (IX): N12-5’(S)-N13-1’-(R)-Ldigitoxosilarciriaflavina [fórmula (IX)].
Fig. 5. Estructuras químicas de [fórmula (III)], [fórmula (IV)], [fórmula (V)], [fórmula (VI)], [fórmula (VII)], [fórmula (VIII)], [fórmula (IX)], [fórmula (XII)], [fórmula (XIII)], [fórmula (XIV)], [fórmula (XV)], [fórmula (XVI)], [fórmula (XVII)] y [fórmula (XVIII)].
Explicación de una forma de realización preferente
Para una mejor comprensión de la presente descripción, se exponen los siguientes ejemplos.
En los siguientes ejemplos se emplean técnicas de manipulación de DNA bien conocidas en el estado de la técnica, tales como las descritas por Sambrook y colaboradores (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989), y por Kieser y colaboradores (Practical Streptomyces genetics, The John
45 Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000).
Ejemplo 1. Obtención de las cepas bacterianas Streptomyces albus 16GNT(pRHAM), Streptomyces albus 16GNT(pLNBIV), Streptomyces albus 16GNT(pLN2) y Streptomyces albus 16GNT(pLNR).
En primer lugar, se construyó el plásmido pKC16GNT, el cual codifica cuatro enzimas para la formación del aglicón indolocarbazol (RebO, RebD, RebC y RebP), una glicosiltransferasa para la formación del enlace N-glicosídico (StaG), una oxigenasa de tipo P-450 para la formación del segundo enlace aglicón-azúcar (StaN), y una proteína que confiere resistencia a rebecamicina (RebT). Para ello, un fragmento de DNA incluyendo staG y staN fue obtenido por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) empleando DNA total de Streptomyces longisporoflavus DSM10189 y los oligonucleótidos CS043 (5’-TATATTACTAGTCGCGGAGGCGACGTTGAC-3’) y STAN2 (5’-TATCTAGAGTCAGTTCAGTACGGCGGGC-3’). Este fragmento de DNA fue clonado como un fragmento SpeI-XbaI en 55 los mismos sitios de LITMUS 28 (New England BioLabs), generándose el plásmido pLGTFstaN. Seguidamente, el plásmido pKC16GNT fue obtenido mediante la clonación en tándem, en el sitio XbaI de pKC016 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005, 102, 461-466), de tres fragmentos de DNA conteniendo: el promotor ermE*p (aislado como un fragmento
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HindIII-BamHI a partir del plásmido pEM4 [Mol. Microbiol. 1998, 28, 1177-1185]), el inserto de pLGTFstaN (conteniendo staG y staN) y el gen rebT (obtenido mediante PCR de la forma descrita en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005, 102, 461466), respectivamente.
A continuación, se introdujo dicho plásmido pKC16GNT en Streptomyces albus J1074 (J. Gen. Microbiol. 1980, 116, 323-334), generándose la cepa Streptomyces albus 16GNT. La introducción del plásmido se realizó mediante transformación de protoplastos, siguiendo procedimientos estándar (Kieser et al., Practical Streptomyces genetics, The John Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000). A partir de la cepa Streptomyces albus 16GNT se obtuvieron las cepas bacterianas Streptomyces albus 16GNT(pRHAM), Streptomyces albus 16GNT(pLNBIV), Streptomyces albus 16GNT(pLN2) y Streptomyces albus 16GNT(pLNR) mediante la introducción, por separado, de cada uno de los siguientes plásmidos: pRHAM, pLNBIV, pLN2 y pLNR, respectivamente. Estos cuatro plásmidos han sido descritos con anterioridad (J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2000, 2, 271-276; Chem. Biol. 2002, 9, 721-729; J. Nat. Prod. 2002, 65, 16851689), y codifican enzimas para la biosíntesis de los siguientes azúcares (en forma de derivados NDP o nucleosidil difosfato): L-ramnosa, L-digitoxosa, L-olivosa y D-olivosa, respectivamente.
Las cepas Streptomyces albus 16GNT(pRHAM) Streptomyces albus 16GNT(pLNBIV), Streptomyces albus 16GNT(pLN2) y Streptomyces albus 16GNT(pLNR) fueron depositadas con fecha 14/03/2008 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Campus de Burjassot, 46100 Burjassot (Valencia, España) con números de acceso CECT 7388, CECT 7389, CECT 7390 y CECT 7391, respectivamente.
Ejemplo 2. Producción de los compuestos de fórmula (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), y de los compuestos defórmula (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI) y (XVIII).
La obtención de los nuevos derivados indolocarbazólicos se realizó mediante HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) preparativa. Para la obtención de los compuestos de fórmulas (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII) y (IX), las cepas Streptomyces albus 16GNT(pRHAM) Streptomyces albus 16GNT(pLNBIV), Streptomyces albus 16GNT(pLN2) y Streptomyces albus 16GNT(pLNR) se cultivaron primero en 50 ml de TSB con el marcador de resistencia adecuado y se dejaron crecer 24 horas a 30°C y a 250 rpm. Pasadas 24 horas, a partir del pre-inóculo se inocularon al 2,5% matraces con 400 ml de medio R5A líquido, tal como se ha descrito anteriormente (Mol. Microbiol. 2005, 58, 17-27).
