ES2584387T3 - 1-(3,3-Dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido(2,3-d)pirimidin-6-il)fenil)urea como inhibidor de Raf quinasa para el tratamiento del cáncer - Google Patents

Abstract

Un compuesto que es 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6- il)fenil)urea, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

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DESCRIPCION

1-(3,3-Dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido(2,3-d)pirimidin-6-il)fenil)urea como inhibidor de Raf quinasa para el tratamiento del cancer

La cascada de senalizacion de protema quinasa quinasa, activada por Ras/Raf/mitogeno (tambien conocida como MAP2K; MAPK quinasa; y MAPK/ERK quinasa o MEK/quinasa regulada por senales extracelulares (ERK) (mencionada en el presente documento como "Ras/Raf/MEK/ERK" o "Ras/Raf/MEK/MAPK") es una ruta evolutivamente conservada que desempena un papel integral en el desarrollo y homeostasis de tejidos en mairnferos. Esta ruta de senalizacion consiste en una cascada de quinasas que transmite senales extracelulares al nucleo para regular la expresion genica y funciones celulares clave. La expresion genica controlada por la ruta de senalizacion Ras/Raf/MEK/ERK regula los procesos celulares fundamentales que incluyen proliferacion, diferenciacion, apoptosis, y angiogenesis. Estos papeles diversos de la senalizacion de Ras/Raf/MEK/ERK se activan de forma aberrante en diversos tipos de cancer. Mutaciones en genes dentro de esta ruta pueden conducir a protemas constitutivamente activas provocando proliferacion celular aumentada, y resistencia a apoptosis.

Raf (una serina/treonina-protema quinasa) esta codificada por una familia de genes que consiste en tres genes que producen tres miembros de isoforma de Raf (B-Raf, C-Raf (Raf-1) y A-Raf). Cada una de estas protemas comparte regiones reguladoras aminoterminales muy conservadas y dominios catalfticos en el extremo carboxi. Salvo que se indique de otro modo, Raf se refiere a los tres miembros. Aunque cada isoforma desempena un papel en la ruta Ras/Raf/MEK/ERK, B-Raf ha demostrado ser el activador principal de MEK. B-Raf se recluta por Ras:GTP a la membrana celular intracelular donde B-Raf se vuelve activo. A su vez, B-Raf es responsable de la activacion de MEK1/2 y MEK1/2 activa ERK1/ERK2. Mutaciones en el gen de B-Raf permiten que B-Raf senalice independientemente de senales corriente arriba. Como resultado, la protema B-Raf mutada (tal como V600E) causa senalizacion excesiva corriente abajo de MEK y ERK. Esto conduce a proliferacion celular excesiva y supervivencia y oncogenesis. La sobreactivacion de la cascada de senalizacion por B-Raf mutada se ha implicado en multiples neoplasias.

El receptor tirosina quinasa (RTK) c-KIT (tambien llamado CD 117), se expresa en una amplia diversidad de tipos celulares. El ligando para c-KIT es el factor de celulas madre (SCF). La union se SCF al domino extracelular de c- KIT induce dimerizacion del receptor y activacion de rutas de senalizacion corriente abajo, incluyendo la ruta RAS/RAF/MEK/ERK. c-KIT mutante se ha implicado en la patogenesis de varios canceres.

A pesar de inhibidores espedficos de B-Raf (tales como vemurafenib), y de compuestos tales como los desvelados en los documentos WO 2006/039718 y WO 2008/034008, existe la necesidad de un inhibidor de Raf activo en la inhibicion de todas las isoformas de protemas Raf, incluyendo A-Raf, B-Raf, C-Raf, y la mutacion V600E de B-Raf. Existe una necesidad adicional de un inhibidor de Raf que sea activo contra celulas tumorales con activacion de ruta corriente arriba por mutaciones de N-Ras, mutaciones de K-Ras y mutaciones de cKit. Ademas, sigue existiendo la necesidad de proporcionar inhibidores alternativos de Raf para el tratamiento del cancer. Tambien sigue existiendo una necesidad de proporcionar inhibidores alternativos de Raf activos en la inhibicion de A-Raf, B-Raf, C-Raf, y la mutacion V600E de B-Raf para el tratamiento del cancer. Por consiguiente, la presente invencion proporciona un inhibidor de Raf que pueda ser activo en la inhibicion de todas las isoformas de protemas Raf. Ademas, la presente invencion proporciona un inhibidor de Raf que puede ser activo contra celulas tumorales con activacion de la ruta corriente arriba por mutaciones de N-Ras, mutaciones de K-Ras, y mutaciones de cKit. Adicionalmente, la presente invencion proporciona un inhibidor alternativo de Raf. Ademas, la presente invencion proporciona un inhibidor alternativo de Raf que puede ser util para tratar el cancer. La presente invencion tambien proporciona un inhibidor alternativo de Raf activo en la inhibicion de A-Raf, B-Raf, C-Raf, y la mutacion V600E de B-Raf. Ademas, la presente invencion proporciona un inhibidor alternativo de Raf activo en la inhibicion de A-Raf, B-Raf, C-Raf, y la mutacion V600E de B-Raf que puede ser util para tratar el cancer.

La Figura 1 es un patron representativo de difraccion en polvo de rayos-X para el Ejemplo 1.

La presente invencion proporciona un compuesto que es 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2- (metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)urea, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

Como una realizacion particular, la presente invencion proporciona el compuesto que es 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2- fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)urea.

La presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4- metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)urea, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, junto con un vehmulo farmaceuticamente aceptable. La presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6- il)fenil)urea, junto con un vehmulo farmaceuticamente aceptable.

La presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4- metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)urea, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, y un vehmulo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable. La presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-

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d]pirimidin-6-il)fenil)urea, y un vetnculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable.

Como una realizacion particular, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende 1- (3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)urea, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, y polivinilpirrolidona-acetato de vinilo (PVP-VA). La presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil- 2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)urea, y polivinilpirrolidona-acetato de vinilo (PVP-VA). Ademas, la presente invencion proporciona realizaciones preferidas de las composiciones farmaceuticas como se describe en el presente documento, en las que PVP-VA se selecciona entre el grupo que consiste en Kollidon® VA 64 y Plasdone™ S-630 copovidona. Preferiblemente, el PVP-VA es Kollidon® VA 64.

Una formulacion actualmente preferida comprende 1-(3,3-dimetilbutil)-3-{2-fluoro-4-metil-5-[7-metil-2-

(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il]fenil}urea, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, junto con Kollidon® VA 64 (BASF Corporation Producto n.° 95405-2-43), un copolfmero de 1 -vinil-2-pirrolidona y acetato de vinilo en una relacion de 60:40 y lauril sulfato sodico al 1-2 % (p/p). Se prepara una dispersion solida que puede comprender una carga de farmaco del 20 % o el 40 % y puede incluir lauril sulfato sodico al 0-2 % o una cantidad apropiada de otro agente humectante farmaceuticamente aceptable adecuado, un plastificado, un auxiliar de procesamiento u otro excipiente o excipientes adecuados.

La presente invencion desvela un procedimiento para tratar cancer que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pinmidin- 6-il)fenil)urea, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma. La presente invencion proporciona un procedimiento para tratar cancer que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de 1- (3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)urea.

La presente invencion proporciona 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-

d]pirimidin-6-il)fenil)urea, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, para su uso en terapia. La presente invencion proporciona 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-

il)fenil)urea, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, para su uso en el tratamiento de cancer. La

presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento de cancer,

comprendiendo la composicion farmaceutica 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-

(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)urea, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma.

La presente invencion proporciona 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-

d]pirimidin-6-il)fenil)urea para su uso en terapia. La presente invencion proporciona 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4- metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)urea para su uso en el tratamiento de cancer. La

presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento de cancer,

comprendiendo la composicion farmaceutica 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-

(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)urea.

La presente invencion proporciona el uso de 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3- d]pirimidin-6-il)fenil)urea, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de cancer. La presente invencion tambien proporciona el uso de 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4- metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)urea en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de cancer.

La presente invencion proporciona 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-

d]pirimidin-6-il)fenil)urea en forma cristalina. La presente invencion tambien proporciona 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2- fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)urea en forma cristalina caracterizada por un patron de difraccion de polvo de rayos X que tiene picos caractensticos, en 20 + 0,2, que aparecen en 16,0 y uno o mas de 6,9, 7,0, 18,2 y 23,2.

Ademas, la presente invencion desvela realizaciones preferidas de los procedimientos y usos como se describe en el presente documento, en que el cancer se selecciona del grupo que consiste en leucemia mielogena aguda (AML, leucemia mieloide aguda), leucemia mielogena cronica (CML), leucemia linfoblastica cronica (CLL), smdrome mielodisplasico, cancer de ovario, melanoma, cancer pulmonar microdtico, cancer pulmonar no microcftico, cancer colorrectal, cancer pancreatico, cancer de prostata, cancer hepatico o cancer de tiroides. Mas preferentemente, el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de tiroides, cancer de ovario, melanoma, leucemia mielogena aguda (AML, leucemia mieloide aguda), y cancer colorrectal. Incluso mas preferentemente, el cancer es melanoma o cancer colorrectal.

La presente invencion desvela un procedimiento de tratamiento de un cancer que es cancer de tiroides, cancer de ovario, melanoma, AML o cancer colorrectal en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad terapeuticamente eficaz de 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2- (metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)urea, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma.

Un compuesto que es 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6- il)fenil)urea, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, para su uso en terapia.

Un compuesto que es 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6- il)fenil)urea, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, para su uso en el tratamiento de un cancer que es cancer de tiroides, cancer de ovario, melanoma, ELA o cancer colorrectal.

Uso de 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)urea, o una sal 5 farmaceuticamente aceptable de la misma, para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de un cancer que es cancer de tiroides, cancer de ovario, melanoma, ELA o cancer colorrectal.

En una realizacion particular, la composicion farmaceutica comprende, 1-(3,3-dimetilbutil)-3-{2-fluoro-4-metil-5-[7- metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il]fenil}urea, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, junto con un vedculo farmaceuticamente aceptable y opcionalmente otros ingredientes terapeuticos.

10 En una realizacion particular, la composicion farmaceutica comprende 1-(3,3-dimetilbutil)-3-{2-fluoro-4-metil-5-[7- metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il]fenil}urea, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, junto con un vedculo farmaceuticamente aceptable y opcionalmente otros ingredientes terapeuticos particularmente para el tratamiento de cancer generalmente o un tipo de cancer espedfico.

La presente invencion proporciona un compuesto de la formula:

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o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

El termino "paciente" significa mamifero y "mamifero" incluye, aunque sin limitacion un ser humano.

"Cantidad terapeuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" significan la dosificacion del compuesto, o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, o composicion farmaceutica que contiene el compuesto ejemplificado, o sal 20 farmaceuticamente aceptable del mismo, necesaria para inhibir la senalizacion de B-Raf, C-Raf, A-Raf y/o B-Raf V600E en un paciente con cancer, y destruir las celulas cancerosas diana o ralentizar o detener la progresion del cancer en un paciente. Las dosificaciones anticipadas del compuesto ejemplificado, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, estan en el intervalo de 300 a 1500 mg/pacienteMa. Se anticipa que dosificaciones preferidas estan en el intervalo de 400 a 1400 mg/paciente/dia. Se anticipa que dosificaciones mucho mas preferidas estan en 25 el intervalo de 600 a 1200 mg/paciente/dia. La dosificacion exacta necesaria para tratar a un paciente y la duracion del tiempo de tratamiento se determinaran por un medico en vista de la fase y gravedad de la enfermedad, asi como las necesidades espedficas y respuesta del paciente individual y el compuesto particular administrado. Aunque se expresa como dosificacion en una base por dia, el regimen de dosificacion puede ajustarse para proporcionar un beneficio terapeutico mas optimo a un paciente. Ademas de la dosificacion diaria, puede ser apropiada dosificacion 30 dos veces al dia (BID) o tres veces al dia (TID). La dosificacion BID es actualmente preferida.

Los terminos "tratamiento", "tratar", y "que trata", se entiende que incluyen el espectro completo de intervencion para el cancer que esta padeciendo el paciente, tal como administracion del compuesto activo para aliviar, ralentizar o revertir uno o mas de los smtomas del cancer y retardar la progresion del cancer incluso si el cancer no esta realmente eliminado.

35 El compuesto ejemplificado de la presente invencion se formula preferentemente como una composicion farmaceutica usando un vedculo farmaceuticamente aceptable o usando uno o mas vedculos, diluyentes, o excipientes farmaceuticamente aceptables y se administra por una diversidad de vias. Preferentemente, dichas composiciones son para administracion oral. Dichas composiciones farmaceuticas y procedimientos para prepararlas son bien conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF 40 PHARMACY (A. Gennaro, y col., eds., 21a ed., Mack Publishing Co., 2005).

El compuesto ilustrado de la presente invencion es capaz de reaccionar con varios acidos inorganicos y organicos para formar sales de adicion de acidos farmaceuticamente aceptables. Dichas sales farmaceuticamente aceptables y metodologia comun para prepararlas se conocen bien en la tecnica. Vease, por ejemplo, P. Stahl, y col., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); 45 S.M. Berge, y col., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, n.° 1, enero de 1977.

Ha de entenderse que 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6- il)fenil)urea, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, puede prepararse mediante una diversidad de procedimientos conocidos en la tecnica, asi como los descritos a continuacion.

El Ejemplo 1 se denomina: 1-(3,3-dimetilbutil)-3-{2-fluoro-4-metil-5-[7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6- 50 il]fenil}urea; y tambien puede denominarse: N-(3,3-dimetilbutil)-N'-[2-fluoro-4-metil-5-[7-metil-2-

(metilamino)pirido[2,3d]pirimidin-6-il]fenil]urea; y pueden usarse otros nombres para identificar ineqmvocamente el

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Ejemplo 1.

Los compuestos empleados como materiales de partida iniciales en la smtesis de 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4- metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pinmidin-6-il)fenil)urea se conocen bien y, en la medida en que no estan disponibles en el mercado, se sintetizan facilmente usando las referencias espedficas proporcionadas, por procedimientos estandar empleados comunmente por los expertos en la tecnica, o se encuentran en textos de referencia generales.

Los ejemplos de procedimientos y metodos conocidos incluyen los descritos en los textos de referencia generales, tales como Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers Inc, 1989; Compendium of Organic Synthetic Methods, Volumenes 1-10, 1974-2002, Wiley Interscience; Advanced Organic Chemistry, Reactions Mechanisms, and Structure, 5a Edicion, Michael B. Smith y Jerry March, Wiley Interscience, 2001; Advanced Organic Chemistry, 4a Edicion, Parte B, Reactions and Synthesis, Francis A. Carey y Richard J. Sundberg, Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2000, etc., y referencias citadas en ese documento.

Como se usa en este documento, los siguientes terminos tienen los significados indicados: "d6-DMSO" se refiere a hexadeutero-dimetilsulfoxido; "DCM" se refiere a diclorometano; "DMSO" se refiere a dimetilsulfoxido; "EtOAc" se refiere a acetato de etilo; "EtOH" se refiere a etanol; "HPLC" se refiere a cromatograffa lfquida de alto rendimiento; "IPAC" se refiere a acetato de isopropilo; "KF" se refiere a Karl Fischer; "EM" se refiere a espectroscopfa de masas; "MeOH" se refiere a metanol; "MTBE" se refiere a terc-butil metil eter; "RMN" se refiere a resonancia magnetica nuclear; "TA" se refiere a temperatura ambiente; "THF" se refiere a tetrahidrofurano.

A menos que se indique otra cosa, los compuestos ilustrados en el presente documento se nombran y se numeran usando ACDLABS o Symyx Draw 3.2.

