KR20140129087A - Raf 키나제 억제제로서 유용한 2-아미노, 6-페닐 치환된 피리도[2,3-D]피리미딘 유도체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Raf를 억제함으로써 암을 치료하는데 유용할 수 있는 화합물 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

Description

Raf 키나제 억제제로서 유용한 2-아미노, 6-페닐 치환된 피리도[2,3-D]피리미딘 유도체{2-AMINO, 6-PHENYL SUBSTITUTED PYRIDO[2,3-D]PYRIMIDINE DERIVATIVES USEFUL AS RAF KINASE INHIBITORS}

Ras/Raf/미토겐-활성화 단백질 키나제 키나제 (MAP2K; MAPK 키나제; 및 MAPK/ERK 키나제 또는 MEK로도 공지됨)/세포외 신호-조절된 키나제 (ERK) 신호전달 캐스케이드 ("Ras/Raf/MEK/ERK" 또는 "Ras/Raf/MEK/MAPK"로서 본원에 지칭됨)는 포유동물에서 발달 및 조직 항상성에 필수적인 역할을 하는 진화적으로 보존된 경로이다. 이 신호전달 경로는 세포외 신호를 핵에 전달하여 유전자 발현 및 주요 세포 기능을 조절하는 키나제 캐스케이드로 이루어진다. Ras/Raf/MEK/ERK 신호전달 경로에 의해 제어되는 유전자 발현은 증식, 분화, 아폽토시스 및 혈관신생을 비롯한 기본적인 세포 과정을 조절한다. Ras/Raf/MEK/ERK 신호전달의 이들 다양한 역할은 다양한 유형의 암에서 비정상적으로 활성화된다. 이 경로 내 유전자에서의 돌연변이는 증가된 세포 증식, 및 아폽토시스에 대한 저항성을 유발하는 구성적으로 활성인 단백질을 유도할 수 있다.

Raf (세린/트레오닌-단백질 키나제)는 3개의 Raf 이소형 구성원 (B-Raf, C-Raf (Raf-1) 및 A-Raf)을 제공하는 3개의 유전자로 이루어진 유전자 패밀리에 의해 코딩된다. 이들 단백질 각각은 카르복시 말단에서 고도로 보존된 아미노-말단 조절 영역 및 촉매 도메인을 공유한다. 달리 나타내지 않는 한, Raf는 3개의 모든 구성원을 지칭한다. 각각의 이소형이 Ras/Raf/MEK/ERK 경로에서 역할을 하지만, B-Raf는 MEK의 주요 활성화제인 것으로 나타나 있다. B-Raf는 Ras:GTP에 의해 세포내 세포 막으로 동원되고, 여기서 B-Raf가 활성화된다. 차례로, B-Raf는 MEK1/2의 활성화를 담당하고, MEK1/2는 ERK1/ERK2를 활성화시킨다. B-Raf 유전자에서의 돌연변이는 B-Raf가 상류 신호와 독립적으로 신호전달하도록 한다. 그 결과로서, 돌연변이된 B-Raf 단백질 (예컨대, V600E)은 MEK 및 ERK의 과도한 하류 신호전달을 야기한다. 이는 과도한 세포 증식 및 생존 및 종양형성을 유도한다. 돌연변이된 B-Raf에 의한 신호전달 캐스케이드의 과다활성화는 다중 악성종양과 관련되어 있다.

수용체 티로신 키나제 (RTK) c-Kit (CD117로도 불림)는 광범위한 세포 유형에서 발현된다. c-KIT에 대한 리간드는 줄기 세포 인자 (SCF)이다. c-KIT의 세포외 도메인에 대한 SCF의 결합은 수용체 이량체화 및 RAS/RAF/MEK/ERK 경로를 비롯한 하류 신호전달 경로의 활성화를 유도한다. 돌연변이 c-KIT는 몇몇 암의 발병기전과 관련되어 있다.

B-Raf 특이적 억제제 (예컨대, 베무라페닙), WO 2006/039718 및 WO 2008/034008에 개시된 것과 같은 화합물에도 불구하고, A-Raf, B-Raf, C-Raf 및 B-Raf V600E 돌연변이를 비롯한 Raf 단백질의 모든 이소형을 억제하는데 활성인 Raf 억제제에 대한 필요성이 존재한다. N-Ras 돌연변이, K-Ras 돌연변이 및 cKit 돌연변이에 의한 상류 경로 활성화를 갖는 종양 세포에 대해 활성인 Raf 억제제에 대한 추가의 필요성이 존재한다. 또한, 암의 치료를 위한 대안적 Raf 억제제를 제공할 필요성이 여전히 존재한다. 암의 치료를 위한 A-Raf, B-Raf, C-Raf 및 B-Raf V600E 돌연변이를 억제하는데 활성인 대안적 Raf 억제제를 제공할 필요성 또한 여전히 존재한다. 따라서, 본 발명은 Raf 단백질의 모든 이소형을 억제하는데 활성일 수 있는 Raf 억제제를 제공한다. 또한, 본 발명은 N-Ras 돌연변이, K-Ras 돌연변이 및 cKit 돌연변이에 의한 상류 경로 활성화를 갖는 종양 세포에 대해 활성일 수 있는 Raf 억제제를 제공한다. 추가로, 본 발명은 Raf의 대안적 억제제를 제공한다. 또한, 본 발명은 암을 치료하는데 유용할 수 있는 Raf의 대안적 억제제를 제공한다. 본 발명은 또한 A-Raf, B-Raf, C-Raf 및 B-Raf V600E 돌연변이를 억제하는데 활성인 Raf의 대안적 억제제를 제공한다. 추가로, 본 발명은 암을 치료하는데 유용할 수 있는 A-Raf, B-Raf, C-Raf 및 B-Raf V600E 돌연변이를 억제하는데 활성인 Raf의 대안적 억제제를 제공한다.

도 1은 실시예 1에 대한 대표적인 X선 분말 회절 패턴이다.

본 발명은 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

특정한 실시양태로서, 본 발명은 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아인 화합물을 제공한다.

본 발명은 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제약상 허용되는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아를 제약상 허용되는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명은 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아, 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

특정한 실시양태로서, 본 발명은 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 폴리비닐 피롤리돈 비닐 아세테이트 (PVP-VA)를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아, 및 폴리비닐 피롤리돈 비닐 아세테이트 (PVP-VA)를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 PVP-VA가 콜리돈(Kollidon)® 64 및 플라스돈(Plasdone)™ S-630 코포비돈으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물의 바람직한 실시양태를 제공한다. 바람직하게는, PVP-VA는 콜리돈® VA 64이다.

현재 바람직한 제제는 1-(3,3-디메틸부틸)-3-{2-플루오로-4-메틸-5-[7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일]페닐}우레아 또는 그의 제약상 허용되는 염을, 60:40 비의 1-비닐-2-피롤리돈 및 비닐 아세테이트의 공중합체인 콜리돈® VA 64 (바스프 코포레이션(BASF Corporation) 제품 번호 95405-2-43) 및 1-2% (w/w) 소듐 라우릴 술페이트와 함께 포함한다. 20% 또는 40% 약물 로드를 포함할 수 있고, 0-2% 소듐 라우릴 술페이트 또는 적절한 양의 다른 적합한 제약상 허용되는 습윤제, 가소제, 가공 보조제 또는 다른 적합한 부형제(들)를 포함할 수 있는 고체 분산물이 제조된다.

본 발명은 유효량의 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아 또는 그의 제약상 허용되는 염을 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아를 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 요법에 사용하기 위한 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 본 발명은 암의 치료에 사용하기 위한 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 본 발명은 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는, 암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다.

본 발명은 요법에 사용하기 위한 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아를 제공한다. 본 발명은 암의 치료에 사용하기 위한 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아를 제공한다. 본 발명은 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아를 포함하는, 암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다.

본 발명은 암의 치료를 위한 의약의 제조에서의, 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 암의 치료를 위한 의약의 제조에서의, 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아의 용도를 제공한다.

본 발명은 결정질 형태의 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아를 제공한다. 본 발명은 또한 2θ ± 0.2 단위의 16.0, 및 6.9, 7.0, 18.2 및 23.2 중 하나 이상에서 나타나는 특징적인 피크를 갖는 X선 분말 회절 패턴을 특징으로 하는 결정질 형태의 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아를 제공한다.

또한, 본 발명은 암이 급성 골수 백혈병 (AML, 급성 골수성 백혈병), 만성 골수 백혈병 (CML), 만성 림프모구성 백혈병 (CLL), 골수이형성 증후군, 난소암, 흑색종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 결장직장암, 췌장암, 전립선암, 간암 또는 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 본원에 기재된 바와 같은 방법 및 용도의 바람직한 실시양태를 제공한다. 보다 바람직하게는, 암은 갑상선암, 난소암, 흑색종, 급성 골수 백혈병 (AML, 급성 골수성 백혈병) 및 결장직장암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직하게는, 암은 흑색종 또는 결장직장암이다.

치료 유효량의 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아 또는 그의 제약상 허용되는 염을 갑상선암, 난소암, 흑색종, AML 또는 결장직장암인 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 갑상선암, 난소암, 흑색종, AML 또는 결장직장암인 암을 치료하는 방법.

요법에 사용하기 위한 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.

갑상선암, 난소암, 흑색종, AML 또는 결장직장암인 암의 치료에 사용하기 위한 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.

갑상선암, 난소암, 흑색종, AML 또는 결장직장암인 암의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도.

특정한 실시양태에서, 제약 조성물은 1-(3,3-디메틸부틸)-3-{2-플루오로-4-메틸-5-[7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일]페닐}우레아 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제약상 허용되는 담체 및 임의로 다른 치료 성분과 함께 포함한다.

특정한 실시양태에서, 제약 조성물은 1-(3,3-디메틸부틸)-3-{2-플루오로-4-메틸-5-[7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일]페닐}우레아 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제약상 허용되는 담체 및 임의로 특히 일반적인 암 또는 특정한 암 유형의 치료를 위한 다른 치료 성분과 함께 포함한다.

본 발명은 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

용어 "환자"는 포유동물을 의미하고, "포유동물"은 인간을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

"치료 유효량" 또는 "유효량"은 암 환자에서 B-Raf, C-Raf, A-Raf 및/또는 B-Raf V600E 신호전달을 억제하고 환자에서 표적 암 세포를 파괴하거나 또는 암의 진행을 둔화 또는 정지시키는데 필요한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 예시된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 함유하는 제약 조성물의 투여량을 의미한다. 예시된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 예상되는 투여량은 300 내지 1500 mg/환자/일의 범위이다. 바람직한 투여량은 400 내지 1400 mg/환자/일의 범위일 것으로 예상된다. 가장 바람직한 투여량은 600 내지 1200 mg/환자/일의 범위일 것으로 예상된다. 환자를 치료하는데 요구되는 정확한 투여량 및 치료 시간의 길이는 질환의 단계 및 중증도, 뿐만 아니라 개별 환자의 특정한 요구 및 반응, 및 투여되는 특정한 화합물을 고려하여 의사가 결정할 것이다. 투여 요법은 1일 기준의 투여량으로서 표현되지만, 환자에게 보다 최적의 치료 이익을 제공하기 위해 조정될 수도 있다. 매일 투여 이외에도, 1일 2회 (BID) 또는 1일 3일 (TID) 투여가 적절할 수 있다. BID 투여가 현재 바람직하다.

용어 "치료", "치료하다" 및 "치료하는"은 암이 실제로 제거되지 않더라도, 환자가 앓고 있는 암에 대한 전 범위의 개입, 예컨대 암의 증상 중 하나 이상을 완화, 둔화 또는 역전시키고, 암의 진행을 지연시키기 위한 활성 화합물의 투여를 포함하도록 의도된다.

본 발명의 예시된 화합물은, 바람직하게는 제약상 허용되는 담체를 사용하거나 또는 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 사용하여 제약 조성물로서 제제화되고, 다양한 경로로 투여된다. 바람직하게는, 이러한 조성물은 경구 투여를 위한 것이다. 이러한 제약 조성물 및 그의 제조 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro, et al., eds., 21^st ed., Mack Publishing Co., 2005)]을 참조한다.

본 발명의 예시된 화합물은 다수의 무기 및 유기 산과 반응하여 제약상 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 이러한 제약상 허용되는 염 및 그를 제조하기 위한 통상의 방법론은 당업계에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts, " Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No.　1, January 1977]을 참조한다.

1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아 또는 그의 제약상 허용되는 염은 당업계에 공지된 다양한 절차, 뿐만 아니라 하기 기재된 것에 의해 제조될 수 있음을 이해하여야 한다.

실시예 1은 1-(3,3-디메틸부틸)-3-{2-플루오로-4-메틸-5-[7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일]페닐}우레아로 명명되고; N-(3,3-디메틸부틸)-N'-[2-플루오로-4-메틸-5-[7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3d]피리미딘-6-일]페닐]우레아로도 명명될 수 있고; 다른 명칭이 실시예 1을 명확하게 확인하기 위해 사용될 수도 있다.

1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아의 합성에서 초기 출발 물질로서 사용되는 화합물은 익히 공지되어 있고, 상업적으로 입수가능하지 않은 정도까지는, 당업자에 의해 통상적으로 사용되는 표준 절차에 의해, 제공된 특정한 참조물을 사용하여 용이하게 합성되거나, 또는 일반적 참고 문헌에서 확인된다.

공지된 절차 및 방법의 예는 일반적 참고 문헌, 예컨대 문헌 [Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers Inc, 1989; Compendium of Organic Synthetic Methods, Volumes 1-10, 1974-2002, Wiley Interscience; Advanced Organic Chemistry, Reactions Mechanisms, and Structure, 5^th Edition, Michael B. Smith and Jerry March, Wiley Interscience, 2001; Advanced Organic Chemistry, 4^th Edition, Part B, Reactions and Synthesis, Francis A. Carey and Richard J. Sundberg, Kluwer Academic / Plenum Publishers, 2000] 등, 및 그 안에 인용된 참고문헌에 기재된 것을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 하기 용어는 나타낸 의미를 갖는데, "d6-DMSO"는 헥사듀테로-디메틸술폭시드를 지칭하고; "DCM"은 디클로로메탄을 지칭하고; "DMSO"는 디메틸술폭시드를 지칭하고; "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 지칭하고; "EtOH"는 에탄올을 지칭하고; "HPLC"는 고성능 액체 크로마토그래피를 지칭하고; "IPAC"는 이소프로필 아세테이트를 지칭하고; "KF"는 칼 피셔(Karl Fischer)를 지칭하고; "MS"는 질량 분광분석법을 지칭하고; "MeOH"는 메탄올을 지칭하고; "MTBE"는 tert-부틸 메틸 에테르를 지칭하고; "NMR"은 핵 자기 공명을 지칭하고; "RT"는 실온을 지칭하고; "THF"는 테트라히드로푸란을 지칭한다.