En el paso de producción, se emplearon 8 matraces Erlenmeyer de 2 litros, cada uno de ellos conteniendo 400 ml de medio, los cuales fueron incubados a 30°C y 250 rpm, durante 4-5 días. Los cultivos se centrifugaron a 12.000 rpm durante 30 minutos. La mayoría de estos compuestos se encuentran tanto en el caldo como en las células. Los precipitados se extrajeron con acetona y los sobrenadantes se filtraron usando un cartucho Mini Profil de 1μm (Pall). El caldo filtrado se sometió a extracción en fase sólida (SepPaK Vac C18, Waters). Los compuestos retenidos se eluyeron con un gradiente lineal de metanol y 0,1% TFA en agua (0 a 100% metanol en 60 min, a 10 ml/min), recogiendo fracciones cada 5 minutos.
Los extractos obtenidos fueron analizados por HPLC. Se realizó utilizando un módulo cromatográfico Alliance acoplado a un detector de fotodiodos 2996 y a un espectrómetro de masas ZQ4000 (Waters-Micromass). La columna utilizada fue una Symmetry C18 (2,1 x 150 mm, Waters) utilizando como solventes acetonitrilo y 0,1% ácido trifluoroacético en agua. La elución empezó con 10% de acetonitrilo durante 4 minutos, seguido por un gradiente linear hasta alcanzar el 88% en el minuto 30, finalmente se bombeó 100% acetonitrilo durante 5 minutos, con un flujo de 0,25 ml/min. se realizó mediante ionización por electrospray (ESI) en modo positivo, con un voltaje de capilar de 3KV y voltajes de cono de 20, 60 y 100V. La longitud de onda a la que se obtuvieron los cromatogramas fue de 290 nm para los compuestos con espectro de estaurosporina y de 316 nm para los compuestos con espectro de rebecamicina.
Tras su análisis, aquellas que contenían los compuestos buscados se evaporaron en el rotavapor, previa adición de 10 ml de tampón fosfato 0,1M pH 7 a cada una de ellas. Los extractos, previamente disueltos en un pequeño volumen de DMSO y acetona (50:50) se cromatografiaron en un cartucho de compresión radial μBondapak C18 (PrepPaK Cartridge, 25 x 100 mm, Waters), utilizando como fase móvil mezclas de acetonitrilo (o metanol) y 0,1% TFA en agua a un flujo de 10 ml/min y recogiendo los compuestos de interés en múltiples inyecciones. En otras purificaciones se usó una columna XTerra (7,8 x 300 mm, Waters) y se siguió el mismo procedimiento aunque trabajando a 3 ml/min. Las soluciones de compuesto purificado se diluyeron con tres volúmenes de agua y se sometieron a extracción en fase sólida para eliminar el ácido de la fase móvil y concentrar los compuestos. Finalmente, éstos se liofilizaron para su conservación.
De esta manera se obtuvieron los siguientes compuestos (Fig. 4). A partir de S. albus 16GNT(pRHAM): 1 mg de N13-1’ß-L-rhamnosilarciriaflavina [fórmula (III)] y 1,2 mg de N12-5’(S)-N13-1’-(R)-L-ramnosilarciriaflavina [fórmula (VII)]. A partir de S. albus 16GNT(pLN2): 2,1 mg de N12-5’(S)-N13-1’-(R)-L-olivosilarciriaflavina [fórmula (VIII)] y 1,2 mg de N13-1’-ß-Lolivosilarciriaflavina [fórmula (IV)]. A partir de S. albus 16GNT(pLNR): 0,8 mg de N13-1’-ß-D-olivosilarciriaflavina [fórmula (VI)]. A partir de S. albus 16GNT(pLNBIV): 1,6 mg de N13-1’-ß-L-digitoxosilarciriaflavina [fórmula (V)] y 1,1 mg de N125’(S)-N13-1’-(R)-L-digitoxosilarciriaflavina [fórmula (IX)].
Los compuestos de fórmulas (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI) y (XVIII) se obtuvieron de forma similar, descrita en Mol. Microbiol. 2005, 58, 17-27.
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Ejemplo 3. Caracterización de los compuestos de fórmula (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), y de los compuestosde fórmula (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI) y (XVIII).
Los compuestos se identificaron inicialmente mediante análisis por HPLC, comparando el espectro de absorción y analizando la masa del ion molecular. El análisis de los extractos de la cepa S. albus 16GNT (pRHAM) mostró dos picos (Fig. 4A) con iones m/z 472 y 470, respectivamente, consistentes con la presencia de L-ramnosa unida a uno y a ambos átomos de nitrógeno del anillo indolocarbazol, respectivamente. El cromatograma correspondiente a la cepa 16GNT(pLN2) también mostró dos picos con el espectro característico de indolocarbazol (Fig. 4B), uno con ión m/z de 454 y otro con ión m/z de 456. Estas masas son las esperadas para la incorporación de L-olivosa unida al aglicón a través de dos y un enlace C-N, respectivamente. En la cepa 16GNT(pLNR) se detectó un único pico (Fig. 4C) con ión m/z de 456 consistente con la unión de D-olivosa a uno sólo de los nitrógenos del aglicón indolocarbazol. Finalmente la cepa 16GNT(pLNBIV) mostró dos picos (Fig. 4D) con iones m/z 456 y 454 respectivamente consistentes con la unión de L-digitoxosa a través de uno y de dos enlaces C-N.