Preparacion 1

5-Bromo-2-fluoro-4-metilanilina

imagen2

Procedimiento A:

Combinar 1-bromo-4-fluoro-2-metilbenceno (30,0 g, 159 mmol) en acido sulfurico concentrado (100 ml), enfriar a aproximadamente -5 °C, y tratar gota a gota con acido mtrico (11,00 ml, 174 mmol) durante 20 minutos. Dejar calentar la mezcla de reaccion a TA y agitar durante 30 min. Verter sobre hielo picado con agitacion y repartir con terc-butil metil eter (MTBE) (200 ml). Separar la fase acuosa y extraer con MTBE (2 x 50 ml). Combinar las fases organicas, secar y concentrar a presion reducida, proporcionando 1-bromo-4-fluoro-2-metil-5-nitrobenceno en forma de un aceite viscoso de color naranja (39,0 g).

Combinar 1-bromo-4-fluoro-2-metil-5-nitrobenceno en bruto (32,4 g, 138 mmol), etanol (100 ml) y Nfquel Raney (1,00 g, 17,04 mmol) en un matraz agitador. Cargar el matraz con hidrogeno (275 kPa) y agitar hasta que se detenga la absorcion de hidrogeno. Despresurizar el recipiente de reaccion, eliminar el catalizador por filtracion, y evaporar el filtrado a sequedad. Anadir MTBE, despues filtrar de nuevo y evaporar el filtrado. Agitar el residuo en hexanos. Recoger los solidos por filtracion, lavar con hexanos fnos y secar al vado, proporcionando el compuesto del tftulo (17,8 g, rendimiento del 63 %) en forma de un solido de color oscuro. EM (m/z): 204,0 (M+1)/206,0 (M+3).

Procedimiento B:

En un matraz de fondo redondo de 4 bocas equipado con agitacion mecanica, un termometro, un bano de hielo y entrada de N2 se le anade 1-bromo-4-fluoro-2-metilbenceno (1,4 kg, 7,4 mol), despues se anade H2SO4 concentrado (6,3 kg) a 0-10 °C. Despues de agitar durante 10-20 minutos, la mezcla se enfna a - 10~0°C, y se anade en porciones KNO3 (0,82 kg, 7,8 mol, 1,05 equiv.) en aproximadamente 6 horas mientras se mantiene la temperatura a - 10~0 °C. Despues de la adicion, la mezcla de reaccion se calienta a 10-20 °C, y se controla por TLC (AE:PE = 1:20) y HPLC hasta que el contenido de 1-bromo-4-fluoro-2-metilbenceno es <0,5 %. La mezcla se vierte en una mezcla de hielo/agua (11,2 kg, Hielo:agua = 1:1) y se extrae dos veces con MTBE (4,7 l y 1,9 l). Las fases organicas se combinan, se lavan con salmuera saturada (5,6 kg) y se concentran a 1,5~2V por debajo de 45 °C a presion reducida. El residuo se diluye con EtOAc (5,6 l) y la solucion resultante se usa directamente en la siguiente etapa (1,22 kg (% en peso corregido), rendimiento del 70,5 %, y 68,3 % de pureza detectada por absorcion UV a 210 nm). RMN 1H (400 MHz, CDCla): 6 8,35 (s, J = 7,1 Hz, 1H), 7,29 (d, J = 11,3 Hz, 1H), 2,59 (d, J = 6,8 Hz, 3H).

En un matraz de fondo redondo de 4 bocas equipado con agitacion mecanica, un termometro y entrada de N2 se anade una solucion de 1-bromo-4-fluoro-2-metil-5-nitrobenceno (1,16 kg, 4,96 mol) en EtOAc (5 l) y una solucion al 36% de HCl (4,9 kg, 49,6 mol, 10,0 equiv.). Despues de agitar durante 5~10 minutos a 20~30 °C, se anade en porciones polvo de Fe (1,34 kg, 24,0 mol, 4,8 equiv.) mientras se mantiene la temperatura a 20-30 °C. La reaccion se controla por TLC (AE:PE = 1:10). Despues de la finalizacion de la reaccion, el valor de pH se ajusta a 2~3 usando

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NaHCO3 y se anade Celite® (0,56 kg). La mezcla se agita durante 0,5~1 hora y se filtra. El solido se lava con tolueno (2 x 2,6 l). Los filtrados se combinan y se agitan durante 0,5~1 h mas antes de la separacion de las fases. La fase acuosa se extrae con tolueno (2,6 l). Las fases organicas se combinan, se lavan con salmuera (3 l) y se filtran a traves de un lecho de gel de sflice (2~3 cm). El filtrado se concentra a 2~2,5 l y el residuo se mezcla con n-Heptano (3,3 l). Despues del concentrado de nuevo a 2~2,5 l, se anade n-heptano (1,65 l). La mezcla se enfria a -10—0 °C y se agita durante 1 hora. El precipitado se recoge por filtracion, se lava con n-heptano (0,5 l, enfriado previamente a - 10~0 °C) y se seca, proporcionando el producto en bruto del compuesto del ritulo en forma de un solido de color pardo. La recristalizacion del producto en bruto con n-Heptano (3,3 l) proporciona un solido de color blanquecino a pardo del compuesto del ritulo. (527 g, rendimiento del 52 % y 98 % de pureza detectada por absorcion UV a 210 nm). RMN 1H (400 MHz, d6-DMSO): 5 6,97 (m, 2H), 5,18 (s, 2H), 2,16 (s, 3H); RMN 13C (500 MHz, CDCls): 5 21,41, 116,60, 118,30, 119,66, 127,22, 132,88, (149,37, 151,12); RMN 19F (400 MHz, CDCls): 5 151,14

Preparacion 2

2-Fluoro-4-metil-5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)anilina

imagen3

Procedimiento A:

Combinar 5-bromo-2-fluoro-4-metilanilina (3,1 g, 15,2 mmol), bis(pinacolato)diboro (4,24 g, 16,7 mmol) y acetato potasico (4,47 g, 45,6 mmol) en dioxano (40 ml) y rociar con argon. Anadir complejo de [1,1'- bis(difenilfosfino)ferroceno]-dicloropaladio (Il)-diclorometano (0,620 g, 0,760 mmol), rociar de nuevo con argon y calentar a 100 °C durante una noche. Filtrar la mezcla de reaccion y concentrar al vado. Purificar por cromatografia sobre gel de sflice (EtOAc al 0-50 %/hexanos) para dar el compuesto del ritulo (3,24 g, rendimiento del 85 %). EM (m/z): 252,1 (M+1).

Procedimiento B:

En un matraz de fondo redondo de 4 bocas equipado con agitacion mecanica, un termometro y entrada de N2 se anaden 5-bromo-2-fluoro-4-metilanilina (200 g, 0,98 mol), CH3COOK (192 g, 1,95 mol, 2,0equiv.), bis(pinacolato)diboro (248 g, 0,98 mol, 1,0 equiv.) e IPAC (3 l). Despues de desgasificar con N2 durante 30 min, la mezcla se calienta a 50 °C y se anade Pd(dppf)Cl2 (8 g, 4 % en peso). La mezcla de reaccion se calienta a reflujo durante al menos 10 h hasta que el contenido de material de partida es <2 % (CG). La mezcla se enfria a 20~30 °C, se filtra a traves de una capa de Celite® y se aclara con IPAC (1 l). El filtrado se concentra hasta que quedan 400~500 ml. El residuo se mezcla con n-Heptano (700 ml), se filtra a traves de un lecho de SiO2 y se eluye con IPAC/n-Heptano (1/5 en primer lugar, ~2 l, y despues 2/5, ~3 l). El filtrado se concentra a 350~400 ml. Se anade n- Heptano (300 ml) y la mezcla se concentra de nuevo a 350~400 ml). El residuo (suspension) se enfria a -10~-20 °C y se filtra despues de agitar durante 2-5 h. El producto en bruto se disuelve en MeOH (200 ml) a 30~40 °C y despues se anade lentamente gota a gota H2O (600 ml) en 0,5~1 h. La suspension se enfria a 20~30 °C y se filtra de nuevo despues de agitar durante 1-2 h .El solido se seca a alto vado, proporcionando el compuesto del ritulo en forma de un solido de color blanquecino (183 g, rendimiento del 74% y 99% de pureza detectada por absorcion UV a 210 nm; RMN 1H (400 MHz, CDCl3): 5 7,42 (d, J = 10,2 Hz, 1H), 7,01 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 3,76 (s, 2H), 2,64 (s, 3H), 1,55 (s, 12H); RMN 13C (500 MHz, CDCl3): 5 20,66, 20,67, 24,40, 82,93, 116,20, 124,37, 130,64, 135,02, (151,93, 153,37); RMN 19F (400 MHz, CDCl3): 5 145,72

Preparacion 3

2-Fluoro-4-metil-5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenilcarbamato de prop-1-en-2-ilo

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Anadir 2-fluoro-4-metil-5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)anilina (5,0 g, 19,91 mmol) y cloroformiato de isopropenilo (2,40 ml, 21,90 mmol) en EtOAc (60 ml) y NaHCO3 acuoso saturado (60 ml) y agitar a TA durante 6 h. Separar las fases, extraer la fase acuosa con EtOAc (2 x), lavar los productos organicos combinados con salmuera, secar sobre Na2SO4 y concentrar, obteniendo el compuesto del ritulo. Usar para la siguiente reaccion sin purificacion adicional (suponiendo un rendimiento del 100 %). EM (m/z): 336,2 (M+1).

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Clorhidrato de 3,3-dimetilbutan-1-amina

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En un matraz de fondo redondo de 4 bocas equipado con agitacion mecanica, un termometro y entrada de N2 se anade 3,3-dimetilbutanal (200 g, 2,0 mol). Despues, se anade gota a gota 1-fenilmetanamina (214 g, 2,0 mol, 1,0 equiv.). La mezcla de reaccion se agita a 20~30 °C durante 2~5 horas hasta una conversion mayor del 99 % por CG. Se anade NaCI (4 g) y la fase acuosa se desecha. Se anade THF (800 ml) y la mezcla se concentra a 400 ml. Esta operation se repite hasta que el KF del residuo es menor del 0,2 %. Se anaden THF (800 ml) y t-BuOK (44,8 g, 0,4 mol, 0,2 equiv.). La mezcla se calienta a 60~65 °C y se agita hasta que el contenido de N-bencil-3,3-dimetil- butan-1-imina es menor del 1 % por CG. Despues de enfriar a 10-20 °C, se anade agua (1500 ml) y la mezcla se extrae con MTBE (2 x 1500 ml). La fase organica combinada se lava con NaCl saturado (800 ml), se muestrea para comprobar para el analisis del contenido de agua y se asegura un contenido de KF del 1 %-2 %. La corriente de N- (3,3-dimetilbutil)-1-fenil-metanimina se usa directamente en la siguiente etapa. (83 % de pureza por CG; CG-EM m/z 188,2 [M-H]+).

En un matraz de fondo redondo de 4 bocas equipado con agitacion mecanica, un termometro y entrada de N2 se anade una solution de N-(3,3-dimetilbutil)-1-fenil-metanimina que se ha obtenido anteriormente (412 g, 2,18 mol, 3,27 l de MTBE 1,3 l de THF) y se anade gota a gota una solucion de HCl/MTBE (16 %, 398 g, 1,74 mol, 0,8 equiv.) a 20~30 °C. Precipito un solido de color blanco durante la adicion. Despues de agitar durante 1~2 h, una muestra de alicuotas de la suspension se filtro. Las aguas madre se comprueban por CG. Si el contenido de N-(3,3-dimetilbutil)- 1-fenil-metanimina es mayor del 30 %, se anade una solucion de HCl/MTBE adicional (45 g, 0,10 equiv.) hasta que el contenido de N-(3,3-dimetilbutil)-1-fenil-metanimina esta entre el 20 %~30 % por CG. El solido se recoge por filtration, se lava con MTBE (870 ml) y se seca en una atmosfera de N2 para dar el compuesto del tUulo deseado en forma de un material cristalino de color blanco (195 g, rendimiento del 65 %; RMN 1H (400 MHz, d6-DMSO): 5 7,90 (s, 3H), 2,74 (m, 2H), 1,47 (m, 2H), 0,89 (s, 9H); RMN 13C (500 MHz, d6-DMSO): 5 28,98, 29,31,35,49, 40,34.

Preparacion 5

1-(3,3-Dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil)urea

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Procedimiento A:

Tratar una solucion de 2-fluoro-4-metil-5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenilcarbamato de prop-1-en-2-ilo (6,67 g, 19,90 mmol) en dioxano (60 ml) con 3,3-dimetilbutan-1-amina (2,42 g, 23,9 mmol) y 1 -metilpirrolidina (0,169 g, 1,99 mmol) y calentar a 75 °C durante una noche. Enfriar la mezcla a TA, recoger el solido por filtracion y lavar con eter dietflico, obteniendo el compuesto del trtulo (6,62 g, rendimiento del 88 % en dos etapas). EM (m/z): 379,2 (M+1).

Procedimiento B:

En un matraz de fondo redondo de 4 bocas equipado con agitacion mecanica, un termometro y entrada de N2 se anaden 2-fluoro-4-metil-5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)anilina (40 g, 0,159 mol), THF (600 ml) y NaHCO3 (16,0 g, 0,19 mol, 1,20 equiv.). La mezcla se enfria a 0~5 °C y se anade gota a gota cloroformiato de fenilo (26,14 g, 0,167 mol, 1,05 equiv.). La mezcla de reaccion se calienta a 60 °C y se agita hasta que el contenido de 2- fluoro-4-metil-5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)anilina es <2 %. La mezcla se filtra y el solido (sal) se lava con THF (120 ml). El filtrado se concentra a 65~80 ml. Al residuo se le anaden tolueno (720 ml), 3,3-dimetilbutan-1- amina (sal HCl, 26,14 g, 0,19 mol, 1,2 equiv.) y TEA (20,87 g, 0,21 mol, 1,3 equiv.). La mezcla resultante se calienta a 90 °C y se agita hasta que el contenido de intermedio es <2 %. La mezcla se enfria a 15~20 °C, se agita durante 2 h y se filtra. El solido se lava con tolueno (120 ml), H2O (2 x 400 ml) y se seca a alto vatio, proporcionando el compuesto del tUulo en forma de un solido de color blanco. (54,9 g, rendimiento del 91,3% y 99% de pureza detectada por absorcion UV a 210 nm); RMN 1H (400 MHz, d6-DMSO): 5 8,34 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 8,08 (s, 1H), 6,98 (d, J = 12,3 Hz, 1H), 6,41 (s, 1H), 3,08 (s, 2H), 2,38 (s, 3H), 1,36 (m, 14H), 0,90 (s, 9H); RMN 13C (500 MHz, d6- DMSO): 5 21,12, 24,65, 29,37, 29,58, 35,65, 43,50, 83,25, 104,32, 116,09, 125,02, 128,19, 138,71, (152,40, 154,34), 154,81; RMN 19F (400 MHz, d6-DMSO): 5 136,34

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4-Amino-2-(metiltio)pirimidin-5-carboxilato de etilo

OEt

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Procedimiento A:

Anadir hidroxido de amonio concentrado (335 ml, 8,60 mol) a una suspension agitada vigorosamente de 4-cloro-2- (metiltio)pirimidin-5-carboxilato de etilo (200 g, 860 mmol) en etanol (EtOH) (450 ml) y permitir la agitacion durante una noche. Recoger los solidos por filtracion, aclarar con EtOH (2 x l00 ml) y H2O (3 x 200 ml) y secar en una estufa de vado (65-70 °C) durante una noche, proporcionando el compuesto del tUulo (164,4 g, rendimiento del 90 %) en forma de un solido de color blanco. EM (m/z): 214,1 (M+1).