달리 언급되지 않는 한, 본원에 예시된 화합물은 ACDLABS 또는 시믹스 드로우(Symyx Draw) 3.2를 사용하여 명명되고 넘버링된다.

제조예 1

5-브로모-2-플루오로-4-메틸아닐린

방법 A:

진한 황산 (100 mL) 중에 1-브로모-4-플루오로-2-메틸벤젠 (30.0 g, 159 mmol)을 합하고, 약 -5℃로 냉각시키고, 20분에 걸쳐 질산 (11.00 mL, 174 mmol)으로 적가 처리하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 30분 동안 교반하였다. 교반하면서 분쇄된 얼음에 붓고, tert-부틸 메틸 에테르 (MTBE) (200 mL)로 분배하였다. 수성 층을 분리하고, MTBE (2 x 50 mL)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 1-브로모-4-플루오로-2-메틸-5-니트로벤젠을 오렌지색 점성 오일 (39.0 g)로서 제공하였다.

진탕 플라스크에서 조 1-브로모-4-플루오로-2-메틸-5-니트로벤젠 (32.4 g, 138 mmol), 에탄올 (100 mL) 및 라니 니켈(Raney Nickel) (1.00 g, 17.04 mmol)을 합하였다. 플라스크를 수소 (275 kPa)로 채우고, 수소의 흡수가 중단될 때까지 교반하였다. 반응 용기를 감압시키고, 여과에 의해 촉매를 제거하고, 여과물을 증발 건조시켰다. MTBE를 첨가한 다음, 다시 여과하고, 여과물을 증발시켰다. 잔류물을 헥산 중에서 교반하였다. 여과에 의해 고체를 수집하고, 차가운 헥산으로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (17.8 g, 63% 수율)을 암색 고체로서 제공하였다.

방법 B:

기계적 교반기, 온도계, 빙조 및 N₂ 유입구를 갖춘 4 구 둥근 바닥 플라스크에 1-브로모-4-플루오로-2-메틸벤젠 (1.4 kg, 7.4 mol)을 첨가한 다음, 진한 H₂SO₄ (6.3 kg)를 0-10℃에서 첨가하였다. 10-20분 동안 교반한 후에, 혼합물을 -10~0℃로 냉각시키고, 온도를 -10~0℃로 유지하면서 약 6시간 내에 KNO₃ (0.82 kg, 7.8 mol, 1.05 당량)을 조금씩 첨가하였다. 첨가 후에, 반응 혼합물을 10-20℃로 가온하고, 1-브로모-4-플루오로-2-메틸벤젠의 함량이 <0.5%가 될 때까지 TLC (EA:PE=1:20) 및 HPLC에 의해 모니터링하였다. 혼합물을 얼음/물 혼합물 (11.2kg, 얼음:물=1:1)에 붓고, MTBE (4.7 L 및 1.9 L)로 2회 추출하였다. 유기 층을 합하고, 포화 염수 (5.6 kg)로 세척하고, 45℃ 미만에서 감압 하에 1.5~2 V로 농축시켰다. 잔류물을 EtOAc (5.6 L)로 희석하고, 생성된 용액을 직접 후속 단계에 사용하였다 (210 nm에서의 UV 흡수에 의해 검출된 1.22 kg (보정된 wt%), 70.5% 수율, 및 68.3% 순도).

기계적 교반기, 온도계 및 N₂ 유입구를 갖춘 4 구 둥근 바닥 플라스크에 EtOAc (5 L) 중 1-브로모-4-플루오로-2-메틸-5-니트로벤젠 (1.16kg, 4.96 mol)의 용액 및 36% HCl 용액 (4.9 kg, 49.6 mol, 10.0 당량)을 첨가하였다. 20~30℃에서 5~10분 동안 교반한 후에, 온도를 20-30℃로 유지하면서 Fe 분말 (1.34 kg, 24.0 mol, 4.8 당량)을 조금씩 첨가하였다. 반응을 TLC (EA:PE=1:10)에 의해 모니터링하였다. 반응이 완료된 후에, NaHCO₃을 사용하여 pH 값을 2~3으로 조정하고, 셀라이트(Celite)® (0.56 kg)를 첨가하였다. 혼합물을 0.5~1시간 동안 교반하고, 여과하였다. 고체를 톨루엔 (2 x 2.6 L)으로 세척하였다. 여과물을 합하고, 또 다른 0.5~1시간 동안 교반한 후에, 층을 분리하였다. 수성 층을 톨루엔 (2.6 L)으로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 염수 (3 L)로 세척하고, 실리카 겔 패드 (2~3 cm)를 통해 여과하였다. 여과물을 2~2.5 L로 농축시키고, 잔류물을 n-헵탄 (3.3L)과 혼합하였다. 2~2.5 L로 다시 농축시킨 후에, n-헵탄 (1.65 L)을 첨가하였다. 혼합물을 -10~0℃로 냉각시키고, 1시간 동안 교반하였다. 침전물을 여과에 의해 수집하고, n-헵탄 (0.5 L, -10~0℃로 예비-냉각됨)으로 세척하고, 건조시켜 표제 화합물의 조 생성물을 갈색 고체로서 수득하였다. n-헵탄 (3.3 L)으로 조 생성물을 재결정화하여 표제 화합물 (210 nm에서의 UV 흡수에 의해 검출된 527g, 52% 수율 및 98% 순도)의 회백색 내지 갈색 고체를 제공하였다.

제조예 2

2-플루오로-4-메틸-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)아닐린

방법 A:

디옥산 (40 mL) 중에 5-브로모-2-플루오로-4-메틸아닐린 (3.1 g, 15.2 mmol), 비스(피나콜레이토)디보론 (4.24 g, 16.7 mmol) 및 아세트산칼륨 (4.47 g, 45.6 mmol)을 합하고, 아르곤으로 폭기시켰다. [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]-디클로로팔라듐(II)-디클로로메탄 복합체 (0.620 g, 0.760 mmol)를 첨가하고, 아르곤으로 다시 폭기시키고, 밤새 100℃에서 가열하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 실리카 겔 크로마토그래피 (0-50% EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 표제 화합물 (3.24 g, 85% 수율)을 제공하였다.

방법 B:

기계적 교반기, 온도계 및 N₂ 유입구를 갖춘 4 구 둥근 바닥 플라스크에 5-브로모-2-플루오로-4-메틸아닐린 (200g, 0.98 mol), CH₃COOK (192g, 1.95 mol, 2.0 당량), 비스(피나콜레이토)디보론 (248g, 0.98 mol, 1.0 당량) 및 IPAC (3L)를 첨가하였다. 30분 동안 N₂로 탈기한 후에, 혼합물을 50℃로 가온하고, Pd(dppf)Cl₂ (8g, 4 wt%)를 첨가하였다. 출발 물질의 함량이 ≤2% (GC)가 될 때까지 반응 혼합물을 적어도 10시간 동안 환류 하에 가열하였다. 혼합물을 20~30℃로 냉각시키고, 셀라이트®의 패드를 통해 여과하고, IPAC (1L)로 헹구었다. 여과물을 400~500ml가 남도록 농축시켰다. 잔류물을 n-헵탄 (700ml)과 혼합하고, SiO₂ 패드를 통해 여과하고, IPAC/n-헵탄 (처음 1/5, ~2L에 이어서 2/5, ~3L)으로 용리시켰다. 여과물을 350~400ml로 농축시키고, n-헵탄 (300ml)을 첨가하고, 혼합물을 다시 350~400ml로 농축시켰다. 2-5시간 동안 교반한 후에, 잔류물 (현탁액)을 -10 ~ -20℃로 냉각시키고, 여과하였다. 조 생성물을 30~40℃에서 MeOH (200 ml) 중에 용해시킨 다음, H2O (600 ml)를 0.5~1시간 내에 천천히 적가하였다. 1-2시간 동안 교반한 후에, 현탁액을 20~30℃로 냉각시키고, 여과하였다. 고체를 고진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 회백색 고체 (210 nm에서의 UV 흡광도에 의해 검출된 183 g, 74% 수율 및 99% 순도)로서 수득하였다.

제조예 3

프로프-1-엔-2-일 2-플루오로-4-메틸-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐카르바메이트

EtOAc (60 mL) 및 포화 수성 NaHCO₃ (60 mL) 중에 2-플루오로-4-메틸-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)아닐린 (5.0 g, 19.91 mmol) 및 이소프로페닐 클로로포르메이트 (2.40 mL, 21.90 mmol)를 첨가하고, 6시간 동안 실온에서 교반하였다. 층을 분리하고, EtOAc (2x)로 수성 층을 추출하고, 합한 유기부를 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. 추가 정제 없이 후속 반응에 사용하였다 (100% 수율로 가정함).

제조예 4

3,3-디메틸부탄-1-아민 히드로클로라이드

기계적 교반기, 온도계 및 N₂ 유입구를 갖춘 4 구 둥근 바닥 플라스크에 3,3-디메틸부탄알 (200g, 2.0 mol)을 첨가하였다. 이어서, 1-페닐메탄아민 (214g, 2.0mol, 1.0 당량)을 적가하였다. GC에 의한 99% 초과의 전환율까지 반응 혼합물을 2~5시간 동안 20~30℃에서 교반하였다. NaCl (4 g)을 첨가하고, 수성 상을 폐기하였다. THF (800 ml)를 첨가하고, 혼합물을 400ml로 농축시켰다. 잔류물의 KF가 0.2% 미만이 될 때까지 이 작업을 반복하였다. THF (800 ml) 및 t-BuOK (44.8g, 0.4 mol, 0.2 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 60~65℃로 가온하고, N-벤질-3,3-디메틸-부탄-1-이민의 함량이 GC에 의해 1% 미만이 될 때까지 교반하였다. 10-20℃로 냉각시킨 후에, 물 (1500 ml)을 첨가하고, 혼합물을 MTBE (2 x 1500 ml)로 추출하였다. 합한 유기 상을 포화 NaCl (800 ml)로 세척하고, 수분 함량 분석을 위해 샘플링하고, 1%-2% KF 함량을 확보하였다. N-(3,3-디메틸부틸)-1-페닐-메탄이민의 스트림을 후속 단계에 직접 사용하였다.

기계적 교반기, 온도계 및 N₂ 유입구를 갖춘 4 구 둥근 바닥 플라스크에 상기에서 수득한 N-(3,3-디메틸부틸)-1-페닐-메탄이민 용액 (412g, 2.18mol, 3.27L MTBE 1.3L THF) 및 HCl/MTBE 용액 (16%, 398g, 1.74 mol, 0.8 당량)을 20~30℃에서 적가하였다. 첨가 동안 백색 고체가 침전되었다. 1~2시간 동안 교반한 후에, 현탁액의 분취액 샘플을 여과하였다. 모액을 GC에 의해 검사하였다. N-(3,3-디메틸부틸)-1-페닐-메탄이민의 함량이 30% 초과인 경우에, N-(3,3-디메틸부틸)-1-페닐-메탄이민의 함량이 GC에 의해 20%~30%가 될 때까지 추가의 HCl/MTBE 용액 (45g, 0.10 당량)을 첨가하였다. 여과에 의해 고체를 수집하고, MTBE (870 ml)로 세척하고, N₂ 하에 건조시켜 목적 표제 화합물을 백색 결정질 물질 (195 g, 65% 수율)로서 제공하였다.

제조예 5

1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)우레아

방법 A:

디옥산 (60 mL) 중 프로프-1-엔-2-일 2-플루오로-4-메틸-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐카르바메이트 (6.67 g, 19.90 mmol)의 용액을 3,3-디메틸부탄-1-아민 (2.42 g, 23.9 mmol) 및 1-메틸피롤리딘 (0.169 g, 1.99 mmol)으로 처리하고, 밤새 75℃에서 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 여과를 통해 고체를 수집하고, 디에틸 에테르로 세척하여 표제 화합물 (2단계에 걸쳐 6.62 g, 88% 수율)을 수득하였다.

방법 B:

기계적 교반기, 온도계 및 N₂ 유입구를 갖춘 4 구 둥근 바닥 플라스크에 2-플루오로-4-메틸-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)아닐린 (40g, 0.159 mol), THF (600 ml) 및 NaHCO₃ (16.0g, 0.19 mol, 1.20 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 0~5℃로 냉각시키고, 페닐 클로로포르메이트 (26.14g, 0.167 mol, 1.05 당량)를 적가하였다. 반응 혼합물을 60℃로 가온하고, 2-플루오로-4-메틸-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)아닐린의 함량이 ≤ 2%가 될 때까지 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 고체 (염)를 THF (120 ml)로 세척하였다. 여과물을 65~80ml로 농축시켰다. 잔류물에 톨루엔 (720 ml), 3,3-디메틸부탄-1-아민 (HCl 염, 26.14g, 0.19 mol, 1.2 당량) 및 TEA (20.87g, 0.21 mol, 1.3 당량)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 90℃로 가열하고, 중간체의 함량이 ≤ 2%가 될 때까지 교반하였다. 혼합물을 15~20℃로 냉각시키고, 2시간 동안 교반하고, 여과하였다. 고체를 톨루엔 (120 ml), H₂O (2 x 400 ml)로 세척하고, 고진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (210 nm에서의 UV 흡수에 의해 검출된 54.9g, 91.3% 수율 및 99% 순도)로서 수득하였다.

제조예 6

에틸 4-아미노-2-(메틸티오)피리미딘-5-카르복실레이트

방법 A:

진한 수산화암모늄 (335 mL, 8.60 mol)을 에탄올 (EtOH) (450 mL) 중 에틸 4-클로로-2-(메틸티오)피리미딘-5-카르복실레이트 (200 g, 860 mmol)의 격렬하게 교반된 현탁액에 첨가하고, 밤새 교반되도록 하였다. 여과에 의해 고체를 수집하고, EtOH (2 x 100 mL) 및 H₂O (3 x 200 mL)로 헹구고, 진공 오븐 (65-70℃)에서 밤새 건조시켜 표제 화합물 (164.4 g, 90% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.

방법 B:

반응 용기를 THF 1190g 및 에틸 4-클로로-2-(메틸술파닐)피리미딘-5-카르복실레이트 (1.0 당량 2.84 mol) 660g으로 채웠다. 20-30분 동안 10~20℃에서 교반한 다음, NH₃-H₂O 907 g 및 Et₃N 989 g을 혼합물에 첨가하였다. 45-55℃로 가열하고, 45-55℃에서 2-6시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후에, 8-12℃로 냉각시키고, 4000g 물을 첨가하였다. 8-12℃에서 4-8시간 동안 교반하고, 여과하고, 200g 물로 헹구었다. 케이크를 8-24시간 동안 80℃에서 진공 하에 건조시켜 표제 화합물

을 수득하였다.