La identificación definitiva se realizó mediante Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de protón. La preparación de la muestra se hizo disolviendo 95-160 µg de producto puro en 200 µl de acetona-d6 y trasferido a un tubo de RMN de 3 mm. Las señales del disolvente se utilizaron como referencia interna. Los espectros de RMN fueron registrados a 298K en un espectrofotómetro Bruker Avance 600 equipado con una criosonda de 5mm TCI. Los valores típicos para experimentos 2D fueron: COSY, 256 y 2048 puntos en F1 y F2, respectivamente, 16 transientes cada uno; HSQCeditado, 256 y 2048 puntos en F1 y F2, respectivamente, 48 transientes cada uno; HMBC, 512 y 2048 puntos en F1 y F2, respectivamente, 64 transientes cada uno. Los tiempos de mezcla para los experimentos 1D sel-nOe fueron 400 ms. Los experimentos de RMN fueron procesados usando el programa Topspin 1.3 (Bruker GmbH, Karlsruhe, Alemania). Las Tablas 1 a 7 muestran los datos obtenidos para los compuestos de fórmulas (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII) y (IX).
Los compuestos de fórmulas (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI) y (XVIII) se caracterizaron de forma similar, tal como se describe en Mol. Microbiol. 2005, 58, 17-27.
Ejemplo 4. Inhibición de proteína quinasas por parte de los compuestos de fórmula (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII),
(IX) y de los compuestos de fórmula (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI) y (XVIII).
El análisis de actividad kinasa descrito aquí fue realizado utilizando la tecnología LabChip (Caliper Life Sciences), concretamente los instrumentos Caliper LC3000 y el EZ Reader II.
El ensayo kinasa utilizado mide la conversión de un péptido fluorescente (sustrato) a un producto fosforilado. La mezcla de reacción, en un pocillo de microplaca, se introduce mediante un capilar en un chip donde el sustrato no fosforilado y el producto fosforilado se separan por electroforesis y se detectan por fluorescencia inducida por láser. La intensidad de la señal fluorescente con el tiempo se relaciona con el progreso de la reacción. El producto fosforilado migra más rápidamente que el sustrato no fosforilado y las señales de las dos formas del péptido aparecen como picos diferenciados. El software de Caliper determina la altura de picos y calcula la proporción de producto en relación a la suma de picos (P/(P+S)). Este valor su usa para comparar pocillos con compuestos y pocillos con controles y así determinar el % de inhibición para un compuesto dado.
Las siguientes quinasas se utilizaron para los estudios de inhibición enzimáticos, entre paréntesis el valor de la constante de Michaelis-Menten, Km, del ATP (Adenosina trifosfato) para cada quinasa, en µM: obtenidas de Carna Biosciences: MAPKAPK2 (4,6), AurA (3,6), AurB (5), PKC (3,8), RSK1 (23,3), PRAK (5), Erk1 (33,4), PKD2 (32,1), CK1d (16,3), CHK1 (33), ABL (61,7), FYN (36), LYNa (17), CHK2 (57,8), MET (79,5), LCK (28,5), SRC (38), GSK3ß (7,3), Erk2 (62,1), PKACα (1,7), AKT2 (186,1), INSR (871,8), p38a (396,5), AKT1(48), MSK1 (21,2), PKCß2 (84,8), ROCK2 (3,3), PIM2 (4,9), AMPK (38,6), KDR (164,8), IRAK4 (196,5), SGK1 (121,8), SYK (33,5); obtenidas de Invitrogen: CDK2 (57,6), BTK (123), HGK (80); obtenidas de Upstate: MST2 (36,6), PKGα (16), PAK2 (1,9), IGF1R (320), FGFR1 (171), MARK1 (33), CAMK2 (22,4), c-TAK1 (66), DYRK1a (18,1), CaMK4 (3,9), FLT3 (350), c-Raf (6,2), P70S6K (95).