Procedimiento B:

Cargar el recipiente de reaccion con 1190 g de THF y 660 g de 4-cloro-2-(metilsulfanil)pirimidin-5-carboxilato de etilo (1,0 equiv. 2,84 mol). Agitar a 10~20 °C durante 20-30 min, y despues anadir 907 g de NH3-H2O y 989 g de Et3N a la mezcla. Calentar a 45-55 °C, y agitar durante 2-6 h a 45-55 °C. Despues de la finalizacion de la reaccion, enfriar a 812 °C y anadir 4000 g de agua. Agitar durante 4-8 h a 8-12 °C, filtrar y aclarar con 200 g de agua. Secar la torta al vado a 80 °C durante 8-24 h, obteniendo el compuesto del tUulo (560 g; 98,8 % de pureza con un rendimiento del 92 %; [M+1] = 213,8, RMN 1H (d6-DMSO, 400 MHz): 5 = 8,564 (s, 1H), 8,278 (s, 1H), 8,011 (s, 1H), 7,649 (s, 1H), 4,293-4,240 (dd, J1 = 6,8, J2 = 14, 2H), 2,462 (s, 3H), 5 1,308-1,272 (m, 3H)).

Preparacion 7

4-Amino-2-(metiltio)pirimidin-5-il)metanol

imagen8

Enfriar una solucion de 4-amino-2-(metiltio)pirimidin-5-carboxilato de etilo (72,3 g, 339 mmol) en tetrahidrofurano (THF) (900 ml) a 0 °C. Anadir gota a gota una solucion de LiAlH4 (2 M en THF) (195 ml, 390 mmol) durante 1 h. Agitar durante 2 h a 0 °C y dejar que la reaccion alcance a TA durante una noche. Enfriar la mezcla a 0 °C e inactivar cuidadosamente por la adicion secuencial de agua (15 ml), KOH ac. al 20 % (15 ml) y agua (30 ml). Agitar la mezcla resultante durante 1 h. Secar sobre MgSO4, filtrar, concentrar a presion reducida y secar al vado, obteniendo el compuesto del trtulo (55,85 g, rendimiento del 96 %). EM (m/z): 172,1 (M+1).

Preparacion 8 4-amino-2-(metiltio)pirimidin-5-carbaldehldo

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Procedimiento A:

Anadir MnO2 (49,8 g, 572 mmol) a una suspension de 4-amino-2-(metiltio)pirimidin-5-il)metanol (28 g, 164 mmol) en cloroformo (818 ml) y calentar la reaccion a 55 °C (medir internamente) durante 4 h. Filtrar la mezcla de reaccion caliente y aclarar la torta de filtro con cloroformo caliente y THF. Concentrar los filtrados combinados a presion reducida y secar al vado, proporcionando el compuesto del tUulo (26,7 g, rendimiento del 96 %) en forma de un solido de color amarillo palido EM (m/z): 170,1 (M+1).

Procedimiento B:

Cargar un recipiente de reaccion con 450 g (2,08 mol, 1,0 equiv.) de 4-amino-2-(metiltio)pirimidin-5-carboxilato de etilo y 6750 ml (15,0 V) de THF. En un recipiente de reaccion separado, cargar 88,1 g (1,1 equiv.) de LiAlH4 y 2250 g (5,0 V) de THF. Enfriar esta mezcla de LiAlH4 a -5~5 °C. Anadir gota a gota la solucion en THF de 4-amino-2- (metiltio)pirimidin-5-carboxilato de etilo a la mezcla de LiAlH4 por debajo de 10 °C. Despues de la adicion, agitar la mezcla a 5~15 °C durante 2~3 horas. Enfriar a -5~5 °C y anadir gota a gota 279 g (1,5 equiv.) de EtOAc por debajo de 20 °C. Agitar la mezcla a 10~20°C durante 1~2 horas. Anadir en porciones 450 g (0,66 equiv.) de Na2SO4110H2O por debajo de 20 °C. Agitar la mezcla a 10~20 °C durante 1 ~2 horas. Filtrar la suspension a traves de tierra de diatomeas. Lavar la torta con THF. Cargar 734 g (4,0 equiv.) de MnO2 en el filtrado que contiene una solucion de 4-amino-2-(metiltio)pirimidin-5-il)metanol. Calentar la mezcla a 40 °C. Agitar la mezcla a 40~45 °C

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durante 6~8 horas. Filtrar la suspension a traves de tierra de diatomeas. Lavar la torta con THF. Combinar el filtrado, concentrar y anadir gota a gota 1530 g (5,0 V) de n-Heptano. Agitar la mezcla a 10~20 °C durante 3~4 horas. Filtrar la suspension y lavar la torta con heptano. Secar la torta de filtro a presion reducida a 40~50 °C durante 10-16 h, proporcionando el compuesto del trtulo (276 g; 97,9 % de pureza con un rendimiento del 75 %; [M+1] = 171,8, RMN 'H (d6-DMSO, 400 MHz): 5 = 7,887 (s, 1H), 6,704 (s, 2H), 5,066-5,042 (m, 1H), 5 4,292-4,280 (d, 2H), 2,392 (s, 3H); [M+1] = 169,8, RMN 1H (CDCls, 400 MHz): 5 = 9,769 (s, 1H), 8,414 (s, 1H), 8,190 (s, 1H), 5,772 (s, 1H), 2,540 (s, 3H)).

Preparacion 9

7-Metil-2-(metiltio)pirido[2,3-d]pirimidin-6-ol

imagen10

Procedimiento A:

Anadir 1-hidroxipropan-2-ona (24,3 ml, 355 mmol) y 4-amino-2-(metiltio)pirimidin-5-carbaldeddo (50 g, 296 mmol) a una solucion de hidroxido sodico (23,64 g, 591 mmol) y agua (200 ml). Anadir EtOH (600 ml) a la suspension y agitar a TA durante una noche. Anadir lentamente una solucion de HCl concentrado (50 ml) en agua (350 ml). Anadir 1:1 de EtOH/H2O (100 ml) y recoger los solidos por filtracion. Lavar los solidos con 1:1 de EtOH/^O (250 ml), EtOH enfriado con hielo (4 x 25 ml) y hexanos (2 x 250 ml). Secar en la estufa de vado a 30-35 °C, proporcionando el compuesto del tflulo en forma de un solido de color castano (34 g, rendimiento del 56 %). EM (m/z): 208,1 (M+1).

Procedimiento B:

Cargar el recipiente de reaccion con 2400 g (8,0 V) de H2O y 177,3 g (2,5 equiv.) de NaOH y 300,0 g (1,77 mol, 1,0equiv.) de 4-amino-2-(metiltio)pirimidin-5-carbaldeddo y 157,6 g (1,2 equiv.) de hidroxiacetona. Calentar la mezcla a 35-45 °C y agitar durante 10-20 h a 35-45 °C. Enfriar la mezcla a 5-15 °C. Anadir gota a gota 4500 ml de HCl 1 N y ajustar el pH a 3~4 por debajo de 15 °C. Agitar durante 1-2 h a 10-15 °C. Filtrar y aclarar la torta con 300 g de agua. Secar la torta de filtro a presion reducida a 50~60 °C durante 16-24 h, proporcionando el compuesto del tflulo (372 g de un solido de color pardo; area de HPLC al 98,0 % (ensayo: 90,0 %); rendimiento del 90 %; RMN 1H (d6-DMSO, 400 MHz): 5 = 10,864 (s, 1H), 9,276 (s, 1H), 7,529 (s, 1H), 2,570 (s, 6 H)).

Preparacion 10

Trifluorometanosulfonato de 7-metil-2-(metiltio)pirido[2,3-d]pirimidin-6-ilo

imagen11

Procedimiento A:

Combinar 7-metil-2-(metiltio)pirido[2,3-d]pirimidin-6-ol (25 g, 121 mmol), DCM (1100 ml) y piridina (98 ml, 1206 mmol) y enfriar la mezcla con un bano de hielo hasta la temperatura interna <3 °C. Anadir lentamente trifluorometanosulfonico anddrido (24,5 ml, 145 mmol) mediante una jeringa a tal velocidad que la temperatura interna se mantenga por debajo de 5 °C. Agitar la mezcla de reaccion a 0 °C durante 2 h. Lavar con agua (3 x 300 ml) y salmuera (300 ml), secar sobre MgSO4 y filtrar. Concentrar el filtrado a presion reducida (temp. bano de agua ~ 35 °C) y secar a alto vado durante 2-3 h a TA. Disolver el residuo en dCm y purificar por cromatografia sobre gel de sflice (EtOAc/hexanos). Concentrar las fracciones, proporcionando un solido semi-puro. Triturar el solido con EtOAc al 20 %/hexanos (100 ml), recoger por filtracion, aclarar con EtOAc al 20 %/hexanos (2 x 10 ml) y secar al vado a TA, proporcionando el compuesto del tflulo en forma de un solido de color rosa palido (28,6 g, rendimiento del 70 %). eM (m/z): 340,0 (M+1).

Procedimiento B:

Cargar el recipiente de reaccion con 4000 ml (20,0 V) de DCM y 208 g (1,0 mol, 1,0 equiv.) de 7-metil-2- (metiltio)pirido[2,3-d]pirimidin-6-ol. Agitar la mezcla durante 10-20 min. Cargar 312 g (4,0 equiv.) de piridina por debajo de 20 °C. Enfriar a -5~0 °C y anadir gota a gota la solucion de 416 g de Trifluorometanosulfonico anddrido (1,5 equiv.) en DCM (2000 ml, 10,0 V) por debajo de 0 °C. Despues de la adicion, agitar a 0-5 °C durante 2-3 horas. Interrumpir la reaccion con 2000 ml de HCl 1 N (2 x). Lavar dos veces con 500 ml de H2O. Anadir 100,0 g de gel de sflice y agitar a 10~20 °C durante 1 -2 horas. Filtrar la mezcla a traves de tierra de diatomeas. Concentrar el filtrado y anadir gota a gota n-heptano 1000 ml (5,0 V) con agitacion a 10~20°C. Agitar la mezcla a 10~20°C durante 34 horas. Filtrar y secar la torta a presion reducida a 35~40 °C durante 8-12 h, proporcionando el compuesto del tflulo (307 g de un solido de color pardo; area de HPLC al 99,1 % (ensayo: 96,8%); rendimiento del 86%; RMN 1H (CDCls, 400 MHz): 5 = 9,216 (s, 1H), 8,120 (s, 1H), 2,890 (s, 3H), 2,773 (s, 3H).

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Trifluorometanosulfonato de 7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-ilo

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Procedimiento A:

Calentar una mezcla de trifluorometanosulfonato de 7-metil-2-(metiltio)pirido[2,3-d]pirimidin-6-ilo (28,6 g, 84 mmol), dimetilformamida (74 ml) y acido acetico glacial (9,61 ml, 169 mmol) a 45 °C y despues anadir gota a gota NaoCl acuoso al 6,15 % (lejia, 612 g, 506 mmol) durante 2 h. Calentar a 45-50 °C durante 2 h, enfriar a TA, recoger los solidos por filtration y lavar con agua (300 ml). Anadir DCM (200 ml) a los solidos, enfriar la suspension en un bano de hielo-agua y tratar con una solution de N-metilamina 2,0 M en THF (126 ml, 253 mmol). Permitir que la mezcla se caliente lentamente a TA y agitar durante 2 h. Eliminar el disolvente a presion reducida, tratar con metanol (MeOH) (50 ml) y agitar a TA durante 30 min. Recoger el solido por filtracion y lavar con MeOH. Tratar el solido con EtOAc (30 ml) y agitar a TA durante 30 min. Recoger el solido por filtracion y lavar con EtOAc para obtener el compuesto del trtulo (19,82 g, rendimiento del 73 %). EM (m/z): 323,0 (M+1).

Procedimiento B:

Cargar el recipiente de reaction con 150 g (0,442 mol, 1,0 equiv. Reactivo limitado) de trifluorometanosulfonato de 7- metil-2-(metiltio)pirido[2,3-d]pirimidin-6-ilo, anadir 3000 ml de DCM hasta eliminar, enfriar la mezcla a -5~5 °C. Anadir en porciones 105 g (0,442 mol, 1,0 equiv.) de m-CPBA por debajo de 5 °C. Agitar la mezcla a 0~5 °C durante 3~4 horas (E/A = 1 %). Anadir gota a gota 660 ml (1,326 mol, 3,0 equiv.) de Metilamina en THF 2 M por debajo de 10 °C, agitar la mezcla a 0~10 °C durante 3~4 horas. Anadir 1500 ml de DCM y 1000 ml de H2O con agitation y separar la fase acuosa. Lavar la capa organica con 500 ml H2O cuatro veces y concentrar a 600 g por debajo de 40 °C. Intercambiar el disolvente con n-heptano dos veces y agitar la mezcla a 10~20 °C durante 3~4 horas. Filtrar la suspension. Aclarar con 150 g de n-heptano y secar la torta de filtro a presion reducida a 65~75 °C durante 10-16 h, obteniendo el compuesto del tUulo (129,6 g, 96,5 % de pureza con un rendimiento del 82 %; LC-EM (EM+ = 371,8); RMN 1H (CDCls, 400 MHz): 5 = 8,932 (s, 1H), 7,86 (m, 1H), 5,707 (s, 1H), 3,192-3,180 (d, 3H), 2,754 (s, 3H).

Preparacion 12

N,7-Dimetilpirido[2,3- d]pirimidin-2-amina

imagen13

Tratar una solucion de 4-amino-2-(metiltio)pirimidin-5-carbaldehido (10 g, 59,1 mmol) en acetona (100 ml) con KOH (3,32 g, 59,1 mmol), agitar a TA durante 10 min, despues concentrar a sequedad. Tratar el residuo con EtOAc, lavar con NaHCO3 acuoso saturado, despues salmuera, secar sobre Na2SO4 y concentrar, obteniendo 7-metil-2- (metiltio)pirido[2,3-d]pirimidina. EM (m/z): 192,1 (M+1). Anadir una solucion de metilamina en etanol (33 %, 80 ml) y calentar a 110 °C durante una noche en un tubo a presion. Eliminar el disolvente a presion reducida y purificar el producto en bruto por cromatografia sobre gel de sflice (EtOAc al 50-100 %/Hexanos), obteniendo el compuesto del tUulo (6,73 g, 65 %, en dos etapas). EM (m/z): 175,1 (M+1).

Preparacion 13

6-Bromo-N,7-dimetilpirido[2,3-d]pirimidin-2-amina

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Enfriar una solucion de N,7-dimetilpirido[2,3-d]pirimidin-2-amina (6,73 g, 38,6 mmol) en acetonitrilo (160 ml) en un bano de hielo y proteger de la luz con una lamina de aluminio. Anadir N-bromosuccinimida (6,88 g, 38,6 mmol) y agitar a 0 °C durante 2 h. Transferir la reaccion a un frigorifico a 5 °C durante 4 dias. Recoger el solido por filtracion. Lavar el solido con DCM y concentrar los lavados, obteniendo el compuesto del trtulo (3,0 g, rendimiento del 31 %). EM (m/z): 253,0/255,0 (M+1).

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Ejemplo 1

1-(3,3-Dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)urea

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El Ejemplo 1 puede prepararse con el Procedimiento A, el Procedimiento B o el Procedimiento C.

Procedimiento A:

Combinar 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil)urea (25,9 g, 68,5 mmol), trifluorometanosulfonato de 7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-ilo (22,09 g, 68,5 mmol) y NaHCO3 (17,28 g, 206 mmol) en 1,4-dioxano (500 ml) y agua (125 ml) y rociar con argon durante 20 minutos. Anadir fetraq(u/s(trifenilfosfina)paladio (3,96 g, 3,43 mmol) y despues calentar en una atmosfera de argon a 50 °C. Anadir una porcion mas de trifluorometanosulfonato de 7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-ilo (300 mg, 0,55 mmol) y continuar el calentamiento a 50 °C durante una noche. Enfriar la mezcla a TA, recoger el solido por filtracion y lavar con agua y despues eter dietflico. Tratar el solido con acetonitrilo (50 ml) y calentar la suspension a 80 °C durante 30 minutos. Recoger el solido por filtracion, lavar con acetonitrilo y secar al vado a 80 °C, obteniendo un solido de color amarillo palido. Tratar el solido con MeOH (50 ml) y calentar la mezcla a 80 °C durante 1 hora. Enfriar a TA, recoger el solido por filtracion, lavar con MeOH (20 ml) y secar al vado para obtener el compuesto del tUulo (22,5 g, rendimiento del 77 %) en forma de un solido de color amarillo palido. EM (m/z): 425,2 (M+1).