제조예 7

4-아미노-2-(메틸티오)피리미딘-5-일)메탄올

테트라히드로푸란 (THF) (900 mL) 중 에틸 4-아미노-2-(메틸티오)피리미딘-5-카르복실레이트 (72.3 g, 339 mmol)의 용액을 0℃로 냉각시켰다. LiAlH₄의 용액 (THF 중 2 M) (195 mL, 390 mmol)을 1시간에 걸쳐 적가하였다. 0℃에서 2시간 동안 교반하고, 반응물이 밤새 실온으로 가온되도록 하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 물 (15 mL), 20% 수성 KOH (15 mL) 및 물 (30 mL)의 순차적 첨가에 의해 조심스럽게 켄칭하였다. 생성된 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시키고, 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (55.85 g, 96% 수율)을 수득하였다.

제조예 8

4-아미노-2-(메틸티오)피리미딘-5-카르브알데히드

방법 A:

MnO₂ (49.8 g, 572 mmol)를 클로로포름 (818 mL) 중 4-아미노-2-(메틸티오)피리미딘-5-일)메탄올 (28 g, 164 mmol)의 현탁액에 첨가하고, 반응물을 4시간 동안 55℃ (내부 측정)에서 가열하였다. 뜨거운 반응 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 뜨거운 클로로포름 및 THF로 헹구었다. 합한 여과물을 감압 하에 농축시키고, 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (26.7 g, 96% 수율)을 연황색 고체로서 수득하였다.

방법 B:

반응 용기를 에틸 4-아미노-2-(메틸티오)피리미딘-5-카르복실레이트 450 g (2.08 mol, 1.0 당량) 및 THF 6750 mL (15.0 V)로 채웠다. 별개의 반응 용기를 LiAlH₄ 88.1 g (1.1 당량) 및 THF 2250 g (5.0 V)으로 채웠다. 이 LiAlH₄ 혼합물을 -5~5℃로 냉각시켰다. 에틸 4-아미노-2-(메틸티오)피리미딘-5-카르복실레이트의 THF 용액을 LiAlH₄ 혼합물에 10℃ 미만에서 적가하였다. 첨가 후에, 혼합물을 2~3시간 동안 5~15℃에서 교반하였다. -5~5℃로 냉각시키고, EtOAc 279 g (1.5 당량) 을 20℃ 미만에서 적가하였다. 혼합물을 1~2시간 동안 10~20℃에서 교반하였다. Na₂SO₄.10H₂O 450 g (0.66 당량)을 20℃ 미만에서 조금씩 첨가하였다. 혼합물을 1~2시간 동안 10~20℃에서 교반하였다. 현탁액을 규조토를 통해 여과하였다. 케이크를 THF로 세척하였다. MnO₂ 734 g (4.0 당량)을 4-아미노-2-(메틸티오)피리미딘-5-일)메탄올 용액을 함유하는 여과물에 채웠다. 혼합물을 40℃로 가열하였다. 혼합물을 6~8시간 동안 40~45℃에서 교반하였다. 현탁액을 규조토를 통해 여과하였다. 케이크를 THF로 세척하였다. 여과물을 합하고, 농축시키고, n-헵탄 1530 g (5.0 V)을 적가하였다. 혼합물을 3~4시간 동안 10~20℃에서 교반하였다. 현탁액을 여과하고, 케이크를 헵탄으로 세척하였다. 필터 케이크를 10-16시간 동안 40~50℃에서 감압 하에 건조시켜 표제 화합물

을 수득하였다.

제조예 9

7-메틸-2-(메틸티오)피리도[2,3-d]피리미딘-6-올

방법 A:

1-히드록시프로판-2-온 (24.3 mL, 355 mmol) 및 4-아미노-2-(메틸티오)피리미딘-5-카르브알데히드 (50 g, 296 mmol)를 수산화나트륨 (23.64 g, 591 mmol) 및 물 (200 mL)의 용액에 첨가하였다. EtOH (600 mL)를 현탁액에 첨가하고, 밤새 실온에서 교반하였다. 물 (350 mL) 중 진한 HCl (50 mL)의 용액을 천천히 첨가하였다. 1:1 EtOH/H₂O (100 mL)를 첨가하고, 여과에 의해 고체를 수집하였다. 고체를 1:1 EtOH/H₂O (250 mL), 빙냉 EtOH (4 x 25 mL) 및 헥산 (2 x 250 mL)으로 세척하였다. 진공 오븐에서 30-35℃에서 건조시켜 표제 화합물을 황갈색 고체 (34 g, 56% 수율)로서 제공하였다.

방법 B:

반응 용기를 H₂O 2400 g (8.0 V) 및 NaOH 177.3 g (2.5 당량) 및 4-아미노-2-(메틸티오)피리미딘-5-카르브알데히드 300.0 g (1.77mol, 1.0 당량) 및 히드록시아세톤 157.6 g (1.2 당량)으로 채웠다. 혼합물을 35-45℃로 가열하고, 35-45℃에서 10-20시간 동안 교반하였다. 혼합물을 5-15℃로 냉각시켰다. 1N HCl 4500 mL를 적가하고, 15℃ 미만에서 pH를 3~4로 조정하였다. 10-15℃에서 1-2시간 동안 교반하였다. 여과하고, 케이크를 물 300g으로 헹구었다. 필터 케이크를 16-24시간 동안 50~60℃에서 감압 하에 건조시켜 표제 화합물

을 제공하였다.

제조예 10

7-메틸-2-(메틸티오)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일 트리플루오로메탄술포네이트

방법 A:

7-메틸-2-(메틸티오)피리도[2,3-d]피리미딘-6-올 (25 g, 121 mmol), DCM (1100 mL) 및 피리딘 (98 mL, 1206 mmol)을 합하고, 혼합물을 내부 온도가 <3℃가 될 때까지 빙조로 냉각시켰다. 트리플루오로메탄술폰산 무수물 (24.5 mL, 145 mmol)을 내부 온도가 5℃ 미만으로 유지되도록 하는 속도로 시린지를 통해 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 0℃에서 교반하였다. 물 (3 x 300 mL) 및 염수 (300 mL)로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하였다. 여과물을 감압 하에 농축시키고 (수조 온도 ~ 35℃), 실온에서 2-3시간 동안 고진공 하에 건조시켰다. 잔류물을 DCM 중에 용해시키고, 실리카 겔 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)에 의해 정제하였다. 분획을 농축시켜 반-순수 고체를 수득하였다. 고체를 20% EtOAc/헥산 (100 mL)으로 연화처리하고, 여과에 의해 수집하고, 20% EtOAc/헥산 (2 x 10 mL)으로 헹구고, 감압 하에 실온에서 건조시켜 표제 화합물을 연분홍색 고체 (28.6 g, 70% 수율)로서 수득하였다.

방법 B:

반응 용기를 DCM 4000 mL (20.0 V) 및 7-메틸-2-(메틸티오)피리도[2,3-d]피리미딘-6-올 208 g (1.0 mol, 1.0 당량)으로 채웠다. 혼합물을 10-20분 동안 교반하였다. 피리딘 312 g (4.0 당량)을 20℃ 미만에서 채웠다. -5~0℃로 냉각시키고, DCM (2000 mL, 10.0 V) 중 트리플루오로메탄술폰산 무수물 (1.5 당량) 416 g의 용액을 0℃ 미만에서 적가하였다. 첨가 후에, 2-3시간 동안 0-5℃에서 교반하였다. 반응물을 1N HCl 2000 mL (2X)로 켄칭하였다. H₂O 500 mL로 2회 세척하였다. 실리카 겔 100.0 g을 첨가하고, 1-2시간 동안 10~20℃에서 교반하였다. 혼합물을 규조토를 통해 여과하였다. 여과물을 농축시키고, 10~20℃에서 교반하면서 n-헵탄 1000 mL (5.0 V)를 적가하였다. 혼합물을 3-4시간 동안 10~20℃에서 교반하였다. 여과하고, 케이크를 8-12시간 동안 35~40℃에서 감압 하에 건조시켜 표제 화합물

을 수득하였다.

제조예 11

7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일 트리플루오로메탄술포네이트

방법 A:

혼합물 7-메틸-2-(메틸티오)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일 트리플루오로메탄술포네이트 (28.6 g, 84 mmol), 디메틸포름아미드 (74 mL) 및 빙초산 (9.61 mL, 169 mmol)을 45℃로 가열한 다음, 2시간에 걸쳐 6.15% 수성 NaOCl (표백제, 612 g, 506 mmol)을 적가하였다. 2시간 동안 45-50℃에서 가열하고, 실온으로 냉각시키고, 여과에 의해 고체를 수집하고, 물 (300 mL)로 세척하였다. DCM (200 mL)을 고체에 첨가하고, 현탁액을 빙수조에서 냉각시키고, THF 중 2.0 M N-메틸아민 (126 mL, 253 mmol)의 용액으로 처리하였다. 혼합물을 실온으로 천천히 가온되도록 하고, 2시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 메탄올 (MeOH) (50 mL)로 처리하고, 30분 동안 실온에서 교반하였다. 여과에 의해 고체를 수집하고, MeOH로 세척하였다. 고체를 EtOAc (30 mL)로 처리하고, 30분 동안 실온에서 교반하였다. 여과에 의해 고체를 수집하고, EtOAc로 세척하여 표제 화합물 (19.82 g, 73% 수율)을 수득하였다.

방법 B:

반응 용기를 7-메틸-2-(메틸티오)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일 트리플루오로메탄술포네이트 150 g (0.442 mol, 1.0 당량 한계 시약)으로 채우고, 3000 mL DCM을 첨가하여 투명하게 하고, 혼합물을 -5~5℃로 냉각시켰다. m-CPBA 105 g (0.442 mol, 1.0 당량)을 5℃ 미만에서 조금씩 첨가하였다. 혼합물을 3~4시간 동안 0~5℃에서 교반하였다 (E/A=1%). 2M THF 중 메틸아민 660 mL (1.326 mol, 3.0 당량)를 10℃ 미만에서 적가하고, 혼합물을 3~4시간 동안 0~10℃에서 교반하였다. 교반하면서 1500 mL DCM 및 1000 mL H₂O를 첨가하고, 수성 층을 분리하였다. 유기 층을 500 mL H₂O로 4회 세척하고, 40℃ 미만에서 600g으로 농축시켰다. 용매를 n-헵탄으로 2회 교환하고, 혼합물을 3~4시간 동안 10~20℃에서 교반하였다. 현탁액을 여과하였다. n-헵탄 150 g으로 헹구고, 필터 케이크를 10-16시간 동안 65~75℃에서 감압 하에 건조시켜 표제 화합물

을 수득하였다.

제조예 12

N,7-디메틸피리도[2,3-d]피리미딘-2-아민

아세톤 (100 mL) 중 4-아미노-2-(메틸티오)피리미딘-5-카르브알데히드 (10 g, 59.1 mmol)의 용액을 KOH (3.32 g, 59.1 mmol)로 처리하고, 10분 동안 실온에서 교반한 다음, 농축 건조시켰다. 잔류물을 EtOAc로 처리하고, 포화 수성 NaHCO₃에 이어서 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켜 7-메틸-2-(메틸티오)피리도[2,3-d]피리미딘을 수득하였다.

에탄올 중 메틸아민의 용액 (33%, 80 mL)을 첨가하고, 압력 튜브에서 밤새 110℃에서 가열하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 조 생성물을 실리카겔 크로마토그래피 (50-100% EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 표제 화합물 (6.73 g, 65%, 2단계에 걸침)을 수득하였다.

제조예 13

6-브로모-N,7-디메틸피리도[2,3-d]피리미딘-2-아민

빙조에서 아세토니트릴 (160 mL) 중 N,7-디메틸피리도[2,3-d]피리미딘-2-아민 (6.73 g, 38.6 mmol)의 용액을 냉각시키고, 알루미늄 호일로 광을 차단하였다. N-브로모숙신이미드 (6.88 g, 38.6 mmol)를 첨가하고, 2시간 동안 0℃에서 교반하였다. 반응물을 4일 동안 5℃ 냉장고로 옮겼다. 여과에 의해 고체를 수집하였다. 고체를 DCM으로 세척하고, 세척물을 농축시켜 표제 화합물 (3.0 g, 31% 수율)을 수득하였다.

실시예 1

1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아

실시예 1은 방법 A, 방법 B 또는 방법 C로 제조할 수 있다.

방법 A:

1,4-디옥산 (500 mL) 및 물 (125 mL) 중에 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)우레아 (25.9 g, 68.5 mmol), 7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일 트리플루오로메탄술포네이트 (22.09 g, 68.5 mmol) 및 NaHCO₃ (17.28 g, 206 mmol)을 합하고, 20분 동안 아르곤으로 폭기시켰다. 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (3.96 g, 3.43 mmol)을 첨가한 다음, 50℃에서 아르곤 하에 가열하였다. 7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일 트리플루오로메탄술포네이트 (300 mg, 0.55 mmol)의 추가의 부분을 첨가하고, 밤새 50℃에서 가열을 계속하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 여과에 의해 고체를 수집하고, 물에 이어서 디에틸 에테르로 세척하였다. 고체를 아세토니트릴 (50 mL)로 처리하고, 슬러리를 30분 동안 80℃에서 가열하였다. 여과에 의해 고체를 수집하고, 아세토니트릴로 세척하고, 80℃에서 진공 하에 건조시켜 연황색 고체를 수득하였다. 고체를 MeOH (50 mL)로 처리하고, 혼합물을 1시간 동안 80℃에서 가열하였다. 실온으로 냉각시키고, 여과를 통해 고체를 수집하고, MeOH (20 mL)로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (22.5 g, 77% 수율)을 연황색 고체로서 수득하였다.

방법 B:

디옥산 (80 mL) 및 물 (20 mL) 중 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)우레아 (4.48 g, 11.8 mmol), 6-브로모-N,7-디메틸피리도[2,3-d]피리미딘-2-아민 (3.0 g, 11.8 mmol) 및 K₂CO₃ (4.91 g, 35.6 mmol)의 현탁액을 아르곤으로 폭기시키고, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0.685 g, 0.593 mmol)으로 처리하고, 밤새 85℃에서 가열하였다. 디옥산을 감압 하에 제거하고, 혼합물을 EtOAc 및 염수로 처리하고, 층을 분리하고, 유기물을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피 (40%에서 100% EtOAc/헥산, 100% EtOAc, 5% MeOH/ EtOAc)에 의해 정제하였다. 물질을 CH₃CN으로 처리하고, 1시간 동안 80℃에서 가열하고, 실온으로 냉각시키고, 여과를 통해 고체를 수집하여 표제 화합물 (3.52 g, 70% 수율)을 연황색 고체로서 수득하였다.