Los compuestos se disolvieron en 100% DMSO y se diluyeron a 25 veces la concentración final deseada para el ensayo. En el caso de la determinación de valores IC50, se realizaron diluciones seriadas para alcanzar ocho concentraciones y dar lugar a la curva de inhibición. Se transfiere 1µL de cada concentración, en duplicado, a una microplaca de 384 pocillos. Se añade a cada pocillo 12µL de tampón enzimático conteniendo kinasa purificada (varios proveedores como se indica arriba), 100 mM HEPES, pH 7.5, 1 mM DTT (Calbiochem), 0.002% Brij-35 (Sigma) y también en presencia de 10mM MgCl2 como cofactor, excepto para INSR y IRAK4 en que se usa 10mM MnCl2 en lugar del MgCl2. Para las quinasas CAMK2 y CAMK4 se añade además 1mM CaCl2 y 6,7 µg/mL de calmodulina. Para la quinasa KDR, se añade 0,05% del detergente CHAPSO. Para la quinasa c-Raf se añade 10mM MnCl2. Para PKCß2 se añaden 0,02 µg/mL de PS/PMA. Para PKGα se añade 10µM de cGMP (guanosina monofosfato ciclico). El compuesto y el enzima se dejan 15 minutos preincubando, y a continuación se añaden a cada pocillo 12 µL de tampón péptido/ATP conteniendo 100 mM HEPES, pH 7.5, 1.5 µM péptido marcado con fluoresceina (específico para la kinasa correspondiente), ATP (a la concentración KM), y 0.002% Brij-35 para iniciar la reacción. Generalmente las reacciones se incuban durante 1-1,5h a temperatura ambiente para obtener una conversión adecuada (15-40%) del péptido al producto fosforilado. Las reacciones fueron terminadas mediante la adición de 45µL de tampón conteniendo 0mM EDTA. Las microplacas fueron leídas por el LabChip 3000 utilizando un LabChip de 12 canales. Los valores P/(P+S) fueron obtenidos como se describe arriba y las curvas IC50 fueron generadas usando Xlfit.
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La Tabla 9a presenta los datos de IC50 obtenidos en parejas de compuesto-quinasa seleccionadas entre los compuestos de fórmula (VII), (VIII), (IX), (XVI), (XVII) y (XVIII) tras realizar medidas de inhibición a 100nM y 10nM. 5 Aquéllas parejas que proveían >70% de inhibición a 10nM se consideraron para medir su IC50.
La Tabla 9b muestra el porcentaje de inhibición obtenido por compuestos de fórmula (III), (IV), (V), (VI), (XII), (XIII),
(XIV) y (XV) cuando se utilizan a concentraciones 100nM y 10nM. Por ejemplo, la actividad de la quinasa Dyrk1a es inhibida en un 87% por el compuesto de fórmula (III) y completamente por el compuesto de fórmula (XII) cuando se utilizan a una concentración 10nM.
10 Ejemplo 5. Actividad antitumoral de los compuestos de fórmula (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX) y de los compuestos de fórmula (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI) y (XVIII).
Los compuestos generados se ensayaron frente a una serie de líneas celulares procedentes de tumores. Se determinó cuantitativamente el crecimiento celular y la viabilidad, utilizando un ensayo tipo colorimétrico, usando la reacción con sulforrodamina B (SRB), según la técnica descrita por Faircloth y colaboradores (Journal of Tissue and Culture Methods
15 1988, 11, 201-205). Los resultados se muestran en la Tabla 5.
Se inoculan placas de “microtiter” de 96 pocillos, con células (5x103 células por pocillo) en alícuotas de 195 µl de medio, incubándolas durante 18 h, en medio sin compuesto añadido, para permitir que las células se adhieran a la superficie. A continuación, se añaden los compuestos a ensayar, en muestras de 5 µl, en un rango de concentraciones de 10 a 10-8 µg/ml, disueltas en DMSO/EtOH (0.2% en tampón PS). Tras 48 h de exposición, se mide el efecto antitumoral utilizando 20 la técnica de Sulforodamina B (SRB): se fijan las células añadiendo 50 µl de ácido tricloroacético frío al 50% (p/v) y se incuba durante 60 min. a 4ºC. Las placas se lavan con agua desionizada y se secan. Se añaden 100 µl de solución de SRB (0.4% p/v en ácido acético al 1%) a cada pocillo, y se incuba durante 10 min. a temperatura ambiente. Se elimina la SRB no unida, lavando con ácido acético al 1%. Las placas se secan al aire y el colorante unido se disuelve con tampón Tris. Se leen las densidades ópticas en un lector espectrofotómetro de placas automático a una longitud de
25 onda de 490 nm.
En la Tabla 8 se muestran los resultados de las GI50 (inhibición del crecimiento) en µM. Para los compuestos de fórmula (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX) y los compuestos de fórmula (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI) y (XVIII).
Tabla 1. Datos de espectros de RMN de N13-1’-ß-L-rhamnosilarciriaflavina [fórmula (III)] en acetona-d6. (1H a 600 MHz, 13C a 150 MHz).
Posición
13C (ppm) 1H (ppm) Multipl. J (H, H) (Hz)
1
110,83 7,826 d 8,3
2
127,4 7,608 td 7,5, 1,2
3
121,17 7,402 td 7,6, 0,8
4
125,76 9,339 d 7,6
4a
122,72 -
4b
119,08 -
4c
NO -
5
NO -
6
- 9,871 s
7
NO -
7a
NO -
7b
117,87 -
7c
122,46 -
8
125,76 9,232 d 7,9
9
120,88 7,328 td 7,6, 1,1
10
127,39 7,533 td 7,5, 1,2
11
111,81 7,647 d 8,3 8,4
12
- 11,727 s
11a
141,62 -
12a
NO -
12b
129,51 -
13a
142,87 -
1'
78,5 6,629 d 9,5
2'
68,76 4,774 ddd 9,9, 6,8, 3,3
2'OH
- 4,654 m
3'
73,09 4,469 d 3,2
3'OH
- 4,65 m
4'
72,36 4,34 d 3,6
4'OH
- 5,92 d 3,2
5'
78,03 4,68 dq 7,3, 1,3
5'CH3
15,42 1,825 d 7,3
imagen44
Tabla 2. Datos de espectros de RMN de N13-1’-ß-L-olivosilarciriaflavina [fórmula (IV)] en acetona-d6. (1H a 600 MHz, 13C a 150 MHz).