Procedimiento B:

Rociar una suspension de 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil)urea (4,48 g, 11,8 mmol), 6-bromo-N,7-dimetilpirido[2,3-d]pirimidin-2-amina (3,0 g, 11,8 mmol) y K2CO3 (4,91 g, 35,6 mmol) en dioxano (80 ml) y agua (20 ml) con argon, tratar con tetraquis(trifenilfosfina)paladio (0,685 g, 0,593 mmol) y calentar a 85 °C durante una noche. Eliminar el dioxano a presion reducida, tratar la mezcla con EtOAc y salmuera, separar las fases, secar los productos organicos sobre Na2SO4, concentrar y purificar por cromatografia sobre gel de sflice (EtOAc del 40 % al 100 %/hexano, EtOAc al 100 %, MeOH al 5 %/EtoAc). Tratar el material con CH3CN, calentar a 80 °C durante 1 hora, enfriar a TA y recoger el solido por filtracion, proporcionando el compuesto del trtulo (3,52 g, rendimiento del 70 %) en forma de un solido de color amarillo palido. EM (m/z): 425,2 (M+1).

Procedimiento C:

Burbujear con N2 los disolventes de mezcla 1, 4-dioxano (1250 g) y agua (200 g) en un recipiente de reaccion. Calentar la mezcla a 80~85 °C. Cargar 100 g (0,31 mol, 1,0 equiv. reactivo limitado) de trifluorometanosulfonato de

7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-ilo, 117,4 g (0,31 mol, 1,0 equiv.) de 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4- metil-5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil)urea, 128,7 g (0,93 mol, 3,0 equiv.) de K2Co3 y 6,81 g (0,0093 mol, 0,03 equiv.) de Pd(dppf)Cl2 en una atmosfera de nitrogeno. Agitar la mezcla a 80~90 °C durante 4~6 horas. Enfriar la mezcla a 40~50 °C. Concentrar y anadir gota a gota 2000 g de agua por debajo de 30 °C. Despues de la adicion, agitar la mezcla a 10~30 °C durante 6~8 horas. Filtrar y aclarar con 200 g de agua, despues lavar la torta. Secar la torta de filtro a presion reducida a 60~70 °C durante 14-16 h, obteniendo API de calidad Tech del compuesto del trtulo (158 g, puro al 90,4 %, ensayo: 63,4 %, KF: 5 %-6 %). Disolver el API de calidad Tech del compuesto del trtulo en 1000 ml de DCM y 1000 ml de EtOH a 10~30 °C. Anadir 50 g de Gel de Sflice, 80 g de Na2S2O3 5H2O y 10 g de carbon activo. Calentar la mezcla a 40~50 °C y agitar durante 3~5 horas y enfriar a 10~30°C. Filtrar y lavar la torta con 200 g de DCM/EtOH (1:1). Agitar con 5g de sflice tiol a 40~50 °C y filtrar. Intercambiar dos veces el disolvente con 390,0 g de EtOH. Concentrar y filtrar la suspension, despues lavar la torta con 39,0 g de EtOH. Secar la torta de filtro a presion reducida a 65~75°C durante 14-16 h, obteniendo API del compuesto del tUulo (61 g, puro al 98,5 %, ensayo: 97,5 %, rendimiento del 65 %; RMN 1H (d6-DMSO, 400 MHz): 5 = 9,077 (s, 1H), 8,278 (s, 1H), 7,968-7,947 (d, 1H), 7,893 (s, 1H), 7,680 (s, 1H), 5 7,193-7,162 (d, 1H), 6,512-6,485 (m, 1H), 3,088-3,035 (m, 2H), 2,924-2,914 (d, 3H), 2,296 (s, 3H), 1,955(s, 3H), 1,344-1,304 (m, 2H), 0,875 (s, 9 H).

Difraccion de polvo de rayos X

Los patrones XRD de los solidos cristalinos se obtienen en un difractometro de polvo de rayos X Bruker D4 Endeavor, equipado con una fuente CuKa X = 1,54060 A) y un detector Vantec, que funciona a 35 kV y 50 mA. La muestra se barre entre 4 y 40° en 20, con un tamano de etapa de 0,009° en 20 y una velocidad de barrido de 0,5 segundos/etapa, y con una divergencia de 0,6 mm, 5,28 anti-dispersion fijado y 9,5 mm de abertura del detector. El polvo seco se envasa en un portamuestras de cuarzo y se obtiene una superficie lisa usando un portaobjetos de vidrio. Los patrones de difraccion de forma cristalina se recogen a temperatura ambiente y humedad relativa. Se conoce bien en la tecnica de la cristalografia que, para cualquier forma cristalina proporcionada, las intensidades

relativas de los picos de difraccion pueden variar debido a la orientacion preferida resultante de factores tales como la morfologfa y el habito del cristal. Cuando los efectos de una orientacion preferida estan presentes, las intensidades de picos se alteran, pero las posiciones del pico caractenstico del polimorfo estan inalteradas. Vease, por ejemplo, The United States Pharmacopeia n.° 23, National Formulary n.° 18, paginas 1843-1844, 1995. Ademas, 5 tambien se conoce bien en la tecnica de la cristalograffa que para cualquier forma cristalina proporcionada, las posiciones de pico angular pueden variar ligeramente. Por ejemplo, las posiciones del pico pueden cambiar debido a una variacion en la temperatura o la humedad a la que se analiza una muestra, el desplazamiento de la muestra o la presencia o ausencia de un estandar interno. En el presente caso, una variabilidad en la posicion del pico de + 0,2 en 20 tendra en cuenta estas potenciales variaciones sin impedir la identificacion inequvoca de la forma cristalina 10 indicada. La confirmacion de una forma cristalina se puede hacer en base a cualquier combinacion unica de picos distinguibles (en unidades de ° 20), tipicamente los picos mas prominentes. El patron de difraccion de forma cristalina, recogido a temperatura ambiente y humedad relativa, se ajusta basandose en los picos estandar de NIST 675 a 8.853 y 26.774 grados 2-theta.

Solido cristalino de base libre

15 Por lo tanto, una muestra preparada del solido cristalino de base libre del Ejemplo 1 esta caracterizada por un patron XRD usando radiacion CuKa por tener picos de difraccion (valores 2-theta) como se describe en la Tabla 1 a continuacion, y en particular por tener picos en 16,0 junto con uno o mas de los picos seleccionados entre el grupo que consiste en 6,9, 7,0, 18,2 y 23,2; con una tolerancia para los angulos de difraccion de 0,2 grados.

Tabla 1: Picos de difraccion de polvo de rayos X del solido cristalino de base libre del Ejemplo 1:

Pico

Angulo (2-Theta °) % de Intensidad

1

6,9 80,4

2

7,0 71,3

3

12,1 13,2

4

13,9 11

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14,1 10,2

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14,9 36,1

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16,0 100

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17,0 16,2

9

18,2 67,5

10

18,4 57,9

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18,6 57,8

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20,0 31,1

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20,5 55,3

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21,9 36,3

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22,1 38,3

16

23,2 59,6

17

23,7 46,8

18

26,0 20,7

19

28,0 20,2

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29,1 32,2

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29,6 16,5

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Se sabe, en lmeas generales, que la biodisponibilidad de un compuesto poco soluble puede potenciarse formulandolo como una dispersion solida en una matriz polimerica. Dichas dispersiones solidas son dispersiones de farmaco en una matriz de vetnculo inerte preparada por fundido (fusion) de mezclas de farmaco-polfmero seguido por solidificacion de la mezcla fundida homogenea por enfriamiento rapido (por ejemplo, usando procedimientos 25 tales como extrusion, de fusion en caliente), o disolviendo el farmaco y el polfmero en disolvente organico apropiado seguido por retirada del disolvente por evaporacion (por ejemplo, secado por pulverizacion) o por precipitacion usando antidisolvente. Las dispersiones solidas tfpicamente convierten el farmaco en una forma amorfa que provoca una tasa mas rapida de disolucion y/o un mayor grado (proporcion) y duracion de supersaturacion que conduce a biodisponibilidad oral potenciada de compuestos poco solubles respecto al farmaco cristalino no dispersado. Los 30 polfmeros que se han usado satisfactoriamente para dispersiones solidas incluyen (aunque sin limitacion)

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polivinilpirrolidona (PVP), polivinilpirrolidona-acetato de vinilo (PVP-VA), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), acetato succinato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCAS), ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP-55) acetato ftalato de celulosa (CAP), y Eudragit® EPO.

La estabilidad ffsica y qmmica de una dispersion solida son factores en la idoneidad de dichas formulaciones. La carga del farmaco es otra variable que puede afectar a la estabilidad ffsica de la forma amorfa metaestable del farmaco asf como su rendimiento in vivo. Un modo preferido para administrar una dispersion solida en seres humanos es formulandola adicionalmente como una capsula, un comprimido, u otra forma solida de dosificacion oral anadiendo un velffculo farmaceuticamente aceptable y, opcionalmente, otros excipientes, adecuados para dicha fabricacion y rendimiento de la forma de dosificacion. Las dispersiones solidas pueden dosificarse llenando el polvo o mezcla granulada en capsulas, como una suspension en vehffculo adecuado o cualquier otra forma oral de dosificacion farmaceutica adecuada tal como (aunque sin limitacion) comprimidos, sobres, granulos, rociadores, etc.

Debido a la baja biodisponibilidad del Ejemplo 1, resultante de su mala solubilidad, se desea posibilitar una formulacion para conseguir a exposiciones diana en estudios en animales pequenos, perros y ratas, y para ensayo clmico. Un poffmero neutro PVP-VA (Kollidon® VA 64) produjo dispersiones solidas que eran tanto qmmica como ffsicamente estables en ensayo de estabilidad acelerada (40 °C; humedad relativa del 75 % sobre un penodo de un mes, asf como tras almacenamiento a largo plazo (11 meses para carga de farmaco del 20% y 10 meses para carga de farmaco del 40 %) en condiciones ambientales.

Ejemplo de Composicion 1: Ejemplo 1 que contiene una dispersion solida al 20 %:PVP-VA (20:80)

Se usa el Ejemplo Cristalino 1 para la preparacion de una dispersion solida. Esta disponible en el mercado polivinilpirrolidona-acetato de vinilo (PVP-VA) con el nombre comercial Kollidon® VA 64 de BASF Corporation. El disolvente es 1:1 de diclorometano y Metanol, preparado mezclando volumenes iguales de diclorometano (Fisher Scientific) y metanol (OmniSolv). Esta disponible en el mercado el lauril sulfato sodico (Fisher Scientific). Procedimiento: Se prepara una dispersion solida y se seca por pulverizacion en dos sub-lotes. Para el primer sub- lote, se anade el Ejemplo 1 (22,22 g) en una botella de 2000 ml. Se anaden 1180 ml de disolvente (diclorometano:metanol, 1:1) y el bano de muestra se sonica durante aproximadamente 20 minutos hasta que todo el compuesto se disuelve dando como resultado una concentracion teorica de 19 mg/ml. A esta solucion se le anaden 88,86 g de PVP-VA y se disuelven por mezcla hasta que se obtiene una solucion homogenea. La solucion del Ejemplo 1 y PVP-VA (20:80) en diclorometano:metanol (1:1) se seca por pulverizacion usando un mini secador por pulverizacion (Buchi Mini Spray Dryer 290). El caudal de la solucion es de 9-12 ml/min, con una temperatura de entrada ajustada a 100°C-110°C dando como resultado una temperatura de salida de 37-55 °C. Para el segundo sub-lote, se anade el Ejemplo 1 (34,62 g) a una botella de 2000 ml. Se anaden 1820 ml de disolvente (Diclorometano:Metanol, 1:1) y el bano de muestra se sonico durante aproximadamente 20 minutos hasta que todo el compuesto se disuelve dando como resultado una concentracion teorica de 19 mg/ml. A esta solucion se le anaden 138,48 g de PVP-VA y se disuelve por mezcla hasta que se obtiene una solucion homogenea. La solucion del Ejemplo 1 y PVP-VA (20:80) en diclorometano:metanol (1:1) se seca por pulverizacion usando un mini secador por pulverizacion (Buchi Mini Spray Dryer 290). El caudal de la solucion es de 14-15 ml/min, con una temperatura de entrada ajustada a 100 °C-110 °C dando como resultado una temperatura de salida de 62-70 °C. El material secado por pulverizacion recogido de ambos sub-lotes se mezcla y se seca adicionalmente en una estufa de vacfo durante una noche entre 40-60 °C, y despues se almacena al vacfo durante un dfa mas a temperatura ambiente.

A 236,28 g del Ejemplo 1 que contiene una dispersion solida:PVP-VA (20:80), se le anaden 4,278 g de lauril sulfato sodico y se mezclan minuciosamente en una placa de cristalizacion grande usando una espatula para dar una composicion final que contiene una dispersion solida al 98 % mas lauril sulfato sodico al 2 %.

Esta formulacion puede dosificarse rellenando el polvo mezclado en capsulas, o en forma de una suspension por suspension en un vehfculo de, por ejemplo, Hidroxietilcelulosa al 1 %/polisorbato 80 al 0,25 %/antiespumante Dow Corning al 0,05 % 1510-US.

Ejemplo de Composicion 2: Ejemplo 1 que contiene una dispersion solida al 40 %:PVP-VA (40:60)

El Ejemplo Cristalino 1, polivinilpirrolidona-acetato de vinilo (PVP-VA), el disolvente y lauril sulfato sodico son como se ha descrito para el Ejemplo de Composicion 1.

Procedimiento: Se prepara una dispersion solida mediante un proceso de secado por pulverizacion sustancialmente como se ha descrito para el Ejemplo de Composicion 1 usando 3,79 g del Ejemplo 1, un volumen apropiado de disolvente (diclorometano:metanol, 1:1) para obtener una solucion concentrada de 20 mg/ml. A esta solucion se le anaden 5,68 g de PVP-VA y se disuelven por mezcla hasta que se obtiene una solucion homogenea. La solucion se seca por pulverizacion sustancialmente como se ha descrito para el Ejemplo de Composicion 1. El caudal de la solucion se ajusta al 40 % usando un tubo de silicona de 2 mm, con una temperatura de entrada ajustada a 80 °C dando como resultado una temperatura de salida de 34 °C. El material secado por pulverizacion se recoge y se seca adicionalmente en una estufa de vacfo durante 14 horas a temperatura ambiente, con una alimentacion lenta de nitrogeno y en presencia de un desecante.

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A 6,64 g del Ejemplo 1 que contiene una dispersion solida:PVP-VA (40:60), se le anaden 0,0665 g de lauril sulfato sodico y se mezclan minuciosamente en ajar usando una espatula, dando como resultado una composicion final que contiene una dispersion solida y lauril sulfato sodico en una relacion de 99:1.

Esta formulacion puede dosificarse rellenando el polvo mezclado en capsulas, o en forma de una suspension por suspension en un vehmulo de, por ejemplo, Hidroxietilcelulosa al 1 %/polisorbato 80 al 0,25 %/antiespumante Dow Corning al 0,05 % 1510-US.

El cancer esta cada vez mas reconocido como un conjunto heterogeneo de enfermedades cuyo inicio y progresion se inducen por la funcion aberrante de uno o mas genes que regulan la reparacion del aDn, la estabilidad del genoma, la proliferacion celular, la muerte celular, la adhesion, la angiogenesis, la invasion, y la metastasis en microentornos celulares y tisulares. Una funcion variante o aberrante de los genes "cancerosos" puede resultar de polimorfismo de ADN de origen natural, cambios en la cantidad de copias del genoma (a traves de amplificacion, delecion, perdida de cromosomas, o duplicacion), cambios en la estructura genica y del cromosoma (a traves de translocacion cromosomica, inversion, u otro reordenamiento que conduzca a expresion genica desregulada), y mutaciones puntuales. Las neoplasias cancerosas pueden inducirse por una funcion genica aberrante, y mantenerse por la misma funcion genica aberrante, o el mantenimiento y la progresion pueden exacerbarse por funciones genicas aberrantes adicionales.