방법 C:

반응 용기에서 혼합 용매 1,4-디옥산 (1250 g) 및 물 (200 g)을 N₂로 버블링시켰다. 혼합물을 80~85℃로 가열하였다. 7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일 트리플루오로메탄술포네이트 100 g (0.31 mol, 1.0 당량 한계 시약), 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)우레아 117.4 g (0.31 mol, 1.0 당량), K₂CO₃ 128.7 g (0.93 mol, 3.0 당량) 및 Pd(dppf)Cl₂ 6.81 g (0.0093 mol, 0.03 당량)을 질소 하에 채웠다. 혼합물을 4~6시간 동안 80~90℃에서 교반하였다. 혼합물을 40~50℃로 냉각시켰다. 농축시키고, 물 2000 g을 30℃ 미만에서 적가하였다. 첨가 후에, 혼합물을 6~8시간 동안 10~30℃에서 교반하였다. 여과하고, 물 200 g으로 헹군 다음, 케이크를 세척하였다. 필터 케이크를 14-16시간 동안 60~70℃에서 감압 하에 건조시켜 기술 등급 API의 표제 화합물 (158g, 90.4% 순도, 검정: 63.4%, KF: 5%-6%)을 수득하였다. 10~30℃에서 DCM 1000 mL 및 EtOH 1000 mL 중에 기술 등급 API의 표제 화합물을 용해시켰다. 실리카 겔 50 g, Na₂S₂O₃.5H₂O 80 g 및 활성 탄소 10 g을 첨가하였다. 혼합물을 40~50℃로 가열하고, 3~5시간 동안 교반하고, 10~30℃로 냉각시켰다. 여과하고, 케이크를 DCM/EtOH (1:1) 200 g으로 세척하였다. 40~50℃에서 실리카티올(SilicaThiol) 5 g과 함께 교반하고, 여과하였다. 용매를 EtOH 390.0 g으로 2회 교환하였다. 농축시키고, 현탁액을 여과한 다음, 케이크를 EtOH 39.0 g으로 세척하였다. 필터 케이크를 14-16시간 동안 65~75℃에서 감압 하에 건조시켜 API의 표제 화합물

을 수득하였다.

X선 분말 회절

결정질 고체의 XRD 패턴은 CuKa 공급원 (λ=1.54060 Å) 및 반텍(Vantec) 검출기가 구비되고 35 kV 및 50 mA에서 작동하는 브루커 D4 엔데버(Bruker D4 Endeavor) X선 분말 회절계 상에서 얻는다. 2θ 단위의 0.0009°의 단계 크기 및 0.5초/단계의 스캔 속도로 2θ 단위의 4 내지 40°에서, 6 mm 발산, 5.28 고정된 산란방지기 및 9.5 mm 검출기 슬릿을 사용하여 샘플을 스캐닝한다. 건조 분말을 석영 샘플 홀더 상에 패킹하고, 유리 슬라이드를 사용하여 평활면을 얻는다. 주위 온도 및 상대 습도에서 결정 형태 회절 패턴을 수집한다. 임의의 주어진 결정 형태에 대해, 결정 형태학 및 성향과 같은 인자에 기인한 바람직한 배향으로 인해 회절 피크의 상대 강도가 달라질 수 있음은 결정학계에 익히 공지되어 있다. 바람직한 배향의 효과가 존재하는 경우에, 피크 강도는 변경되지만, 다형체의 특징적인 피크 위치는 변하지 않는다. 예를 들어, 문헌 [The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, pages 1843-1844, 1995]을 참조한다. 또한, 임의의 주어진 결정 형태에 대해, 각도상의 피크 위치는 약간씩 달라질 수 있음이 또한 결정학계에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 샘플이 분석되는 온도 또는 습도의 변경, 샘플 교체, 또는 내부 표준의 존재 또는 부재로 인해 피크 위치가 이동할 수 있다. 본 발명의 경우에, 2θ 단위의 ± 0.2의 피크 위치 가변성이 지시된 결정 형태의 명백한 확인을 방해하지 않으면서 이들 잠재적인 변경을 고려할 것이다. 결정 형태의 확인은 구별되는 피크 (°2θ의 단위), 전형적으로 보다 우세한 피크의 임의의 특유한 조합에 기반하여 이루어질 수 있다. 주위 온도 및 상대 습도에서 수집된 결정 형태 회절 패턴은 8.853 및 26.774도 2-세타에서의 NIST 675 표준 피크에 기반하여 조정된다.

유리 염기 결정질 고체

이에 따라, 실시예 1의 유리 염기 결정질 고체의 제조된 샘플은 CuKa 방사선을 사용한 XRD 패턴에 의해 하기 표 1에 기재된 바와 같은 회절 피크 (2-세타 값)를 갖는 것으로서, 특히 6.9, 7.0, 18.2 및 23.2로 이루어진 군으로부터 선택된 피크 중 하나 이상과 조합된 16에서의 피크를 갖는 것으로서 특성화되고; 여기서 회절 각도에 대한 허용오차는 0.2도이다.

표 1: 실시예 1의 유리 염기 결정질 고체의 X선 분말 회절 피크:

일반적으로, 난용성 화합물의 생체이용률은 그것을 중합체 매트릭스 중 고체 분산물로서 제제화함으로써 증진될 수 있는 것으로 공지되어 있다. 이러한 고체 분산물은 약물-중합체 혼합물을 용융 (융합)시키고, 이어서 신속하게 냉각시킴으로써 (예를 들어, 핫 멜트 압출과 같은 공정을 사용함으로써) 균질 용융 혼합물을 응고시키거나, 또는 약물 및 중합체를 적절한 유기 용매 중에 용해시키고, 이어서 증발 (예를 들어, 분무-건조)에 의해 또는 역용매를 사용한 침전에 의해 용매를 제거함으로써 제조된 불활성 담체 매트릭스 중 약물의 분산물이다. 고체 분산물은 약물을 전형적으로 비분산된 결정질 약물에 비해 증진된 난용성 화합물의 경구 생체이용률을 유도하는 보다 빠른 용해 속도 및/또는 보다 높은 과포화도 (정도) 및 과포화 지속기간을 유발하는 무정형 형태로 만든다. 고체 분산물에 대해 성공적으로 사용되고 있는 중합체는 폴리비닐 피롤리돈 (PVP), 폴리비닐 피롤리돈-비닐 아세테이트 (PVP-VA), 히드록시프로필 메틸셀룰로스 (HPMC), 히드록시프로필 메틸셀룰로스 아세테이트 숙시네이트 (HPMCAS), 히드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트 (HPMCP-55), 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 (CAP) 및 유드라짓(Eudragit)® EPO를 포함한다 (이에 제한되지는 않음).

고체 분산물의 물리적 및 화학적 안정성은 이러한 제제의 적합성에서의 인자이다. 약물 로딩은 약물의 준안정 무정형 형태의 물리적 안정성 뿐만 아니라 그의 생체내 성능에 영향을 미칠 수 있는 또 다른 변수이다. 인간에서 고체 분산물을 투여하는 바람직한 방식은 그것을 캡슐, 정제, 또는 다른 고체 경구 투여 형태 (이러한 투여 형태 제조 및 성능에 적합한 제약상 허용되는 담체 및 임의적인 다른 부형제를 첨가하는 것에 의함)로서 추가로 제제화하는 것에 의한다. 고체 분산물은 분말 또는 과립화된 블렌드를 캡슐 내에 충전함으로써, 적절한 비히클 중의 현탁액, 또는 임의의 다른 적합한 경구 제약 투여 형태, 예컨대 정제, 사쉐, 과립, 스프링클 등 (이에 제한되지는 않음)으로서 투여될 수 있다.

실시예 1의 불량한 용해도에 기인한 낮은 생체이용률로 인해, 개 및 래트 소형 동물 연구에서 및 임상 시험을 위해 표적 노출을 달성할 수 있는 제제가 바람직하다. 중성 중합체 PVP-VA (콜리돈® VA 64)는 주위 조건 하의 가속화된 안정성 시험 (1개월의 기간에 걸쳐 40℃; 상대 습도 75%, 뿐만 아니라 장기간 저장 시 (20% 약물 로드의 경우 11개월 및 40% 약물 로드의 경우 10개월)) 하에 화학적으로 및 물리적으로 안정한 고체 분산물을 생성하였다.

조성물 실시예 1: 실시예 1:PVP-VA (20:80)를 함유하는 20% 고체 분산물

결정질 실시예 1을 고체 분산물의 제조에 사용하였다. 폴리비닐 피롤리돈 비닐 아세테이트 (PVP-VA)는 바스프 코포레이션으로부터 콜리돈® VA 64의 상표명 하에 상업적으로 입수가능하다. 용매는 디클로로메탄 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)) 및 메탄올 (옴니솔브(OmniSolv))의 동등 부피를 혼합함으로써 제조된 1:1 디클로로메탄 및 메탄올이다. 소듐 라우릴 술페이트 (피셔 사이언티픽)는 상업적으로 입수가능하다.

절차: 고체 분산물을 제조하고, 2개의 서브-배치로 분무-건조시켰다. 제1 서브-배치에 대해, 실시예 1 (22.22 g)을 2000 mL 병에 첨가하였다. 용매 (디클로로메탄:메탄올, 1:1) 1180 mL를 첨가하고, 모든 화합물이 용해될 때까지 샘플 조를 약 20분 동안 음파처리하여 19 mg/mL의 이론적 농도를 생성하였다. 이 용액에 PVP-VA 88.86 g을 첨가하고, 균질 용액이 수득될 때까지 혼합함으로써 용해시켰다. 디클로로메탄:메탄올 (1:1) 중 실시예 1 및 PVP-VA (20:80)의 용액을 미니-분무-건조기 (부치(Buchi) 미니 분무 건조기 290)를 사용하여 분무 건조시켰다. 용액 유량은 9-12 ml/분이었고, 여기서 유입구 온도는 37-55℃의 유출구 온도를 유발하는 100℃-110℃로 설정하였다. 제2 서브-배치에 대해, 실시예 1 (34.62 g)을 2000 mL 병에 첨가하였다. 용매 (디클로로메탄:메탄올, 1:1) 1820 mL를 첨가하고, 모든 화합물이 용해될 때까지 샘플 조를 약 20분 동안 음파처리하여 19 mg/mL의 이론적 농도를 생성하였다. 이 용액에 PVP-VA 138.48 g을 첨가하고, 균질 용액이 수득될 때까지 혼합함으로써 용해시켰다. 디클로로메탄:메탄올 (1:1) 중 실시예 1 및 PVP-VA (20:80)의 용액을 미니-분무-건조기 (부치 미니 분무 건조기 290)를 사용하여 분무 건조시켰다. 용액 유량은 14-15 ml/분이었고, 여기서 유입구 온도는 62-70℃의 유출구 온도를 유발하는 100℃-110℃로 설정하였다. 서브-배치 둘 다로부터 수집된 분무-건조된 물질을 혼합하고, 40-60℃에서 밤새 진공 오븐에서 추가로 건조시킨 다음, 실온에서 추가로 하루 동안 진공 하에 저장하였다.

실시예 1:PVP-VA (20:80)를 함유하는 고체-분산물 236.28 g에, 소듐 라우릴 술페이트 4.278 g을 첨가하고, 대형 결정화 디쉬에서 스패튤라를 사용하여 완전하게 블렌딩하여 98% 고체 분산물 및 2% 소듐 라우릴 술페이트를 함유하는 최종 조성물을 제공하였다.

이 제제는 블렌딩된 분말을 캡슐 내에 충전함으로써, 또는 예를 들어 1% 히드록시에틸셀룰로스/0.25% 폴리소르베이트 80/0.05% 다우 코닝(Dow Corning) 소포제 1510-US를 비히클 중에 현탁시킴으로써 현탁액으로서 투여될 수 있다.

조성물 실시예 2: 실시예 1:PVP-VA (40:60)를 함유하는 40% 고체 분산물

결정질 실시예 1, 폴리비닐 피롤리돈 비닐 아세테이트 (PVP-VA), 용매 및 소듐 라우릴 술페이트는 조성물 실시예 1에 대해 기재된 바와 같다.

절차: 3.79 g의 실시예 1, 적절한 부피의 용매 (디클로로메탄:메탄올, 1:1)를 사용하여 실질적으로 조성물 실시예 1에 대해 기재된 바와 같은 분무-건조 공정에 의해 고체 분산물을 제조하여 20 mg/mL 진한 용액을 수득하였다. 이 용액에 PVP-VA 5.68 g을 첨가하고, 균질 용액이 수득될 때까지 혼합함으로써 용해시켰다. 용액을 실질적으로 조성물 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 분무 건조시켰다. 용액 유량은 2 mm 실리콘 튜빙을 사용하여 40%로 설정하였고, 여기서 유입구 온도는 34℃의 유출구 온도를 유발하는 80℃로 설정하였다. 분무-건조된 물질을 수집하고, 건조제의 존재 하에 느린 질소 공급과 함께, 실온에서 14시간 동안 진공 오븐에서 추가로 건조시켰다.

실시예 1:PVP-VA (40:60)를 함유하는 고체-분산물 6.64 g에 소듐 라우릴 술페이트 0.0665 g을 첨가하고, 병에서 스패튤라를 사용하여 완전하게 블렌딩하여 99:1의 비로 고체 분산물 및 소듐 라우릴 술페이트를 함유하는 최종 조성물을 생성하였다.

이 제제는 블렌딩된 분말을 캡슐 내에 충전함으로써, 또는 예를 들어 1% 히드록시에틸셀룰로스/0.25% 폴리소르베이트 80/0.05% 다우 코닝 소포제 1510-US를 비히클 중에 현탁시킴으로써 현탁액으로서 투여될 수 있다.

암은 세포 및 조직 미세환경에서의 DNA 복구, 게놈 안정성, 세포 증식, 세포 사멸, 부착, 혈관신생, 침습 및 전이를 조절하는 하나 이상의 유전자의 비정상적 기능에 의해 그의 개시 및 진행이 유도되는 질환의 불균질한 모임으로서 점차적으로 인식되고 있다. "암" 유전자의 변형된 또는 비정상적 기능은 자연 발생 DNA 다형성, (증폭, 결실, 염색체 손실, 또는 복제를 통한) 게놈 카피수에서의 변화, (염색체 전위, 역위, 또는 탈조절된 유전자 발현을 유도하는 다른 재배열을 통한) 유전자 및 염색체 구조에서의 변화, 및 점 돌연변이로부터 유발될 수 있다. 암성 신생물은 하나의 비정상적 유전자 기능에 의해 유도되고, 동일한 비정상적 유전자 기능에 의해 유지되거나, 또는 추가의 비정상적 유전자 기능에 의해 유지 및 진행이 악화될 수 있다.