Posición
13C (ppm) 1H (ppm) Multipl. J (H, H) (Hz)
1
110,22 7,783 d 8,4
2
128,27 7,644 t 7,6
3
121,85 7,425 td 7,3, 0,8
4
126,59 9,367 d 8
4a
122,63 -
4b
118,59 -
4c
120,29 -
5
NO -
6
- 9,879 s
7
NO -
7a
120,29 -
7b
116,28 -
7c
122,17 -
8
126,21 9,234 d 8,1
9
121,38 7,35 td 7,4, 1,1
10
127,86 7,54 td 7,1, 1,2
11
112,38 7,674 d 8,4
12
- 11,935 s
11a
141,41 -
12a
130,16 -
12b
129,22 -
13a
140,9 -
1'
74,61 6,926 dd 11,6, 3,4
2'a
34,54 2,979 ddd 14,9, 11,9, 3,3
2'e
34,54 1,98 ddd 14,3, 3,1, 2,7
3'
69,97 4,461 m
3'OH
- 4,86 m
4'
70,3 4,072 m
4'OH
- 5,83 m
5'
78,43 4,73 q 7,5
5'CH3
15,63 1,844 d 7,2
Tabla 3. Datos de espectros de RMN de N13-1’-ß-L-digitoxosilarciriaflavina [fórmula (V)] en acetona-d6. (1H a 600 MHz, 13C a 150 MHz).
Posición
13C (ppm) 1H (ppm) Multipl. J (H, H) (Hz)
1
110,02 7,921 d 8,7
2
127,44 7,601 td 7,4, 1,38
3
121,27 7,407 td 7,5, 0 8
4
125,89 9,364 d 7,9
4a
122,25 -
4b
118,68 -
4c
122,42 -
5
NO -
6
- 9,862 s
7
NO -
7a
122,42 -
7b
118,05 -
7c
122,18 -
8
125,38 9,231 d
8
9
120,5 7,338 td 7,5, 0 8
10
127,25 7,535 dt 7,4, 1,1
11
112,13 7,743 d 7,8
11a
141,85 -
12
- 12,185 s
12a
130,16 -
12b
128,97 -
13
-
13a
140,95 -
1'
76,95 6,793 dd 11,7, 3,5
2'a
36,11 2,704 dd 12,5, 11,9
2'e
36,11 2,196 ddd 12,9, 5,0, 3,5
3'
65,3 4,62 ddd 11,5, 5,3, 2,0
3'OH
- NO
4'
71,61 4,154 t 2
4'OH
- NO
5'
76,55 4,739 dq 1,7, 7,2
5'CH3
14,85 1,67 d 7,2
imagen45
Tabla 4. Datos de espectros de RMN de N13-1’-ß-D-olivosilarciriaflavina [fórmula (VI)] en acetona-d6. (1H a 600 MHz, 13C a 150 MHz).
Posición
13C (ppm) 1H (ppm) Multipl. J (H, H) (Hz)
1
111,2 7,985 d 8,6
2
127,6 7,629 td 7,6, 1,0
3
121,78 7,432 td 7,3, 0,8
4
125,9 9,324 d 7,8
4a
122,95 -
4b
119,57 -
4c
NO -
5
NO -
6
- 9,957 s
7
NO -
7a
NO -
7b
NO -
7c
122,91 -
8
125,6 9,222 d
8
9
121,15 7,406 td 7,6, 0,8
10
127,79 7,601 td 7,6, 1,2
11
112,07 7,809 d 8,2
12
10,927 s
11a
141,09 -
12a
NO -
12b
NO -
13a
141,39 -
1'
82,88 6,685 dd 11,2, 2,7
2'a
29,82 2,245 ddd 13,2, 11,2, 5,2
2'e
29,82 2,186 ddd 13,2, 5,2, 2,8
3'
72,03 4,102 m
3'OH
- NO m
4'
78,02 3,676 dd 9,5, 9,1
4'OH
- NO m
5'
76,92 4,11 dd 9,5, 6,1
5'CH3
18,39 1,719 d 6,1
Tabla 5. Datos de espectros de RMN de N12-5’(S)-N13-1’-(R)-L-ramnosilarciriaflavina [fórmula (VII)] en acetona-d6. (1H a 600 MHz, 13C a 150 MHz).