Mas alla de las aberraciones cromosomicas geneticas mencionadas anteriormente, cada uno de los canceres tambien puede incluir modificaciones epigeneticas del genoma incluyendo metilacion del ADN, impronta genomica, y modificacion de histonas por acetilacion, metilacion, o fosforilacion. Una modificacion epigenetica puede desempenar un papel de la induccion y/o mantenimiento de la neoplasia.

Se han compilado catalogos extensivos de las aberraciones citogeneticas en cancer humano y se mantienen y actualizan regularmente en lmea (vease, The Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer at the US National Cancer Institute (NCI) Cancer Genome Anatomy Project (CGAP) sitio Web:
http://cgap.nci.nih.gov). La base de datos incluye aberraciones cromosomicas para al menos algunas de las neoplasias de la presente invencion. El Wellcome Trust Sanger Institute Cancer Genome Project mantiene un detallado "Cancer Gene Census" en lmea de todos los genes humanos que han estado vinculados de forma causal a tumorigenesis (vease
http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census) asf como la base de datos COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) de mutaciones somaticas en cancer humano (vease,
http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic). Una fuente adicional que contiene informacion abundante sobre cambios citogeneticos vinculados de forma causal a diversos canceres es el Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology (
http://atlasgeneticsoncology.org//Anomalies/Anomliste.html#MDS). Estas bases de datos tambien incluyen aberraciones cromosomicas para al menos algunas de las neoplasias de la presente invencion.

El diagnostico de neoplasias cancerosas por biopsia, inmunofenotipado y otros ensayos es conocido y usado de forma rutinaria. Ademas del bandeo cromosomico de alta resolucion y las tecnologfa avanzadas de imagenes cromosomica, pueden determinare aberraciones cromosomicas en casos sospechosos de cancer a traves de analisis citogenetico tal como hibridacion in situ de fluorescencia (FISH), cariotipado, cariotipado espectral (SKY), FISH combinado (M-FISH), hibridacion genomica comparativa (CGH), series de polimorfismos de un unico nucleotido (Chips en SNP) y otros ensayos de diagnostico y analisis conocidos y usados por los expertos en la materia.

La ruta de senalizacion Ras/Raf/MEK/MAPK transmite estfmulos extracelulares al nucleo, regulando de ese modo diversas respuestas celulares incluyendo la proliferacion, diferenciacion y apoptosis celular. La perturbacion de estos procesos por senalizacion aberrante de MaPk tal como alteraciones geneticas, a menudo conduce a transformacion maligna. La importancia de esta ruta de senalizacion en neoplasias es evidente a traves del descubrimiento de muchos alelos mutantes que activan esta ruta en una diversidad de neoplasias humanas. Mutaciones oncogenicas en receptores tirosina quinasa (RTK), tales como EGFR y cMet, o sobreexpresion de RTK y sus ligandos activan de forma anormal Ras y sus componentes corriente abajo. Se han detectado mutaciones de Ras activadoras en aproximadamente el 30 % de los canceres humanos. Estas mutaciones disminuyen de forma marcada la actividad GTPasa, llevando de ese modo a Ras al estado unido a GTP y activo. En mairnferos, la familia Ras consiste en tres genes: K-Ras, N-Ras y H-Ras. K-Ras esta a menudo mutado en canceres epiteliales, tales como cancer pancreatico, pulmonar y colorrectal, mientras que a menudo suceden mutaciones en N-Ras en melanoma, neoplasias de hngado y mieloides (AML, CML). Se han descubierto mutaciones activadoras de B-Raf, un miembro de la familia Raf, con alta frecuencia en melanoma y carcinoma de tiroides y, a un menor grado en cancer colorrectal, de ovario y pulmonar. Se han identificado mutaciones somaticas de MEK1 y MEK2 en pacientes con melanoma. Finalmente, la perdida de reguladores negativos, tales como miembros de la familia Sprouty y GAP (protemas activadoras de GTPasa) tales como NF1, pueden activar indirectamente esta ruta. Se cree que muchos tumores muestran desregulacion de la ruta Ras/Raf/MEK/MAPK, haciendo que sea una diana atractiva para intervencion terapeutica.

Las protemas Raf estan compuestas de tres miembros, A-Raf, B-Raf y C-Raf (tambien llamada Raf1), que desempenan un papel central en la transduccion de senales desde Ras hasta componentes corriente abajo MEK1/2

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y ERK1/ERK2. Las protema quinasas Raf han demostrado desempenar un papel en el tumorigenesis incluyendo proliferacion, supervivencia, invasion y angiogenesis de celulas tumorales, Sebolt-Leopold y col., Nat Rev Cancer, 2004, 4: 937-947; Wellbrock y col., Nat Rev Mol Cell Biol, 2004, 5: 875-885. La activacion de la ruta de MAPK en celulas tumorales por multiples mecanismos tales como mutaciones o sobreexpresion de RTK y mutaciones de Ras, todas pasa todo por las protemas Raf. De forma mas importante, a menudo se observan mutaciones activadoras de B-Raf, Davies y col, Nature, 2002, 417: 949-954, en varias neoplasias incluyendo melanoma, carcinoma colorrectal, pulmonar, de ovario y de tiroides. Casi el 90 % de las mutaciones de B-Raf son un cambio T1799A en el exon 15 que provoca una sustitucion de aminoacido de Val a Glu (B-Raf V600E). Esta mutacion en B-Raf conduce a actividad quinasa constitutiva aproximadamente 500 veces mayor que la de la protema de tipo silvestre, y transformacion maligna. Mutaciones adicionales, tales como T529I, una mutacion de tipo guardian de B-Raf de treonina a isolucina y G468A, una mutacion secundaria de B-Raf en G1403C en el exon 11 tambien son conocidas y se cree que desempenan un papel en la causa, mantenimiento, o exacerbacion de transformacion maligna, Whittaker y col., Sci. Transl. Med., 2010, 2(35) ra41; Wan y col., Cell, 2004, 116: 855-867.

Recientemente, se aprobo un inhibidor de quinasa espedfico de B-Raf vemurafenib (tambien llamado PLX-4032) por la United States Food and Drug Administration (FDA) para el tratamiento de pacientes con melanoma con la mutacion V600E de B-Raf. Vemurafenib es eficaz y proporciona beneficios de supervivencia en esto pacientes. Sin embargo, los pacientes sensibles a este farmaco generalmente desarrollan resistencia al farmaco que conduce a recidiva de la enfermedad en un promedio de 7 meses. Similar a muchas otras terapias dirigidas, la resistencia adquirida a inhibicion de B-Raf presenta un reto terapeutico para el beneficio de supervivencia a largo plazo en esta poblacion de pacientes.

Para mejorar el beneficio de los inhibidores de B-Raf, se sigue investigando para identificar los mecanismos que vuelven a las celulas de melanoma que expresan B-Raf mutante resistentes a vemurafenib. Estudios recientes han indicado que la reactivacion de la ruta de MAPK es un mecanismo de resistencia a la inhibicion de B-Raf. Los mecanismos de resistencia implican principalmente la reactivacion de la senalizacion de ERK a traves de mecanismos de derivacion que son dependientes de Ras/Raf, tal como la activacion de N-Ras, Nazarian y col., Nature. 2010, 468: 973-7, activacion de H-Ras (Su y col., New England Journal of Medicine. 2012, 366: 207-215) o regulacion positiva de C-RAF, (Johannessen y col., Nature. 2010, 468: 968-72; Montagut y col, Cancer Res. 2008, 68: 4853-61), variantes con corte y empalme aberrante de B-RAF V600E (Poulikakos y col, Nature. 2011, 480: 387390), o independientes de Ras/RAF (sobreexpresion de Tp12/COT) Johannessen y col., Nature. 2010, 468: 968-72. Por consiguiente, multiples mecanismos podnan atenuar el efecto de la inhibicion de B-RAF en la senalizacion de MAPK en canceres con B-RAF mutante. Aunque aun no se ha identificado clmicamente una mutacion de tipo guardian de B-RAF (T529I) que podna causar resistencia a la inhibicion de B-RAF, se ha demostrado experimentalmente que dicha mutacion causa resistencia, Whittaker y col., Sci Transl Med. 2010, 2(35): ra41. Estudios recientes tambien han sugerido que la activacion de las rutas de senalizacion redundantes de MAPK por RTK tales como IGF-1R o PDGFRp podna desempenar un papel en resistencia adquirida a la inhibicion de B-RAF; Nazarian y col., Nature. 2010, 468: 973-7; Villanueva y col., Cancer Cell. 2010, 18: 683-95; Shi y col., Cancer Res. 2011, 71: 5067-74. Esta claro que la reactivacion de MAPK esta implicada en muchos de estos mecanismos de resistencia. Se espera que un inhibidor de pan-Raf bloquee la reactivacion de MAPK.

Adicionalmente, inhibidores espedficos de B-Raf incluyendo vemurafenib y su analogo cercano N-[3-(5-cloro-1H- pirrolo[2,3-b]piridina-3-carbonil)-2,4-difluorofenil]propano-1-sulfonamida (PLX4720; un inhibidor de R-Raf selectivo disponible en el mercado) demostraron inducir activacion paradojica de la ruta a traves de dimerizacion con otras isoformas de Raf en un fondo de tipo silvestre de B-Raf, Hatzivassiliou G, y col., Nature, 2010, 464: 431-435; Poulikakos y col., Nature, 2010, 464: 427-430; Heidorn, y col., Cell, 2010, 140: 209-221. Se cree que vemurafenib activa la ruta Raf/MEK/ERK a traves de la union de B-Raf de tipo silvestre y estimulando la dimerizacion B-Raf-C- Raf. Esta activacion paradojica de la ruta por inhibicion espedfica de B-Raf se cree que es una razon principal de efectos secundarios cutaneos (tales como carcinoma de celulas escamosas) en algunos pacientes con melanoma tratados con vemurafenib. El vemurafenib no esta aprobado para tratamiento de pacientes con cancer con un fondo genetico de tipo silvestre de B-Raf debido a su actividad de activacion paradojica de la ruta en este fondo genetico.

El compuesto ejemplificado ensayado es un inhibidor de Raf quinasa que inhibe toda las isoformas de protemas Raf incluyendo A-Raf, B-Raf, C-Raf, y la mutacion V600E de B-Raf. Debido a sus actividades pan-Raf, el compuesto ejemplificado ensayado es activo contra celulas tumorales con activacion de la ruta MAPK por senalizacion corriente arriba tal como mutacion de N-Ras y mutacion de K-Ras, ambas con fondo genetico de tipo silvestre de B-Raf. Por lo tanto, el compuesto ejemplificado ensayado tiene el potencial de tratar pacientes con cancer con mutacion B-Raf (tal como melanoma, carcinoma colorrectal, pulmonar, de ovario y de tiroides), mutacion de N-Ras, B-Raf de tipo silvestre (tal como melanoma, AML, CML, ALL, CLL, cancer hepatico), (Schubbert y col., Nature Reviews Cancer, 2007, 7: 295; Pylayeva-Gupta y col., Nature Reviews Cancer, 2011, 11: 761); o mutacion de K-Ras, B-Raf de tipo silvestre (tal como tracto biliar, cervical, colorrectal, de endometrio, pulmonar, de ovario, pancreatico, y hepatico; Schubbert y col., Nature Reviews Cancer, 2007, 7: 295; Pylayeva-Gupta y col., Nature Reviews Cancer, 2011, 11: 761) u otros mecanismos de activacion de Raf incluyendo mutacion/sobreexpresion de RTK de activacion corriente arriba. El compuesto ejemplificado ensayado tambien es activo contra celulas tumorales de melanoma que desarrollaron resistencia a vemurafenib. Por lo tanto, se cree que el compuesto ejemplificado ensayado sera eficaz para pacientes con melanoma que han fracasado con vemurafenib u otros inhibidores de B-Raf.

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El compuesto ejemplificado ensayado tambien es un inhibidor de c-Kit. c-Kit es un receptor tirosina quinasa que controla normalmente la funcion de celulas hematopoyeticas primitivas, melanocitos y celulas germinales. Despues de la union con su ligando el factor de celulas madre (SCF), c-Kit experimenta dimerizacion/oligomerizacion y autofosforilacion. Mutaciones geneticas (tales como L576P, K642E, T670I, y V654A) de c-Kit que activan de forma constitutiva c-Kit pueden conducir a melanoma, leucemia mielogena aguda, y tumores del estroma gastrointestinal (GIST), por lo tanto, el compuesto ejemplificado ensayado tiene el potencial de tratar a pacientes con melanoma, leucemia mielogena aguda y GIST, Lennartsson y col., Current Cancer Drug Targets, 2006, 6: 65.

El compuesto ejemplificado puede usarse como agente unico o en combinacion con uno o mas farmacos aprobados diferentes para el tratamiento de pacientes con cancer. Estos pacientes con cancer incluyen: pacientes con melanoma con la mutacion V600E de B-Raf, pacientes con melanoma que han fracasado con vemurafenib u otros inhibidores de B-Raf, pacientes de melanoma con mutacion de N-Ras B-Raf de tipo silvestre, pacientes con melanoma con sobreexpresion de c-Kit o mutacion de c-Kit; pacientes con cancer colorrectal con mutacion V600E de B-Raf o mutacion de K-Ras B-Raf de tipo silvestre; pacientes con cancer de ovario con la mutacion V600E de B- Raf o mutacion de K-Ras B-Raf de tipo silvestre; paciente con cancer pulmonar con la mutacion V600E de B-Raf o mutacion de K-Ras B-Raf de tipo silvestre; pacientes con leucemia mieloide con mutacion de N-Ras B-Ras de tipo silvestre, o sobreexpresion de c-Kit o mutacion de c-Kit; pacientes con cancer hepatico con mutacion de N-Ras o KRas B-Raf de tipo silvestre; pacientes con cancer pancreatico con mutacion de K-Ras B-Raf de tipo silvestre; pacientes con carcinoma de tiroides con B-Raf V600E o mutacion de N-Ras B-Raf de tipo silvestre; pacientes con cancer del tracto biliar con mutacion de K-Ras B-Raf de tipo silvestre; pacientes con GIST con mutacion o sobreexpresion de c-Kit.

Los siguientes estudios in vitro e in vivo demuestran la actividad inhibidora de la senalizacion de la ruta Ras/Raf/MEK/ERK del compuesto ejemplificado. Estos ensayos estan reconocidos, en lmeas generales, por los expertos en la materia como indicativos de actividad quimioterapeutica clmica humana. Como se pone de manifiesto, la inhibicion de Raf y la actividad inhibidora de la senalizacion de la ruta, pueden realizarse sustancialmente del siguiente modo, o por ensayos similares que producen datos similares. Salvo que se indique de otro modo, los valores presentados de CI50 son absolutos.

Ensayos enzimaticos de actividades quinasa de B-Raf, C-Raf y mutaciones de B-Raf

El compuesto de ensayo se evalua para sus actividades inhibidoras contra B-Raf de tipo silvestre humano, C-Raf de tipo silvestre humano, B-Raf V600E humano, B-Raf V600E+T529I humano o B-Raf V600E+G468A humano. T529I es una mutacion de tipo guardian de B-Raf de treonina a isoleucina y G468A es una mutacion secundaria de B-Raf en G1403C en el exon 11. Los ensayos enzimaticos de B-Raf, C-Raf y mutaciones de B-Raf evaluan una propiedad de Raf y el complejo MEK1, que en presencia de ATP, cataliza una hidrolisis potenciada de ATP (Rominger, y col., Arch. Biochem. Biophys. 2007, 464: 130-137; publicacion de patente de Estados Unidos n.° 2006/0211073). El ADP formado se controla por el sistema PK/LDH acoplado bien conocido (piruvato quinasa/lactato deshidrogenasa) en forma de oxidacion de NADH, que puede controlarse y detectarse de forma espectrofotometrica por absorbancia a 340 nm (A340; para los principios del procedimiento vease Schindler y col., Science, 2000, 289: 1938-1942). La actividad ATPasa de MEK1 activada por Raf es una propiedad compartida por todas las isoformas de protemas Raf.