상기 언급된 유전적 염색체 이상을 넘어서, 각각의 암은 또한 DNA 메틸화, 게놈 각인, 및 아세틸화, 메틸화 또는 인산화에 의한 히스톤 변형을 비롯한 게놈의 후성적 변형을 포함할 수 있다. 후성적 변형은 악성종양의 유도 및/또는 유지에서 역할을 할 수 있다.

인간 암에서의 세포유전 이상의 광범위한 카탈로그는 정리되어 있고, 유지되고 있으며, 온라인에서 정기적으로 업데이트되고 있다 (The Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer at the US National Cancer Institute (NCI) Cancer Genome Anatomy Project (CGAP) Web site: http://cgap.nci.nih.gov 참조). 데이터베이스는 본 발명의 악성종양 중 적어도 일부에 대한 염색체 이상을 포함한다. 웰컴 트러스트 생거 인스티튜트 캔서 게놈 프로젝트(Wellcome Trust Sanger Institute Cancer Genome Project)는 종양발생과 인과적으로 연결되어 있는 모든 인간 유전자의 상세한 온라인 "암 유전자 센서스(Census)" (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census 참조) 뿐만 아니라 인간 암에서의 체세포 돌연변이의 COSMIC (암에서의 체세포 돌연변이의 카탈로그(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer)) 데이터베이스 (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic 참조)를 유지하고 있다. 다양한 암과 인과적으로 연결되어 있는 세포유전 변화에 대한 풍부한 정보를 함유하는 추가의 공급원은 종양학 및 혈액학에서의 유전학 및 세포유전학의 아틀라스 (http://atlasgeneticsoncology.org//Anomalies/Anomliste.html#MDS)이다. 이들 데이터베이스 또한 본 발명의 악성종양 중 적어도 일부에 대한 염색체 이상을 포함한다.

생검, 면역표현형 결정 및 다른 시험에 의한 암성 악성종양의 진단은 공지되어 있고, 일상적으로 사용된다. 고 해상도 염색체 밴딩 및 진보된 염색체 영상화 기술 이외에, 암이 의심되는 사례에서의 염색체 이상은 세포유전 분석, 예컨대 형광 계내 혼성화 (FISH), 핵형 결정, 스펙트럼 핵형 결정 (SKY), 멀티플렉스 FISH (M-FISH), 비교 게놈 혼성화 (CGH), 단일 뉴클레오티드 다형성 어레이 (SNP 칩), 및 당업자에게 공지되고 그에 의해 사용되는 다른 진단 및 분석 시험을 통해 결정될 수 있다.

Ras/Raf/MEK/MAPK 신호전달 경로는 세포외 자극을 핵에 전달함으로써 세포 증식, 분화 및 아폽토시스를 비롯한 다양한 세포 반응을 조절한다. 비정상적 MAPK 신호전달에 의한 이들 과정의 동요, 예컨대 유전자 변경은 종종 악성 형질전환을 유도한다. 신생물에서의 이 신호전달 경로의 중요성은 다양한 인간 악성종양에서 이 경로를 활성화시키는 많은 돌연변이 대립유전자의 발견을 통해 명백해진다. 수용체 티로신 키나제 (RTK), 예컨대 EGFR 및 cMet에서의 종양원성 돌연변이, 또는 RTK 및 그의 리간드의 과다발현은 Ras 및 그의 하류 성분을 비정상적으로 활성화시킨다. 활성화 Ras 돌연변이는 인간 암의 대략 30%에서 검출되었다. 이들 돌연변이는 GTPase 활성을 현저하게 감소시킴으로써 Ras를 GTP-결합 및 활성 상태로 만든다. 포유동물에서, Ras 패밀리는 3개의 유전자: K-Ras, N-Ras 및 H-Ras로 이루어진다. K-Ras는 상피암, 예컨대 췌장암, 폐암 및 결장직장암에서 종종 돌연변이되는 반면, N-Ras 돌연변이는 흑색종, 간 및 골수성 (AML, CML) 악성종양에서 종종 발생한다. Raf 패밀리의 구성원인 B-Raf의 활성화 돌연변이는 흑색종 및 갑상선 암종에서 높은 빈도로, 결장직장암, 난소암 및 폐암에서는 보다 낮은 정도로 발견되었다. MEK1 및 MEK2의 체세포 돌연변이는 흑색종 환자에서 확인되었다. 마지막으로, 음성 조절제, 예컨대 스프라우티(Sprouty) 패밀리의 구성원 및 GAP (GTPase-활성화 단백질), 예컨대 NF1의 손실은 이 경로를 간접적으로 활성화시킬 수 있다. 많은 종양이 Ras/Raf/MEK/MAPK 경로의 탈조절을 나타내는 것으로 여겨지고, 이는 그것을 치료적 개입에 대한 매력적인 표적으로 만든다.

Raf 단백질은 3개의 구성원 A-Raf, B-Raf 및 C-Raf (Raf1로도 불림)로 구성되고, 이들은 Ras로부터의 신호를 하류 성분 MEK1/2 및 ERK1/ERK2로 전달하는데 중추적 역할을 한다. Raf 단백질 키나제는 종양 세포 증식, 생존, 침습 및 혈관신생을 비롯한 종양발생에서 역할을 하는 것으로 나타나 있다 (문헌 [Sebolt-Leopold et al, Nat Rev Cancer, 2004, 4: 937-947; Wellbrock et al, Nat Rev Mol Cell Biol, 2004, 5: 875-885]). RTK의 돌연변이 또는 과다발현 및 Ras 돌연변이와 같은 다중 메카니즘에 의한 종양 세포에서의 MAPK 경로 활성화는 모두 Raf 단백질을 거친다. 보다 중요하게는, B-RAF의 활성화 돌연변이 (문헌 [Davies et al, Nature, 2002, 417: 949-954])는 흑색종, 결장직장, 폐, 난소 및 갑상선 암종을 비롯한 몇몇 악성종양에서 종종 관찰된다. B-Raf 돌연변이 중 거의 90%는 그의 결과가 Val에서 Glu로의 아미노산 치환 (B-Raf V600E)인 엑손 15에서의 T1799A 변화이다. B-Raf에서의 이 돌연변이는 야생형 단백질의 것보다 대략 500배 높은 구성적 키나제 활성, 및 악성 형질전환을 유도한다. 추가의 돌연변이, 예컨대 트레오닌에서 이소류신으로의 B-Raf 게이트키퍼 돌연변이인 T529I 및 엑손 11 내 G1403C에서의 B-Raf 2차 돌연변이인 G468A 또한 공지되어 있고 악성 형질전환을 야기하거나, 유지하거나, 또는 악화시키는데 역할을 하는 것으로 여겨진다 (문헌 [Whittaker et al, Sci. Transl. Med., 2010, 2(35) ra41; Wan et al, Cell, 2004, 116: 855-867]).

최근에, B-Raf 특이적 키나제 억제제 베무라페닙 (PLX-4032로도 불림)은 B-Raf V600E 돌연변이를 갖는 흑색종 환자의 치료에 대해 미국 식품 의약품국 (FDA)에 의해 승인받았다. 베무라페닙은 효능이 있고, 이들 환자에서 생존 이익을 제공한다. 그러나, 이 약물에 반응성인 환자에서는 일반적으로 평균 7개월 내에 질환 재발을 유도하는 약물 내성이 발생한다. 많은 다른 표적화 요법과 유사하게, B-RAF 억제에 대한 후천적 내성은 이 환자 집단에서의 장기 생존 이익에 대한 치료 과제를 제시한다.

B-Raf 억제제의 이익을 개선하기 위해, 돌연변이 B-RAF 발현 흑색종 세포를 베무라페닙에 대해 내성으로 만드는 메카니즘을 확인하는 연구가 계속되었다. 최근 연구에서는 MAPK 경로의 재활성화가 B-RAF 억제에 대한 내성의 메카니즘인 것으로 나타났다. 내성 메카니즘은 N-Ras 활성화 (문헌 [Nazarian et al, Nature. 2010, 468: 973-7]), H-Ras 활성화 (문헌 [Su et al, New England Journal of Medicine. 2012, 366: 207-215]) 또는 C-RAF 상향조절 (문헌 [Johannessen et al, Nature. 2010, 468: 968-72; Montagut et al, Cancer Res. 2008, 68: 4853-61]), B-RAF V600E의 비정상적으로 스플라이싱된 변이체 (문헌 [Poulikakos et al, Nature. 2011, 480: 387-390])와 같은 Ras/RAF 의존성, 또는 Ras/RAF 독립성 (Tpl2/COT 과다발현) (문헌 [Johannessen et al, Nature. 2010, 468: 968-72])인 우회 메카니즘을 통한 ERK 신호전달의 재활성화를 주로 포함한다. 결론적으로, 다중 메카니즘이 B-RAF 돌연변이 암에서 MAPK 신호전달에 대한 B-RAF 억제의 효과를 감쇠시킬 수 있다. BRAF 억제에 대한 내성을 야기할 수 있는 B-RAF의 게이트키퍼 돌연변이 (T529I)는 아직 임상적으로 확인되지는 않았지만, 이러한 돌연변이가 내성을 야기한다는 것은 실험적으로 입증되었다 (문헌 [Whittaker et al, Sci Transl Med. 2010, 2(35): ra41]). 최근 연구는 또한 RTK, 예컨대 IGF-1R 또는 PDGFRβ에 의한 MAPK-과잉 신호전달 경로의 활성화가 B-RAF 억제에 대한 후천적 내성에서 역할을 할 수 있음을 시사하였다 (문헌 [Nazarian et al, Nature. 2010, 468: 973-7; Villanueva et al, Cancer Cell. 2010, 18: 683-95; Shi et al, Cancer Res. 2011, 71: 5067-74]). MAPK 재활성화가 다수의 이들 내성 메카니즘과 관련되어 있음은 명백하다. 범 Raf 억제제는 MAPK 재활성화를 차단할 것으로 예상된다.

추가로, 베무라페닙 및 그의 밀접한 유사체 N-[3-(5-클로로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-카르보닐)-2,4-디플루오로페닐]프로판-1-술폰아미드 (PLX4720; 상업적으로 입수가능한 선택적 B-Raf 억제제)를 비롯한 B-Raf 특이적 억제제는 B-Raf 야생형 배경에서 다른 Raf 이소형과의 이량체화를 통해 역설적 경로 활성화를 유도하는 것으로 입증되었다 (문헌 [Hatzivassiliou G, et al. Nature, 2010, 464: 431-435; Poulikakos et al, Nature, 2010, 464: 427-430; Heidorn, et al, Cell, 2010, 140: 209-221]). 베무라페닙은 B-Raf 야생형을 결합시켜 B-Raf-C-Raf 이량체화를 자극하는 것을 통해 Raf/MEK/ERK 경로를 활성화시키는 것으로 여겨진다. B-Raf 특이적 억제에 의한 이 역설적 경로 활성화는 베무라페닙으로 치료한 일부 흑색종 환자에서의 피부 부작용 (예컨대, 편평 세포 암종)의 주요 이유인 것으로 여겨진다. 베무라페닙은 B-Raf 야생형 유전적 배경에서 그의 역설적 경로 활성화 활성으로 인해 이 유전적 배경을 갖는 암 환자의 치료에 대해서는 승인되지 않았다.

시험된 예시 화합물은 A-Raf, B-Raf, C-Raf 및 B-Raf V600E 돌연변이를 비롯한 Raf 단백질의 모든 이소형을 억제하는 Raf 키나제 억제제이다. 그의 범 Raf 활성으로 인해, 시험된 예시 화합물은, 둘 다 B-Raf 야생형 유전적 배경을 갖는 것인 N-Ras 돌연변이 및 K-Ras 돌연변이와 같은 상류 신호전달에 의한 MAPK 경로 활성화를 갖는 종양 세포에 대해 활성이다. 따라서, 시험된 예시 화합물은 B-Raf 돌연변이 (예컨대, 흑색종, 결장직장, 폐, 난소 및 갑상선 암종), N-Ras 돌연변이, B-Raf 야생형 (예컨대, 흑색종, AML, CML, ALL, CLL, 간암) (문헌 [Schubbert et al, Nature Reviews Cancer, 2007, 7: 295; Pylayeva-Gupta et al, Nature Reviews Cancer, 2011, 11: 761]); 또는 K-Ras 돌연변이, B-Raf 야생형 (예컨대, 담도, 자궁경부, 결장직장, 자궁내막, 폐, 난소, 췌장 및 간; 문헌 [Schubbert et al, Nature Reviews Cancer, 2007, 7: 295; Pylayeva-Gupta et al, Nature Reviews Cancer, 2011, 11: 761]) 또는 상류 활성화 RTK 돌연변이/과다발현을 비롯한 Raf 활성화의 다른 메카니즘을 갖는 암 환자의 치료에 대한 잠재력을 갖는다. 시험된 예시 화합물은 또한 베무라페닙에 대한 내성이 발생한 흑색종 종양 세포에 대해서도 활성이다. 따라서, 시험된 예시 화합물은 베무라페닙 또는 다른 B-Raf 억제제에서 실패한 흑색종 환자에 대해 유효할 것으로 여겨진다.

시험된 예시 화합물은 또한 c-Kit의 억제제이다. C-Kit는 원시 조혈 세포, 멜라닌세포 및 배세포의 기능을 정상적으로 제어하는 수용체 티로신 키나제이다. 그의 리간드 줄기 세포 인자 (SCF)와 결합한 후에, c-Kit는 이량체화/올리고머화 및 자가인산화를 겪는다. c-Kit를 구성적으로 활성화시키는 c-Kit의 유전자 돌연변이 (예컨대, L576P, K642E, T670I 및 V654A)는 흑색종, 급성 골수 백혈병 및 위장 기질 종양 (GIST)을 유도할 수 있고, 따라서 시험된 예시 화합물은 흑색종, 급성 골수 백혈병 및 GIST 환자의 치료에 대한 잠재력을 갖는다 (문헌 [Current Cancer Drug Targets, 2006, 6: 65.]).

예시된 화합물은 단일 작용제로서 또는 암 환자의 치료를 위한 하나 이상의 다른 승인된 약물과 조합되어 사용될 수 있다. 이들 암 환자는 B-Raf V600E 돌연변이를 갖는 흑색종 환자, 베무라페닙 또는 다른 B-Raf 억제제에서 실패한 흑색종 환자, N-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형을 갖는 흑색종 환자, c-Kit 과다발현 또는 cKit 돌연변이를 갖는 흑색종 환자; B-Raf V600E 돌연변이 또는 K-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형을 갖는 결장직장암 환자; B-Raf V600E 돌연변이 또는 K-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형을 갖는 난소암 환자; B-Raf V600E 돌연변이 또는 K-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형을 갖는 폐암 환자; N-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형, 또는 c-Kit 과다발현 또는 c-Kit 돌연변이를 갖는 골수성 백혈병 환자; N-Ras 또는 K-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형을 갖는 간암 환자; K-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형을 갖는 췌장암 환자; B-Raf V600E 또는 N-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형을 갖는 갑상선 암종 환자; K-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형을 갖는 담도암 환자; c-Kit 돌연변이 또는 과다발현을 갖는 GIST 환자를 포함한다.