Posición
13C (ppm) 1H (ppm) Multipl. J (H, H) (Hz)
1
109,68 8,25 d 8,3
2
127,87 7,659 td 7,1, 1,1
3
120,95 7,46 td 6,8, 0,8
4
126,06 9,26 d 7,9
4a
122,87 -
4b
NO -
4c
NO -
5
NO -
6
- 9,906 s
7
NO -
7a
NO -
7b
NO -
7c
124,26 -
8
126,06 9,38 d 8,3
9
120,86 7,36 td 7,8, 0,8
10
126,11 7,518 td 6,8 1,5
11
117,49 8,21 d 8,6
11a
142,82 -
12a
NO -
12b
129,69 -
13a
139,08 -
1'
88,27 6,726 d 1,8
2'
72,75 4,47 s
2'OH
- 5,299 m
3'
65,91 3,872 dd 11,1, 2,6
3'OH
- 4,118 m
4'
74,42 4,661 dd 11,1, 3,7
4'OH
- 4,956 m
5'
97,62 -
5'CH3
29,77 2,463 s
Tabla 6. Datos de espectros de RMN de N12-5’(S)-N13-1’-(R)-L-olivosilarciriaflavina [fórmula (VIII)] en acetona-d6. (1H a 600 MHz, 13C a 150 MHz).
Posición
13C (ppm) 1H (ppm) Multipl. J (H, H) (Hz)
1
109,55 7,711 d 8,3
2
127,44 7,641 td 7,7, 1,1
3
121,27 7,447 td 7,4, 0,8
4
125,9 9,265 d 8,3
4a
123,07 -
4b
117,96 -
4c
NO -
5
NO -
6
- 9,894 s
7
NO -
7a
NO -
7b
117,96 -
7c
124,45 -
8
125,2 8,894 d 7,9
9
120,76 7,354 t 7,1
10
126,58 7,509 dt 8,0, 1,5
11
116,7 8,222 d 8,7
11a
142,53 -
12a
NO -
12b
129,68 -
13a
138,6 -
1'
83,36 6,958 dd 4,9, 1,5
2'a
38,95 2,587 ddd 13,8, 11,7, 5,0
2'e
38,95 2,647 ddd 13,8, 4,2, 1,5
3'
63,22 3,85 ddd 11,5, 9,8, 4,2
3'OH
NO 3,812 s
4'
81,03 4,108 t 9,8
4'OH
- 4,103 s
5'
97,32 -
5'CH3
29,38 2,463 s
imagen46
Tabla 7. Datos de espectros de RMN de N12-5’(S)-N13-1’-(R)-L-digitoxosilarciriaflavina [fórmula (IX)] en acetona-d6. (1H a 600 MHz, 13C a 150 MHz).
Posición
13C (ppm) 1H (ppm) Multipl. J (H, H) (Hz)
1
109,31 7,65 d 8,3
2
127,07 7,6 td 7,0, 1,3
3
120,93 7,402 td 7,3, 1,1
4
125,85 9,24 d 8
4a
123,16 -
4b
116,15 -
4c
NO -
5
NO -
6
- 9,783 s
7
NO -
7a
NO -
7b
117,55 -
7c
124,57 -
8
125,31 9,36 d 8,2
9
120,53 7,32 dt 7,6, 0 8
10
126,35 7,48 dt 7,9, 1,6
11
116,34 8,18 d 8,7
11a
142,39 -
12a
NO -
12b
131,21 -
13a
139,12 -
1'
80,37 6,82 dd 5,6, 1,4
2'a
34,85 2,8 ddd 15, 3,0, 5,6
2'e
34,85 2,7 ddd 15,0, 3,4, 1,4
3'
65,14 4,275 ddd 3,0, 3,0, 3,0
3'OH
- NO
4'
74,44 4305 d 3
4'OH
- NO
5'
-
5'CH3
30,37 2,404 s
Tabla 8. Ensayo de la actividad antitumoral de indolocarbazoles frente a líneas celulares tumorales. Se incluyen también los datos obtenidos con STP y RBM como referencia. Los valores numéricos hacen referencia a la GI50 (µM), o concentración a la que el compuesto ensayado inhibe el 50% del crecimiento celular en comparación con células no tratadas. N13-1’-ß-L-rhamnosilarciriaflavina [fórmula (III)], N13-1’-ß-L-olivosilarciriaflavina [fórmula (IV)], N13-1’-ß-L5 digitoxosilarciriaflavina [fórmula (V)], N13-1’-ß-D-olivosilarciriaflavina [fórmula (VI)], N12-5’(S)-N13-1’-(R)-Lramnosilarciriaflavina [fórmula (VII)], N12-5’(S)-N13-1’-(R)-L-olivosilarciriaflavina [fórmula (VIII)], N12-5’(S)-N13-1’-(R)-Ldigitoxosilarciriaflavina [fórmula (IX)], N13-1’-ß-L-rhamnosil-k252c [fórmula (XII)], N13-1’-ß-L-olivosil-k252c [fórmula (XIII)], N13-1’-ß-L-digitoxosil-k252c [fórmula (XIV)], N13-1’-ß-D-olivosil-k252c [fórmula (XV)], N12-5’(S)-N13-1’-(R)-L-ramnosilk252c [fórmula (XVI)], N12-5’(S)-N13-1’-(R)-L-olivosil-k252c [fórmula (XVII)] y N12-5’(S)-N13-1’-(R)-L-digitoxosil-k252c
10 [fórmula (XVIII)].