Expresion y purificacion de protemas Raf

En lmeas generales, se generan lmeas celulares usando materiales disponibles en el mercado por procedimientos conocidos y usados de forma rutinaria por los expertos en la materia. Las secuencias de nucleotidos que codifican el ADN de tipo silvestre de B-Raf de longitud completa (National Center for Biotechnology Information (NCBI), secuencia de referencia NC_000007.13), C-Raf (National Center for Biotechnology Information (NCBI), secuencia de referencia NC_000003.11) y A-Raf (National Center for Biotechnology Information (NCBI), secuencia de referencia NC_000023.10) son conocidas. Vease tambien, por ejemplo, para B-Raf: S. Ikawa, y col., "B-raf, a new member of the raf family, is activated by DNA rearrangement," Mol Cell Biol, 8(6):2651-4 (1988); para C-Raf: M. Fukui, y col., "Molecular cloning and characterization of an activated human c-raf-1 gene," Mol Cell Biol, 7(5):1776-81 (1987); Bonner, y col., "The complete coding sequence of the human raf oncogene and the corresponding structure of the c- raf-1 gene," Nucleic Acids Res., 14 (2), 1009-1015 (1986); para MEK1: C.F. Zheng, y col., "Cloning and characterization of two distinct human extracellular signal-regulated kinase activator kinases, MEK1 and MEK2," J. Biol. Chem., 268 (15), 11435-11439 (1993); para informacion de marcas: J. Tsai, y col., "Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 105(8), 30413046 (2008); G. Hatzivassiliou, y col., "RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth," Nature, 464 (7287), 431-435 (2010).

B-RafV600E (restos 433-726 que contienen la mutacion V600E) que contiene una marca de purificacion N-terminal se expresa y purifica esencialmente como se ha descrito previamente (Wan y col., Cell, 2004, 116, 855-867).

Construcciones de B-Raf V600E que contienen una mutacion secundaria T529I o mutacion G468A se generan por mutagenesis dirigida al sitio (Quikchange, Strategene) de la construccion basica de bRaf (433-726, V600E).

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Secuencias que se usan en el presente documento incluyen: B-RafV600E (restos 433-726 que contienen la mutacion V600E) con marca de purificacion N-terminal; B-RafV600E (restos 433-726 que contienen las mutaciones V600E y T529I) sin marca de purificacion N-terminal; B-RafV600E (restos 433-726 que contienen las mutaciones V600E y G468A) sin marca de purificacion N-terminal; BRAF-V600E; BRAF-V600E+T529I; BRAF-V600E+G468A; BRAF-de tipo silvestre, de longitud completa; C-RAF; secuencia proteica de MEK1 usada para exploracion.

Ensayos enzimaticos que miden la actividad Raf quinasa

El compuesto de ensayos se evalua para sus actividades inhibidoras contra B-Raf de tipo silvestre, C-Raf de tipo silvestre, B-Raf V600E, B-Raf V600E+T529I y B-Raf V600E+G468A. T529I es una mutacion de tipo guardian de B- Raf y G468A es una mutacion secundaria de B-Raf. Los ensayos enzimaticos de B-Raf, C-Raf y mutaciones de B- Raf evaluan una propiedad de Raf y el complejo MEK1, que en presencia de ATP, cataliza una hidrolisis potenciada de ATP (Rominger, y col., Arch. Biochem. Biophys. 2007, 464: 130-137). El ADP formado se controla por el sistema PK/LDH acoplado bien conocido (piruvato quinasa/lactato deshidrogenasa) en forma de oxidacion de NADH, que puede controlarse y detectarse por absorbancia a 340 nm (A340; para los principios del procedimiento vease Schindler y col., Science, 2000, 289: 1938-1942). La actividad ATPasa de MEK1 activada por Raf es una propiedad compartida por todas las formas de protemas Raf. En el ensayo enzimatico de B-Raf de tipo silvestre, la mezcla de reaccion contiene B-Raf 1,2 mM, MEK1 30 mM, ATP 1000 uM, 3,5 unidades (por 100 ul) de PK, 5 unidades (por 100 ul) de LDH, fosfoenol piruvato (PEP) 1 mM, y 280 uM de NADH. En el ensayo de C-Raf, la mezcla de reaccion contiene C-Raf 0,6 mM, MEK1 26 mM, ATP 2000 uM, y la misma cantidad de PK, LDH, PEP y NADH que anteriormente. En el ensayo de B-Raf V600E, la mezcla de reaccion contiene B-Raf V600E 1,6 uM, MeK1 26 mM, ATP 200 uM y la misma cantidad de PK, LDH, PEP y NADH que anteriormente. En el ensayo de B- RafV600E+T529l, la mezcla de reaccion contiene B-Raf V600E+T529I 6,2 mM, MEK1 30 mM, ATP 200 uM y la misma cantidad de PK, LDH, PEP y NADH que anteriormente. En el ensayo de B-Raf V600E+G468A, la mezcla de reaccion contiene B-Raf 3,5 mM, MEK1 30 mM, ATP 200 uM y la misma cantidad de PK, LDH, PEP y NADH que anteriormente. Todos los ensayos se inician mezclando la mezcla anterior con el compuesto de ensayo y controlando a A340 de forma continua durante aproximadamente 5 h. Los datos de reaccion en la franja de tiempo de 3 a 4 horas se recogen para calcular los valores CI50.

Para el Ejemplo 1, el resultado de CI50 de la enzima para B-Raf V600E es 6 mM y para C-Raf es 15 mM. Estos datos evidencian que el compuesto ejemplificado inhibe B-Raf V600E y C-Raf en estos ensayos.

El Ejemplo 1 se evalua en ensayos enzimaticos adicionales realizados por procedimientos sustancialmente similares a los descritos anteriormente. El Ejemplo 1 inhibe B-Raf de tipo silvestre, B-Raf V600E+T529I y B-Raf V600E+G468A con valores de IC50 de 9,8, 15,47 y 16,9 mM, respectivamente. Estos datos evidencian que el Ejemplo 1 es un inhibidor de B-Raf en esto ensayos.

Ensayo enzimatico de la actividad quinasa de c-Kit

c-Kit es un oncogen importante, y su sobreexpresion y mutaciones geneticas a menudo suceden en pacientes con melanoma y tumor del estroma gastrointestinal (GIST). En el ensayo enzimatico de c-Kit, la fosforilacion de poli E4Y por ATP catalizada por c-Kit humano se controla de forma espectrofotometrica. El ADP producido de la reaccion quinasa se acopla a reacciones de piruvato quinasa/lactato deshidrogenasa (PK/LDH) donde se forma NAD a partir de piruvato y NADH. Puede detectarse NADH por absorbancia a 340 nm, como se ha descrito anteriormente para ensayos enzimaticos de las actividades quinasa de B-Raf, C-Raf y mutaciones de B-Raf.

Expresion y purificacion del receptor de tipo silvestre de c-Kit

En lmeas generales, se generan lmeas celulares usando materiales disponibles en el mercado por procedimientos conocidos y usados de forma rutinaria por los expertos en la materia.

La secuencia de nucleotidos que codifica el ADN del receptor de c-Kit de tipo silvestre humano de longitud completa (National Center for Biotechnology Information (NCBI) secuencia de referencia NC 000004.11), es conocida. Vease tambien, por ejemplo, para la secuencia proteica de cKit humano: Y. Yarden, Y., y col., "Human proto-oncogene c- kit: a new cell surface receptor tyrosine kinase for an unidentified ligand," EMBO J. 6 (11), 3341-3351 (1987); para protemas de fusion de GST: D.B. Smith, y col., "Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase," Gene 67 (1988) 31-40; D.B. Smith, "Purification of glutathione S- transferase fusion proteins," Methods Mol. Cell Biol. 4 (1993) 220-229.

Ensayos de c-Kit

La mezcla de reaccion del ensayo incluye c-KIT de tipo silvestre humano 6 mM, 1 mg/ml de poli(Glu, Tyr) (Sigma), fosfoenol-piruvato 1 mM, NADH 280 |jM, 5 U/3,5 U (por 100 ul) de piruvato quinasa/lactato deshidrogenasa, Tris 85 mM, pH 7,5, MgCl2 17 mM, Triton® X-100 al 0,0042 %, BSA al 0,005 %, DMSO al 1 %. El compuesto de ensayo se incuba con la mezcla de reaccion durante 0,5 horas antes de anadir ATP 200 jM para iniciar la reaccion a 30 °C. Se usan las velocidades de reaccion a 0,5 a 1 horas para calcular el % de inhibicion y las CI50.

Una secuencia que se usa en el presente documento incluye c-KIT con la fusion N-terminal de GSM.

Para el Ejemplo 1, el resultado de la CI50 de inhibicion de c-Kit humano es 21 mM. Este dato evidencia que el compuesto ejemplificado ensayado es un inhibidor de c-Kit de tipo silvestre humano en este ensayo.

Para evaluar adicionalmente el compuesto de ensayo, se ensaya frente a mutaciones de c-Kit que aparecen habitualmente en melanoma y/o GIST. Se transfecta la lmea celular Ba/F3 (de la ATCC) con c-Kit de tipo silvestre 5 (WT), c-Kit L576P (Willmore-Payne y col., Human Pathology, 2005, 36(5), 486; Willmore-Payne y col., Human

Pathology, 2006, 37, 520), c-Kit K642E (Willmore y col., Am J Clin Pathol, 2004, 122(2), 206; Monsel y col., Oncogene, 2010, 29, 227), c-Kit T670I (Tamborini y col., Oncogene, 2006, 25, 6140), o c-Kit V654A (Tamborini y col., Oncogene, 2006, 25, 6140), se establecen respectivamente por procedimientos de transfeccion retrovmca bien conocidos y usados por los expertos en la materia. Las mutaciones se generan por mutagenesis por reaccion en 10 cadena de la polimerasa (PCR) y se confirman por secuenciacion automatizada de la construccion de expresion de c-Kit amplificada por PCR. Se generan lmeas celulares estables Ba/F3 por transfeccion con ADN plasirndico. La expresion de los mutantes apropiados de c-Kit se confirma por analisis de transferencia de Western.

Las celulas Ba/F3 de tipo silvestre generalmente son dependientes de IL-3 para el crecimiento. Despues de la transfeccion con c-Kit, estas celulas se cultivan en medio de cultivo recomendado por la ATCC para Ba/F3 en 15 presencia de factor de celulas madre (SCF), el ligando de c-Kit. Las actividades anti-proliferacion de los compuestos de ensayo contra estas celulas se ensayan en presencia de IL-3 o SCF.

Tabla 2: Actividades anti-proliferacion del Ejemplo 1 en lmeas celulares Ba/F3 de c-Kit

Actividades anti-proliferacion (CI50, uM) del Ejemplo 1 en lmeas celulares de c-Kit Ba/F3

Compuesto de ensayo

Tratamiento Ba/F3 Ba/F3 c- Kit WT Ba/F3 c-Kit L576P Ba/F3 c-Kit K642E Ba/F3 c-Kit T670I Ba/F3 c-Kit V654A

Ejemplo 1

SCF ND 0,062 0,179 0,047 0,29 0,086

IL-3

ND 2,858 2,079 1,200 5,919 2,942

Los datos de la Tabla 2 evidencian que el Ejemplo 1 tiene actividad inhibidora de la proliferacion y viabilidad celular 20 contra c-Kit de tipos silvestre y las mutaciones geneticas de c-Kit identificadas en celulas Ba/F3.

Medicion de las actividades de Raf Quinasa con enzimas completas nativas usando ensayo KiNativ de ActivX Biosciences Inc.

Para evaluar adicionalmente las actividades enzimaticas de pan-Raf del compuesto de ensayo, se evalua en un ensayo KiNativ desarrollado y realizado por ActivX Biosciences Inc. usando lisados de celulas completas de celulas 25 A375. Las celulas A375 son celulas de melanoma humano con una mutacion V600E de B-Raf, A-Raf de tipo

silvestre y C-Raf de tipo silvestre.

Preparacion de la muestra: Se lisan celulas A375 (B-Raf V600E) de la ATCC por sonicacion en tampon de lisis disponible en el mercado, se retiran los desechos celulares por centrifugacion, y se filtra en gel el sobrenadante resultante en un tampon de reaccion de quinasa disponible en el mercado que contiene MnCh 20 mM. La 30 concentracion final de protemas de los lisados son 10 mg/ml. Se anaden 5 pl de cada compuesto de ensayo de soluciones madre 100 pM, 10 pM, 1 pM, o 0,1 pM en DMSO a 500 pl de lisado por duplicado para concentraciones finales de 1 pM, 0,1 pM, 0,01 pM, y 0,001 pM. Se anaden 5 pl of DMSO a 500 pl de lisado por cuadruplicado para los controles. Despues de incubacion de 15 minutos, se anade sonda de destiobiotina-ATP acilfosfato a cada muestra hasta una concentracion final de 5 pM y se incuba con las muestras durante 10 minutos. Despues de la 35 reaccion de la sonda, se preparan muestras para analisis dirigido de espectro de masas usando el protocolo convencional ActivX. En resumen, se preparan muestras para digestion con tripsina (desnaturaliza, reduce alquilato), se digieren con tripsina, y se enriquecen peptidos destio-biotinilados en resina de estreptavidina.

Recogida de datos: Se analizan muestras enriquecidas en peptido por CL-EM/EM en un espectrometro de masas de captura de iones Thermo-LTQ Velos usando la metodologfa de recogida de datos ActivX para celulas A375 V600E.

40 Analisis de datos: Todas las cuantificaciones se realizan extrayendo senales de iones de fragmentos caractensticos de espectros EM/EM dirigidos y comparando las senales en muestras de control y tratadas. Se usa el software ActivX con validacion manual/inspeccion visual realizada segun lo necesario en base a las medidas de marcaje/filtrado de datos. Todos los datos puntuales de inhibicion se verifican visualmente, asf como todos los datos puntuales que muestran variabilidad fuera de los lfmites normales. La significancia de los datos puntuales que 45 muestran inhibicion >35 % se determina de acuerdo con la siguiente formula: areas promedio de pico de control -

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areas promedio de pico tratado|/(2*DesTip(areas de pico de control) + |area de pico de replica uno tratada - area de pico de replica dos tratada| > 0,8. Los valores de CI50 se determinan usando el software IGOR®.

Tabla 3. Actividades pan-Raf del Ejemplo 1 en ensayo de lisado de celulas completas A375 ActivX KiNativ

% de inhibicion CI50 (nM)

Ejemplo 1 (nM)

1000 100 10 1

B-Raf (V600E)

96,5 82,9 19,7 8,1 31

B-Raf (V600E)

>98 82 7,5 -10 47

A-Raf (WT)

72 53,6 13,4 4,3 44

C-Raf (WT)

79,3 50,8 23,9 -11 42

Como se muestra en la Tabla 3, el Ejemplo 1 inhibfa A-Raf, B-Raf V600E y C-Raf con valores de CI50 de 44, 31-47, y 42 mM, respectivamente. Estos datos evidencian la inhibicion del Ejemplo 1 de A-Raf, C-Raf y B-Raf V600E en un ensayo de lisado de celulas completas.