하기 시험관내 및 생체내 연구는 예시된 화합물의 Ras/Raf/MEK/ERK 경로 신호전달 억제 활성을 입증한다. 이들 검정은 인간 임상의 화학요법 활성을 가리키는 것으로서 당업자에 의해 일반적으로 인식되어 있다. 범 Raf 억제 및 경로 신호전달 억제 활성을 증명하는 검정을 실질적으로 하기와 같은 또는 유사한 데이터를 제공하는 유사한 검정에 의해 수행할 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 보고된 IC₅₀ 값은 절대적이다.

B-Raf, C-Raf 및 B-Raf 돌연변이의 키나제 활성의 효소적 검정

시험 화합물을 인간 야생형 B-Raf, 인간 야생형 C-Raf, 인간 B-Raf V600E, 인간 B-Raf V600E+T529I 또는 인간 B-Raf V600E+G468A에 대한 그의 억제 활성에 대해 평가하였다. T529I는 트레오닌에서 이소류신으로의 B-Raf 게이트키퍼 돌연변이이고, G468A는 엑손 11 내 G1403C에서의 B-Raf 2차 돌연변이이다. B-Raf, C-Raf 및 B-Raf 돌연변이의 효소적 검정은 ATP의 존재 하에 증진된 ATP 가수분해를 촉매하는 Raf 및 MEK1 복합체의 특성을 평가한다 (문헌 [Rominger, et al, Arch. Biochem. Biophys. 2007, 464: 130-137]; 미국 특허 공개 번호 2006/0211073). 형성된 ADP는, 340 nm에서의 흡광도 (A340; 방법의 원리에 대해서는 문헌 [Schindler et al, Science, 2000, 289: 1938-1942] 참조)에 의해 분광광도측정법으로 모니터링하고 검출할 수 있는 NADH 산화의 형태인 익히 공지된 커플링된 PK/LDH (피루베이트 키나제/락테이트 데히드로게나제) 시스템에 의해 모니터링한다. Raf 활성화 MEK1 ATP 활성은 Raf 단백질의 모든 형태에 의해 공유되는 특성이다.

Raf 단백질의 발현 및 정제

일반적으로, 세포주는 당업자에게 공지되고 그에 의해 일상적으로 사용되는 절차에 의해 상업적으로 입수가능한 물질을 사용하여 생성한다. 전장 B-Raf 야생형 DNA (미국 국립 생물 정보 센터 (NCBI), 참조 서열 NC_000007.13), C-Raf (미국 국립 생물 정보 센터 (NCBI), 참조 서열 NC_000003.11) 및 A-Raf (미국 국립 생물 정보 센터 (NCBI), 참조 서열 NC_000023.10)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있다. 또한, 예를 들어 B-Raf에 대해서는 문헌 [S. Ikawa, et al., "B-raf, a new member of the raf family, is activated by DNA rearrangement," Mol Cell Biol, 8(6):2651-4 (1988)]; C-Raf에 대해서는 문헌 [M. Fukui, et al., "Molecular cloning and characterization of an activated human c-raf-1 gene," Mol Cell Biol, 7(5):1776-81 (1987); Bonner, et al., "The complete coding sequence of the human raf oncogene and the corresponding structure of the c-raf-1 gene," Nucleic Acids Res., 14 (2), 1009-1015 (1986)]; MEK1에 대해서는 문헌 [C.F. Zheng, et al., "Cloning and characterization of two distinct human extracellular signal-regulated kinase activator kinases, MEK1 and MEK2," J. Biol. Chem., 268 (15), 11435-11439 (1993)]; 태그 정보에 대해서는 문헌 [J. Tsai, et al., "Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 105(8), 3041-3046 (2008); G. Hatzivassiliou, et al., "RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth," Nature, 464 (7287), 431-435 (2010)]을 참조한다.

N-말단 정제 태그를 함유하는 B-RafV600E (V600E 돌연변이를 함유하는 잔기 433-726)는 본질적으로 이전에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다 (문헌 [Wan et al, Cell, 2004, 116, 855-867]).

2차 T529I 돌연변이 또는 G468A 돌연변이를 함유하는 B-Raf V600E 구축물은 염기 bRaf (433-726, V600E) 구축물의 부위 지정 돌연변이 (퀵체인지(Quikchange), 스트라테진(Strategene))에 의해 생성하였다.

본원에 사용된 서열은 N-말단 정제 태그가 없는 B-RafV600E (V600E 돌연변이를 함유하는 잔기 433-726); N-말단 정제 태그가 없는 B-RafV600E (V600E 및 T529I 돌연변이를 함유하는 잔기 433-726); N-말단 정제 태그가 없는 B-RafV600E (V600E 및 G468A 돌연변이를 함유하는 잔기 433-726); BRAF-V600E; BRAF-V600E+T529I; BRAF-V600E+G468A; 전장 BRAF-야생형; C-RAF; 스크리닝에 사용된 MEK1 단백질 서열을 포함한다.

Raf 키나제 활성을 측정하는 효소적 검정

시험 화합물을 야생형 B-Raf, 야생형 C-Raf, B-Raf V600E, B-Raf V600E+T529I 및 B-Raf V600E+G468A에 대한 그의 억제 활성에 대해 평가하였다. T529I는 B-Raf 게이트키퍼 돌연변이이고, G468A는 B-Raf 2차 돌연변이이다. B-Raf, C-Raf 및 B-Raf 돌연변이의 효소적 검정은 ATP의 존재 하에 증진된 ATP 가수분해를 촉매하는 Raf 및 MEK1 복합체의 특성을 평가한다 (문헌 [Rominger, et al, Arch. Biochem. Biophys. 2007, 464: 130-137]). 형성된 ADP는, 340 nm에서의 흡광도 (A340; 방법의 원리에 대해서는 문헌 [Schindler et al, Science, 2000, 289: 1938-1942] 참조)에 의해 모니터링하고 검출할 수 있는 NADH 산화의 형태인 익히 공지되어 있는 커플링된 PK/LDH (피루베이트 키나제/락테이트 데히드로게나제) 시스템에 의해 모니터링한다. Raf 활성화 MEK1 ATPase 활성은 Raf 단백질의 모든 형태에 의해 공유되는 특성이다. B-Raf 야생형 효소적 검정에서, 반응 혼합물은 1.2 nM B-Raf, 30 nM MEK1, 1000 uM ATP, 3.5 단위 (100 ul당)의 PK, 5 단위 (100 ul당)의 LDH, 1 mM 포스포에놀 피루베이트 (PEP) 및 280 uM의 NADH를 함유하였다. C-Raf 검정에서, 반응 혼합물은 0.6 nM C-Raf, 26 nM MEK1, 2000 uM ATP, 및 상기와 동일한 양의 PK, LDH, PEP 및 NADH를 함유하였다. B-Raf V600E 검정에서, 반응 혼합물은 1.6 uM B-Raf V600E, 26 nM MEK1, 200 uM ATP, 및 상기와 동일한 양의 PK, LDH, PEP 및 NADH를 함유하였다. B-RafV600E+T529I 검정에서, 반응 혼합물은 6.2 nM B-Raf V600E+T529I, 30 nM MEK1, 200 uM ATP, 및 상기와 동일한 양의 PK, LDH, PEP 및 NADH를 함유하였다. B-Raf V600E+G468A 검정에서, 반응 혼합물은 3.5 nM B-Raf, 30 nM MEK1, 200 uM ATP, 및 상기와 동일한 양의 PK, LDH, PEP 및 NADH를 함유하였다. 모든 검정은 상기 혼합물을 시험 화합물과 혼합함으로써 시작하였고, 대략 5시간 동안 계속적으로 A340에서 모니터링하였다. 3 내지 4시간의 기간에서 반응 데이터를 수집하여 IC50 값을 계산하였다.

실시예 1에 대해, B-Raf V600E에 대한 효소 IC₅₀ 결과는 6 nM이고, C-Raf에 대해서는 15 nM이었다. 이들 데이터는 이들 검정에서 예시된 화합물이 B-Raf V600E 및 C-Raf를 억제함을 증명한다.

실시예 1을 상기 기재된 것과 실질적으로 유사한 방법에 의해 수행되는 추가의 효소적 검정에서 평가하였다. 실시예 1은 각각 9.8, 15.47 및 16.9 nM의 IC₅₀ 값으로 야생형 B-Raf, B-Raf V600E+T529I 및 B-Raf V600E+G468A를 억제하였다. 이들 데이터는 이들 검정에서 실시예 1이 B-Raf 억제제임을 증명한다.

c-Kit 키나제 활성의 효소적 검정

c-Kit는 중요한 종양유전자이고, 그의 과다발현 및 유전자 돌연변이는 흑색종 및 위장 기질 종양 (GIST) 환자에서 종종 발생한다. c-Kit 효소적 검정에서, 인간 c-Kit에 의해 촉매된 ATP에 의한 폴리 E4Y의 인산화를 분광광도측정법으로 모니터링하였다. 키나제 반응으로부터 생성된 ADP는, 피루베이트 및 NADH로부터 NAD가 형성되는 피루베이트 키나제/락테이트 데히드로게나제 (PK/LDH) 반응에 커플링된다. NADH는 B-Raf, C-Raf 및 B-Raf 돌연변이의 키나제 활성의 효소적 검정에 대해 상기 기재된 바와 같이 340nm에서의 흡광도에 의해 검출할 수 있다.

c-Kit 야생형 수용체의 발현 및 정제

일반적으로, 세포주는 당업자에게 공지되고 그에 의해 일상적으로 사용되는 절차에 의해 상업적으로 입수가능한 물질을 사용하여 생성한다.

전장 인간 야생형 c-Kit 수용체 DNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (미국 국립 생물 정보 센터 (NCBI) 참조 서열 NC_000004.11)은 공지되어 있다. 또한, 예를 들어 인간 cKit 단백질 서열에 대해서는 문헌 [Y. Yarden,Y., et al., "Human proto-oncogene c-kit: a new cell surface receptor tyrosine kinase for an unidentified ligand ," EMBO J. 6 (11), 3341-3351 (1987)]; GST 융합 단백질에 대해서는 문헌 [D.B. Smith, et al., "Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase," Gene 67 (1988) 31-40; D.B. Smith, "Purification of glutathione S-transferase fusion proteins," Methods Mol. Cell Biol. 4 (1993) 220-229]을 참조한다.

c-Kit 검정

검정 반응 혼합물은 6 nM 인간 야생형 c-KIT, 1 mg/mL 폴리 (Glu, Tyr) (시그마(Sigma)), 1 mM 포스포에놀-피루베이트, 280 μM NADH, 5U/3.5U (100 ul당) 피루베이트 키나제/락테이트 데히드로게나제, 85 mM 트리스, pH 7.5, 17 mM MgCl₂, 0.0042% 트리톤(Triton)® X-100, 0.005% BSA, 1% DMSO를 포함하였다. 시험 화합물을 0.5시간 동안 반응 혼합물과 함께 인큐베이션한 후에, 200μM ATP를 첨가하여 30℃에서 반응을 시작하였다. 0.5 내지 1시간에서의 반응 속도를 사용하여 억제% 및 IC₅₀을 계산하였다.

본원에 사용된 서열은 N-말단 GST 융합을 갖는 c-KIT를 포함한다.

실시예 1에 대해, 인간 c-Kit 억제 IC₅₀ 결과는 21 nM이었다. 이 데이터는 본 검정에서 시험된 예시 화합물이 인간 야생형 c-Kit 억제제임을 증명한다.

시험 화합물을 추가로 평가하기 위해, 그것을 흑색종 및/또는 GIST에서 통상적으로 발생하는 c-Kit 돌연변이에 대해 시험하였다. Ba/F3 세포주 (ATCC로부터의 것)를 야생형 (WT) c-Kit, c-Kit L576P (문헌 [Willmore-Payne et al, Human Pathology, 2005, 36(5), 486; Willmore-Payne et al, Human Pathology, 2006, 37, 520]), c-Kit K642E (문헌 [Willmore et al, Am J Clin Pathol, 2004, 122(2), 206; Monsel et al, Oncogene, 2010, 29, 227]), c-Kit T670I (문헌 [Tamborini et al, Oncogene, 2006, 25,6140]) 또는 c-Kit V654A (문헌 [Tamborini et al, Oncogene, 2006, 25,6140])로 각각 형질감염시키고, 당업자에게 익히 공지되고 그에 의해 사용되는 레트로바이러스 형질감염 방법에 의해 확립시켰다. 돌연변이는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 돌연변이유발에 의해 생성하고, PCR-증폭된 c-Kit 발현 구축물의 자동화 서열결정에 의해 확인하였다. Ba/F3 안정한 세포주는 플라스미드 DNA로 형질감염시킴으로써 생성하였다. 적절한 c-Kit 돌연변이체의 발현은 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다.

야생형 Ba/F3 세포는 일반적으로 성장에 대해 IL-3에 의존한다. c-Kit 형질감염 후에, 이들 세포를 c-Kit의 리간드인 줄기 세포 인자 (SCF)의 존재 하에 Ba/F3 ATCC 권고된 성장 배지 중에서 성장시켰다. 이들 세포에 대한 시험 화합물의 항증식 활성을 IL-3 또는 SCF의 존재 하에 시험하였다.

표 2: Ba/F3 c-Kit 세포주에서의 실시예 1의 항증식 활성

표 2의 데이터는 Ba/F3 세포에서의 야생형 c-Kit 및 확인된 c-Kit 유전자 돌연변이에 대해 실시예 1이 세포 증식 및 생존 억제 활성을 가짐을 증명한다.

액티브엑스 바이오사이언시스 인크.(ActivX Biosciences Inc.)의 KiNativ 검정을 사용한 천연 전체 효소로의 Raf 키나제 활성의 측정

시험 화합물의 효소적 범 Raf 활성을 추가로 평가하기 위해, 그것을 액티브엑스 바이오사이언시스 인크.에 의해 개발되고 수행되는 KiNativ 검정에서 A375 세포의 전세포 용해물을 사용하여 평가하였다. A375 세포는 B-Raf V600E 돌연변이, A-Raf 야생형 및 C-Raf 야생형을 갖는 인간 흑색종 세포이다.