Línea celular
compuestos
(tipo de cáncer)
STP RBM III IV V VI VII VIII IX
MDA-MB-231 (mama)
0,013 - 4,40 14,1 4,19 2,43 1,35 7,50 8,16
A549 (pulmón)
0,008 0,76 4,18 8,79 4,41 2,21 2,04 5,73 5,51
HT29 (colon)
0,076 1,55 2,42 8,79 6,39 2,16 2,45 11,2 8,16
Línea celular
compuestos
(tipo de cáncer)
STP RBM XII XIII XIV XV XVI XVII XVIII
MDA-MB-231 (mama)
0,013 - 1,97 1,43 2,49 3,17 0,59 1,05 1,84
A549 (pulmón)
0,008 0,76 2,84 1,56 3,40 4,98 0,61 1,02 1,96
HT29 (colon)
0,076 1,55 2,10 1,52 3,40 3,85 0,87 1,21 1,52
imagen47
Tabla 9a. Ensayo de la actividad kinasa de indolocarbazoles de los compuestos N12-5’(S)-N13-1’-(R)-Lramnosilarciriaflavina [fórmula (VII)], N12-5’(S)-N13-1’-(R)-L-olivosilarciriaflavina [fórmula (VIII)], N12-5’(S)-N13-1’-(R)-Ldigitoxosilarciriaflavina [fórmula (IX)], N12-5’(S)-N13-1’-(R)-L-ramnosil-k252c [fórmula (XVI)], N12-5’(S)-N13-1’-(R)-Lolivosil-k252c [fórmula (XVII)] y N12-5’(S)-N13-1’-(R)-L-digitoxosil-k252c [fórmula (XVIII)]. Los valores numéricos hacen referencia a la IC50 (nM), o concentración a la que el compuesto ensayado inhibe el 50% de la actividad kinasa en comparación con ensayos control. Las kinasas ensayadas son AurA, AurB, Chk1, Dyrk1a, Ftl3, FGFR1, HGK, Ikkb, Jak2, KDR y SYK.
VII
VIII IX XVI XVII XVIII
AurA
>10 >10 6.7 - 5.0 >10
AurB
- - 4.5 - 6.8 -
Chk1
1.0 4.9 - 2.4 - >10
Dyrk1a
4.0 - >10 - - >100
Ftl3
0.57 0.56 0.43 0.59 0.54 -
FGFR1
8.9 - >10 - >10 >100
HGK
0.78 - >10 - - >10
Ikkb
0.17 <0.03 >10 - - >100
Jak2
0.50 0.74 1.2 0.43 0.57 0.53
KDR
3.7 0.55 >10 - - >10
SYK
1.0 1.1 2.3 - - >10
10
Tabla 9b. ensayo de la actividad kinasa de indolocarbazoles de los compuestos N13-1’ -β-L-ramnosilarciriaflavina [fórmula (III)], N13- 1’-β-L-olivosilarciriaflavina [fórmula (IV)], N13- 1’-β-L-digitoxosilarciriaflavina [fórmula (V)], N13- 1’-β
15 D-olivosilarciriaflavina [fórmula (VI)], N13- 1’-β-L-ramnosil-k252c [fórmula (XII)], N13- 1’ -β-L-olivosil-k252c [formula (XIII)], N13- 1’-β-L-digitoxosil-k252c [formula (XIV)], N13- 1’-β-D-olivosil-k252c [formula (XV)]. Los valores numéricos hacen referencia a la actividad kinasa remanente (en %) tras el tratamiento con el compuesto ensayado a las concentraciones de 10 nM y 100 nM. Las kinasas ensayadas son AmpKa1, AurA, CamK2a, Chk1, Dyrk1a, Erk2, FGFR1, FGFR3, Ftl3, GSK3β, HGK, Ikkb, Jak2, KDR, MST2, p38a, PDK1, RSK1 y SGK1.
imagen48

Claims (10)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto seleccionado de entre el grupo:
    H
    imagen2
    imagen3
    imagen4
    (IV)
    (V)
    (VI)
    imagen5
  2. 2. Un método para producir derivados de rebecamicina o estaurosporina seleccionados de entre el grupo:
    imagen6
    (IV)
    (V)
    (VI)
    imagen7
    imagen8
    5 que comprende:
    a) incubar una cepa bacteriana derivada de Streptomyces albus para producir una composición que incluye un derivado de rebecamicina o de estaurosporina; y
    b) aislar un derivado de rebecamicina o estaurosporina a partir de la composición 10 producida en el paso (a),
    caracterizado porque dicha cepa tiene ácidos nucleicos adicionales que codifican enzimas activos para la biosíntesis de indolocarbazoles glicosilados, no estando estos enzimas presentes en
    Streptomyces albus
  3. 3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque la cepa bacteriana se selecciona
    15 entre Streptomyces albus 16GNT (pLNBIV), Streptomyces albus 16GNT (pLN2) o Streptomyces albus 16GNT (pLNR).
    imagen9
  4. 4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque dicha cepa se selecciona entre:
    (i) Streptomyces albus 16GNT (pLNBIV), y donde dichos ácidos nucleicos son los plásmidos pKC16GNT y pLNBIV que codifican enzimas activos para la biosíntesis del compuesto de fórmula (IV) y de sus intermediarios biosintéticos,
    5 (ii) Streptomyces albus 16GNT (pLN2), y donde dichos ácidos nucleicos son los plásmidos pKC16GNT y pLN2 que codifican enzimas activos para la biosíntesis del compuesto de fórmula (V) y de sus intermediarios biosintéticos,
    (iii) Streptomyces albus 16GNT (pLNR), y donde dichos ácidos nucleicos son los
    plásmidos pKC16GNT y pLNR que codifican enzimas activos para la biosíntesis del 10 compuesto de fórmula (VI) y de sus intermediarios biosintéticos.