El Ejemplo 1 inhibe la actividad fosfo-ERK celular

Para investigar si las actividades bioqmmicas in vitro del Ejemplo 1 se traducen en actividades celulares, se usa el Ejemplo 1 para tratar celulas de melanoma, celulas A375 V600E, y WM-266-4 V600E, celulas resistentes A375 V600E-PLX4032 (A375-res; generacion a continuacion) y celulas HCT-116 (mutante de K-Ras B-Raf de tipo silvestre), una celula de tumor de colon con una mutacion en K-Ras. El mutante A375 V600E, WM-266-4 V600E, HCT-116 K-Ras B-Raf de tipo silvestre son de la ATCC. Las actividades celulares se evaluan por un ensayo ELISA disponible en el mercado de TGR Bioscience para medir los niveles de fosfo-ERK de cada tipo celular.

Se cultivan celulas resistentes A375 V600E, A375 V600E-PLX4032, celulas WM-266-4 V600E, o HCT-116 (K-Ras mutante B-Raf de tipo silvestre) en medio de cultivo (descrito a continuacion para el ensayo CellTiterGlo) en placas de 96 pocillos de PerkinElmer durante una noche, despues se tratan con Ejemplo 1 a 0 y 11 diferentes concentraciones de diluciones en serie que vanan de 0,17 a 10000 mM durante 1 hora. Las celulas en cada pocillo despues se lisan con 50 pl de tampon de lisis de TGR Bioscience. Las actividades fosfo-ERK se determinan con el kit de ensayo SureFire fosfo-ERK AlphaScreen de TGR Bioscience segun las instrucciones del fabricante.

El Ejemplo 1 inhibfa el nivel de fosfo-ERK de un modo dependiente de la dosis en todas las lmeas celulares ensayadas. Los valores de CI50 para celulas A375 V600E, WM-266-4 V600E, A375 V600E-res y HCT-116 (K-Ras mutante B-Raf de tipo silvestre) son 3, 4,9, 9,7 y 132,8 mM, respectivamente. Estos datos evidencian que el ejemplo 1 inhibe la senalizacion corriente abajo en celulas A375 V600E, WM-266-4 V600E, A3 75 V600E-res y HCT-116 KRas mutante B-Raf de tipo silvestre como resultado de la inhibicion de Raf en este ensayo.

Ensayo de proliferacion y viabilidad de celulas CellTiter-Blue

Ensayo de proliferacion de celulas A375

Se obtienen celulas A375 (n.° de catalogo CRL-1619) de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). En resumen, se cultivan celulas en DMEM de alto contenido en glucosa suplementado con suero bovino fetal caracterizado al 10 % (Invitrogen, Carlsbad, CA) y penicilina al 1%/estreptomicina/L-glutamina a 37 °C, CO2 al 5 %, y humedad del 95 %. Se permite que las celulas se expandan hasta alcanzar confluencia del 70-95 %, punto en el cual se subclonan o recogen para uso en el ensayo. Se distribuye una dilucion en serie del compuesto de ensayo en una placa de fondo transparente negro de 384 pocillos por triplicado. Se anaden seiscientas veinticinco celulas por pocillo en 50 pl de medio completo de cultivo en la placa de 384 pocillos. Las placas se incuban durante 67 horas a 37 °C, CO2 al 5 %, y humedad del 95 %. Al final del periodo de incubacion, se anaden 10 pl de una solucion 440 pM de resazurina (Sigma, St. Louis, MO) en PBS a cada pocillo de la placa y las placas se incuban durante 5 horas adicionales a 37 °C, CO2 al 5 %, y humedad del 95 %. Las placas se leen en un lector Synergy2 (Biotek, Winooski, VT) usando una excitacion de 540 nm y una emision de 600 nm. Los datos se analizan usando el software Prism (Graphpad, San Diego, CA) para calcular los valores de CI50.

Ensayo de proliferacion de celulas Colo-205

Se obtienen Colo-205 (n.° de catalogo HB-8307) de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). En resumen, las celulas se cultivan en RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal caracterizado al 10 % (Invitrogen, Carlsbad, CA), piruvato sodico 1 mM y penicilina al 1%/estreptomicina/L-glutamina a 37 °C, CO2 al 5 %, y humedad del 95 %. Se deja que las celulas se expandan hasta alcanzar confluencia del 30-60 %, punto en el cual se subclonan o recogen para uso en el ensayo. Se distribuye una dilucion en serie del compuesto de ensayo en una placa de fondo transparente negro de 384 pocillos por triplicado. Se anaden mil doscientas cincuenta celulas por pocillo en 50 pl de medio completo de cultivo en la placa de 384 pocillos. Las placas se incuban durante 67 horas a

37 °C, CO2 al 5 %, y humedad del 95 %. Al final del periodo de incubacion, se anaden 10 pl de una solucion 440 pM de resazurina (Sigma, St. Louis, MO) en PBS a cada pocillo de la placa y las placas se incuban durante 5 horas adicionales a 37 °C, CO2 al 5 %, y humedad del 95 %. Las placas se leen en un lector Synergy2 (Biotek, Winooski, VT) usando una excitacion de 540 nm y una emision de 6O0 nm. Los datos se analizan usando el software Prism 5 (Graphpad, San Diego, CA) para calcular los valores de CI50.

Ensayo de proliferacion de celulas HT-29

Se obtienen HT-29 (n.° de catalogo HTB-38) de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). En resumen, las celulas se cultivan en 5A de McCoy suplementado con suero bovino fetal caracterizado al 10 % (Invitrogen, Carlsbad, CA), y penicilina al 1%/estreptomicina/L-glutamina a 37 °C, CO2 al 5 %, y humedad del 95 %. 10 Se deja que las celulas se expandan hasta alcanzar confluencia del 75-90 %, punto en el cual se subclonan o recogen para uso en el ensayo. Se distribuye una dilucion en serie del compuesto de ensayo en una placa de fondo transparente negro de 384 pocillos por triplicado. Se anaden mil doscientas cincuenta celulas por pocillo en 50 pl de medio completo de cultivo en la placa de 384 pocillos. Las placas se incuban durante 67 horas a 37 °C, CO2 al 5 %, y humedad del 95 %. Al final del periodo de incubacion, se anaden 10 pl de una solucion 440 pM de resazurina 15 (Sigma, St. Louis, MO) en PBS a cada pocillo de la placa y las placas se incuban durante 5 horas adicionales a 37

°C, CO2 al 5 %, y humedad del 95 %. Las placas se leen en un lector Synergy2 (Biotek, Winooski, VT) usando una

excitacion de 540 nm y una emision de 600 nm. Los datos se analizan usando el software Prism (Graphpad, San

Diego, CA) para calcular los valores de CI50.

Ensayo de proliferacion de celulas HCT-116

20 Se obtienen HCT-116 (n.° de catalogo CCL-247) de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). En resumen, las celulas se cultivan en 5A de McCoy suplementado con suero bovino fetal caracterizado al 10 % (Invitrogen, Carlsbad, CA), y penicilina al 1%/estreptomicina/L-glutamina a 37 °C, CO2 al 5 %, y humedad del 95 %. Se deja que las celulas se expandan hasta alcanzar confluencia del 75-90 %, punto en el cual se subclonan o recogen para uso en el ensayo. Se distribuye una dilucion en serie del compuesto de ensayo en una placa de fondo

25 transparente negro de 384 pocillos por triplicado. Se anaden seiscientas veinticinco celulas por pocillo en 50 pl de

medio completo de cultivo en la placa de 384 pocillos. Las placas se incuban durante 67 horas a 37 °C, CO2 al 5 %, y humedad del 95 %. Al final del periodo de incubacion, se anaden 10 pl de una solucion 440 pM de resazurina (Sigma, St. Louis, MO) en PBS a cada pocillo de la placa y las placas se incuban durante 5 horas adicionales a 37

°C, CO2 al 5 %, y humedad del 95 %. Las placas se leen en un lector Synergy2 (Biotek, Winooski, VT) usando una

30 excitacion de 540 nm y una emision de 600 nm. Los datos se analizan usando el software Prism (Graphpad, San

Diego, CA) para calcular los valores de CI50.

Ensayo de proliferacion de celulas SK-Mel-2

Se obtienen Sk-Mel-2 (n.° de catalogo HTB-68) de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). En resumen, las celulas se cultivan en MEM suplementado con suero bovino fetal caracterizado al 10 % (Invitrogen, 35 Carlsbad, CA), piruvato sodico 1 mM, aminoacidos no esenciales 0,1 mM, y penicilina al 1%/estreptomicina/L- glutamina a 37 °C, CO2 al 5 %, y humedad del 95 %. Se deja que las celulas se expandan hasta alcanzar confluencia del 75-90 %, punto en el cual se subclonan o recogen para uso en el ensayo. Se distribuye una dilucion en serie del compuesto de ensayo en una placa de fondo transparente negro de 384 pocillos por triplicado. Se anaden mil doscientas cincuenta celulas por pocillo en 50 pl de medio completo de cultivo en la placa de 384 40 pocillos. Las placas se incuban durante 67 horas a 37 °C, CO2 al 5 %, y humedad del 95 %. Al final del periodo de incubacion, se anaden 10 pl de una solucion 440 pM de resazurina (Sigma, St. Louis, MO) en PBS a cada pocillo de la placa y las placas se incuban durante 5 horas adicionales a 37 °C, CO2 al 5 %, y humedad del 95 %. Las placas se leen en un lector Synergy2 (Biotek, Winooski, VT) usando una excitacion de 540 nm y una emision de 600 nm. Los datos se analizan usando el software Prism (Graphpad, San Diego, CA) para calcular los valores de CI50.

45 Las celulas A375, HT-29, y Colo-205 (ATCC) albergan una mutacion V600E. Las celulas HCT-116 (ATCC) albergan una mutacion en K-Ras B-Raf de tipo silvestre, y las celulas SK-Mel-2 (ATCC) albergan una mutacion en N-Ras B- Raf de tipo silvestre.

Tabla 4 Inhibicion de la proliferacion y viabilidad celular

Ejemplo n.°

CI50 de inhibicion de la proliferacion celular, nM

A375

HT-29 Colo-205 HCT-116 SK-Mel-2

1

9 7 27 224 158

50 Los datos de la Tabla 4 evidencian que el compuesto ejemplificado inhibe la proliferacion y viabilidad de las celulas especificadas que albergan las mutaciones identificadas en este ensayo.

Actividad de inhibicion de la proliferacion y viabilidad

Se ensaya el Ejemplo 1 para la actividad de inhibicion de la proliferacion y viabilidad a traves de un panel diverso de lmeas de celulas tumorales humanas en ensayos CellTiterGlo.

En lmeas generales, para el ensayo CellTiterGlo (Promega), las celulas se cultivan en medio de Eagle modificado 5 por Dulbecco (DMEM, Thermo Scientific) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS, Invitrogen). Las celulas (5X103) mantenidas en medio de cultivo, se siembran en pocillos recubiertos con poli-D-Lisina en placas de 96 pocillos (BD Biosciences) un dfa antes del tratamiento. Las celulas se tratan durante 48-72 horas, y despues se analizan para la proliferacion y viabilidad usando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiterGlo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega) y un lector de placa SpectraMax (Molecular Devices). Se usa 10 regresion no lineal y curvas sigmoideas de respuesta a dosis para calcular la concentracion inhibidora la mitad de la maxima (CI50) con el software GraphPad Prism 4.

Se ensayaron lmeas celulares de cancer hematico adicionales de N-RAS mutante B-Raf de tipo silvestre para la sensibilidad al Ejemplo 1. Mutaciones que activan N-Ras son habituales en canceres hematicos que suceden a una frecuencia del 10-30 %. Se ensayaron dos lmeas celulares de melanoma de B-Raf V600E mutante (A-375 y SK-Mel- 15 28), nueve lmeas celulares hematicas de N-Ras mutante (HL-60, THP-1, TALL-1, C8166, H9, IM-9, GA-10 clon 4,

P31-FUJ, MOLT-4) y siete lmeas celulares de N-Ras de tipo silvestre (LOUCY, HEL, U266, EB2, P30-OHK, NOMO- 1, CCRF-CEM), y se presentaron los datos de CI50. Aunque hubo un intervalo de sensibilidad entre estas lmeas celulares, 7 de las 9 lmeas celulares de cancer hematico con mutaciones de N-Ras B-Raf de tipo silvestre eran sensibles a concentraciones submicromolares de Ejemplo 1 (CI50 < 1pM).

20 Tabla 5 Actividad de inhibicion de la proliferacion y viabilidad del Ejemplo 1 en nM

Abs CI50

Rel CI50 Denominacion de LiNEA CELULAR Disponible en el mercado

0,04

0,03 SK-Mel-28 ATCC

0,05

0,04 COLO-829 ATCC

0,06

0,03 HepG2 ATCC

0,08

0,03 THP-1 ATCC

0,11

0,03 A375 ATCC

0,13

0,06 SK-Mel-5 ATCC

0,17

0,09 NCI-H1993 ATCC

0,19

0,12 LOVO ATCC

0,2

0,25 GA-10-Clone-4 ATCC

0,2

0,14 HL-60 ATCC

0,24

0,22 Calu-6 ATCC

0,33

0,19 H9 ATCC

0,33

0,33

KATOIII ATCC

0,38

IM-9 ATCC

0,39

0,23 BxPC-3 ATCC

0,44

0,13 HuH-7 JCRB Cellbank

0,44

P31-FUJ JCRB Cellbank

0,6

0,42 DMS-53 ATCC

0,68

0,21 NUGC-3 Health Science Research Resources B

0,69

0,23 SW900 ATCC

0,72

0,42 HCT-116 ATCC

0,75

TALL-1 JCRB Cellbank

0,8

0,36 Hep3B2.1-7 ATCC

0,81

0,2 A2780 Sigma-Aldrich

0,83

0,41 NCI-H2030 ATCC

0,91

0,14 NCI-H1299 ATCC

0,93

0,69 NCI-H1975 ATCC

0,98

0,76 Hs746T ATCC

0,98

0,5 HT-1080 ATCC

0,98

1,87 MV-4-11 ATCC

1,09

0,56 C8166 Sigma-Aldrich

1,09

0,31 MIA-PaCa-2 ATCC

1,1

U-266 ATCC

1,14

0,34 AGS ATCC

1,22

0,38 AsPC-1 ATCC

1,22

1,08 LN 229 ATCC

1,27

0,33 NCI-H2052 ATCC

1,43

P30-OHK JCRB Cellbank

1,5

CCRF-CEM ATCC

1,87

2,01 SNU-449 ATCC

1,96

0,19 22RV1 ATCC

(continuacion)

Abs CI50

Rel CI50 Denominacion de LiNEA CELULAR Disponible en el mercado

1,96

0,31 SK-HEP-1 ATCC

1,99

0,59 huH-1 JCRB Cellbank

2,63

NOMO-1 JCRB Cellbank

2,86

0,46 SW620 ATCC

2,91

2,03 Caki-1 ATCC

4,42

2,07 A549 ATCC

4,5

0,22 NCI-H522 ATCC

4,92

0,26 RKO ATCC

5,18

0,66 DU-145 ATCC

5,21

0,76 U-118-MG ATCC

5,72

0,87 MKN45 JCRB Cellbank

6,27

0,69 NCI-H23 ATCC

6,93

LOUCY ATCC

8,35

12,74 NCI-H1436 ATCC

9,58

5,32 CaOV-3 ATCC

11,63

10,89 BT-474 ATCC

11,92

1,58 NCI-H2009 ATCC

13,37

6,97 NCI-H838 ATCC

15,07

16,27 NCI-H1694 ATCC

15,09

1,01 M059K ATCC

15,13

19,95 NCI-H2170 ATCC

>20

4,58 786-0 ATCC

>20

0,6 C3A ATCC

>20

0,5 EB2 ATCC

>20

>20

HCC70 ATCC

>20

HEL ATCC

>20

0,06 HT-29 ATCC

>20

>20

LN18 ATCC

>20

2,74 LNCaP-Clone-FGC ATCC

>20

0,26 MDA-MB-436 ATCC

>20

1,21 MOLT-4 ATCC

>20

0,47 NCI-H1155 ATCC

>20

0,99 NCI-H1573 ATCC

>20

0,36 NCI-H1793 ATCC

>20

>20

NCI-H2081 ATCC

>20

>20

NCI-H2126 ATCC

>20

1,18 NCI-H2228 ATCC

>20

12,55 NCI-H661 ATCC

>20

>20

PC-3 ATCC

>20

11,72 PLC-PRF-5 ATCC

>20

>20

SiHa ATCC

>20

10,8 SK-OV-3 ATCC

>20

4,34 U-87-MG ATCC

Los datos anteriores evidencian que celulas de melanoma A375 son sensibles al Ejemplo 1. Entre las lmeas celulares mas sensibles en este tamiz estan las celulas HepG2 y THP-1. HepG2 se obtiene de un carcinoma 5 hepatocelular, THP-1 es una lmea celular AML, y ambas portan mutaciones activadoras de N-Ras B-Raf de tipo silvestre. Los datos evidencian la actividad inhibidora de pan-Raf y la intervencion de la activacion de senalizacion corriente arriba por el Ejemplo 1 en este ensayo.