샘플 제조: ATCC로부터의 A375 (B-Raf V600E) 세포를 상업적으로 입수가능한 용해 완충제 중에서 음파처리에 의해 용해시키고, 세포 잔해를 원심분리에 의해 제거하고, 생성된 상청액을 20 mM MnCl₂를 함유하는 상업적으로 입수가능한 키나제 반응 완충제 내로 겔 여과하였다. 용해물의 최종 단백질 농도는 10 mg/mL였다. DMSO 중 100 μM, 10 μM, 1 μM 또는 0.1 μM 원액으로부터의 각각의 시험 화합물 5 μL를 1 μM, 0.1 μM, 0.01 μM 및 0.001 μM의 최종 농도를 위해 2벌로 용해물 500 μL에 첨가하였다. DMSO 5 μL를 대조군을 위해 4벌로 용해물 500 μL에 첨가하였다. 15분 인큐베이션 후에, 데스티오비오틴-ATP 아실포스페이트 프로브를 5 μM의 최종 농도로 각각의 샘플에 첨가하고, 10분 동안 샘플과 함께 인큐베이션하였다. 프로브 반응 후에, 액티브엑스 표준 프로토콜을 사용하여 표적화 질량 스펙트럼 분석을 위해 샘플을 제조하였다. 간략하게, 샘플을 트립신 소화 (변성, 환원 알킬화)를 위해 제조하고, 트립신으로 소화시키고, 데스티오-비오티닐화 펩티드를 스트렙타비딘 수지 상에 풍부화시켰다.

데이터 수집: 풍부화된 펩티드 샘플을 A375 V600E 세포에 대한 액티브엑스 데이터 수집 방법론을 사용하여 써모-LTQ 벨로스(Thermo-LTQ Velos) 이온 포획 질량 분광계 상에서 LC-MS/MS에 의해 분석하였다.

데이터 분석: 표적화 MS/MS 스펙트럼으로부터 특징적인 단편 이온 신호를 추출하고, 대조군 및 처리된 샘플에서의 신호를 비교함으로써 모든 정량화를 수행하였다. 액티브엑스 소프트웨어를 데이터 플래깅/필터링 측정값에 기반하여 필요한 경우 수동 검증/시각적 검사를 수행하면서 사용하였다. 모든 억제 데이터 지점을, 정상 한계를 벗어난 가변성을 나타내는 모든 데이터 지점에 대한 것과 같이 시각적으로 검증하였다. >35% 억제를 나타내는 데이터 지점의 유의성을 하기 공식: |평균 대조군 피크 영역 - 평균 처리된 피크 영역|/(2^*StdDev(대조군 피크 영역) + |처리된 복제 1 피크 영역 - 처리된 복제 2 피크 영역| > 0.8에 따라 결정하였다. IC₅₀ 값을 IGOR® 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.

표 3, 액티브엑스 KiNativ A375 전세포 용해물 검정에서의 실시예 1의 범 Raf 활성

표 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 1은 각각 44, 31-47 및 42 nM의 IC₅₀ 값으로 A-Raf, B-Raf V600E 및 C-Raf를 억제하였다. 이들 데이터는 전세포 용해물 검정에서 A-Raf, C-Raf 및 B-Raf V600E에 대한 실시예 1의 억제를 증명한다.

실시예 1은 세포 포스포-ERK 활성을 억제한다

실시예 1의 시험관내 생화학적 활성이 세포 활성으로 옮겨지는지를 조사하기 위해, 실시예 1을 사용하여 흑색종 세포, A375 V600E 및 WM-266-4 V600E, A375 V600E-PLX4032 내성 세포 (A375-res; 생성은 하기 기재됨), 및 K-Ras 돌연변이를 갖는 결장 종양 세포인 HCT-116 (K-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형) 세포를 처리하였다. A375 V600E, WM-266-4 V600E, HCT-116 K-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형은 ATCC로부터의 것이다. 세포 활성을 TGR 바이오사이언시스(TGR Biosciences)로부터 상업적으로 입수가능한 ELISA 검정에 의해 평가하여 각각의 세포 유형의 포스포-ERK 수준을 측정하였다.

A375 V600E, A375 V600E-PLX4032 내성 세포, WM-266-4 V600E 또는 HCT-116 (K-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형) 세포를 퍼킨엘머(PerkinElmer)로부터의 96 웰 플레이트 내 성장 배지 (셀타이터글로(CellTiterGlo) 검정에 대해 하기 기재된 것) 중에서 밤새 성장시킨 다음, 1시간 동안 0 및 0.17 내지 10000 nM 범위의 11개의 다양한 연속 희석 농도의 실시예 1로 처리하였다. 이어서, 각 웰에서의 세포를 TGR 바이오사이언시스로부터의 50 μl 용해 완충제로 용해시켰다. 포스포-ERK 활성을 제조업체의 지침에 따라 TGR 바이오사이언시스로부터의 슈어파이어(SureFire) 포스포-ERK 알파스크린(AlphaScreen) 검정 키트로 결정하였다.

실시예 1은 시험된 모든 세포주에서 용량 의존적 방식으로 포스포-ERK 수준을 억제하였다. A375 V600E, WM-266-4 V600E, A375 V600E-res 및 HCT-116 (K-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형) 세포에 대한 IC₅₀ 값은 각각 3, 4.9, 9.7 및 132.8 nM이었다. 이들 데이터는 실시예 1이 본 검정에서 Raf 억제의 결과로서 A375 V600E, WM-266-4 V600E, A375 V600E-res 및 HCT-116 K-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형 세포에서의 하류 신호전달을 억제함을 증명한다.

셀타이터-블루 세포 증식 및 생존 검정

A375 세포 증식 검정

A375 세포 (카탈로그 #CRL-1619)를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC, 버지니아주 마나사스)으로부터 입수하였다. 간략하게, 세포를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 10% 특성화 태아 소 혈청 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민으로 보충된 DMEM 고 글루코스 중에서 성장시켰다. 세포를 70-95% 전면생장률에 도달할 때까지 확장되도록 하고, 이 시점에 그것을 계대배양하거나 또는 검정 사용을 위해 수확하였다. 시험 화합물의 연속 희석물을 384-웰 흑색 투명 바닥 플레이트에 3벌로 분배하였다. 625개의 세포를 384-웰 플레이트 내 50 μL 완전 성장 배지 중에 웰마다 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 67시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 말미에, PBS 중 레자주린 (시그마, 미주리주 세인트 루이스)의 440 μM 용액 10 μL를 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 추가의 5시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 540 nm의 여기 및 600 nm의 방출을 사용하여 시너지2(Synergy2) 판독기 (바이오텍(Biotek), 버몬트주 위누스키) 상에서 판독하였다. 데이터를 프리즘(Prism) 소프트웨어 (그래프패드(Graphpad), 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 분석하여 IC₅₀ 값을 계산하였다.

Colo-205 세포 증식 검정

Colo205 세포 (카탈로그 #HB-8307)를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC, 버지니아주 마나사스)으로부터 입수하였다. 간략하게, 세포를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 10% 특성화 태아 소 혈청 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드), 1 mM 피루브산나트륨 및 1% 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민으로 보충된 RPMI 1640 중에서 성장시켰다. 세포를 30-60% 전면생장률에 도달할 때까지 확장되도록 하고, 이 시점에 그것을 계대배양하거나 또는 검정 사용을 위해 수확하였다. 시험 화합물의 연속 희석물을 384-웰 흑색 투명 바닥 플레이트에 3벌로 분배하였다. 1250개의 세포를 384-웰 플레이트 내 50 μL 완전 성장 배지 중에 웰마다 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 67시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 말미에, PBS 중 레자주린 (시그마, 미주리주 세인트 루이스)의 440 μM 용액 10 μL를 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 추가의 5시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 540 nm의 여기 및 600 nm의 방출을 사용하여 시너지2 판독기 (바이오텍, 버몬트주 위누스키) 상에서 판독하였다. 데이터를 프리즘 소프트웨어 (그래프패드, 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 분석하여 IC₅₀ 값을 계산하였다.

HT-29 세포 증식 검정

HT-29 세포 (카탈로그 #HTB-38)를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC, 버지니아주 마나사스)으로부터 입수하였다. 간략하게, 세포를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 10% 특성화 태아 소 혈청 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민으로 보충된 맥코이(McCoy) 5A 중에서 성장시켰다. 세포를 75-90% 전면생장률에 도달할 때까지 확장되도록 하고, 이 시점에 그것을 계대배양하거나 또는 검정 사용을 위해 수확하였다. 시험 화합물의 연속 희석물을 384-웰 흑색 투명 바닥 플레이트에 3벌로 분배하였다. 1250개의 세포를 384-웰 플레이트 내 50 μL 완전 성장 배지 중에 웰마다 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 67시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 말미에, PBS 중 레자주린 (시그마, 미주리주 세인트 루이스)의 440 μM 용액 10 μL을 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에사 추가의 5시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 540 nm의 여기 및 600 nm의 방출을 사용하여 시너지2 판독기 (바이오텍, 버몬트주 위누스키) 상에서 판독하였다. 데이터를 프리즘 소프트웨어 (그래프패드, 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 분석하여 IC₅₀ 값을 계산하였다.

HCT-116 세포 증식 검정

HCT-116 세포 (카탈로그 #CCL-247)를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC, 버지니아주 마나사스)으로부터 입수하였다. 간략하게, 세포를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 10% 특성화 태아 소 혈청 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민으로 보충된 맥코이 5A 중에서 성장시켰다. 세포를 75-90% 전면생장률에 도달할 때까지 확장되도록 하고, 이 시점에 그것을 계대배양하거나 또는 검정 사용을 위해 수확하였다. 시험 화합물의 연속 희석물을 384-웰 흑색 투명 바닥 플레이트에 3벌로 분배하였다. 625개의 세포를 384-웰 플레이트 내 50 μL 완전 성장 배지 중에 웰마다 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 67시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 말미에, PBS 중 레자주린 (시그마, 미주리주 세인트 루이스)의 440 μM 용액 10 μL를 플레이트 내 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 추가의 5시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 540 nm의 여기 및 600 nm의 방출을 사용하여 시너지2 판독기 (바이오텍, 버몬트주 위누스키) 상에서 판독하였다. 데이터를 프리즘 소프트웨어 (그래프패드, 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 분석하여 IC₅₀ 값을 계산하였다.

SK-Mel-2 세포 증식 검정

Sk-Mel-2 세포 (카탈로그 #HTB-68)를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC, 버지니아주 마나사스)으로부터 입수하였다. 간략하게, 세포를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 10% 특성화 태아 소 혈청 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드), 1 mM 피루브산나트륨, 0.1 mM 비-필수 아미노산 및 1% 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민으로 보충된 MEM 중에서 성장시켰다. 세포를 70-95% 전면생장률에 도달할 때까지 확장되도록 하고, 이 시점에 그것을 계대배양하거나 또는 검정 사용을 위해 수확하였다. 시험 화합물의 연속 희석물을 384-웰 흑색 투명 바닥 플레이트에 3벌로 분배하였다. 1250개의 세포를 384-웰 플레이트 내 50 μL 완전 성장 배지 중에 웰마다 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 67시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 말미에, PBS 중 레자주린 (시그마, 미주리주 세인트 루이스)의 440 μM 용액 10 μL를 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 추가의 5시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 540 nm의 여기 및 600 nm의 방출을 사용하여 시너지2 판독기 (바이오텍, 버몬트주 위누스키) 상에서 판독하였다. 데이터를 프리즘 소프트웨어 (그래프패드, 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 분석하여 IC₅₀ 값을 계산하였다.

A375, HT-29 및 Colo-205 세포 (ATCC)는 V600E 돌연변이를 보유한다. HCT-116 세포 (ATCC)는 K-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형을 보유하고, SK-Mel-2 세포 (ATCC)는 N-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형을 보유한다.

표 4. 세포 증식 및 생존 억제

표 4에서의 데이터는 본 검정에서 예시된 화합물이 확인된 돌연변이를 보유하는 명시된 세포의 증식 및 생존을 억제함을 증명한다.

증식 및 생존 억제 활성

실시예 1을 셀타이터-글로 검정에서 인간 종양 세포주의 다양한 패널에 걸쳐 증식 및 생존 억제 활성에 대해 시험하였다.

일반적으로, 셀타이터-글로 검정 (프로메가(Promega))을 위해, 세포를 10% 태아 소 혈청 (FBS, 인비트로젠)으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific) 중에서 배양하였다. 세포 (5X10³개)를 성장 배지 중에 유지시키고, 처리 하루 전에 96 웰 플레이트 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))에서 폴리-D-리신-코팅된 웰 상에 플레이팅하였다. 세포를 48-72시간 동안 처리한 다음, 제조업체 (프로메가)의 지침에 따라 셀타이터-글로 발광 세포 생존 검정을 사용하고 스펙트라맥스(SpectraMax) 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))를 사용하여 증식 및 생존에 대해 분석하였다. 비선형 회귀 및 S자형 용량-반응 곡선을 사용하여 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 4 소프트웨어로 반수 최대 억제 농도 (IC₅₀)를 계산하였다.

추가의 N-RAS 돌연변이 B-Raf 야생형 혈액암 세포주를 실시예 1에 대한 감수성에 대해 시험하였다. N-Ras 활성화 돌연변이는 혈액암에서 10-30%의 빈도로 흔하게 발생한다. 2종의 B-Raf V600E 돌연변이 흑색종 세포주 (A-375 및 SK-Mel-28), 9종의 N-Ras 돌연변이 혈액 세포주 (HL-60, THP-1, TALL-1, C8166, H9, IM-9, GA-10 clone 4, P31-FUJ, MOLT-4) 및 7종의 N-Ras 야생형 세포주 (LOUCY, HEL, U266, EB2, P30-OHK, NOMO-1, CCRF-CEM)를 시험하고, IC₅₀ 데이터를 보고하였다. 이들 세포주 사이에서 다양한 감수성이 존재하였지만, N-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형을 갖는 9종의 혈액암 세포주 중 7종이 마이크로몰 미만 농도 (IC₅₀ < 1μM)의 실시예 1에 대해 감수성이었다.

표 5. nM 단위의 실시예 1 증식 및 생존 억제 활성

상기 데이터는 A375 흑색종 세포가 실시예 1에 대해 감수성임을 증명한다. 그 중 이 스크린에서 가장 감수성인 세포주는 HepG2 및 THP-1 세포였다. HepG2는 간세포 암종으로부터 유래되고, THP-1은 AML 세포주이고, 둘 다 활성화 N-RAS 돌연변이 B-Raf 야생형을 보유한다. 데이터는 본 검정에서 실시예 1에 의한 상류 신호전달 활성화의 범 Raf 억제 활성 및 개입을 증명한다.