  5. 5.
    Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, donde la cepa bacteriana se obtiene mediante un método que comprende la introducción de un ácido nucleico en Streptomyces albus o en una cepa derivada de Streptomyces albus.
  6. 6.
    El método de la reivindicación 5, donde la introducción de un ácido nucleico comprende la
    15 introducción de plásmidos seleccionados de plásmidos pKC16GNT y pLNBIV, plásmidos pKC16GNT y pLN2, o plásmidos pKC16GNT y pLNR, en Streptomyces albus.
  7. 7. Una preparación farmacéutica que comprende, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto seleccionado de entre el grupo,
    H
    imagen10
    (IV)
    (V)
    (VI)
    imagen11
    imagen12
    H
    imagen13
    o una sal farmacéuticamente efectiva, o solvato del mismo, junto con uno o más excipientes y diluyentes.
  8. 8. Un compuesto seleccionado de entre el grupo,
    imagen14
    (IV)
    (V)
    (VI)
    imagen15
    imagen16
    H
    imagen17
    o una sal farmacéuticamente efectiva, o solvato del mismo, para uso en el tratamiento de cáncer en un sujeto diagnosticado con dicha enfermedad.
  9. 9. Un compuesto seleccionado de entre el grupo,
    (IV)
    (V)
    (VI)
    imagen18
    imagen19
    imagen20
    H
    imagen21
    o una sal farmacéuticamente efectiva, o solvato del mismo, para uso en el tratamiento de una enfermedad neurológica en un sujeto diagnosticado con dicha enfermedad.
  10. 10. Un compuesto seleccionado de entre el grupo,
    imagen22
    (IV)
    (V)
    imagen23
    H
    imagen24
    (VI)
    o una sal farmacéuticamente efectiva, o solvato del mismo, para uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un sujeto diagnosticado con dicha enfermedad.
    imagen25
    FIG. 1
    HH
    imagen26N N
    3 10 9
    2 11 imagen27O 1
    (S) (R)
    5' 1' 3'
    Me
    2'
    MeO 4' NHMe MeO OH
    imagen28
    STP RBM
    imagen29
    FIG. 2
    H HH imagen30 N imagen31 N imagen32 N
    RebC RebP
    StaG
    imagen33
    imagen34
    NN HH HH
    imagen35 H AF O
    imagen36 imagen37OH Me imagen38OH
    CPA O NDP
    imagen39HO
    RebO O
    imagen40IG (1N) RebD OH
    Me StaN (x2) imagen41OH
    imagen42
    imagen43
    HO HH2N
    COOH NDP-L-rham N
    imagen44OleL OleS OleE OleU
    N H
    imagen45
    imagen46 imagen47 O PO3H2 imagen48 OTrp
    imagen49 imagen50Me
    OH
    HO
    imagen51OH OH HO
    imagen52
    OH
    HO IG (2N) Glc-1-P
    imagen53
    imagen54
    FIG. 3
    imagen55
    imagen56
    imagen57
    FIG. 4A FIG. 4B
    min.
    min.
    FIG. 4C FIG. 4D
    min. min.
    FIG. 5
    R1 R1
    R1 N
    N
    imagen58N
    R3 R2 R3R2 R2R3
    O
    imagen59R4O Me R4 OR5 imagen60R5
    R12
    R6 R12
    R10
    R6
    R11 R11 R6
    R5
    R9imagen61R9 R8 R9 R8
    R8 R7
    R10 R7 R10 R7
    (II)
    (I) (X)
    R1 imagen62 N
    R2 R3
    O
    Me R6
    R10 R5
    R imagen63 9 R8 R7
    (XI)
    imagen64
    imagen65
    imagen66
    imagen67
    Cpt
    Fórmula General R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12
    (III)
    (I) H H H H H OH H OH OH H H Me
    (IV)
    (I) H H H H H H H OH OH H H Me
    (V)
    (I) H H H H H H OH H OH H H Me
    (VI)
    (I) H H H H H H OH H H OH Me H
    (VII)
    (II) H H H - H OH H OH OH H - -
    (VIII)
    (II) H H H - H H H OH OH H - -
    (IX)
    (II) H H H - H H OH H OH H - -
    (XII)
    (X) H H H H H OH H OH OH H H Me
    (XIII)
    (X) H H H H H H H OH OH H H Me
    (XIV)
    (X) H H H H H H OH H OH H H Me
    (XV)
    (X) H H H H H H OH H H OH Me H
    (XVI)
    (XI) H H H - H OH H OH OH H - -
    (XVII)
    (XI) H H H - H H H OH OH H - -
    (XVIII)
    (XI) H H H - H H OH H OH H - -
    imagen68
    REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN
    La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para la conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.
    Documentos de patentes citados en la descripción
    imagen69
    Literatura no patente citada en la descripción
    imagen70
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