El Ejemplo 1 inhibe el crecimiento celular de celulas HCT-116 con mutacion de K-Ras:

Una mutacion de K-Ras B-Raf de tipo silvestre es una de las mutaciones mas habituales y mas importantes en 10 muchos tipos de cancer, incluyendo cancer pancreatico, pulmonar y colorrectal (Bos, Cancer Research, 1989, 49(17): 4682). La mutacion de K-Ras conduce a la activacion de la cascada Ras/Raf/MEK/MAPK que contribuye a la transformacion y malignidad de las celulas. Para evaluar la actividad antiproliferacion del Ejemplo 1 en celulas K-Ras mutantes B-Raf de tipo silvestre, se usan celulas HCT-116 de tumor de colon (ATCC) que albergan una mutacion de K-Ras B-Raf de tipo silvestre en un ensayo de proliferacion y viabilidad celular CellTiterGlo. El Ejemplo 1 inhibfa la 15 proliferacion y viabilidad de HCT-116 con mutacion de K-Ras B-Raf de tipo silvestre de un modo dependiente de la dosis con una CI50 de 178 mM. Estos datos evidencian que la actividad inhibidora de Raf por el Ejemplo 1 interviene en la senalizacion corriente arriba activada de forma inapropiada en este ensayo.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

El Ejemplo 1 inhibe el crecimiento celular de celulas tumorales con mutacion de N-Ras:

N-Ras a menudo esta mutado en melanoma, leucemia mieloide aguda (AML), y cancer hepatico (Bos, Cancer Research, 1989, 49(17): 4682). Mutaciones de N-Ras B-Raf de tipo silvestre conduce a activacion de MAPK a traves de protemas Raf, particularmente C-Raf. Se ensaya la actividad antiproliferacion del Ejemplo 1 en celulas tumorales N-Ras mutantes B-Raf de tipo silvestre, la lmea celular de melanoma humano SK-Mel-2 que alberga la mutacion de N-Ras Q61R, y B-Raf de tipo silvestre (ATCC), en el ensayo CellTiterGlo para la inhibicion de la proliferacion y viabilidad celular y se realiza analisis de transferencia de Western.

Analisis de inmunotransferencia (transferencia de Western)

Se realiza el ensayo a dosis de 0, y 11 diluciones en serie que vanan de 0,17 a 10000 mM. El lisado proteico se genera por tratamiento de las celulas con tampon de lisis RIPA de Millipore. El analisis de transferencia de Western se realiza sustancialmente como se describe en Yadav y col, Molecular Carcinogenesis, 2011, 50: 346-52. En resumen, se realiza SDS-PAGE sobre lisados celulares que contienen 20 ug de protema total usando geles con gradiente de tri-glicina Novex® del 4-20% (Invitrogen). La protema se transfiere a membranas de nitrocelulosa de 0,45 |jM usando tampon de transferencia NuPAGE® (Invitrogen) y metanol al 10 % a 100 V, 4 °C durante 1 hora. En lmeas generales, se usa el anticuerpo primario a dilucion de 1:1000, y el anticuerpo secundario a dilucion de 1:20000. Las protemas se detectan usando el sistema de imagenes infrarrojas Odyssey (Li-COR Biosciences). Se obtienen anticuerpos contra ERK1/2, fosfo-ERK1/2, fosfo-MEK1/2, y actina de Cell Signaling Technology.

El Ejemplo 1 muestra inhibicion de fosfo-MEK y fosfo-ERK dependiente de dosis en celulas SK-Mel-2 que albergan la mutacion de N-Ras Q61R, y B-Raf de tipo silvestre como se determina por analisis de transferencia de Western. La actividad fosfo-ERK se elimina sustancialmente a una dosis de 370 mM.

El Ejemplo 1 inhibe la proliferacion y viabilidad de celulas SK-Mel-2 en el ensayo CellTiter-Glo con una CI50 de 188 mM. Estos datos evidencian que el Ejemplo 1 inhibfa la proliferacion y viabilidad celular en celulas SK-MEL-2 que albergaban B-Raf de tipo silvestre y la mutacion de N-Ras Q61R en este ensayo.

Actividad del Ejemplo 1 en la inhibicion de celulas de melanoma resistentes a vemurafenib

Vemurafenib (PLX4032) y PLX4720 son inhibidores del mutante B-Raf V600E (Johannessen y col, Nature, 2010, 468: 968-72; Montagut y col, Cancer Res. 2008, 68: 4853-61; Wagle y col, Journal of Clinical Oncology, 2011, 29: 3085-96). Algunos de los pacientes que inicialmente responden a terapia con vemurafenib desarrollan resistencia al farmaco y se vuelven refractarios en un promedio de 7 meses, Whittaker y col, Sci Transl Med. 2010, 2: 35-41. Se genera una lmea celular resistente a vemurafenib por tratamiento cronico de la lmea celular de melanoma humano A375 (ATCC) que alberga la mutacion de B-Raf V600E con concentraciones crecientes de PLX4720.

Generacion de lmeas celulares de melanoma B-Raf V600E resistentes a inhibicion de B-Raf

Para generar celulas resistentes, se cultivan celulas A375 B-Raf V600E (ATCC) en medio de cultivo, como se ha descrito anteriormente para el ensayo CellTiter-Glo, en presencia de concentraciones gradualmente crecientes de N- [3-(5-cloro-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carbonil)-2,4-difluorofenil]propano-1-sulfonamida (PLX4720; un inhibidor selectivo de B-Raf disponible en el mercado) de 0,02 a 2 jM a traves de aproximadamente 4 meses y 30 pases para producir una lmea celular resistente denominada A375res. La resistencia de A375res a vemurafenib y PLX4720 se confirma por reactivacion de MAPK por analisis de transferencia Western y desplazamiento de los valores de CI50 en el ensayo de proliferacion y viabilidad celular CellTiter-Glo.

En estas celulas A375res, PLX4032 pierde mucha de su actividad desplazandose casi 30 veces desde 252 mM hasta mas de 7 jM. La actividad del Ejemplo 1 contra estas celulas resistentes evidencia un CI50 de 34 mM que se desplaza solamente 3 veces desde 11 mM. Estos datos evidencian que el Ejemplo 1 inhibfa la proliferacion y viabilidad celular en celulas A375res en este ensayo.

El Ejemplo tiene activacion paradojica minima de la ruta

Recientes estudios publicados (vease anteriormente) sugieren que inhibidores espedficos de B-Raf, tales como vemurafenib (PLX-4032) inducen "activacion paradojica de la ruta" a traves de dimerizacion de B-Raf con otras isoformas de Raf en fondos de tipo silvestre de B-Raf. Vemurafenib no esta aprobado para el tratamiento de pacientes con cancer de tipo melanoma con fondo genetico de tipo silvestre de B-Raf. Esta activacion paradojica de la ruta tambien se cree que es una causa de los efectos secundarios cutaneos (tales como carcinoma de celulas escamosas) en algunos pacientes con melanoma tratados con vemurafenib.

El Ejemplo 1 se ensaya contra celulas HCT-116 (ATCC) que albergan B-Raf de tipo silvestre y mutacion en K-Ras en un ensayo de viabilidad CellTiter-Glo. El ensayo se realiza a dosis de 0, y 11 diluciones en serie que vanan de 0,17 a 10000 mM. Se evaluaron las actividades fosfo-MEK y fosfo-ERK por analisis de inmunotransferencia (transferencia de Western).

El Ejemplo 1 evidencio activacion paradojica mmima de la ruta, y mantiene las actividades inhibidoras de fosfo-MEK y fosfo-ERK en celulas HCT-116 que albergan B-Raf de tipo silvestre y fondo genetico K-Ras. El Ejemplo 1 elimina sustancialmente la senal fosfo-ERK a dosis por encima de 41 mM en este ensayo. Como el Ejemplo 1 tambien evidencia inhibicion de C-Raf (ensayos previos, anteriormente) se cree que no debe suceder activacion paradojica 5 de la ruta.

El Ejemplo 1 inhibe el crecimiento celular de celulas tumorales con la mutacion V600E de B-Raf:

Las mutaciones de B-Raf, particularmente B-Raf V600E en cancer humano, a menudo se observan en neoplasias humanas incluyendo melanoma, cancer colorrectal, pulmonar y de ovario. Esta mutacion en B-Raf puede conducir a actividad quinasa constitutiva y transformacion maligna. El Ejemplo 1 se ensaya en el ensayo CellTiter-Glo en tres 10 lmeas celulares de melanoma A375 (ATCC), WM-266-4 (aTcC) y SK-Mel-28 (ATCC), y dos lmeas celulares de

tumor de colon HT-29 (ATCC) y Colo-205 (ATCC); las cinco lmeas celulares tienen una mutacion V600E de B-Raf.

Tabla 6. Actividad del Ejemplo 1 contra celulas tumorales que albergan la mutacion V600E de B-Raf

Lmea celular

Mutacion Tipo de tumor CI50 (nM)

A375

B-Raf V600E melanoma 9,2

WM-266-4

B-Raf V600E melanoma 52,9

SK-Mel-28

B-Raf V600E melanoma 29

HT-29

B-Raf V600E colon 7,3

Colo-205

B-Raf V600E colon 27

El Ejemplo 1 inhibfa la viabilidad celular de tres lmeas de melanoma, A375, WM-266-4 y SK-Mel-28 con valores de 15 CI 50 de 9,2, 52,9 y 29 mM, respectivamente. Asimismo, el Ejemplo 1 inhibfa la viabilidad celular de dos lmeas

celulares de colon, HT-29 y Colo-205 con valores de CI50 de 7,3 y 27 mM. Los datos evidencian que el Ejemplo 1 es activo en la inhibicion de la viabilidad y crecimiento celular de celulas tumorales con la mutacion V600E de B-Raf en este ensayo.

El Ejemplo 1 tambien inhibfa las actividades fosfo-MEK y fosfo-ERK en las celulas A375 ensayadas anteriormente 20 que se evaluaron adicionalmente por analisis de transferencia de Western que evidencia inhibicion de la senalizacion corriente abajo de un modo dependiente de la dosis. La actividad Fosfo-ERK se elimino sustancialmente a 41 mM.

Actividad in vivo

Para evaluar la actividad in vivo del Ejemplo 1, se usan modelos de tumor por xenoinjerto A375 V600E (ATCC) y 25 HCT-116 K-Ras mutante B-Raf de tipo silvestre (ATCC). En resumen, se implantan 10 x 106 celulas (A375) o 5 x 106

celulas (HCT-116) en una mezcla 1:1 de medio y matrigel (0,2 ml de volumen total) por inyeccion subcutanea en la pata trasera de ratas hembra desnudas (NIH modelo N.° NIHRNU-M de Taconic). Se usa un total de 8 ratas en cada grupo para el estudio de eficacia, y se usa un total de 3-4 ratas en cada grupo para un estudio farmacodinamico. El Eli Lilly and Company Animal Care and Use Committee aprobo todos los protocolos experimentales. El tratamiento 30 se inicia con administracion oral (sonda nasogastrica) del Ejemplo 1 o vehmulo (Captisol® al 20%, fosfato 25 mM, pH 2,0) en un volumen de 0,6 ml cuando el tamano del tumor alcanza aproximadamente 500 mg. El Ejemplo 1 se dosifica por via oral dos veces al dfa a 5, 10, 15, y 20 mg/kg durante 21 dfas para el modelo de xenoinjerto A375, o 15 y 30 mg/kg durante 21 dfas para el modelo de xenoinjerto HCT-116. Se controla el crecimiento del tumor y el peso corporal en el tiempo para evaluar la actividad y signos de toxicidad. Se realizan mediciones bidimensionales 35 de los tumores dos veces a la semana y se calculan los volumenes del tumor basandose en una longitud a medio eje y anchura a medio eje. Los datos de volumen del tumor se transforman a una escala log para equilibrar la varianza en el tiempo y los grupos de tratamiento. Los datos log del volumen se analizan con un analisis de medidas repetidas bidireccional de la varianza por tiempo y tratamiento usando los procedimientos MIXED® en el software sAs® (version 8.2). El modelo de correlacion para las medidas repetidas es potencia espacial. Los grupos tratados 40 se comparan con el grupo de control en cada punto temporal. El procedimiento MIXED® tambien se usa por separado para cada grupo de tratamiento para calcular las medias ajustadas y los errores tfpicos en cada punto temporal. Ambos analisis justifican la autocorrelacion en cada animal y la perdida de datos que sucede cuando los animales con tumores grandes se retiran del estudio de forma prematura. Las medias ajustadas y los errores tfpicos se representan para cada grupo de tratamiento frente al tiempo.

45 En los modelos de xenoinjerto A375 todos los grupos de dosis evidenciaron inhibicion del crecimiento del tumor y regresion del crecimiento del tumor, y no hubo perdida de peso corporal del animal en ninguno de estos grupos. En el modelo de xenoinjerto HCT-116, el grupo de 30 mg/kg mostro inhibicion del crecimiento del tumor estadfsticamente significativo. Estos datos evidencian actividad in vivo por el Ejemplo 1 y apoyan la correlacion de los datos enzimaticos, de lisado celular y proliferacion celular a una actividad in vivo.

En un estudio diferente para evaluar los efectos farmacodinamicos (PD) del Ejemplo 1 en el modelo de xenoinjerto A375, se realiza un estudio de una sola dosis con dosis que vanan de 3,125 a 50 mg/kg.

Dos horas despues del tratamiento de una sola dosis, se observan efectos PD dependientes de la dosis como se pone de manifiesto mediante analisis de transferencia de Western. Se observo inhibicion de fosfo-MEK y fosfo-ERK 5 en todos los grupos de dosis y 25 mg/kg eliminaba casi completamente las actividades fosfo-MEK y fosfo-ERK en este modelo.

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto que es 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6- il)fenil)urea, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
2. 2. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 que es 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2- (metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)urea.
3. 3. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 2 que es 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2- (metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)urea en forma cristalina caracterizado por un patron de difraccion de polvo de rayos X que tiene picos caractensticos, en 20 + 0,2, que aparece en 16,0 y uno o mas de 6,9, 7,0, 18,2 y 23,2.
4. 4. Una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la reivindicacion 1, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, junto con un vehnculo farmaceuticamente aceptable.
5. 5. Una composicion farmaceutica que comprende el compuesto o sal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, y un vehnculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable.
6. 6. Una composicion farmaceutica que comprende el compuesto o sal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, y polivinilpirrolidona-acetato de vinilo (PVP-VA).
7. 7. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 6, en la que PVP-VA es Kollidon® VA 64.
8. 8. El compuesto o sal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para uso en terapia.
9. 9. El compuesto o sal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso en el tratamiento del cancer.
10. 10. El compuesto o sal para su uso de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de tiroides, cancer de ovario, melanoma, leucemia mielogena aguda (AML), y cancer colorrectal.
11. 11. El compuesto o sal para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que el cancer es melanoma.
12. 12. El compuesto o sal para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que el cancer es cancer colorrectal.