실시예 1은 K-Ras 돌연변이를 갖는 HCT-116 세포의 세포 성장을 억제한다:

K-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형은 췌장암, 폐암 및 결장직장암을 비롯한 많은 암 유형에서 가장 흔하고 가장 중요한 돌연변이 중 하나이다 (문헌 [Bos, Cancer Research, 1989, 49(17): 4682]). K-Ras 돌연변이는 세포 형질전환 및 악성종양에 기여하는 Ras/Raf/MEK/MAPK 캐스케이드의 활성화를 유도한다. K-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형 세포에서의 실시예 1의 항증식 활성을 평가하기 위해, 셀타이터-글로 세포 증식 및 생존 검정에 K-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형을 보유하는 결장 종양 HCT-116 세포 (ATCC)를 사용하였다. 실시예 1은 178 nM의 IC₅₀ 및 용량 의존적 방식으로 HCT-116 K-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형 증식 및 생존을 억제하였다. 이들 데이터는 본 검정에서 부적절한 활성화 상류 신호전달에서의 실시예 1 개입에 의한 Raf 억제 활성을 증명한다.

실시예 1은 N-Ras 돌연변이를 갖는 종양 세포의 세포 성장을 억제한다:

N-Ras는 흑색종, 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 간암에서 종종 돌연변이된다 (문헌 [Bos, Cancer Research, 1989, 49(17): 4682]). N-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형은 Raf 단백질, 특히 C-Raf를 통해 MAPK 활성화를 유도한다. N-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형 종양 세포인, N-Ras 돌연변이 Q61R 및 B-Raf 야생형을 보유하는 인간 흑색종 세포주 SK-Mel-2 (ATCC)에서의 실시예 1의 항증식 활성을 세포 증식 및 생존 억제에 대해 셀타이터-글로 검정에서 시험하고, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.

이뮤노블롯팅 (웨스턴 블롯) 분석

시험은 0, 및 0.17 내지 10000 nM 범위의 11개 연속 희석물의 용량으로 수행하였다. 밀리포어(Millipore)로부터의 RIPA 용해 완충제로 세포를 처리함으로써 단백질 용해물을 생성시켰다. 웨스턴 블롯팅 분석은 실질적으로 문헌 [Yadav et al, Molecular Carcinogenesis, 2011, 50: 346-52]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 4-20% 노벡스(Novex)® 트리-글리신 구배 겔 (인비트로젠)을 사용하여 전체 단백질 20 ug을 함유하는 세포 용해물 상에서 SDS-PAGE를 수행하였다. 단백질을 1시간 동안 100 V, 4℃에서 NuPAGE® 전달 완충제 (인비트로젠) 및 메탄올 10%를 사용하여 0.45 μM 니트로셀룰로스 막 상으로 전달하였다. 일반적으로, 1차 항체는 1:20000 희석으로, 2차 항체는 1:1000 희석으로 사용하였다. 단백질을 오디세이(Odyssey) 적외선 영상화 시스템 (리-코르 바이오사이언시스(Li-COR Biosciences))을 사용하여 검출하였다. ERK1/2, 포스포-ERK1/2, 포스포-MEK1/2에 대한 항체, 및 액틴은 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)로부터 입수하였다.

실시예 1은 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정된 바와 같이 N-Ras 돌연변이 Q61R 및 B-Raf 야생형을 보유하는 SK-Mel-2 세포에서 용량 의존적 포스포-MEK 및 포스포-ERK 억제를 나타내었다. 포스포-ERK 활성은 370 nM의 용량에서 실질적으로 제거되었다.

실시예 1은 188 nM의 IC₅₀으로 셀타이터-글로 검정에서 SK-Mel-2 세포 증식 및 생존을 억제하였다. 이들 데이터는 실시예 1이 본 검정에서 야생형 B-Raf 및 N-Ras 돌연변이 Q61R를 보유하는 SK-MEL-2 세포에서의 세포 증식 및 생존을 억제함을 증명한다.

베무라페닙-내성 흑색종 세포 억제에서의 실시예 1의 활성:

베무라페닙 (PLX4032) 및 PLX4720은 돌연변이 B-Raf V600E의 억제제이다 (문헌 [Johannessen et al, Nature, 2010, 468: 968-72; Montagut et al, Cancer Res. 2008, 68: 4853-61; Wagle et al, Journal of Clinical Oncology, 2011, 29: 3085-96]). 초기에 베무라페닙 요법에 반응한 환자 중 일부는 평균 7개월 내에 약물 내성이 발생하여 불응성이 된다 (문헌 [Whittaker et al, Sci Transl Med. 2010, 2: 35-41]). 베무라페닙-내성 세포주는 B-Raf V600E 돌연변이를 보유하는 인간 흑색종 세포주 A375 (ATCC)의, 증가시킨 농도의 PLX4720으로의 장기 치료에 의해 생성시킨다.

B-RAF 억제에 대해 내성인 B-RAF V600E 흑색종 세포주의 생성

내성 세포를 생성하기 위해, 대략 4개월 및 30 계대를 통해, 0.02 내지 2 μM의 점차적으로 증가시킨 농도의 N-[3-(5-클로로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-카르보닐)-2,4-디플루오로페닐]프로판-1-술폰아미드 (PLX4720; 상업적으로 입수가능한 선택적 B-Raf 억제제)의 존재 하에, 셀타이터-글로 검정에 대해 상기 기재된 바와 같은 성장 배지 중에서 A375 B-Raf V600E 세포 (ATCC)를 배양하여, A375res로서 지정된 내성 세포주를 수득하였다. 베무라페닙 및 PLX4720에 대한 A375res의 내성은 웨스턴 블롯 분석에 의한 MAPK 재활성화 및 셀타이터-글로 세포 증식 및 생존 검정에서의 IC₅₀ 값 이동에 의해 확인하였다.

이들 A375res 세포에서, PLX4032는 252 nM로부터 7 μM 초과까지 거의 30배 이동하여 그의 활성을 크게 상실하였다. 이들 내성 세포에 대한 실시예 1의 활성은 11 nM로부터 오직 3배만 이동한 34 nM의 IC₅₀을 증명하였다. 이들 데이터는 실시예 1이 본 검정에서 A375res 세포에서의 세포 증식 및 생존을 억제함을 증명한다.

실시예 1은 최소의 역설적 경로 활성화를 갖는다:

최근 공개된 연구 (상기 참조)는 B-Raf 특이적 억제제, 예컨대 베무라페닙 (PLX-4032)이 B-Raf 야생형 배경에서 다른 Raf 이소형과의 B-Raf 이량체화를 통해 "역설적 경로 활성화"를 유도함을 시사하였다. 베무라페닙은 B-Raf 야생형 유전적 배경을 갖는 흑색종 암 환자의 치료에 대해 승인되지 않았다. 이 역설적 경로 활성화는 또한 베무라페닙으로 치료한 일부 흑색종 환자에서의 피부 부작용 (예컨대, 편평 세포 암종)의 원인인 것으로 여겨졌다.

실시예 1을 셀타이터-글로 생존 검정에서 B-Raf 야생형 및 K-Ras 돌연변이를 보유하는 HCT-116 (ATCC) 세포에 대해 시험하였다. 시험은 0, 및 0.17 내지 10000 nM 범위의 11개 연속 희석물의 용량으로 수행하였다. 포스포-MEK 및 포스포-ERK 활성을 이뮤노블롯팅 (웨스턴 블롯) 분석에 의해 평가하였다.

실시예 1은 최소의 역설적 경로 활성화를 증명하였고, B-Raf 야생형 및 K-Ras 유전적 배경을 보유하는 HCT-116 세포에서 포스포-MEK 및 포스포-ERK 억제 활성을 유지하였다. 실시예 1은 본 검정에서 41 nM 초과의 용량에서 포스포-ERK 신호를 실질적으로 제거하였다. 실시예 1은 또한 C-Raf 억제를 증명하였기 때문에 (상기 이전 검정), 역설적 경로 활성화는 발생하지 않아야 하는 것으로 여겨진다.

실시예 1은 B-Raf V600E 돌연변이를 갖는 종양 세포의 세포 성장을 억제한다:

인간 암에서의 B-Raf 돌연변이, 특히 B-Raf V600E는 흑색종, 결장직장암, 폐암 및 난소암을 비롯한 인간 악성종양에서 종종 관찰된다. B-Raf에서의 이 돌연변이는 구성적 키나제 활성 및 악성 형질전환을 유도할 수 있다. 실시예 1을 셀타이터-글로 검정에서, 3종의 흑색종 세포주 A375 (ATCC), WM-266-4 (ATCC) 및 SK-Mel-28 (ATCC), 및 2종의 결장 종양 세포주 HT-29 (ATCC) 및 Colo-205 (ATCC)에서 시험하였고; 여기서 5종의 세포주는 모두 B-Raf V600E 돌연변이를 가졌다.

표 6. B-Raf V600E 돌연변이를 보유하는 종양 세포에 대한 실시예 1의 활성

실시예 1은 각각 9.2, 52.9 및 29 nM의 IC₅₀ 값으로 3종의 흑색종 세포주 A375, WM-266-4 및 SK-Mel-28의 세포 생존을 억제하였다. 유사하게, 실시예 1은 7.3 및 27 nM의 IC₅₀ 값으로 2종의 결장 세포주 HT-29 및 Colo-205의 세포 생존을 억제하였다. 데이터는 실시예 1이 본 검정에서 B-Raf V600E 돌연변이를 갖는 종양 세포의 세포 생존 및 성장을 억제하는데 활성임을 증명한다.

실시예 1은 또한 상기 시험된 A375 세포에서의 포스포-MEK 및 포스포-ERK 활성을 억제하였고, 이는 용량 의존적 방식으로 하류 신호전달을 억제함을 증명한 웨스턴 블롯 분석에 의해 추가로 평가되었다. 포스포-ERK 활성은 41 nM에서 실질적으로 제거되었다.

생체내 활성

실시예 1의 생체내 활성을 평가하기 위해, A375 V600E (ATCC) 및 HCT-116 K-Ras 돌연변이 B-Raf 야생형 (ATCC) 이종이식 종양 모델을 사용하였다. 간략하게, 1:1 배지 및 매트리겔 믹스 (0.2 mL 전체 부피) 중 10 x 10⁶개 세포 (A375) 또는 5 x 10⁶개 세포 (HCT-116)를 누드 암컷 래트 (타코닉(Taconic)으로부터의 NIH 모델 번호 NIHRNU-M)의 뒷다리에 피하 주사에 의해 이식하였다. 각 군에서의 총 8마리의 래트를 효능 연구를 위해 사용하고, 각 군에서의 총 3-4마리의 래트를 약역학적 연구를 위해 사용하였다. 일라이 릴리 앤드 캄파니(Eli Lilly and Company) 동물 실험 윤리 위원회는 모든 실험 프로토콜을 승인하였다. 종양 크기가 대략 500 mg에 도달하였을 때, 0.6 mL 부피의 실시예 1 및 비히클 (20% 캅티솔(Captisol)®, 25 mM 포스페이트, pH 2.0)의 경구 투여 (위관영양)로 처리를 시작하였다. 실시예 1을 A375 이종이식 모델에 대해 21일 동안 5, 10, 15 및 20 mg/kg, 또는 HCT-116 이종이식 모델에 대해 21일 동안 15 및 30 mg/kg으로 1일 2회 경구 투여하였다. 활성 및 독성 신호를 평가하기 위해 종양 성장 및 체중을 시간 경과에 따라 모니터링하였다. 종양의 2차원 측정을 1주 2회 수행하고, 종양 부피를 중간-축 길이 및 중간-축 폭에 기반하여 계산하였다. 시간 및 처리군에 걸친 분산을 균등화하기 위해 종양 부피 데이터를 로그 스케일로 변환하였다. 로그 부피 데이터를 사스(SAS)® 소프트웨어 (버전 8.2)에서 믹스드(MIXED)® 절차를 사용하여 시간 및 처리에 의한 분산의 이원 반복 측정 분석으로 분석하였다. 반복 측정에 대한 상관관계 모델은 스페이셜 파워(spatial power)였다. 처리군을 각 시점에서 대조군과 비교하였다. 믹스드® 절차를 또한 각 처리군에 대해 개별적으로 사용하여 각 시점에서의 조정된 평균 및 표준 오차를 계산하였다. 둘 다의 분석은 각 동물 내의 자기상관, 및 거대 종양을 갖는 동물이 초기에 연구로부터 제거되는 경우 발생하는 데이터의 손실을 고려하였다. 조정된 평균 및 표준 오차를 각 처리군 대 시간에 대해 플롯팅하였다.

A375 이종이식 모델에서, 모든 용량 군은 종양 성장 억제 및 종양 성장 퇴행을 증명하였고, 이들 군 중 어느 것에서도 동물 체중 감소는 존재하지 않았다. HCT-116 이종이식 모델에서, 30 mg/kg 군은 통계적으로 유의한 종양 성장 억제를 나타내었다. 이들 데이터는 실시예 1에 의한 생체내 활성을 증명하고, 효소적 세포 용해물을 지지하고, 세포 증식 데이터를 생체내 활성과 상호관련시켰다.

A375 이종이식 모델에서의 실시예 1의 약역학적 (PD) 효과를 평가하기 위한 별개의 연구에서는, 3.125 내지 50 mg/kg 범위의 용량으로 단일 용량 연구를 수행하였다.

단일 용량 처리 후 2시간째에, 웨스턴 블롯 분석에 의해 증명된 바와 같이 용량 의존적 PD 효과가 관찰되었다. 포스포-MEK 및 포스포-ERK 억제가 모든 용량 군에서 관찰되었고, 25 mg/kg은 이 모델에서 포스포-MEK 및 포스포-ERK 활성을 거의 완전히 제거하였다.

Claims (16)

1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.

제1항에 있어서, 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아인 화합물.

제2항에 있어서, 2θ ± 0.2 단위의 16.0, 및 6.9, 7.0, 18.2 및 23.2 중 하나 이상에서 나타나는 특징적인 피크를 갖는 X선 분말 회절 패턴을 특징으로 하는 결정질 형태의 1-(3,3-디메틸부틸)-3-(2-플루오로-4-메틸-5-(7-메틸-2-(메틸아미노)피리도[2,3-d]피리미딘-6-일)페닐)우레아인 화합물.

제1항의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제약상 허용되는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물.

제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 염, 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.

제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 염, 및 폴리비닐 피롤리돈 비닐 아세테이트 (PVP-VA)를 포함하는 제약 조성물.

제6항에 있어서, PVP-VA가 콜리돈(Kollidon)® VA 64인 제약 조성물.

유효량의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 염을 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.

제8항에 있어서, 암이 갑상선암, 난소암, 흑색종, 급성 골수 백혈병 (AML) 및 결장직장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.

제9항에 있어서, 암이 흑색종인 방법.

제9항에 있어서, 암이 결장직장암인 방법.

제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 화합물 또는 염.

제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한 화합물 또는 염.

제13항에 있어서, 암이 갑상선암, 난소암, 흑색종, 급성 골수 백혈병 (AML) 및 결장직장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물 또는 염.

제14항에 있어서, 암이 흑색종인 화합물 또는 염.

제14항에 있어서, 암이 결장직장암인 화합물 또는 염.

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